Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Бактериологическая диагностика и морфологическая характеристика тканей и органов перепелов при экспериментальном эшерихиозе

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Бактериологическая диагностика и морфологическая характеристика тканей и органов перепелов при экспериментальном эшерихиозе"

На правах рукописи

МАНСУРОВА ЕКАТЕРИНА АНАТОЛЬЕВНА

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА И МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ ПЕРЕПЕЛОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ЭШЕРИХИОЗЕ

06.02.02 - Ветеринарная микробиология, вирусология,

эпизоотология, микология с мнкотоксикологнен и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

3 0 МАЙ 2013

МОСКВА 2013

005060349

005060349

Работа выполнена на кафедре «Инфекционные и паразитарные болезни» ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» (ФГБОУ ВПО «МГУПП») Министерства образования и науки РФ

Научный руководитель: Ленченко Екатерина Михайловна,

1 ' м доктор ветеринарных наук, профессор

Официальные оппоненты: Скородумов Дмитрий Иванович,

* доктор ветеринарных наук, профессор

ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств»

зав. кафедрой «Микробиология, вирусология, генная инженерия»

Селезнев Сергей Борисович,

доктор ветеринарных наук, профессор ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

проф. кафедры «Клиническая ветеринария»

Ведущая организация: Государственное научное учреждение ' 1 «Научно-исследовательскии институт

птицеперерабатывающей промышленности» Россельхозакадемии РФ (ГНУ «ВНИИПП»)

Защита состоится «27» июня 2013 г. в «12.00» часов на заседании диссертационного совета Д 212.148.09 при ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» (109316, Москва, ул. Талалихина, 33).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств».

Автореферат разослан 2013 г.

Автореферат размещен на Официальном сайте ,

Министерства образования и науки РФ http://vak.ed.ruy 2013г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор ветеринарных наук, профессор Андрианова Т.Г

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В структуре инфекционной патологии птиц в 2012 г из числа заразных болезней удельный вес эшерихиоза составил 53,9 %, среди павших птиц - 92,0 % (Бобылева Г.А., 2013). Эшерихиоз птиц протекает в виде септицемии (Coliceplicaemia avium), сальпингита и колигранулематоза (Бессарабов Б.Ф., 1980, 2007; Тугаринов O.A., 1983; Стрельников А.П., 1987; Пирожков М.К., 1989; Радчук H.A., 1990; Жаров A.B., 1995; Кунаков A.A., 1995; Сидоров М.А. и соавт., 1995; Селезнев С.Б., 2000; Куриленко А.Н. и соавт., 2005; Борисенкова А.Н. и соавт., 2004; Светоч Э.А., 2004; Крупальник В.Л., 2005; Хатько Н.Ф., 2005; Сидорчук A.A., 2007; Кожемяка Н. В., 2008; Кононенко А.Б. и соавт., 2009; Ленченко Е.М. и соавт., 2013; Samelson L.E., 1985; StanleyV.G. etal., 1996; Collins, 2001; Janice Y.C., 2011). При идентификации из-за узкого спектра и невысокой чувствительности существующих наборов «О-коли сывороток» не типируется 49,0-54,3 % культур микроорганизмов E.coli. Схему бактериологической диагностики эшерихиоза завершает биологическая проба, характеризующаяся сложностью воспроизведения, чрезвычайной

продолжительностью по времени исполнения. Восприимчивость лабораторных моделей зависит от вирулентности возбудителя, дозы, метода введения, чувствительности к термолабильным и термостабильным токсинам (Каврук Л.С., 1994; Светоч Э.А., 2000; Капустин A.B., 2001; Скородумов Д.И. и соавт., 2005; Рождественская Т.Н., 2011). При доместикации в неестественной среде обитания ограниченное территориальное пространство, нетрадиционное кормление являются основными причинами развития патологических процессов диких, экзотических и декоративных итиц (Бессарабов Б.Ф., 2005; Ежков В.О., 2008; Пименов Н.В., 2012). В частности, на перепелиных фермах технологии содержания птицы существенно отличаются от природных условий, что приводит к снижению уровня показателей естественной резистентности организма птицы (Паникар И.А. и соавт., 1992; Гущин В.В., 2003; Шваб A.A., 2006; Белогуров А.Н., 2009). Циркулирующие в перепелиных хозяйствах штаммы микроорганизмов Е. coli были представлены серогруппами: 078, 0111, из числа выделенных 61,53 % имели адгезивные антигены: К88ав, К88ас, К99, 987Р, и F41, летальность перепелов при эшерихиозе составляла 97,25 %, сальмонеллезе -78,7 % (Паникар И.А. и соавт., 1995; Булгакова И.А., 1997; Панасенко A.C., 2008). При заражении Micobacterium avium у перепелов развивались изменения, характерные для туберкулеза (Бушмелева П. В., 2011). При желудочно-кишечных болезнях в микробиоценозах кишечника перепелов увеличивалось содержание патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, в том числе E.coli (Шмидт Г.О., Плешакова В.И., 2012). Учитывая, что степень реализации потенциальной патогенное™ микроорганизмов определяется восприимчивостью макроорганизма, актуальность представляют исследования по воспроизведению инфекционного процесса на восприимчивых лабораторных моделях для изучения динамики патологических процессов, апробация и подбор эффективных диагностических сред, тест-систем для индикации и дифференциации микроорганизмов Escherichia coli.

Цель работы - изучить клинические признаки, особенности течения болезни, морфологические изменения, колонизационную резистентность кишечника, диссеминациго бактерий в ткани и органы перепелов при экспериментальном эшерихиозе.

Задачи исследовании:

- изучить клинические признаки, особенности течения болезни, гематологические, биохимические показатели сыворотки крови перепелов при экспериментальном эшерихиозе;

- изучить динамику морфологических изменений тканей и органов перепелов при экспериментальном эшерихиозе;

определить колонизационную резистентность кишечника и диссеминацию бактерий в ткани и органы перепелов при экспериментальном эшерихиозе;

- изучить гемолитические свойства, чувствительность к желчи и антибиотикам микроорганизмов Escherichia coli, выделенных из патматериала перепелов;

- апробировать и оценить эффективность лабораторных моделей и тест-системы «VET-RPLA »для оценки патогенных свойств Escherichia coli, выделенных из патматериала перепелов.

Научная иовизна. При экспериментальном воспроизведении эшерихиоза на перепелах установлено, что динамика патологических процессов при остром течении болезни обусловлена септицемией, при подостром течении -энтеротоксемией. Признаки воспалительного процесса, сопровождающегося миграцией и интерстициальной инфильтрацией псевдоэозинофилов, развиваются через 4-6 ч, моноцитов - через 7-8 ч после заражения микроорганизмами Е. coli. Количество энтеробактерий (КОЕ lg/r) слепых отростков кишечника перепелов при экспериментальном эшерихиозе составляет 4,19±0,15 - 6,88±0,21, индекс колонизации (ИК) эшерихий у 10-ти суточных перепелов - 0,766; 20-ти суточных - 0,797; 30-ти суточных - 0,837. При изучении чувствительности микроорганизмов к действию желчи перепелов установлено, что зоны задержки роста микроорганизмов Е. coli составляют 11,9-17,6 мм. При оценке токсигепных свойств культур микроорганизмов Escherichia coli, выделенных из патматериала перепелов, с применением тест-системы «VET-RPLA», основанной на методе обратной латекс-агглютинации, установлена корреляция результатов исследования с результатами, основанными на применении лабораторных моделей (г=0,89).

Практическая значимость работы. Установлена эффективность применения хромогенных сред «Chromogenic E.coli/Coliform medium agar», «LMX Manaß & Osmer», позволяющих в течение 24ч при идентификации микроорганизмов дифференцировать эшерихии от таксономически сходных видов энтеробактерий, выделенных из патматериала перепелов. Для количественного учета микроорганизмов в пищевых продуктах, микробиоценозах кишечника птицы, разработан способ определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, позволяющий сократить расход питательных сред,

стерильной бактериологической посуды. Результаты исследований используются в учебном процессе на ветеринарно-санитарном факультете ФГБОУ ВПО «МГУПП» по дисциплинам: «Цитология, гистология, эмбриология»; «Эпизоотология».

Апробация материалов диссертации. Основные результаты диссертационной работы доложены и одобрены на заседаниях кафедры «Инфекционные и паразитарные болезни» ФГБОУ ВПО «МГУПП» (Москва, 2008-2011 гг.); на VI, VII, VIII Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (М., 2009; М., 2010; М., 2011).

Основные положения, выносимые на защиту:

• результаты клшшкО-морфологнческих исследований, оценки колонизационной резистентности кишечника перепелов и диссеминации бактерий в ткани и органы перепелов при экспериментальном эшерихиозе;

• результаты изучения гемолитических свойств, чувствительности к желчи и антибиотикам микроорганизмов Escherichia coli, выделенных из патматериала перепелов;

• эффективность лабораторных моделей и тест-системы «VET-RPLA» для оценки патогенных свойств Escherichia coli, выделенных из патматериала перепелов.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано б научных работ, в т.ч. 3 - в журналах, рекомендованных ВАК.

Струю-ура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, выводов, библиографии, приложения. Работа изложена на 110 страницах компьютерного текста, содержит 15 таблиц, 20 фотографий и микрофотографий. Библиографический список включает 124 источников, из них 77 иностранных авторов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена с 2007 по 2012 гг. на кафедре «Инфекционные и паразитарные болезни» ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» в соответствии с планом НИР (тема № 7-707). Экспериментальные исследования проводили на перепелах 10-, 20-, 30-ти суточного возраста постинкубационного онтогенеза породы Coturnix coturnix japónica, выращиваемые в птицеводческом хозяйстве ООО «Инкубаторий», Чеховского района, Московской области. В опытах использовали штаммы микроорганизмов: Escherichia coli 02, № 388; Escherichia coli 078.-K80, Ks 320; Escherichia coli Ol 15 №723; Escherichia coli 0138:K81, № 723; Salmonella enteritidis № 204; Salmonella typhimurium № 5715; Proteus vulgaris H2091; Klebsiella pneumonia №24; Staphylococcus aureus № 123, полученные из коллекции ФГБУ «ВГНКИ». Бактериологические исследования проводили в соответствии с «Методическими указаниями по бактериологической

диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных» (2000); «Инструкцией по санитарно-микробиологическому контролю тушек, мяса птицы, птицепродуктов, яиц и яйцепродуктов на птицеводческих и птицеперерабатывающих предприятиях» (М., 1990). Идентификацию микроорганизмов проводили, изучая морфологические, тиикториальные, культуральцые, ферментативные свойства микроорганизмов (Герхардт Ф. и соавт., 1984; Сидоров М.А. и соавт., 1995; Скородумов Д.И. и соавт., 2005). Биохимические свойства микроорганизмов изучали с использованием сред Гисса и тест-систем: «СИБ» (НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород); «Enterotube II» («Becton Dickinson GmbH BD Diagnostics»). Серогрупповую принадлежность E.coli определяли в реакции агглютинации с диагностическими О-коли агглютинирующими сыворотками, ФГУП «Армавирская биофабрика». Гемолитическую активность микроорганизмов оценивали на МПА с содержанием 5,0 % стерильной крови барана (Лабинская A.C., 1984).Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам и желчи перепелов изучали методом диффузии в агар (Навашин С.М., Фомина И.П., 1982).Индекс колонизации (ИК) эшерихий рассчитывали по формуле: ИК=А/В, где А - % эшерихий, выделенных из кишечника незараженных птиц; В- % эшерихий, выделенных из кишечника зараженных птиц (Скородумов Д.И. и соавт., 2008). Патогенные свойства микроорганизмов оценивали с применением лабораторных моделей: эмбрионов кур породы "Белый леггорн"; перепелов породы Coturnix coturnix japónica; беспородных лабораторных мышей, массой 14-16 г. Токсигенные свойства микроорганизмов изучали на лабораторных моделях (белые беспородные мыши; морские свинки породы «Seif» (Биргер М.О., 1973). Для оценки способности E.coli к продукции токсинов применяли тест-систему «VET-RPLA» (OXOID). Для определения бактерицидной, лизоцимной активности сыворотки крови, активности фагоцитоза, фагоцитарного индекса использовали общепринятые методы. Гематологические и биохимические показатели сыворотки крови перепелов исследовали на гематологическом ветеринарном анализаторе автомате «РСЕ-90 Vet» и полуавтоматическом биохимическом анализаторе «Clima Plus» (RAL, Испания). Патологоанатомические исследования проводили общепринятыми методами (Автандилоп Г.Г., 1972; Бессарабов Б.Ф., 1980; Жаров A.B., 1981; Стрельников А.П., 1985, 2007; Селезнев С.Б., 2000; Сулейманов С.М., 2002).Для гистологических исследований исследуемый материал фиксировали 10,0 % формалином и заключали в парафин, срезы окрашивали гематоксилином и эозином; по Ван Гизону; по Крантцу (Волкова О.В., Елецкий Ю.К., 1971).При оптической микроскопии для получения репрезентативной информации исследования проводили методом случайного отбора поля зрения микроскопа «Н604 Т Trinocular Unico» (USA). Экспериментальные данные подвергали статистической обработке общепринятым методом (Ашмарин И.П., Воробьев JI.A., 1962; Садовский Н.В., 1975), с использованием программы «Statistika» для PC Microsoft Excel 2007.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Клинические признаки, особенности течения болезни, гематологические и биохимические показатели перепелов при экспериментальном эшерихиозе

Для экспериментального воспроизведения эшерихиоза использовали особи перепелов породы Cotumix cotwnix japónica (/¡=45) 10-, 20-, 30-ти суточного постинкубационного онтогенеза, птицу по принципу аналогов (одинаковый возраст, пол, живая масса, условия кормления и содержания) разделили на группы: контроль - интраназальное введение 0,5 см3 0,9 % раствора NaCl (л=15); опыт - интраназальное заражение К.сой 02, № 388(п=15) и Е. cali 078:К80, № 320 (п=15) в дозе 0,5 см3 в концентрации 1 млрд./ см3.При заражении перепелов культурами микроорганизмов Е. coli 02 и Е. coli 078:К80 клинические признаки болезни были сходными, наблюдались через24-48ч после заражения в виде прогрессирующей депрессии, отсутствия аппетита, жажды, цианоза слизистых оболочек, в последующие 4-5 суток развивались признаки диареи. Наблюдение за птицей (продолжительность эксперимента 25 суток) позволили выявить острое и подострое течение болезни (табл. ]).

Таблица 1

Группа Течение болезни Заболеваемость Летальность

птиц Острое Подострое

(п=30) Абс. % Лбе. % Абс. % Абс. %

Escherichia coli 02

! 0-ти сут. 4 80 1 20 5 100 5 100

20-ти сут. 3 60 2 40 5 100 3 60

30-ти сут. I 20 4 80 5 100 2 40

Escherichia coli 078:К80

10-ти сут. 4 80 1 20 5 100 4 80

20-ти сут. 2 40 3 60 5 100 4 SO

30-ти сут. 2 40 3 60 5 100 2 40

При остром течении через 24-72 часа после заражения клинические проявления болезни проявлялись в виде поражения центральной нервной системы, выражающиеся судорогами, парезами, параличами конечностей, депрессией, дыхание напряженное, с влажными хрипами, температура тела -43,4-43,8 С. При подостром течении через 4-5 суток после заражения клинические признаки болезни проявлялись в виде общей вялости, из носовых отверстий и клюва выделялась пенистая слизь, испражнения были водянистыми беловато-серого цвета, с примесью слизи и крови. Птицы становились вялыми, сидели с опущенными крыльями, оперение взъерошено, температура тела - 43,1-43,3°С. Птицы погибали на фоне нарастающей слабости, адинамии, нарушения сердечной деятельности, дегидратации.

Динамика гематологических изменений у перепелов с клиническими признаками диареи, прогрессирующей депрессии, цианозе видимых слизистых оболочек характеризовалась повышением эозинофилов, псевдоэозинофилов, лимфоцитов, моноцитов (табл. 2).

Таблица 2

Результаты гематологических исследований сыворотки крови 30-ти суточных перепелов при экспериментальном эшерихйозе, М±т

Гематологические показатели Группа птицы

Контроль (п=5) Опыт (н=10)

Е.соП 02 Е.соП 078:К80

Эритроциты мли/л 4,03± 0,43 4,94445 4,15476

Гемоглобин, г/% 12,245 12.42451 12,51461

Лейкоциты, тыс./мкл 26,9*0,9 28,31"5 0,62 28,8110,54

Эозинофилы, ТЫС./МКЛ 2,3± 0,4 4,12± 0,44 3,90^0,8

Псевдоэозинофилы, тыс./мкл 1,1- 0,6 9,61± 0,51 9,40х 0,58

Лимфоциты, ТЫС./МКЛ 13,910,41 15,77*0^7 14,82* 0,77

Моноциты, тыс./мкл 1,745 2, 14^4,42 2,31х 0,65

Примечание: р<0,05

При экспериментальном эшерихиозе были снижены показатели сыворотки крови (%): бактерицидная активность: контроль - 62,9^1,65, опыт -57,9^0,71; лизоцимная активность: контроль- 23,9 4,63, опыт - 20,9 —1,11. Фагоцитарная активность лейкоцитов (%): контроль — 60,1±2,51, опыт -55,44,65; индекс фагоцитоза (%): контроль- 3,29-0,18, опыт - 2,79 ±0,23.Биохимические показатели характеризовались снижением общего белка, глюкозы, аланинаминотрансферазы, лактатдегидрогеназы, повышением мочевины, аспартатаминотрансферазы, щелочной фосфатазы, наблюдались нарушения водно-электролитного баланса (табл. 3).

Таблица 3

Результаты биохимических исследований сыворотки крови 30-ти

суточпых перепелов при экспериментальном эшерихиозе, М±т

Биохимические показатели Группа птицы

Контроль (л=5) Опыт (я=10)

£.соИ 02 Е.соН 078:К80

Общий белок, г/ л 30,5- 0,2 22,243 23,2 ± 0,3

Мочевина, ммоль/л из1 о,п 1,544 1,6±0,4

Глюкоза, ммоль/л 18,943 16,75431 14,54 3

Аланинаминотраисфераза, ед/л 1,945 3,242 3,414 2

Аспартатаминотрансфераза, ея/л 225.243 412,042 395,24 3

Лактатдегидрогеназа, ед/л 220,34,4 200,246 147,943

Амилаза, ед/л 187,54,6 117,344 167,67461

Щелочная фосфатаза, ед/л 675,344 710,3403 719,144

Калий, ммоль,л 28,9*0,34 16.9*0,3 11,543

Натрий, ммоль,л 139,3414 127,04,4 144,7*0,6

Хлориды, ммоль, л 112,7-0,26 106,010,2 109,0^ 0,2

Примечание: р<0.05

3. 2. Результаты изучения динамики морфологических изменений тканей и органов перепелов при экспериментальном эшерихиозе

Динамика патологических процессов через 24-72ч после экспериментального заражения патогенными штаммами Е. coli при остром течении болезни характеризовалась наличием точечных кровоизлияний на слизистых и серозных оболочках сердечно-сосудистой, дыхательной и пищеварительной системы, наблюдалась гиперплазия селезенки (табл. 4). Селезенка была вишневого цвета, кровенаполненная, выявляли отек и частичное разволокнение капсулы. В отдельных участках наблюдались опустошения пульпы, как результат нарушения структурных связей элементов, выявлялись гигантские макрофаги. Венозные синусы красной пульпы были расширенными. В белой пульпе вокруг центральной артерии не выявлялось формирование плотного кольца из лимфоцитов, слои оболочек артерий были разволокненные, в центрах размножения наблюдалась пролиферация лимфоцитов.

Таблица 4

Морфометрические показатели селезенки перепелов при экспериментальном эшерихиозе

Морфометрические показатели Масса органа - г

Опыт Контроль Am Д (М+т)

Абсолютная масса, г 1,12 1,02 0,10 0,112^,0104

1,16 1,01 0,15

1,14 1,03 0,11

1,13 1,02 0,11

1,10 1,01 0,09

Длина, см 0,36 0,28 0,08 0,06±0,004

0,34 0,26 0,08

0,33 0,27 0,06

0,30 0,26 0,04

0,29 0,25 0,04

Ширина, см 0,32 0,21 0,11 0,102^,0064

0,34 0,20 0,14

0,31 0,24 0,07

0,32 0,21 0,11

0,30 0,22 0,08

Как правило через 4-5 суток после заражения при подостром течении болезни наблюдали серозно-фибринозный аэросаккулит, перикардит. В трахее выявлялся пенистый экссудат, легкие имели дряблую консистенцию, пораженные дольки были увеличенными, уплотненными, окрашены в сине-красный цвет, поверхность разреза органа была влажной, при надавливании выделялась мутная, иногда кровянистая жидкость. Воздухоносные мешки были утолщенные, тусклые, непрозрачные с наложениями пленок фибрина, сосуды налиты кровыо. Наблюдали скопление катарального экссудата и серозно-клеточный выпот в альвеолах, дистрофия и слущивание эпителиального слоя, в

9

междольковой соединительной ткани наблюдалась гиперемия и лейкоцитарная инфильтрация, пролиферация фибробластов в периваскулярной соединительной ткани. В полости парабронхов выявлялась светло-розовая сеточка фибрина с наличием эритроцитов и единичных плазмоцитов просвет парабронхов заполнен большим количеством псевдоэозинофилов, лимфоцитов, эпителиальными клетками. В оболочках сердца выявлялись точечные кровоизлияния, перикард был растянут и заполнен серозно-фибринозным экссудатом; эпикард покрыт пленками фибрина, тусклый, покрасневший, утолщен вследствие пропитывания серозно-фибринозным экссудатом и инфильтрации псевдоэозинофилами, лимфоцитами, гистиоцитами и фибробластами. Участки миокарда, прилегающие к эпикарду, были инфильтрированы псевдоэозинофилами, лимфоцитами и гистиоцитами. Кровеносные сосуды эндокарда были расширены и заполнены плотно расположенными эритроцитами и псевдоэозинофилами.

При исследовании органов пищеварительной системы выявлена коррелятивная зависимость степени выраженности морфологических изменений, развивающихся одновременно в кишечнике, печени и поджелудочной железе. У птиц всех возрастных групп патологические изменения характеризовались катаральным или катарально-фибринозпым энтероколитом с наличием волокон фибрина, точечных, пятнистых и полосчатых кровоизлияний в слизистой оболочке тонкого и толстого отделов кишечника. В тонком отделе наблюдались увеличение количества бокаловидных клеток, переполненных светло-розовым секретом, каемчатые эпителиоциты находились в состоянии слизистой дистрофии, некроза и отторжения. В собственной пластинке слизистой оболочки выявлялись палочковидные бактерии, в подслизистом слое слизистой оболочки наблюдались отек и кровенаполнение кровеносных сосудов. Для эпителиального слоя слизистой оболочки толстого отдела кишечника были характерны слизистая дистрофия, некробиоз и частичная десквамация эпителия, просвет крипт был сужен. На всем протяжении кишечника наблюдалась гиперемия слизистой оболочки, инфильтрация лимфоцитами, гистиоцитами и псевдоэозинофилами рыхлой волокнистой соединительной ткани, лимфатические фолликулы имели нечеткие границы, количество лимфоцитов в центре фолликулов было значительно меньше по сравнению с контролем, выявлялась множественная бактериальная эмболия кровеносных сосудов серозной оболочки. Печень нередко была перерождена, глинистого цвета, пульпа органа на разрезе дряблой консистенции. Оболочка органа и междольковая рыхлая волокнистая соединительная ткань были инфильтрированы псевдоэозинофильными и лимфоидными клетками. Наблюдалась дискомплексация балочной структуры долек органа, кровенаполнение центральной вены и синусоидных капилляров, размер некоторых гепатоцитов уменьшался, часть гепатоцитов были увеличенными и характеризовались белковой и жировой дистрофией. Изменения в поджелудочной железе перепелов характеризовались наличием

периваскулярной воспалительной инфильтрации, кровенаполнением кровеносных сосудов, отеком междольковой рыхлой волокнистой

ю

соединительной ткани, выявлялись, дистрофические изменения и вакуолизация цитоплазмы эпителиальных клеток ацинусов.

При исследовании фабрициевой бурсы отмечали набухание многорядного призматического эпителия складок слизистой оболочки; в некоторых клетках встречались мелкие вакуоли; в собственном слое слизистой оболочки выявлялись признаки отека. Корковое вещество лимфатических фолликулов было истончено, выявлялись просветленные участки; в мозговом веществе выявлялись очаги деструкции и лизиса лимфоцитов с явлениями кариопикноза и кариорексиса. При большом увеличении микроскопа в корковом веществе лимфатических фолликулов обнаруживались близкорасположенные лимфоциты, мозговое вещество — более светлой окраски.

В целом при экспериментальном воспроизведении эшерихиоза на перепелах установлено, что при остром течении болезни процесс, обусловленный септицемией, характеризовался нарушением порозности кровеносных сосудов, выходом форменных элементов крови и выпадением фибриногена, развитием точечных кровоизлияний на слизистых и серозных оболочках внутренних органов, гиперплазией селезенки. При подостром течении болезни процесс, обусловленный энтеротоксемией, характеризовался серозно-фибринозным аэросаккулитом, перикардитом, перигепатитом, катарально-фибринозным энтероколитом. При гистологическом исследовании выявлялась множественная бактериальная эмболия кровеносных сосудов серозных оболочек, в паренхиматозных органах выявлялись многочисленные некротические очажки, инфильтрированные лейкоцитами.

3.3. Результаты изучения колонизационной резистентности кишечника и днссеминацни эшерихий в ткани и органы перепелов при экспериментальном эшерихиозе

С целью подбора эффективного способа количественного учета микроорганизмов на первом этапе исследований провели учет количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФЛнМ) в пробах пищевых продуктов и микробиоценозах кишечника перепелов. Для определения КМАФАнМ пищевых продуктов исследуемые образцы (ш=25 г): тушки перепелов (п=3), фарш из мяса птицы (п=3) погружали в пептонную воду в соотношении 1:5. Для количественного учета микроорганизмов использовали два способа: способ 1- серийные разведения в 0,9 % №С1; способ II - серийные разведения в 0,7 % МПА.

Количество микроорганизмов определяли через 18 ч культивирования при 37 °С по количеству колоний, выросших на питательной среде с пересчетом на количество посеянного материала и степень разведения культуры по формуле: х = а" х 10,где х - КОЕ микроорганизмов; а - количество выросших колоний; п - степень разведения. При определении бактериологической контаминации было установлено, что КМАФАнМ пищевых продуктов, определенное двумя способами, существенно не отличалось, однако применение в качестве

11

раствора для разведения 0,7 % раствора МПА позволило сократить расход питательных сред, стерильной бактериологической посуды и времени проведения анализа (табл. 5).

Таблица 5

Результаты определения количества микроорганизмов (КОЕ) пищевых продуктов

Исследуемые пробы Число КОЕ\ед.об | Чашки Петри, шт. | Объем среды (мл)

Способы исследований

I 11 I 11 1 II

Мясо птицы (п=3) 19х 10J 27x103 29x103 26x10! 24x103 23х105 15 3 180 90

Фарш из мяса птицы (п=3) 47x105 39x105 42х105 32x1o5 41х105 38х105 24 8 210 120

Способы исследований: 1 — серийные разведения в 0, 9 % NaCJ; И - серийные разведения в 0,7 % МПА

Учитывая, что способ с применением в качестве раствора для разведения 0,6-0,7 % раствора МПА прост в исполнении, информативен, дает статистически достоверные результаты, экспериментальный материал был взят нами за основу при разработке «Способа определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в пищевых продуктах» (патент на изобретение № 2400746 от 23 октября 2008).

При изучении количественного состава энтеробактерий в микробиоценозах кишечника перепелов исследовали определенный объем (0,1 мл) разведения содержимого слепых отростков кишечника перепелов. При определении индекса колонизации учитывали количество эшернхий, выделенных из содержимого слепых отростков кишечника всех зараженных (опыт) и отдельно незараженных (контроль) перепелов, и выражали в виде процента от максимально возможной изоляции возбудителя эшерихиоза. При экспериментальном эшерихиозе количество энтеробактерий (КОЕ ^/г)содержимого слепых отростков кишечника перепелов составило: 4,19±0,15 - 6,88±0,21 (опыт), 3,21±0,13-5,76±0,19 (контроль), индекс колонизации эшерихий (ИК) - 0,766 -0,837 % (табл. 6).

Таблица 6

Количественный состав энтеробактерий в мнкробмоценозах кишечника перепелов при экспериментальном эшерихиозе

Возраст Перепелов Количество бактерии (КОЕ lg/r) среда «Эндо» при 37 °С, 18 ч Индекс колонизации, %

Контроль Опыт

10-ти суточные 3,21 ±0,13 4,19±0,15 0,766

20-ти суточные 4,14±0,24 5,19±0,11 0,797

30-ти суточнь[е 5,76±0,19 6,88±0,21 0,837

При выделении чистой культуры микроорганизмов E.coli для прижизненной диагностики исследовали feces птицы, для посмертной диагностики - патматериал павших или убитых с диагностической целью перепелов. Посевы органов делали путем отпечатков разрезанной поверхностью кусочка органа на питательную среду в чашках Петри или вносили материал пастеровской пипеткой на поверхность среды. При исследовании тонкого отдела кишечника удаляли содержимое, соскабливали слизистую оболочку пастеровской пипеткой и наносили на поверхность дифференциально-диагностических сред (табл. 7).

Таблица 7

Дифференциальные признаки колоний энтеробактерии

Среды Характеристика колоний (37 °С, 18 ч) Рост тест штамма S. aureus

Е. coli S. enleritidis

«Эндо» 1,0-2,0 мм, • лактоза «+»: темно-красные; • лактоза «-»: бесцветные • лактоза «+»: бесцветные, в центре розовый оттенок 1,0-4,0 мм, • лактоза «-»: бесцветные «-»

«ТВХ medium agar» 1,0-2,0 мм, • ß-глюкуронидаза «+» сине-зеленые 1,0-4,0 мм, • ß-глюкуронидаза«+» бесцветные

«Chromogenic F.. coli / Coiiform medium agar» 1,0-3,0 мм, • ß-глюкуронидаза «+» • ß-талактозидаза«+» темно-фиолетовые 1,0-2,0 мм, « ß-глюкуронидаза «-» • ß-галактозидаза«-» розовые

На хромогенных средах наличие триптофана позволяло провести «тест на индол» с использованием реактива Ковача. Тест считали «+», если на среде «Chromogenic Е. coli/Coliform medium agar» в течение 3-5 секунд фиолетовый цвет колоний изменялся на розово-красный, в жидкой среде «LMX Manafi & Osmer» образование красного пристеночного кольца подтверждало наличие микроорганизмов Е. coli.

При изучении ферментативных свойств бактерий установлено преимущество использования тест-систем «СИБ» и «Enterotube П», позволяющие одновременно определять 15 признаков без использования питательных сред и стерильной бактериологической посуды.

При индикации и идентификации микроорганизмов Е. coli бактериологические исследования проводили по схемам: схема I с применением среды «Эндо»; схема II с применением среды «Chromogenic Е. coli/Coliform medium agar». Установлено, что идентификация микроорганизмов Е. coli с применением хромогенной среды «Chromogenic Е. coli/Coliform medium agar» (схема II) при подтверждении «теста на индол» в течение 24 ч позволила дифференцировать микроорганизмы Е. coli.

На основании сравнительной оценки и подбора эффективных дифференциально- диагностических сред и тест-систем при экспериментальном эшерихиозе было реизолировано 62 культуры микроорганизмов E.coli ссрогруппы 02 и 078 (табл. 8). При определении диссеминации возбудителя за пределы кишечного тракта (срок эксперимента 120 ч) было установлено, что культуры микроорганизмов E.coli через 24 ч выделялись из feces, через 96 и 120ч - из патматериала и feces (табл. 9).

Таблица 8

Индикации и идентификации Е. coli из патматериала перепелов

Группа птиц Количество выделенных культур микроо| ЭГЗННЗМОВ

Сердце Печень Легкие Селезенка Тонкий кишечник

Абс. % Абс. % Абс. % Абс. % Абс. %

10-ти сут. 5 8.06 6 9,67 6 9,67 4 6,45 5 8,06

20-ти сут. 3 4,8 4 6,45 5 8,06 2 3,2 4 6,45

30-ти сут. 2 3,2 5 8,06 5 8,06 2 . 3,2 4 6,45

Таблица 9

Диссемипация Е. coli в ткани н органы перепелов

Объект выделения Период выделения (часы)

E.coli 02 E.coli 07S

24 48 72 96 120 24 48 72 96 120

Кровь из сердца - - + + - - - + +

Селезенка - - 1 ¥ + - - - + +

Легкие - - 1 + + - - - + +

Печень - - 1 + + - - - + +

Почки - - - + + - - - + +

feces + -t- + + + + + + + -t-

3, 4. Результаты изучения гемолитических свойств, чувствительности к желчи и антибиотикам Escherichia coli

При определении гемолитической активности культур микроорганизмов E.coli учитывали степень образования зон гемолиза при культивировании микроорганизмов (37°С, 24 ч) на агаре Хоттингера с добавлением 5,0 % дефибринированной крови барана. При учете результатов установили, что 6,0 % изученных культур микроорганизмов E.coli вокруг колоний имели незначительную зону гемолиза - а-гемолиз, 4, 0 % изученных культур микроорганизмов E.coli были окружены прозрачными зонами гемолиза различного размера-/?-гемолиз.

Установлено, что культуры микроорганизмов^. соП, выделенные из патматериала перепелов, были чувствительными к антибиотикам группы аминогликозидов (амикацин, канамицин, неомицин, тобрамицин), фторхинолонов (байтрил, пефлоксацин, офлоксацин, ципрофлоксацин, энрофлон), цефалоспоринов (цефазолин, цефатоксим); умеренно чувствительными к группе макролидов (эритромицин, олеандомицин); устойчивыми к р-лактамным антибиотикам группы природных пенициллинов (ампицилин, бензилпенициллин, карбенциллин, оксациллин) (табл. 10).

Таблица 10

Результаты изучения чувствительности Е. coli к антибиотикам

Антибиотики Зона задержки роста микроорганизмов, см

1 2 3 М±ш t td

Амикацин 2,3 2,2 2,4 2,3± 0,2 11,5 1,176

Ампицилин 1,9 1,8 2,0 1,9+-0,2 9,5 1,176

Байтрил 1,1 1,3 1,5 1,3^0,4 3,25 1,156

Бензилпенициллин 1,9 1,7 1,8 1,8*0,2 9,0 1,176

Канамицин 1,7 1,9 1,8 1,8±0,2 9,0 1,176

Карбенцшчнш 2,1 2,0 2,2 2,1±0,2 10,5 1,176

Неомицин 2,2 2,1 2,3 2,242 11,0 1,176

Оксациллин 1,0 0,9 1,1 1,042 5,0 1,176

Олеандомицин 1,1 1,3 1,5 цз^чм 3,25 1,156

Офлоксацин 2,2 2,1 2,3 2,2-4),2 11,0 1,176

Пефлоксацин 2,1 2,0 2,2 2,1 1 0,2 10,5 1,176

Тобрамицин 2,0 1,8 1,9 1,9 1 0,2 9,5 1,176

Цефазолин 2,4 2,3 2,5 2,4 ±0,2 12,0 1,176

Цефатоксим 2,4 2,2 2,3 2,3 42 11,5 1,176

Ципрофлоксацин 2,4 2,3 2,5 2,4±0,2 12,0 1,176

Энрофлон 1,1 1,3 1,2 1,2 42 6,0 1,176

Эритромицин 1,0 0,9 1,1 1,0 42 5,0 1,176

Примечание: t - доверительный коэффициент; td -коэффициент достоверности различий средних величин

При изучении чувствительности микроорганизмов к действию желчи перепелов установили, что воздействие желчи перепелов, изученных возрастных групп, существенно не отличалась, зоны задержки роста микроорганизмов Е. coli составили от 11,9 до 17,6 мм (табл. 11).

Таблица 11

Результаты изучения чувствительности Е. coli к желчи перепелов

Культуры микроорганизмов (источник выделения) Зоны задержки роста, мм (Mini)

Желчь перепелов

10-ти сут. 20-ти сут. 30-ти сут.

Escherichia coli 07S:K80, № 320(референтный штамм) 11,9±0,1 12,6±0,3 12,3±0,5

Escherichia coli 02, № 388 (референтный шта.\ш) 16,9±0,3 17,1±0,5 17,6±0,3

Escherichia coli 078. № 1 \(патматериа! перепелов) 12,4±0,4 12,6±0,8 12,1 ±0,6

Escherichia coli 02, № 18 (патматернал перепелов) 16,5±0,3 16,7±0,5 16,9±0,2

3. 5. Результаты изучепия патог енных свойств Escherichia coli, выделенных из патматериала перепелов

Для оценки патогенных свойств микроорганизмов исследуемые 5-формы Escherichia coli культивировали на МПА при температуре 37 °С в течение 1820 ч, смывали 0,85%-ным раствором хлорида натрия и доводили концентрацию бактерий до 1 млрд. бактериальных клеток в 1 мл в соответствии с оптическим стандартом мутности ГИСК им. Тарасевича. Патогенные свойства микроорганизмов оценивали с применением лабораторных моделей: 3-х суточные перепела породы Coíurnix coturnix japónica; беспородные лабораторные мыши, массой 14-16 г; 11-суточные эмбрионы кур породы "Белый леггорн". При внутрибргошинном заражении перепелам (п=12), мышам (п=12) вводили по 0,5 см3 взвеси культур микроорганизмов Escherichia coli - опыт; аналогичной группе перепелов (;j=3) и мышей (п=3) внутрибрюшинно вводили по 0,5 см3 0,85 %-го раствора NaCl- контроль. Было установлено, что изученные культуры микроорганизмов Escherichia coli были патогешшми (табл. 12).

Таблица 12

Результаты изучения патогенных свойств Escherichia coli

Культуры .микроорганизмов (источник выделения) Патогенные свойства

Число перепелов Число мышей Число куриных эмбрионов

Escherichia coli 078.К80, № 320 (референтный штамм) 3\3 3\3 3 43

Escherichia coli 02, Ks 388 (референтный штамм) 3\3 3\3 3 \ 3

Escherichia coli 078, № 11 (патматериал перепелов) 3 \ 3 3\3 3\3

Escherichia coli 02, № 18 (патмсмгернал перепелов) 3\3 3\3 3\3

Условные обозначения: числитель - число зараженных; знаменатель - число погибших

При заражении 11-суточных эмбрионов кур породы "Белый леггорн" (п=12) в аллантоисную оболочку вводили бактериальную взвесь Escherichia coli по 0,2 см3 бактериальных клеток - опыт; аналогичной группе эмбрионов водили по 0,2 см3 0,85 %-го раствора NaCl (п=3) - контроль.

При учете результатов гибель 3 зараженных эмбрионов (табл. 12) наблюдалась через 24 часа после заражения. Как правило, у погибших эмбрионов выявлялись изменения сосудов зародышевых оболочек. На кожных

покровах зародыша выявляли наличие цианоза, гиперемию и кровоизлияния, слизистые оболочки глаз, носовых отверстий и клоаки были гиперимированные. При препарировании кожи со стороны подкожной жировой клетчатки были выявлены кровоподтеки, а также наличие кровоизлияний в мышцах туловища и конечностей эмбрионов. При вскрытии грудной и брюшной полости выявлялись кровенаполнение сосудов сердечной мышцы, точечные и пятнистые кровоизлияния в области клапанов сердца на эпи- и эндокарде, наличие точечных, пятнистых и полосчатых кровоизлияний в легких, катаральное воспаление слизистой оболочки кишечника, в брюшной полости выявляли серозный экссудат светло-желтого цвета. Печень была перерождена, глинистого цвета, на разрезе имела дряблую консистенцию, желчный пузырь был растянутым и заполнен темно-зеленым содержимым. Почки были увеличенными, дряблой консистенции, выражен венозный застой и явления дистрофии, под капсулой точечные кровоизлияния, на разрезе не выявляется четкая граница между корковым и мозговым слоем. Селезенка была увеличенной, наблюдались признаки застойной гиперемии.

При бактериологическом исследовании из патматериала (сердце, селезенка, печень, участок кишечника) эмбрионов были реизолированы культуры микроорганизмов Escherichia coli.

Для оценки токсигенных свойств исследуемые 5-формы культуры микроорганизмов Escherichia coli культивировали в жидкой среде Хоттипгера в течение 24 ч при 37"С, затем культуры микроорганизмов центрифугировали при 6000 об\мин, в течение 30 мин, полученную надосадочную жидкость вводили лабораторным животным (опыт), аналогичной группе животных вводили стерильный бульон Хоттипгера (контроль).

При оценке токсигенных свойств E.coli с применением лабораторной модели «кожнореактивный фактор» у морских свинок породы '.(Selfл (п=24) массой 200-250 г, за 24 ч до начала опыта на спине тщательно выстригали волосы. Затем в участки депиляции (размеры 1,0 см3) внутрикожно шприцом с тонкой иглой срезом вверх под острым углом вводили испытуемый материал в объеме 0,1 мл, через 24 ч учитывали результаты изменений кожного покрова. Для оценки токсигенных свойств E.coli с примене1шем лабораторной модели «плантарный тест» надосадочную жидкость вводили белым беспородным мышам (п=7) в область плантарной поверхности лапы в дозе 0,1 мл. В качестве контроля использовали исходную среду, которую вводили параллельно в другую лапу в той же дозе. Учет результатов проводили через 24 ч, величину отека определяли по разности массы лапок мышей в контроле и опыте (табл. 13).

Таблица 13

Результаты оценки токсигенных свойств E.coli

Вид микроорганизмов Токсигенные свойства

Кожнореактивный фактор Плантарный тест"

Е.соИ 078, №11 (патматериал перепелов) 1,5-2,0 41,66+5,14

Е.соН 02, № 18 (патматериал перепелов) 1,5-2,0 39,51+6,17

Е.соИ 078:К80, № 320 (референтный штамм) 1,5-2,0 36,42+5,23

Е.соН 02, № 388 (референтный штамм) 1,5-2,0 40,00+3,41

Есо/Ю138:К81, № 723 (референтный штамм) 2,5-3,0 69,17+5,40

Б.еШегШсИз.Ш 204 (референтный штамм) 1,0-1.5 29,17+3,22

Эмигет. № 123 (референтный штамм) 0 1,66 + 1,27

токснгенные игтаммы; 2,5 - 3.0 балла - высокотокснгениые '•средняя радаостклэпи: 15,00-34,00 - слабогоссгсгенные; 35,00-64,00 - умереннотоксш в ысокото ксигеиные

2,0 балла - умеренно енные; 65 и более-

При виутрикожной инъекции токсина Escherichia coli в рыхлой волокнистой соединительной ткани подкожной клетчатке выявлялись признаки воспалительного процесса, что сопровождалось миграцией лейкоцитов в область посткапиллярных венул, периваскулярной и интерстициалыюй инфильтрацией. На первом этапе через 4-6 ч после инъекции, выявляли накопление преимущественно нсевдоэозинофилов, на втором этапе через 7-8 ч наблюдалось усиленное накопление моноцитов.

Для оценки способности E.coli к продукции токсинов апробировали тест-систему «VET-RPLA», основанную на методе обратной пассивной латексной агглютинации. Принцип действия заключается в том, что антитела реагируют с растворенным антигеном, при наличии токсина, латексные частицы соединяются, образуя комплекс специфического антигена с антителами (реакция агглютинации). При учете результатов сравнивали интенсивность агглютинации каждого образца по отношению к контролю. При наличии четко видимых агрегатов латексных частиц реакции агглютинации считали «положительными», что свидетельствовало о наличии токсина. При оценке токсигенных свойств Escherichia coli были выявлены видимые агрегаты латексных частиц, что свидетельствовало о наличии токсина (табл. 14).

При оценке тест-системы в опытах с использованием смеси культур E.coli + S. enteritidis, E.coli +S.aureus выявлялись видимые агрегаты латексных частиц в реакции агглютинации, что свидетельствовало о специфичности тест-системы. При отсутствии агрегатов латексных частиц реакции агглютинации считали «отрицательными», что было установлено в опытах с культурами микроорганизмов 5. enteritidis, S. aureus. При оценке токсигенных свойств культур микроорганизмов Escherichia coli, выделенных из патматериала перепелов, с применением тест-системы «VET-RPLA», основанной на методе

is

обратной латекс-агглютинации, установлена корреляция результатов исследования с результатами, основанными на применении лабораторных моделей (1=0,89).

Таблица 14

Результаты оценкнтоксигенных свойств Е.соИ с применением тест-системы «УЕТ-ИРГА»

Вид микроорганизмов № штамма Токсигенные свойства Тест-система «VET-RPLA»

E.coli 078, № 11 (патматериал перепелов) «++»

E.coii 02, № 18 (патматериал перепелов)

E.coli 078-.К80, № 320 (референтный штамм)

E.coli 02, № 388 (референтный штамм) «++»

iT.co/i'0138:К81, №723 (референтный штамм) «+++»

5. enleritidis,№ 204 (референтный штамм)

S. aureus, № 123 (референтный штамм)

Примечание: реакция агглютинации: «-)>,«+» - отсутствие гикскна; «+». «++», «+++» - |щллчие токсина

ВЫВОДЫ

1. При экспериментальном воспроизведении эшерихиоза на перепелах установлено, что динамика патологических процессов при остром течении болезни обусловлена септицемией, при подостром течении -энтеротоксемией.

2. При гистологическом исследовании выявлялась множественная бактериальная эмболия кровеносных сосудов серозных оболочек, в паренхиматозных органах выявлялись многочисленные некротические очажки, инфильтрированные лейкоцитами. Признаки воспалительного процесса, сопровождающегося миграцией и интерстициальной инфильтрацией псевдоэозинофилов, развиваются через 4-6 ч, моноцитов- через 7-8 ч после заражения микроорганизмами Е. coli.

3. Установлена эффективность применения хромогенных сред «Chromogenic Е. coli/Coliform medium agar» и «LMX Manafi & Osmer», позволяющих при подтверждении «геста на индол», дифференцировать микроорганизмы Е. coliот таксономически сходных видов энтеробактерий в течение 24 ч.

4. Установлено, что количество энтеробактерий (КОЕ 1§/г)слепых отростков кишечника перепелов составляла 4,19±0,15- 6,88±0,21 (опыт), 3,21 ±0,13-5,76±0,19(контроль); при экспериментальном эшерихиозе индекс колонизации (ПК) эшерихий у 10-ти суточных перепелов- 0,766; 20-ти суточных - 0,797; 30-ти суточных - 0,837.

5. При изучении чувствительности микроорганизмов к действию желчи перепелов установлено, что зоны задержки роста микроорганизмов Е. coli составили 11,9-17,6 мм.

6. Культуры микроорганизмов Е. coli, выделенные из патматериала перепелов, были чувствительными к антибиотикам группы аминогликозлдов (амикацин, канамицин, неомицин, тобрамицин), фторхинолонов (байтрил, пефлоксацин, офлоксацин, ципрофлоксацин, энрофлон), цефалоспоринов (цефазолин, цефатоксим); умеренно чувствительными к группе макролидов (эритромицин, олеандомицин); устойчивыми к ß-лактамным антибиотикам группы природных пенициллинов (ампицилин, бензилпенициллин, карбенциллин, оксациллин).

7. При оценке токсигенных свойств культур микроорганизмов Escherichia coli, выделенных из патматериала перепелов, с применением тест-системы «VET-RPLA», основанной на методе обратной латекс-агглютинации, установлена корреляция результатов исследования с результатами, основанными на применении лабораторных моделей (г=0,89).

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

• Для использования в лабораториях и научно-исследовательских учреждениях разработан «Способ определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в пищевых продуктах" (Патент на изобретение № 2400746, от 23 октября 2008), основанный на определении количественного состава микроорганизмов, выделенных из пищевых продуктов, в том числе продукции птицеводства.

• При проведении бактериологической диагностики эшерихиоза птиц рекомендуется использовать хромогенные среды «Chromogenic Е. coli/ Coliform medium agar» и «LMX Manafi & Osmer», позволяющие при первичной идентификации дифференцировать микроорганизмы Е. coli от таксономически сходных видов энтеробактерий в течение 24 ч.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Мансурова Е.А. Изучение механизма действия токсина энтеробактерий // Е.А.Мансурова, Е.МЛенченко // Ветеринария. -2008. - №8.-С.60-64.

2. Мансурова Е.А. Морфологические показатели и водно-электролитный баланс при эшерихиозе //Живые системы и биологическая

безопасность населения: Материалы VII международной научной конференции студентов и молодых ученых,- М.: МГУПБ, 2008,- С.262-263.

3. Мансурова Е.А. Структурно-функциональная характеристика органов пищеварения птиц при экспериментальном моделировании инфекционного процесса // Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и средства переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания: Материалы международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2009.- С.288-289.

4. Мансурова Е.А. Микроскопическое исследование взаимодействия микроорганизмов с клетками крови животных и птиц //Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы VIII международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2010.-С.246-248.

5. Мансурова Е.А. Динамика изменений гематологических показателей при желудочно-кишечных болезней животных / Е.А.Мансурова, Е.М.Ленченко // Аграрная наука. - 2011.- №6.- С. 30-32.

6. Ленченко Е.М. Гистохимические исследования при заражении птиц токсигенными эшерихиями / Е.М.Ленченко, Е.А.Мансурова // Аграрная наука. -2012,- №4,- С.29-30.

Отпечатано в типографии ООО "Франтера" Подписано к печати 20.05.201 Зг. Формат 60x84/16. Бумага "Офсетная №1" 80г/м\ Печать трафаретная. Усл.печ.л. 1,50. Тираж 100. Заказ 5908.

\VVVW. FRANTERA.COM

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Мансурова, Екатерина Анатольевна, Москва

На правах рукописи

МАНСУРОВА ЕКАТЕРИНА АНАТОЛЬЕВНА

04201356096

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА И МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ ПЕРЕПЕЛОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ЭШЕРИХИОЗЕ

06.02.02 - Ветеринарная микробиология, вирусология,

эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

МОСКВА 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................................................................................................3

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................................................................7

1.1. Перепеловодство как отрасль птицеводства....................................................................................7

1.2. Этиологическая структура болезней перепелов....................................................................................11

1.3. Циркуляция Е. coli в птицеводческих хозяйствах, источники и пути 14 заражения птицы..............................................................................

1.4. Диагностика и профилактика эшерихиоза птиц..............................................................................25

СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ..........................................................................................................................................31

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..............................................................................................................................31

2.1. Клинико-морфологические методы исследований..........................................................................32

2.2. Бактериологические методы исследований......................................................................................................35

2.3. Методы изучения гемолитических свойств, чувствительности к желчи и антибиотикам....................................................................................................................................................................37

2.4. Методы изучения патогенных свойств микроорганизмов Е. coli........................................39

2.5. Методы статистической обработки результатов исследований........................................40

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ..............................................................................................................41

3.1. Клинические признаки, особенности течения болезни, гематологические и 41 биохимические показатели перепелов при экспериментальном

эшерихиозе......................................................................................

3.2. Результаты изучения динамики морфологических изменений тканей и органов 44 перепелов при экспериментальном эшерихиозе........................................

3.3. Результаты изучения колонизационной резистентности кишечника и диссеминации эшерихий в ткани и органы перепелов при экспериментальном 61 эшерихиозе....................................................................................

3.4. Результаты изучения гемолитических свойств, чувствительности к желчи 76 и антибиотикам Escherichia coli, выделенных при эшерихиозе перепелов.........................................................................................................

3.5. Результаты изучения патогенных свойств Escherichia coli, выделенных из 79 патматериала и feces перепелов..............................................................

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ............................................................................................................................................................85

ВЫВОДЫ............................................................................................................................................................................................................................96

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ....................................................................................................................................................97

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................................................................................................98

ПРИЛОЖЕНИЕ........................................................................................................................................................................................................И6

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В структуре инфекционной патологии птиц в 2012 г из числа заразных болезней удельный вес эшерихиоза составил 53,9 %, среди павших птиц - 92,0 % (Бобылева Г.А., 2013). Эшерихиоз птиц протекает в виде септицемии (Colicepticaemia avium), сальпингита и колигранулематоза (Бессарабов Б.Ф., 1980, 2007; Тугаринов O.A., 1983; Стрельников А.П., 1987; Пирожков М.К., 1989; Радчук H.A., 1990; Жаров A.B., 1995; Кунаков A.A., 1995; Сидоров М.А. и соавт., 1995; Селезнев С.Б., 2000; Куриленко А.Н. и соавт., 2005; Борисенкова А.Н. и соавт., 2004; Светоч Э.А., 2004; Крупальник В.Л., 2005; Хатько Н.Ф., 2005; Сидорчук A.A., 2007; Кожемяка Н. В., 2008; Кононенко А.Б. и соавт., 2009; Ленченко Е.М. и соавт., 2013; Samelson L.E., 1985; StanleyV.G. etal., 1996; Collins, 2001; Janice Y.C., 2011). При идентификации из-за узкого спектра и невысокой чувствительности существующих наборов «О-коли сывороток» не типируется 49,0-54,3 % культур микроорганизмов E.coli. Схему бактериологической диагностики эшерихиоза завершает биологическая проба, характеризующаяся сложностью воспроизведения, чрезвычайной продолжительностью по времени исполнения. Восприимчивость лабораторных моделей зависит от вирулентности возбудителя, дозы, метода введения, чувствительности к термолабильным и термостабильным токсинам (Каврук Л.С., 1994; Светоч Э.А., 2000; Капустин A.B., 2001; Скородумов Д.И. и соавт., 2005; Рождественская Т.Н., 2011). При доместикации в неестественной среде обитания ограниченное территориальное пространство, нетрадиционное кормление являются основными причинами развития патологических процессов диких, экзотических и декоративных птиц (Бессарабов Б.Ф., 2005; Ежков В.О., 2008; Пименов Н.В., 2012). В частности, на перепелиных фермах технологии содержания птицы существенно отличаются от природных условий, что приводит к снижению уровня показателей естественной резистентности организма птицы (Паникар И.А. и соавт., 1992; Гущин В.В., 2003; Шваб A.A., 2006; Белогуров А.Н., 2009). Циркулирующие в перепелиных хозяйствах штаммы

микроорганизмов Е. coli были представлены серогруппами: 078, 0111, из числа выделенных 61,53 % имели адгезивные антигены: К88ав, К88ас, К99, 987Р и F41, летальность перепелов при эшерихиозе составляла 97,25 %, сальмонеллезе -78,7 % (Паникар И.А. и соавт., 1995; Булгакова И.А., 1997; Панасенко А.С., 2008). При заражении Micobacterium avium у перепелов развивались изменения, характерные для туберкулеза (Бушмелева П. В., 2011). При желудочно-кишечных болезнях в микробиоценозах кишечника перепелов увеличивалось содержание патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, в том числе E.coli (Шмидт Г.О., Плешакова В.И., 2012). Учитывая, что степень реализации потенциальной патогенности микроорганизмов определяется восприимчивостью макроорганизма, актуальность представляют исследования по воспроизведению инфекционного процесса на восприимчивых лабораторных моделях для изучения динамики патологических процессов, апробация и подбор эффективных диагностических сред, тест-систем для индикации и дифференциации микроорганизмов Escherichia coli.

Цель работы - изучить клинические признаки, особенности течения болезни, морфологические изменения, колонизационную резистентность кишечника, диссеминацию бактерий в ткани и органы перепелов при экспериментальном эшерихиозе.

Задачи исследований:

изучить клинические признаки, особенности течения болезни, гематологические, биохимические показатели сыворотки крови перепелов при экспериментальном эшерихиозе;

- изучить динамику морфологических изменений тканей и органов перепелов при экспериментальном эшерихиозе;

определить колонизационную резистентность кишечника и диссеминацию бактерий в ткани и органы перепелов при экспериментальном эшерихиозе;

- изучить гемолитические свойства, чувствительность к желчи и

антибиотикам микроорганизмов Escherichia coli, выделенных из патматериала перепелов;

- апробировать и оценить эффективность лабораторных моделей и тест-системы «VET-RPLA» для оценки патогенных свойств Escherichia coli, выделенных из патматериала перепелов.

Научная новизна. При экспериментальном воспроизведении эшерихиоза на перепелах установлено, что динамика патологических процессов при остром течении болезни обусловлена септицемией, при подостром течении -энтеротоксемией. Признаки воспалительного процесса, сопровождающегося миграцией и интерстициальной инфильтрацией псевдоэозинофилов, развиваются через 4-6 ч, моноцитов - через 7-8 ч после заражения микроорганизмами Е. coli. Количество энтеробактерий (КОЕ lg/r) слепых отростков кишечника перепелов при экспериментальном эшерихиозе составляет 4,19±0,15 - 6,88±0,21, индекс колонизации (ИК) эшерихий у 10-ти суточных перепелов - 0,766; 20-ти суточных - 0,797; 30-ти суточных - 0,837. При изучении чувствительности микроорганизмов к действию желчи перепелов установлено, что зоны задержки роста микроорганизмов Е. coli составляют 11,9-17,6 мм. При оценке токсигенных свойств культур микроорганизмов Escherichia coli, выделенных из патматериала перепелов, с применением тест-системы «VET-RPLA», основанной на методе обратной латекс-агглютинации, установлена корреляция результатов исследования с результатами, основанными на применении лабораторных моделей (г=0,89).

Практическая значимость работы. Установлена эффективность применения хромогенных сред «Chromogenic E.coli/Coliform medium agar», «LMX Manafi & Osmer», позволяющих в течение 24ч при идентификации микроорганизмов дифференцировать эшерихии от таксономически сходных видов энтеробактерий, выделенных из патматериала перепелов. Для количественного учета микроорганизмов в пищевых продуктах, микробиоценозах кишечника птицы, разработан способ определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных

микроорганизмов, позволяющий сократить расход питательных сред, стерильной бактериологической посуды. Результаты исследований используются в учебном процессе на ветеринарно-санитарном факультете ФГБОУ ВПО «МГУПП» по дисциплинам: «Цитология, гистология, эмбриология»; «Эпизоотология».

Апробация материалов диссертации. Основные результаты диссертационной работы доложены и одобрены на заседаниях кафедры «Инфекционные и паразитарные болезни» ФГБОУ ВПО «МГУ 1111» (Москва, 2008-2011 гг.); на VI, VII, VIII Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (М., 2009; М., 2010; М., 2011).

Основные положения, выносимые на защиту:

• результаты клинико-морфологических исследований, оценки колонизационной резистентности кишечника перепелов и диссеминации бактерий в ткани и органы перепелов при экспериментальном эшерихиозе;

• результаты изучения гемолитических свойств, чувствительности к желчи и антибиотикам микроорганизмов Escherichia coli, выделенных из патматериала перепелов;

• эффективность лабораторных моделей и тест-системы «VET-RPLA» для оценки патогенных свойств Escherichia coli, выделенных из патматериала перепелов.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 научных работ, в т.ч. 3 - в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, библиографии, приложения. Работа изложена на 115 страницах компьютерного текста, содержит 20 таблиц, 4 диаграммы, 30 фотографий. Библиографический список включает 174 источников, из них 77 иностранных авторов.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Перепеловодство как отрасль птицеводства

В соответствии с классификацией «Международная регистрационная книга пород и линий птиц» перепела занимают следующее таксономическое положение:

Перепел обыкновенный Coturnix coturnix, как вид описан Карлом Линнеем (1758), самый мелкий представитель и единственные перелетные птицы в отряде Курообразных, кочующих в августе ближе к Крыму, готовясь к перелету, затем преодолевающих Черное и Средиземное моря. Помимо перепелов к отряду Курообразные относятся куры, куропатки, фазаны, павлины. Перепелов обычно подразделяют на две группы: американские перепела (10 родов) и перепела Старого Света (5 родов), насчитывающих 6 региональных форм: Coturnix coturnix africana (Южная Африка); Coturnix coturnix confusa (Канарскиеострова); Coturnix coturnix coturbans (Азорские острова,)/ Coturnix coturnix coturnix (Европа); Coturnix coturnix japónica (Восточная Азия и Япония); Coturnix coturnix inopinata (остров Капверден). Помимо Перепела обыкновенного одомашнены еще два вида: хохлатые (Lophortyx) и зубчатоклювые (Colinus). На территории России обитает два подвида: Перепел обыкновенный и Перепел немой (японский).

К числу распространенных пород относятся японские, английские белые, английские черные, маньчжурские золотистые, австралийские желто-коричневые, смокинговые, фараон.

Царство: Животные Тип: Хордовые Подтип: Позвоночные Класс: Птицы Отряд: Курообразные Семейство: Фазановые Подсемейство: юпатковые Род: Перепела

Вид: Перепел обыкновенный

Animalia Chordata Vertebrata Aves

Galliformes

Phasiamidae

Perdicinae

Coturnix

Coturnix coturnix

У диких и домашних перепелов наблюдаются биологические особенности: половой диморфизм выражается различиями в живой массе; разделить по полу перепелов, можно по цвету оперения. Также у половозрелых самцов всех пород, имеется клоакальная железа розового цвета, в виде небольшого уплотнения, которая располагается над клоакой; а у самок клоакальная железа отсутствует, кожа вокруг клоаки с темным оттенком. По клюву перепелов можно определять пол - у самцов темнее, чем у самок. Масса перепелов колеблется в пределах 110,0 - 200,0 г, в зависимости от половой принадлежности. Вес самого маленького представителя рода перепелов составляет 120,0 г. Перепела производят 220-300 яиц в год массой 9,0 - 12,0 г. За год самка осуществляет две-три кладки яиц массой 10,0 -12,0 г. К мясному направлению относят перепелов пород фараон и маньчжурские (масса тела составляет 150,0 - 300,0 г). Яйценоскость- до 220 яиц в год массой 12,0 - 16,0 г.

Доместикация (одомашнивание) перепелов началась в Японии около тысячи лет назад, но только около ста лет назад, перепелов начали использовать для получения яиц и мяса в промышленном производстве. Одомашненные самки перепелов утратили инстинкт насиживания, поэтому для вывода молодняка применяют искусственную инкубацию яиц (выход перепелят в среднем составляет 70,0 %). Для этого используют практически любой инкубатор, позволяющий устанавливать и поддерживать температуру в пределах 37...39 °С. Перепела по строению тела, внутренних органов ничем, кроме размеров и высокой температуры тела, не отличаются от кур, кроме того, они имеют генетическое родство. Об этом свидетельствует тот факт, что при искусственном осеменении самки перепела семенем петуха возможны гибриды. (Гущин В.В., 2013; Кожемяка Н.В., 2011; Рахманов А.И., 2004).

В настоящее время, перепеловодство - признано одним из перспективных направлений птицеводства. Хотя ряд исследователей считают, что производство продукции перепеловодства и перепелиный рынок развиваются медленно - предложение отстает от спроса (в Японии ежегодно выращивают свыше 8 млн. перепелов, в Китае - более 70 перепелов). Во всем мире

разведение перепелов ведется на уровне ферм. Яично-бройлерных фабрик, на которых этих птиц разводили бы так же, как кур, просто не существует: везде этим занимается малый и средний бизнес. Крупные фермы по разведению перепелов имеются в ряде зарубежных стран, например, интенсивно развивается перепеловодство в США, Венгрии, Италии, Франции, Англии. Эти страны специализируются на производство перепелиного мяса, а в Японии, в основном, производят яйца этой птицы.

В России перепелов начали разводить в 60-х годах прошлого столетия, впервые в нашу страну японские перепела были завезены из Югославии в 1964 г. в Краснодарское лесоохотохозяйство (г. Майкоп, Краснодарский край). Впоследствии стали создаваться крупные перепелиные фермы: Солнечногорский район Московской области, Производственно-экспериментальная птицефабрика «Племптица» (Московской области), птицефабрика «Снежка» Брянской области (Бобылева Г.А., 2013; Борисенкова А.Н., 1994; Венгеренко Л.А., 2003; Гущин В.В., 2013). В начале 70-х годов развитие перепеловодства было прервано, в начале 80-х отрасль стала возрождаться. Считается, что развитию перепеловодства в нашей стране, отчасти препятствует холодный, порой суровый климат средних и северных широт. Перепела породы Фараон были завезены из Польши в 1975 г., а перепел английский черный был завезен из Англии в 1971 г. В большинстве случаев разводят японских перепелов московской популяции. Крупнейшей перепелиной фабрикой в России сегодня считается «Интерптица» (г. Воронеж), где одновременно содержится 180 тысяч несушек. Все остальные производители заметно отстают, так что куда более типичные примеры — действующая в поселке «Ржавки», Московской области ферма с двадцати пяти тысячным поголовьем или ферма «Зоомир», Ярославской области, созданная на площадях бывшего свинарника семь лет назад, где тридцать тысяч птиц ежедневно дают до девяти тысяч яиц. В целом в нашей стране ежедневно производится 350 тысяч перепелиных яиц (Гусев В.В., 2000; Фисинин В.И., 2013; Тубол О.В., 2009).

1.2. Этиологическая структура болезней перепелов

При современных технологиях интенсивного ведения птицеводства с реализацией генетических возможностей продуктивности на грани износа организма в этиологии и патогенезе отдельных нозологических форм инфекционной патологии птиц первоочередную значимость приобретают несоответствие условий содержания с концентрацией большого поголовья на малых площадях и несоблюдение ветер