Распространение и молекулярные механизмы резистентности к макролипидным антибактериальным препаратам микроорганизмов рода Streptococus в Российской Федерации

Филимонова, Ольга Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Распространение и молекулярные механизмы резистентности к макролипидным антибактериальным препаратам микроорганизмов рода Streptococus в Российской Федерации
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Распространение и молекулярные механизмы резистентности к макролипидным антибактериальным препаратам микроорганизмов рода Streptococus в Российской Федерации"

004611628

На правах рукописи

Филимонова Ольга Юрьевна

Распространение и молекулярные механизмы резистентности к макролидным антибактериальным препаратам микроорганизмов рода Streptococcus в Российской Федерации

03.02.03 - Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 8 ОКТ 20Ю

Москва 2010 год

004611628

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Российская Медицинская Академия Последипломного Образования»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Сидоренко Сергей Владимирович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Белокрысенко Сергей Сергеевич

доктор медицинских наук, профессор Мазурова Изабелла Константиновна

Ведущая организация: Военно-медицинская Академия

им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится "Ц" ЙО^Ъ^Л- 2.0 № г. в 10 ~ часов на заседании диссертационного совета Д 208.04.01 при Федеральном Государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г.Москва, ул.Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Автореферат разослан 2010г.

Ученый секретарь диссертационного совета Доктор медицинских наук

О.Ю.Борисова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Респираторные инфекции занимают важное место среди инфекционных заболеваний человека.

Наиболее частыми возбудителями респираторных инфекций в амбулаторной практике являются Streptococcus pneumoniae и Streptococcus pyogenes (ß-гемолитический стрептококк группы А) (Белошицкий Г.В., 2005; Белов Б.С., 2003; Зубков М.Н., 2005; Катосова Л.К., 2005; Королева И.С, 2003; Ноников В.Е., 2001; Манеров Ф.К., 1990; Сидоренко C.B., 2004; Черняев А.Л., 2002).

Макролиды, а также сходные с ними по механизму действия линкозамиды и стрептограмины, давно и с успехом применяются в амбулаторной практике при различных бактериальных инфекциях респираторного тракта. Данные препараты объединены в MLS антимикробную группу (М-макролид, L-линкозамид, S-стрептограмин). При этом появление в 80-е - 90-е годы прошлого века новых препаратов этой группы существенно расширило возможности их практического применения (Дворецкий Л.И., 2005; Заплатников A.JL, 2002; Козлов P.C., 2001; Bergman M., 2006).

Однако, широкое, а в ряде случаев бесконтрольное и неоправданное использование макролидных антибиотиков при респираторных инфекциях, привело к появлению среди пневмотропных возбудителей устойчивых штаммов. Так, наиболее высокий удельный вес резистентных штаммов S.pneumoniae и S.pyogenes отмечен в тех странах, где макролидные антибиотики традиционно широко используются в клинической практике (Bergman M., 2004; Critchley I.A., 2007; Doern G.V., 2005; Fujita K„ 1994; Gherardi G., 2007; Gracia, M., 2009; Guchev A., 2006; Kresken M, 2004).

К наиболее распространенным механизмам устойчивости

стрептококков к макролидным антибиотикам относятся модификация

мишени действия этих препаратов (метилирование участка связывания

антибиотиков, расположенного в V домене рРНК) и активное выведение лекарственного вещества из внутренней среды бактериальной клетки (эффлюкс). К редким механизмам устойчивости относятся мутации в генах рРНК и генах рибосомальных белков. Ферменты, осуществляющие метилирование рРНК, кодируются группой родственных генов (em). У стрептококков чаще всего встречаются егт(А) и егт(В) гены, локализованные на хромосомах в составе транспозонов. Активное выведение макролидов осуществляется транспортными системами, представляющими собой крупные белки с 12-ю трансмембранными доменами. Указанные белки кодируются группой близкородственных генов (mej), которые локализуются на различных генетических элементах и опосредуют несколько различные уровни резистентности. В последние годы замечено возрастание количества вариантов те/генов (Betschel S.D., 1998; Blackman Northwood J., 2009; Cochetti I., 2005; Corne H.W. Klaassen, 2005; Del Grosso M., 2004; Farrell DJ, 2005).

В связи с вышеизложенным, наблюдение за динамикой распространения устойчивости к макролидам среди стрептококков и расшифровка ее механизмов является необходимым условием обоснования рационального применения этих антибиотиков. Учитывая особенности быстрого распространения резистентности среди стрептококков посредством эффлюкса, представляется актуальным более углубленное исследование mef-генов.

Цель исследования.

Оценить, с помощью современных фенотипических и молекулярно-генетических методов, динамику распространения штаммов S.pneumoniae и S.pyogenes резистентных к макролидным антибиотикам, выделенных от больных с внебольничными респираторными инфекциями, и расшифровать молекулярные механизмы устойчивости.

Задачи исследования. 1. Оценить динамику распространения штаммов S. pneumoniae и S. pyogenes устойчивых к макролидным антибиотикам, выделенных от больных с

внебольничными респираторными инфекциями в различных регионах Российской Федерации.

2. Расшифровать механизмы резистентности у штаммов, проявляющих фенотипическую устойчивость к макролидным антибиотикам, и выявить ведущие механизмы устойчивости.

3. Разработать высокопроизводительный метод дифференцировки /ие/-генов на подклассы, основанный на определении нуклеотидных полиморфизмов в реакции минисеквенирования с последующим масс-спектрометрическим анализом.

4. Оценить клональное родство антибиотикоустойчивых штаммов S.pneumoniae.

Научная новизна работы.

В ходе настоящего исследования выявлены значительные различия в динамике распространения и уровне резистентности к макролидным антибиотикам среди S.pneumoniae и S.pyogenes в различных регионах Российской Федерации. Указанные различия обосновывают необходимость разработки региональных рекомендаций по применению макролидов для эмпирической терапии инфекций дыхательных путей.

Проведенный мониторинг чувствительности к антибактериальным препаратам у 2944 клинических штаммов S.pneumoniae и S.pyogenes, выделенных от больных с респираторными инфекциями показал, что характер динамики распространения изолятов, устойчивых к макролидным антибактериальным препаратам, а также абсолютные показатели уровня резистентности в отдельных регионах РФ существенно различаются.

С помощью ПЦР проведена детекция генов резистентности у штаммов стрептококков, проявляющих фенотипическую устойчивость к макролидным антибиотикам. Выявлено, что ведущими механизмами устойчивости у штаммов S.pneumoniae были: рибосомальное метилирование, кодируемое е/7л(В)-геном и сочетание метилирования (присутствие егт{В) гена) с активным выведением лекарственного вещества, связанное с наличием mef

гена. В последние годы отмечено нарастание частоты выделения штаммов S.pnenmoniae, несущих одновременно два гена, что увеличивает уровень резистентности микроорганизмов. Ведущим механизмом устойчивости к макролидам у штаммов S.pyogenes был эффлюкс, опосредованный /»¿/-геном.

Разработан высокопроизводительный метод дифференцировки те/-гена на подклассы, основанный на MALDI-TOF масс-спектрометрии продуктов амплификации, полученных с помощью термоциклического достраивания праймеров с участием дезокси- и дидезоксинуклеотид-трифосфатов.

Впервые, с помощью разработанного метода, была проведена дифференцировка /и<?/-генов на подклассы теДА), meflE) и meß}) у штаммов S.pneumoniae и S.pyogenes.

Проведено мультилокусное сиквенс-типирование макролид-резистентных штаммов S.pneumoniae, обладающих ассоциированной устойчивостью к бета-лактамным антибиотикам. Установлено, что они принадлежат к международно-распространенным клонапьным комплексам СС81, СС271 и СС315.

Практическая значимость работы.

Собрана уникальная коллекция клинических штаммов S.pneumoniae и S.pyogenes, выделенных от больных с внебольничными респираторными инфекциями в различных регионах РФ, позволяющая проводить многоплановые исследования с целью оценки динамики изменения антибиотикочувствительности и перспективности использования новых групп антибактериальных препаратов.

Полученные данные о динамике распространения штаммов S.pneumoniae и S.pyogenes резистентных к макролидным антибиотикам в различных регионах России могут быть использованы для оптимизации антибактериальной терапии респираторных инфекций.

Создан банк ДНК клинических изолятов S.pneumoniae и S.pyogenes, устойчивых к макролидным антибактериальным препаратам, который можно использовать в дальнейших работах по прогнозированию распространения

резистентных штаммов и в исследованиях, направленных на изучение молекулярно-генетических механизмов их передачи.

Разработанный высокопроизводительный метод выявления нуклеотидных полиморфизмов для дифференцировки теf генов расширяет возможности лабораторий лечебно-профилактических учреждений по наблюдению за динамикой распространения детерминант устойчивости к макролидным антибиотикам и повышает эффективность методов идентификации, генотипирования и определения генетических маркеров лекарственной устойчивости микроорганизмов.

Нуклеотидные последовательности различных подклассов /л¿У генов, обнаруженных у штаммов S.pneumoniae, внесены в международную базу GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ (EU486997, EU486999, EU486995, EU487001).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Динамика распространения штаммов S.pneumoniae и S.pyogenes резистентных к макролидным антибиотикам в различных регионах Российской Федерации носит разнонаправленный характер, а ее уровень варьирует в широких пределах.

2. Ведущие механизмы устойчивости к макролидным антибиотикам у штаммов S.pneumoniae и S.pyogenes различаются. У штаммов S.pneumoniae устойчивость связана либо с генами егт(В), либо с наличием генов егт(В) и те/одновременно. У штаммов S.pyogenes устойчивость связана, в основном с те/ генами.

3. Распространенные среди Streptococcus spp. те/ гены отличаются значительным разнообразием. Среди S.pneumoniae превалируют гены те/(Е) подкласса, среди S.pyogenes - mefl\) подкласса.

Апробация работы.

Диссертация апробирована на заседании кафедры микробиологии Российской медицинской академии последипломного образования, протокол №6 от 14 октября 2009 г.

Основные результаты исследований представлены и доложены на VII-й Российской научно-практической конференции «Современные проблемы антимикробной химиотерапии» (Москва, 2006), Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным болезням (Копенгаген, 2005), Международной конференции по антимикробным препаратам и химиотерапии (Сан-Франциско, 2006), конференции Европейского общества химиотерапии (Ахен, 2006), Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным болезням (Мюнхен, 2007), Н-м Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2010).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, в том числе 5 статей, опубликовании в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 2 статьи в периодической печати, 9 - в материалах конференций.

Структура и объем диссертации.

Материалы диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, заключение по обзору литературы, 5 глав собственных исследований, заключение, выводы, приложение. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 27 рисунками. Список использованной литературы включает 156 источников, в том числе отечественных - 44 и зарубежных - 112 авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы.

Материалы.

В работу включены 2944 клинических изолята бактерий рода

Streptococcus (S.pneumoniae и S.pyogenes), полученных в ходе

многоцентрового исследования в период с 2002 по 2007 гг от больных с

респираторными инфекциями различной локализации (острые синуситы,

острые средние отиты, обострение хронических бронхитов, пневмонии,

пневмонии с бактериемией, менингиты, конъюнктивиты) из десяти ЛПУ

г.Москвы и из областных клинических больниц г.Санкт-Петербурга, г.Ярославля, г.Томска, г.Иркутска, г.Владивостока. Источниками выделения бактерий были: мокрота, бронхо-альвеолярный аспират, аспират из придаточных пазух носа, мазки из зева. Коллекция образцов клинических штаммов по годам и Федеральным округам представлена в таблице 1.

Таблица 1.

Коллекция образцов клнннческих штаммов_

Микроорганизм Общее кол-во Федеральные округа

Год Центральный СевероЗападный Сибирский Дальнево сточный

2002 S. рп 0 0 0 0 0

5. руо 195 186 0 9 0

2003 S. рп 237 237 0 0 0

S. руо 218 173 0 45 0

2004 S. рп 581 300 31 250 0

5. руо 196 158 0 38 0

2005 S. рп 585 242 101 242 0

S. руо 171 117 0 54 0

2006 S. рп 457 253 47 157 0

S. руо 61 34 0 27 0

2007 S. рп 243 82 6 18 137

S- РУ° 0

Итого S. рп 2103 1114 185 667 137

5. руо 841 668 0 173 0

Методы.

Микробиологические исследования.

Идентификацию бактерий в бактериологических лабораториях ЛПУ проводили микроскопическим и культуральным методами, а также коммерческими тест-системами Crystal (BD, США). В качестве контроля использован референтный штамм АТСС 49619 S.pneumoniae.

Определение чувствительности к антимикробным препаратам проводилось методом микроразведений в бульоне Мюллера-Хинтон (BBL, США) согласно рекомендациям и критериям Методических указаний по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам 2004г, а также CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institution, 2007г.) в 96-лунковых планшетах для иммунологических исследований.

В панель тестируемых антибиотиков для штаммов S.pneumoniae были включены: эритромицин, кларитромицин, азитромицин, спирамицин, мидекамицин ацетат, джозамицин, телитромицин, клиндамицин; для штаммов S.pyogenes — пенициллин, эритромицин, телитромицин, клиндамицин, тетрациклин, хлорамфеникол, офлоксацин, левофлоксацин (Sigma).

Молекулярные методы исследования.

Выделение ДНК. ДНК из суточной культуры S. pneumoniae или S.pyogenes, выращенной на твердом Колумбийском агаре (bioMerieux, Франция) с добавлением 5% дефибринированной бараньей крови, была выделена с помощью набора «ДНК-экспресс» (ООО НПФ «Литех», г.Москва), согласно инструкции.

Таблица 2.

Набор олигонуклеотидных ираймеров, использованных для

амплификации различных фрагментов генома _

N JIokjc Праймер S'-3' последовательность Размер продукта, n.ii.

1 me/ mef_F mef_R 5' ATG GAA AAA TAC AAC AAT TGG AAA 3' 5' TTA TTT TAA АТС TAA TTT TCT AAC CTC 3' 1100

2 mefl mef_F_l mef_R_l 5' ATG GAA AAA TAC AAC AAT TGG AAA 3' 5' CC AGC TGC TGC GAT AAT TAA АТС 3' 263

3 mefmel mefme 1_F mef_ mel_R 5' GCC TGA ATA TTT AGG ACG TGT 3' 5' CTT CAC GGT СТА AAT GGC TCG 3' 718

4 ermB ermBF ermBR 5' GAA AAG GTA CTC AAC CAA ATA 3' 5' AGT AAC GGT ACT TAA ATT GTT TAC 3' 640

5 ermA ermAF ermAR 5' TCT AAA AAG CAT GTA AAA GAA 3' 5' CTT CG A TAG TTT ATT AAT ATT AGT 3' 600

Штаммы, нечувствительные к макролидным антибактериальным

препаратам, исследованы методом полимеразной цепной реакции для

детекции ег/л-генов и те/-генов. В исследовании использованы праймеры,

представленные в таблице 2 (Okitsu N. et al. J Clin Microbiol. 2005; Klaassen,

CHW, Mouton JW, Antimicrob Agents Chemother. 2005, Филимонова О.Ю. 2007). Из-за того что, не всегда воспроизводился результат с праймерами для mef-reHa, взятыми из других источников, нами разработаны праймеры mefl и mef mel и подобраны условия ПЦР, которые использовались параллельно.

Потшеразная цепная реакция проведена в амплификаторе РТС-240 DNA Engine Tetrad2 (MJ Research Bio-Rad, США) с последующим анализом продуктов амплификации в 2%-ном агарозном геле.

Определение нуклеотидной последовательности генов проводили модифицированным методом Сенгера с использованием прибора ABI Prism® 3100 Genetic Analyzer ("Applied Biosystems", США; "Hitachi" Япония). Полноразмерную последовательность генов получали путем склеивания нуклеотидных фрагментов с использованием программного продукта «Vector NTI® Suite v. 9» (Informax Inc, США). Для поиска гомологичных нуклеотидных или аминокислотных последовательностей в международных базах данных GenBank и EMBL была использована программа BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

Статистическую обработку и анализ данных производили с помощью компьютерных программ Microsoft® Office Excel 2003, Whonet-5.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Динамика распространения штаммов S. pneumoniae и S.pyogenes резистентных к макролидам и оценка антибактериальной активности препаратов MLS-группы

Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам является неотъемлемой частью в работе клинических лабораторий в ЛПУ при диагностике возбудителей респираторных инфекций.

Проведен анализ статистических параметров макролидов и линкозамидов за пять лет (характер распределения МПК, диапазон МПК, значения МПК50, МПК90, средняя геометрическая МПК) у 2103 штаммов S.pneumoniae и 841 штамма S.pyogenes.

Выявлено, что наибольший уровень антибактериальной активности к изученным штаммам S.pneumoniae и S.pyogenes наблюдался у телитромицина (полусинтетическое производное эритромицина, выделенное в подгруппу кетолидов).

Препараты эритромицин (14-членный природный макролид), кларитромицин (14-членный полусинтетический макролид) и клиндамицин (линкозамид) практически не различались по уровню активности и уступали телитромицину у обоих представителей рода Streptococcus. Уровень активности азитромицина (15-членный полусинтетический макролид) был несколько ниже, чем у трех выше приведенных антибиотиков.

Следует также отметить, что соотношение чувствительных, промежуточных и устойчивых штаммов для 14-ти и 15-ти членных макролидов было практически одинаковым.

Уровень чувствительности к телитромицину составил 99% у всех изученных штаммов. Только один штамм S.pneumoniae и пять штаммов S.pyogenes показали промежуточную устойчивость к этому препарату.

Учитывая приведенные данные, для анализа динамики распространения резистентных штаммов использовали эритромицин, как маркер устойчивости ко всем 14-ти и 15-ти членным макролидам, а также клиндамицин, как представитель линкозамидов.

На рисунке 1 представлен сводный график динамики распространения штаммов S.pneumoniae и S.pyogenes резистентных к эритромицину и клиндамицину (в %) по годам.

Выявлено, что уровень устойчивости S.pyogenes к эритромицину на территории Российской Федерации выше, чем у штаммов S. pneumoniae и варьирует в диапазоне 7-15.8%.

А уровень резистентности к клиндамицину, напротив, выше у штаммов S. pneumoniae, чем у пиогенных стрептококков, и практически полностью повторяет динамику устойчивости пневмококков к эритромицину, разница в частоте устойчивости к сравниваемым препаратам не превышает 1% - 2%.

Рисунок 1. Динамика распространения штаммов S.pneumoniae и S.pyogenes резистентных к эритромицину и клиндамицину (в %).

Примечание:

-•-Эритромицин S.pneumoniae Клиндамицин S.pneumoniae

-^¡»-Эритромицин S.pyogenes

Анализируя эти данные, можно предположить, что ведущие механизмы резистентности у штаммов S.pneumoniae и S.pyogenes различны.

По длительности наблюдения и количеству изученных изолятов наиболее полные данные получены для Центрального Федерального округа. Как видно из таблицы 1, за пять лет в Центральном Федеральном округе собрано и исследовано 1114 штаммов S.pneumoniae и 668 штаммов S.pyogenes. В 2003 году нечувствительными к эритромицину были 30 (12.7%) штаммов S.pneumoniae из изученных изолятов, в 2004 году - 21 штамм (7%). В последующие годы отмечали постепенный рост частоты выделения изолятов нечувствительных к эритромицину, в 2007 году этот показатель составил 14.6%. Частота распространения нечувствительных к эритромицину штаммов S.pyogenes в период с 2002 по 2004 гг. оставалась практически

постоянной 14 (7.5%), 13 (6.9%) и 11 (6.9%) штаммов соответственно. В 2005 году наблюдали некоторое повышение показателя устойчивости до 11.1%.

В других регионах Российской Федерации длительность периода наблюдения за распространением резистентных штаммов стрептококков была меньше, меньшим было и количество изученных изолятов.

Наименьшее число нечувствительных к эритромицину штаммов S.pneumoniae было выделено в г.Томске. Однако, если в 2004 году не выявлено из всех изучаемых изолятов ни одного штамма S.pneumoniae, резистентного к эритромицину, то в 2006 году устойчивые штаммы составили 3%. В г.Ирутске также наблюдалась тенденция к росту показателя устойчивости с 3.1% в 2004 году до 12.22% в 2006 году. В г.Санкт-Петербурге, напротив, прослеживалось снижение частоты выделения резистентных пневмококков к эритромицину с 13% до 6.4% за тот же период наблюдения.

Более 80% штаммов S.pneumoniae устойчивых к эритромицину показали резистентность и к клиндамицину. В полной мере сказанное относится к г.Москве, г.Томску и г.Санкт-Петербургу. Существенные различия выявлены лишь в г.Иркутске, где устойчивость к клиндамицину росла значительно медленнее, чем к эритромицину (50% штаммов).

И другая картина наблюдалась в отношении штаммов S.pyogenes устойчивых к эритромицину. Только четыре штамма S.pyogenes устойчивые к эритромицину ( г.Москва) были резистентны к клиндамицину. В остальных регионах все штаммы S.pyogenes были чувствительны к этому препарату.

В целом, частота распространения устойчивых штаммов S.pneumoniae и S.pyogenes к макролидным антибиотикам в различных регионах в отдельные периоды существенно варьировала. Характер динамики и абсолютные показатели уровня резистентности в отдельных регионах различались.

Следует отмегить, что невозможно использование усредненных данных по распространению штаммов S.pneumoniae и S.pyogenes,

резистентных к макролидам, в отдельных регионах Российской Федерации для оптимизации терапии.

Разработка метода дифференцировки mef-гена на подклассы В связи с высокой гомологией /ие^генов их дифференцировка с помощью ПЦР практически невозможна. Метод PCR-RFLP достаточно трудоемок, плохо поддается стандартизации и не позволяет детектировать все подклассы /ие/тена.

Задача дифференцировки mef генов по существу сводится к детекции нуклеотидных полиморфизмов, характерных для их отдельных подклассов. Анализ представленных в GenBank последовательностей подклассов mef генов выявил три точки полиморфизма (положения: 264-267 пн., 587-588 пн., 745-746 пн), в каждой из которых последовательности нуклеотидов оказались уникальными для отдельных подгрупп генов.

Для выявления нуклеотидных последовательностей в указанных точках полиморфизма нами был разработан метод, основанный на реакции ферментативного достраивания олигонуклеотидных праймеров с последующим определением молекулярной массы продуктов реакции с помощью времяпролётной масс-спектрометрии с лазерной десорбционной ионизацией в присутствии вспомогательного вещества - матрицы (MatrixAssisted Laser Desorption/lonisation, MALD1).

Идентификацию wt/-генов проводили путем сравнения молекулярных масс предсказанных продуктов реакции термоциклического достраивания и реально полученных (таблица 3, рисунок 2 (А и Б), рисунок 3 (А и Б), рисунок 4 (А и Б)). На этих рисунках представлены масс-спектры, полученные при проведении реакции термоциклического достраивания праймеров F-264 (рисунок 2 А и Б), R-587 (рисунок 3 А и Б), R-745 (рисунок 4 А и Б).

Результат типирования рассматривался как однозначный, если во всех трех точках полиморфизма размер продуктов достройки соответствовал расчетному. В ряде случаев по результатам минисеквенирования сделать

однозначное заключение о типе mef-гена было невозможно. В рамках группы те/-гена выделены подклассы meflE) и mefil).

Метод, основанный на селективном ферментативном достраивании олигонуклеотидных праймеров, по точности идентификации однонуклеотидного полиморфизма сопоставим с прямым определением нуклеотидной последовательности интересующих локусов, при этом является значительно более простым и дешевым в исполнении (стоимость расходных материалов сопоставима со стоимостью стандартной ПЦР).

Для валидации разработанной системы дифференцировки было проведено определение нуклеотидных последовательностей mef-генов у 52-х изолятов S. pneumoniae и 33-х изолятов S. pyogenes.

Однозначные результаты дифференцировки mef-кноъ с помощью минисеквенирования полностью совпадали с результатами, полученными при классическом секвенировании по Сэнгеру. В тех случаях, когда результаты дифференцировки с помощью минисеквенирования оказались неопределенными, при классическом секвенировании были выявлены mef-гены, демонстрировавшие наибольшую степень гомологии с m¿/-геном недавно описанным у Bacteroides ovatus и не получившим до настоящего времени отдельного обозначения.

Генетические детерминанты резистентности Streptococcus spp. к макролидным антибиотикам

Из изолятов со сниженной чувствительностью к эритромицину (МПК > 1.0 мкг/мл), обнаруженных в ходе настоящей работы, изучены на наличие основных детерминант устойчивости к макролидам с помощью ПЦР и разработанной системы дифференцировки mef-гена 164 штамма S.pneumoniae и 70 штаммов S.pyogenes.

Таблица 3

Названия и состав праймсров, состав реакционных смесей и возможные продукты реакции для отдельных ntef genes.

Точки Состав праймеров Состав Ген Возможные продукты M.m. 5a

полиморфизма, реакцион ной смеси реакции

названия (dNTP и

праймеров ddNTP)

264-267 5 '-ТТА ATTATCGC AGCAGCTGG-3' dT, dC, Нет Праймер (F-264) 6132 -

по ddG Mefi. А) Праймер + dT + dT + dC + ddG 7343 1211

F-264 Me.fl Е) Праймер + dT + ddG 6750 618

Мет Праймер + ddG 6445 313

587-588 3' -С A CGTTTC A A A CCTTGGTT-5' dT, ddG, Нет Праймер (R-587) 5754 -

по ddC Mef[A) Праймер + ddG 6067 313

R-587 Л/еДЕ) Праймер + dT + dT + ddG 6675 921

МеМ) Праймер + dT + ddC 6331 264

745-746 по 3 '-TG A A ATTACCTTGTGG ACACG-5' dA, ddG, Нет Праймер (R-745) 6446 -

R-745 ddT МеЛА) Праймер + dA + dA + ddT 7360 914

Mej[E) Праймер + ddG 6759 313

МеА I) Праймер + dA + ddT 7047 601

Д= 314.232

100 5250 5500 5750 6000 6250 6500 6750 7000 7250 7500

m/z

Рисунок 2-А. Результаты дифференцировки те/генов по точке полиморфизма 264 -267 (праймер F-264). Продукт достраивания /иеД1)-ген.

Примечание: первый пик соответствует массе исходного праймера F-264 (расчетная мол. масса = 6132 d, экспериментальная = 6138.742 d). Второй пик соответствует продукту достраивания, характерному для те/(1)-гена (расчетная мол. масса = 6445 d, экспериментальная = 6452.492 d). Расчетная разница мол. масс исходного праймера и продукта достраивания составляет 313 d, экспериментальная - 314.232 d.

Д= 618,007

ssbö 'sYsb' Yo'oö' 62^0' 'e'sbö

7000725075007750

Рисунок 2-Б. Результаты дифференцировки те/генов по точке полиморфизма 264 -267 (праймер Р-264). Продукт достраивания теДЕ)-ген.

Примечание: первый пик соответствует массе исходного праймера Р-264 (расчетная мол. масса = 6132 d, экспериментальная = 6132.461 d). Второй пик соответствует продукту достраивания, характерному для ше/(С) гена (расчетная мол. масса = 6750 d, экспериментальная = 6750.468 d). Расчетная разница мол. масс исходного праймера и продукта достраивания составляет 618 d> экспериментальная -618.007 d.

Д= 313,817

ssbí)' 's>io' Vcbó V2Í0' Ysbo' 'í'7^0' íc'oq' Y^ó' Ysbb' 'üYo'

Рисунок 3-A. Результаты дифференцировки те/-генов по точке полиморфизма 587-588 (праимер R-587). Продукт достраивания теДЕ)-ген.

Примечание: первый пик соответствует массе исходного праймера R-587 (расчетная мол. масса = 6446 d, экспериментальная = 6443.225 d). Второй пик соответствует продукту достраивания, характерному для mej[Е) гена (расчетная мол. масса = 6759.2 d, экспериментальная = 6757.042 d). Расчетная разница мол. масс исходного праймера и продукта достраивания составляет 313.2 d, экспериментальная -313.817 d.

7047 9В7 6759 161 I

Д= 602,453

s'sbo' 's>ib' Vobö' 'eVbb' 'e'sbö' 'e>bo' '?Vgq 1 '7'1'ib' Yi'oo' '7)10

m Ii

Рисунок 3-Б. Результаты дифференцировки /ие/"-генов по точке полиморфизма 587-588 (праймер R-587). Продукт достраивания шеД1)-ген.

Примечание: первый пик соответствует массе исходного праймера R-587 (расчетная мол. масса = 6446 d, экспериментальная = 6445.534 d). Второй пик соответствует продукту достраивания, характерному для mej[\) гена (расчетная мол. масса = 7047.2 d, экспериментальная = 7047.987 d). Расчетная разница мол. масс исходного праймера и продукта достраивания составляет 601.2 d, экспериментальная - 602.453 d.

* 923,043

. rtMwi

Рисунок 4-А. Результаты дифференцировки «/¿/-генов по точке полиморфизма 745-746 (праймер Я-745). Продукт достраивания /иеДЕ)-ген.

Примечание: первый пик соответствует массе исходного праймера Я-745 (расчетная мол. масса = 5754 (1, экспериментальная = 5753.491 (1). Второй пик соответствует продукту достраивания, характерному для теДЕ) гена (расчетная мол. масса = 6675.2 <1, экспериментальная = 6757.042 (1). Расчетная разница мол. масс исходного праймера и продукта достраивания составляет 921.2 <1, экспериментальная - 923.043 й.

Д-577,636

SS00 SISO «ООО 02S0 Í500 I7S0 7000 7150 750О 7750

Рисунок 4-Б. Результаты дифференцировки те/-генов по точке полиморфизма 745-746 (праймер 11-745). Продукт достраивания /иеД1)-ген.

Примечание: первый пик соответствует массе исходного праймера Я-745 (расчетная мол. масса = 5754 <1, экспериментальная = 5752.999 (1). Второй пик соответствует продукту достраивания, характерному для теД!) гена (расчетная мол. масса = 6331.2 (1, экспериментальная = 6330.635 с1). Расчетная разница мол. масс исходного праймера и продукт а достраивания составляет 577.2 (1, экспериментальная - 577.636 с1.

Гены, ответственные за резистентность к макролидным антибиотикам и их комбинации, которые встречались у изученных штаммов Б.рпеитотае представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Результаты детекции детерминант резистентности к макролидным

Период Генотипы резистентности

выделения erm(B)+me/(E) erm(B)+me/(l) егт(В)+/пеГ" erm(B) mef(l) mef(E) mef* mef"

2003(п=24) 9 /38% - - 11/46% 1 /4% 2 / 8% 1 /4% -

2004(п=29) 10 /35% - - 14/48% 1 /3% 3/10% - 1 / 3%

2005(п=44) 7 /16% - 1 / 2% 26/59% 3 17% 6/14% - 1 / 2%

2006(п=43) 15/35% 2 / 5% 6 /14% 9/21% 3 / 7% 7/16% 1 12% -

2007(п=24) 10 /42% - 8 /33% 4/17% - 2/ 8% - -

ИТОГО(п=164) 51 /31% 2 /1% 15 /9% 64/39% 8 1 5% 20/12% 2 11% 2 /1%

Примечание: * - те/-ген, сходный с mef-геном, Bacteroides ovatus (GeneBank AJ557257) ** - осуществить точную идентификаю mef-гена не удалось

Ведущим механизмом устойчивости у пневмококков было рибосомальное метилирование, опосредованное егт(В) геном. Поэтому превалировали штаммы S.pneumoniae с изолированным егт(В) геном и штаммы, содержащие одновременное егт(В) и mef[Е) гены.

Так, в период с 2003 по 2005 гг. отмечено преобладание пневмококков с изолированными егт(В) генами, а в 2006 и 2007 гг. выявлена тенденция к увеличению частоты штаммов, обладающих одновременно двумя генами. Генов егт{А) у S. pneumoniae обнаружено не было.

Распространенность штаммов S.pneumoniae с изолированными mef[E) генами нарастала в период с 2003 по 2006 гг. (от 8% до 16%), а в 2007 было отмечено снижение частоты их выделения до 12.5%. Пневмококки с генами подкласса meßl) встречались спорадически. Следует также отметить отсутствие среди изученных штаммов генов mefiА).

В 2003 и 2006 гг. было обнаружено по одному штамму, обладающему оте/-геном, сходным с «jl/-геном, ранее выявлявшимся только у Bacteroides ovatus в 2003 году. У двух штаммов провести точную идентификацию mef-генов не удалось.

Как следует из данных таблицы 5, гены резистентности пиогенных стрептококков к макролидам, также разнообразны и встречаются в различных комбинациях.

Таблица 5.

Результаты детекции детерминант резистентности к макролидным антибиотикам у штаммов S. pyogenes

егт( А)+ me/U) егт(А) + теЛЕ) егт{ А) + mef* erm(B) + mefil) erm(A) me)(1) me/E) mef mef*

2002(п=14) - - - I /7% 8/57% 1 /7% 1/7% 3/21%

2003(п=16) - - 1 /6% - - 6/38% - - 9/56%

2004(п=15) - 1 / 7% 1 /7% I /7% - 8/53% - 1/7% 3/20%

2005(п=18) 1 /6% - - - - 5/28% 2/11% 2/11 8/44%

2006(п=7) - - - - - - - - 7/100%

Итого (п=70) 1 /1% 1 /1% 2 /3% 1 /1% 1 /1% 27/39 % 3 /4% 4/6% 30/43 %

Примечание: * - mef-ген, сходный с ше/-геном, Bacteroides ovalus (GeneBank AJ557257

** - осуществить точную идентификаю те/-гена не удалось

Ведущим механизмом устойчивости был эффлюкс, опосредованный /иеД1)-геном. У единичных штаммов обнаружены е/ти(А)-гены либо в изолированном виде, либо в комбинации с различными те^генами. Ген егт(В) удалось обнаружить только в одном штамме в комбинации с те/{I) геном. У значительной части штаммов те/- гены не были точно идентифицированы, так как с использованными в работе праймерами не удалось получить ампликоны достаточного размера.

У четырех штаммов обнаружены те/-гены, сходные с те/-генами ВасШо^йгз ога/г« (ОепеВапк Аи557257).

Валидация полученных результатов проведена с помощью прямого секвенирования при сопоставлении с международной базой данных генотипов (ОепеВапк).

Молекулярное типирование штаммов S.pneumoniae, устойчивых к макролидам.

Для мультилокусного сиквенс-типирования (MLST - Multilocus Sequence Typing) отобрано 29 штаммов пневмококков. Результаты приведены в таблице 6.

В результате MLST типирования S. pneumoniae, среди изученных штаммов преобладали пневмококки 81 ССЬ клонального комплекса, распространенного в Южной Африке, Южной Корее и Японии. Эти штаммы содержали два механизма резистентности к макролидным антибиотикам и, кроме того, были устойчивы к пенициллину и тетрациклину.

Таблица 6.

Результаты MLST тнпирования штаммов S. pneumoniae, устойчивых к

макролидным антибиотикам

Кол-во Генотип штаммов Серотип Клональные комплексы ССЬ STa

15 erm(B)+meftE) - 14 шт е/тл(В)+/иеД?) - I шт 23 F (10 шт) Не определяли 5шт 81 81

4 егт( В) 6В 315 315

1 егт( В) 14 63 3816

1 егт(В) - 156 790

1 ermiß) - 143

1 егт(В)+шеДЕ) 19F 236

1 теДЕ) 19F 271 651

1 erm(B)+mej[E) - 271

1 - 1012 1012

1 егга(В) 6В new new

1 ега(В) 19А new new

1 erm(B)+meJ{?) - new new

Четыре штамма определились как 315 ССЪ клональный комплекс, который соответствовал Poland 6В-20 АТСС ВАА-612. Эти штаммы

содержали только ти(В)-ген. Три штамма принадлежали 271 ССЬ клональному комплексу, соответствовавшему Taiwan 19F-14 АТСС 700905.

Метод молекулярного типирования позволяет оценить клональное родство микроорганизмов и решать задачи глобальной эпидемиологии, затрагивающие значительные ареалы распространения или всю популяцию в целом. Сравнение полученных данных между собой, выяснение эволюционных связей между штаммами, их генетического расстояния производится с использованием специализированного программного обеспечения и международной базы. Это необходимо для наблюдения за миграцией отдельных достаточно стабильных клонов, которые могут претерпевать на региональном уровне изменчивость, сопровождающуюся приобретением дополнительных маркеров устойчивости или/и утратой отдельных их детерминант.

Выводы

1. Наибольший уровень резистентности к макролидным антибиотикам среди S. pneumoniae на территории Российской Федерации был отмечен в Москве в 2007 г (14,6%), а среди S.pyogenes в 2005 г в Иркутске (41.2%). Разнонаправленный характер динамики и частоты распространения устойчивых штаммов в отдельных регионах не позволяет использовать усредненные данные для оптимизации терапии на этих территориях. Тенденция к увеличению распространения резистентных штаммов, требует постоянного мониторинга за чувствительностью микроорганизмов.

2. Разработан метод дифференцировки те/- генов на подклассы, основанный на детекции нуклеотидных последовательностей в трех точках полиморфизма в реакции термоциклического достраивания праймеров и последующей масс-спектрометрической детекцией продуктов амплификации.

3. Выявлено, что у штаммов S.pneumoniae ведущими механизмами устойчивости были: рибосомальное метилирование, опосредованное егт(В) геном и сочетание метилирования (присутствие егт(Ъ) гена) с активным выведением лекарственного вещества, связанное с наличием meß, Е) гена. Распространенность штаммов S.pneumoniae с изолированным егт(В) геном - 39% и штаммов, содержащих одновременно егт{В) и mefiE) гены - 31%. В последние годы отмечено нарастание частоты выделения штаммов S.pneumoniae, несущих одновременно два гена, что увеличивает уровень резистентности микроорганизмов.

4. Ведущим механизмом устойчивости к макролидам у штаммов S.pyogenes был эффлюкс, опосредованный ягеД1)-геиом. У единичных штаммов обнаружены егт(А) и егт(В) -гены либо в изолированном виде, либо в комбинации с различными /яе/-генами. Поэтому 16-членные макролиды и линкозамиды имеют явное преимущество перед 14- и 15-членными макролидами в лечении инфекций, вызванных штаммами S.pyogenes.

5. Установлено, что макролид-резистентные штаммы 5. pneumoniae, обладавшие ассоциированной устойчивостью к бета-лактамным антибиотикам, принадлежали к международно-распространенным клональным комплексам СС81, СС271 и СС315. Подобные штаммы пневмококков распространены в странах Юго-Восточной Азии и Европы.

Практические рекомендации

Результаты изучения генетических механизмов устойчивости стрептококков к макролидным антибиотикам существенно дополняют данные о распространении резистентных штаммов, выявленных фенотипическими методами, что позволило сделать ряд практически важных выводов.

Невысокий уровень резистентности Б.рпеитотае к макролидным антибиотикам в регионах Российской Федерации (за исключением г.Москвы) позволяет рассматривать макролидные антибиотики как средства эмпирической терапии пневмококковых инфекций в тех случаях, когда по тем или иным причинам применение бета-лактамов является невозможным или нежелательным.

В г.Москве ситуация несколько сложнее в связи с наблюдающейся тенденцией к росту устойчивости штаммов Б.рпеитотае к макролидным антибиотикам. Для принятия решения о возможности использования макролидов в качестве средств эмпирической терапии необходимо наблюдение за чувствительностью штаммов З.рпеитотае к данному классу антибактериальных препаратов. Следует также отметить, что поскольку основными механизмами резистентности к макролидам у Б.рпеитотае является экспрессия егт генов либо в качестве единственной детерминанты, либо совместно те/генами, 16-членные макролиды и линкозамиды не будут иметь существенных преимуществ перед 14- и 15-членными макролидами.

Роль макролидов как средств эмпирической терапии инфекций, вызванных З.руодепея более определенна. Практически во всех регионах уровень устойчивости этих бактерий к макролидам колеблется в пределах 3% - 17%, однако поскольку ведущим механизмом резистентности является эффлюкс (в 90% случаев), 16-членные макролиды и линкозамиды обладают явным преимуществом в сравнении с 14- и 15-членными антибиотиками и могут рассматриваться как надежные средства эмпирической терапии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Дворецкий Л.И. Левофлоксацин и макролиды при обострении хронического бронхита. Результаты длительного мониторинга больных / Л.И.Дворецкий, Н.В.Дубровская, С.А.Грудинина, О.Ю.Филимонова, С.В.Сидоренко, С.В.Яковлев // Инфекции и антимикробная терапия-2005.-Том 7- №1, С. 18-26

2. Дворецкий Л.И. Клинико-микробиологический мониторинг больных с обострением хронического бронхита, леченного антибактериальными препаратами / Л.И.Дворецкий, Н.В.Дубровская, С.А.Грудинина, О.Ю.Филнмонова, С.В.Яковлев, Е.В.Сергеева, С.В.Сидоренко // Терапевтический архив-2006-Том 78-№3, С. 25-35

3. Дворецкий Л.И. Левофлоксацин и макролиды при обострении хронического бронхита: сравнительный анализ эффективности лечения и длительности безрецидивного периода / Л.И.Дворецкий, Н.В.Дубровская, С.А.Грудинина, О.Ю.Филимонова, С.В.Сидоренко, С.В.Яковлев // Антибиотики и химиотерапия-2007, 52; 7—8, С.21-31

4. Дубровская Н.В. Респираторные фторхинолоны, защищенные пенициллины и макролиды в лечении обострений хронического бронхита (ХБ) и хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) / Н.В.Дубровская, Л.И.Дворецкий, С.В.Яковлев, С.А.Грудинина, О.Ю.Филимонова, С.В.Сидоренко. // Сборник материалов VII Российской конференции «Современные проблемы антимикробной химиотерапии» - 2005- С. 22

5. Малахова М.В. Применение метода MALDI-ToF масс-спектрометрии для анализа генетически детерминированной устойчивости Streptococcus pneumoniae к фторхинолонам / М.В.Малахова,

B.А.Верещагин, Е.Н.Ильина, В.М.Говорун, О.Ю.Филимонова,

C.А.Грудинина, С.В.Сидоренко // Антибиотики и химиотерапия-2007, 52, 1—2, С.10-17

6. СавиноваТ.А. Генетическое разнообразие пенициллин-устойчивых Streptococcus pneumoniae / О.Ю.Филнмонова, С.А.Грудинина, С.В.Сидоренко // Журнал инфектологии-2010, Т.1, № 4, С. 66-71.

7. Филимонова О.Ю. Антибиотикорезистентность Haemophilus influenzae, выделенных в 2002-2004гг. в г.Москва / Филимонова О.Ю., Грудинина С.А., Катосова Л.К., Столярова Л.Г., Фатова М.А., Дубровская Н.В. // Антибиотики и химиотерапия-2004.-№12, С. 14-20

8. Филимонова О.Ю. Метод MALDI-tof масс-спектро-метрической дифференцировки mef генов стрептококков / Филимонова О.Ю., Савинова Т.А., Солдатова С.И., Круглов А.Н., Ильина E.H., Сидоренко С.В. // Материалы И Ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням -Москва-2010, С.340-341

9. Grudinina S.A. Surveillance of antibacterial resistance in major pathogens of community-acquired respiratory tract infections in Moscow, Russia, 2004 /

S.A.Grudinina, O.Y.Filimonova, S.V.Sidorenko//15 European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases -Copenhagen-April 2-5, 2005.-P1776- P. 585

10. Grudinina S.A. High prevalence of erm(B)/mef(A) positive isolates among macrolide resistant Streptococcus pneumoniae in Russia / S. Grudinina, E. Ilina, O. Filimonova, A. AI-Lahham, M. Malakhova, L. Stolyarova, S. Sidorenko, R. Reinert. // European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases -Germany, Aachen -2006.-P.1191

U. Grudinina S.A. Characterization of macrolide resistant Streptococcus pneumoniae isolates from Russia / S.A Grudinina, O.Y Filimonova, E.N.Ilina, A.Al-Lahham, M.V.Malachova, L.G.Stolyarova, S.V.Sidorenko, R.R.Reinert // Nice, ESCMID, European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases -Germany, Aachen -2006.-P.1190

12. Grudinina S.A. Mass-spectrometric Discrimination of mej[A), mefiE) and mej[l) Genes and their Prevalence among Macrolide-Resistant Streptococcus pneumoniae (Spn) Isolates from Russia / S.A Grudinina, O.Y.Filimonova, T.A. Savinova, L.G. Stolyarova, E.N.Ilina, L.M.Weigel, S.V.Sidorenko // ICAAC06 Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy -Atlanta, GA-2006.-A-2520-ASM

13. Grudinina S.A. Haemophilus influenzae resistance patterns in Moscow / S.A.Grudinina, O.Y.Filimonova, S.V.Sidorenko. // 5 Eropean Congress of Chemotherapy and Infection. -Rhodes, Greece, October 17-20, 2003. -Mon 135, - P.122

14. Grudinina S.A. Prevalence and Mechanisms of Streptococcus pyogenes Resistance to Macrolides in Moscow, Russia / S.A.Grudinina, O.Y.Filimonova, E.N.Ilina, S.V.Sidorenko. // European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases -Germany, Munchen-2007-April -P.741

15. Reinert R.R. Mechanisms of Macrolide Resistance among Streptococcus pneumoniae Isolates from Russia / R.R.Reinert, O.Y.Filimonova, A.Al-Lahham, S.A.Grudinina, E.N.Ilina, L.M. Weigel, S.V.Sidorenko// Antimicrobial Agents and Chemotherapy-June-2008.- N 6 - P. 2260-2262

16. Rezvan S.P. Antibacterial resistance in respiratory pathogens in Northen Caucasia / S.P.Rezvan, S.A.Grudinina, V.S.Shoukhov, L.G.Stolyarova, O.Y.Filimonova, S.V.Sidorenko. // 5 Eropean Congress of Chemotherapy and Infection. -Rhodes, Greece- October 17-20,2003. -Mon 136, - P.122

Список используемых сокращений

АБП - антибактериальные препараты

БАЛ - бронхоапьвеолярный лаваж

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

дНТФ - дезоксинуклеотидтрифосфат

КОЕ - колониеобразующая единица

МПК - минимальная подавляющая концентрация

МПК50 - минимальная подавляющая концентрация для 50% штаммов

МПК90 - минимальная подавляющая концентрация для 90% штаммов

ПДРФ (RFLP - англ.) - полиморфизм длины рестриктазных фрагментов

п.н. (Ь.р. - англ.) - пар нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

рРНК - рибосомная РНК

Р - резистентный штамм

УР - умереннорезистентный штамм

Ч - чувствительный штамм

егт-гены (erythromycin ribosome methylation) - гены, кодирующие метилтрансферазы, которые взаимодействуя с определенными участками рибосомы приводят к снижению связывания с макролидами, линкозамидами, стрептрогграмином В.

MALD1-TOF MS - Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time Of Flight Mass-Spectrometry (времяпролётная масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбционной ионизацией)

MLS (М-макролид, L-линкозамид, S-стрептограмин) - антимикробная группа препаратов с одинаковым механизмом действия

MLST (Multijocus Sequence Typing) - метод молекулярного типирования mef- гены (macrolide efflux) - гены, ответственные за выведение антибактериального препарата.

CLSI/NCCLS - Clinical Laboratory Standards Institut / National Committee for Clinical Laboratory Standards (Институт по клиническим и лабораторным стандартам, ранее назывался Национальный комитет по клиническим и лабораторным стандартам)

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Филимонова, Ольга Юрьевна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Общая характеристика рода Streptococcus.

1.2. Общая характеристика S.pyogenes.

1.2.1. Эпидемиология.

1.2.2. Патогенез и факторы вирулентности.

1.2.3. Клинические проявления.

1.2.4. Микробиологическая диагностика.

1.3. Общая характеристика не ^-гемолитических стрептококков.

1.4. Общая характеристика Streptococcus pneumoniae.

1.4.1. Эпидемиология.

1.4.2. Патогенез и факторы вирулентности.

1.4.3. Клинические проявления.

1.4.4. Микробиологическая диагностика.

1.5. Антибактериальная терапия стрептококковых инфекций.

1.6. Характеристика макролидных и линкозамидных антибиотиков

1.6.1. Классификация макролидов.

1.6.2.Механизмы действия макролидных, линкозмидных антибиотиков

1.6.3.Резистентность стрептококков к MLS антибиотикам.

1.7. Эпидемиология резистентности к макролидам.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1 Микробиологические исследования'.

2.1.1 Получение материала, выделение, идентификация и хранение стрептококков.

2.1.2 Определение чувствительности к антимикробным препаратам

2.2 Методы обработки данных и статистического анализа.

2.3 Молекулярные исследования.

2.3.1 Выделение тотальной бактериальной ДНК.

2.3.2 Амплификация фрагментов генома.

2.3.3 Детекция продуктов амплификации.

2.3.4 Подготовка продуктов амплификации для дальнейшего анализа

2.3.5 Минисеквенирование.

2.3.6 Очистка продуктов реакций.

2.3.7 MALDI-TOF масс-спектрометрический анализ- продуктов реакций минисеквенирования.

2.3.8 Учет результатов минисеквенирования.

2.3.9 Секвенирование фрагментов генов mef{A), meflE), meßj).

2.3.10 Анализ нуклеотидных последовательностей mef-генов.

Глава 3. Результаты.

3.1 Коллекция образцов клинических штаммов.

3.2 Динамика распространения штаммов S.pneumoniae и S.pyogenes резистентных к макролидам и оценка антибактериальной активности препаратов MLS-группы.

3.3 Разработка метода дифференцировки mef-TQim на подклассы.

3.3.1. Методы дифференцировки те/^гена на подклассы.70'

3.3.2. Разработка метода дифференцировки mef-reнов.

3.3.3 Валидация дифференцировки те/-генов методом минисеквенирования

3.4. Генетические детерминанты резистентности Streptococcus spp. к макролидным антибиотикам.

3.4.1. Генетические детерминанты резистентности у штаммов S.pneumoniae к макролидным антибиотикам.

3.4.2. Генетические детерминанты резистентности у штаммов S.pyogenes к макролидным антибиотикам.

3.4.3. Молекулярное типирование штаммов S.pneumoniae, устойчивых к макролидам.

Глава 4. Обсуждение.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Распространение и молекулярные механизмы резистентности к макролипидным антибактериальным препаратам микроорганизмов рода Streptococus в Российской Федерации"

Респираторные инфекции занимают важное место среди инфекционных заболеваний человека. Примерно 1/3 всех прописываемых антимикробных препаратов приходится на острое бактериальное воспаление верхних дыхательных путей. К ним относят острый ринит, острый синусит, острый отит, острый тонзиллофарингит, острый эпиглоттит, острый ларингит и трахеит [5, 9, 17, 22]. При этом важность проблемы- респираторных инфекций связана не только с их широким и повсеместным распространением, но и с риском развития серьезных осложнений, особенно, у детей раннего возраста [4, 9, 13, 22, 26, 27]. Эмпирический подход к антибиотикотерапии подобных заболеваний в амбулаторных условиях является единственно возможным, по крайней мере, на начальном этапе лечения [3, 13, 14, 18, 22, 25, 28, 35, 37, 42].

Этиология бактериальных инфекций верхних дыхательных путей обусловлена определенными видами микроорганизмов. Наиболее частым возбудителем этих заболеваний является Streptococcus pneumoniae. Среди бактериальных возбудителей острого тонзиллита и фарингита наибольшее значение имеет Streptococcus pyogenes (ß-гемолитический стрептококк группы А) [4, 5, 10, 13, 17, 24, 26, 31, 40]. В последние годы отмечается увеличение частоты случаев синуситов и отитов, вызванных микробными ассоциациями, в том числе зеленящими стрептококками [53].

От грамотного решения врача в выборе средств и методов стартовой терапии зависит самое главное — удастся ли остановить процесс бактериального воспаления на начальной стадии его развития и предупредить развитие осложнений. Имеются существенные различия подходов к выбору средств начальной терапии в разных странах. Это связано с региональными особенностями структуры возбудителей и их чувствительности к антибактериальным препаратам, а также "формулярным" ("протокольным") отношением к системному применению антибактериальных препаратов [2, 3, 11, 12, 13, 14, 22, 25, 30, 36, 37, 42, 62,

63, 67, 68, 80, 95, 96].

Макролиды, а также сходные с ними по механизму действия линкозамиды и стрептограмины, давно' и с успехом* применяются в амбулаторной практике при различных бактериальных инфекциях респираторного тракта. Данные препараты объединены в MLS антимикробную группу (М-макролид, L-линкозамид, S-стрептограмин). При этом появление в 80-е - 90-е годы прошлого века количества новых препаратов этой группы существенно расширило возможности их практического применения.

Спектр действия макролидов, высокая чувствительность к ним пневмотропных возбудителей, а также хорошая переносимость (особенно "новых" макролидов), обуславливают ведущие позиции этих антибиотиков при лечении респираторных инфекций бактериальной этиологии [11, 12, 14, 65,91].

Однако, широкое, а в ряде случаев бесконтрольное и неоправданное использование макролидных антибиотиков при респираторных инфекциях, в том числе и вирусной этиологии (!), привело к появлению среди пневмотропных возбудителей устойчивых штаммов. При этом было установлено, что уровень резистентности микрофлоры к макролидам напрямую зависит от частоты их применения. Так наиболее высокий удельный вес резистентных штаммов S. pneumoniae и S. pyogenes отмечен в тех странах, где макролидные антибиотики традиционно широко используются в клинической практике.

В подавляющем большинстве случаев резистентность микроорганизмов к макролидам является перекрестной среди, всех 14- и 15-членных препаратов. Исключение составляют 16-членные макролиды, которые сохраняют эффективность по отношению к пенициллин- и эритромицин-резистентным пневмококкам, а также эритромицин-резистентным пиогенным стрептококкам [18, 19, 49, 50, 70, 79, 83, 85, 88, 99, 112, 118, 126].

Цель и задачи исследования

Оценить с помощью* современных фенотипических и молекулярно-генетических методов динамику распространения штаммов Б.рпеитотае и S.pyogenes резистентных к макролидным антибиотикам, выделенных от больных с внебольничными респираторными инфекциями, и расшифровать молекулярные механизмы устойчивости.

Для достижения поставленной цели были определены основные задачи:

1. Оценить динамику распространения устойчивости к макролидным антибиотикам среди штаммов Б.рпеитотае и S.pyogenes, в различных регионах Российской Федерации.

3. Разработать высокопроизводительный метод дифференцировки ;пе/-генов на подклассы, основанный на определении нуклеотидных полиморфизмов в реакции минисеквенирования с последующим масс-спектрометрическим анализом.

4. Оценить клональное родство антибиотикоустойчивых штаммов З.рпеитотае.

Научная новизна работы

В ходе настоящего исследования выявлены значительные различия в динамике распространения и уровне резистентности к макролидным антибиотикам среди З.рпеитотае и S.pyogenes в различных регионах Российской Федерации. Указанные различия обосновывают необходимость разработки региональных рекомендаций по применению макролидов для эмпирической терапии инфекций дыхательных путей.

Проведенный мониторинг чувствительности к антибактериальным препаратам у 2944 клинических штаммов Б.рпеитотае и Spyogen.es, выделенных от больных с респираторными инфекциями показал, что характер динамики распространения изолятов, устойчивых к макролидным антибактериальным препаратам, а также абсолютные показатели уровня' резистентности в отдельных регионах РФ существенно различаются.

С помощью ПНР проведена детекция генов резистентности у штаммов, стрептококков, проявляющих фенотипическую устойчивость к макролидным антибиотикам. Выявлено, что ведущими механизмами устойчивости у штаммов S.pneumoniae были: рибосомальное метилирование, кодируемое егш(В)-геном и сочетание метилирования (присутствие ermiß) гена) с активным выведением лекарственного вещества, связанное с наличием те/ гена. В последние годы отмечено нарастание частоты выделения штаммов S.pneumoniae, несущих одновременно два гена, что увеличивает уровень резистентности микроорганизмов. Ведущим механизмом устойчивости к макролидам у штаммов S.pyogenes был эффлюкс, опосредованный же/^геном.

Разработан высокопроизводительный метод дифференцировки те^гена на подклассы, основанный на MÄLDI-TOF масс-спектрометрии продуктов амплификации, полученных с помощью термоциклического достраивания праймеров с участием дезокси- и дидезоксинуклеотид-трифосфатов.

Впервые, с помощью разработанного метода, была проведена дифференцировка /ие/^-генов на подклассы теДА), meflß) и meßj) у штаммов S.pneumoniae и S.pyogenes.

Проведено мультилокусное сиквенс-типирование макролид-резистентных штаммов S.pneumoniae, обладающих ассоциированной устойчивостью к бета-лактамным антибиотикам. Установлено, что они принадлежат к международно-распространенным клональным комплексам СС81, СС271 и СС315.

Практическая значимость

Собрана уникальная коллекция-клинических штаммов S.pneumoniae и S.pyogenes, выделенных от больных с внебольничными респираторными инфекциями в различных регионах РФ, позволяющая проводить многоплановые исследования с целью оценки динамики изменения антибиотикочувствительности и перспективности, использования- новых групп антибактериальных препаратов.

Полученные данные о динамике^ распространения- штаммов Б.рпеитотае и З.руо^епез резистентных к макролидным антибиотикам в различных регионах. России могут быть использованы для оптимизации-антибактериальной терапии респираторных инфекций.

Создан банк ДНК клинических изолятов Зрпеитотае и Spyogenes, устойчивых к макролидным антибактериальным препаратам, который можно использовать в дальнейших работах по прогнозированию распространения резистентных штаммов и в исследованиях, направленных на изучение молекулярно-генетических механизмов их передачи.

Разработанный высокопроизводительный метод выявления нуклеотидных полиморфизмов для дифференцировки те/ генов расширяет возможности лабораторий лечебно-профилактических учреждений по наблюдению за динамикой распространения детерминант устойчивости к макролидным антибиотикам и повышает эффективность методов идентификации, генотипирования и определения генетических маркеров лекарственной устойчивости микроорганизмов.

Внедрение результатов в практику

Материалы диссертации используются на теоретических семинарах сертификационных циклов усовершенствования врачей на кафедре микробиологии ГОУ ДПО РМАПО.

Нуклеотидные последовательности различных подклассов те/ генов, обнаруженных у штаммов Б.рпеитотае, внесены в международную базу ОепВапк http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ (ЕШ86997, ЕШ86999, Е11486995, ЕИ487001).

Практические рекомендации

Невысокий- уровень резистентности S-.pneumoniae к; макролидным антибиотикам в регионах Российской Федерации (за исключением г.Москвы) позволяет рассматривать макролидные антибиотики; как: средства эмпирической терапии» пневмококковых инфекций в тех случаях, когда по тем или иным причинам применение бета-лактамовг является невозможным1 или нежелательным.

В г.Москве ситуация несколько сложнее в связи с наблюдающейся тенденцией к росту устойчивости штаммов Stpneumoniae к макролидным антибиотикам. Для принятия решения- о возможности использования макролидов в качестве средств эмпирической? терапии необходимо наблюдение за чувствительностью штаммов; S.pneumoniae к данному классу антибактериальных препаратов. Следует также отметить, что -поскольку основными механизмами резистентности к макролидам у S.pneumoniae является экспрессия ermгенов либо в качестве единственной детерминанты, либо совместно с mef генами, 16-членные макролиды и линкозамиды не будут иметь существенных преимуществ перед 14- и 15-членными макролидами.

Роль макролидов как средств эмпирической терапии инфекций, вызванных S.pyogenes более определенна. Практически; во всех регионах уровень устойчивости этих бактерий к макролидами колеблется в пределах 3% - 17%, однако; поскольку ведущим механизмом резистентности: является* эффлюкс:(в 90%;случаев),. 16-членные:макролиды и линкозамиды обладают явным преимуществом в сравнении с, 14- и, 15-членными антибиотиками: и могут рассматриваться как надежные средства эмпирической! терапии;.

Положения, выносимые на защиту 1. Динамика распространения, штаммов S.pneumoniae и S.pyogenes резистентных к макролидным антибиотикам в различных регионах

Российской Федерации носит разнонаправленный характер, а ее уровень варьирует в широких пределах.

2. Ведущие механизмы устойчивости к макролидным антибиотикам у штаммов S.pneumoniae и S.pyogenes различаются. У штаммов Spneumoniae устойчивость связана либо с генами егт(В), либо с наличием генов erm{ß) и mef одновременно. У штаммов S.pyogenes устойчивость связана, в основном с mef генами.

3. Распространенные среди Streptococcus spp. mef гены отличаются значительным разнообразием. Среди S.pneumoniae превалируют гены mef(E) подкласса, среди S.pyogenes - mef I) подкласса.

Апробация работы

Основные результаты исследований представлены и доложены на VII-й Российской научно-практической конференции «Современные проблемы антимикробной химиотерапии» (Москва, 2006), Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным болезням (Копенгаген, 2005), Международной конференции по антимикробным препаратам и химиотерапии (Сан-Франциско, 2006), конференции Европейского общества химиотерапии (Ахен, 2006), Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным болезням (Мюнхен, 2007), П-м Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2010).

Публикация научных исследований

По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, в том числе 5 статей, опубликованны в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 2 статьи в периодической печати, 9 - в материалах конференций.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Филимонова, Ольга Юрьевна

Выводы

2. Разработан метод дифференцировки гае/-генов на подклассы, основанный на детекции нуклеотидных последовательностей в трех точках полиморфизма в реакции термоциклического достраивания праймеров и последующей масс-спектрометрической детекцией продуктов амплификации.

3. Выявлено, что у штаммов S.pneumoniae ведущими механизмами устойчивости были: рибосомальное метилирование, опосредованное егт{В) геном и сочетание метилирования (присутствие егт{В) гена) с активным выведением лекарственного вещества, связанное с наличием meß Е) гена. Распространенность штаммов Spneumoniae с изолированным егт(В) геном - 39% и штаммов, содержащих одновременно егт{В) и meßЕ) гены - 31 %. В последние годы отмечено нарастание частоты выделения штаммов Spneumoniae, несущих одновременно два гена, что увеличивает уровень резистентности микроорганизмов.

4. Ведущим механизмом устойчивости к макролидам у штаммов S.pyogenes был эффлюкс, опосредованный гае/(1)-геном. У единичных штаммов обнаружены егт{А) и егт(В) -гены либо в изолированном виде, либо в комбинации с различными те/-генами. Поэтому 16-членные макролиды и линкозамиды имеют явное преимущество перед

14- и 15-членными макролидами в лечении инфекций, вызванных штаммами S.pyogenes. 5. Установлено, что макролид-резистентные штаммы S. pneumoniae, обладавшие ассоциированной устойчивостью к бета-лактамным антибиотикам, принадлежали к международно-распространенным клональным комплексам СС81, СС271 и СС315. Подобные штаммы пневмококков распространены в странах Юго-Восточной Азии и Европы.

Заключение

Результаты изучения генетических механизмов устойчивости стрептококков к макролидным антибиотикам существенно дополнили, данные о распространении фенотипической устойчивости и позволили сделать ряд практически важных выводов.

Невысокий уровень резистентности S. pneumoniae к макролидным антибиотикам в регионах Российской Федерации (за исключением г.Москвы) позволяет рассматривать макролидные антибиотики как средства эмпирической терапии пневмококковых инфекций в тех случаях, когда по тем или иным причинам применение бета-лактамов является невозможным или нежелательным.

В г.Москве ситуация несколько сложнее в связи с наблюдающейся устойчивой тенденцией к росту устойчивости. Для принятия решения о возможности использования макролидов в качестве средств эмпирической терапии необходимо тщательное наблюдение за динамикой устойчивости. Следует также отметить, что поскольку основными механизмами резистентности является экспрессия егт генов либо в качестве единственной детерминанты, либо совместно mef генами, 16-членные макролиды и линкозамиды не будут иметь существенных преимуществ.

Роль макролидов как средств эмпирической терапии инфекций, вызванных S.pyogenes более определенна. Во всех регионах кроме г.Иркутска уровень устойчивости этих бактерий к макролидам колеблется в пределах 3% - 17%, однако поскольку ведущим механизмом резистентности является эффлюкс (в 90% случаев), 16-членные макролиды и линкозамиды обладают явным, преимуществом в сравнении, с 14- и 15-членными антибиотикам и могут рассматриваться как надежные средства эмпирической терапии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Филимонова, Ольга Юрьевна, Москва

1. Андреева И.В., Беденков А.В., Веселов А.В., Галкин Д.В., Дехнич А.В. и др. // Справочник по антимикробной терапии / Под редакцией Страчунского Л.С. Дехнича А.В. Смоленск. - 2006. - С.280-281.

2. Белоусов Ю:Б., Володин П.Н., Андреева И.В. Применение антиинфекционных химиопрепаратов у детей // Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии / Под редакцией Страчунского Л.С., Белоусова Ю.Б., Козлова С.Н. Москва. - 2002. - С.ЗЗ 1-339.

3. Балясинская Г.Л., Богомильский М.Р. и совр. Местная антибиотикотерапия заболеваний верхних дыхательных путей у детей // Пробл. Педиатрии, Москва. -2002. Том 1, №3. -С.85-91.

4. Белошицкий Г.В., Королева И.С., Чистякова Г.Г. Эпидемиологические особенности менингитов // Эпидемиология и инфекционные болезни. -2005. -№ 3. С.28-30.

5. Белов Б.С., Наносова В.А., Гришаева Т.П. Ревматологические аспекты стрептококкового тонзиллита // Институт ревматологии РАМН. Москва. -2003.-35стр.

6. Брико Н.И., Ешина А.С., Ряпис JLA. Лабораторная диагностика стрептококковых инфекций // Пособие для врачей и научных сотрудников. -Москва. 2000. - 72стр.

7. Генодиагностика бактериальных менингитов и генотипирование их возбудителей. Пособие для врачей. Москва. - 2001. - 47стр.

8. Грубер И.М., Жданова Л.Г., Мохов Ю.В. и др. Физиологические особенности пневмококков // Журнал микробиологии. 1981. - № 12. -С.24-29.

9. Грубер И.М., Нисилевич В.Ф. Использование системы биологических параметров процессов культивирования при сравнительной характеристике различных штаммов Streptococcus pneumoniae. // Журнал Микробиологии. — 1989. № 4. - С.3-6.

10. Зубков М.Н. Эпидемиология внебольничной пневмонии у детей // Материалы совещания экспертов "Внебольничная пневмония". Москва. -2005.-С.17.

11. Иванов И., Ершов Г., Барский В., Бельговский А., Кириллов Е., Крейндлин Э., Паринов С., Мологина И., и Мирзабеков А. Диагностика генетическихмутаций на олигонуклеотидных микрочипах // Молекулярная Биология. — Москва. 1997. - С.159-167.

12. Катосова JI.K. Этиология внеболыгичной пневмонии у детей // Материалы совещания экспертов "Внебольничная пневмония". Москва. - 2005. - С.22.

13. Козлов Р.С. и соавт. Антибиотиокрезистентность Streptococcus pyogenes в России: результаты многоцентрового проспективного исследования ПеГАС-1 // Журнал «Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия». -2005. Том 7, №2. - С. 154-166.

14. Королева И.С., Демина А.А., Платонов А.Е. и др. // Журнал «Эпидемиология и вакцинопрофилактика». 2003. - Том №5. - С.28-30.

15. Крюков А.И., Туровский А.Б. Антибактериальная терапия острого воспаления в оториноларингологии // Журнал «Справочник поликлинического врача». 2005. - Том 3, № 1. - С.25-27.

16. Лопаткин А.С. Антибактериальная терапия при острых инфекциях ЛОР-органов // Российский медицинский журнал. 2004. - Том №2'. - С.3-9.

17. Манеров Ф.К., Паули Б.А., Чернов О.М. и др. Клинические варианты пневмококковой пневмонии, особенности ее течения и исходы // Педиатрия. 1990. - № 3. - С.23-28.

18. Ноников В.Е. Атипичные пневмонии // Журнал «Антибиотики и химиотерапия». 2001. - Том 6. - С.32-37.

19. Поздеев O.K. Медицинская микробиология // Учебное пособие для вузов под редакцией акад. РАМН Покровского В,И. Москва. - 2006. - С.288-296.

20. Покровский В .И1., Брико Н.И., Ряпис JI.A. Стрептококки* и стрептококкозы-Москва. 2006. - 544стр.

21. Рачина С.А. Клиническая фармакология и практическое использование кларитромицина. // Кафедра клинической фармакологии Смоленской государственной медицинской академии / Журнал «Consilium Medicum». — 2006. Том 8, № 3. - С. 15-23.

22. Сидоренко С.В., Гучев И.А. Антибактериальная терапия синусита: современный взгляд на проблему // Журнал «Consilium Medicum». 2004. -Том 6, №1.-С.4-5.

23. Сидоренко С.В., Гучев И.А. Тонзиллофарингит: вопросы диагностики и антибактериальной терапии // Журнал «Consilium Medicum». 2004. - Том 6, №4. - С.8-9.

24. Сидоренко С.В., Колупаев В.Е. Антибиотикограмма: Диско-диффузионный метод. Интерпретация результатов. Москва. - 2003. - 59 стр.

25. Сидоренко С.В, Тишков В.И. Молекулярные основы резистентности к антибиотикам // Успехи биологической химии. — 2004. Том 44. — С.263-306.

26. Скала JI.3., Сидоренко C.B., Нехорошева А.Г., Лукин И.Н., Грудинина С.А. Практические аспекты современной клинической микробиологии Москва. - 2004. - 258 стр.

27. Страчунский Л.С., Каманин Е.И. Антибактериальная терапия инфекций в оториноларингологии // Русский Медицинский Журнал. 1998. - Том 6, №17. - С.38-42.

28. Таточенко В.К., Середа Е.В., Федорова A.M., Катососва Л.К., Самсыгина Г.А. и др. Антибактериальная терапия пневмонии у детей. // Пособие для врачей / Под редакцией Страчунского Л.С.-КМАХ. 2000. - Том 2. - С.7787.

29. Харитонов М.А., Николаев A.B. Антибактериальная терапия инфекций нижних дыхательных путей // Военно-медицинская академия Санкт-Петербург. Россия. - 2004. - С. 102-109.

30. Цыганкова О.И. Бактериальные гемолизины и связь с вирулентностью.-Ставрополь-Медицина. 1988. - 50 стр.

31. Черняев А.Л., Чучалин А.Г., Синопальников А.И., Чернеховская E.H. Патологическая анатомия и патогенез внебольничных пневмоний // Пневмония. Москва. - 2002. - С.198-217.

32. Яковлев C.B. Рациональная антибактериальная терапия инфекций верхних дыхательных путей: значение системных и местных антибиотикам.-ММА им.И.М.Сеченова. Москва. - 2002. - 193стр.

33. Янов Ю.К. Принципы этиопатогенетической терапии острых синуситов // Методические рекомендации Министерства здравоохранения Российской Федерации.-Санкт-Петербург. 2003. - 223стр.

34. Albrich WC, Monnet DL, Harbarth S. Antibiotic selection pressure and resistance in Streptococcus pneumoniae and Streptococcus pyogenes. // Emerg Infect Dis — 2004.-№10. P.514-517.

35. Alouf, J. E. Streptococcal toxins (streptolysin O, streptolysin S, erythrogenic toxin). // Pharmacol. Ther. 1980. - №11. - P.661-717.

36. Arlet, G., and A. Philippon. 1994. PCR-based approaches for the detection of bacterial resistance, PCR-based diagnostics in infectious diseases. // Blackwell Scientific Publications -Oxford-United Kingdom. 1994. -P.665-687.

37. Betschel S.D., Borgia S.M., Barg N.L., Low D.E., and J. C. De Azavedo. Reduced virulence of group A streptococcal Tn916 mutants that do not produce streptolysin S. // Infect. Immun. 1998. -№66. -P.1671-1679.

38. Bergeron M.G., Ouellette M. Preventing Antibiotic Resistance through Rapid Genotypic Identification of Bacteria and of Their Antibiotic Resistance Genes in the Clinical Microbiology Laboratory // J. Clin. Microbiol. 1998. - №27. -P.2169-2172.

39. Bergman M, Huikko S, Huovinen P, Paakkari P, SeppalaH. Macrolide and azithromycin use are linked to increased macrolide resistance in Streptococcus pneumoniae. // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2006. - №50. -P.3646-3650.

40. Bergman M, Huikko S, Pihlajamaki M, Laippala P, Palva E, Huovinen P, et al. Effect of macrolide consumption on erythromycin resistance in Streptococcus pyogenes in Finland in 1997-2001. // Clin Infect Dis. 2004. - №38. - P.1251-1256.

41. Bryskier A. Viridans group Streptococci: a reservoir of resistant bacteria in oral cavities. // Clin Microbiol Infect. 2002. - № 8. - P.65-72.

42. Cochetti, I., M. Vecchi, et al. Molecular characterization of pneumococci with efflux-mediated erythromycin resistance and identification of a novel rnef gene subclass, nief(I). // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2005. - №49. -P.4999-5006.

43. Cohen, Y. Aujard, P. Bidet et al. Le streptocoque du groupe A. Un patliogene majeur pour la prochaine decennie? // Archives de pediatrie. 2005. - №12. -P.1065-1067.

44. Corne H.W. Klaassen and Johan W.Mouton. Molecular Detection of Macrolide Efflux Gene: To Discriminate or Not To Discriminate between mef(A) and mef(E). // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2005. - №7. - P. 12711278.

45. Courvalin P. Genotypic approach to the study of bacterial resistance to antibiotics // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1991. - № 6. - P.1019-1023.

46. Cresti S, Lattanzi M, Zanchi A et al. Resistance determinants and clonal diversity in group A streptococci collected during a period of increasing macrolideresistance. // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2002. - №46. - P. 1816— 1822.

47. Del Grosso M., Scotto d'Abusco A., Iannelli F., Pozzi G., and Pantosti A. Tn2009, a TnP7(5-like element containing meflE) in Streptococcus pneumoniae. II Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2004. - №48. - P.2037-2042.

48. Del Grosso M, Iannelli F, Messina C, et al. Macrolide efflux genes mef(A) and mef(E) are carried by different genetic elements in Streptococcus pneumoniae. // J. Clin Microbiol. 2002. - №40. - P.774-778.

49. Doern GV, Richter SS, Miller A, et' al. Antimicrobial resistance among Streptococcus pneumoniae in the United States: have we begun to turn the corner on resistance to certain antimicrobial classes? // Clin Infect Dis. 2005. - №41. -P.139-148.

50. Domej W., Floegel E., Tilz G.P., Demel U. Sinn und Unsinn der Antibiotikatherapie respiratorischer Infekte II Internist. 2005. - №46. — P.795-799.

51. Edelstein PH. Pneumococcal resistance to macrolides, lincosamides, ketolides, and streptogramin B agents: molecular mechanisms and resistance phenotypes. // Clin Infect Dis. 2004. - №38. - P.322-327.

52. Egorov A.M., Sidorenko S.V., Grudinina SA. Four-Year Surveillance- of Antibiotic Resistance in Streptococcus pneumoniae in Moscow 2001 // 43rd ICAAC September 14-17. Chicago. - Illinois. - 2003. - abstract. - C2-945.

53. European Antimicrobial Resistance Surveillance System. Ongoing surveillance of S.pneumoniae, S. aureus, E.coli, E.faecium, E.faecalis. // EARSS Annual Report. — 2004.-P.41^9.

54. Farrell DJ, Doutliwaite S, Morrissey I-, et al. Macrolide resistance by ribosomal mutation in clinical isolates of Streptococcus pneumoniae from the PROTEKT 1999- 2000 study. // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2003. - №47. -P. 1777-1783.

55. Farrell DJ, Jenkins SG, Brown SD, Patel M, Lavin BS, Klugman KP. Emergence and spread of Streptococcus pneumoniae with erm(B) and mef(A) resistance. // Emerg Infect Dis. 2005. -№11.- P.851-858.

56. Farrell DJ, Morrissey I, Bakker S, Morris L, Buckridge S, Felmingham D. Molecular epidemiology of multiresistant Streptococcus pneumoniae with both erm(B)- and mef(A)- mediated macrolide resistance. // J Clin Microbiol. 2004. -№42. - P.764-768.

57. Ferretti, J. J., W. M. McShan, D. Ajdic, D. J. Savic, G. Savic, K. Lyon, C. Primeaux et al. Complete genome sequence of an Ml strain of Streptococcus pyogenes. II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. - 2001. -№98. - P.4658-4663.

58. Finkelstein JA, Huang SS, Daniel J, et al. Antibioticresistant Streptococcus pneumoniae in the heptavalent pneumococcal conjugate vaccine era: predictors of carriage in a multicommunity sample. // Pediatrics. 2003. - №112. - P.862-869.

59. Fluit C., Visser M.R., and Schmitz F. Molecular detection of antimicrobial resistance. //J. Clinical Microbiology Reviews.-2001. -№14. -P.836-871.

60. Fujita K, Murono K, Yoshikawa M. Decline of erythromycin resistance of group A Streptococci in Japan. // J. Pediatr Infect Dis. 1994. - №13. - PI075-1083.

61. Gay K., Stephens D.S.,Structure and dissemination of a chromosomal insertionelement encoding macrolade efflux in Streptococcal pneumoniae // J. Infect. Dis. 2001. - №184. - P.56-65.

62. Gherardi> G, Fallico L, Del Grosso M, et al. Antibiotic resistant invasive pneumococcal clones in Italy. // J Clin Microbiol. 2007. - №45. - P.306-312.

63. Giovanetti Eleonora, Brenciani Andrea, Burioni Roberto. A Novel Efflux System in Inducibly Erythrornycin-Resistant Strains of Streptococcus pyogenes // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2002. - P. 3750-3755.

64. Gracia, M., C. Diaz, et al. Antimicrobial susceptibility of Streptococcus pyogenes in Central, Eastern, and Baltic European Countries, 2005 to 2006: the cefditoren surveillance program // Diagn Microbiol Infect Dis. 2009. - №64. - P.52-56.

65. Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Atlanta. - 2006. -abstract. - A-2520. - ASM

66. Guillemot D, Carbon C, Thibult N et al. Macrolide use is associated with macrolide resistant (MRSp) and penicillin resistant (PRSp) Streptococcus pneumoniae. // 40th ICAAC. Toronto. - 2000. - abstract. - 1863. - ASM.

67. Hamilton-Miller JM, Shah S. Comparative in-vitro activity of ketolide HMR 3647 and four macrolides against grampositive cocci of known erythromycin susceptibility status. // J Antimicrob Chemother. 1998. - №41. - C.649-653.

68. Hoban D, Waites K, Felmingham D. Antimicrobial susceptibility of community-acquired respiratory tract pathogens in North America in 1999-2000: findings of the PROTEKT surveillance study // Diagn Microbiol Infect Dis. 2003. - 45. -C.251-259.

69. Isozumi R, Ito Y, Ishida T, et al. Genotypes and related factors reflecting macrolide resistance in pneumococcal pneumonia infections in Japan. // J Clin Microbiol. 2007. - №45. - C. 1440-1446.

70. Jari Jalava* 1, Martti Vaara2 and Pentti Huovinenl. Mutation at the position 2058 of the 23S rRNA as a cause of macrolide resistance in Streptococcus pyogenes. II Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 2004, - №3. - P.202-204.

71. Johnson DM, Stilwell MG, Fritsche TR, Jones RN. Emergence of multidrug-resistant Streptococcus pneumoniae: report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (1999-2003). // Diagn Microbiol Infect Dis. -2006. №56. - C.69-74.

72. Karita D.Ambrose, Rebecca Nisbet, and David S. Stephens. Macrolide Efflux in Streptococcus pneumoniae Is Mediated by a Dual Efflux Pomp (mel and mef) and Is Erythromycin Inducible. // Antimicrobial Agents and Chemotherapy.- 2005. №10. - P.4203^4209.

73. Latini L, Ronchetti MP, Merolla R, et al. Prevalence of mefE, enn and tet(M) genes in Streptococcus pneumoniae strains from Central Italy. // Int J .Antirnicrob Agents. 1999. -№13. -P.29-33.

74. Leclercq R. Mechanisms of Resistance to Macrolides and Lincosamides: Nature of the Resistance Elements and Their Clinical Implications. // Clin. Infect. Dis. 2002. - №34. - P.482^192.

75. Lonks JR, Garau J, Gomez L, et al. Failure of macrolide antibiotic treatment in patients with bacteremia due to erythromycin-resistant Streptococcus pneumoniae. // Clin Infect Dis. 2002. - №35. - P.556-564.

76. Lonks JR, Goldmann DA. Telithroinycin: a ketolide antibiotic for treatment of respiratory tract infections. // Clin Infect Dis. 2005. - №40. - P. 1657-1664.

77. Malbruny B, Nagai K, Coquemont M, Bozdogan B, Andrasevic AT, Hupkova H, et al. Resistance to macrolides in clinical isolates of Streptococcus pyogenes due to ribosomal mutations. // J Antirnicrob Chemother. 2002. - №49. -P.93 5-939.

78. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically // approved standard M7-A7, 7th ed., vol.26.-Clinical Laboratory Standards Institute. CLSI. - Wayne. - PA. - 2006. - 135p.

79. Monaco M, Camilli R, D'Ambrosio F, Del Grosso M, Pantosti A. Evolution of erythromycin resistance in Streptococcus pneumoniae in Italy. // J Antimicrob Chemother. 2005. - №55. - P.256-259.

80. Montagnani, F., L. Stolzuoli, et al. Erythromycin resistance in Streptococcus pyogenes and macrolide consumption in a central Italian region. // Infection. 2009. - №37(4). - P.353-357.

81. Montanari MP, Mingoia M, Cochetti I, Varaldo PE. Phenotypes and genotypes of erythromycin-resistant pneumococci in Italy. // J Clin Microbiol. -2003. -№41. -P.428-431.

82. Murray CJL, Lopez AD. Mortality by cause for eight regions of the world: Global Burden of Disease Study. // Lancet. 1997. -№349. - P.1269-1276.

83. Nordhoff E., Luebbert C., Thiele G., Heiser V. and Lehrach H. Rapid determination of short DNA sequences by the use of MALDI-MS. // Nucleic Acids Research. 2000. - №28. - P.86-92.

84. Perez-Trallero E. Pneumococcal macrolide resistance not a myth. // J Antimicrob Chemother. - 2000. - №45. -P.401-402.

85. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. // Tenth informational supplement M100-S11. National Committee for Clinical Laboratory Standards.-NCCL Wayne,PA. - 2001. - 143p.

86. Persing, D. H., D. A. Relman, and F. C. Tenover. Genotypic detection of antimicrobial resistance. PCR protocols for emerging infectious diseases. // ASM Press-Washington. -D.C.- 1996.-P.33-57.

87. Pililajamaki M, Kotilainen P, Kaurila T, Klaukka T, Palva E, Huovinen P. Macrolide-resistant Streptococcus pneumoniae and use of antimicrobial agents. // Clin Infect Dis. 2001. - №33. - P.483^88.

88. Pitt T.L., Saunders N.A. Molecular bacteriology: a diagnostic tool for the millennium. // J. Clinical. Pathol. 2000. -№53. - P.71-75.

89. Powis J, McGeer A, Green K, et al. In vitro antimicrobial susceptibilities of Streptococcus pneumoniae clinical isolates obtained in Canada in 2002. // Antimicrob Agents Chemother. 2004. - №48. - P.3305-3311.

90. Poulakou G, Katsarolis I, Matthaiopoulou I, et al. Nationwide surveillance of Streptococcus pneumoniae in Greece: patterns of resistance and serotype epidemiology. // Int J Antimicrob Agents. 2007. - №30. - P.87-92.

91. Ramdani-Bouguessa N. Rahal K. Serotype distribution and antimicrobial resistance of Streptococcus pneumoniae isolated in Algiers, Algeria. // Antimicrob Agents Chemother. 2003. - №47. - P.824-826.

92. Reinert RR, Lutticken R, Bryskier A, Al-Lahham A. Macrolide-resistant Streptococcus pneumoniae and Streptococcus pyogenes in the pediatric population in Germany during 2000-2001. // Antimicrob Agents Chemother. 2003. - №47. -P.489- 493.

93. Riedel S, Beekmann SE, Heilmann KP, et al. Antimicrobial use in Europe and antimicrobial resistance in Streptococcus pneumoniae. // Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2007. - № 26. - C.485^190

94. Roberts, M. C., J. Sutcliffe, P. Courvalin, L. B. Jensen, J. Rood, and H. Seppala. Nomenclature for macrolide and macrolide-lincosamidestreptogramin B resistance determinants. // Antimicrob. Agents Chemother. 1999. - №43. -P.2823-2830.

95. Roland Leclercq, and Patrice Courvalin, Resistance to Macrolides and Related Antibiotics in Streptococcus pneumoniae II Antimicrob. Agents Chemother. 2003. - №43. - P.2522-2529.

96. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain terminating inhibitors // Proc. Natl. Academ. Sei. USA. 1977. - №74. - P.5463-5467.

97. Seppala H, Klaukka T, Vuopio-Varkila J et al. The effect of changes in the consumption of macrolide antibiotics on erythromycin resistance in group A Streptococci in Finland. // N Engl J Med. 1997. - №337. - P.441^46.

98. Song JH, Jung SI, Ko KS, et al. High prevalence of antimicrobial resistance among clinical Streptococcus pneumoniae isolates in Asia (an ANSORP study). // Antimicrob Agents Chemother. -2004. -№48. -P.2101-2107.

99. Storm N., Damhofer-Demar B., van den Boom D., Rodi C.P. MALDI-TOF Mass Spectrometry-Based SNP Genotyping./ZMetliods in Molecular Biology. — 2002. №212. - P.241—262.

100. Sutcliffe, J., T. Grebe, A. Tait-Kamradt, and L. Wondrack. Detection of erythromycin-resistant determinants by PCR. // Antimicrob. Agents Chemother.1996. №40. - P.2562-2566.

101. Syrogiannopoulos GA, Grivea IN, Ednie LM, et al. Antimicrobial susceptibility and macrolide resistance inducibility of Streptococcus pneumoniae carrying enn(A), erm(B), or mef(A). // Antimicrob Agents Chemother. 2003. -№47. -P.2699- 2702.

102. Tait-Kamradt A, Davies T, Appelbaum PC, et al. Two new mechanisms of macrolide resistance in clinical strains of Streptococcus pneumoniae from Eastern Europe and North America. // Antimicrob Agents Chemother. 2000. - №44. -P.3395- 3401.

103. Tait-Kamradt, A., J. Clancy, M. Cronan, F. Dib-Hajj, L. Wondrack, W. Yuan, and J. Sutcliffe. 1997. mefE is necessary for the erythromycin-resistant M phenotype in Streptococcus pneumoniae. Antimicrob. // Agents Chemother.1997. -№41. -P.2251-2255.

104. Tenover Bauer F. C., Kirby meet Watson and Crick: antimicrobial susceptibility testing in the molecular era // ASM News. 1992. - Vol.58. .-P.669-672.

105. Tiemei Z, Xiangqun F, Youning L. Resistance phenotypes and genotypes of erythromycin-resistant Streptococcus pneumoniae isolates in Beijing and

106. Shenyang, China. // Antimicrob Agents Chemother. 2004. - №48. - P.4040-4041.

107. Vester B., Douthwaite S. Macrolide Resistance Conferred by Base Substitutions in 23 S rRNA. // Antimicrob. Agents Chemother. 2001. - №45. -P.l-12.

108. Wierzbowski AK, Swedlo D, Boyd D, et al. Molecular epidemiology and prevalence of macrolide efflux genes mef(A) and mef(E) in Streptococcus pneumoniae obtained in Canada from 1997 to 2002. // Antimicrob Agents Chemother. 2005. - №49. - P.1257-1261.

109. Weisblum B. Erythromycin resistance by ribosome modification. // Antimicrob .Agents Chemother. 1995. - №39. - P.577-85.

110. Woodford, N., Sundsfjord, A. Molecular detection of antibiotic resistance: when and where? // J Antimicrob Chemother. 2005. - №56. - P.259-261.

111. Zhanel GG, Dueck M, Hoban DJ, et al. Review of macrolides and ketolides: focus on respiratory tract infections. // Drugs. 2001. - №61. - P.443-498.

Информация о работе

Филимонова, Ольга Юрьевна
кандидата медицинских наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Распространение и молекулярные механизмы резистентности к макролипидным антибактериальным препаратам микроорганизмов рода Streptococus в Российской Федерации - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы