Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фаги в эпидемиологическом маркировании серраций

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Фаги в эпидемиологическом маркировании серраций"

^ £

V

#

" ^^ На правах рукописи

БЛИЕВЛ ЛАРИСА ЗАУРБЕКОВПА

ФАГИ В ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОМ МАРКИРОВАНИИ

СЕРРАЦИЙ

03.00.07 - МИКРОБИОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нальчик - 1997

Работа выполнена в Кабардино-Балкарском государственном университете.

Научный руководитель: Член-корреспондент РАЕН,

доктор биологических наук, профессор Габрилович И.М.

Официальные оппоненты: академик РАЕН, доктор медицинских

наук, профессор Г.М.Шуб

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник О.П.Плотников

Ведущая организация: Ростовский научно-исследовательский противочумный институт

Защита диссертации состоится 997 г. в

часов на заседании диссертационного совета Д 0/4.32.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410071.г.Саратов, ул.Университетская,46).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РНИПЧИ "Микроб".

Автореферат разослан '^щфВ1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

профессор Г.А.Корнеев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние десятилетия особое внимание органов здравоохранения привлечено к проблеме внутри-больничных инфекций, заболеваний, связанных с оказанием медицинской помощи. Эти инфекционные заболевания резко снижают эффективность лечебных мероприятий, увеличивают сроки пребывания больных в стационарах, повышают летальность (Kramer и соавт.,1984; В.В.Влодавец,1989; Н.А.Семина и соавт.,1989;. Р.Х.Яфаев и Л.П.Зуева,1989; В.П.Венцел,1990). Большую часть внутрибольничных инфекций вызывают условно-патогенные микроорганизмы, в том числе и представители многих родов семейства Enterobacteriaceae: Escherichia, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Yersinia и др. Если в недавнем прошлом внимание микробиологов, главным образом, привлекали эшерихии, сальмонеллы, шигеллы, то в последнее время обращается внимание на все большее число родов и видов этого семейства.

Род Serratia является типичным примером этого процесса. За последние десятилетия при различных заболеваниях, наряду с S.marcescens, высевались представители других видов этих бактерий, отмечается увеличение удельного веса их при внутрибольничных инфекциях (Pecarrere и соавт.,1979; Pitt и соавт.,1980; Harden и соавт., 1980; Serruses-Schontens и соавт.,1984; Horwitz и соавт.,1987; Zbiden и Blass,1988).

Серрации обнаруживаются повсеместно - в воде, почве, пищевых продуктах, в различном клиническом материале (моча, кровь, фекалии, слизь из носоглотки, мокрота, гной из абсцессов и др.). Наряду с этим, эти бактерии используются в биотехнологии при получения продигиозина, из которого впоследствии готовится лекарственный препарат продигиозан, у некоторых представителей серраций обнаружена азотфиксирующая активность и способность к деградации лигнина.

Род Serratia является одним из сравнительно слабоизученных среди энтеробактерий, но возрастающая частота выделения серраций и их этиологическая значимость при внутрибольничных инфекциях объясняют интерес к поискам надежных эпидемиологических маркеров, которые дали бы возможность сравнительно быстро и точно разграничивать серрации от представителей других родов, а также внутри рода и внутри видов.

Методы эпидемиологического маркирования бактерий достаточно разнообразны и разграничиваются на классические и моле-

кулярные. К первым относятся биотипирование, серотипирование, фаготипирование, бактериоцинотипирование, резистенстипирование; ко вторым - плазмидный анализ, рестрикционный анализ, полиме-разная цепная реакция, иммуноблотинг и др. (Darini, 1994). Среди этих методов особое место принадлежит методу фаготипирования, который оправдал себя при изучении многих бактерий (Callow, 1959; Blair и Williams,1961).

Данные о типировании ссрраций ограничиваются отдельными сообщениями о попытках серотипирования (Auchen и Pitt,1995), биотипирования (Traub,1991), бактериоцинотипирования (Anderhub и соавт., 1977) и фаготипирования (Pitt и соавт.,1980; Р.Х.Гайрабеков и И.М.Габрилович,1993).

Целью работы было совершенствование методов эпидемиологического маркирования серраций различного происхождения, в частности с использованием метода фаготипирования.

Для достижения этой цели следовало решить следующие задачи:

1. Изучить различные эпидемиологические маркеры серраций.

2. Исследовать биологические свойства фагов серраций, представляющих две коллекции - Нальчикскую и Английскую.

3. На основе результатов исследования фагов серраций разработать рациональную схему фаготипирования этих бактерий.

Работа выполнена в соответствии с основными направлениями научных исследований Кабардино-Балкарского государственного университета в рамках темы : "Разработка способов выявления и эпидемиологического маркирования условно-патогенных представителей энтеробактерий", зарегистрированной во ВНТИЦентре, N гос.регистрации 01.91.0044705.

Научная новизна. Проведен анализ распространения среди серраций, выделенных из патологического материала и из внешней среды, факторов вирулентности различной природы, полирезистентности, плазмидного профиля- ДНК. Сравнительное изучение свойств фагов серраций из 2 коллекций - Нальчикской и Английской - позволило отобрать типовые фаги, использованные для разработки схемы фаготипирования этих бактерий.

Практическая значимость. Разработана рациональная схема фаготипирования S.marcescens, включающая 4 типовых фага из разных коллекций и позволившая выделить 14 фаготипов этих бактерий. С помощью предложенной схемы типированы 84,3% исследованных штаммов S.marcescens. Показана возможность патотипи-

рования серраций. Полученные результаты использованы в практической работе учреждений системы санэпиднадзора Кабардино-Балкарской Республики. Материалы диссертации внедрены в учебный процесс в Кабардино-Балкарском государственном университете и в Кабардино-Балкарской государственной сельскохозяйственной академии.

Апробация работы. Результаты работы обсуждались на:

1) выездной сессии Президиума Академии естественных наук (Махачкала, 1993);

2) научной конференции, посвященной 25-летию ветеринарного факультета КБАМИ (Нальчик, 1994);

3) научной конференции молодых ученых "Достижения медицинской науки - практическому здравоохранению" (Нальчик, 1995);

4) юбилейной конференции, посвященной 30-летию медицинского факультета (Нальчик, 1996).

По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Положения, выносимые на защиту

1. У серраций достаточно часто обнаруживаются факторы вирулентности, которые являются эпидемиологическими маркерами этих бактерий. В качестве таких маркеров может быть использована также полирезистентность бактерий и наличие у них плазмид.

2. Фаги З.гпагсезсепз из двух коллекций близки между собой по морфологии негативных колоний, антигенным свойствам, чувствительности к действию внешних агентов, параметрам взаимодействия с чувствительными клетками, но различаются по спектру действия.

3. Для целей фаготипирования целесообразно использовать фаги, представляющие разные коллекции, что дает больший процент типируемых штаммов.

Структура и объем диссератцин. Диссертация изложена на 130 страницах машинописи, иллюстрирована 33 таблицами и 1 рисунком, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 3 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, указателя литературы, включающего 169 источников, из которых 36 отечественных и 133 зарубежных, и приложения.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

В работе использованы 74 штамма, отнесенные на основании биологических свойств к роду Serratia. 70 штаммов принадлежали к виду S.marcescens, а 4 - к S.liquefaciens. Штаммы получены из различных лабораторий и выделены нами из патологического материала и из внешней среды.

Исследованные штаммы условно разделены на 2 группы. Первую составили 56 клинических штаммов, выделенных из различного патологического материала от больных: из фекалий - 19, из гнойного отделяемого - 20, из различных выделений (моча, мокрота, кровь) - 17. Во вторую группу включены 18 штаммов, выделенных из объектов внешней среды (почва, смывы с предметов, медицинских инструментов и др.).

Исследования проводились с двумя коллекциями фагов Serratia. Нальчикская коллекция выделена кандидатом биологических наук Р.Х.Гайрабековым (фаги 5, Р, 29, 30, 31, 32). Английская коллекция представлена 11 фагами, выделенными Farmer. Фаги получены от д-ра T.Pitt (Лондон). Фаги обеих коллекций пассировались на одном индикаторном штамме S.marcescens N5.

Для культивирования бактерий и фагов применялись питательные среды, приготовленные из концентратов производства Дагестанского научно-производственного объединения "Питательные среды" (Махачкала). Использовались 1,5% и 0,7% питательный агар, а также питательный бульон. Посевы выращивались в течение 18-24 часов при температуре 37°С.

Выделение и идентификация бактерий проводились общепринятыми методами бактериологического исследования. Биохимические свойства бактерий изучались с использованием систем индикаторных бумажных (СИБ) производства Нижегородского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии для идентификации представителей семейства Enterobacteriaceae (набор А). Исследования производились согласно соответствующего Наставления. Чувствительность бактерий к антбиотикам определяли методом диффузии в агаре с использованием стандартных дисков. Учет результатов проводился в соответствии с Инструкцией.

Для определения профиля плазмидной ДНК серраций использовали метод вертикального электрофореза в 0,7% агарозе

(Eckhardt,1978). Молекулярная масса выявляемых плазм ид определялась с помощью реперных плазмид: PR-4 (38 МД), Rmsl48 (95 МД), pBR 322 (2,8 МД), RSF1010 (5,5 МД).

Адгезивность бактерий изучали с использованием формали-низированных эритроцитов человека группы 0(I)Rh+ (В.И.Брилис и соавт.,1986). Определяли средний процент адгезии, коэффициент участия эритроцитов и индекс адгезивности микроорганизмов (НАМ ). Исходя из показателей ИАМ бактерии разграничивались на неадгезивные (ИАМ < 1,75), низкоадгезивные (ИАМ = 1,76-2,5), среднеадгезивные (ИАМ = 2,51-4,0) и высокоадгезивные (ИАМ > 4,0). Гемагглютинирующую способность бактерий изучали в реакции гемагглютинации с 3% взвесью свежих эритроцитов человека группы 0(I)Rh+ и барана, которую проводили на плексигласовых панелях. Для выявления D-маннозорезистентной гемагглютинации во взвесь эритроцитов добавляли 1,5% D-маннозы. Адсорбция бактериями красителя конго красного определялась на 1,5% питательном агаре с 0,02% казаминовых кислот и 0,01% конго красного.

Антилизоцимную активность изучали по методике О.В.Бухарина и соавт.(1984). Исследования проводили в диапазоне концентраций от 1 до 6 мкг/мл. В качестве тест-культуры использовался штамм Micrococcus luteus var. lysodeikticus N2665.

Гемолитическую способность бактерий определяли на питательном агаре с 3-5% отмытых в растворе Хенкса эритроцитов кролика. Для выявления тиолзависимых гемолизинов использовался питательный агар с 0,002% L-цистеина. Культуры засевались уколом, гемолиз учитывался через 24-48 часов.

Патотипирование проводили согласно разработанной на кафедре микробиологии Кабардино-Балкарского государственного университета схемы (И.М.Габрилович, 1996).

При работе с фагами использовались общепринятые методики (М.Адамс,1961; Д.М.Гольдфарб,1961; И.М.Габрилович, 1973). Пассирование фагов проводили на индикаторном штамме в бульонной среде. Фаги титровали двухслойным методом. Для исследования антигенных свойств фагов использовали реакцию нейтрализации фагов антифаговыми сыворотками по общепринятой методике (М.Адамс,1961). Для получения антифаговых сывороток иммунизировали кроликов весом 2,5-3 кг подкожно фаговыми суспензиями, содержавшими в 1 мл 5x108- 5x109 инфекционных центров (и.ц.).

Чувствительность фагов к действию внешних факторов исследовали в питательном бульоне по общепринятой методике. Определяли процент выживаемости фага при воздействии температуры и хлороформа и вычисляли константу скорости инактивации фага. При определении чувствительности фагов к хлороформу обрабатывали фаговую суспензию хлороформом в соотношении 1:10 при постоянном встряхивании.

Взаимодействие фага с чувствительной клеткой (скорость адсорбции, латенный период, средний урожай фага) определяли по суммарному количеству свободного неадсорбированного фага и вновь образовавшегося фага.

Определение фагочувствительности бактерий проводили на питательном агаре путем нанесения фага петлей на газон исследуемого штамма, приготовленный двухслойным методом. Концентрация испытуемых фагов составляла 106 -107 и.ц. в 1 мл.

Результаты исследований подвергались статистической обработке согласно общепринятым методам. Вычисляли среднюю арифметическую, ошибку средней арифметической (ш). При необходимости проводили статистическую обработку с использованием метода альтернативного варьирования. Сравнение показателей проводилось с использованием ^критерия Стыодента.

Результаты н их обсуждение

Биологические свойства штаммов серраций. Изученные штаммы серраций имели типичную морфологию и представляли собой грамотрицательные, подвижные палочки. При росте на питательных средах у 14 штаммов отмечено образование красно-розового пигмента. Пигмент чаще выявлялся у серраций, выделенных из внешней среды (у 13 штаммов, или 72,2%), тогда как из клинических штаммов такой способностью обладал лишь 1 (1418).

Для характеристики основных биологических свойств изученных штаммов проведено исследование их биохимических свойств, чувствительности к антибиотикам, выявление факторов вирулентности и плазмидного профиля ДНК бактерий.

Исследование биохимических свойств серраций показало, что все штаммы не продуцировали оксидазу, уреазу, фенилаланин-дезаминазу и аргининдекарбоксилазу, не ферментировали дульцит. У подавляющего большинства исследованных культур отмечено образование р- галактозидазы, лизин- и орнитиндекарбоксилазы,

утилизация цитрата, ферментация глюкозы, сахарозы, маннозы, маннита, мальтозы, сорбита, инозита, салицина. Серрации редко образовывали сероводород и индол (5,4-9,4%), утилизировали мало-нат (21,6%). Желатиназная активность, способность ферментировать лактозу, арабинозу, рамнозу, адонит выявлены у 36,6-52,7% культур. Между клиническими штаммами серрации и культурами, выделенными из внешней среды, отмечены определенные различия в биохимических свойствах. Последние достоверно реже продуцировали лизин- и орнитиндекарбоксилазу, обладали желатиназной активностью (Р < 0,05). Эти штаммы достоверно чаще ферментировали лактозу и рамнозу (Р < 0,05). Попытки разграничения исследованных бактерий по ферментативной активности на биотипы не дали положительных результатов - способность ферментировать лактозу и рамнозу в большинстве случаев совпадала.

Исследование чувствительности серраций к 18 антибиотикам, представляющим 10 групп по химической структуре, показало сравнительно высокую устойчивость их к антибиотикам. Все испытанные штаммы были устойчивыми лишь к линкомицину. Наибольшую устойчивость серрации проявляли к макролидам (89,294,6%). К беталактамным антибиотикам группы пенициллина чувствительность была выражена по-разному - высоко устойчивыми бактерии были к пенициллину и оксациллину и в меньшей степени - к карбенициллину и ампициллину. Наименьшую устойчивость серрации проявляли к аминогликозидам, особенно к гентамицину и стрептомицину. Штаммы, выделенные из внешней среды, несколько отличались от клинических. Для них была характерна низкая устойчивость к ампициллину и более высокая к канамицину и неомицину. У клинических штаммов, выделенных из различного материала, существенных различий в чувствительности к антибиотикам не отмечено.

Изученные штаммы серраций характеризовались близкой чувствительностью к антибиотикам. Перечни антибиотиков, к кото-р ум были устойчивы бактерии, т.е. их резистенс-типы, были практи-« зеки близкими и разграничить бактерии по этим критериям не пред-с гавляется возможным.

Представляло интерес выяснить распространение среди изученных культур серраций полирезистентньгх штаммов, характеризующихся множественной устойчивостью к антибиотикам (таблица 1).

ТАБЛИЦА 1 Множественно устойчивые штаммы серраций

Группа штаммов Число штаммов Полирезистентные штаммы

число в %%(Х±ш)

Клинические: 56 31 55,3 ±6,6

из фекалий 19 9 64,7±10,9

из выделений 17 11 58,3±5,4

из гнойного 20 11 55,0± 11,1

отделяемого

Из внешней среды 18 5 27,8+10,5

Всего: 74 36 48,6±5,8

К таким штаммам мы относили культуры, устойчивые не менее чем к 7 группам из 10 использованных групп антибиотиков. Сер-рации, обладавшие множественной устойчивостью к антибиотикам, составляли 48,6% исследованных культур, причем среди штаммов, выделенных из внешней среды, их было достоверно меньше, чем среди клинических штаммов (Р < 0,05). Следует отметить, что серрации, изолированные из различного патологического материала, обладали близкими значениями распространения множественно устойчивых штаммов (таблица 1).

Исследовано распространение среди культур серраций факторов вирулентности. Определялись факторы вирулентности, относящиеся по механизму действия к разным группам: факторы адге-зивности, персистенции и токсичности. Способность бактерий к адгезии определялась по комплексу тестов, характеризующих это свойство. Исследовали адгезивность бактерий на эритроцита?, человека группы 0(1)Ш1+, способность бактерий агглютинировать эритроциты человека и барана, а также адсорбировать краситель конго красный. Адгезивноактивными считались культуры, у которых значения ИАМ были выше 2,5. К таким штаммам отнесены 52, или 70,3±5,3%. Высокоадгезивные штаммы (ИАМ > 4,0) составили 32,6% адгезивноактивных культур (17 штаммов), или 23% среди всех

исследованных, причем среди клинических и штаммов из внешней среды доля таких штаммов была близкой - соответственно 32,5% и 33,3%. Несколько чаще такие штаммы встречались среди культур, выделенных из выделений больных - 42,8% адгезивноактивных штаммов (таблица 2).

ТАБЛИЦА 2

Адгезивные свойства серраций (число/процент штаммов)

Группа штаммов Число штаммов Адгезивно-активные штаммы Агглютинация эритр. человека Агглютинация эритр. барана Адсорбция конго красного

Клинические: 56 43/76,8 12/21,4 38/67,8 40/71,4

из фекалий 19 12/63,1 2/10,5 11/57,9 13/68,4

из выделений 17 14/82,3 5/29,4 12/70,6 12/70,6

из гнойного отделяемого 20 17/85,0 5/25,0 15/75,0 15/75,0

Из внешней среды 18 9/50,0 1/5,5 12/66,7 9/50,0

Всего: 74 52/70,3 13/17,6 50/67,6 49/66,2

Средние значения ИАМ у всей совокупности изученных культур серраций соответствовали среднеадгезивным штаммам и составляли 3,12+0,11. Колебания средних значений показателя ИАМ у клинических штаммов и культур, выделенных из внешней среды, были несущественными (3,19 и 2,89). Также не было существенных различий в средних значениях этого показателя у серраций, выделенных из различного патологического материала.

Изученные штаммы серраций характеризовались низкой способностью агглютинировать эритроциты человека - такие свойства обнаружены лишь у 13 штаммов (17,6%), из которых 12 принадлежали к группе клинических штаммов (таблица 2). Из этих культур лишь у 3 выявлены маннозорезистентные гемагглютинины. Способность агглютинировать эритроциты барана была выражена у серраций значительно лучше. Такими свойствами обладали 50 штаммов (67,6%), причем частота выявления этой способности у

штаммов различных групп была близкой - 57,9-75%. В подавляющем большинстве случаев эти гемагглютинины были маннозоре-зистентными - лишь у 7 штаммов выявлены маннозочувствительные гемагглютинины. Гемагглютинины у всех культур, изолированных из выделений больных, были маннозорезистентными. Большинство исследованных штаммов серраций были способны адсорбировать конго красный - 66,2% исследованных штаммов. Это свойство примерно с равной частотой выявлялось у культур разных групп.

Способность серраций к персистенции определялась по выраженности у них антилизоцимной активности. Такая способность выявлена у подавляющего большинства исследованных культур - у 63, или 85,1% (таблица 3).

ТАБЛИЦА 3

Распространение антилизоцимной активности у серраций

Группа штаммов Число штаммов Число штаммов с антилизоцимной активностью Процент штаммов с антилизоцимной активностью (Х±ш)

Клинические: 56 48 85,7± 4,7

из фекалий 19 15 78,9± 9,4

из выделений 17 13 76,5± 10,3

из гнойного 20 20 100,0

отделяемого

Из внешней среды 18 15 83,3± 8,8

Всего: 74 63 85,1± 4,1

Частота выявления антилизоцимной активности у бактерий различных групп была близкой. Уровень антилизоцимной активности у подавляющего большинства изученных культур серраций был низким и средним. К штаммам с низким уровнем антилизоцимной активности мы относили культуры с активностью 1-

2 мкг/мл, к штаммам со средним уровнем - 3-5 мкг/мл, с высокой -6 мкг/мл. Культуры с низким и средним уровнем антилизоцимной активности составляли 81% исследованных штаммов.

Штаммы серраций с высокой антилизоцимной активностью отмечены только среди клинических штаммов. Соотношения штаммов с низким и средним уровнем антилизоцимной активности в разных группах серраций были близкие. Лишь у штаммов из внешней среды отмечено существенное преобладание культур с низким уровнем антилизоцимной активности (61,1% против 22,2%, Р < 0,05). Антилизоцимная активность серраций, выделенных из объектов внешней среды, была ниже, чем у клинических штаммов. Уровень антилизоцимной активности культур, изолированных из различного патологического материала, существенно не различался.

Определение у серраций гемолизинов двух типов (а -гемолизинов и тиолзависимых гемолизинов) выявило гемолитическую способность у 28 штаммов (37,8%), причем а- гемолизины обнаружены у 24 культур серраций, а тиолзависимые гемолизины -лишь у 4. Гемолитическая способность выявлялась у серраций различных групп с близкой частотой - 31,6-45%. Подобная картина наблюдалась как в отношении а -гемолизинов, так и у тиолзависимых гемолизинов.

Электрофоретическое определение плазмидного профиля ДНК у серраций позволило обнаружить наличие плазмид у 23 штаммов (31,1%). Распространение плазмидосодержащих штаммов среди культур разных групп было близким и составляло 17,647,4%. У большинства плазмидосодержащих штаммов серраций выявлено по 1 плазмиде (15 культур из 23, 65,3%), 5 штаммов содержали по 2 плазмиды и 3 - по 3 плазмиды. Выявленные плазми-ды относились к крупным и обладали молекулярной массой 40-90 МД. Среди выявленных плазмид чаще встречались плазмиды молекулярной массы 50-60 МД, которые составляли 52,9% среди обнаруженных плазмид. Такие плазмиды преобладали у серраций всех выделенных нами групп.

Исследованные штаммы серраций были подвергнуты типи-рованию на основании имеющихся у них факторов вирулентности -патотипированию. Среди исследованных штаммов серраций обнаружены 19 из 24 возможных патотипов, в которые входили от 1 до 12 штаммов. Наибольшее число культур принадлежало к патотипам 2г и 2я (16 штаммов), 4г, и (17 штаммов). Большинство этих штаммов относилось к клиническим. Следует отметить, что среди изоли-

рованных из гнойного отделяемого больных штаммов серраций 40% относились к патотипу 2 (эти культуры характеризовались выраженной адгезивной и персистирующей способностями), а 35% - к патотипу 4 (обладали адгезивной и гемолитической способностями). Среди культур, полученных из выделений больных, по 29,4% штаммов принадлежали к патотипам 4 и 5. В то же время штаммы, изолированные из фекалий, принадлежали к различным патотипам. Из объектов внешней среды высевались серрации разных патотипов, однако 36,9% их приходилось на патотип 8, не обладавший факторами вирулентности.

Биологические свойства фагов серраций. Проведено исследование основных биологических свойств фагов Serratia, которые имеют значение при классификации фагов.

Негативные колонии изученных фагов сравнительно мало различались между собой. Они имели мелкие размеры (до 2 мм в диаметре), ровные края. На основании размеров колоний и степени их прозрачности у изученных фагов нами выделены 3 типа негативных колоний. Наиболее распространенным типом негативных колоний у фагов серраций является I. Это колонии диаметром 1-2 мм, прозрачные с ровным краем. Такие колонии имели 13 из 17 изученных фагов. Негативные колонии II типа отличались от предыдущего более мелкими размерами - это были точечные колонии, диаметр которых составлял 0,2-0,3 мм. Подобные негативные колонии выявлены у одного фага Ф9. Наконец, негативные колонии III типа имели размеры 1-2 мм, но были мутными. Такие колонии отмечены у 3 фагов Нальчикской коллекции (30/5, 31/5, 32/5).

Результаты опытов нейтрализации фагов 3 полученными антифаговыми сыворотками показали наличие определенного антигенного родства между большинством изученных фагов Serratia (таблица 4).

Изученные фаги в основном являются однородными в антигенном отношении и имеют общие антигены. Об этом свидетельствует тот факт, что все изученные фаги в той или иной степени нейтрализовались всеми полученными сыворотками. Исходя из приведенных выше критериев, оказалось возможным выделить 4 сероти-па фагов серраций. Большинство фагов отнесены к серотипу 1.

ТАБЛИЦА 4

Нейтрализация фагов Serratia антифаговыми сыворотками (в %%)

Серотип Фаг Сыворотка

ФЗ Ф5 32/5

1 Ф2 98,8 99,2 95,9

Ф4 88,1 99,5 81,6

Ф6 99,1 98,9 97,0

Ф8 93,4 99,8 95,9

Ф9 98,8 98,8 98,8

Ф10 86,7 91,7 88,6

Ф11 99,0 98,0 90,2

5/5 98,8 93,4 93,5

Р/5 99,4 98,0 95,4

29/5 99,5 88,8 88,6

30/ 99,4 68,0 98,7

31/5 99,4 86,0 98,5

32/5 99,5 73,0 98,7

2 Ф1 98,5 97,6 68,9

3 Ф5 20,6 99,4 99,4

Ф7 57,1 91,5 73,4

4 ФЗ 99,7 69,3 5,2

Исследована чувствительность фагов серраций к воздействию температуры и хлороформа. Отношение фагов к температурному воздействию определяли при 10-минутной экспозиции при температурах 45°, 50°, 55° и 60°С. Опыты показали, что при температуре 45°С инактивации исследованных фагов не происходило. При температуре 50°С значительная инактивация отмечалась лишь у

фагов 5/5, Р/5 и 29/5 (более 99%). Фаги Ф2 и Ф6 инактивировались на 65-74%, а остальные фаги либо вовсе не инактивировались либо их инактивация составляла менее 48%. По отношению к температуре 55°С оказалось возможным выделить 3 группы фагов серраций. Первую составили термоустойчивые фаги (ФЗ, Ф4, Ф5), для которых константа скорости инактивации (К) была 0,07-0,089 мин1. Во вторую группу включены термочувствительные фаги с величиной К, равной 0,51-0,85 мшг": Ф6, Ф7, Ф8, Ф9, Ф11, 5/5, Р/5, 29/5,31/5, 32/5. К третьей группе можно отнести умеренно чувствительные к температуре фаги Ф1, Ф2, Ф10, 30/5 (К = 0,23-0,42 мин1). При температуре 60°С изученные фаги практически полностью инактивировались. Среди фагов обеих использованных коллекций встречались фаги различной термоустойчивости. Так, фаги Английской коллекции ФЗ, Ф4, Ф5 могут быть отнесены к термоустойчивым, фаги Ф1,Ф2, Ф10 - к умеренно устойчивым, а остальные фаги - к термочувствительным. Среди фагов Нальчикской коллекции лишь фаг 30/5 обладал умеренной устойчивостью к температуре, остальные фаги были термочувствительными. Какой-либо связи термоустойчивости фагов серраций с их серотипом и типом негативных колоний не отмечено.

Определение чувствительности фагов к воздействию хлороформа (1:10) показало, что в течение 15-20 минут существенной инактивации фагов не происходит. Исходя из этого, изученные фаги серраций могут рассматриваться как устойчивые к хлороформу, и обработка этим препаратом может быть использована при получении фаговых суспензий.

Все изученные фаги Serratia пассировались на одном хозяине - штамме N 5. Для выяснения способности фагов лизогенизировать этот штамм получены вторичные фагоустойчивые варианты штамма N5. Все полученные фагоустойчивые штаммы обладали способностью продуцировать фаги. Таким образом, изученные фаги серраций можно считать умеренными в отношении индикаторного штамма N 5. Полученные фагоустойчивые варианты штамма N 5 испытаны на чувствительность ко всем фагам обеих коллекций. Существенных различий между фагами обеих коллекций не наблюдается.

Исходя из полученных результатов изучения перекрестной чувствительности вторичных резистентных культур индикаторного штамма, фаги серраций могут быть объединены в 5 групп: 1-ю соста-

вили фаги 5/5, Р/5, 29/5, 30/5, 31/5, 32/5, Ф2,Ф7,Ф10,Ф11; 2-ю группу - фаги ФЗ, Ф6, Ф8, Ф9; 3-ю - фаг Ф1, 4-ю - фаг Ф4 и 5-ю - фаг Ф5.

Адсорбцию фагов на чувствительных клетках индикаторного штамма N 5 изучали при температуре 37°С в питательном бульоне. Изученные фаги серраций сравнительно медленно адсорбировались на индикаторном штамме. К 30 минуте адсорбировалось 50-70% фаговых частиц, к 40 минуте - 65-90%. Константы скорости адсорбции фагов серраций колебались в пределах 0,48-4,3x109 мл/мин. По величине этого показателя исследованные фаги можно распределить условно в 3 группы. К первой отнесены фаги, у которых константа скорости адсорбции была ниже 1х 10 9 мл/мин (фа-ги Ф1, Ф2, Ф6, Ф7, Ф9, Ф10, Ф11, 5/5, Р/5, 29/5, 32/5). Во вторую группу вошли фаги, у которых эта величина составляла 1-2х10"9 мл/мин (фаги Ф5, Ф8, 30/5). В третью группу включены фаги, у которых скорость адсорбции превышала 2х109 мл/мин (фаги ФЗ, Ф4, 31/5). Существенных различий между фагами Английской и Нальчикской коллекций по величине константы скорости адсорбции не отмечено (если для первых средняя величина этого показателя составляла 1,3х10"9 мл/мин, то для фагов Нальчикской коллекции - 1,0х10-9 мл/мин). Также не установлено каких-либо связей между скоростью адсорбции фагов, их серотипом и типом негативных колоний.

Определяли длительность латентного периода и средний урожай фага на 1 бактериальную клетку. Изученные фаги характеризовались латентным периодом в диапазоне от 35 до 55 минут. По этому показателю фаги условно можно разделить на 4 группы. В первую группу можно включить фаги ФЗ и 5/5, для которых латентный период составлял 35-40 минут. Во вторую группу отнесены фаги с латентным периодом в 40-45 минут (фаги Ф1, Ф5, Ф6, Ф7, Ф9, Р/5, 30/5, 31/5, 32/5). Третью группу составили фаги Ф2, Ф4, Ф8, Ф11, 29/5 с латентным периодом 45-50 минут. Наконец, к четвертой группе отнесен фаг Ф10 с латентным периодом 50-55 минут. По величине латентного периода фаги обеих коллекций не различались между собой, не выявлено связей длительности латентного периода с серотипом фагов и типом их негативных колоний.

Величина среднего урожая фаговых частиц на 1 инфицированную бактериальную клетку при использованной методике колебалась в пределах от 3,4 до 15,8. По данному параметру изученные фаги условно распределены в 3 группы. К первой отнесены фаги с урожаем до 5 частиц на 1 клетку (фаги Ф2, Фб, Р/5, 31/5), ко второй - фаги со средним урожаем от 5 до 10 частиц на клетку (фаги Ф1, Ф4, Ф8,

Ф10, Ф11, 29/5, 30/5, 32/5) и к третьей группе - фаги с урожаем свыше 10 на 1 клетку (фаги ФЗ, Ф5, Ф7, Ф9, 5/5). Каких-либо существенных различий в величине среднего урожая фагов разных коллекций, серотипов и типов негативных колоний не отмечено. Можно выделить лишь фаг ФЗ, отнесеннный к серотипу 4, у которого латентный период был 35-40 минут, а средний урожай самый высокий среди изученных фагов (15,8).

Спектр действия фагов и фаготипирование серраций. Для установления специфичности изученных фагов серраций проведены испытания их на всех 74 штаммах этих бактерий, а также на 86 штаммах, представляющих другие роды семейства Enterobacte-riaceae. Ни один из испытанных штаммов бактерий других родов фагами серраций не лизировался. Изученные фаги серраций являются высоко специфичными для штаммов S.marcescens, так как ими лизировались только культуры этого вида (88,6%). Ни один из 4 штаммов S.liquefaciens не был чувствительным ни к одному из использованных фагов.

Определена чувствительность 74 штаммов серраций ко всем 17 фагам - фагочувствительными оказались 62 штамма (83,8±4,3%). Среди клинических штаммов чувствительные к фагам составили 85,7±4,7%, а среди культур, выделенных из объектов внешней среды - 77,8±9,8%. Среди клинических штаммов наиболее низкая фагочув-ствительность отмечена у культур серраций, изолированных из фекалий, - у 12 штаммов из 19 (63,5±11,0%). В то же время все штаммы, выделенные из гнойного отделяемого, были чувствительными к фагам, а среди культур, изолированных из различных выделений больных, фагочувствительные составили 94,1 ±5,7%, что достоверно выше, чем у штаммов, выделенных из фекалий. Однако, среди этих штаммов были 4 культуры S.liquefaciens, нечувствительные к фагам. Если учитывать только культуры S.marcescens, то фа-гочувствительность серраций этой группы существенно не отличается от других групп клинических штаммов - фагочувствительными были 12 из 15 штаммов (80,0±10,3%).

Фагами Нальчикской коллекции лизировались 53 штамма, а Анлийской -57. Каких-либо существенных различий в чувствительности к фагам обеих коллекций культур, отнесенных нами к разным группам, не отмечено. Однако, только фагами Английской коллекции лизировалось несколько большее число исследованных штам-

мов (9, или 18,7±5,6% фагочувствительных культур), чем только фагами Нальчикской коллекции (5, или 10,4±4,4%).

Использованные фаги обладали различными спектрами действия. Ими лизировались от 16 до 51 штамма. При этом фагами Нальчикской коллекции лизировались от 16 до 43 штаммов, а фагами Английской коллекции - от 17 до 51.

Среди фагов Нальчикской коллекции выявлен более широкий спектр действия в отношении культур серраций, выделенных из внешней среды по сравнению с фагами Английской коллекции: 2 фага имели узкий спектр действия и 4 - широкий, тогда как среди фагов Английской коллекции узким спектром действия в отношении этой группы культур обладали 8 фагов.

По отношению к клиническим штаммам фаги обеих коллекций не имели существенных различий. Все фаги Английской коллекции обладали широким спектром действия, тогда как среди фагов Нальчикской коллекции таким спектром действия характеризовались 5 фагов из 6. Наиболее широким спектром действия обладали фаг Английской коллекции Ф4, который лизировал 51 штамм, и фаг Нальчикской коллекции 32/5, лизировавший 43 штамма.

Как было показано, спектр действия исследованных фагов серраций был различным. Благодаря этому, представляется возможным разграничить культуры этих бактерий по их чувствительности к фагам, т.е. провести фаготипирование этих микробов.

Учитывая, что для фаготипирования целесообразно использовать ограниченное число типовых фагов, в качестве таковых были отобраны 4 фага: по 2 фага из каждой коллекции. Отбирались, в первую очередь, фаги, обладавшие широким спектром действия и лизировавшие культуры, устойчивые к другим фагам.

Типовыми фагами являлись фаги 30/5 и 32/5 из Нальчикской коллекция и Ф4 и Ф11 из Английской коллекции. Фаги Ф4 и 32/5 обладали очень широким спектром действия. Фаги Ф11 и 30/5 характеризовались широким спектром действия.

Все типовые фаги относились к 1 серотипу. Фаг Ф4 был термоустойчивым, остальные типовые фаги - термочувствительными. Фаг Ф4 по результатам изучения перекрестной чувствительности вторичных резистентных культур отличался от 3 остальных фагов, которые оказались близкими между собой по этому признаку. Ото-

бранные типовые фаги характеризовались близкими значениями параметров взаимодействия с чувствительными бактериями (латентный период у них составлял 40-50 минут, средний урожай -5,6-6 частиц на 1 клетку, скорость адсорбции у них колебалась в пределах 0,48 - 2,2x10 5-9 0 мл/мин).

На основании фагочувствительности бактерий к отобранным типовым фагам разработана предварительная схема фаго-типирования культур Б-шагсезсепБ (таблица 5).

ТАБЛИЦА 5

Схема фаготипирования Б.шагсезсепз

Фаготип Число штаммов Чувствительность к фагам

Ф4 ФП 30/5 32/5

1 9 + + + +

2 1 + + + -

3 8 + + - -

4 11 + - + +

5 1 - + + +

6 1 + + - -

7 2 + - + -

8 10 + - - +

9 1 - + + -

10 1 - - + +

11 8 + - - -

12 2 - + - -

13 1 - - + -

14 3 - - - +

С помощью отобранных фагов из 70 штаммов З.тагсезсеш удалось типировать 59 культур (84,3% исследованных штаммов, или 95,2% фагочувствительных штаммов этих бактерий). Ориентировочно выделены 14 фаготипов, которые включают от 1 до 11 штаммов.

Отмечено определенное преобладание некоторых фаготипов. Так, чаще других встречались фаготипы 4 (11 штаммов, или 18,6% типи-руемых кз'льтур), 8 (10 штаммов - 16,9%), 1 (9 штаммов - 15,2%), 3 и 11 (по 8 штаммов - 13,5%). Распределение фаготипов среди серраций различных групп было неодинаковым. Так, штаммы фаготипа 1 встречались только среди клинических культур, причем большей частью из гнойного отделяемого - 6 штаммов из 9. Также среди культур фаготипа 3 преобладали культуры, выделенные из гнойного отделяемого (6 из 8 штаммов). Культуры фаготипа 4 чаще встречались среди штаммов, выделенных из фекалий и из выделений больных (5 и 4 штамма соответственно). Штаммы фаготипа 8 встречались равномерно среди серраций различных групп. В то же время среди штаммов из внешней среды чаще встречались культуры фаготипа 11 - 5 штаммов из 8 культур этого фаготипа приходились на штаммы, выделенные из объектов внешней среды.

Анализ фаготипов серраций показал, что в ряде случаев из близких очагов высевались культуры одного фаготипа. Так, среди 32 штаммов, выделенных при вспышке менингококковой инфекции в Москве в 1981-1982 гг., 31 штамм был типирован. Выявлены культуры серраций фаготипов: 1, 3, 4, 8, 11, 12 и 14. Изолированные из фекалий 4 штамма Блпагсезсепз относились к разным фаготипам, тогда как из выделений больных высеяны 2 штамма фаготипа 1,4- фаготипа 4 и 3 - фаготипа 8. В гнойном отделяе-мом также преобладали культуры фаготипа 1 (4 штамма), фаготипов 3 и 8 (по 2 штамма). Из объектов внешней среды чаще высевались штаммы фаготипа 11 (3 штамма), 8 и 14 (по 2 штамма). Выделенные из фекалий в Харькове 2 штамма относились к фаготипу 4. Среди 7 культур серраций, выделенных из внешней среды (почва) в Минске в 1951 г., 2 принадлежали к фаготипу 11. Полученные из Лондона штаммы серраций отнесены к фаготипу 3 (4 штамма), 1 (2 штамма), 5, 6, 11, 12 (по 1 штамму).

выводы

1. Исследование 74 штаммов серраций, выделенных от больных и из внешней среды, показало слабую гетерогенность бактерий по их биохимическим свойствам и чувствительности к антибиотикам. Среди исследованных штаммов 48,6% обладали полирезистентностью к антибиотикам.

2. Серрации характеризовались наличием факторов вирулентности с различным мехнизмом действия: адгезивностью, перси-стирующей способностью, гемолитическими свойствами. Существенных различий между штаммами из разного патологического материала по этим свойствам не выявлено. Штаммы из внешней среды характеризовались низкой вирулентностью.

3. На основании комплекса факторов вирулентности с учетом полирезистентности осуществлено патотипирование серраций.

4. Исследование 17 фагов Б.шагсезсепз из двух коллекций показало определенную близость между фагами по антигенным свойствам, чувствительности к инактивирующим агентам, параметрам взаимодействия с чувствительными клетками. Фаги характеризовались различиями в спектре действия.

5. С помощью 4 типовых фагов (30/5, 32/5, Ф4, Ф11) разработана схема фаготипирования З.тагсезсет, включающая 14 фаготи-пов, в которые входят 84,4% испытанных культур этих бактерий.

6. Эпидемиологическими маркерами серраций могут служить полирезистентность бактерий, наличие факторов вирулентности, содержание плазмид, фаготип бактерий.

Список опубликованных работ

1. Адгезивные свойства некоторых представителей условно-патогенных энтеробактерий /Габрилович И.М., Блиева JI.3., Габрилович М.И. и др./-// Фундаментальные основы жизнедеятельности организма в норме и патологии.- Нальчик, 1994.-С.40-44.

2. Фаготипирование в контроле за внутрибольничными инфекциями, обусловленными условно-патогенными энтеробакте-риями /Габрилович И.М., Бакова Ф.Т., Блиева Л.З. и др./-// Фундаментальные и прикладные вопросы естественных наук (региональные проблемы).-Махачкала, 1994.-С.88-89.

3. Использование фагов в диагностике условно-патогенных энтеробактерий / Алакаев А.Б., Бакова Ф.Т., Блиева Л.З. и др. /-// Материалы научно-практической конференции Кабардино-Балкарской государственной сельхозяйственной академии (1994 г.). - Нальчик, 1995.-С. 173-174.

4. Характеристика клинических штаммов серраций /Блиева Л.З./-//Достижения медицинской науки-практическому здравоохранению.-Нальчик, 1995.-С. 16-17.

5. Патовары как эпидемиологические маркеры условно-патогенных энтеробактерий /Габрилович И.М., Бакова Ф.Т., Блиева Л.З. и др./-// Идеи И.И.Мечникова и развитие современного естс-ствознания.-Харьков, 1995.-С.66-67.

, 6. Molecular marking of conditionally pathogenic enterobacteria' clinical strains / Gabrilovich I.M., Bakova F.T., Blieva L.Z. et al./-// Medicine.-Moscow, 1995.-II.-C.29-31.

7. Multiple antibiotic resistance as epidemiological marker of opportunistic Enterobacteria / Gabrilovich I.M., Bakova F.T., Blieva L.Z. et al/-//Medical Microbiology Letters, suppl.l.- 1996.-V.5.-C.19.

8. Сравнительное исследование фагов Serratia / Блиева Л.3., Гайрабеков Р.Х., Габрилович И.М.1-11 Гомеостаз и инфекционный процесс. - Саратов, 1996. - ч.1. - С.46.

9. Патотипирование в диагностике внутрибольничных инфекций / Габрилович И.М., Блиева Л.З., Габрилович М.И. и др./-// Материалы VII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - М..1997.-Т. 1.-C.172-I73.

Сдано в набор 3.11.97 г. Подписано в печать 4.11.97 г. Формат 60 х 84'/16. Бумага офсетная. Печать трафаретная. Гарнитура "Тайме". Усл.п.л. 1,2. Тираж 100 экз. Заказ 57.