Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Диагностически значимые биологические свойства возбудителей кишечных эшерихиозов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Диагностически значимые биологические свойства возбудителей кишечных эшерихиозов"

Министерство здравоохранения Российской Федерации

Г--V-

Московская медицинская академия О1 имени И.М.Сеченова

На правах рукописи

ЕВДОКИМОВА ОЛЬГА ВАЛЕРЬЕВНА УДК 616.348 - 002:576.851.48.097.21

ДИАГНОСТИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КИШЕЧНЫХ ЭШЕРИХИОЗОВ

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА, 1997

Работа выполнена на кафедре микробиологии Рязанского государственного медицинского университета имени академика И.П.Павлова.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

ЕиВ.Смирнов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор С^Дратвин доктор медицинских наук Д.Д.Меньшиков

Ведущая организация: Московский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.ИМечникова.

Защита состоится " " 1997 года

на заседании Диссертационного совета Д.074.05.10 при Московской медицинской академии имени И.М.Сеченова

(119881, Москва, Г-435, Б.Пироговская ул., д.2-6)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова по адресу: 119042, Москва, Зубовский бульвар, д.37/1

Автореферат разослан " " 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного

Совета, кандидат медицинских наук Л.Ю.Миронов

Актуальность. Проблема острых кишечных инфекций бактериальной природы сохраняет актуальность до настоящего времени как в нашей стране, так и за рубежом (Хазенсон Л.Б., 1987; Касьяненко A.M., 1988; Шаханина И.А.,1996; Donnenberg M.S., 1989). По данным ВОЗ ежегодно регистрируется от 68,4 млн. до 275 млн. диарейных заболеваний взрослых и детей, в нашей стране этот показатель доходит до 2 млн. случаев ОКИ в год (Покровский В.И.,1993).

В спектре возбудителей острых кишечных инфекций существенный удельный вес имеют Escheichia coli (Шаханина И.А.,1996).В общей сумме кишечных инфекций у детей раннего возраста этот показатель по данным разных авторов составляет от 29,4% до 81,4% (Садыков М.Ш.,1991; Молочаева И.С.,1991; Szirok Е.,1983; Law D.,1992; Vergara М., 1992), причем в 18% случаев эшерихиозы выявляются среди ОКИ неустановленной этиологии (Покровский В.И.,1993).

Диагностика кишечных эшерихиозов основывается на выделении возбудителей из испражнений; принадлежность к патогенным E.coli определяют на основании идентификации О-серогруппы или ОН-серовара (Голубева И.В.,Киселева B.C., 1985). Хотя и выявляется определенная связь пато-генности с принадлежностью эшерихий к той или иной серо группе, прямой зависимости не существует. Выделение, например, от больных энтеритом эшерихий определенных серо групп еще не является доказательством их этиологической роли в развитии кишечного заболевания (Szirok Е.,1983). Отсутствие четкой связи между серогруппой (сероваром) и определенным механизмом взаимодействия эшерихий с кишечным эпителием, макроорганизмом в целом, ставит перед исследователями задачу выявления диагностически значимых биологических свойств возбудителя (тесно связанных с их патогенным потенциалом) с целью дифференциации возбудителей от нормальной или сопутствующей микрофлоры (Голутва Н.К.,1988; Покровский В.И.,1993; Шаханина И.А.,1996; Lim G.S.,1992). Выполнение этой задачи включает тщательную фенотипическую и генотипическую идентификацию представителей вида Escherichia coli и выявление их маркеров

вирулентности. С этих позиций актуальным является изучение метаболических особенностей, профилей антибио-тикоустойчивости и их связи с адгезивными и персистентными характеристиками возбудителей кишечных эшерихиозов.

Цель настоящей работы заключалась в комплексном изучении диагностически значимых биологических свойств эшерихий патогенных серогрупп, относимых к возбудителям кишечных эшерихиозов.

В ходе исследования решались следующие задачи:

1. Изучить с использованием различных моделей адгезивную активность возбудителей кишечных эшерихиозов у представителей отдельных серогрупп и биоваров.

2. Определить уровни устойчивости эшерихий патогенных серогрупп к антибиотикам и механизмы ее генетического детерминирования.

3. Изучить уровни антилизоцимной и антикомплементарной активности, а также взаимосвязь антибиотикоустойчивости с персистентными характеристиками эшерихий патогенных серогрупп.

4. Разработать экономичный способ определения антикомплементарной активности у возбудителей кишечных эшерихиозов.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное сравнительное исследование биологических свойств возбудителей кишечных эшерихиозов и банальных эшерихий, выделенных из кишечника больных эшерихиозом и здоровых людей. С использованием клеточных моделей культуры ткани Нер-2 и эритроцитов человека изучена адгезивная активность эшерихий различного происхождения, что позволило установить существенные различия в индексах адгезии штаммов, выделенных от больных ОКИ и из кишечника

здоровых лиц. Впервые показано, что значение индексов адгезии эшерихий на эритроцитах зависит от принадлежности штаммов к серогруппе. При изучении чувствительности к 7 широко используемым антибиотикам у клинических штаммов эшерихий установлено преобладание множественноустойчивых штаммов, фенотип которых характеризовался наибольшим разнообразием количества и сочетания маркеров антибиотикоустойчивости. При изучении механизмов формирования высоких уровней антибиотикоустойчивости впервые проведено, сравнение средних геометрических уровней плазмидной и хромосомной устойчивости к ампициллину, аминогликозидам и тетрациклину у клинических штаммов эшерихий с аналогичными показателями эшерихий другого происхождения, что позволило установить существенные различия. Установлено широкое распространение признака выживания в нормальной человеческой сыворотке у эшерихий различного происхождения; у возбудителей кишечных эшерихиозов проявление этого признака контролируется хромосомными и плазмидными генами. При изучении роли плазмидного генома в устойчивости эшерихий к бактерицидному действию сыворотки крови впервые установлено, что у клинических штаммов показатель выживания зависит от содержания И-плазмид. Разработан и предложен новый экономичный способ определения антикомплементарной активности эшерихий, основанный на их способности к диффузному росту в полужидком питательном агаре. Изучена структура бактериальных популяций штаммов эшерихий различного происхождения по признаку антилизоцимной активности, что позволило выявить неоднородность популяций в зависимости от их уровней антибиотикоустойчивости. Впервые в структуре бактериальных популяций антибиотикоустойчивых возбудителей кишечных эшерихиозов показано преобладание клонов с более высокими уровнями антилизоцимной активности. При исследовании влияния различных концентраций пипольфена на стабильность наследования Я-плазмид штаммами Е.соН впервые отмечено элиминирующее действие пипольфена на собственные плазмиды клинических штаммов эшерихий патогенных серогрупп, гены

которых контролируют устойчивость к антибиотикам и действию нормальной сыворотки крови человека. Сравнительное исследование стабильности наследования Я-плазмид в присутствии пипольфена и бромистого этидия позволило выявить различия в их действии на плазмиды некоторых штаммов.

Практическая значимость. На основе проведенных исследований разработаны методические рекомендации для врачей бактериологов "Определение антикомплементарной активности эшерихий культуральным методом", в которых предложено определять данный признак по разности диаметров зон диффузного роста эшерихий в полужидком питательном агаре с нативной и гретой сыворотками. Рекомендации внедрены в работу Муниципального учреждения здравоохранения г.Рязани "Диагностический центр" (акт внедрения от 15.01.97). Оформлено информационное письмо "Антибиотикоустойчивостъ энтеропатогенных и банальных эшерихий в зависимости от происхождения", внедренное в работу бактериологических лабораторий г.Рязани (акт внедрения от 20.04.95). Полученные данные используются в учебном процессе на кафедре микробиологии, гигиены и экологии ФПДО РГМУ им. акад. И.П.Павлова. Данные об элиминирующем действии пипольфена на Я-плазмиды эшерихий могут быть использованы для рациональной этиотропной химиотерапии кишечных эшерихиозов. Апробация работы и публикации. Материалы диссертации опубликованы в 5 работах. Результаты исследований доложены на 1-й международной компьютерной конференции "Актуальные вопросы диагностики, лечения и профилактики заболеваний человека" (г.Тернополь, 1994), на 4-м научном заседании Европейского общества по химиотерапии инфекционных болезней человека (Афины, Греция, 1995), на заседаниях Ассоциации микробиологов Рязанской области (г.Рязань, 1996, 1997).

Положения, выносимые на защиту:

1. Сравнительная характеристика возбудителей кишечных, эшерихиозов и банальных эшерихнй по адгезивной активности, ферментативному профилю, чувствительности к антимикробным препаратам и некоторым персистентным свойствам позволяет выявить ряд диагностически значимых признаков, характерных для патогенных эшерихий; наряду с антигенными свойствами их можно рассматривать как маркеры вирулентности возбудителей кишечных эшерихиозов.

2. Некоторые персистентные характеристики энтеропа-тогенных эшерихий (показатель выживания в сыворотке крови, антилизоцимная активность) более выражены у антибиотикоустойчивых штаммов, что может быть связано с наличием у них Я-плазмид.

3. Разработанный культуральный метод позволяет проводить определение антикомплементарной активности патогенных эшерихий с меньшими затратами, по сравнению с известными титрационными методами.

Структура н объем диссертации.

Диссертация изложена на 193 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы ( 146 отечественных и 167 зарубежных источников), 2-х приложений. В тексте имеется 29 таблиц и 14 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обосновывается актуальность настоящего исследо-вания, определяются его цель, задачи, раскрывается научная новизна и научно-практическая значимость работы, сформулированы основные положения, выносимые на защиту.

Первая глава посвящена обзору литературы по проблеме патоген-ных свойств эшерихий, вызывающих кишечные

эшерихиозы, их антибиотикоустойчивости и биологическим свойствам, связанным с вирулентностью.

Во второй главе представлены материалы и методы исследований. В работе использовано 228 штаммов, в том числе 114 штаммов эшерихий патогенных серогрупп, выделенных от больных с острыми кишечными инфекциями, этиологически расшифрованными как кишечные эшерихиозы (группа А) и 59 банальных эшерихий (группа Б), а также 50 изогенных производных, полученных в опытах элиминации и конъюгации и 5 контрольных штаммов других энтеробактерий*. Всего проведено 11.266 исследований (табл.1). Изучение биохимических свойств и антигенной структуры эшерихий проводили общепринятыми методами. Адгезивные свойства эшерихий определяли на модели заражения перевиваемой клеточной линии Нер-2 по методике, разработанной в НИИЭМ им. Пастера (Г.Я.Ценева и соавт., 1983)**, к эритроцитам - по несколько модифицированной методике Т.А.Брилиса и соавт.(1982). Элиминацию и коньюгационный перенос R-плазмид проводили общепринятыми методами (Ф. Герхард и соавт., 1984). В опытах элиминации применяли бромистый этидий и прометазина гидрохлорид. Уровни устойчивости к антибиотикам исходных штаммов и их производных определяли методом серийных разведений в плотной и жидкой питательной среде (Е.А. Ведьмина с соавт. 1979, С.М. Навашин с соавт., 1982). Чувствительность и выживание эшерихий в человеческой сыворотке определяли по J.Heesemann и соавт. 1983, антилизоцимную активность - методом отсроченного антагонизма по О.В. Бухарину с соавт., 1984. Выделение плазмидной ДНК из изучаемых штаммов проводили по методике Portnoy и White (1984), электрофорез препаратов ДНК - по Meyers (1984) на приборе для диск-электрофореза 69 модели фирмы "Реанал", Венгрия.

* Выражаем искреннюю благодарность Т. И Карповой и В.Ф.Туровскому за предоставление части указанных штаммов.

** Выражаем искреннюю признательность ГЛ.Цеиевой за предоставление рабочего места для освоения указанной методики.

Таблица 1 Объем исследований

Наименование исследований Количе-

_ство

Биохимические и антигенные свойства 4557

Чувствительность к антибиотикам (методом дисков и 830 серийных разведений)

Определение локализации генетических детерминант 809 антибиотикоустойчивости

Адгезия на клетках культуры тканей и эритроцитах 204

Выживание в сыворотке крови человека 1440

Влияние пипольфена на стабильность наследования 1670 Я-плазмид штаммами эшерихий

Антилизоцимная активность 1520

Разработка способа определения 236 антикомплементарной активности эшерихий

Всего исследований 11.266

В третьей главе представлены результаты сравнительного исследования адгезивной активности клинических штаммов эшерихий различных серо групп и биоваров, банальных эшерихий с использование клеточной линии Нер-2 и эритроцитов человека 1(0) группы.

Результаты изучения адгезии эшерихий патогенных серо групп с использованием культуры клеток Нер-2 позволили выявить существенные различия индексов адгезии и колонизационной активности у эшерихий патогенных серогрупп, выделенных от больных ОКИ и от здоровых лиц. Клинические штаммы эшерихий патогенных серогрупп показали выраженную адгезивную и инвазивную активность, а также повреждающий эффект в отношении клеток монослоя. Количество бактерий на одну клетку к 2 часам у них составило 7,5+1,1, а процент пораженных клеток монослоя 29,7-89,3. Напротив, штаммы эшерихий серогруппы 0151, выделенные от здоровых лиц, имели низкие индексы адгезии(0,8±0,18)без принаков цитопатического

действия на культуру клеток (Рис 1.). При изучении колонизационной и инвазивной активности у эшерихий патогенных серогрупп, выделенных от больных ОКИ,через 5 часов контакта с монослоем отмечено активное размножение на плазмолемме клеток Нер-2 и выраженные цитопатические изменения.

Установлены статистически достоверные различия между индексами адгезии на эритроцитах и принадлежностью эшерихий к серогруппе (Рис.1). Так, для штаммов серогрупп 0124 и 0144 характерными были близкие значения индексов адгезии (1,1+0,1), которые в 5,5 раза превышали индексы адгезии штаммов серогруппы 0151 на этой модели (Р <0,001).

Среди эшерихий серогр уппы 0144 обнаружена значительная доля (41,7%) штаммов, ферментирующих сорбит и не ферментирующих салицин, что в сочетании с отсутствием ферментации дульцита позволило их выделить в самостоятельный, 4-й биологический вариант. Отмечена связь между сроками ферментации лактозы и принадлежностью эшерихий 0124 и 0144 к различным биоварам..Так, штаммы 1-го (серогруппы 0144) и 3-го биоваров (серогрупп 0124 и 0144) ферментировали лактозу в ранние сроки (на 1-3-и сутки); штаммы 1-го (серогруппы 0124) и 4-го биовара (серогруппы 0144) на 3-4-е и 4-6-е сутки, соответственно.

В четвертой главе проанализированы результаты исследования чувствительности эшерихий двух групп к 7-ми широко используемым антибиотикам, а также роли коньюга-тивных, неконьюгативных Л-плазмид и хромосомных генов в формировании их антибиотикоустойчивости. Установлено, что подавляющее большинство эшерихий патогенных серогрупп (68,2 - 85,0%) и банальных (70,7 - 93,1%) чувствительны к ампициллину, гентамицину, канамицину и хлорамфениколу. Более половины штаммов (57,0 - 96,3%) эшерихий патогенных серогрупп оказались устойчивы к стрептомицину, тетрациклину и рифампицину. В группе клинических штаммов было в 1,4-4,2 раза больше эшерихий, устойчивых к гентамицину, канамицину, тетрациклину и рифампицину (РГ <0,05), а средние геометрические уровни МИК указанных антибиотиков в

1.» 1.4

1 •

о.а

О.б -0,4 • 0,2 ■ О

0124 (4 шт.)

1 2 3 0151 (14 шт.)

ИТ

Ж

1 2 3 4 Бвовар 0144 (48пгг.)

м

Рис.1 Адгезивная активность ЭИКП различных биоваров и других энтеробактерий (Escherichia coli М-17 -1, Shigellla flexneri - 2, Shigella sonnei -3) в отношении эритроцитов человека. ИА - индекс адгезии.

55555555555555555555E555555555

93,1%) чувствительны к ампициллину, гентамипину, кана-мицину и хлорамфениколу. Более половикы штаммов (57,0 -96,3%) эшерихий патогенных серогрупп оказались устойчивы к стрептомицину, тетрациклину и рифампицину. В группе клинических штаммов было в 1,4-4,2 раза больше эшерихий, устойчивых к гентамицииу, каиамицииу, тетрациклину и рифампицину (Р1" <0,05), а средние геометрические уровни МИК указанных антибиотиков в отношении штаммов группы А были в 1,6-2,3 раза выше, чем штаммов группы Б, и составили 4,5; 16,2; 47,2 и 36,4 мкг/мл, соответственно. Следует отметить, что в группе А преобладали также штаммы, характеризующиеся выраженной устойчивостью к канамицину, рифампицину (МИК - 128,0-1500 мкг/мл) и тетрациклину (МИК - 32,0-1500 мкг/мл).

Для большинства штаммов обеих групп (62,5% группы А и 75,0% группы Б) характерно наличие множественной лекарственной устойчивости (одновременно к 2-5 антибиотикам). Наиболее разнообразные сочетания маркеров устойчивости отмечены у эшерихий патогенных серогрупп, на долю которых пришлось 55,9% всех выявленных фенотипов антибио^тикоустойчивости, против 11,8% фенотипов, выявленных у банальных эшерихий (Ртмф <0,05). Штаммы выделенные от больных наиболее часто характеризовались устойчивостью к 2-м антибиотикам, среди которых преобладающим было сочетание тетрацнклинового и стрептомицинового маркеров (15,9% от общего количества штаммов).

При изучении механизмов формирования устойчивости, установлено, что у значительной части (37,8%) штаммов эшерихий, выделенных от больных ОКИ, и 21,0% штаммов, выделенных из кишечника здоровых лиц (РГ >0,05), антибиотикоустойчивость была связана с наличием одной или нескольких коныогагивных К-плазмид в различных сочетаниях. Выявленные К-плазмилы характеризовались достаточно высокой частотой переноса маркеров (от 7,1x10 5 до 2,3x10"2). У 80,9% штаммов они контролировали устойчивость к стрептомицину, 42,6%- к ампициллину и тетрациклину ; маркеры хлорамфеникола и канамицшш в составе коныогагивных Я-плазмид выявлены у 33,3% и 14,3% штаммов, соответственно.

Сравнение частоты распространения R-нлазмид, имеющих полное фенотипическое выражение устойчивости в С600 5К, показало, что они встречаются у штаммов группы А, устойчивых к стрептомицину, ампициллину и хлорамфениколу (в 46,0%; 85,7%; и 66,7% случаев, соответственно), а в группе Б - только у ампициллипустойчи-вых штаммов.

I Доведенные исследования не выявили существенных различий в количестве и сочетании маркеров антибиотикоуетойчиво-сти, контролируемых коныогативными R-плазмидами, а среднегеометрические уровней МИК стрептомицина и ампициллина по отношению к трансконъюгантам с R-плазмидами от эшерихий патогенных серогрупп были в 1,6 - 1,8 раза выше, чем у трансконъю-гантов с R-плазмидами от банальных эшерихий.

Для изучения роли хромосомных генов в формировании антибиотикоустойчивости эшерихий обеих групп, в соответствии с выявленными маркерами, сравнивали уровни устойчивости к 4-м антибиотикам у штаммов с R-нлазмидами и их бесплазмидных производных. Установлено, что уровни устойчивости бесплазмидных производных эшерихий двух групп в отношении ампициллина, тетрациклина и хлбрамфеникола находятся в пределах от 1,1 ±0,1 до 9,7 + 0,3 мкг/мл.

Следует отметить, что бесплазмидные производные эшерихий группы А имели уровень устойчивости к стрептомицину 46,0 мкг/мл.

В пятой главе представлены результаты изучения антилизо-цимной и антикомплементарной активности, а также взаимосвязь антибиотикоустойчивости с персистентными характеристиками эшерихий, выделенных от больных ОКИ и от здоровых лиц.

Изучение распространения признака антилизоцимной активности (AJIA) и его уровней проведено у 104 штаммов эшерихий патогенных серогрупп, а также у 53 штаммов контрольной группы. Установлено, что антилизоцимная активность встречается с близкой и довольно высокой частотой у эшерихий патогенных серогрупп и банальных, в 88.5% и 88.7%, соответственно (Рф > 0.05). В сравниваемых ipvmiax количество штаммов, имеющих низкий и средний уровень антилизоцимной активности, практически совпа-

дало (87.5% и 88.6%, Рф>0.05). Только один штамм серогруппы Olli, выделенный от больного, имел уровень антилизоцимной активности 15 мкг/мл.

Следует также отметить отсутствие статистически достоверных различий у эшерихий групп А и Б в средних геометрических уровней антилизоцимной активности, которые практически совпадали и составили 1.86 - 2.48 мкг/мл и 1.35 - 2.35 мкг/мл, соответственно. Существенных различий также не выявлено в уровнях АЛА эшерихий различных серогрупп: в группах ЭИКП и ЭПКП они составили 2.27 и 2.07 мкг/мл, соответственно. В то же время уровни антилизоцимной активности (Мгеом.) ЭИКП серогруппы 0144 в 1,4 раза превышали уровни АЛА серогрупп 0124 и 0151.

При изучении частоты распространения чувствительных и устойчивых к антибиотикам штаммов среди эшерихий, имеющих различные уровни АЛА, установлено следующее. Среди антибио-тикочувствительных эшерихий обеих групп чаще встречаются штаммы с уровнем антилизоцимной активности 2 мкг/мл (Рф < 0.05), а среди устойчивых к антибиотикам Е. coli, - штаммы с уровнем 1 мкг/мл. Это свидетельствует о независимом распределении и наследовании детерминант, контролирующих проявление признаков антибиотикоустойчивости и антилизоцимной активности у штаммов эшерихий.

При изучении клонального состава популяций эшерихий групп А и Б с одинаковыми уровнями антилизоцимной активности установлена их неоднородность, которая проявлялась в различном количественном соотношении клонов, имеющих низкий, средний и высокий уровни антилизоцимной активности. Популяция Е. coli серогруппы 0144 со средним уровнем АЛА 10 мкг/мл была представлена клонами имеющими низкий, средний и высокий уровни антилизоцимной активности, клоны со средним и высоким уровнями составили 5.8% и 17.3% - соответственно, а 1.9% клонов имели уровень АЛА 25 мкг/мл. Напротив, в популяциях штаммов банальных эшерихий большая часть клонов (от 51.9% до 84.6%) характеризовалась низким уровнем антилизоцимной активности; у некото-,-ртх штаммов отсутствовали клоны со средним и высоким уровнем антйЪизоцимной активности. В популяциях штаммов группы Б

также встречались клоны, не обладающие данным признаком (11.5%), а количество клонов с высоким уровнем антилизоцимной активности было в 9.1 раза меньше, чем у эшерихий группы А (Рф <0.05).

Выявленная неоднородность бактериальных популяций эшерихий групп А и Б распространялась на штаммы, отличающиеся чувствительностью к антибиотикам. Как правило, для популяций аитибиотикоустойчивых штаммов эшерихий двух групп, независимо от количества и сочетания маркеров устойчивости, характерным было преобладание клонов с более высокой антилизоцимной активностью. Например, в популяциях аитибиотикоустойчивых эшерихий серогруппы 025 (группа А) было в 2.0 раза больше клонов с уровнями АЛА 5-10 мкг/мл, чем у антибиотикочувствительного штамма серогруппы 0144 (Рф<0.05). Аналогичные закономерности выявлены у штаммов контрольной группы.

Одной из наиболее гетерогенных по признаку АЛА оказалась популяция антибиотикоустойчивого штамма серогруппы 0111 с уровнем антилизоцимной активности 15 мкг/мл (Рис. 2). Она состоит из клонов с антилизоцимной активностью в диапазоне от 1 до 25 мкг/мл. В структуре бактериальной популяции антибиотикоустойчивого штамма группы Б с суммарным уровнем АЛА менее 1 мкг/мл 59.6% клонов неактивны в отношении лизоцима, а остальные имели уровень АЛА 1 мкг/мл.

При изучении устойчивости к бактерицидному действию сыворотки крови (БДСК) у чувствительных к антибиотикам штаммов эшерихий групп А и Б существенных различии в распространении данного признака не обнаружено. У эшерихий патогенных серог-рупп, устойчивых и чувствительных к антибиотикам, признак выживания в нормальной человеческой сыворотке (НЧС) выявлен у 85.7% и 100% штаммов, соответственно (Ртмф >0.05); в группе банальных у 85.7% и 71.4% (Ртмф > 0.05).

Учитывая, что антибиотикоустойчивость бактерий детерминируется генами как хромосомы, так и плазмпд, оценивали возможное влияние плазмидного генома на выживание эшерихий в сыворотке. В опытах использовали исходные антибиотикоустойчи-вые штаммы (21) и их антибиотикочувствительные производные

Рис.. 2 Структура бактериальных популяций эшерихий суровнем АЛА15.0 мкг/мл. Количество клонов сразличным

уровнем АЛА: м (в %) (А - шт.№ 2891, Б - N2 630)

(21), полученные в опытах элиминации, а также трансконыо-гаты с Я-плазмидами (10).

В наших исследованиях установлено, что для многих эшери-хий (71.4% шгаммов группы А и 57.1% группы Б), содержащих II-плазмиды, характерно возрастание количества КОЕ через 3 часа контакта с сывороткой (от 0.2 до 1.2 1«), У бесплазмидных Е. сой, полученных в ходе элиминации, показатель выживания колебался в широких пределах: у производных эшерихий патогенных серог-рупп он находился в более узком диапазоне (от +0.3 до +0.9 у производных банальных эшерихий - в более широком (от +0.1 до +1.1 \ё).

При сравнении выживания в сыворотке изогенных пар, отличающихся по признаку содержания Я-плазмид, существенная разница показателей выживания (от 0.8 до 3.1 выявлена у эшерихий патогенных серогрупп (Рис. 3). Как видно из представленных данных, выживание последних в нормальной человеческой сыворотке существенно зависит от наличия Л-плазмид (Ртмф<0.05). В течении 3 часов инкубации статистически достоверное различие концентраций антибиотикоустойчивых клонов и их бесплазмидных производных (Р<0.05) отмечено у 20 изогенных пар; в течении первых 30 минут - у 35.7% изогенных пар и через 2, 3 часа контакта с сывороткой - у 71.4%, 78.6%, соответственно.

Следует отметить, что у изогенной пары штаммов серогруп-пы 0144 после контакта с сывороткой отсутствовали статистически достоверные различия концентраций клеток, а у некоторых бесплазмидных антибиотикочувствительных производных (серогрупп 075, 0119, 0124 и 0144) отмечалось возрастание КОЕ через 1-2 ч (на 2.1 - 2.5 Это свидетельствует о влиянии хромосомных генов на выживание эшерихий патогенных серогрупп в НЧС , которое, тем не менее, выраженно в меньшей степени, чем влияние Я-плазмид.

При инкубировании в нормальной человеческой сыворотке антибиотикоустойчивых штаммов банальных эшерихий и их бесплазмидных производных у 71.4% изогенных пар различия КОЕ через 3 часа контакта с сывороткой статистически недостоверны (Р>0,05).

% КОЕ /мл

% КОЕ /мл

Рис.3 Кривые выживания Е.соН серогрупп 0151 (1, 2 - NN6368, 44627), 0119 и 075 (3, 4 - NN202, 1090) в нормальной человеческой сыворотке в зависимости от содержания К-плазмид (11+ - исходный антибиотикоусгойчивый штамм, Я- -производный, утративший маркер(ы) антибиотикоустойчивости).

Влияние R-ллазмид на выживание эшерихий в НЧС подтверждено в опытах с реципиентным штаммом С600 5К и транс-коньюгантами. У трансконьюгантов, полученных от скрещивания эшерихий патогенных серогрупп, разница показателей выживания с реципиентным штаммом составила от +0.26 до +1.07 lg (Ртмф<0.05). Анализ кривых выживания реципиентного штамма и трансконьюгантов, полученных от банальных E.coli показал, что переданные плазмиды не только не оказывали существенного влияния на выживание штаммов, но и увеличивали их чувствительность к бактерицидному действию сыворотки.

Сопоставление наиболее распространённых среди штаммов обеих групп маркеров антибиотикоустойчивости и признака выживания в НЧС показало, что между наличием определенного маркера антибиотикоустойчивости у изучаемых штаммов и признаком выживания в нормальной человеческой сыворотке отсутствует прямая корреляционная связь (показатель г abed для Тс составил 0.23; Ар - 0.02; Cm - 0.12; Km - 0.02 и Sm - 0.24).

Известные ранее титрационные (чашечные) методы определения антикомплементарной активности (чувствитель-ности к БДСК) основаны на 2-3-х-часовом инкубировании испытуемых штаммов в НЧС с последующим высевом инкубационной смеси на плотные питательные среды и подсчетом численности жизнеспособных клеток . Однако эти методы являются трудоемкими, т.к. требуют использования большого количества лабораторной посуды, титрования инкубационной смеси, и, кроме этого, предполагают наличие в смеси балластных веществ, мешающих определению .

Учитывая способность патогенных эшерихий к диффузному росту в полужидком питательном агаре, нами испытан новый способ определения АКА. Для этого испытуемый штамм в одинаковых дозах вносили в полужидкий питательный агар с нативной и гретой сыворотками в 2-х чашках Петри, где он в ходе инкубирования образовывал зоны диффузного роста. Различие между диаметрами зон в опыте и контроле предложено использовать в качестве показателя АКА: разность, равная 0,14 - 1,25 мм, свидетельствует о наличии признака АКА; равная 1,70 - 2,74 мм - об отсутствии признака. Результаты исследования, проведенные с использованием

общепринятого и предложенного метода представлены в табл.2. Следует отметить, что результаты выявления чувствительных и устойчивых к БДСК штаммов эшерихий, полученные двумя испытанными методами, совпадают.

Выявленные в предыдущих исследованиях свойства R-плазмид клинических штаммов эшерихий послужили основанием для проведения серии опытов изучения влияния прометазина гидрохлорида (пипольфена) на стабильность наследования этих плаз-мид. В опытах использовали 11 штаммов (8 -группы А и 3 - группы Б). Исследование включало определение МИК пипольфена при различных температурах культивирования эшерихий, влияние различных (от 100 до 500 мкг/мл) концентрации препарата на стабильность наследования R-плазмид.

Установлено существенное влияние температуры культивирования на уровень МИК геом. пипольфена в отношении эшерихий патогенных серогрупп. При 37°С МИК геом. препарата составила 317.4 ± 1.2 мкг/мл, при +42°С чувствительность к антимикробному действию пипольфена повышалась, что сопровождалось снижением МИК геом. до 255.4 ±1.2 мкг/мл. Аналогичные результаты в тех же условиях опыта наблюдали при исследовании МИК геом. в отношении штаммов, выделенных из кишечника здоровых лиц. Вместе с тем, у эшерихий

Таблица 2. Показатели АКА чувствительных и устойчивых к действию нормальной сыворотки штаммов E.coli, полученные титрационным и культуральным методами.

N ш т Титрацнонный метод Культуральный метод

а м м а Кол-во КОЕ после инкуб* Отношение к БДСК Диаметр зоны диффузии М+т, мм Р

Опыт Контроль Показатель АЛА (А) (Б) (Б - А)

I 2% чувствнт. 6,04+0,60 8,41 ±0,72 2,41+0,33 < 0,05

2 0% чувствит. 0,47+0,42 2,59+0,48 2,11 ±0,41 <0,01

3 7% чувствит. 2,12+0,11 4,43+0,56 2,21 ±0,34 <0,01

4 121% устойч. 3,20+0,41 3,83+0,33 0,73±0,24 >0,05

5 178% устой ч. 3,31+0,32 4,30+0,33 0,97±0,28 >0,05

6 209% устойч. 6,05+0,57 6,50+0,55 0,85±0,27 >0,05

7 89% усгойч. 2,28+0,23 1,90+0,19 0,38±0,24 >0,05

8 247% устойч. 2,92+0,26 3,45+0,35 0,56±0,22 >0,05

Примечание: *-по отношению к числу КОЕ до инкубации

различного происхождения при одинаковых температурах культивирования выявлены близкие значения МИК геом. пипольфена, различия между ними статистически недостоверны (Р>0.05).

Показано, что стабильность наследования R-плазмид у разных штаммов в присутствии пипольфена неодинакова и не зависит от концентрации препарата в диапазоне 100 - 450 мкг/мл. Так у 7-ми штаммов (групп А и Б) количество антибиотикочувствиггельных клонов при различных концентрацях препарата находилась в диапазоне 0.1 - 3.8%; у всех клонов 3-х штаммов серогрупп 0151 и 0144 при концентрации пипольфена 250 -300 мкг/мл наблюдали стабильное наследование маркеров антибиотикоустойчивости, а статистически достоверное увеличение количества антибиотико-устойчивых клонов (Р<0.05) отмечено только у штаммов серогрупп 0111 и 0144 в присутствии 150 и 250 мкг/мл пипольфена, соответственно. Значительное увеличение количества клонов, утративших R-плазмиду (до 65.8%), наблюдали у одного штамма группы Б, причём при всех испытанных концентрациях препарата. Практически совпадающие количества появляющихся антибиотикочувстви-тельных клонов у этого штамма при концентрации пипольфена 100 и 300 кг/мл (45.9 - 66.8% и 49.9 - 55.8% .соответственно) также подтверждают отсутствие зависимости между концентрацией пипольфена и уровнем нестабильности R-плазмид.

При изучении дестабилизируещего влияния пипольфена на R-плазмиды, контролирующие устойчивость к антибиотикам и

бактерицидному действию сыворотки крови, обнаружено, что большинство полученных производных штаммов эшерихий патогенных серогрупп чувствительны к БДСК: после контакта с сывороткой рост жизнеспособных клеток при высеве на плотные питательные среды у них отсутствовал или значение КОЕ уменьшалось на 0.2 - 0.8

ВЫВОДЫ

1. Штаммы эшерихий патогенных серогрупп, выделенные от больных кишечными эшерихиозами, в отличие от штаммов неклициче-ского происхождения, обладают более высокой адгезивной активностью при заражении клеток культур Нер-2; значения индексов адгезии эшерихий на эритроцитах зависят от принадлежности штаммов к серогруппе.

2. При биотипировании эшерихий серогрупп 0124 и 0144 в качестве дополнительного признака можно учитывать сроки ферментации лактозы, что позволяет определить принадлежность к 1-му, 3-му или 4-му биоварам.

3. Возбудители кишечных эшерихиозов, по сравнению с эшери-хиями, выделенными из кишечника здоровых лиц, чаще обладают выраженной устойчивостью к стрептомицину, тетрациклину и ри-фампицину; высокая устойчивость эшерихий патогенных серогрупп к стрептомицину контролируется генами коньюгативных К-плазмид и(или) хромосомы.

4. Для структуры популяций антибиотикоустойчивых штаммов возбудителей кишечных эшерихиозов, по сравнению с популяциями антибиотикочувствительных штаммов, характерно преобладание клонов с более высокими уровнями антилизоцимной активности (от 17,3% до 25,0%).

5. Показатель выживания эшерихий патогенных серогрупп в нормальной человеческой сыворотке (от 0,8 до 3,1 lg) существенно зависит or наличия у них R-плазмид. Штаммы с R-плазмидами вне зависимости от состава детерминант антибиотикоустойчивости имеют более высокие показатели выживания, чем бесплазмидные штаммы.

6. На основе изучения подвижного роста в полужидком питательном агаре в присутствии нормальной человеческой сыворотки разработан простой и экономичный способ определения антикомплементарной активности эшерихий.

7. Пипольфен в суббактериостатических концентрациях оказывает элиминирующее действие на собственные R-плазмиды возбудителей кишечных эшерихиозов, контролирующие также устойчивость к бактерицидному действию сыворотки крови. Стабильность наследования R-плазмид зависит от штамма и не зависит от концентрации препарата в диапазоне 100-450 мкг/мл.

. Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Адгезивная активность энтероинвазивных эшерихий различных биоваров и серогрупп / О.В.Евдокимова, И.В.Смирнов, Т.И.Карпова, Н.И.Картавых, Н.И.Терехина, В.Д.Соколова, Ю.Л.Лесняк.- Тез.докл. 1-й Международной компьютерной конференции "Актуальные вопросы диагнос-тики, лечения и профилактики заболеваний человека", Украина, Тернополь. - 1994,- 4 с.

2. Антибиотикоустойчивость эшерихий различного происхождения./ О.В.Евдокимова, И.В.Смирнов, К.А.Силин, М.В.Коренева. - Антибиотики и химиотерапия, 1995. - т.40. -N8.-с.27-31.

3. Евдокимова О.В., Смирнов И.В., Коноплева В.И. Выживание Escherichia coli в сыворотке крови в зависимости от R-плазмид.

- Антибиотики и химиотерапия, 1995. - т.40. - N8. - с.32 - 35.

4. Smimov I.V.,Evdokimova O.V. A study of drug resistance and virulence markers in Escherichia coli and Yersinia enterocolitica strains. - Med.Microbiol.Lett., Suppl.1.,1996, May. - v.5. - p. 41 (P70).

5. Евдокимова O.B., Смирнов И.В. Распространение признака ан-тилизоцимной активности у чувствительных и устойчивых к антибиотикам штаммов эшерихий. - Деп. в ВИНИТИ -N 3014-В96 от 14.10.96.-8 с.