Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Колицинотипирование эшерихий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Колицинотипирование эшерихий"

На правах рукописи

рг« ОД

1 7 июл ?000

ХАЛИШХОВА МАРИНА ХАЖМУДИНОВНА

КОЛИЦИНОТИПИРОВАНИЕ ЭШЕРИХИЙ

03.00.07 - МИКРОБИОЛОГИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нальчик - 2000

Работа выполнена в Кабардино-Балкарском государственном университете

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Габрилович И.М.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Шуб Г.М.,

доктор биологических наук, профессор Зыкин Л.Ф.

Ведущая организация: Ставропольский научно-

исследовательский противочумный институт

Защита диссертации состоится "упа^и Д в ча-

сов на заседании диссертационного совета Д 074.32.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410005, г.Саратов, ул.Университетская,46).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РНИПЧИ "Микроб".

Автореферат разослан " апреле &ссо г

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Г.А.Корнеев

Е№А О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Явление бактериоциногении, обусловленное продуцируемыми бактериями бактериоцинами, широко распространено среди микроорганизмов, состоит в антагонистическом действии одних бактерий в )тношении других и характеризуется достаточно высокой специфичностью. Зактериоцины проявляют высокую активность против различных бактерий, эезистентных к применяемым антимикробным препаратам, и могут составить резерв лечебных средств для практической медицины.

Явление бактериоциногении лучше всего изучено у энтеробактерий и, в тервую очередь, у эшерихий. Бактериоцины эшерихий (колицины) были 1ервыми среди обнаруженных бактериоцинов. На примере этих структур ¡ыявлены основные особенности бактериоцинов, их механизм действия Reeves, 1972; Konisky, 1973, 1978; Brandis, 1975).

Получены отдельные данные о возможности типирования бактерий рода Escherichia с использованием явления бактериоциногении (И.В.Голубева и :оавт.,1964; Н.В.Давьщова,1965). Однако, общепринятые схемы 5актериоцинотипирования эшерихий отсутствуют. Одной из причин этого [вляются изменения, происходящие среди тфкулиругощих у людей и кивотных микроорганизмов под влиянием различных факторов.

В то же время разграничение бактерий на основании их способности фодуцировать бактериоцины или проявлять чувствительность к таким ¡ещсствам представляет значительный интерес. Бактериоцинотипы могут :лужить одним из эпидемиологических маркеров бактерий, особенно федставляющих интерес с точки зрения внутрибольничных инфекций.

Эшерихии, как известно, являются одним из распространенных юзбудителей внутрибольничных инфекций. Методы их внутривидового ипирования достаточно разнообразны и не являются универсальными, ^еротипирование эшерихий дает очень большое разнообразие вариантов, громе того, происходит смена вариантов и появление новых серологических ¡ариантов этих бактерий. Один из распространенных методов типирования -[иготипирование - для эшерихий не разработан. Бакгсриоцинотишфование тляется одним из классических методов типирования, наряду с ^аготигафованием, серотипированием, биотипированием. Молекулярные ютоды тишфования эшерихий только разрабатываются (Vogel и соавт., 1999).

Цель и задачи работы. Исходя из сказанного, целью работы было [Зучение бактериоциногенных свойств клинических штаммов эшерихий для [спользования их в типировании бактерий.

Для реализации этой цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Выявить распространение бактериоцииогении среди клинически: штаммов эшерихий, выделенных из различных источников и из разны: регионов.

2. Установить возможности колицинотипирования бактерий по и: бактериоциночувствительносга и бактериоциногенности.

3. Выяснить связи между результатами колицинотипирования и другим) методами маркирования эшерихий.

Работа проводилась в соответствии с основными направлениями НШ Кабардино-Балкарского государственного университета. Тема: "Разработк; методов эпидемиологического маркирования возбудителей внутрибольничны: инфекций", зарегистрирована во ВНТИЦентре, № гос.регистрацш 01.91.0044705.

Научная новизна. Установлено достаточно широкое распространен» колициногенных штаммов у эшерихий различного происхождения Разработаны различные схемы типирования эшерихий на основании и: бактериоциногенности. Свежевыделенные штаммы эшерихий значительш лучше типируются с использованием бактериоцинов. Отмечен; корреляционная связь между результатами типирования эшерихий т основании разных методов типирования.

Практическая ценность. При сравнении 3 схем типирования эшерихш отобрана наиболее рациональная схема, включающая сочетание стандартны:' колициногенных штаммов E.coli и местных штаммов этих бактерий. С использованием этой схемы типированы 78% культур эшерихий, в том числе свежевыделенные штаммы типированы в 85% случаев. Полученные результаты находят использование в практической работе учреждений системь санэпиднадзора Кабардино-Балкарской Республики при анализе распространения эшерихий. Материалы диссертации внедрены в учебньп процесс в Кабардино-Балкарском государственном университете и Кабардино-Балкарской государственной сельскохозяйственной академии.

Апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 4 работах.

Полученные данные доложены:

1. На межвузовской научно-практической конференции, посвященной 40-летаю КБГУ "Актуальные проблемы биологии, медицины и сельского хозяйства в исследованиях молодых ученых КБР" (Нальчик, 1997).

2. На Северо-Кавказской региональной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Перспсктива-99" (Нальчик, 1999).

3. На научной конференции "Актуальные вопросы биологии и медицины", посвященной 30-летию кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Кабардино-Балкарского госуниверситета (Нальчик, 1999).

Положения, выносимые на защиту.

1. Среди клинических штаммов эшерихий достаточно часто выявляются :олициногенные штаммы.

2. Спектр действия продуцируемых колицинов различен и позволяет [роводить типирование бактерий.

3. Между эпидемиологическими маркерами эшерихий, в том числе и ¡актериоцинотипами, имеется корреляционная связь.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 123 траницах машинописи, иллюстрирована 25 таблицами и 4 рисунками, состоит [3 введения, обзора литературы, материалов и методов, 3 глав собственных ¡сследований, обсуждения полученных результатов, выводов и указателя итераторы, включающего 194 источника, из которых 39 отечественных и 155 арубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал н методы исследовании.

Материалом для исследования служили 129 штаммов Escherichia coli, из оторых 7 культур представляли коллекцию Fredericq, полученную из Харьковского научно-исследовательского института микробиологии и ммунологии им. И.И.Мечникова, а 122 штамма выделены из различного лииического материала от людей и животных и из внешней среды в разных ородах. Кроме того, в работе использованы 65 штаммов E.coli, вежевыделенных из мочи, кала и гнойного отделяемого больных, полученные .з бактериологической лаборатории Центра Госсанэпиднадзора г.Нальчика, ¡сего, таким образом, в исследованиях использованы 194 штамма E.coli.

Клинические штаммы E.coli выделены из гнойного отделяемого (42 ггамма), кала (37), мочи (25), мокроты (6), смывов (5) и от животных (7 ггаммов). Исследуемые культуры были выделены в 3 городах: в Москве - 19 ггаммов, в Черкесске - 19 штаммов и в Нальчике - 84 штамма.

При проведении исследований использованы также штаммы бактерий ругих родов семейства Enterobacteriaceae, имеющиеся в музее кафедры шкробиологии, вирусологии и иммунологии. Эти бактерии были редставлены 8 штаммами рода Klebsiella, 10 - рода Enterobacter, 5 - рода 'itrobacter и 6 - культурами рода Serratia.

В работе использовались питательные среды, приготовленные из онцентратов производства Дагестанского научно-производственного бъединения "Питательные среды" (Махачкала): 1,5% и 0,7% питательный гар, а также питательный бульон.

Посевы культивировались в течение 18-48 часов при температуре 37°С.

Исследование бактерий проводили в соответствии с общепринятыми методиками.

Выявление колициногенности проводили методом отсроченного антагонизма по Fredericq (1957). Исследуемые штаммы засевались на поверхность агара в виде "бляшек", посевы инкубировались в течение 48 часов при температуре 37°С, после чего обрабатывались парами хлороформа в течение 20-30 минут, а затем на чашки наслаивалась суточная бульонная культура индикаторного штамма, внесенная в количестве 0,3 мл в 2,5 мл расплавленного и охлажденного до 37-38°С 0,7% питательного агара. Результаты учитывались после 24 часов инкубации. Вокруг колициногенного штамма формировалась зона подавления роста индикаторной культуры.

При проведении дифференциации бактериоцинов от бактериофагов из зоны подавления роста бактерий производился пассаж материала в питательном бульоне с индикаторной культурой. После суточной инкубации посевы центрифугировались и надосадочная жидкость испытывалась на наличие фага.

Исследование чувствительности бактерий к колицинам проводилось по той же методике отсроченного антагонизма.

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам проводилось диффузией в агаре с помощью метода стандартных дисков. Учет результатов проводился согласно соответствующей Инструкции.

Для исследования профиля плазмидной ДНК использовали метод вертикального электрофореза в 0,7% агарозе (Eckhardt, 1978). Молекулярная масса выявляемых плазмид устанавливалась при использовании реперных плазмид: RP-4 (40 МД), Rmsl48 (95 МД), pBR 322 (2,8 МД), RSF1010 (5,5 МД).

Адгезивную способность бактерий определяли по методике В.И.Брилиса и соавт.(1986) с использованием формалинизированных эритроцитов человека группы 0(I)Rli+. Устанавливали средний процент адгезии, коэффициент участия эритроцитов и индекс адгезивности микроорганизмов (ИАМ), на основании чего бактерии считались неадгезивными (ИАМ<1,75), низкоадгезивными (ИАМ= 1,76-2,5), средне-адгезивными (ИАМ = 2,51-4,0) и высокоадгезивными (ИАМ > 4,0). Подсчет вели на 50 эритроцитах.

Гемагглютинирующую активность определяли в реакции гемагглютинации, которую ставили на плексигласовых панелях с 3% взвесью свежих эритроцитов человека группы 0(I)Rh+ и барана. D-Маннозорезистентная гемагглютинация выявлялась при добавлении к взвеси эритроцитов 1,5% D-маннозы.

Способность бактерий адсорбировать краситель конго красный станавливалась на 1,5% питательном агаре с 0,02% казаминовых кислот и ,01% конго красного.

Ангилизоцимная активность определялась по методике О.В.Бухарина и оавт.(1984), основанной на принципе "отсроченного антагонизма". )пределения проводили в диапазоне концентраций от 1 до 8 мкг/мл. Тест-ультурой служил штамм Micrococcus luteus var. lysodeikticus N2665.

Гемолитическую активность бактерий изучали на питательном агаре с 3% отмытых в растворе Хенкса эритроцитов кролика. Для выявления иолзависимых гемолизинов использовался питательный агар с 0,002% L-истеина. Культуры засевались уколом, гемолиз учитывался через 24-48 часов.

Патотипирование бактерий проводилось согласно рабочей схемы пределения патоваров (И.М.Габрилович,1996).

При патотипировании учитывали факторы вирулентности, редставляющие 3 различные группы по механизму их действия (факторы цгезивности, персистенции и токсичности) и множественную устойчивость к нтибиотикам.

Адгезивность устанавливали на основании комплексного изучения оказателей этого процесса. Адгезивными считались культуры, обладавшие эчетанием, по крайней мере, 2 показателей адгезивных свойств, из которых цин - ИАМ > 2,5, а второй - гемагглютинационная способность либо зеорбция конго красного. Кроме того, к адгезивным относили культуры элько по величине ИАМ, если она превышала 4,0.

Показателем персистенции бактерий служила антилизоцимная ктивность не ниже уровня 3-4 мкг/мл.

Критерием токсичности была гемолитическая способность бактерий: родукция ими а- гемолизинов и тиолзависимых гемолизинов. При наличии юлзависимых гемолизинов патовар выделялся знаком "t".

Полученные результаты при необходимости подвергались статистической зработке, для которой использовались общепринятые методики. Проводили тределение средней арифметической, ошибки средней арифметической. При 5работке по альтернативной изменчивости также вычисляли среднюю пибку. Достоверность различий показателей определяли по критерию тьюдента.

Корреляционный анализ проводили согласно общепринятым критериям с ¡пользованием специальной программы "Полный корреляционный анализ" 5.Б.Бозиев и А.Б.Бозиев,1995), позволяющей определить все основные эказатели линейной и нелинейной корреляционной связи между двумя 1блюдаемыми величинами.

Вычисления проводились на компьютере IBM PS-AT Pcntiuin-100 ] системе FOXPRO.

Результаты н их обсуждение.

Распространение колициногении среди эшерихий. С целью обнаружен! колициногенных штаммов Escherichia coli перекрестному испытанию бьи подвергнуты 129 штаммов. В результате проведенных исследоваш колициногенными были признаны 27 штаммов, среди которых 4 штамма (Ca Са38, Са42, Са53) входят в серию стандартных штаммов Fredericq, а S являются клиническими.

Для исключения наличия фагов в этих штаммах они были подвергну! пассированию на чувствительных культурах. Ни в одном случае признаков фа не было обнаружено. Это дало возможность считать выявленные штамм колициногенными. Таким образом, частота обнаружения колициногеннь штаммов среди исследованных клинических штаммов составляет 18,8±3,5%, среди всех исследованных культур эшерихий - 17,8+3,4%.

Из 23 выявленных колициногенных штаммов 10 были вьщелены i гнойного отделяемого (24,4% штаммов, выделенных из этого материала), 5 - i кала (13,5%), 4 - из мочи (16,0%), 2 - из мокроты (33,3%) и по одному штамд - из смывов (20,0%) и от животных (14,3%), т.е. частота обнаружен! колициногенных штаммов среди культур, выделенных из разных источнико была близкой.

Среди выявленных колициногенных штаммов 14 представляли культур] выделенные в Нальчике (16,7+4,0% этих штаммов), 6 - изолированные Черкесске (31,6+10,6%) и 3 - выделенные в Москве (15,8+8,3%). Различ! между этими группами культур были несущественными (Р>0,05).

Таким образом, каких-либо заметных связей между распространение колициногенных культур эшерихий и их происхождением не обнаружено.

Колициночувствительными были 80 штаммов (62,0±9,0%). Среди них штаммов представляли коллекцию Frcdericq. Таким образом, срс; клинических штаммов эшерихий колициночувствительные составш 60,6+4.4%. Таких штаммов было 74.

Среди колициночувствительных культур 6 были выделены в Моею (31,6±10,6% штаммов этой группы), 15 - в Черкесске (78,9±9,3%) и 53 -Нальчике (63,1+5,3%). Эти данные показывают, что Московские штамм обладают достоверно меньшей чувствительностью к колицинам по сравнению двумя остальными группами (Р<0,05).

Больше всего колициночувствительных штаммов было среди культу выделенных из гнойного отделяемого - 24 штамма (57,1% таких штаммов). ; колициночувствительный штамм был выделен из кала (56,7%), 17 - из мо1

8,0%), б - от животных (85,7%), 4 - из мокроты (66,7%) и 2 - из смывов 0,0%). Эти данные в делом близки между собой.

Таким образом, колициногенные штаммы составляют 17,8-18,8% :следованных культур эшерихий, а чувствительность к колидинам проявляют 1,6-62% штаммов.

Для установления специфичности колицинов, продуцируемых швленными колициногенными штаммами, проведены испытания на штаммах ктерий некоторых родов семейства Enterobacteriaceae: Klebsiella - 8 штаммов, iterobacter - 10 штаммов, Citrobacter - 5 штаммов, Serratia - 6 штаммов.

Чувствительность к колицинам отмечена у 2 штаммов Klebsiella и 2 гаммов Enterobacter. 1 штамм клебсиелл проявил чувствительность к лицину, продуцируемому штаммом из коллекции Fredericq Са53, 1 - к гамму Са42 из этой же коллекции. Оба штамма бактерий рода Enterobacter :азались чувствительными к колицину штамма Са53.

Колициногенные культуры, выявленные среди клинических штаммов, не юявляли активности в отношении энтеробактерий других родов.

Таким образом, колицины выявленных колициногеиных штаммов ляются достаточно специфичными.

Колицины, продуцируемые выявленными колициногенными штаммами, [растеризовались различными спектрами действия. Для сравнения этих льтур между собой определялся индекс спектра действия (ИСД), за который снималось отношение числа чувствительных к данному колициногенному гамму культур эшерихий к общему числу исследованных культур (129 гаммов). Условно по величине ИСД исследованные колициногенные штаммы .тли разделены на 3 группы.

1 группу составили культуры с узким спектром действия продуцируемых щицинов (ИСД <0,1). К этим колицинам чувствительными были от 1 до 12 гаммов. Таких культур было 8. 2 группа включала 11 колициногеиных гаммов со средним спектром действия продуцируемых колицинов (ИСД в гсделах от 0,1 до 0,2). Чувствительность к этим колицинам отмечена у 13-24 :следованных штаммов. Среди штаммов этой группы 6 выделены в Нальчике, - в Черкесске и 1 - в Москве. Из гнойного отделяемого получены 4 штамма, ; мочи и кала - по 2, из мокроты и от животных - по одному штамму. Один гамм этой группы был из коллекции Fredericq (Са42). В 3 группу включены шициногенные штаммы с широким спектром действия продуцируемых ими шицинов. ИСД этих штаммов был более 0,2, к этим колицинам были 'вствительными более 26 штаммов.

Анализ спектров действия продуцируемых колицинов показывает, что льтуры, выделенные из кала, характеризовались более широким спектром

действия продуцируемых колицинов по сравнению со штаммами, выделенными из других источников.

Спектр чувствительности эшерихий к продуцируемым колицинам также был различным. Сравнение колициночувствительных культур между собой по чувствительности к бактериоцинам проводилось на основании индекса спектра чувствительности (ИСЧ), который рассчитывался путем определения отношения числа колициногенных штаммов, к которым чувствительна данная культура, к общему числу выявленных колициногенных штаммов.

В зависимости от величины ИСЧ исследованные бактерии условно разделены на 3 группы: чувствительные к 1-5 колициногенным штаммам, имеющие ИСЧ < 0,2; чувствительные к 6 - 11 колициногенным бактериоциногенным штаммам (ИСЧ = 0,2-0,4) и чувствительные более чем к 11 колициногенным штаммам (ИСЧ >0,4).

Больше всего исследованных культур относилось к 1 группе. Они характеризовались узким спектром чувствительности к колицинам - таких штаммов было 39 (48,7% чувствительных к колицинам культур). У 26 штаммов отмечен средний спектр чувствительности к колицинам - 32,5% чувствительных культур. Широкий спектр чувствительности к колицинам имели 15 штаммов (18,8%).

Наиболее высокой чувствительностью к колицинам характеризовались индикаторные штаммы из коллекции Ргсс1спсс1 11о\у и К12, которые были чувствительными к 25 и 23 колициногенным штаммам соответственно. Третий индикаторный штамм из этой коллекции (В) был чувствительным к 15 колициногенным штаммам. Помимо этих культур, широким спектром чувствительности к колицинам обладали 6 штаммов, выделенных в Нальчике и по 3 - в Москве и Черкесске. 5 из этих штаммов были изолированы из гнойною отделяемого, 4 - из мочи, 2 - из кала и 1 - из мокроты.

Для выяснешм имеющихся различий между колициногенными и неко-лициногенными штаммами эшерихий у всех культур было изучено распространение факторов вирулентности 3 групп по механизму действия, ангибиотикочувствительности и плазмвдного профиля ДНК.

Исследовано распространение у изученных бактерий факторои вирулешности, характеризующих адгезивную, персистируюшую способность бактерий и их токсичность.

Адгезивные свойства эшерихий устанавливались на основании результатов изучения адгезивности бактерий на эритроцитах человека группы 0(1)Шг+, гемагглютинирующей способности бактерий в отношении эритроцитов человека и барана и способности к адсорбции красителя конго красного.

К адгезивноактивным штаммам мы относили культуры, у которых индекс адгезивности микроорганизмов (ИАМ) был больше 2,5. Среди 21

колициногенных штаммов таких культур было 18 (66,7%), а среди 102 неколициногенных - 66 (64,7%). Высокоадгезивные штаммы (ИАМ>4,0) несколько чаще отмечены среди неколициногенных штаммов, а неадгезивные штаммы (ИАМ<1,75) встречались только среди неколициногенных культур. Средний уровень ИАМ у колициногенных штаммов составил 2,9+0,13, а у неколициногенных - 2,9510,09. Гемагглготшшругощая способность у колициногенных и неколициногенных штаммов была выражена одинаково. Существенные различия наблюдались лишь по распространенности маннозорезистентных гемагглютининов в отношении эритроцитов человека. У колициногенных штаммов такие гсмагглютинины отмечены у 3,7±3,6% штаммов, тогда как у неколициногенных - у 16,6+3,7% (Р<0,05) Способность адсорбировать краситель конго красный у обеих групп штаммов была выражена одинаково.

На основании указанных характеристик адгезивного процесса 12 колициногенных штаммов были отнесены к адгезивным (44,4+9,5%). При этом мы исходили из следующего. Адгезивными считались культуры, у которых отмечалось сочетание хотя бы двух параметров: один - уровень адгезивности на эритроцитах человека >2,5, а второй - гемагглютинирующая способность или адсорбция конго красного. При уровне ИАМ>4,0 штаммы рассматривались как адгезивные, несмотря на наличие или отсутствие других показателей адгезивного процесса. Среди неколициногенных штаммов к адгезивным отнесены 53 (51,9+4,9%) культуры.

Таким образом, адгезивные свойства колициногенных и неколициногенных штаммов эшерихий практически не различались.

В качестве показателя псрсистенции эшерихий использовано определение антилизоцимной активности бактерий. Среди колициногенных штаммов 59,2% обладали антилизоцимной активностью, среди неколициногенных таких штаммов было 63,7%. Различий между колициногенными и неколициногенными штаммами по различным параметрам, характеризующим антилизоцимную активность бактерий, не установлено. Средний уровень антилизоцимной активности эшерихий обеих групп был близким. Близким было распространение штаммов с разным уровнем антилизоцимной активности.

Показателем токсичности эшерихий использована гемолитическая способность бактерий. Исследовалось образование двух типов гемолизинов: ос-гемолизинов и тиолзависимых гемолизинов. Гемолитическими свойствами обладали лишь 4 колициногенных штамма (14,8%), причем образования тиолзависимых гемолизинов этими культурами не отмечено. У неколициногенных штаммов гемолитические свойства были выражены значительно лучше - 22 штамма (21,6%) продуцировали а-гемолизины и 10

штаммов (9,8%) - тиолзависимые гемолизины. В целом у неколициногенн штаммов эшерихий гемолитическими свойствами обладали 32 штамма (31,4" что достоверно выше, чем у колициногенных культур (Р<0,05).

Проведено сравнительное изучение колициногенных и неколициногенн штаммов эшерихий на чувствительность к 18 антибиотикам, которые относят к 10 различным группам по химической структуре: 1 - беталактамн антибиотики группы пенициллина, 2 - беталактамные антибиотики груш цефалоспорина, 3 - антибиотики группы тетрациклина, 4 - аминогликозиды, ; макролвды, 6 - рифамицины, 7 - гликопептиды (группа ристомицина), Я нитробензолы (группа левомицетина), 9 - полипептиды (группа полимиксина] 10 -линкомицин.

Полученные результаты показывают, что исследованные колициногенн: штаммы эшерихий проявляют устойчивость к большинству использованш антибиотиков. Наиболее высокая чувствительность отмечена к гентамицш левомицетину и полимиксину (устойчивые к этим препаратам штам;> составляли 25,9-33,3%). Наибольшую устойчивость эти культуры проявляли оксациллину, олеандомицину, линкомицину.

Неколициногенные культуры эшерихий характеризовались близ» устойчивостью к антибиотикам. Однако, отмечены определенные различ между рассмотренными группами штаммов. По чувствительности пенициллину и ампициллин}' колициногенные штаммы достоверно отличали от неколициногенных - эти культуры были более чувствительными к даннь препаратам (55,5±9,5% и 80,4±3,9% устойчивых к пенициллину штаммов 40,7±9,4% и 71,6±4,4% устойчивых к ампициллину штаммов, Р<0,05). отношении канамицина отмечена противоположная зависимость колициногенные штаммы были более устойчивыми по сравнению неколициногенными (81,5+7,5% против 54,9±4,9%, Р<0,05).

Представляло интерес распространение среди изученных культ множественно устойчивых штаммов. К таким штаммам мы относили культур] устойчивые не менее чем к б из 10 использованных групп антибиотиков.

Исходя из этих критериев 7 из 27 колициногенных штаммов признан множественно устойчивыми (25,9±8,4%). Среди неколициногенных штамме множественно устойчивых было 47, или 46,1 ±4,9%. Отмеченные различ! являются достоверными (Р<0,05).

Таким образом, колициногенные штаммы эшерихий характеризуют более низкой устойчивостью к антибиотикам по сравнению неколициногенными культурами. .

При электрофоретическом определении плазмидного профиля ДНК у 14 гшциногенных штаммов выявлены плазмиды (51,8+9,6%), причем 12 аммов содержали по 1 плазмиде, а 2 - по 3 плазмиды.

У неколициногенных штаммов плазмиды обнаруживались с близкой уготой - у 43 штаммов (42,1%). В 36 случаях бактерии содержали по 1 ммидс, в 6 - по 2 и один штамм имел 3 плазмиды.

Большинство плазмид как у колициногенных, так и у неколициногенных аммов, принадлежало к группе плазмид с молекулярной массой 50-60 МД -1% и 41,2% выявленных у бактерий плазмид.

Таким образом, по плазмидному профилю ДНК колициногенные и солициногенные штаммы практически не различались между собой.

Учитывая сравнительно небольшие различия между колициногенными и солициногенными штаммами по наличию факторов вирулентности и наличие эеделенных различий между этими культурами по их чувствительности к гибиотикам, представляло интерес сравнение изученных бактерий по .шлексу этих характеристик. На основании сочетания факторов зулентности с учетом множественной устойчивости к антибиотикам 'ществлено патотипирование изученных бактерий.

Среди исследованных штаммов выявлены культуры, отнесенные к 22 из 24 ¡можных патоваров. Колициногенные штаммы принадлежали к 12 патоварам, почавшим от 1 до 6 штаммов. В то же время неколицнногенные штаммы ли более разнообразными - они относились ко всем выявленным патоварам, кдый из которых насчитывал от 1 до 17 штаммов (рис. 1).

Среди колициногенных штаммов чаще всего встречались культуры •овара 6б - 22,2% этих штаммов. Эти штаммы характеризовались раженной антилизоцимной активностью и не обладали множественной ойчивостью к антибиотикам. Также часто отмечены культуры патовара 5б, у •орых была выражена адгезивная способность и также отсутствовала эжественная устойчивость. Среди колициногенных культур достаточно часто речались штаммы патовара 8б, у которых не были выявлены факторы )улентности и не отмечена множественная устойчивость к антибиотикам.

У неколициногенных штаммов чаще всего встречались культуры патовара 46,6%), которые характеризовались выраженными адгезивными свойствами, илизоцимной активностью и множественной устойчивостью к антибиотикам. ;колько реже отмечались патовары 5э ибэ (по 11,8%).

В целом, колициногенные штаммы отличались менее выраженными сторами вирулентности - среди этих культур 77,8% обладали хотя бы одним ггором вирулентности. У неколициногенных штаммов такой способностью адали 87,7% культур.

Колициногенные штаммы

1г,15,Ш,15 13% 8%

Нсколицнногснныс штаммы

Рис.1. Распределение паговаров у колициногенных и неколициногенпых

штаммов эшерихин.

Проведено исследование свойств штаммов эшерихий, чувствительных к ¿явленным колицинам и не обладающих такой чувствительностью. Изучались ; же характеристики бактерий, которые рассматривались применительно к пициногенным штаммам.

У чувствительных к колицинам и нечувствительных к ним штаммов церихнй показатели адгезивности в отношении эритроцитов человека были шзкими. Не различались у исследованных культур и показатели ИАМ: у 'вствительных к колицинам штаммов - 2,94±0,09, у нечувствительных к ним -93±0,13. Гемагглютинирующие свойства и адсорбция конго красного также сазались близкими. Не выявлено различий и в частоте обнаружения цезивных штаммов среди рассмотренных культур.

Таким образом, изученные характеристики адгезивного процесса у ^вствительных к колицинам и нечувствительных к ним культур эшерихий )актически совпадают.

Показатели антилизоцимной активности у чувствительных к колицинам таммов и у нечувствительных к ним в основном были сходными. Однако, -мечены и различия. В частности, средний уровень антилизоцимной тивности у антшшзоцимактивных колициночувствительных штаммов был >стоверно выше (4,71 ±0,18 мкг/мл), чем у аналогичной группы культур, ¡чувствительных к колицинам (3,81±0,29 мкг/мл, Р<0,05). Одновременно, у таммов, нечувствительных к колицинам, количество культур с низкой ггилизоцимной активностью существенно превышало аналогичный показатель колициночувствительных штаммов (16,3±5,3% против 5,0±2,4%). Это >зволяет считать, что у чувствительных к колицинам штаммов эшерихий ювень антилизоцимной активности выше, чем у культур, нечувствительных к иицинам.

По выраженности гемолитических свойств чувствительные к колицинам таммы не отличались от нечувствительных к ним.

У 36 чувствительных к колицинам штаммов эшерихий выявлены газмиды (45,0+5,6%). У 31 штамма обнаружено по 1 плазмиде, у 3 - по 2 и у 2 по 3 плазмиды.

У нечувствительных к колицинам штаммов плазмиды выявлялись с тзкой частотой - у 21 штамма (42,8%). 17 штаммов содержали по 1 плазмиде, 3 штамма - по 2 и 1 штамм имел 3 плазмиды.

Отмечены различия в распределении плазмид молекулярной массы 50-60 Д у рассмотренных групп культур. У чувствительных к колицинам штаммов кие плазмиды составляли 53,415,6% выявленных плазмид, тогда как у ¡чувствительных к колицинам культур - 34,6±6,8%, различия являются >стоверными (Р<0,05).

1Г,18,Ш 15% 8%

16%

Чувствительные к колицинам штаммы

"7ч '

2%

21%

12%

23%

12%

Нечувствительные к колицинам штаммы

Рис.2. Распределение патоваров у чувствительных и нечувствительных к колицинам штаммов эшерихий.

Таким образом, по плазмидному профилю ДНК между чувствительными и нечувствительными к колицинам культурами эшерихий имеются лишь различия в преобладании плазмид определенной молекулярной массы.

Проведено определение патоваров у чувствительных к колицинам и нечувствительных к ним штаммов эшерихий.

Колицшючувствительные штаммы отнесены к 20 патоварам, включавшим от 1 до 14 штаммов. Нечувствительные к колицинам культуры оказались менее гетерогенными - у них выявлены 15 патоваров, включавших от 1 до 6 штаммов.

Среди колициночувствительных штаммов чаще всего встречались культуры патоваров 6s и 2г - 14 (17,5%) и 13 (16,2%) штаммов соответственно. Достаточно часто выявлялись штаммы патовара 5s (11 штаммов, 13,7%) (рис.2). Не были обнаружены культуры патоваров Ist и Зг. Патовары, характеризующиеся образованием тиолзависимых гемолизинов, содержали по 1 штамму - lrt, 3rt, 4rt, 4st, 7st.

У нечувствительных к колицинам культур не было отмечено заметного преобладания каких-либо патоваров. Чаще выявлялись культуры патоваров 2г, 5s, 8s-по 12,2%.

Титрование эшерихий с помощью колицинов. Учитывая, что исследованные колициногенные штаммы характеризуются различными спектрами действия продуцируемых колицинов, представляется возможным разграничение эшерихий с помощью колицинов.

При типировашга бактерий с помощью бактериоцинов разграничение может проводиться на основании чувствительности к бактериоцинам либо по продуцируемым бактериоцинам.

Для проведения типирования по колициночувствительности эшерихий необходимо было использовать типовые колициногенные штаммы.

При разработке такого способа типирования мы использовали в качестве типовых колициногенные штаммы из коллекции Fredericq: Са7, Са38, Са42 и Са53. На основании чувствительности к продуцируемым этими штаммами колицинам установлены 15 колицинотипов, из которых исследованные штаммы эшерихий отнесены к 10. Каждый из колицинотипов включал от 1 до 18 штаммов. Всего по данной схеме удалось типировать 65 штаммов (50,4±4,2% исследованных штаммов).

Больше всего штаммов отнесены к колицинотипу 10 - 18 штаммов (27,7% типированных культур). Достаточно часто встречались штаммы колицинотипов 13 и 15 (15.4% и 12,3% типированных культур соответственно).

Из 65 типированных штаммов 42 были выделены в Нальчике (50,0±5,4% всех культур этой группы), 12 - в Черкесске (63,1+11,0%), 6 - в Москве

(31,6±10,6%) и 5 штаммов представляли коллекцию Ргес1спсд. Достоверны^ различий в типируемости эшерихий из разных городов не отмечено (Р>0,05).

Колицинами штаммов Ргес1ег^ типировались все 7 вьщеленных О) животных культур эшерихий. Кроме того, типировались: 18 штаммов изолированных из гнойного отделяемого (42,8±7,6%), 14 - из мочи (56,0+9,9%) 16 - из кала (43,2+8,1%), а также 3 из 6 культур, выделенных из мокроты и 2 и' 5 - выделенных из смывов. Таким образом, различий в колицинотипируемосп штаммов из различного материала не отмечено.

Для проверки эффективности данной схемы проведено типирование 6! свежсвыделенных штаммов эшерихий.

Из 65 штаммов типировались 38 (58,5±6,1%). Как видно из этих данных различия с результатами типирования клинических штаммов был! несущественными.

Типированные штаммы отнесены к 8 колицинотипам. Из них колицинотиг

2 не был отмечен у клинических штаммов. Наиболее часто встречалиа культуры колицинотипа 14 - 18 штаммов (47,4% типированных культур).

Имелись значительные различия в распределении колицинотипов ) клинических и свежевыделенных штаммов.

Из 23 выявленных среди клинических штаммов колициногенных культу! были отобраны 9 штаммов, которые использованы в качестве типовых дш типирования бактерий.

С помощью указанных 9 колициногенных штаммов типировались 7^ штаммов, или 60,5±4,3% исследованных штаммов. Среди свежевыделенны> культур типировались 47 штаммов (72,3+6,5%). Выявлено 57 варианта чувствительности к колицинам. Каждый из этих вариантов насчитывал от 1 дс 24 штаммов.

Большое число вариантов (колицинотипов) ограничивает возможности использования этой схемы. Поэтому рационально было разработать схему которая бы была более простой, чем вторая, и давала большую эффективность чем первая.

В качестве типовых мы отобрали 5 колициногенных штаммов, из которы>

3 (803,842,846) взяты из второй схемы, а 2 (Са38 и Са42) - из первой.

Исходя из этой схемы удалось типировать 74 клинических штаммг (57,4±3,7%) (таблица 1).

Выявлено 27 колицинотипов, которые включали от 1 до 12 штаммов. Чаще всего встречались культуры колицинотипов 17 и 24 (16,2% и 10,8°/ исследованных штаммов).

Таблица 1

Рабочая схема колицинотипирования эшерихий_

Кали-ЦИ но- Чувствительность к Число/ Штаммы

колнцинам процент

ши 803 842 846 Са38 Са42 штаммов

1 2 3 4 5 6 7 8

1 + + + + + 3 / 4,05 В, Row, 20

2 + + + + - 2/2,7 К12, 286

3 + + + - + 1/1,35 25

4 + - - + + 1 / 1,35 69

5 - -f- + + + 2/2,7 22, 1285

6 + - + + + 3 / 4,05 63, 717, 831

7 - + + - + 1 / 1,35 Са7

8 - - + + + 4/5,4 27, 95, 253, 287

9 + + - + - 6/8,1 101, 108, 297, 716, 748, 834

10 + - + - + 2/2,7 16, 279

11 - + + + - 1/1,35 Са53

12 + - - - + 2/2,7 36, 737

13 + - + + - 1/1.35 65

14 - + - - + 1/1,35 93

15 - - + - + 2/2,7 17, 125

16 + - + - - 1 /1,35 124

17 + + 12/16,2 117,211,252,715, 719, 735, 736, 738, 741,747, 828, 829

18 - - + + - 1/1,35 806

19 + - - - - 1/1,35 29

20 - + - + - 3 / 4,05 106, 291,423

21 - - - + + 1 / 1,35 298

22 - + + - - 1/1,35 299

23 - + - + + 3 / 4,05 114, 256, 273

24 + - - - - 8 / 10,8 21, 72, 807, 833, 843, 844, 847, 848

25 - + - - - 4/5,4 96, 295, 826, Са38

26 - - + - - 3 / 4,05 61, 62, 845

27 - - - + - 4/5,4 254, 804, 832, 849

Из тонированных по этой схеме кулыур б были изолированы в Москве (31,6±10,6% штаммов этой группы), 14 - в Черкесске (73,7±10,1%) и 48 - в Нальчике (55,8±5,4%). 6 типированных штаммов принадлежали к коллекции Ргес1ег^. По типируемости колицинами Московские штаммы достоверно отличались от выделенных в Черкесске и Нальчике.

Частота типируемых колицинами штаммов среди выделенных из разных источников культур эшерихий была близкой. Среди культур, выделенных из гнойного отделяемого типировались 23 (54,8±7,2%). Из выделенных из кала штаммов типируемо было 20 (54,0±8,2%), из мочи - 15 (60,0±9,8%), из мокроты - 4 (66,7±19,2%), из смывов - 2 (40,0±21,9%). Среди выделенных от животных штаммов типировались 4 (57,1±18,7%).

Свежевыделенные штаммы эшерихий по указанной рабочей схеме типировались в 72,3±5,5% случаев - 47 штаммов.

Эти культуры отнесены к 16 колицинотипам, которые включали от 1 до 10 штаммов. Частота типируемости свежевыделенных штаммов эшерихий была достоверно выше, чем клинических штаммов (72,3±5,5% против 57,4±3,7%, Р<0,05). Между этими группами эшерихий имелись различия в распределении ко лицинотипов.

Так, у свежевыделенных штаммов преобладали культуры колицинотипов 23 (21,3% типированных штаммов) и 8 (15%). У клинических штаммов чаще отмечен колицинотип 17 (16,2%).

Для осуществления типирования бактерий по их бактериоциногенности необходимы типовые индикаторные штаммы. В качестве таковых нами были отобраны 3 штамма: №106, выделенный из гнойного отделяемого в Москве, чувствительный к 16 колициногенным штаммам; №108, также выделенный в Москве, но из мокроты, чувствительный к 21 колициногенному штамму; №834, выделенный из гнойного отделяемого в Нальчике, чувствительный к 17 колициногенным культурам.

Указанные типовые индикаторные штаммы были чувствительными в совокупности ко всем 27 выявленным колициногенным штаммам эшерихий. По сочетанию действия продуцируемых бакгериями колицинов на эти типовые штаммы можно выделить 7 бактериоцинотипов (таблица 2).

Чаще других встречался колицинотип 1. Штаммы этого типа действовали на все 3 типовые индикаторные культуры. К этому колицинотипу отнесены - 13 штаммов (48,1±9,6%). В колицинотипы 2 и 4 включены по 4 штамма (14,8±6,8%), в остальные колицинотипы - 1-3 штамма. К 7 возможному колицинотипу не принадлежал ни один из исследованных колициногенных штаммов.

Таблица 2

Схема типирования эшерихий по колициногенности_

Колици- Чувствительный Число Штаммы

1 ЮТИ II штамм

106 108 834 штаммов

1 + + + 13 33, 285, 295, 299, 423, 803, 826, 842, 846, 849, Са7, Са38, Са53

2 + + - 4 94, 96, 825, 834

3 - + + 3 124, 211, 845

4 + - + 1 Са42

5 + - - 4 254, 804, 806, 832

6 - + - 2 106, 253

Таким образом, на основании колициногенности эшерихий удалось гипировать все выявленные колидиногенные штаммы, которые составляли 20,9% всех исследованных культур.

Связи между кояиципотипами и другими эпидемиологическими маркерами эшерихий. При анализе свойств колициногенных и колициночувствительных штаммов эшерихий было установлено, что различия иежду колициногенными и неколициногенными, чувствительными и нечувствительными к колицинам штаммами бактерий могут проводиться по таспространению и сочетанию факторов вирулентности, множественной ,'стойчивости их к антибиотикам, плазмидному профилю ДНК. Исследованные лтаммы эшерихий были разграничены на основании чувствительности к отлицинам и по колициногенности. Все эти характеристики являются эпидемиологическими маркерами этих бактерий.

Представляло интерес выяснение вопроса о наличии связей между этими ;войствами бактерий. Для этого был проведен корреляционный анализ с юмощыо специальной программы "Полный корреляционный анализ".

При оценке результатов этого анализа высокая степень корреляционной :вязи между рассматриваемыми показателями отмечалась при коэффициенте дарреляции >0,7. При значениях этого коэффициента в пределах 0,4-0,7 корреляционная связь считалась умеренной, при коэффициентах корреляции от ),2 до 0,4 - слабой, а при более низких значениях этого показателя юрреляционная связь отсутствовала.

Анализ коэффициентов линейной корреляции, рассмотренных эпидемиологических маркеров, показал отсутствие такой связи.

Отмечена слабая корреляция между колицинотипами, установленными с юмощыо штаммов Ргес1ег^ и по рабочей схеме колицинотипирования (г =

0,33-0,48). Кроме того, установлена умеренная корреляционная связь между патоваром и антилизоцимной активностью бактерий (г = 0,55) и слабая кореляция между патоваром и адгезивными свойствами бактерий, образованием а-гемолизинов и множественной устойчивостью к антибиотикам (г = 0,26-0,38).

При прослеживании корреляционных отношений отмечена более выраженная корреляция между рассмотренными эпидемиологическими маркерами эшерихий (таблица 3).

Таблица 3

Корреляция между эпидемиологическими маркерами эшерихий

(корреляционные отношения)

Свойстве 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 0,81 0,42 0,91 0,26 0,02 0,05 0,23 0,08 0,43

2 0,78 ' 0,28 0,9 0,33 0,05 0,01 0,03 0,01 0,31

3 0,45 0,49 0,87 0,14 0,00 0,06 0,64 0,22 0,45

4 0,35 0,44 0,14 ¡ЭЙ!; 0,15 0,00 0,00 0,29 0,16 0,68

5 0,4 0,46 0,22 0,92 •^г:».: V'1 ЙЗёШ 0,04 0,12 0,44 0,21 0,94

6 0,33 0,42 0,17 0,89 0,44 0.24 0,37 0,00 1,00

7 0,31 0,51 0,32 0,82 0,09 0,00 0,27 0,00 1,00

8 0,31 0,43 0,16 0,88 0,19 0,14 0,26 0,02 0,42

9 0,33 0,47 0,46 0,86 0,3 0,00 0,28 0,27 0,97

10 0,37 0,44 0,29 0,93 0,64 0,41 0,02 0,37 0,39

Обозначения: 1 - колицинотип по схеме со штаммами Ргес1сг^; 2 колицинотип по рабочей схеме колицинотипирования; 3 - колицинотип п< колищшогенности; 4 - адгезивные свойства; 5 - антилизоцимная активность; 6 образование а-гемолизинов, 7 - образование тиолзависимых гемолизинов, 8 наличие плазмид; 9 - множественная устойчивость к антибиотикам, 10 -патовар.

Наиболее высокая корреляционная связь наблюдалась межд колищшотипами, установленными с использованием штаммов Fredericq и п рабочей схеме колицинотипирования (г = 0,78-0,81). Колицинотиг установленный по штаммам Егеиег^, обладал умеренной корреляцией колицинотипом, установленным по колищшогенности бактерий, антилизоцимной активностью. С остальными маркерами была слаба корреляционная связь.

У колицинотипа по рабочей схеме колицинотипирования наблюдалась :решгая корреляция со всеми маркерами. Однако, колицинотип, ановленный по колициногенности, характеризовался более слабыми феляционными связями с другими эпидемиологическими маркерами ерихий. Умеренная корреляция наблюдалась только с колицинотипом, ановленным при помощи штаммов Ргескг^, и множественной ойчивостью к антибиотикам, с остальными маркерами отмечена слабая )реляционная связь, а с адгезивными свойствами, образованием а-юлизинов, наличием плазмвд корреляции не было.

Наиболее высокая корреляционная связь отмечена у адгезивных свойств ерихий с остальными эпидемиологическими маркерами (г = 0,82-0,93).

Антилизоцимная активность характеризовалась умеренной корреляцией с оваром и образованием а-гемолизинов. С колицинотипами, установленными колициногенности, с адгезивными свойствами, образованием тиолзависимых юлизинов и наличием плазмид корреляции не было. С остальными сазателями отмечена слабая корреляционная связь.

Гемолитические свойства практически не коррелировали с другими гдемиологическими маркерами эшерихий. Однако, у образования шзависимых гемолизинов наблюдалась слабая корреляция с образованием а-голизинов, наличием плазмид и множественной устойчивостью к ибиотикам (г = 0,24-0,28).

Наличие у бактерий плазмид имело умеренные корреляционные связи с кщинотипами, установленными по колициногенности, и с антилизоцимной ивностью (г = 0,44-0,64). Не было корреляции с колицинотипом, ановленным по рабочей схеме колицинотипирования, а с остальными экерами отмечалась слабая корреляционная связь.

Множественная устойчивость к антибиотикам характеризовалась слабой 'реляцией с колицинотипом, установленным по колициногенности, (азованием а-гемолизинов и патоваром.

Наконец, патовар бактерий обладал высокой корреляционной связью с илизоцимной активностью, гемолитическими свойствами и множественной ойчивостью к антибиотикам (г = 0,94-1,00). С колицинотипом, ановленным с помощью штаммов Егес1ег^ и по колициногенности, а также с [ичием плазмид наблюдалась слабая корреляция, а с остальными маркерами реляции не было.

выводы

1. При исследовании 129 штаммов эшерихий, выделенных в разны> регионах из различного клинического материала, выявлено 23 колициногснны> штамма. Частота обнаружения колициногенных культур эшерихий составляет 18,8%. Чувствительность к колицинам проявили 62% исследованных культур.

2. Колицины, продуцируемые выявленными клиническими колициногенными штаммами эшерихий, обладают специфичностью г характеризуются различными спектрами действия.

3. Колициногенные штаммы эшерихий обладали менее выраженнымг гемолитическими свойствами и более низкой устойчивостью к антибиотикам пс сравнению с неколициногенными. У чувствительных к колицинам культур эшерихий отмечен более высокий уровень антилизоцимной активности, чем } нечувствительных к колицинам штаммов. Выявлены различия в распределенш патоваров у колициногенных и колициночувствительных штаммов эшерихий.

4. Разработаны схемы колицинотипирования эшерихий, основанные на их чувствительности к колицинам и на колициногенности. По колициночувствительности типированы 50,4-57,4% штаммов, по колициногенности - 20,9%. Наиболее эффективным было применение рабочей схемы колицинотипирования эшерихий с использованием в качестве типовых штаммов Са38 и Са42 из коллекции Бгескмтсд и выявленных колициногенных клинических штаммов №№803, 842, 846. По этой схеме типированы 57,4% исследованных клинических культур и 72,3% свежевыделенных штаммов эшерихий.

5. Обнаружены четкие корреляционные связи между колицинотипами, установленными по разным схемам типирования и между различными эпидемиологическими маркерами эшерихий. Особенно выраженными эти связи были между адгезивными свойствами бактерий и их патоваром и другими характеристиками эшерихий.

Список опубликованных работ

1. Связь колициногенности с факторами вирулентности эшерихий Халишхова М.Х., Накова Л.В. // Гомеостаз и инфекционный процесс Материалы Второй Всероссийской конференции. - Саратов, 1998. - с.71.

2. Распространение колициногенных и колициночувствительны: штаммов эшерихий / Халишхова М.Х.// Тезисы докладов Севсро-Кавказско) региональной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учены: «Перспектива-99», Нальчик, 1999, с.248-249.

3. Распространение колициногенности среди эшерихий / Халишхова М.Х.// Сб. Актуальные вопросы биологии и медицины. - Нальчик, 1999.-С. 109-110.

4. Типирование Escherichia coli с помощью колицинов / Халишхова М.Х.// Сб. Актуальные вопросы биологии и медицины. - Нальчик, 1999.-С. 111-112.