Этиологическая структура сальмонеллеза и эшерихиоза птиц

Плитов, Иван Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Этиологическая структура сальмонеллеза и эшерихиоза птиц
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Этиологическая структура сальмонеллеза и эшерихиоза птиц"

На правах рукописи

ПЛИТОВ ИВАН СЕРГЕЕВИЧ

ЭТИОЛОГИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА САЛЬМОНЕЛЛЕЗА И ЭШЕРИХИОЗА ПТИЦ

06.02.02 — Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

1 7 МАЙ 2012

005043660

МОСКВА 2012

005043660

Работа выполнена на кафедре «Инфекционные и паразитарные болезни» ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» (ФГБОУ ВПО «МГУПП») Министерства образования и науки РФ.

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор

Ленченко Екатерина Михайловна (ФГБОУ ВПО «МГУПП»)

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Степаненко Петр Петрович (ФГБОУ ВПО «МГУПП»)

доктор ветеринарных наук Пирожков Михаил Константинович (ФГБУ «ВГНКИ»)

Ведущая организация: Государственное научное учреждение

«Научно-исследовательский институт птицеперерабатывающей промышленности» Россельхозакадемии РФ (ГНУ НИИПП)

Защита состоится «т^» 2012 г. часов на заседании Со-

вета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.148.09 в ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» (109316, Москва, ул. Талалихина, 33).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств».

Автореферат разослан ■ ^ • 2012 г.

Автореферат размещен на сайте www.mgupp.ru Э.З.оч . 2012 г.

Автореферат отправлен для размещения на сайте

Министерства образования и науки РФ ^ . 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В структуре инфекционной патологии птиц по статистическим данным более 60,0 % составляют болезни бактериальной этиологии, из числа которых в период 2007-2011 гг. массовая доля сальмонеллеза составила 11,7%, эшерихиоза - 63,0 % (Венгеренко JI. А., 2009, 2011;Фисинин В. И., 2007, 2011).

В этиологии сальмонеллеза птиц участвуют микроорганизмы S. typhimurium и S. enteritidis, а также S. gallinarum и S. pullorum, вызывающие пуллороз птиц отряда Куриные. Этиологическая структура эшерихиоза наиболее часто представлена серогруппами Ol, 02, 026, 055, 078, 0138 (Бессарабов Б. Ф., 1980, 2007; Кожемяка Н. В., 1982, 2008; Грошева Г. А., 1983; Стрельников А. П., 1987; Радчук Н. А., 1990; Гусев А. А. и соавт., 1992; Козак С. С, 1992, 2011; Тугаринов О. А., 1993; Сидоров М. А. и соавт. 1995; Панин А. Н. и соавт., 1995; Ленев С. В., 1996; Шустер Б. Ю., 1996; Субботин В. В., 1997; Куликовский А. В., 1998, 2011; Малик Н. И. и соавт., 1998; Яременко Н. А., 1998; Каврук Л. С. и соавт., 1999; Пирожков М. К., 1999, 2002; Степаненко П. П., 1999; Виноходов В. О., 2000; Ленченко Е. М., 2000, 2011; Капустин А. В., 2001; Степаненко И. П., 2001; Венгеренко Л. А., 2003; Андреева Н. Л. и соавт., 2004; Бовкун Г. Ф., 2004; Салаутин В. В., 2004; Борисенкова А. Н. и соавт., 2004; Светоч Э. А., 2004; Крупальник В. Л., 2005; Скородумов Д. И. и соавт., 2005; Гусев В. В., 2006; Павлова И. Б., 2007; Галазин Н. М. и соавт., 2007; Рождественская Т. Н., 2009, 2011; Кононенко А. Б. и соавт, 2011; Смирнов Д. Д., 2011; Eickhoff Т. С., 1981; М. D. Galvez А., 1989; Collins, 2001; Janice Y. С., 2011). Установлено, что при болезнях бактериальной этиологии в биотопе желудочно-кишечного тракта диких и синантропных птиц преобладают микроорганизмы родов Salmonella, Escherichia, Staphylococcus, Streptococcus, Pasteurella (Белоусова Р. В., 1977; Сюрин В. Н., 1979; Бессарабов Б. Ф., 2005, Багрецова А. Л., 2005; Бондарев А. Ю., 2009). Циркулирующие среди поголовья птицы микроорганизмы характеризуются устойчивостью к химиотерапевтическим препаратам, в частности, установлена устойчивость эптеробактерий к антибиотикам тетрациклинового ряда, природным и полусинтетическим пенициллинам (Пилипейко В. Г. и соавт., 2002; Хиштова Н. С., 2008; Шурахова Ю. Н. и соавт., 2011). При проведении мониторинговых исследований распространенности сальмонеллеза и эшерихиоза птиц целесообразным представляется применение эффективных методов индикации, оценки антагонистической активности, чувствительности к антибиотикам и дезинфицирующим средствам патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, циркулирующих среди поголовья птицы при массовых желудочно-кишечных болезнях, что и определило актуальность темы диссертационной работы.

Цель исследований: изучить этиологическую структуру сальмонеллеза и эшерихиоза птиц с применением эффективных диагностических питательных сред и тест-систем для индикации и идентификации таксономически сходных видов эптеробактерий.

Задачи исследований:

- провести ретроспективный анализ данных по распространенности инфекционных болезней птиц бактериальной этиологии;

- изучить ростообеспечивающие и ингибирующие свойства дифференциально-диагностических питательных сред и чувствительность иммунохромато-графической гест-системы «Singlepath ® Salmonella» для индикации и идентификации микроорганизмов;

- изучить эффективность схем бактериологического исследования на наличие микроорганизмов рода Salmonella и Escherichia;

- изучить количественный и видовой состав микроорганизмов в микробиоценозах кишечника птиц;

- изучить видовой состав патогенных и условно-патогенных энтеробакте-рий, выделенных из патологоанатомического материала птиц;

- изучить этиологическую структуру сальмонеллеза и эшерихиоза птиц;

- изучить антагонистическую активность, чувствительность к антибиотикам, устойчивость к дезинфицирующим средствам выделенных изолятов энте-робактерий

Научная новизна. Установлено, что при желудочно-кишечных болезнях птицы в микробиоценозе желудочно-кишечного тракта доминируют культуры микроорганизмов, отнесенные к видам: Escherichia coli - 41,2 %; Salmonella typhimurium — 12,8 %; Salmonella enteritidis — 10,7 %; Proteus vulgaris - 7,0 %. Установлено, что этиологическая структура сальмонеллеза представлена видами - S. enteritidis (45,8 %), S. typhimurium (54,2 %); эшерихиоза, серогруппами -02 (32,14 %), 015 (25,0 %), 01 (21,43 %), 078 (21,43 %), соответственно. При определении адгезивных антигенов установлено, что из 9 изолятов Е. coli, отнесенных к серогруппе 02, адгезивными свойствами обладали 4 изо-лята (К99, 987Р, F41, А20); из 7 изолятов, отнесенных к серогруппе 015, - 4 изолята (К99, А20); из 6 изолятов, отнесенных к серогруппе Ol, — 3 изолята (А20); из 6 изолятов, отнесенных к серогруппе 078, - 4 изолята (К88, А20). С применением модифицированного метода изучения антагонистической активности бактерий установлено, что биологически активные вещества, продуцируемые изолятами Е. coli, угнетают рост бактерий S. typhimurium с зоной задержки роста 1,4±0,1 мм; S. enteritidis - 1,6±0,1 мм; C.freundii- 1,5±0,2 мм; P. mirabilis - 0,6±0,1 мм; К. pneumonia - 1,3±0,1 мм. Из изолятов энтеробактерий, выделенных при желудочно-кишечных болезнях птиц, 21,4 % штаммов были чувствительны к антибиотикам группы цефалоспоринов (цефазолин, цефатоксим); 19,1 % - фторхинолонов (офлоксацин, ципрофлоксацин); 16,7 % - аминоглико-зидов (канамицин, амикацин). Среди изолятов энтеробактерий выделены штаммы, устойчивые к антибиотикам группы макролидов (эритромицин, оле-ацдомицин) и природных пенициллинов (оксациллин), - 21,4 % соответственно.

нистической активности микроорганизмов и разработаны «Методические рекомендации по определению антагонистотеской активности микроорганизмов», утвержденные секцией «Ветеринарная санитария, гигиена и экология» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 8 от 22 июня 2010 года). Результаты исследований используются в учебном процессе на ветеринарно-санитарном факультете ФГБОУ ВПО «МГУПП» но дисциплине «Эпизоотология».

Апробация материалов диссертации. Основные результаты диссертационной работы доложены и одобрены на заседаниях кафедры «Инфекционные и паразитарные болезни» МГУПБ (М., 2008-2011); на VII Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (М., 2008); на II Международной научно-практической конференции «Научно-техническое творчество молодежи - путь к обществу, основанному на знаниях» (М., 2010); на VI Международном ветеринарном конгрессе по птицеводству (М., 2010).

Основные положения, выносимые на защиту:

• результаты ретроспективного анализа данных по распространенности инфекционных болезней птиц бактериальной этиологии;

• количественный и видовой состав энтеробактерий, доминирующих в микробиоценозах кишечника при желудочно-кишечных болезнях птиц;

• этиологическая структура сальмонеллеза и эшерихиоза птиц;

• антагонистическая активность, чувствительность к антибиотикам, устойчивость к дезинфицирующим средствам выделенных изолятов энтеробактерий

Публикация результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 научных статей, в том числе 4 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, выводов, библиографии, приложения. Работа изложена на 120 страницах компьютерного текста, содержит 14 таблиц, 10 рисунков. Библиографический список включает 174 источника, из них 71 иностранных авторов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена с 2007 по 2011 гг. на кафедре «Инфекционные и паразитарные болезни» ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии». Часть исследований проводилась в отделе диагностики бактериальных болезней ФГБУ «ЦНМВЛ».

В опытах были использованы паспортизированные штаммы: Salmonella typhimarium № 5715; Salmonella enteritidis № 204; Escherichia coli 02, № 388; Escherichia coli 078.K80, № 320; Escherichia coli 0138.K8I, № 723; Klebsiella pneumonia N° 24; Staphylococcus aureus № 123; Proteus vulgaris H2091, полученные из коллекции ФГБУ ВГНКИ, Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. JI. А. Тарасевича. Изучение ростообеспечивающих, дифференциальных и ингибирующих свойств пита-

тельных сред проводили в соответствии с «Рекомендациями по организации и проведению контроля качества питательных сред для ветеринарных лабораторий» (М., 2011). При учете количественного состава энтеробактерий в микробиоценозах кишечника цыплят учитывали КОЕ микроорганизмов (Ig/r) в определенном объеме (0,1 мл) разведения feces (Эпштейн-Литвак Р. В., 1969; Субботин В. В., 1999). С целью выделения возбудителей сальмонеллеза и эшерихи-оза исследования проводили в соответствии с методическими указаниями: «Лабораторная диагностика сальмонеллезов человека и животных, обнаружение сальмонелл в кормах, продуктах питания и объектах внешней среды» (М., 1990); «Методические указания по бактериологической диагностике колибак-териоза (эшерихиоза) животных» (М., 2000). Для оценки этиологической значимости патогенных и условно-патогенных энтеробактерий при желудочно-кишечных болезнях исследования проводили в соответствии с «Методическими указаниями по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями» (М., 1999). Пробы пищевых продуктов для бактериологических исследований отбирали в количествах, предусмотренных нормативными документами: ГОСТ 26668-85 (СТСЭВ 3013-81) «Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологического анализа»; ГОСТ 7269-79 «Мясо. Методы отбора образцов и органолептические методы определения свежести»; СанПиН 2.3.2.560-96 и 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов»; ГОСТ 10444.15-94 «Продукты пищевые. Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов»; ГОСТ 30519-97 (ГОСТ Р 50474-93) «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)»; ГОСТ 30519-97 (ГОСТ Р 50480-93) «Продукты пищевые. Методы выявления бактерий рода Salmonella». Идентификацию выделенных культур проводили в соответствии с классификационной системой «Bergy' s manual... 1984-1989». Биологические свойства микроорганизмов изучали, используя общепринятые методы (Герхардт Ф. и соавт., 1984; Сидоров М.А. и соавт., 1995; Скородумов Д.И. и соавт., 2005). В экспериментах использовали иммунохроматографическую тест-систему «Singlepalh ® Salmonella» {«Merck», Германия), латекс-агглютинационный экспресс-тест «Salmonella latex kit» {«Oxoid», Англия), питательные среды «ВСА», «Эндо» («Hi-media», Индия), «Rambach agar», «XLT-4 agar», «Cromocult Coliform agar» {«Merck», Германия). Биохимические свойства микроорганизмов изучали с использованием сред Гисса и множественной тест-системы «API» {«BioMerieux», Франция). Серогрупповую принадлежность сальмонелл определяли в реакции агглютинации на стекле с диагностическими сыворотками (ФГУП «Курская биофабрика»), в соответствии с рекомендациями, изложенными в «Наставлениях по применению наборов сывороток сальмо-неллезных О-комплексных и монорецепторных О- и Н-агглютинирующих для идентификации сальмонелл в РА на стекле» (М., 1997). Серогрупповую принадлежность эшерихий определяли в реакции агглютинации с диагностически-

ми сыворотками (ФГУП «Армавирская биофабрика»), в соответствии с рекомендациями, изложенными в «Наставлении по применению агглютинирующих О-коли сывороток» (М., 1998). Для определения адгезивных антигенов эшери-хий использовали агглютинирующие сыворотки К88, К99, 987Р, F41, А20 любезно предоставленные профессором Эдуардом Арсеньевичем Светочем (ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии).

Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам изучали методами серийных разведений, диффузии в агар (Навашин С. М., Фомина И. П., 1982), с использованием микробиологического анализатора «MicroTax». Антагонистические свойства микроорганизмов изучали общепринятыми методами (Егоров Н. С., 1979; Степаненко П. П., 1999) и с применением мембранных фильтров (Павлова И. Б., Ленченко Е. М., 1997). Исследования по устойчивости микроорганизмов к дезинфицирующим средствам проводили в соответствии с методическими указаниями «О порядке испытания новых дезинфицирующих средств для ветеринарной практики» (М., 1987), «Проведение дезинфекции и дезинва-зии объектов государственного ветеринарного надзора» (М., 2002). Полученные данные обрабатывали методом вариационной статистики с использованием методического руководства «Теория статистики» и программы «Statgraphics» (ШмойловаР. А.,2006).

Выражаем благодарность д-ру биол. наук, проф. Павловой И. Б. (В1ГИИВСГЭ) за оказание консультативной помощи при выполнении опытов по оценке антагонистической активности микроорганизмов, д-ру вет. наук Бе-лоусову В. И. (ФГБУ «ЦНМВЛ») за оказание консультативной помощи при проведении ретроспективного анализа данных статистической отчетности по бактериальным болезням птиц.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Анализ данных о распространенности инфекционных болезней птиц бактериальной этнологии

В период с 2008 по 2011 гг. был проведен ретроспективный анализ первичных данных отчетности ветеринарных лабораторий субъектов РФ в соответствии с «Журналом сведений о работе ветеринарных лабораторий» форма № 4-Вет (ФГБУ «ЦНМВЛ»). При анализе данных по инфекционным болезням птицы бактериальной этиологии установлено, что до 49,0 % поступившего материала (патологический материал, инкубационные и товарные яйца, эмбрионы задохлики, feces) было исследовано на наличие возбудителей сальмонеллеза, 25,0 % - эшерихиоза. От общего количества проведенных исследований -216723 исследованных проб наибольший процент положительных результатов, составляли эшерихиоз, стрептококкоз и сальмонеллез; диагноз эшерихиоз регистрировался в 63,0 % случаев, сальмонеллез - 17,3 %. От общего количества положительных результатов (24200) 60,0 % составлял эшерихиоз, 13,0 % -стрептококкоз, 12,5 % - сальмонеллез, 6,2 % - стафилококкоз, 6,0 % - нсевдо-

моноз, 2,0 % - пастереллез, 0,5 % - условно-патогенные микроорганизмы (табл.

Таблица 1

Результаты анализа данных о структуре инфекционных болезней птиц __бактериальной этиологии_

Диагноз Г >Д

2008 | 2009 2010 I 2011

Источник выделения, % положительных случаев (патологический материал, эмбрионы задохлики, feces)

I II III I II III I II III I II III

Сальмонеллез 39,3 9,2 51,5 41,2 8,7 50,1 42,4 7,9 49,7 41,7 8,9 49,4

Эшерихиоз 42,5 14,3 43,2 45,3 13,9 40,8 44,9 17,4 37,7 43,2 14,1 42,7

Псевдомоноз 54,1 33,7 12,2 52,3 36,8 10,9 55,1 27,3 17,6 53,8 24,1 22,1

Стафилококкоз 44,6 31,7 23,7 48,3 34,1 17,6 45,6 33,8 20,6 45,1 30,4 24,5

Стрептококкоз 48,9 28,7 22,4 50,2 28,4 21,4 49,7 30,1 20,2 50,4 29,3 20,3

Условные обозначения: I - патологический материал; II - эмбрионы задохлики; III -feces

В структуре инфекционной патологии птиц бактериальной этиологии в период с 2008 по 2011 годы массовая доля сальмонеллеза и эшерихиоза составляла 12,3 и 64,0 % соответственно (рис. 1).

70 64,40%

20 12,30% 15,30%

10 ¡Üj ■ 5,10 % 2,90% ..¡¡¿¿¡ячШШ

Эшерихиоз Сальмонеллез Стрептококкоз Стафилококкоз Псевдомоноз

Рве. 1. Результаты анализа данных статистической отчетности о структуре инфекяионных болезней птиц бактериальной этиологии

3.2. Сравнительная характеристика эффективности дифференциально-диагностических сред в опытах с референтными штаммами микроорганизмов

Для оценки дифференциально-диагностических свойств сред взвесь микроорганизмов, содержащую около 1000 бактериальных клеток в 1 мл (стандарт мутности ГИСК им. Л. А. Тарасевича), высевали по 0,1 мл на поверхность исследуемой среды, культивировали при 37 °С 24 ч. При оценке свойств сред «ВСА» и «Эндо», «Rambach agar», «XLT-4 agar», «Cromocult Coliform agar» в опытах с чистой культурой микроорганизмов и со смешанной суспензией мик-

роорганизмов росгообеспечивающие и ингибирующие свойства сред существенно не отличались (табл. 2,3).

Таблица 2

Сравнительная оценка ростообеспечивающих свойств сред

Среда Количество выросших колоний, КОЕ

S. typhimurium S. enteritidis Е. coli Р. vulgaris .S. aureus

ВСА 81,33*1,63 90,17±1,47 70,00*1,41 79,67*0,89 -

Эндо 86,25±2,31 86,40±2,13 81,20±1,47 81,10*0,89 •

Rambach agar 92,00*1,41 97,30*1,03 89,50± 1,04 79,00*3,74 -

XLT-4 agar 91,70*1,32 96,70*1,12 87,20*1,44 71,10*2,67 -

Условные обозначения: «-» нет роста микроорганизмов

Таблица 3

Сравнительная оценка ингибирующих свойств сред для индикации сальмонелл (М±т)

Среда Количество колоппй микроорганизмов КОЕ

fe twhimurum 5. enteritidis S. tvnhimurium S. enteritidis f. tvphimurum X enteritidis

Е. coli Е. coli P. vulgaris P. vulgaris S. aureus S. aureus

ВСА 45.7*2.1 25,6*3,5 42.3*3.4 13,4*2,7 41,3*2,6 24,7*4,1 43.2*3,9 21,17*2,40 47.3*1,8 44.10±2.67

Rambach agar 41.60*1.96 33,8*4,5 39.2*3.7 41,2*2,1 42.3*3.7 23,2*2,9 47.3*3.3 22,6*3,5 48.3*3.7 48.2*3.6

Условные обозначения: «-» нет роста микроорганизмов

Микроорганизмы S. typhimurhim и S. enteritidis, образующие сероводород, на среде «ВСА» формировали черные колонии с характерным металлическим блеском; микроорганизмы Е. coli и P. vulgaris, не образующие сероводород, формировали светло-зеленые колонии. Микроорганизмы S. enteritidis и S. typhimurium формировали розово-красные колонии на среде «Rambach agar» и черные колонии на среде «XLT-4 agar»\ микроорганизмы Е. coli формировали на среде «Rambach agar» сине-зеленые колонии, на среде «XLT-4 agar» -желтые колонии; микроорганизмы P. vulgaris формировали на среде «Rambach agar» колонии оранжевого цвета, на среде «XLT-4» - бесцветные колонии. Дифференцирующее действие среды «Rambach agar» основано на том, что входящий в состав среды пропиленгликоль ферментируется сальмонеллами до кислоты, которая, воздействуя на рН-индикаторы, окрашивает колонии в красный цвет. Применение среды позволяло дифференцировать розово-красные колонии сальмонелл от сине-зеленых колоний эшерихий и оранжево-желтых колоний протея. Входящий в состав среды дезоксихолат натрия ингибировал феномен "роения" протея и рост S. aureus. Индикацию сальмонелл на среде «XLT-4 agar» проводили по черной окраске колоний, обусловленной продукцией сероводорода при ферментации лизина и отсутствии или малой интенсивности,

ферментации ксилозы, лактозы и сахарозы. На среде «Cromocult Coliform agar» Е. coli формировали колонии фиолетового цвета; S. typhimurium, S. enteritidis и Р. vulgaris - бесцветные колонии. В целом ростообеспечивающие и ингибиру-ющие свойства изученных питательных сред существенно не отличались, вместе с тем хромогенные среды «Rambach agar», «XLT-4 agar» ,«Cromocult Coliform agar» отличались более выраженными дифференциальными свойствами по сравнению со средами «Висмут-сульфит агар», «Эндо».

3.3. Сравнительная оценка эффективности схем бактериологического исследования на наличие микроорганизмов рода Salmonella и Escherichia

Оценка эффективности схем бактериологического исследования на наличие сальмонелл. Исследовали патологический материал от сельскохозяйственных птиц («=40); пробы feces сельскохозяйственных, а также синантроп-ных птиц (и=50); охлажденное мясо птицы (/¡=20). Исследования на наличие сальмонелл проводили по схемам: схема I «Индикация и идентификация сальмонелл с применением среды «ВСА»', схема II — с применением среды «Rambach agar»\ схема III - с применением среды «XLT-4 agar». Идентификацию сальмонелл, выделенных из патологического материала, по схеме I проводили на 5-е сутки исследования, из 84 типичных колоний были идентифицированы 10 культур микроорганизмов рода Salmonella, специфичность среды - 11,9 %; по схеме II - на 4-е сутки исследования, из 16 типичных колоний были идентифицированы 10 культур микроорганизмов рода Salmonella, специфичность среды - 62,5 %; по схеме III - на 4-е сутки исследований, из 19 типичных колоний идентифицировано 10 культур микроорганизмов рода Salmonella, специфичность среды - 52,6 %. Идентификацию сальмонелл, выделенных из feces, по схеме I проводили на 4-е сутки исследования, из 38 типичных колоний было идентифицировано 14 культур микроорганизмов рода Salmonella, специфичность среды - 36,8 %; по схеме II - на 4-е сутки исследования, из 19 типичных колоний были идентифицированы 14 культур микроорганизмов рода Salmonella, специфичность среды - 73,7 %; по схеме III - на 4-е сутки исследований, из 21 типичных колоний идентифицировано 14 культур микроорганизмов рода Salmonella, специфичность среды составила - 66,6 %. Идентификацию сальмонелл, выделенных из охлажденного мяса, по схеме I проводили на 4-е сутки исследования, из 15 типичных колоний были идентифицированы 10 культур микроорганизмов рода Salmonella, специфичность среды - 66,6 %; по схем^ II - на 4-е сутки исследования, из 12 типичных колоний были идентифицированы 10 культур микроорганизмов рода Salmonella, специфичность среды - 83,3 %; по схеме III - на 4-е сутки исследования, из 13 типичных колоний было идентифицировано 10 культур микроорганизмов рода Salmonella, специфичность среды - 76,9 % (табл. 4).

Сравнительная характеристика эффективности схем бактериологического исследования на наличие микроорганизмов рода Salmonella_

Исследуемый Схема исследования Количество Количество культур мик-

материал (продолжительность, типичных ко- роорганизмов рода Salmo-

сутки) лоний nella

Всего %

Патологический матерная (п-40) Н5) 84 10 11,9

11(4) 16 10 62,5

1IH4) 19 10 52,6

Feces (n=S0) I (4) 38 14 36,8

IK4) 19 14 73,7

III(4) 21 14 66,6

Охлажденное мясо (п=20) 1(4) 15 10 66,6

И(4) 12 10 83,3

111(4) 13 10 76,9

Для оценки чувствительности и специфичности иммунохроматографиче-ской тест-системы «Singlepath ® Salmonella», принцип действия которой заключается в учете результата наличия возбудителей сальмонеллеза в материале за счет связывания комплекса «антиген-антитело», взвеси культур микроорганизмов S. enteritidis, S. typhimurium, Е. coli, содержащие от 10 до 10s бактериальных клеток в 1 мл по стандарту мутности ГИСК им. JI. А.Тарасевича, высевали в лунку тест-планшета. В качестве контроля производили посев культур на среды «Висмут-сульфит агар», «Rambach agar», культивировали в течение 24 ч при 37 °С и учитывали рост характерных колоний. С применением тест-системы «Singlepath ® Salmonella» учет результатов можно проводить как при посеве чистых культур микроорганизмов Salmonella spp., так и смешанных культур микроорганизмов S. enteritidis, S. typhimurium, Е. coli в концентрациях от 100 бактериальных клеток в 1 мл суспензии Объектом исследования служили охлажденные куриные окорочка (л = 20): 1 группа - контаминация культурой S. enteritidis (опыт); 2 группа — контаминация культурой S. typhimurium (опыт); 3 группа - контаминация культурами S. enteritidis и Е. coli (опыт); 4 группа - не контаминированные образцы (контроль). Исследуемые пробы т=25 г, погруженные в пептонную воду в соотношении 1:5, контаминировали взвесью микроорганизмов в концентрациях от 107 до 102 бактериальных клеток в 1 мл суспензии и помещали в термостат при 37 °С на 24 ч. С использованием тест-пластин «Petrifilm ЗМ» определяли количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ), сред «Эндо», «Висмут-сульфит агар», «Rambach agar», «XLT-4», «Cromocult Coliform agar» -наличие бактерий группы кишечных палочек (БГКП) и сальмонелл. Индикацию микроорганизмов Salmonella spp. проводили по трем схемам: схема 1 - среда предобогащения —> среда обогащения—> среда ВСА; схема 2 — среда предо-богащения —> среда обогащения—> среда «Rambach agar» и «XLT-4»-, схема 3

- среда предобогащения —> среда обогащения—> иммунохроматографическая система «Singlepath ® Salmonella». Установлено, что КМАФАнМ составило: при посеве разведения 103 - 59,20±4,57; 104 - 24,70±5,24; 105- 8,90± 4,23. С применением схемы 1 индикацию сальмонелл осуществляли на 4-е сутки исследования, применение схемы 2 позволяло провести индикацию сальмонелл на 3 сутки исследования. Применение схемы 3 позволяло провести индикацию микроорганизмов Salmonella spp. на 2-е сутки исследований. При учете результатов после внесения 160 мкл прогретой жидкой среды накопления через 20 мин проявлялись 2 красные полоски, что указывало на наличие в пробе сальмонелл. Результаты, полученные с помощью иммунохроматографической тест-системы, подтверждали пересевом проб на плотные дифференциально-диагностические среды. Тест-система позволяла в течение 24 ч при первоначальной концентрации в исследуемом образце от 100 бактериальных клеток Salmonella spp. проводить индикацию и идентификацию возбудителей сальмонелл еза.

Оценка эффективности схем бактериологического исследования на наличие эшерихий. Исследования на наличие эшерихий проводили по схемам: схема I «Индикация и идентификация эшерихий с применением среды «Эндо»; схема II с применением среды «Chromocult Coliform agar». Идентификацию эшерихий, выделенных из патологического материала, по схеме I проводили на 7-е сутки исследования, из 78 типичных колоний были идентифицированы 20 культур микроорганизмов рода Escherichia, специфичность среды - 25,6 %; из feces - на 6-е сутки исследования, из 47 типичных колоний были идентифицированы 27 культур микроорганизмов рода Escherichia, специфичность среды -57,4 %. Идентификацию эшерихий, выделенных из патологического материала, по схеме II проводили на 6-е сутки исследования, из 36 типичных колоний были идентифицированы 20 культур микроорганизмов рода Escherichia, специфичность среды - 55,5 %; из feces птиц - на 5-е сутки исследования, из 34 типичных колоний были идентифицированы 27 культур микроорганизмов рода Escherichia, специфичность среды - 79,4 % (табл. 5).

Таблица 5

Сравнительная характеристика схем бактериологического исследования на эшерихноз_

Исследуемый материал Схема исследования (продолжительность, сутки) Количество типичных колоний Количество идентифицированных культур макроорганизмов Escherichia coli

Всего %

Патологический материал (п=Щ I 78 20 25,6

II 36 20 55,5

feces (п=50) I 47 27 57,4

II 34 27 79,4

3.4. Результаты оценки кишечных микробиоценозов птиц с синдромом желудочно-кишечных болезней

3.4.1. Количественный и видовой состав бактерий в микробиоценозах

кишечника клинически здоровых птиц

Для выявления изменений экологического равновесия в биотопе желудочно-кишечного тракта клинически здоровых цыплят проводили бактериологические исследования feces, учитывая количественный и видовой состав энте-робактерий, лактобактерий и бифидобактерий. Количество микроорганизмов (КОЕ) в 1 г рассчитывали путем высева 0,1 мл различных разведений исследуемого материала на чашки Петри с плотными дифференциально-диагностическими питательными средами.

Количество выросших колоний эшерихий при посеве пробы feces (m=l,0 г), с последующим высевом на плотные дифференциально-диагностические среды составило при исследовании проб от суточных цыплят: для среды «МПА» - 0, «Эндо» - 0, «Rambach agar» - 0; от цыплят в возрасте 3 суток: «МПА» - 3,98±0,78, «Эндо» - 4,06±0,11, «Rambach agar» - 4,12±0,12; при исследовании цыплят в возрасте 5 суток: «МПА» - 7,61±0,64, «Эндо» - 7,37±0,22, «Rambach agar» - 7,93±0,15; при исследовании цыплят в возрасте 15 суток: «МПА» - 8,71±0,37, «Эндо» - 8,89±0,15, «Rambach agar» - 9,22±0,52. Определение видового состава микроорганизмов на хромогенных средах позволило сократить расход питательных сред, стерильной бактериологической посуды и времени проведения анализа. Для количественного учета лактобактерий использовали среду «MRS agar», бифидобактерий - «Bifidobacterium agar». Количество лактобактерий в зависимости от возраста цыплят составило: 1 сут. -4,21±0,31; 3 сут. - 4,94±0,35; 5 сут. - 6,47±0,34; 15 сут. - 9,42±0,38. Количество бифидобактерий составило: 1 сут. - 0; 3 сут. - 5,17±0,41; 5 сут. - б,78±0,44; 15 сут. - 8,47±0,61.

Биохимическую идентификацию выделенных культур энтеробактерий выполняли с применением сред Гисса и набора «API 20Е», предназначенного для ускоренной биохимической идентификации 104 таксонов грамотрицательных палочек в течение 18-24 ч. Тест-система состоит из прозрачной полимерной пластинки с 20 микропробирками объемом 0,25 мл, содержащими дегидратированные субстраты для определения 20 биохимических тестов. Результаты учитывали, заполняли бланки с кодами цифрового профиля, идентификацию проводили по кодам или идентификационной таблице.

3.4.2. Количественный и видовой состав бактерий в микробиоценозах кишечника птиц с синдромом желудочно-кишечных болезней

При исследовании количественного учета бактерий в микробиоценозах кишечника цыплят с синдромом желудочно-кишечных болезней были выявлены существенные отличия количественного и видового состава микрофлоры

кишечника от нормы. Количество эшерихий при исследовании проб feces от суточных цыплят составляло - 3,73±0,18; проб от цыплят в возрасте 3 сут. -5,54±0,17; проб от цыплят в возрасте 5 сут. - 7,50±0,21. Количество Salmonella enteritidis при исследовании проб feces от суточных цыплят составляло -2,02±0,12; проб от цыплят в возрасте 3 сут. - 3,41±0,11; проб от цыплят в возрасте 5 сут. - 4,09±0,17. Количество Salmonella typhimurium при исследовании проб feces от суточных цыплят составляло - 1,77±0,45; проб от цыплят в возрасте 3 сут. - 2,74±0,31; проб от цыплят в возрасте 5 сут. - 3,79±0,31. Количество лактобактерий в зависимости от возраста цыплят составило: 1 сут. -3,17±0,24; з Сут. - 3,81±0,12; 5 сут. - 4,13±0,17. Количество бифвдобактерий составило: 1 сут. - 0; 3 сут. - 4,11±0,13; 5 сут. - 5,42±0,26.

3.5. Результаты выделения энтеробактерий из патологического материала птиц с синдромом желудочно-кишечных болезней

При исследовании 50 проб патологического материала и 50 проб feces птиц отряда Куриные мясной породы «Брама», яичной породы «Русская белая», мясо-яичной породы «Московская белая»; отряда Гусиные породы «Холмогорская»; отряда Перепела «Японская порода», а так же синантропных птиц отряда Голубиные в возрасте от 1 до 15 суток установлено, что при желудочно-кишечных болезнях доминировали культуры микроорганизмов, отнесенные к видам: Escherichia coli - 41,2 %; Salmonella typhimurium - 12,8 %; Salmonella enteritidis - 10,7 %; Staphylococcus aureus - 11,8 %; Enterococcus faecalis - 10,7 %; Proteus vulgaris - 7,9 %; Enterococcus faecium - 4,9 % (табл. 6).

При серологической идентификации 24 культур сальмонелл, выделенных из патологического материала и feces птиц 11 изолятов (45,8 %) были отнесены к Salmonella enteritidis, 13 изолятов (54,2 %) к Salmonella typhimurium. В результате серологической идентификации культур сальмонелл, выделенных при бактериологическом исследовании патологического материала и feces птиц породы «Брама», 3 изолята (23,2 %) были отнесены к Salmonella typhimurium, 2 изолята (18,2 %) к Salmonella enteritidis; породы «Русская белая» 3 изолята (23,2 %) были отнесены к Salmonella typhimurium, 2 изолята (18,2 %) к Salmonella enteritidis; породы «Московская белая» 2 изолята (15,2 %) были отнесены к Salmonella typhimurium, 3 изолята (27,2 %) к Salmonella enteritidis; «Холмогорской» породы 2 изолята (15,2 %) были отнесены к Salmonella typhimurium, 2 изолята (18,2 %) к Salmonella enteritidis; «Японская порода» 3 изолята (23,2 %) были отнесены к Salmonella typhimurium, 2 изолята (18,2 %) к Salmonella enteritidis (табл. 7).

Таблица 6

Видовой состав патогенных и условно-патогенных бактерий, выделенных из патологического материала птиц

Вид бактерий Соотношение видов бастернй Количество выделенных культур микроорганизмов

Сердце Печень Легкие Селезенка Трубчатая кость Feces

Абс. % Лбе. % Абс. % Абс. % Абс. % Абс. % Абс. %

Escherichia coli 42 41,2 9 21,4 10 23,8 3 7,2 1 2,4 1 2,4 18 42,8

Salmonella enteritidis 11 10,7 - - 6 54,6 - - - - - - 5 45,4

Salmonella typhimurium 13 12,8 - - 9 69,2 - - - - - - 4 30,8

Proleus vulgaris 8 7,9 1 12,5 1 12,5 3 37,5 - - - - 3 37,5

Enterococcus faecalis 11 10,7 2 18,2 5 45,5 - - - - - - 4 36,3

Enterococcus faecium 5 4,9 1 20 2 40 - - - - - - 2 40,0

Staphylococcus aureus 12 11,8 2 16,6 2 16,6 2 16,6 1 8,3 3 33,6 2 16,6

Всего 102 100

Общее количество изолятов, выделенных из органов 15 14,8 35 34,5 8 8,1 2 2,1 4 3,1 38 37,4

Результаты серологической идентификации

микроорганизмов рода Salmonella_

Порода птицы Количество выделенных штаммов, %

Salmonella typhimurium Salmonella enteriíidis

Отряд Куриные: Мясная порода «Брама» 23,2 18,2

Яичная порода «Русская белая» 23,2 18,2

Мясо-яичная порода «Московская белая» 15,2 27,2

Отряд Гусиные: «Холмогорская порода» 15,2 18,2

Отряд Перепела: «Японская порода» 23,2 18,2

3.6. Определение серогрупповой принадлежности и адгезивных антигенов E.coli

Серогрупповую принадлежность культур E.coli определяли в реакции агглютинации антигена с диагностическими О-коли сыворотками. При определении серогрупповой принадлежности эшерихий агглютинирующими поливалентными и моновалентными сыворотками было идентифицировано 28 изоля-тов (66,6 %). Среди изолятов, реагирующих с поливалентной сывороткой «группы №1», обнаружены серогруппы 02, 01, 015, 078. К серогруппе 02 отнесены 9 изолятов (32,14 %), к 01 - 6 (21,43 %), к 015 - 7 (25,0 %), к 078 - 6 (21,43 %).

При серологической идентификации культур эшерихий, выделенных при бактериологическом исследовании патологического материала и feces сельскохозяйственной птицы породы «Русская белая», 4 изолята (44,5 %) были отнесены к серогруппе 02, 2 изолята (33,3 %) к серогруппе 01; породы «Московская белая» 2 изолята (22,2 %) были отнесены к серогруппе 02, 2 изолята (28,6 %) к серогруппе 015, 2 изолята (33,3 %) к серогруппе 078; «Холмогорской» породы 2 изолята (28,6 %) были отнесены к серогруппе 015.

При серологической идентификации изолятов эшерихий, выделенных от синантропных птиц семейства «Голубиные», установлено, что к серогруппе 02 отнесено 3 изолята (33,3 %); к серогруппе 01-4 изолята (66,7 %); к серогруппе 015-3 изолята (42,9 %); к серогруппе 078 - 4 изолята (66,7 %). Из 42 изолятов Е. coli 33,4 % не удалось типировать набором стандартных «О-коли сывороток».

Для определения адгезивных антигенов эшерихий использовали агглютинирующие сыворотки К88, К99, 987Р, F41 и А20 в реакции агглютинации (РА) на стекле. Микроорганизмы культивировали на скошенном МПА или агаре Хотгингера для выявления антигенов К88, 987Р, А20 и на среде Минка - для обнаружения антигенов К99, F41. Реакцию учитывали в течение одной минуты при легком покачивании стекла при температуре 18-28 °С. Контролем служила испытуемая культура, смешанная с каплей физиологического раствора (pH 7,27,4) и с каплей кроличьей сыворотки, разведенной 1:10 (для исключения самоагглютинации). Положительная реакция характеризовалась склеиванием бактериальных клеток в зерна или хлопья различной величины и полным или частичным просветлением сыворотки при отсутствии агглютинации в контроле. Реакцию учитывали сначала с комплексной сывороткой и в случае положительной реакции исследовали культуры, выращенные на МПА или среде Хоттингера, с сыворотками К88, 987Р и А20, а культуры со среды Минка - с К99 и F41.

При определении адгезивных антигенов изолятов Е coli, выделенных из feces и патологического материала сельскохозяйственной и синантропной птицы, установлено, что из 9 изолятов, отнесенных к серогруппе 02, адгезивными свойствами обладали 4 изолята (02:К99 - 1, 02:987Р - 1, 02:F41 - 1, О2.А20 -1); из 6 изолятов, отнесенных к серогруппе 01, адгезивными свойствами обладали 3 изолята (01 :А20 - 3); из 7 изолятов, отнесенных к серогруппе 015, адгезивными свойствами обладали 4 изолята (015:К99 - 1, 015:А20 - 3); из 6 изолятов, отнесенных к серогруппе 078, адгезивными свойствами обладали 4 изолята (078:К88 - 2, 078:А20 - 2) (табл. 8).

Таблица 8

Результаты оценки адгезивных антигенов Е. coli

Вид микроорганизмов (источник выделения, количество изолятов) Адгезивная сыворотка (кол-во и % положительных результатов)

Комплекс К88 К99 987Р F41 А20

E.coli 01 (feces птиц) 4 2 (50,0) - - - - 2 (50,0)

E.coli 02 (feces птиц) 6 3 (50,0) - 1 (33,3) 1 (33,3) - 1 (33,3)

E.coli 015 (feces птиц) 4 2 (50,0) - - - - 2 (50,0)

E.coli 078 (feces птиц) 3 3 (100,0) 1 (33,3) - - - 2 (66,7)

E.coli 01 (патматериал птиц) 2 1 (50,0) - - - - 1 (50,0)

E.coli 02 (патматериал птиц) 3 1 (33,3) - - - 1 (33,3) -

E.coli 015 (патматериал птиц) 3 2 (66,6) - 1 (33,3) - - 1 (33,3)

E.coli 078 (патматериал птиц) 3 1 (33,3) 1 (33,3) - - - -

Всего: 28 15 (53,6) 2 (13,3) г (13,з) 1 (6,66) 1 (6,66) 9 (60,0)

При определении гемолитической активности изолятов Kcoli учитывали степень образования на 5%-м кровяном агаре зон просветления среды. Установлено, что характерной р-гемолитической активностью обладали 8,0 % изученных изолятов Е. coli.

3.7. Результаты изучения свойств энтеробактерий, доминирующих при желудочно-кишечных болезнях птиц

3.7.1. Изучение антагонистической активности

При исследовании межвидового антагонизма использовали общепринятые методы исследования: перпендикулярных штрихов; агаровых блочков, находящихся в центре мембранного фильтра, а также с использованием мембранных фильтров. Суть методики состоит в способности биологически активных веществ, продуцируемых микробами-антагонистами, диффундировать через мембранные фильтры в слой питательной среды. Культуру изучаемого микроорганизма в количестве 0,5 мкл и концентрации 107-108 кл/мл наносили в виде капли в центр мембранного фильтра, помещенного на поверхность плотной питательной среды, и культивировали при оптимальных для данного микроорганизма условиях. Затем мембранные фильтры удаляли с поверхности плотной питательной среды, и на то же место помещали новые мембранные фильтры, на поверхность которых наносили взвесь исследуемых тест-штаммов патогенных бактерий в той же концентрации. Контролем служил рост культур, не подвергшихся воздействию БАВ. После воздействия биологически активных веществ на поверхностях мембранных фильтров выявляли рост культуры бактерий в виде пятна различной плотности и величины. Для определения антагонистической активности микроорганизмов применение мембранных фильтров позволяет проводить количественную оценку степени ингибирования штамма-антагониста, с применением хромогенных сред представляется возможным определять антагонистическую активность микроорганизмов, относящихся к разным систематическим группам. Кроме того, на одной чашке Петри можно проводить исследования антагонистической активности 3-4 штаммов-антагонистов к 9-24 тест-культурам.

При изучении антагонистической активности микрорганизмов установлено, что изученные культуры микроорганизмов Е. coli угнетали рост S. typhi-murium с зоной задержки роста 1,4±0,1 мм; S. enteritidis — 1,6±0,1 мм; C.freundii - 1,5±0,2 мм; P. mirabilis-0,6±0,1 мм; К. pneumonia - 1,3±0,1 мм (табл. 9).

Результаты изучения антагонистической активности бактерий

Вид микроорганизма Зона задержки роста, мм

1 2 3 M±m t td

Salmonella typhimurium 1,4 1,3 1,5 1,4±0,I 24,249 1,65

Salmonella enteritidis 1,6 1,5 1,7 1,6±0,1 27,713 1,85

Citrobacter freundii 1,3 1,5 1,7 I,5±0,2 12,99 2,0

Proteus mirabilis 0,7 0,5 0,6 0,6±0,1 10,392 0,85

Klebsiella pneumonia 1,2 1,4 1,3 1,3±0,1 22,517 1,55

Примечание: t - доверительный коэффициент; td - коэффициент достоверности различий средних величин

3.7.2. Изучение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам изучали методами серийных разведений, диффузии в агар, а также с использованием микробиологического анализатора «MicroTax». Бактериальную суспензию из 18-часовой культуры готовили в 3-5 мл изотонического раствора 0,9%-ного NaCl по оптическому стандарту мутности "McFarland" 0,5. Подготовленную бактериальную суспензию в количестве 10 мкл переносили в 10 мл среды "Isosensitest". Из среды "Isosensitest" в определенные лунки планшета вносили по 100 мкл бактериальной суспензии, планшет инкубировали в термостате 18-24 ч при 35-37 °С. Затем производили учет результатов на микробиологическом анализаторе "MicroTax Rider".

Антибиотикорезистентность микроорганизмов определяли с помощью методик: «Оценка критической дозы ("Break-point")», «Оценка минимальной ин-гибирующей концентрации ("МИК")». При отсутствии роста в минимальной и максимальной концентрациях антибиотика микроорганизмы считали чувствительными к препарату. При наличии роста при минимальной концентрации антибиотика чувствительность микроорганизма к препарату являлась промежуточной. Если рост наблюдался при минимальной и максимальной концентрациях антибиотика, микроорганизмы считали устойчивыми к препарату. Минимальной ингибирующей концентрацией считали минимальную концентрацию антибиотика, которая ингибирует рост микроорганизмов.

При изучении чувствительности к антибиотикам из 42 изученных изолятов Е. coli 9 (21,4 %) были чувствительны к антибиотикам группы цефалоспоринов (цефазолин, цефатоксим); 8 (19,1%) - группы фторхинолонов (офлоксацин, ци-профлоксацин); 7 (16,7 %) - группы аминогликозидов (канамицин, амикацин); 9 (21,4 %) были устойчивы к антибиотикам группы макролидов (эритромицин, олеандомицин); 9 (21,4 %) - к группе природных пенициллинов (оксациллин). Из 24 изолятов сальмонелл б (25,0 %) были чувствительны к антибиотикам группы цефалоспоринов (цефазолин, цефатоксим); 5 (20,8 %) - группы фторхинолонов (офлоксацин, ципрофлоксацин); 3 (12,5 %) - группы аминогликозидов

(канамицин, амикацин); 6 (25,0 %) - были устойчивы к антибиотикам группы макролидов (эритромицин, олеандомицин); 4 (16,7 %) - группы природных пе-нициллинов (оксациллин) (табл. 10).

Таблица 10

Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам_

Антибактериальный препарат Чувствительность микроорганизма

Escherichia coli Salmonella enleritidis Salmonella typhimvrium

I* II* I* II* I* II*

Цефазолин 10,5 - 18,2 - 7,7 -

Цефатоксим 10,9 - 18,2 - 7,7 -

Офлоксации 8,3 - 9,1 - 15,4 -

Ципрофлоксацин 10,8 - 9,1 - 7,7 -

Канамицин 7,8 - 9Д - - -

Амикацин 8,9 - 9,1 - 7,7 -

Эритромицин - 16,3 - 9,1 - 15,4

Олеандомицин - 5,1 - 18,2 - 7,7 7,7

Оксациллин - 21,4 - - -

Примечание: I* - % чувствительных микроорганизмов; П* - % устойчивых микроорганизмов

3.7.3. Изучение чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующим средствам

При оценке чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующему средству «Дезант» (1,6,3,8-диметано-1,3,6,8-теграазациклодекан), наряду с общепринятым методом диффузии в агар, нами были апробированы «Дип-слайды», предназначенные для бактериологического исследования поверхностей. При исследовании полимерную пластину слайда, покрытую плотной питательной средой, плотно прижимали к поверхности, а затем помещали в контейнер и культивировали при 37 °С 18-24 ч. Дезинфекция признавалась удовлетворительной, если зона задержки роста микроорганизмов вокруг лунок с дезинфицирующим препаратом составляла более 10 мм, во всех исследованных смывах и «Дип-слайдах» отсутствовал рост микроорганизмов S.typhimurium, S.enteritidis, Е. coli. Применение «Дип-слайдов» «Oxoid», покрытых агаризиро-ваной средой и предназначенных для контроля качества дезинфекции поверхностей, позволяла выявлять уровень контаминации патогенными и условно-патогенными микроорганизмами семейства Enterobacteriaceae (табл. 11).

Таблица 11

Результаты изучения чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующему препарату «Дезант»

Вид микроорганизмов, № штамма (источник выделения) Метод исследования

Диффузия в агар (зона задержки роста, мм) Диа-слайды «Oxoid» (степень коптамипации)

Концентрация препарата, %

2,0 2,5 3,0 2,0 2,5 3,0

S.typhimurium №5715 (референтный штамм) 13,70*2,31 15,20±1,76 16,90±2,33 ++ - -

S.typhimurium (fares immbrt 14,30±1,83 15,00±2,30 16,20±1,89 -н- - -

S. typhimurium (п/м) 13,90±2,17 14,80±3,10 15,70±2,44 ++ - -

S.enteritidis №204 (референтный штамм) 14,20±2,55 15,10±1,78 16,20±1,34 ++ - -

S.enteritidis (feces птицы) 14,40±2,11 15,70*1,74 16,80±1,85 - - -

S.enteritidis (патматериал птицы) 15,40±1,88 16,50±2,03 17,30±1,36 - - -

E.coli 0115 №580 (референтный штамм) 15,70±1,19 16,40±1,84 17,80±1,86 ++ - -

E.coli Ol (feces птицы) 15,20±2,43 16,50±2,32 17,80±2,11 - -

E.coli 02 (feces птицы) 16,90±2,62 17,40±1,24 18,30±1,55 - - -

E.coli 015 (feces птицы) 15,70±2,31 16,20±1,57 17,40±1,65 - - -

E.coli 078 (feces птицы) 14,70±1,77 15,70±2,21 16,80*2,32 ++ - -

Примечание: «-»,«++» отсутствие контаминации, слабая контаминация соответственно

На основании результатов исследований установлено, что при желудочно-кишечных болезнях птицы в микробиоценозе желудочно-кишечного тракта доминируют культуры микроорганизмов, отнесенные к видам: Escherichia coli -41,2 %; Salmonella typhimurium - 12,8 %; Salmonella enteritidis — 10,7 %. Этиологическая структура сальмонеллеза представлена видами: S. typhimurium (54,2 %); S. enteritidis (45,8 %); эшерихиоза, серогруппами - 02 (32,14 %), 015 (25,0 %), Ol (21,43 %), 078 (21,43 %), соответственно. При определении адгезивных антигенов установлено, что из 9 изолятов Е. coli, отнесенных к серо-группе 02, адгезивными свойствами обладали 4 изолята (К99, 987Р, F41, А20); из 7 изолятов, отнесенных к серогруппе 015,-4 изолята (К99, А20); из 6 изолятов, отнесенных к серогруппе 01,-3 изолята (А20); из 6 изолятов, отнесенных к серогруппе 078, - 4 изолята (К88, А20).

выводы

1. На основе сравнительной оценки и подбора эффективных дифференциально-диагностических питательных сред и тест-систем из патологического материала и feces при желудочно-кишечных болезнях птиц выделено и идентифицировано 102 культуры микроорганизмов, отнесенных к видам: Escherichia coli - 41,2 %; Salmonella typhimurium - 12,8 %; Salmonella enteritidis - 10,7 %; Staphylococcus aureus - 11,8 %; Enterococcus faecalis - 10,7 %; Proteus vulgaris -7,9 %; Enterococcus faecium - 4,9 %.

2. При серологической идентификации 24 изолятов микроорганизмов рода Salmonella, выделенных из патологического материала и feces птицы, 11 изолятов (45,8 %) были oTiieceitbi к Salmonella enteritidis, 13 (54,2 %) - Salmonella typhimurium.

3. При определении серогрупповой принадлежности 42 изолятов Е. coli, выделенных из патологического материала и feces, к серогруппе 02 отнесены 9 изолятов (32,14 %), 015 - 7 (25,0 %), 01-6 (21,43 %), 078 - 6 (21,43 %), 33,4 % изолятов не удалось типировать стандартным набором «О-коли сывороток».

4. При определении адгезивных антигенов микроорганизмов, выделенных va feces и патологического материала птиц, из 9 изолятов Е. coli серогруппы 02 адгезивными свойствами обладали 4 культуры микроорганизмов: 02:К99 - 1, 02:987Р - 1, 02:F41 - 1, 02:А20 - 1; из 7 изолятов серогруппы 015 - 4 изолята: 015:К99 - 1, 015:А20 - 3; из 6 изолятов серогруппы 01 - 3 культуры: 01:А20 -3; из 6 изолятов серогруппы 078 - 4 изолята: 078:К88 - 2, 078:А20 - 2.

5. Установлено, что использование сред «Rambach agar», vXLT-4 agar», «Cromocult Coliform agar» позволяет с высокой специфичностью и в ускоренные сроки проводить индикацию и идентификацию сальмонелл и эшерихий.

6. Установлено, что применение иммунохроматографической тест-системы «Singlepath ® Salmonella» позволяет в течение 24 ч с учетом обогащения при первоначальной концентрации в исследуемом образце от 100 бактериальных клеток проводить индикацию микроорганизмов рода Salmonella.

7. Установлено, что из 42 изолятов К coli 9 (21,4 %) были чувствительными к антибиотикам группы цефалоспоринов (цефазолин, цефатоксим); 8 (19,1 %) - группы фторхинолонов (офлоксацин, ципрофлоксацин); 7 (16,7 %) -группы аминогликозидов (канамицин, амикацин); 9 (21,4 %) - были устойчивы к антибиотикам группы макролидов (эритромицин, олеандомищш); 9 (21,4 %) -группы природных пенициллинов (оксациллин).

8. Установлено, что из 24 изолятов микроорганизмов рода Salmonella 6 (25,0 %) были чувствительны к антибиотикам группы цефалоспоринов (цефазолин, цефатоксим); 5 (20,8 %) - группы фторхинолонов (офлоксацин, ципрофлоксацин); 3 (12,5 %) - группы аминогликозидов (канамицин, амикацин); 6 (25,0 %) - были устойчивы к антибиотикам группы макролидов (эритромицин, олеандомицин); 4 (16,7 %) - группы природных пенициллинов (оксациллин)

9. Применение «Дип-слайдов» «Oxoid», покрытых агаризированой средой и предназначенных для контроля качества дезинфекции поверхностей, позволяет

выявлять уровень контаминации патогенными и условно-патогенными микроорганизмами семейства ЕгиегоЪаЫеНасеае.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Использование сред «Rambach agar», «.XLT-4 agar», «Cromocult Coliform agar» при бактериологической диагностике сальмонеллеза и эшерихиоза позволяет при первичной идентификации дифференцировать колонии сальмонелл и эшерихий от таксономически сходных видов энтеробактерий.

2. Для использования в научно-исследовательских учреждениях разработаны и изданы «Методические рекомендации по определению антагонистической активности микроорганизмов», утвержденные секцией «Ветеринарная санитария, гигиена и экология)) отделения ветеринарной медицины Россельхоза-кадемии (протокол № 8 от 22 июня 2010 года).

1. Плитов И.С. Сравнительная характеристика питательных сред для количественно-качественного учета энтеробактерий при дисбактериозе кишечника птиц // Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания : Материалы VIII международной конференции студентов и молодых ученых. — М. : МГУПБ, 2009. - С. 287-288.

2. Плитов И.С. Определение чувствительности энтеробактерий к антибиотикам и дезинфицирующим средствам // Ветеринария. - 2010. - № 12. - С. 42—45.

3. Шурахова. Ю.Н. Этиологическая структура бактериальных болезней птиц по данным отчетов ветлабораторий Российской Федерации за 2009 год П Ю.Н. Шурахова, И.С. Плитов, М.В. Калмыков, О.Н. Виткова // VI международный ветеринарный конгресс по птицеводству. - М., 2010. - С. 102-103.

4. Ленченко Е.М. Сравнительная характеристика дифференциально-диагностических питательных сред для индикации возбудителей сальмонеллеза птиц // Е.М. Ленченко, И.С. Плитов // Аграрная наука. - 2011. - №3. - С. 26-28.

5. Плитов И.С. Антагонистическая активность микроорганизмов при эшери-хиозе птиц // Ветеринария. -2011. -№ 9. - С. 30-32.

6. Плитов И.С. Индикация патогенных бактерий, циркулирующих в птицеводческих хозяйствах // Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии. -2011.-№1 (5).-С. 63-65.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

Подписано в печать 26.04.2012. Усл. печ.л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 518.

МГУПП, 105316, Москва, ул. Талалихина, 33.

ООО «Франтера». 109316, Москва, ул. Талалихина, 33.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Плитов, Иван Сергеевич, Москва

61 12-16/98

На правах рукописи

ПЛИТОВ ИВАН СЕРГЕЕВИЧ

ЭТИОЛОГИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА САЛЬМОНЕЛЛЕЗА И ЭШЕРИХИОЗА ПТИЦ

06.02.02 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель - доктор ветеринарных наук, профессор

Ленченко Е.М.

МОСКВА 2012

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................................................................................................3

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................................................................8

1.1. Таксономическое положение и история изучения энтеробактерий........................8

1.2. Распространение энтеробактерий в природе, источники и пути заражения животных и человека....................................................................................................................................................16

1.3. Факторы патогенности энтеробактерий........................................................................................................................24

1.4. Диагностика болезней птиц, вызываемых патогенными и условно-патогенными энтеробактериями........................................................................................................................29

1.5. Организация мер борьбы и профилактики....................................................................................35

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..................................................................................................................................39

2.1. Эпизоотологические и клинико-морфологические методы исследований... 41

2.2. Методы оценки дифференциально-диагностических сред и тест-систем

для индикации энтеробактерий..........................................................................................................................42

2.3. Методы индикации и идентификации патогенных и условно-патогенных энтеробактерий..................................................................................................................................................................43

2.4. Методы серологической идентификации возбудителей сальмонеллеза............47

2.5. Методы серологической идентификации возбудителей эшерихиоза....................48

2.6. Методы изучения антагонистической активности, чувствительности к антибиотикам и дезинфицирующим средствам....................................................................................51

2.7. Методы статистической обработки результатов исследований........................................55

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ................................................................................................................57

3.1. Результаты анализа данных о распространенности бактериальных инфекционных болезней птиц..............................................................................................................................57

3.2. Результаты изучения дифференциально-диагностических признаков таксономически сходных видов энтеробактерий..................................................................................67

3.3. Сравнительная оценка эффективности схем бактериологического исследования на наличие микроорганизмов рода Salmonella и Escherichia 75

3.4. Результаты оценки кишечных микробиоценозов птиц с синдромом желудочно-кишечных болезней............................................................................................................................92

3.4.1. Количественный и видовой состав бактерий в микробиоценозах кишечника клинически здоровых птиц..............................................................................................92

3.4.2. Количественный и видовой состав бактерий в микробиоценозах кишечника птиц с синдромом желудочно-кишечных болезней......................................94

3.5. Результаты выделения энтеробактерий из патологического материала

птиц с синдромом желудочно-кишечных болезней........................................................................95

3.6. Результаты серологической идентификации..............................................................................97

3.6.1. Этиологическая структура сальмонеллеза птиц............................................................97

3.6.2. Этиологическая структура эшерихиоза птиц....................................................................98

3.7. Результаты изучения свойств энтеробактерий, доминирующих при желудочно-кишечных болезнях птиц............................................................................................................101

3.7.1. Изучение антагонистической активности..........................................................................101

3.7.2. Изучение чувствительности к антибиотикам..................................................................104

3.7.3. Изучение чувствительности к дезинфицирующим средствам..........................106

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ....................................................................................................................................108

ВЫВОДЫ......................................................................................................................................................................................................123

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ..............................................................................................................................................................125

ПРИЛОЖЕНИЯ......................................................................................................................................................................126

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................................................................................128

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В структуре инфекционной патологии птиц по статистическим данным более 60,0 % составляют болезни бактериальной этиологии, из числа которых в период 2007-2011 гг. массовая доля сальмонеллеза составила 11,7 %, эшерихиоза - 63,0 % (Венгеренко JT. А., 2009, 2011; Фисинин В. И., 2007, 2011).

птиц преобладают микроорганизмы родов Salmonella, Escherichia, Staphylococcus, Streptococcus, Pasteurella (Белоусова P. В., 1977; Сюрин В. Н., 1979; Бессарабов Б. Ф., 2005, Багрецова А. Л., 2005; Бондарев А. Ю., 2009). Циркулирующие среди поголовья птицы микроорганизмы характеризуются устойчивостью к химиотерапевтическим препаратам, в частности, установлена устойчивость энтеробактерий к антибиотикам тетрациклинового ряда, природным и полусинтетическим пенициллинам (Пилипейко В. Г. и соавт., 2002; Хиштова Н. С., 2008; Шурахова Ю. Н. и соавт., 2011). При проведении мониторинговых исследований распространенности сальмонеллеза и эшерихиоза птиц, целесообразным представляется применение эффективных методов индикации, оценки антагонистической активности, чувствительности к антибиотикам и дезинфицирующим средствам патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, циркулирующих среди поголовья птицы при массовых желудочно-кишечных болезнях, что и определило актуальность темы диссертационной работы.

Задачи исследований:

-провести ретроспективный анализ данных по распространенности инфекционных болезней птиц бактериальной этиологии;

-изучить ростообеспечивающие и ингибирующие свойства дифференциально-диагностических питательных сред и чувствительность

иммунохроматографической тест-системы «Singlepath ® Salmonella» для индикации и идентификации микроорганизмов;

-изучить эффективность схем бактериологического исследования на наличие микроорганизмов рода Salmonella и Escherichia;

-изучить количественный и видовой состав микроорганизмов в микробиоценозах кишечника птиц;

-изучить видовой состав патогенных и условно-патогенных энтеробактерий, выделенных из патологоанатомического материала птиц; -изучить этиологическую структуру сальмонеллеза и эшерихиоза птиц; -изучить антагонистическую активность, чувствительность к антибиотикам, устойчивость к дезинфицирующим средствам выделенных изолятов энтеробактерий

бактерий установлено, что биологически активные вещества, продуцируемые изолятами Е. coli, угнетают рост бактерий S. typhimurium с зоной задержки роста 1,4±0,1 мм; S. enteritidis - 1,6±0,1 мм; С. freundii -1,5±0,2 мм; P. mirabilis - 0,6±0,1 мм; К. pneumonia - 1,3±0,1 мм. Из изолятов энтеробактерий, выделенных при желудочно-кишечных болезнях птиц, 21,4 % штаммов были чувствительны к антибиотикам группы цефалоспоринов (цефазолин, цефатоксим); 19,1% - фторхинолонов (офлоксацин, ципрофлоксацин); 16,7 % - аминогликозидов (канамицин, амикацин). Среди изолятов энтеробактерий выделены штаммы, устойчивые к антибиотикам группы макролидов (эритромицин, олеандомицин) и природных пенициллинов (оксациллин) - 21,4 %, 21,4 %, соответственно.

Практическая значимость работы. На основании экспериментальных данных по изучению межпопуляционных взаимодействий таксономически сходных видов энтеробактерий модифицирована методика определения антагонистической активности микроорганизмов и разработаны «Методические рекомендации по определению антагонистической активности микроорганизмов», утвержденные секцией «Ветеринарная санитария, гигиена и экология» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 8 от 22 июня 2010 года). Результаты исследований используются в учебном процессе на ветеринарно-санитарном факультете ФГБОУ ВПО «МГУПП» по дисциплине «Эпизоотология».

Апробация материалов диссертации. Основные результаты диссертационной работы доложены и одобрены на заседаниях кафедры «Инфекционные и паразитарные болезни» ФГБОУ ВПО «МГУПП»

(М., 2008-2011); на Международной научной конференции молодых ученых «Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания» (М., 2009); на VI Международном ветеринарном конгрессе по птицеводству (М., 2010).

Основные положения, выносимые на защиту:

• этиологическая структура сальмонеллеза и эшерихиоза птиц;

Публикация результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 научных статей, в т. ч. 4 в журналах, рекомендованных ВАК.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Таксономическое положение и история изучения энтеробактерий

Бактерии семейства Enterobacteriaceae в соответствии с «Определителем бактерий Берджи» (1997) занимают следующее таксономическое положение:

Надцарство: Procaryota или Прокариоты

Царство: Bacteria, Bacteriobiota Haeckel, 1984 - Бактерии

Отдел: Proteobacteria Cavalier-Smith, 2002

Класс: Gammaproteobacteria

Порядок: Enterobacteriales

Семейство: Enterobacteriaceae

Семейство подразделено на 14 общеизвестных и 6 малоизученных или недавно описанных родов, которые имеют 83 вида (Сидоров М.А., и соавт.,

1995.).

Энтеробактерии - представители семейства Enterobacteriaceae, на

протяжении истории развития мировой бактериологии являются объектом

постоянного и пристального внимания ветеринарных специалистов.

Диагностические бактериологические исследования предусматривают

поиск и выделение, в основном, патогенных энтеробактерий -

возбудителей сальмонеллеза и эшерихиоза. По данным литературы в

этиологии болезней птиц, наряду с сальмонеллами и энтеропатогенными

эшерихиями, так же могут участвовать представители других родов

энтеробактерий (Бессарабов Б. Ф., 1980, 2007; Кожемяка Н. В., 1982, 2008;

Грошева Г. А., 1983; Стрельников А. П., 1987; Радчук Н. А., 1990; Гусев

А. А. и соавт., 1992; Козак С. С., 1992, 2011; Тугаринов О. А., 1993;

Сидоров М. А. и соавт. 1995; Панин А. Н. и соавт., 1995; Ленев С. В.,

1996; Шустер Б. Ю., 1996; Субботин В. В., 1997; Куликовский А. В., 1998,

2011; Малик Н. И. и соавт., 1998; Яременко Н. А., 1998; Каврук Л. С. и

соавт., 1999; Пирожков М. К., 1999, 2002; Степаненко П. П., 1999;

Виноходов В. О., 2000; Ленченко Е. М., 2000, 2011; Капустин А. В., 2001; Степаненко И. П., 2001; Венгеренко Л. А., 2003; Андреева Н. Л. и соавт., 2004; Бовкун Г. Ф., 2004; Салаутин В. В., 2004; Борисенкова А. Н. и соавт., 2004; Светоч Э. А., 2004; Крупальник В. Л., 2005; Скородумов Д. И. и соавт., 2005; Гусев В. В., 2006; Павлова И. Б., 2007; Галазин Н. М. и соавт., 2007; Рождественская Т. Н., 2009, 2011; Кононенко А. Б. и соавт, 2011; Смирнов Д. Д., 2011; Eickhoff Т. С., 1981; М. D. Galvez А., 1989; Collins, 2001; Janice Y. С., 2011).

Бактерии вида Е. coli являются наиболее изученными представителями семейства энтеробактерий и наиболее частыми возбудителями инфекционных заболеваний желудочно-кишечного тракта у животных и человека, известных как колибактериоз, эшерихиоз, коли-инфекция, коли-диарея и др. Эти бактерии выделены в Австрии в 1885 году немецким педиатром Т. Эшерихом. Этиологическая роль вида Е. coli в возникновении инфекционной диареи молодняка животных впервые установлена датским ученым К.О. Иенсоном еще в 1893 году, а затем подтверждена и другими отечественными и зарубежными исследователями.

Родовое название Salmonella было дано этим бактериям J. Gartner в 1900 г. в честь американского исследователя D. Salmon, описавшего в 1885 г. микроорганизм, известный теперь как Salmonella choleraesues и считавшийся первоначально возбудителем чумы свиней. Первым, кто обосновал бактериальную этиологию сальмонеллезов, был A. Garner, выделивший в 1888 г. во время вспышки энтеритов во Франкенхаузене из мяса вынужденно убитой коровы и селезенки умершего человека идентичные бактерии, названные им «Bacillus enteritidis» и именуемые ныне Salmonella enteritidis. Ранее, в 1884 г., ученик Р. Коха G. Garrfiky впервые сообщил о выделении S. tiphi в чистой культуре из селезенки умершего от брюшного тифа во время эпидемии этой инфекции в

Виттенбергере в 1882 г. В дальнейшем изучением возбудителя сальмонеллеза занимались многие ученые, в том числе отечественные.

История большой и многообразной группы бактерий, входящих в род Proteus, началась с описания Hauser в 1885 г. необычных микроорганизмов, выделенных им из гниющего мяса. Способность их менять внешние проявления роста на агаровых пластинчатых средах послужила основанием для наименования Proteus (бог, способный менять свой облик). После первого сообщения последовала серия работ других авторов с описанием сходных по свойствам микроорганизмов, известных в литературе под различными названиями. В настоящее время эти бактерии продолжают составлять предмет многочисленных дискуссий ученых, занимающихся таксономией. Причем некоторые считают Proteus лишь отдаленно связанными с семейством Enterobacteriaceae «каемкой» (fring -англ.) семейства.

Клебсиеллы известны как возбудители заболеваний дыхательных путей: пневмонии, риносклеромы и озены. Клебсиелл считают возбудителями внутрибольничных инфекций, различных заболеваний новорожденных. Патогенность клебсиелл была известна с момента их описания. Начало открытия клебсиелл длительное время связывали с именем Фридлендера, который выделил из экссудата пневмонического очага больного, умершего от пневмонии, типичные микроорганизмы и описал их свойства: наличие капсулы и гроздевидный характер роста в желатине, а также патогенность для лабораторных животных - белых мышей и морских свинок. Позднее русский исследователь К.Ф. Флеров в 1895 году на основании собственных экспериментов и анализа опубликованной к тому времени литературы приходит к выводу, что микроорганизмы, описанные Фридлендером, являются не только специфическими возбудителями крупозной пневмонии, но и «микробами нагноения, способными вызвать гнойно-септические процессы». Из

общего числа более чем 60 наименований вначале принятым было

«палочки Фридлендера», в дальнейшем переименованно в к

Информация о работе

Плитов, Иван Сергеевич
кандидата ветеринарных наук
Москва, 2012
ВАК 06.02.02

Диссертация

Этиологическая структура сальмонеллеза и эшерихиоза птиц - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы