Идентификация специфичных маркеров для характеристики множественно-устойчивых госпитальных штаммов Enterobacteriaceae

Прямчук, Сергей Дмитриевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Идентификация специфичных маркеров для характеристики множественно-устойчивых госпитальных штаммов Enterobacteriaceae
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация специфичных маркеров для характеристики множественно-устойчивых госпитальных штаммов Enterobacteriaceae"

005003948

ИРЯМЧУК СЕРГЕЙ ДМИТРИЕВИЧ

ИДЕНТИФИКАЦИЯ СПЕЦИФИЧНЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ МНОЖЕСТВЕННО-УСТОЙЧИВЫХ ГОСПИТАЛЬНЫХ ШТАММОВ ЕХТЕИОВЛ СТЕША СЕАЕ

03.02.03 микробиология 03.02.07 генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 8 ДЕК ?011

0боленск-2011

005003948

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Дятлов Иван Алексеевич кандидат биологических наук Фурсова Надежда Константиновна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Михайлова Наталья Александровна доктор биологических наук Игнатов Сергей Георгиевич

Ведущая организация:

Федеральное бюджетное учреждение науки Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора

Защита состоится «26» декабря 2011 года вДч на заседании диссертациониого совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» по адресу: 142279, Московская обл., Серпуховский район, п. Оболенск С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии».

Автореферат разослан «¿^Г*"» ноября 2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Фурсова Н.К.

Общая хараетеристика работы

Актуальность проблемы. Одной из наиболее серьезных проблем современной медицины является стремительный рост числа возбудителей инфекционных заболеваний, как внутрибольничных, так и внебольничных, имеющих множественную лекарственную устойчивость (МЛУ). Неудачи клинического лечения, подъем заболеваемости и смертности, увеличение продолжительности пребывания в стационаре зачастую связаны с инфекциями, вызываемыми такими микроорганизмами (Livermore, 2009). Устойчивость микроорганизмов к антибактериальным препаратам является неизбежным следствием широкого клинического применения антибиотиков. В различные периоды времени, в зависимости от перечня антибиотиков разных функциональных групп, интенсивно используемых в лечебных учреждениях, в популяциях бактериальных патогенов развиваются разные механизмы резистентности к антибактериальбным препаратам и способы распространения генов МЛУ (Wright, 2010). Терапия инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, наиболее часто основывается на использовании бета-лактамных антибиотиков, фторхинолонов и аминогликозидов. Общее потребление антибиотиков за последние годы значительно возросло, а расширенное их использование привело к повышению резистентности к данным классам лекарств. Распространение генов устойчивости к антибактериальным средствам среди возбудителей инфекционных болезней человека и, прежде всего, возбудителей госпитальных инфекций, приняло угрожающий характер (Warren et al, 2008; Козлов, 2000).

Горизонтальный перенос генов посредством плазмид, имеющих мозаичную генетическую структуру, формируемую в результате процессов рекомбинации и транспозиции, является причиной наблюдаемого повсеместно быстрого распространения генов устойчивости к разным классам антибиотиков (Hawkey&Jones, 2009). Фенотип МЛУ у бактерий формируется в результате аккумуляции внутри плазмид или транспозонов генов, обеспечивающих устойчивость к отдельным антибиотикам и/или кодирующих эффлюксные насосы, которые могут удалять из клетки несколько видов лекарств одновременно (Nikaido, 2009).

довательности ДНК, гены или мутации. Поэтому исследования, направленные на увеличение списка генетических детерминант, доступных тестированию, проводятся постоянно и основываются на изучении генотипов бактерий, циркулирующих в настоящее время в конкретном регионе. При этом большое значение приобретают не только детекция генов резистентности как таковых, но также выявление и характеристика молекулярных механизмов их эволюции и распространения (кассеты МЛУ, мобильные генетические элементы, плазми-ды). Такой подход позволяет оценить современную эпидемиологическую ситуацию по распространению антибиотикорезистентности среди популяций бактериальных патогенов, определить молекулярные механизмы природы этой резистентности, прогнозировать ее развитие на будущее и представить клиницистам рекомендации по оптимизации схем лечения определенных типов инфекционных заболеваний (Aminov, 2010).

Цель исследования - выявление и молекулярно-генетическая характеристика маркеров резистентности к антибактериальным препаратам у бактерий семейства Enterobactericiceae, выделенных в стационарах Российской Федерации в 2003-2007 гг.

Задачи исследования:

1. Создание коллекции антибиотикорезистентных госпитальных (но-зокомиальных) штаммов семейства Enterobactericiceae, выделенных в разных регионах РФ в 2003-2007 гг.

2. ПЦР-скрининг нозокомиальных штаммов семейства Enterobacteria-сеае на наличие генов устойчивости к бета-лактамным антибиотикам и антибактериальным средствам других функциональных классов. Анализ распространенности генов устойчивости.

3. Разработка алгоритма идентификации генов 6/йСтх-м, детерминирующих синтез наиболее распространенного типа бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС), с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ),

4. Изучение генетического окружения генов Ыастх-м и определение мобильных генетических элементов, обеспечивающих эпидемическое распространение данных генов.

5. Детекция конъюгативных плазмид и интегронных структур в госпитальных штаммах семейства Enterobacteriaceae.

6. Создание перечня генетических маркеров антибиотикорезистентности для ПЦР-детекции у возбудителей госпитальных инфекций семейства Enterobacteriaceae.

Научная новизна. Проанализирована коллекция МЛУ бактерий семейства Enterobacteriaceae - возбудителей госпитальных инфекций, выделенных в РФ в течение 2003-2007 гг., на наличие генов устойчивости к антибиотикам разных функциональных классов. Выявлено, что в подавляющем большинстве случаев

(75%) устойчивость к этому классу антибиотиков обусловлена продукцией БЛРС СТХ-М типа. Разработан метод ПЦР-ПДРФ анализа для идентификации генов Ыастх-м, позволяющий определить до индивидуального гена 49 генов из 96, а остальные 47 - в составе небольших групп. Изучено генетическое окружение генов 6/астх-м подтипов (кластеров) 1, 2 и 9, выявлено и размещено в базе данных GenBank 46 последоватеотностей, аналогичных ранее описанным и 15 новых вариантов последовательностей. Идентифицирован новый ген ¿/ястх-м-пб и размещен в базах данных GenBank и Lahey. Показано, что гены 6/астх-м локализованы преимущественно на высокомолекулярных конъюгатив-ных плазмидах (>80 т.п.н.), принадлежащих к различным группам несовместимости, в зависимости от кластера фермента: ¡ncF, IncA/C, IncN, Incll и IncL/M— для кластера 1; Incll и IncP - для кластера 2; IncF, IncA/C, IncK, Incll, IncB/O, IncFIA и IncFIB - для кластера 9. Показано, что гены, обеспечивающие устойчивость к другим классам антимикробных веществ (аминогликозидам, сульфаниламидам, хлорамфениколу), часто располагаются на тех же плазмидах, что и гены Ыастк-ы, внутри вариабельных участков интегронов классов 1 и 2. Размещены в базе данных GenBank 43 последовательности интегронных вставок, в том числе новых - 3.

Практическая значимость. Собрана и охарактеризована коллекция штаммов энтеробактерий - возбудителей нозокомиальных инфекций (п=923). Депонированы в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ФБУН ГНЦ ПМБ (Федеральный уровень внедрения) штаммы (п=141), охарактеризованные по уровням и спектрам устойчивости к антибактериальным средствам разных функциональных классов, в том числе штаммы, депонированные в качестве референсных для детекции генов антибиотико-устойчивости (п=33). Созданы электронные каталоги «Нозокомиальные штаммы энтеробактерий, выделенные в России в 2003-2007 гг.» и «Генетические маркеры для изучения антибиотикоустойчивости у энтеробактерий», доступные для использования в научной библиотеке ФБУН ГНЦ ПМБ. Разработаны методические рекомендации «Идентификация генов ЫаСтх-м, детерминирующих устойчивость к цефалоспоринам III-IV поколений, методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов» (Учрежденческий уровень внедрения, 2010 г.) и «Молекулярно-генетические методы выявления генов лекарственной устойчивости в популяциях возбудителей бактериальных инфекций» (Учрежденческий уровень внедрения, 2010 г.). Материалы диссертации используются Пущинским государственным университетом в процессе подготовки магистрантов по специальности 03.02.03 - «микробиология» в курсах «Генетика и молекулярная микробиология микроорганизмов» и «Лекарственная устойчивость микроорганизмов». Размещены в базе данных GenBank 136 последовательностей ДНК генов антибиотикоустойчивости и их генетического окружения, доступные для использования исследователям во всем мире.

Положения, выносимые на защиту:

1. Госпитальные штаммы энтеробактерий, выделенные в различных регионах РФ в 2003-2007 гг., в большом проценте случаев являются носителями генов резистентности к антимикробным препаратам различных функциональных групп одновременно, что определяет их множественную устойчивость.

2. Устойчивость изученных штаммов к бета-лактамным антибиотикам определяется наличием генов бета-лактамаз ТЕМ, SHV, ОХА, АтрС и СТХ-М типов, присутствующих в геномах преимущественно по два (49 % изо-лятов) или три (18 % изолятов) гена в разных сочетаниях.

3. Гены Ыйстх-м ~ превалирующие детерминанты устойчивости к бе-та-лактамам (77 % штаммов) - локализованы преимущественно на высокомолекулярных плазмидах (>80 т.п.н.), имеющих гибридную природу и относящихся к группам несовместимости IncF, IncA/C, Inc UM. Генетическое окружение данных генов включает мобильные генетические элементы ISEcpl, IS26, IS903, or/513 и др., в зависимости от кластера гена и вида микроорганизма.

4. Разработанный алгоритм ПЦР-ПДРФ-анализа позволяет идентифицировать описанные к настоящему времени гены ¿/ястх-м ао индивидуального гена (51 %) или в составе небольших подгрупп (49 %).

5. В геноме нозокомиалыюго штамма Proteus mirabilis, выделенного в Москве в 2005 г., идентифицирован ген ¿/йстх-м-пб (учетный номер в международной базе данных GenBank JF966749; учетный номер в специализированной базе данных Lahey - «СТХ-М-116»), кодирующий ранее не описанный фермент СТХ-М-типа, имеющий гибридную природу.

6. Интегроны классов 1 и 2 играют важную роль в формирование ан-тибиотикоустойчивости к аминогликозидам, хлорамфениколу, эритромицину, сульфаниламидам и др. препаратам у значительной части (38 %) госпитальных штаммов энтеробактерий, выделенных в РФ в 2003-2007 гг.

7. Устойчивости к хинолонам у 23 % штаммов Enterobacter spp. определяется наличием плазмидных генов qnr, сравнительно новым молекулярным механизмом устойчивости к данному классу препаратов.

8. Перечень генетических маркеров для ПЦР-детекции генов резистентности, включающий в себя детерминанты устойчивости к бета-лактамам (13), к аминогликозидам (7), к сульфаниламидам (5), к хинолонам (3), к другим антибактериальным препаратам (4), может обеспечить информативную генетическую характеристику госпитальных штаммов Enterobacteriaceac, циркулирующих в клиниках РФ.

Работа выполнена в лаборатории антимикробных препаратов отдела молекулярной микробиологии ФБУН Г1Щ ПМБ в рамках темы НИР «Исследование генетических структур, ответственных за устойчивость к расширенному спектру антибактериальных средств у возбудителей внутриболыгачных и пищевых инфекций» (20062010 гг.) и международного проекта ISTC#2913/BTEP#61

«Изучение распространенности и молекулярно-генетических механизмов устойчивости грамотрицатсльпых возбудителей нозокомиальных инфекций к бета-лактамным антибиотикам» (2005-2007).

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена лично автором; результаты, описанные в отдельных главах получены в сотрудничестве с к.б.н. Фурсовой Н.К., к.м.н. Абаевым И.В., к.б.н. Кругловым А.Н., н.с. Печерских Э.И., к.б.н. Коробовой О.В., к.б.н. Шишковой Н.А., к.м.н. Анисимовой В.Н., к.б.н. Ковалёвым Ю.П., к.м.н. Асташкиным Е.И., к.б.н. Пачкуновым Д.М., д.в.н., проф. Светочем Э.А., д.м.н., проф. Сидоренко С.В. ид.н.н, проф. Дятловым И.А.

Апробация работы. Основные материалы по теме диссертационной работы были представлены, доложены и обсуждены на 18 российских и международных конференциях: The 16th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Nice, France, April 1-4, 2006; VII Международный Конгресс MAKMAX/ASM по антимикробной терапии. 30 мая - 1 июня 2006 г., Москва; The 2006 NIAID Research Conference, Opatija, Croatia, June 24-30, 2006; The 46th Interscicnce Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, USA, September 27-30, 2006; VII Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ, 3-5 октября 2006 г., Оболенск, Московская обл., Россия; The 17th European Congress on Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID) & 25th International Congress of Chemotherapy (ICC), Munich, Germany, March 31-April 4, 2007; IX Международный конгресс MAKMAX/BSAC по антимикробной терапии. Москва, 30 мая - 1 июня 2007 г.; The 47th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Chicago, IL, USA, September 17-20, 2007; «Молекулярная диагностика-2007». Москва, 28-30 ноября 2007 г.; Всероссийская научная конференция «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний». Санкт-Петербург, 18-19 апреля 2008; The 18th European Congress on Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Barcelona, Spain, April 19-22, 2008; I Оболенская школа-конференция молодых ученых. 22-23 апреля 2008 г.; X Международный конгресс МАКМАХ по антимикробной терапии. Москва, 21-23 мая 2008; The 19th European Congress on Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Helsinki, Finland, May 16-19,2009; The I2th SAC Seminar «Combating Global Infections», Irkutsk, Sept., 21-25, 2009. Международная научная конференция «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями», Санкт-Петербург, 18-20 мая 2010 г.; Первая международная научная-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», Москва, 17-19 ноября 2010 г.; XIII Международный конгресс МАКМАХ по антимикробной терапии. Москва, 18-20 мая 2011.

Публикации. Основное содержание работы отражено в 22 публикациях, в том числе в трех научных работах, опубликованных в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, выводы и указатель литературы, включающий 145 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 46 рисунками и 20 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Две коллекции независимо полученных нозокомиальных изолятов ЕШегоЬаМепасеае собраны в 2003-2004 гг. (п=489) из разнопрофильных стационаров 15 городов РФ: Владивосток (п=15), Воронеж (п=12), Екатеринбург (п=14), Иркутск (п=80), Казань (п=7), Краснодар (п=37), Магнитогорск (п=3), Москва (п=91). Омск (п=48), Ростов-на-Дону (п=7), Санкт-Петербург (п=70), Саратов (п=22), Томск (п=28), Уфа (п=6) и Ярославль (п=49) (рис. 1); а также в 2005-2007 гг. (п=434) из 12 разнопрофильных клиник Московской медицинской академии (ММА) им. И.М. Сеченова: общей хирургии, гнойной хирургии, кардиохирургии, урологии, гинекологии, челюстно-лицевой хирургии, отделения патологии новорожденных, ЛОР, нефрологии, отделений интенсивной терапии терапевтических клиник (рис. 1).

"* / ' Г ■ - ;.....

Рисунок 1 - Карта Российской Федерации, на которой представлено количество госпитальных штаммов, выделенных в различных городах в 2003-2007 гг.

Видовую принадлежность изолятов проводили с помощью идентификационной системы BBL Crystal™ E/NF (Becton, Dickinson, США) и коммерческих панелей в автоматической системе идентификации MicroScan (DadeBehring, США). Штаммы микроорганизмов отобраны в коллекцию в соответствии со следующими критериями: 1) устойчивость к одному или нескольким цефалос-поринам III-IV поколений; 2) положительный тест на наличие бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС). Бактериальные культуры хранили в 20 %-ном глицерине при -70 °С.

Минимальные подавляющие концентрации (МПК) антибиотиков аз-треонама, амикацина, ампициллина, ампициллин-сульбактама, гентамицина,

доксициклина, имипенема, ко-тримоксазола, меропенема, хлорамфеникола, це-фепима, цефоперазона, цефоперазон-сульбактама, цефуроксима, цефокситина, цсфотаксима, цефтазидима, цефтазидим-клавуланата и ципрофлоксацина (Merck, США) определяли в соответствии с указаниями Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (CCLS/CLSI. 2006), рекомендациями European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (ttp://ww\v.eucast.org) и с методическими указаниями Роспотребнадзора РФ (Методические указания, 2004). В качестве внутренних стандартов использовали чувствительный штамм Е. coli АТСС 25922 и высокоустойчивый штамм Е. coli АТСС 35218.

Определение генов устойчивости, а также IS-элементов, транспозонов и интегронов проводили с помощью специфических праймеров. В качестве матрицы ДНК использовали кипяченые лизаты. Амплификацию ДНК проводили в 25 мкл смеси, содержащей 75 mM Tris-HCl (pH 8.8), 20 тМ (NH4)2S04, 0,01% Tween 20, 1,5 тМ MgCl2, 200 цМ каждого dNTPs, 0,5 цМ каждого праймера, 0,7 единиц активности Гад-полимеразы (Fermentas, Литва), и 2 мкл матричной ДНК. Амплификацию проводили в приборе GradientPalmCycler (Corbert Research, Австралия) в следующих условиях: начальная денатурация при 95 °С в течение 2 мин; последующие 30 циклов: денатурация при 95 °С в течение 30 с; отжиг при 51-60 СС, в зависимости от используемых праймеров, элонгация при 72 °С в течение 30 с-2 мин, в зависимости от длины амплифицируемого фрагмента, заключительная элонгация при 72 °С в течение 10 мин. Визуализацию ПЦР-продуктов проводили с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле на оборудовании Sub-Cell GT (BioRad, США), окрашивания раствором бромистого этидия и фотографирования на приборе Gel Doc XR System 170-8170 (Bio-RAD, США) в УФ свете с длиной волны 254 нм.

Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) ПЦР-продуктов осуществляли с использованием 26 рестрикционных эндонуклеаз Alul, Avail, Bbvl, BsaHI, BsrBI, BsrDI, Bspl286I, BstXI, CviJI, Ddel, EcoRII, Hinfl, HphI, Hpy99I, Hpyl88I, Hpyl88III, Ksp632I, Maell, Merl, MspAlI, MstI, Mwol, Piel, Sfcl, SimI, Sthl32I (Fermentas, Литва).

Секвенирование последовательностей ДНК проводили на оборудовании ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом на автоматическом секвснаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant (Applied Biosystems, США).

Конъюгативный перенос плазмид из клинических изолятов осуществляли с использованием реципиентного лабораторного штамма Е. coli С600 (Rif*AzR) (Прямчук и др., 2010).

ДНК плазмид выделяли по методу Kado & Liu. (1981). Плазмидные профили штаммов изучали, используя в качестве маркера ДНК плазмид, выделенных из штамма Е. coli К-12 NCTC 50192 (148, 64, 36, 23 и 7 т.п.н).

Гибридизацию ДНК-ДНК осуществляли с помощью высокочувствительного набора реактивов AlkPhos Direct Labeling и детектирующей системы CDP-Star в соответствии с рекомендациями производителя (Amersham, США). ДНК-зонды готовили из ПЦР-продуктов, амплифицированных с генов Ыастх-м и генов intll интеграз 1 класса.

' Группы несовместимости {Ine) плазмид идентифицировали методом ПЦР-типирования по Carattoli А. (2005).

Биоинформатический анализ последовательностей нуклеотидов генов и их рестрикционных карт проводили с помощью программного обеспечения Vector NTI9 (lnvitrogen Corporation, США). Последовательности ДНК сравнивали с представленными в базе данных GenBank с помощью программы BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast).

Учетные номера последовательностей ДНК, секвенированных в ходе данной работы и размещенных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), представлены в табл. 1.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнение нозокомиальных изолитов семейства Enterobacteriaceae, выделенных в РФ в 2003-2004 гг. и в 2005-2007 гг.

Анализ видовой принадлежности клинических изолятов, выделенных в РФ в 2003-2004 гг. и в 2005-2007 гг., показал, что в данных коллекциях преобладали Escherichia coli (34 % и 30 % соответственно), Klebsiella spp. (27 % и 35 %) и Enterobacter spp. (16 % и 22 %). Другие виды энтеробактерий в сумме составляли 23 % и 13 % соответственно. Наиболее часто источниками выделения изолятов в 2003-2004 гг. были: моча, органы дыхания и хирургические раны, а в 2005-2007 гг. - моча, хирургические раны и ЖКТ. При этом основными источниками выделения изолятов Е. coli были моча (49 %), органы дыхания (18 %) и хирургические раны (17 %); изоляты Klebsiella spp. преимущественно выделялись из мочи (38 %), органов дыхания (19 %), хирургических ран (14 %) и желчи (11 %), а изоляты Enterobacter spp. - из мочи (40 %), органов дыхания (18 %), хирургических ран (18 %), желчи (5 %) и внешней среды (5 %).

Анализ уровней устойчивости изолятов к цефалоспоринам 1II-JV поколений с учетом пограничных концентраций цефотаксима (МПК>2 мг/л), цефта-зидима (МПК>8 мг/л) и цефепима (МПК>8 мг/л), опубликованных на сайте EUCAST (http://www.eucast.org/) в 2010 г., показал, что к цефотаксиму устойчивы 100 % Е. coli, 100 % Klebsiella spp. и >92 % Enterobacter spp.; к цефтазидиму - >70 % изолятов всех трех видов энтеробактерий; а к цефепиму - около 75 % Е. coli и Klebsiella spp. и >50 % Enterobacter spp. Многие изоляты проявляли устойчивость к двум и даже трем цефалоспоринам одновременно. Доля именно таких изолятов значительно увеличилась за данный период времени (рис. 2).

Значительная часть изучаемых изолятов проявляла ассоциативную устойчивость к антимикробным препаратам других функциональных классов (не бе-та-лактамам): гентамицину, амикацину, ципрофлоксацину, ко-тримоксазолу и хлорамфениколу. Сравнение фенотипов Е. coli, выделенных в 2003-2004 гг. и в 2005-2007 гг., показало, что доля изолятов, устойчивых к ципрофлоксацину (МПК>4 мг/л) и ко-тримоксазолу (МПК>4 мг/л), в обеих коллекциях одинакова, а изолятов, устойчивых к гентамицину (МПК>16 мг/л), амикацину (МПК>64 мг/л) и хлорамфениколу (МПК>32 мг/л), - несколько выше в первой коллекции (рис. ЗА). Но при этом доля изолятов, высокоустойчивых

(МПК>256 мг/л) к гентамицину и ципрофлоксацину, напротив, во второй коллекции выше, чем в первой (рис. ЗБ).

Сравнение фенотипов Klebsiella spp. показало, что доли устойчивых изоля-тов несколько выше в первой коллекции, чем во второй: к гентамицину, амика-цину и ко-тримоксазолу, но ниже к ципрофлоксацину, и одинаковы - к хлорам-фениколу. Доли изолятов Klebsiella spp., высокоустойчивых (МПК>256 мг/л) к хлорамфениколу и к ципрофлоксацину, в первой коллекции ниже, чем во второй.

Е Е. со Ii 2003-2004 (/1=133)

Я Enterobacter spp. 2005-2007

ctx* caz* cep' ctxtc« caztcep»-^

МПК ^256 >256 5-256 ^256/256 9256/25^ ^56/256 ^|PJ56i256

Рисунок 2 - Доля клинических изолятов Е. coli, Klebsiella spp. и Enterobacter spp., устойчивых (МПК>2/8/8 мг/л) и высокоустойчивых (МПК>256 мг/л) к цефотаксиму (СТХ), цефтази-диму (CAZ) и цефепиму (СЕР), среди изолятов, выделенных в 2003-2004 гг. и в 2005-2007 гг. СТХ* - включая СТХ+СА7., СТХ+СЕР и CTX+CAZ+CEP; CAZ* - включая СТХ+СА7., CAZ+CEP и CTX+CAZ+CEP; СЕР* - включая СТХ+СЕР, CAZ+CEP и CTX+CAZ+CEP.

Ш Е coli 2005-2007 (п=126)

В Klebsiella spp. 2003-2004 (П'131)

1 Klebsiella spp. 2005-2007

(п=146)

IB Enterobacter spp. 2003-2004 <n=77)

S>2/8/8

CTX*

CAZ* ÄS

CEP*

Доли изолятов Enterobacter spp., устойчивых к ряду антибиотиков, во второй коллекции выше, чем в первой: к гентамицину, амикацину и ципрофлоксацину, в то время как для других антибиотиков (хлорамфениколу и ко-тримоксазолу) соотношение обратное. Доля высокоустойчивых изолятов Enterobacter spp. с МПК>256 мг/л в первой коллекции ниже, чем во второй, для всех маркеров ассоциативной устойчивости, кроме хлорамфеникола. Таким образом, для Е. coli и Klebsiella spp. отмечена тенденция к снижению ассоциативной устойчивости, а для Enterobacter spp. - к ее повышению. Аналогично, доля изолятов, одновременно устойчивых к трем классам антибиотиков -цефалоспоринам, амикацину и ципрофлоксацину - (МЛУ-3), а также к пяти классам антибиотиков - цефалоспоринам, амикацину, ципрофлоксацину, хлорамфениколу и ко-тримоксазолу - (МЛУ-5), уменьшилась для Е. coli и Klebsiella spp.,но увеличилась для Enterobacter spp (рис. 2).

% Ml

1# ¡pi Sä ; ft-if

1 ! f г Л Л I

' н 1 ! 11 Ij

Щ 11 A Ii it 1 fll ' 1

1 ..... 1

1 1

1 1 1 ll lit

S64

5>4

5=32

% 80

а е. со// 2003-2004

(п*133)

□ £. со//

2005-2007 (п=126)

Ш Klebsiella spp.

2003-2004 (П=131)

S Klebsiella spp.

2005-2007 (п-146)

Ш Enterobacter spp.

2003-2004 (п=77)

■ Enterobacter spp.

2005-2007 <n=91)

Рисунок 3 - Доля клинических изолятов Е. coli, Klebsiella spp. и Enterobacter spp., устойчивых и высокоустойчивых к гентамицину (GEN), амикацину (AMI) ципрофлоксацину (CIP), хлорамфениколу (СМ) и ко-тримоксазолу (CTZ). МЛУ-3* - устойчивость к трем классам антибиотиков (цефалоспоринам, амикацину и ципрофлоксацину); МЛУ-5* - устойчивость к пяти классам антибиотиков (цефалоспоринам, амикацину, ципрофлоксацину, хлорамфени-колу и ко-тримоксазолу).

Таким образом, анализ видового состава и источников выделения возбудителей нозокомиальных инфекций, а также фенотипов устойчивости данных бактерий к антибактериальным препаратам, используемым в клиниках РФ, указывает на широкое распространение в госпитальных сообществах штаммов, устойчивых к бета-лчктамам и антибиотикам других функциональных групп.

ПЦР-детекция генов антибиотикоустойчивости

Методом ПЦР в геномах изучаемых клинических изолятов показано наличие генов бета-лактамаз, принадлежащих к разным типам ферментов: ТЕМ, SHV, СТХ-М, ОХА и АгпрС (табл. 2). Наибольшее распространение получили гены ¿/ястх-м> присутствующие в 90 % изолятов Е. coli и Klebsiella spp., а также в 40 % Enterobacter spp.

Некоторые изоляты несут по одному из тестируемых генов бета-лактамаз, но большинство - 68% Е. coli , 83 % Klebsiella spp. и 44 % Enterobacter spp. -имеют одновременно два или три гена в разных сочетаниях. Стоит отметить, что ранее, в работе Сидоренко С.В. с соавт. (2004) сообщалось, что в России доля штаммов, имеющих не один, а несколько генов БЛРС разных типов, составляла 40 %, таким образом произошло существенное увеличение данного показателя. Самыми распространенными комбинациями генов в изученных на-

ми клинических изолятах оказались ¿/otem+Wöctx-m для Е. coli (51 %) и ¿/flsHv+ö^cTx-м - Для Klebsiella spp. (39 %), что также значительно превышает аналогичные оценки в исследовании Сидоренко С.В. с соавт. (2004). Именно в данной категории изолятов выявлены два изолята, продуцирующие дополнительно оксациллиназу ОХА-2. Наиболее распространенными комбинациями генов для Enterobacter spp. были ¿/ötem (14 %) и б/ятЕм+б/ястх-м (13 %).

Таблица 2 - Гены бета-лактамаз в геномах энтеробактерий, _ _выделенных в 2003-2007 гг.

Гены Ыа, Количество изолятов, шт. (%)

кодирующие £ coli Klebsiella spp. Enterobacter spp.

бета-лактамазы 2003-2004 2005-2007 2003-2004 2005-2007 2003-2004 2005-2007

п=133 п=126 n=131 n=146 n=77 n=97

ТЕМ 5(4) 3(2) HD Hl) 12(16) 22 (23)

SHV 0 KD 5(4) 2(1) 6(8) 3(3)

СТХ-М 35(26) 42 (33) 14(11) 16(11) 7(9) 5(5)

TEM+SHV 9(7) 0 9(7) 7(5) 10(13) 11(11)

ТЕМ+СТХ-М 70 (53) 63 (50)* 10(8) 2(1) 20 (26) 13(13)

SHV+CTX-M 8(6) 3(2) 44 (34) 65 (45)* 2(3) 5(5)

TEM+SHV+CTX-M 11(8) 11(9) 43 (33) 50 (34) 2(3) 14(14)

Нет генов 6(5) 3(2) 0 3(2) 20 (26) 24 (25)

Всего ТЕМ 84(63) 77 (61) 66 (50) 60 (41) 44 (57) 60 (62)

Всего SHV 28(21) 15(12) 104 (79) 124(85) 18(23) 33 (34)

Всего СТХ-М 113(85) 119(94) 114(87) 133(91) 29(38) 37 (38)

Всего АтрС 0 0 13 0 0 13

DHA 0 0 И 0 0 0

MIR 0 0 2 0 0 11

МОХ 0 0 0 0 0 1

LAT 0 0 0 0 0 1

Интересно отметить, что 26 изолятов (6 %) в первой коллекции и 30 изолятов (7 %) второй коллекции, большинство из которых являлись Enterobacter spp., не имели ни одного из тестируемых генов бета-лактамаз. Очевидно, что устойчивость данных микроорганизмов к бета-лактамам обеспечивается какими-то другими молекулярными механизмами, чем наличие бета-лактамаз. По литературным данным, это могут быть эффлюксные системы, снижение проницаемости мембран за счет мутаций в генах пориновых белков или наличие индуцибельных ферментов AmpC-типа (Fernández-Cuenca F., 2006).

Таким образом, с помощью ПЦР-детекции генов показано, что основным молекулярным механизмом устойчивости к цефалоспоринам III-IVпоколений у изучаемых штаммов энтеробактерий является наличие генов бета-лактамаз СТХ-М-типа.

Разработка алгоритма идентификации генов Ыастх-м

Для идентификации генов, кодирующих ферменты цефалоспориназ СТХ-М, разработан двухэтапный алгоритм ПЦР-ПДРФ-анализа, включающий в себя (1) определение кластера гена с помощью рестриктазы AluI и (2) идентификацию гена внутри кластера с помощью набора из 26 рестриктаз. Ме-

тод позволяет определить 49 генов из 96, размещенных к настоящему времени в базе данных GenBank. Остальные 47 генов определяются в составе небольших подгрупп.

Разработанный алгоритм идентификации генов Ыастх-м использован в ходе молекулярно-эпидемиологического мониторинга генов Ыастх-м в нозокоми-альных изолятах, выделенных в РФ в 2003-2007 гг. Показано, что идентифицированные гены Ыастх-м (п=585) вносят решающий вклад в формирование бактериальных фенотипов устойчивости к цефалоспоринам, они присутствовали в геномах 66 % изолятов (рис. 4).

Идентификация нового гена Wacrx-м-ш

В геноме нозокомиального штамма Proteus mirbilis, выделенного в Москве в 2005 г. от пациента отделения урологии ММА им. И.М. Сеченова, идентифицирован ген 6/йстх-м-иб, кодирующий ранее не описанный фермент СТХ-М-типа. Данный ген идентифицирован методом ПЦР-ПДРФ с последующим сек-венированием, в результате которого было установлено, что он является гибридом между двумя известными ранее генами: ¿/ястх-м-23 и ¿/астх-м-22- Нуклеотид-ная последовательность гена, вместе с расположенной рядом последовательностью мобильного генетического элемента ISEcpl, размещена в международной базе данных GenBank (учетный номер JF966749). Ген Ыастх-м-пе включен в специализированную базу данных по ферментам бета-лактамазам Lahey (http://www.lahey.org/Studies/other.asp).

Изучение генетического окружения генов А/ястх-м

Анализ генетического окружения генов ¿>/аСтх-м показал, что для большинства генов (6/астх-м-з, ¿^стх-м-н и Шстх-м-is) характерно наличие рядом с геном последовательности мобильного генетического элемента (МГЭ) ISEcpl. Характерно, что данный МГЭ располагается «выше» гена бета-лактамазы на расстоянии, характерном для индивидуальных генов: 48 п.н. для ¿/ястх-м-н - (кроме одного изолята Е. coli, у которого данная последовательность равна 45 п.н.); 127 п.н. для б/аегх-м-з; 42 п-п Для ¿/астх-м-м- В некоторых изолятах элемент ISEcpl имеет стандартную структуру, но во многих содержит делеции различной протяженности, а также инсерции других МГЭ в разных ориентациях: IS26, IS], IS10 и resTtú. «Ниже» генов кластера Ыастх-м-i в подавляющем числе изолятов локализована структура or/477-mucA, причем для гена ¿/ястх-м-з их нук-леотидные последовательности в большинстве изолятов не нарушены, а для гена Ыастх-м-15 характерны укороченные варианты - Aor/477-AmucA. В двух изолятах Е. coli «ниже» гена 6/аСТх-м-15 идентифицирована последовательность, имеющая дополнительную вставку: Aorf477-Aorß-AmucA. «Ниже» генов, кодирующих ферменты СТХ-М-14, локализована последовательность элемента IS903, в полноразмерном или укороченном виде (рис. 5).

Enterobacter spp.f16) Klebsiella fipp,(7) E. со Ii (2) Proteus app d)

Klebsiella spp. (242) E. coli (219) Enterobacter spp. (47) Proteus tpp. {13) Citrobacter spp. (9) Morganella morganii (5) Serratia spp. (3) Providentia Stuart» (1) Hafnla afvel (1)

E. iiquefaciens (11 p. mlrabltis <1}

P.stuertH (1)

E. cott (1)

E doaccae (1) Salmonella enterfea (3)

E.coli (2)

E. coli (30) Klebsiella spp. (4) E. doaceaa (1) Я. mirabllis (1)

Рисунок 4 - Результаты идентификации генов, кодирующих бета-лактамазы СТХ-М-типа, в нозокомиальных изолятах бактерий семейства Еп(егоЬас(еггасеае, выделенных в 2003-2007 гг. В скобках после родового или видового названия бактерий указано количество изолятов

Генетическое окружение генов Ыастх-и-г и Ыастх-м-9 принципиально отличается от описанного выше, т.к. названные гены локализованы в структуре IS СЮ элемента, «ниже» интегрона класса 1 и последовательности МГЭ orfil3.

Выявленное разнообразие генетического окружения генов, кодирующих БЛРС СТХ-М-типа в российских клинических изолятах, не противоречит схемам, описанным ранее другими исследователями (Eckert С., et al., 2006), но добавляет новые, ранее не описанные варианты, возникающие в результате рекомбинации и горизонтального переноса.

Таким образом, полученные нами дачные показывают наличие большого генетического разнообразия в участках геномов бактерий семейства Еп-terobacteriaceae, прилегающих к генам Ыастх-м, определяющим высокие уровни устойчивости к цефалоспоринам III-IV поколений. Данное разнообразие, во всей видимости, является отражением эволюционных процессов, проходящих на фоне селективного давления широко применяемых лекарственных средств для лечения инфекционных осложнений в стационарах РФ.

Идентификация генов резистентности, локализованных в интегронах

С помощью ПЦР показано, что изучаемые клинические изоляты имеют детерминанты устойчивости не только к бета-лактамам, но и к аминогликозидам (гены аденилилтрансфераз aadAl, aadA2, aadAS, aadB; аминогликозидацетил-трансфераз aacAA, aac(6')-Ib); сульфаниламидам (гены дигидрофолатредуктаз dfrAl, dfrA5, dfrA12, dfrAlT), хлорамфениколу (ген протонного эффлюксного насоса cmlAl и хлорамфениколацетилтрансферазы catB8), эритромицину (ген эритромицинэстеразы егеА2) и стрептотрицину (ген стрептотрицинацетилазы sail) - в виде генетических кассет в составе интегронных вставок (рис. 6).

Изучение конъюгативных плазмид, несущих гены устойчивости

Конъюгативный перенос генов ö/öctx-m из клеток изучаемых клинических штаммов энтеробактерий в лабораторный реципиентный штамм Е coli С600 (RifÄAzK) был успешно осуществлен для 23 % Е. coli, 27 % Klebsiellaspp., 12% Enterobacter spp. и 44% Citrobacter spp. с эффективностью 10"3-10". Отмечено, что перенос генов кластера Wöctx-m-i в большинстве случаев происходил на одном репликоне с генами 6/ötem- Напротив, перенос генов кластера 6/астх-м-9 чаще всего происходил отдельно от генов 6/ятем- Экспрессия передаваемых конъюгацией генов blacrx-м (оцениваемая по МПК трех антибиотиков: цефотаксима, цефтазидима, цефепима) различалась в донорном и реци-пиентном штаммах. Это выражалось в увеличении МПК в несколько раз (от 4 мг/л до 256 мг/л) цефтазидима (п=17); а также в изменении МПК цефепима -как в сторону снижения (п=6), так и в сторону увеличения (п=6).

Ы?СТХ-М-15

ISEcpl \_ /Aorf477-musfi

1521 876

Ыа.

!стх-м-и

isEtpi \_ / is доз

15'11 " S7S «.56 42

¿19903

........272 _

IS2~е* &

IS26 ________252 _

IS26 <«

153 m

IS26 4S

. .......

его <S56

IS26

......

rcsTh 3 ¿я

700 "

1591 :: ¿ISECpl 48

5« р

48 ..19«

" iSfO '

IS 26

«2

.254

s?o ¿»ISEcpl

530

«Я7,.

JS»o : 1325

.■л;;.'/-- « 42

fc/a

'CTX-M-3

IS!6 A/sa»i\ коЛШ-лмгеЛ

820 222 Й 8?6 127

IS26 ISEcpl \orf433-mucA

1S91

127

IS26 MSEcpl

........

554

127

orf433-mucA

«Э «5

orf433-mucA

Orf433-mucA

егНЗЗ-mticA

127

mill i^ss "

sett

prfSJ

b!aCTX-M-9

fnill >7:,.

фк w

Ыа

'СГХ-М-Z

Рисунок 5 - Генетическое окружение генов ¿/¡зс

Размер

attl , Sill К tOOO n н ПЦР-продуиз П.к.

dfrA 1 aadA1

'TZZZ.T. »'ЯЯф( ГЗГ*5> dfrA17 aadA 5

dfrA12 orfF a ad A 2

bli>OXA-30 aadA 1

aaci$")-lb cmlA1

^aac(6-)-lb I catBS orfD-like orfWS-like

intl1 cfft-AS ere A 2 qaclTl^

745

intt 1 qacE 1 153

attl (

aadB

V-/4 _____---—

5 -CS Генные кассеты 3 -CS aadA 1 aadA2

aac(6')~lb orfD

art/2 5Sibe 5Sfbe intl2 dfrA1 sail aadA1 orfX

2216

Рисунок 6 - Структура интегронных вставок класса 1 (А) и класса 2 (Б)

Сравнение плазмидных профилей доноров и трансконъюгантов показало, что клинические изоляты содержали от одной до двенадцати плазмид различной молекулярной массы (наибольшее количество плазмид отмечено в некоторых изолятах К. pneumoniae), а в клетках трансконъюгантов в подавляющем большинстве случаев определялась только одна, высокомолекулярная плазмида размером 60-160 т.п'.н. С целью типирования конъюгативных плазмид плазмид-ную ДНК гидролизовали рестриктазами BamHI и EcoRI. Определено не менее 10 вариантов плазмид, что хорошо коррелировало с данными ПЦР-анализа на наличие генов интеграз и бета-лактамаз. На основании различий в молекулярных массах, плазмиды были подразделены на несколько групп (А, В, С, D, Е, F, G), а с помощью последующего рестрикционного анализа эндонуклеазами ВатШ и EcoRI - на подгруппы (Al, А2, A3, А4, А5, Аб, А7; Bl, В2/ CI, С2; D1, D2)

С помощью Саузерн-гибридизации со специфичным ДНК-зондом показано, что в большинстве клинических изолятов гены 6/йстх-м и интегроны класса 1 локализованы на высокомолекулярных плазмидах (>80 т.п.н.). На описан-

ных конъюгативных плазмидах локализованы также гены, кодирующие бета-лактамазы ТЕМ-типа (13 % изолятов).

ПЦР-типирование плазмид по группам несовместимости Jnc показало, что конъюгативные плазмиды, присутствующие в клинических изолятах Е. coli, преимущественно принадлежат к группам несовместимости IncF, JncAJC и Incl 1-1у; в изолятах Klebsiella spp. - к /ncL/М и Inc¥, а в изолятах Enterobacter spp. - к IncYVd,, IncLM и /исА/С (рис 7).

Многие конъюгативные плазмиды (38 %) имели гибридную природу, т.е. показывали принадлежность к двум-четырем разным группам несовместимости. Показано, что группы несовместимости плазмид достаточно специфичны для разных аллотипов гена 6/дстх-м: ген ¿/«ctx-m-is чаще ассоциирован с плаз-мидами групп несовместимости IncF, IncL/M и IncA/'C; ген Ыастх-м-з - с плаз-мидами IncL/M; а ген blaCTii-u-u - с плазмидами IncF, lncll-ly и IncAJC.

А 25'; II ...........

ь^стхм-з ь/встх-м-5

(11=11} (п=21 (п=11 1П=1)

Рисунок 7 - 1пс группы конъюгативных плазмид разных видов энтеробактерий (А); 1пс группы плазмид, на которых локализованы гены ¿>/аСтх-м (Б)

Таки.ч образом, полученные нами данные показывают, что гены резистентности к бета-лактамньш антибиотикам и антибактериальным средствам других функциональных классов в нозокомиальных штаммах энтеробактерий локализованы на конъюгативных плазмидах, что обеспечивает их горизонтальное распространение между бактериями. Нами подтверждается отмеченная ранее другими авторами важная роль конъюгативных плазмид в распространении генов лекарственной устойчивости.

Заключение

Представители семейства Enterobacteriaceae играют важнейшую роль в этиологии госпитальных инфекций - они составляют около 20 % среди общего количества возбудителей. В данном исследовании проведено сравнительное изучение изолятов, выделенных в 2003-2004 гг. из крупных городов РФ, и в 2005-2007 гг. - из клиник ММА им. И.М. Сеченова. Показано, что штаммы обеих коллекций устойчивы к бета-лактамам, аминогликозидам, фторхиноло-нам и сульфаниламидам. Большая часть коллекции (89 %) представлена штаммами, одновременно устойчивыми к трем и более классам антибактериальных препаратов. Показано, что геномы штаммов, устойчивых к бета-лактамным антибиотикам, содержат от одного до трех генов различных бета-лактамаз. Наиболее распространенным геном является ген ¿/аСтх-м-15, принадлежащий к кластеру Ыаах-ыл- Генетическое окружение генов, кодирующих бета-лактамазы СТХ-М типа, включает в себя мобильные генетические элементы, набор которых характерен для индивидуальных генов и вида микроорганизма. Показана значительная вариабельность данных последовательностей, что указывает на бурные эволюционные процессы, проходящие в данных участках генома. Подтверждением данного тезиса явилось открытие нового гена й/астх-м-пб, который представляет собой гибрид между генами ¿/астх-м-2з и й/дстх-м-22, и содержит в середине последовательности соге-сайт, в области которого, предположительно, произошла рекомбинация. Показано, что гены ЫаС1Х-ч локализованы преимущественно на высокомолекулярных плазмидах, имеющих гибридную природу и относящихся к группам несовместимости IncF, IncA/C, Inc L/M, и др., специфичным для вида микроорганизма и кластера гена. В ходе работы разработан алгоритм ПЦР-ПДРФ-анализа генов 6/яСтх-М> позволяющий идентифицировать около половины генов до индивидуального гена, а остальные - в составе небольших подгрупп.

Установлено, что устойчивость штаммов к антибиотикам других функциональных классов (не бета-лактамам) в большой степени определяется наличием интегронов классов 1 и 2, которые присутствуют в геномах 38 % изученных штаммов. Интегроны несут генные кассеты устойчивости к аминогликозидам, хлорамфениколу, эритромицину, сульфаниламидам и стрептотрицину. Кроме того, в геномах 23 % энтеробактеров обнаружены детерминанты нового механизма устойчивости к хинолонам - плазмидно-кодируемых генов qnr.

На основании проведенных исследований создан перечень генетических маркеров для ПЦР-детекции генов резистентности в штаммах энтеробактерий, включающий 48 позиций: 13 - к бета-лактамам, 7 - к аминогликозидам, 3 - к хинолонам, 5 - к сульфаниламидам, 4 - к другим антибактериальным препаратам.

Выводы

1. Создана и охарактеризована коллекция госпитальных штаммов (п=923) семейства Enterobacteriaceae, выделенных в РФ в 2003-2007 гг., в которой 99 % устойчивы к бета-лактамным антибиотикам, 83 % - к аминогликозидам, 91 % -к фторхинолонам, 72 % - к сульфаниламидам. Большая часть коллекции представлена штаммами, одновременно устойчивыми к нескольким классам антибактериальных препаратов: к двум - 8 %, к трем -14 %, к четырем - 25 %, к пяти - 36 % и к шести - 13 %.

2. Устойчивость изученных штаммов к бета-лактамным антибиотикам (пенициллинам и цефалоспоринам) определяется наличием генов бета-лактамаз ТЕМ, SHV, ОХА, АтрС и СТХ-М типов, присутствующих в геномах преимущественно по два (49 % изолятов) или три (18 % изолятов) гена в разных сочетаниях.

3. Наиболее распространенными в изученной коллекции генами бета-лактамаз являются гены 6/астх-м (77 % изолятов), генетическое окружение которых характерно для индивидуальных генов и демонстрирует большую вариабельность. Данные гены локализованы преимущественно на высокомолекулярных плазмидах (>80т.п.н.), имеющих гибридную природу и относящихся к группам несовместимости IncF, IncAJC, Inc L/M, и др., специфичным для вида микроорганизма и кластера гена.

4. Разработан алгоритм ПЦР-ПДРФ-анализа генов 6/яСтх-м> позволяющий идентифицировать 49 генов до индивидуального гена и 47 генов определить в составе небольших подгрупп.

5. Идентифицирован новый ген ¿/астх-м-нб и размещен в базах данных GenBank и Lahey.

6. Интегроны классов 1 и 2 присутствуют в геномах 38 % изученных штаммов; они несут генные кассеты устойчивости к аминогликозидам (аасА4, aac(6')Ib, aadAl, aadA2, aadB), хлорамфениколу (catBH, cmlAl), эритромицину (ereA2), сульфаниламидам (dfrAl, dfrAS, dfrA12, dfrA17 и sull), стрептотрицину (satl) и бета-лактамам (bla0xа-зо) •

7. В геномах 23 % штаммов Enterobacter spp. зафиксировано появление сравнительно нового механизма устойчивости к хинолонам - плазмидно-кодируемых генов qnrB2, qnrB4 и qnrS.

8. Предложен перечень генетических маркеров для ПЦР-детекции в геномах множественно устойчивых штаммов Enterobacteriaceae, циркулирующих в госпитальных сообществах РФ, включающий в себя 48 позиций , в том числе маркеры устойчивости к бета-лактамам (13), аминогликозидам (7), сульфаниламидам (5), хинолонам (3) и другим антибактериальным препаратам (4), а также структуры мобильных генетических элементов.

Таблица 1 - Учетные номера последовательностей ДНК в базе данных ОепВапк

Описание последовательности Учетные номера в Gen Bank

Генетическое окружение генов 4/астх-МВ штаммах Е coli GQ2S4323; GQ330538; GQ330539; GQ33054G; GQ339101; GQ339102; GQ339103; GQ339104: GQ339105; GQ339106: GQ344SGO; GQ344801; GQ3S5305; GQ385306; GQ3S5309; GQ3S5307; GQ3S530S; GQ3S5310, GQ3S5311: GQ3S5312: GQ3S5313; GQ3S5314; C-Q3S531S; GQ385319; GQ3S532Ü: GQ3S5321; GQ3S5322; GQ3S5323; GQ3S5324; GQ3S5325; GQ3S5326; GÜ1S7357; HM5S9735

Генетическое окружение генов Ыастх-у.в штаммах К. pneumoniae GQ292712: GQ292713; GQ304737; GQ32570S; GQ32S7Ü9; GQ325710; GQ32S7U; GQ3S5315; GQ3SS31fi; GQ3S5317;

Генетическое окружение генов №ст?шв штаммах Enterobacter spp. GQ3S5330; HM219230: HQ2Ü4574: HQ214Ü44; HQ214046; HQ204572; HQ214047; HQ214049; HQ214045; HQ214051; HQ214052; HQ21404S; HQ214050

Генетическое окружение теноЕ Wacix-мв штаммах Salmonella, Serratia и Citrobacter GQ3S5327; GQ3S532S; GQ385329; HM470254; HQ214C43

Последовательность гена i/астх-м-иб JF96S749

Интегронные структуры в штаммах Е, coli GQ89649Q; GQ896491; GQS96492; GQS96493; GQS96495; GQS96494: GQS96496; GQS964 97; GQS9649S; GQS96499; GQS96500; GQS96501; GQ924770; GQ924771: GQ924772: GQ924774; GQ924 775; GQ924776; GQ924777; GQ924762: GQ924763; GQ924764; GQ924765; GQ924766; GQ92+767: GQ92476S; GU00194S; GU001949; GU05S937; HM569733; HM043571; HM4S55S6: HM043573; HM043577

Иктегронные структуры в штаммах К. pneumoniae GQ924773: HM043570; HM043572;HM0435/4; HM04357S; HM043576; HMS69734

Интегронные структуры в штаммах Enterobacter spp. и Salmonella enterica HM569736: GQ924769

Гены ¿/05HV в штаммах Е. coli HM123689; HM125693

Гены Ыодг," в штаммах К. pneumoniae HM1256S 7; HM1256S6; HM12S690; HM125692; HMI25694; HM125695: HM12S696

Гены Wgshv в штаммах Enterobacter spp. HM04SS7S; HM04SS79; HM04S880; HM12568S;HM125<591;

Гены WerjEMB штаммах К. pneumoniae и Enterobacter spp HM131426; HM131427

Гены blatssxi в штаммах Serratia plymutlv,ca; Citrobacter freunaii и Proteus mirabiiis HM131429; 1ШШ430; HM131431

Ген blaasxs в штамме К. pneumoniae HM13142S

Гены <jnrB штаммах Enterobacter cioacae HM12S697; HM12569S; HM12S699; НШ 25700: HM125701; Ш1125702: HM125703; HM125704; HM125705; HM1257C6

Ген arnui E штамме Enterobacter cloacae HQ204573

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

а) Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК

1. Прямчук С.Д., Фурсова Н.К., Лбаев И.В., Ковазев Ю.Н., Шишкова Н.А., Печерских Э.И., Коробова О.В., Асташкин Е.И., Пачкунов Д.М., Круглов А.Н., Иванов Д.В., Сидоренко C.B., Светоч Э.А., Дятлов И.А. Генетические детерминанты устойчивости к антибактериальным средствам в нозокомиальных штаммах Escherichia coh, Klebsiella spp. и Ente-robacter spp., выделенных в России в 2003-2007 гг. // Антибиот. химиотер. - 2010. - Т. 55, №9-10.-С. 3-10.

2. Фурсова Н.К., Прямчук С.Д., Абаев И.В., Ковалев Ю.Н., Шишкова НА., Пе-черских Э.И., Коробова О.В., Асташкин Е.И., Пачкунов ДМ., Светоч Э.А., Сидоренко C.B. Генетическое окружение генов ¿/астх-м, локализованных на конъюгативных плазмидах нозокомиальных изолятов Enterobacteriaceae, выделенных в России в 2003-2007 гг. // Антибиот. химиотер. -2010. - Т. 55, №11-12. - С. 3-10.

3. Прямчук С.Д., Фурсова Н.К., Анисимова В.А., Ковалев Ю.Н., Абаев И.В., Ку-жельная Е.Н., Светоч ЭА. Алгоритм идентификации генов, кодирующих бета-лактамазы СТХ-М-типа, методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ПЦР-продукта. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. -2011. - № 4 - С. 7-13.

б) Тезисы научных конференций:

4. Fursova N.K., Kruglov A.N., Abaev I.V., Kovalev Y.N., Pecherskikh E.I., Astashkin E.I., Pachku-nov D.M., Pryamchuk S.D., Anisimova V.A., Mitzevich M.E. Spreading of beta-lactamase genes among nosocomial isolates collected from Moscow clinics. //Clin. Microbiol. Infect, -2006. -V. 12(4). - P. 1351.

5. Фурсова U.K., Абаев И.В., Ковалев Ю.Н., Печерских Э.И., Асташкин Е.И., Пачкунов Д.М., Прямчук СД., Круглов А.Н. Распространенность генов бета-лактамаз в клиниках Московской медицинской академии. //Материалы VII Международ. Конгресса MAKMAX/ASM по антимикробной терапии. 30 мая - 1 июня 2006 г., Москва Клин, микробиол. антимикроб, химиотер. 2006. - T. S. - С. 40.

6. Fursova N.K., Abaev I.V., Kovalev Y.N., Pecherskikh E.I., Astashkin Е.1., Pachkunov D.M., Pryamchuk S.D., Morosova O.A., Kruglov A.N., Weigel L.M., Rasheed J.K. ТЕМ, SHV, and CTX-M classes of beta-lactamase genes among nosocomial isolates collected from Moscow clinics. //Abstract #21 on the 2006 NIAID Research Conference, Opatija, Croatia, June 24-30,2006.

7. Abaev I., Fursova N., Pecherskikh E., Pryamchuk S„ Korobova O., Shishkova N., Kovalev Y., Kruglov A., Ivanov D., Sidorenko S. Correlations Between Spreading of CTX-M-2 and CTX-M-9 Genes and Class 1 and Class 2 Intégrons. //Abstract #C2-1661 on the 46" Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, USA, September 27-30,2006.

8. Фурсова H.K., Абаев И.В., Печерских Э.И., Прямчук С.Д., Коробова О.В., Шишкова Н.А., Ковалев Ю.Н., Асташкин Е.И., Пачкунов Д.М., Круглов А.Н., Дронов НА., Морозова О.А., Иванов Д.В., Сидоренко C.B. Распределение генов бета-лактамаз расширенного спектра среди нозокомиальных штаммов Enterobacteriaceae. I/ Материалы VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ, 3-5 октября 2006 г., Оболенск. - С. 72-74.

9. Fursova N., I. Abaev, О. Korobova, E. Pecherskikh, N. Shishkova, S. Pryamchuk, A. Kruglov, D. Ivanov, L. Weigel, J. Rasheed. Comparative Study for Conjugative Plasmids Carrying CTX-M Genes in Escherichia coli Nosocomial Isolates. //Poster # P585 on the 17th European Congress on Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCM1D) & 25th International Congress of Chemotherapy (ICC), Munich, Germany, March 31-April 4,2007.

10. Фурсова U.K., АЗаев И.В., Коробова O.B., Печерских Э.И., Шишкова Н.А., Прямчук С.Д., Круглов А.Н., Иванов Д.В., Вейгел Л., Рашид Дж. К. Разнообразие конъюгативных плазмид, несущих гены ЫоСТХ-М-1, в нозокомиальных изолятах энтеробактерий //Материалы IX Международного конгресса MAKMAX/BSAC по антимикробной терапии. Москва, 30 мая - 1 июня 2007 г. Клин, микробиол. антимикроб, химиотер. - №81. - С. 42.

11. Fursova N., Abaev I., Pecherskikh E„ Pryamchuk S„ Korobova O., Shishkova N„ Kruglov A., Ivanov D., Weigel L., Rasheed I. Analysis of Gene Cassettes on Class 1 Intégrons from CTX-M-producing

Isolates from Russia. //Abstract #CI-100 on the 47th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Chicago, IL, USA, September 17-20,2007. - P. 69.

12. Прямчук С.Д., Абаев И.В., Коробова O.B., Шишкова Н.А., Печерских Э.И., Фурсова Н.К. Детекция генетических структур в составе вариабельных участков интегронов класса 1, локализованных на плазмидах нозокомиальных штаммов Escherichia coli и Klebsiella pneumoniae.// Тезисы конференции «Молекулярная диагностика-2007». Москва, 28-30 ноября 2007 г. - Т. 2. - С. 400-401.

13. Шишкова Н.А., Абаев И.В., Коробова О.В., Нрямчук С.Д., Печерских Э.И., Фурсова Н.К. Идентификация групп несовместимости конъюгативных плазмид, несущих гены бета-лактамаз расширенного спектра СТХ-М типа, в нозокомиальных штаммах Escherichia coli и Klebsiella pneumoniae. II Материалы Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний». Санкт-Петербург, 18-19 апреля 2008 г. Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2008. - №2(22). - Ч. 1. - С. 198-199.

14. Fursova N., I. Abaev, Pryamchuk S., Shishkova N., Pecherskikh E., Korobova O., Kruglov A., Wei gel L., Rasheed J.. Variability of Inc group of Conjugative Plasmids and CTX-M Gene Environments in Enterobacteriaceae Nosocomial Strains Isolated from Russia. //Materials of the 18th European Congress on Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Barcelona, Spain, April 19-22, 2008. - Clin. Microbiol. Infect. - 2008. - V. 15. - P. 38-39.

15. Фурсова H.K., Абаев И.В., Прямчук С.Д., Шишкова Н.А., Печерских Э.И., Коробова О.В., Круглов А.Н., L.M. Weigel, J. К. Rasheed. Изучение механизмов распространения генов устойчивости к бета-лактамам среди нозокомиальных штаммов семейства Enterobacteriaceae: группы несовместимости конъюгативных плазмид и генетическое окружение генов бета-лактамаз СТХ-М типа. //Тезисы I Оболенской школы-конференции молодых ученых. 22-23 апреля 2008 г.

16. Фурсова Н.К., Шишкова Н.А., Прямчук С.Д., Абаев И.В., Печерских Э.И., Круглов А.Н., Морозова О. A., L. Weigel, J. К. Rasheed. Обнаружение плазмидных детерминант устойчивости к хи-нолонам qnrB и qnrS в нозокомиальных штаммах Enterobacteriaceae. // Материалы X Международного конгресса МАКМАХ по антимикробной терапии. Москва, 21-23 мая 2008. Клин, микробиол. антимикроб. химиотер. - 2008. - Т. 10. - №2. - С. 43.

17. Fursova N.. S. Pryamchuk, I. Abaev, N. Shishkova, E. Pecherskikh, A. Kruglov, S. Sidorenko, E. Svetoch, L. Weigel, J. Rasheed. Diversity of CTX-M Gene Environments in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae Nosocomial Strains Isolated from Russia. //Poster # P1199 on the 19th European Congress on Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Helsinki, Finland, May 16-19, 2009. - Clin. Microbiol. Infect. - 2009. V. - 15(4). - P. 327.

18. Fursova N.K., Pryamchuk S., Abaev I., Kovalev Y.N., Shishkova N., Korobova O., Pecherskikh E., Astashkin E.I., Pachkunov D.M., A. Kruglov, S. Sidorenko, Svetoch E„ Weigel L.M., Rasheed J.K.. Prevalent Mechanisms of Multidrug Resistance in Enterobacteriaceae Nosocomial Strains: Genes, Cassettes, Plasmids. //Materials of the 12th SAC Seminar «Combating Global Infections», Irkutsk, Sept., 21-25,2009. -P. 48-49.

19. Фурсова H.K., Прямчук С.Д., Абаев И.В., Ковалев Ю.Н., Шишкова Н.А., Печерских Э.И., Коробова О.В., Асташкин Е.И., Пачкунов Д.М., Круглов А.Н., Светоч Э.А., Дятлов И.А. Вклад интег-ронов классов 1 и 2 в формирование множественной устойчивости к антибиотикам у возбудителей нозокомиальных инфекций семейства Enterobacterobacieriaceae, выделенных в 2005-2007 гг. //Материалы международной научной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями», Санкт-Петербург, 18-20 мая 2010 г.

20. Фурсова Н.К., Прямчук С.Д., Кужельная Е.Н., Абаев И.В., Светоч Э.А. Интегроны 1 и 2 классов в геномах грамотрицательных возбудителей нозокомиальных и пищевых инфекций //Материалы Первой международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», Москва, 17-19 ноября 2010 г..

21. Асташкин Е.И., Прямчук С.Д., Светоч Э.А., Фурсова Н.К. Характеристика нозокомиальных штаммов Salmonella enterica. .'/ Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. Тезисы XII Международного конгресса MAKMAX/ESCM1D по антимикробной терапии. Москва, 1820 мая 2011 г.

22. Кужельная Е.Н., Прямчук С.Д., Карцев Н.Н., Фурсова Н.К. ПЦР-детекция генов антибио-тикорезистентности в нозокомиальных изолятах неферментирующих бактерий, выделенных в России в 2003-2010 гг. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. Тезисы XII Международного конгресса MAKMAX/ESCMID по антимикробной терапии. Москва, 18-20 мая 2011 г.

Подписано в печать:

23.11.2011

Заказ № 6336 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Прямчук, Сергей Дмитриевич

терминов.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Значение устойчивости к антибиотикам у возбудителей внутрибольничных инфекций семейства ЕЫегоЪаМепасеае.

1.2 Распространенность клинически значимых штаммов Еп1егоЬас1епасеае, возбудителей нозокомиальных инфекций.

1.3 Механизмы формирования устойчивости к антибактериальным средствам.

1.4 Генетические детерминанты устойчивости к бета-лактамам.

1.4.1 Бета-лактамазы.

1.4.2 Хромосомные и плазмидные гены бета-лактамаз

1.5 Генетические детерминанты ассоциативной устойчивости и их локализация в геноме бактерий.

1.5.1 Гены, кодирующие устойчивость к аминогликозидам.

1.5.2 Гены, кодирующие устойчивость к фторхинолонам

1.5.3 Гены, кодирующие устойчивость к сульфаниламидам.

1.6 Роль мобильных генетических элементов в быстром распространении генов устойчивости к антибактериальным препаратам.

1.6.1 Геномные острова.

1.6.2 Плазмиды.

1.6.3 Транспозоны и 18-элементы.

1.6.4 Интегроны.

1.6.5 Рекомбинация.

1.7 Методы изучения устойчивости к антибактериальным препаратам.

1.7.1 Микробиологические методы.

1.7.2 Биохимические методы.

1.7.3 Биофизические методы.

1.7.4 Генетические методы.

1.7.5 Молекулярно-генетические методы.

1.7.6 Методы биоинформатики.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация специфичных маркеров для характеристики множественно-устойчивых госпитальных штаммов Enterobacteriaceae"

Актуальность проблемы

Одной из наиболее серьезных проблем современной медицины является стремительный рост числа возбудителей инфекционных заболеваний, как внутрибольничных, так и внебольничных, имеющих множественную лекарственную устойчивость (МЛУ). Неудачи клинического лечения, подъем заболеваемости и смертности, увеличение продолжительности пребывания в стационаре зачастую связаны с инфекциями, вызываемыми такими микроорганизмами [79]. Устойчивость микроорганизмов к антибактериальным препаратам является неизбежным следствием широкого клинического применения антибиотиков. В различные периоды времени, в зависимости от перечня антибиотиков разных функциональных групп, интенсивно используемых в лечебных учреждениях, в популяциях бактериальных патогенов развиваются разные механизмы резистентности к антибактериальным препаратам и способы распространения генов МЛУ [143]. Терапия инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, наиболее часто основывается на использовании бета-лактамных антибиотиков, фторхинолонов и аминогликозидов. Общее потребление антибиотиков за последние годы значительно возросло, а расширенное их использование привело к повышению резистентности к данным классам лекарств. Распространение генов устойчивости к антибактериальным средствам среди возбудителей инфекционных болезней человека и, прежде всего, возбудителей госпитальных инфекций, приняло угрожающий характер [3, 139].

Горизонтальный перенос генов посредством плазмид, имеющих мозаичную генетическую структуру, формируемую в результате процессов рекомбинации и транспозиции, является причиной наблюдаемого повсеместно быстрого распространения генов устойчивости к разным классам антибиотиков [57]. Фенотип МЛУ у бактерий формируется в результате аккумуляции внутри плазмид или транспозонов генов, обеспечивающих устойчивость к отдельным антибиотикам и/или кодирующих эффлюксные насосы, которые могут удалять из клетки несколько видов лекарств одновременно [94].

Быстрое определение видовой принадлежности возбудителей инфекций и их чувствительности к антибактериальным препаратам зачастую является вопросом жизни и смерти пациентов. Методы, используемые для этого в рутинной практике, варьируют в зависимости от оснащенности клинических лабораторий и подготовленности персонала - от микробиологических, в разной степени автоматизированных, до молекулярно-биологических. Наиболее перспективными с точки зрения быстроты и точности получаемого ответа являются разные варианты скрининга, основанного на амплификации ДНК с помощью специфичных праймеров, особенно полимеразная цепная реакция (ПЦР), в стандартном режиме и в режиме реального времени [47]. Преимуществами данного метода являются быстрота, надежность и специфичность; недостатком — то, что выявлению подлежат только уже описанные ранее последовательности ДНК, гены или мутации. Поэтому исследования, направленные на увеличение списка генетических детерминант, доступных тестированию, проводятся постоянно и основываются на изучении генотипов бактерий, циркулирующих в настоящее время в конкретном регионе. При этом большое значение приобретают не только детекция генов резистентности как таковых, но также выявление и характеристика молекулярных механизмов их эволюции и распространения (кассеты МЛУ, мобильные генетические элементы, плазмиды). Такой подход позволяет оценить современную эпидемиологическую ситуацию по распространению антибиотикорезистентности среди популяций бактериальных патогенов, определить молекулярные механизмы природы этой резистентности, прогнозировать ее развитие на будущее и представить клиницистам рекомендации по оптимизации схем лечения определенных типов инфекционных заболеваний [10]. г 7

Цель исследования

Целью настоящего исследования является выявление и молекулярно-генетическая характеристика маркеров резистентности к антибактериальным препаратам у бактерий семейства Enterobacteriaceae, выделенных в стационарах Российской Федерации в 2003-2007 гг.

Задачи исследования

1. Создание коллекции антибиотикорезистентных госпитальных (нозокомиальных) штаммов семейства Enterobacteriaceae, выделенных в разных регионах РФ в 2003-2007 гг.

2. ПЦР-скрининг нозокомиальных штаммов семейства Enterobacteriaceae на наличие генов устойчивости к бета-лактамным антибиотикам и антибактериальным средствам других функциональных классов. Анализ распространенности генов устойчивости.

3. Разработка алгоритма идентификации генов ЫаСтх детерминирующих синтез наиболее распространенного типа бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС), с помощью ПЦР-ПДРФ анализа.

4. Изучение генетического окружения генов 6/<ясгх-м и определение мобильных генетических элементов, обеспечивающих эпидемическое распространение данных генов.

5. Детекция конъюгативных плазмид и интегронных структур в госпитальных штаммах семейства Enterobacteriaceae.

6. Создание перечня генетических маркеров антибиотикорези-стентности для ПЦР-детекции у возбудителей госпитальных инфекций семейства Enterobacteriaceae.

Научная новизна работы

Проанализирована коллекция МЛУ бактерий семейства Enterobacteriaceae - возбудителей госпитальных инфекций, выделенных в РФ в течение 2003-2007 гг., на наличие генов устойчивости к антибиотикам разных функциональных классов. Выявлено, что в подавляющем большинстве случаев

75%) устойчивость к этому классу антибиотиков обусловлена продукцией БЛРС СТХ-М типа. Разработан алгоритм ПЦР-ПДРФ анализа для идентификации генов ¿/«стх-м, позволяющий определить до индивидуального гена 49 генов из 96, а остальные 47 - в составе небольших групп. Изучено генетическое окружение генов 6/ясгх-м подтипов (кластеров) 1, 2 и 9, выявлено и размещено в базе данных GenBank 46 последовательностей, аналогичных ранее описанным и 15 новых вариантов последовательностей. Идентифицирован новый ген 6/ястх-м-пб и размещен в базах данных GenBank и Lahey. Показано, что гены 6/астх-м локализованы преимущественно на высокомолекулярных конъюгативных плазмидах (>80 т.п.н.), принадлежащих к различным группам несовместимости, в зависимости от кластера фермента: IncF, IncA/C, IncN, Incll и IncL/M - для кластера 1; Incll и IncP - для кластера 2; IncF, IncA/C, IncK, Incll, IncB/O, IncFlA и IncFIB - для кластера 9. Показано, что гены, обеспечивающие устойчивость к другим классам антимикробных веществ (аминогликозидам, сульфаниламидам, хлорамфениколу), часто располагаются на тех же плазмидах, что и гены Ыас гх-м> внутри вариабельных участков интегронов классов 1 и 2. Размещены в базе данных GenBank 43 последовательности интегронных вставок, в том числе новых - 3.

Практическая значимость работы

Собрана и охарактеризована коллекция штаммов энтеробактерий -возбудителей нозокомиальных инфекций (п=923). Депонированы в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ФБУН ГНЦ ПМБ (Федеральный уровень внедрения) штаммы (п=141), охарактеризованные по уровням и спектрам устойчивости к антибактериальным средствам разных функциональных классов, в том числе штаммы, депонированные в качестве референсных для детекции генов антибиотикоустойчиво-сти (п=33). Созданы электронные каталоги «Нозокомиальные штаммы энтеробактерий, выделенные в России в 2003-2007 гг.» и «Генетические маркеры для изучения антибиотикоустойчивости у энтеробактерий», доступные для использования в научной библиотеке ФБУН ГНЦ ПМБ. Разработаны методические рекомендации «Идентификация генов Ыас\х-м> детерминирующих устойчивость к цефалоспоринам III-IV поколений, методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов» (Учрежденческий уровень внедрения, 2010 г.) и «Молекулярно-генетические методы выявления генов лекарственной устойчивости в популяциях возбудителей бактериальных инфекций» (Учрежденческий уровень внедрения, 2010 г.). Материалы диссертации используются Пущинским государственным университетом в процессе подготовки магистрантов по специальности 03.02.03 - «микробиология» в курсах «Генетика и молекулярная микробиология микроорганизмов» и «Лекарственная устойчивость микроорганизмов». Размещены в базе данных GenBank 136 последовательностей ДНК генов антибиотикоустойчивости и их генетического окружения, доступные для использования исследователям во всем мире.

Положения, выносимые на защиту

2. Устойчивость изученных штаммов к бета-лактамным антибиотикам определяется наличием генов бета-лактамаз ТЕМ, SHY, ОХА, АтрС и СТХ-М типов, присутствующих в геномах преимущественно по два (49 % изолятов) или три (18 % изолятов) гена в разных сочетаниях.

3. Гены Ыастх.м - превалирующие детерминанты устойчивости к бета-лактамам (77 % штаммов) - локализованы преимущественно на высокомолекулярных плазмидах (>80 т.п.н.), имеющих гибридную природу и относящихся к группам несовместимости IncF, IncA/C, Inc L/M. Генетическое окружение данных генов включает мобильные генетические элементы ISEcpl, IS26, IS903, orf513 и др., в зависимости от кластера гена и вида микроорганизма.

4. Разработанный алгоритм ПЦР-ПДРФ-анализа позволяет идентифицировать описанные к настоящему времени гены 6/ястх-м До индивидуального гена (51 %) или в составе небольших подгрупп (49 %).

5. В геноме нозокомиального штамма Proteus mirabilis, выделенного в Москве в 2005 г., идентифицирован ген ¿/остх-м-пб (учетный номер в международной базе данных GenBank JF966749; учетный номер в специализированной базе данных Lahey - «СТХ-М-116»), кодирующий ранее не описанный фермент СТХ-М-типа, имеющий гибридную природу.

6. Интегроны классов 1 и 2 играют важную роль в формирование антибиотикоустойчивости к аминогликозидам, хлорамфениколу, эритромицину, сульфаниламидам и др. препаратам у значительной части (38 %) госпитальных штаммов энтеробактерий, выделенных в РФ в 2003-2007 гг.

8. Перечень генетических маркеров для ПЦР-детекции генов резистентности, включающий в себя детерминанты устойчивости к бета-лактамам (13), к аминогликозидам (7), к сульфаниламидам (5), к хинолонам (3), к другим антибактериальным препаратам (4), может обеспечить информативную генетическую характеристику госпитальных штаммов Enterobacteriaceae, циркулирующих в клиниках РФ.

Работа выполнена в лаборатории антимикробных препаратов отдела молекулярной микробиологии ФБУН ГНЦ ПМБ в рамках темы НИР «Исследование генетических структур, ответственных за устойчивость к расширенному спектру антибактериальных средств у возбудителей внутрибольничных и пищевых инфекций» (2006-2010 гг.) и международного проекта ISTC#2913/BTEP#61 «Изучение распространенности и молекулярно-генетических механизмов устойчивости грамотрицательных возбудителей нозокомиальных инфекций к бета-лактамным антибиотикам» (2005-2007).

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена лично автором; результаты, описанные в отдельных главах получены в сотрудничестве с к.б.н. Фурсовой Н.К., к.м.н. Абаевым И.В., к.б.н. Кругловым А.Н., н.с. Печерских Э.И., к.б.н. Коробовой О.В., к.б.н. Шишковой Н.А., к.м.н. Аниси-мовой В.Н., к.б.н. Ковалёвым Ю.Н., к.м.н. Асташкиным Е.И., к.б.н. Пачкуно-вым Д.М., д.в.н., проф. Светочем Э.А., д.м.н., проф. Сидоренко С.В. и д.м.н., проф. Дятловым И.А.

Апробация работы. Основные материалы по теме диссертационной работы были представлены, доложены и обсуждены на 18 российских и международных конференциях: The 16th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Nice, France, April 1-4, 2006; VII Международный Конгресс MAKMAX/ASM по антимикробной терапии. 30 мая - 1 июня 2006 г., Москва; The 2006 NIAID Research Conference, Opatija, Croatia, June 24-30, 2006; The 46th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, USA, September 27-30, 2006; VII Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ, 3-5 октября 2006 г., Оболенск, Московская обл., Россия; The 17th European Congress on Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID) & 25th International Congress of Chemotherapy (ICC), Munich, Germany, March 31-April 4, 2007; IX Международный конгресс MAKMAX/BSAC по антимикробной терапии. Москва, 30 мая - 1 июня 2007 г.; The 47th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Chicago, IL, USA, September 17-20, 2007; «Молекулярная диагностика-2007». Москва, 28-30 ноября 2007 г.; Всероссийская научная конференция «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний». Санкт-Петербург, 18-19 апреля 2008; The 18th European Congress on Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Barcelona, Spain, April 19-22, 2008; I Оболенская школа-конференция молодых ученых. 22-23 апреля 2008 г.; X Международный конгресс МАКМАХ по антимикробной терапии. Москва, 21-23 мая 2008; The 19th European Congress on Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Helsinki, Finland, May 16-19, 2009; The 12th SAC Seminar «Combating Global Infections», Irkutsk, Sept., 21-25, 2009. Международная научная конференция «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями», Санкт-Петербург, 18-20 мая 2010 г.; Первая международная научная-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», Москва, 17-19 ноября 2010 г.; XIII Международный конгресс МАКМАХ по антимикробной терапии. Москва, 18-20 мая 2011.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Прямчук, Сергей Дмитриевич

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представители семейства ЕмегоЬаМепасеае играют важнейшую роль в этиологии госпитальных инфекций - они составляют около 20 % среди общего количества возбудителей. В данном исследовании проведено сравнительное изучение изолятов, выделенных в 2003-2004 гг. из крупных городов РФ, и в 2005-2007 гг. - из клиник ММА им. И.М. Сеченова. Показано, что штаммы обеих коллекций устойчивы к бета-лактамам, аминогликозидам, фторхинолонам и сульфаниламидам. Большая часть коллекции (89 %) представлена штаммами, одновременно устойчивыми к трем и более классам антибактериальных препаратов. Показано, что геномы штаммов, устойчивых к бета-лактамным антибиотикам, содержат от одного до трех генов различных бета-лактамаз. Наиболее распространенным геном является ген Ь/астх-м-15, принадлежащий к кластеру Ь/ястх-м-ь Генетическое окружение генов, кодирующих бета-лактамазы СТХ-М типа, включает в себя мобильные генетические элементы, набор которых характерен для индивидуальных генов и вида микроорганизма. Показана значительная вариабельность данных последовательностей, что указывает на бурные эволюционные процессы, проходящие в данных участках генома. Подтверждением данного тезиса явилось открытие нового гена Ь/ястх-м-пб5 который представляет собой гибрид между генами 6/астх-м-2з и 6/ястх-м-22> и содержит в середине последовательности соге-сайт, в области которого, предположительно, произошла рекомбинация. Показано, что гены 6/астх-м локализованы преимущественно на высокомолекулярных плазмидах, имеющих гибридную природу и относящихся к группам несовместимости 1псР, 1псА/С, 1пс Ь/М, и др., специфичным для вида микроорганизма и кластера гена. В ходе работы разработан алгоритм ПЦР-ПДРФ-анализа генов ЫаСтх-м> позволяющий идентифицировать около половины генов до индивидуального гена, а остальные - в составе небольших подгрупп.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Прямчук, Сергей Дмитриевич, Оболенск

1. Методические указания МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». Утверждены Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко 04.03.2004 г.

2. Козлов Р.С. Нозокомиальные инфекции: эпидемиология, патогенез, профилактика, контроль // Клин микробиол антимикроб химиотер. — 2000. — Т. 2. №1. — С. 16-30.

3. Козлов Р.С., Стецюк О.У., Андреева И.В. Современные тенденции анти-биотикорезистентности возбудителей нозокомиальных инфекций в ОРИТ России: что нас ждет дальше? // Журн интенс тер. — 2007. — № 4 // Available from: http://www.icj.ru/2007-04-01.html

4. AMP AMS CEF FOX CTX CAZ CAK CEP AZT MER GEN AMI CIP DOC CM CTZ

5. M. morganu K-264 M 15.02.2006 моча >256 128 >256 256 >256 >256 128 >256 >256 <0,12 >256 4 >256 >256 64 >16

6. P. mirabilis K-011 M 02.03.2005 органы дыхания >256 4 >256 2 64 1 <0,12 4 0,5 <0,12 4 32 4 128 256 >16

7. P. mirabilis K-027 M 28.03.2005 моча >256 32 >256 32 32 0,25 <0.12 32 2 <0,12 32 0,5 256 >256 128 0,5

8. P. mirabilis K-038 M 17.02.2004 моча >256 32 >256 16 >256 2 1 64 1 <0,12 >256 8 16 >256 16 >16

9. P. mirabilis К-043 M 18.04 2005 моча >256 16 >256 2 64 0,5 <0,12 2 0,5 <0,12 16 32 4 128 128 >16

10. P. mirabilis К-099 M 21.06.2005 моча >256 32 >256 8 256 16 <0,12 256 128 <0,12 >256 32 >256 >256 128 >16

11. P. mirabilis К-222 M 07.12.2005 жкт 256 4 >256 2 32 2 <0,12 >256 16 <0,12 64 64 <0,12 >256 8 >16

12. P. mirabilis К-333 M 21.06.2006 моча >256 256 >256 256 >256 8 1 >256 128 <0,12 >256 >256 32 32 128 >16

13. P. mirabilis К-346 M 12.07.2006 моча >256 64 >256 16 >256 4 <0,12 64 2 <0,12 >256 32 8 >256 >256 8

14. P. mirabilis К-416 M 22.11.2006 моча >256 64 >256 16 256 0.5 <0,12 >256 4 <0,12 256 8 64 >256 128 >16

15. P. mirabilis К-417 M 20.11.2006 моча >256 32 >256 8 >256 32 <0,12 >256 128 <0,12 >256 32 >256 >256 128 >16

16. P. mirabilis К-455 M 13.03.2007 моча >256 16 >256 16 >256 64 <0,12 >256 64 >256 32 >256 >256 256 16

17. P. mirabilis К-526 M 26.06.2007 хирургическая рана >256 32 8 4 1 1 <0,12 0,5 2 <0,12 16 1 2 4 4 1

18. P. mirabilis К-532 M 09.07.2007 моча >256 16 >256 2 >256 0,5 <0,12 256 4 <0,12 64 4 4 256 128 >16

19. P. mirabilis К-544 M 22.08.2007 моча >256 16 >256 16 64 1 <0,12 16 2 <0,12 128 8 128 >256 >256 >16

20. P. mirabilis К-576 M 30.10.2007 моча >256 64 >256 16 >256 8 <0,12 >256 32 0,25 >256 >256 256 >256 128 >16

21. P. penneri К-398 M 02.11.2006 моча >256 64 >256 8 64 2 <0.12 >256 32 <0,12 256 8 8 >256 >256 16

22. P. stuartii К-155 M 30.09.2005 моча >256 128 >256 32 16 1 1 32 0.5 0,25 >256 4 256 >256 >256 >16

23. P. stuartii К-577 M 25.10.2007 моча >256 64 >256 32 128 8 <0,12 32 32 <0,12 128 1 >256 >256 64 2

24. P. vulgaris К-404 M 11.11.2006 моча >256 64 >256 8 >256 4 <0,12 >256 16 <0,12 128 >256 256 >256 256 4

25. S. liquefaciens К-593 M 07.11.2007 органы дыхания ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND

26. S. marcescens К-091 M 05.05.2005 ЖКТ 128 64 >256 128 4 <0.12 <0,12 <0,12 I <0,12 0,25 4 8 4 16 1

27. S. marcescens К-180 M 24.10.2005 органы дыхания >256 128 >256 32 16 16 16 1 4 <0,12 16 4 8 128 256 >16

28. S. marcescens К-373 M 25.09.2006 ЖКТ >256 256 >256 16 >256 128 1 >256 256 <0,12 >256 32 2 >256 16 0,25

29. S. plymuthica К-060 M 12.05.2005 моча >256 64 >256 >256 >256 64 4 64 128 <0,12 128 4 0,5 2 4 025

30. S. plymuthica К-529 M 11.07.2007 моча >256 64 >256 4 256 64 <0,12 32 128 <0,12 128 16 <0,12 128 4 >16

31. K. ascorbata К-438 M 02.02.2007 ЖКТ >256 >256 >256 >256 256 256 8 16 64 16 64 32 128 128 256 >16

32. K. ascorbata К-531 M 10.07.2007 моча 64 4 64 8 <0,12 <0,12 <0,12 <0,12 <0.12 <0,12 <0,12 1 <0,12 4 4 0,25923 llafnia alvei К-118 M 01.09.2005 ЖКТ ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND1. Примечание:

33. Я Ярославль; M - Москва; СП - С.-Петербург; Т - Томск; КР - Краснодар; КЗ - Казань; BP - Воронеж; Р - Ростов-Дон; И - Иркутск; С - Саратов; У - Уфа; Е- Екатеринбург; О -Омск; МГ - Магнитогорск; BJI - Владивосток;

Информация о работе

Прямчук, Сергей Дмитриевич
кандидата биологических наук
Оболенск, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Идентификация специфичных маркеров для характеристики множественно-устойчивых госпитальных штаммов Enterobacteriaceae - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Идентификация специфичных маркеров для характеристики множественно-устойчивых госпитальных штаммов Enterobacteriaceae - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы