Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биолого-экологический аспект персистенции эшерихий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Лиманская, Ирина Васильевна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.0. Колонизация эшерихиями различных экологических ниш

1.1. Роль факторов колонизации и персистенции эшерихий в формировании биоценозов организма

1.2. Эколого-климатические особенности региона обследования

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.0. Материалы и методы исследования

2.1. Методы микробиологического исследования

2.2. Методика изучения адгезивных свойств бактерий

2.3. Методика определения антилизоцимной активности бактерий

2.4. Методика определения антиинтерфероновой активности 37 бактерий

2.5. Выделение плазмидной ДНК из штаммов кишечной палочки

2.6. Выделение тотальной ДНК

2.7. Ферментативные реакции и электрофорез в агарозном геле

2.8. Амплификация с произвольными праймерами (RAPD)

2.9. Выявление генов энтеротоксинов E.coli

3.0. Эшерихии в биоценозе лиц обследуемых групп

3.1. Эшерихии в биоценозе здоровых людей

3.2. Колонизация E.coli различных биотопов тела человека при 49 нарушении микроэкологии кишечника

3.3. Экология эшерихий в медицинских стационарах

3.4. Некоторые биологические свойства эшерихий, 61 колонизирующих различные экологические ниши

4.0. Факторы, способствующие колонизации эшерихий в различных 65 биотопах тела человека

4.1. Адгезивные свойства

4.2. Факторы персистенции эшерихий, колонизирующих различные 66 экологические ниши

4.2.1. Распространенность и выраженность активности 67 секретируемых признаков у эшерихий, выделенных из кишечника практически здоровых людей

4.2.2. Распространенность и выраженность факторов 73 персистенции у эшерихий, выделенных из кишечника людей, страдающих дисбактериозом

4.3. Распространенность и выраженность факторов персистенции 80 у эшерихий, выделенных от больных с внекишечной формой эшерихиоза

5.0. Зависимость антилизоцимной активности от репродуктивной 87 функции эшерихий, выделенных от лиц обследуемых групп

6.0. Ферменты «агрессии» и токсины у эшерихий, выделенных из различных экологических ниш

7.0. Генотипирование эшерихий различных экологических ниш

7.1. Плазмидный анализ штаммов

7.2. Внутривидовая дифференциация штаммов эшерихий с 95 использованием произвольных праймеров

7.3. Генотипирование эшерихий на основе факторов вирулентности

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биолого-экологический аспект персистенции эшерихий"

Актуальность темы

Человек и окружающая среда представляют единую экологическую систему, находящуюся в состоянии биологического равновесия. Микробы, входящие в биоценоз различных топодемов макроорганизма, не только формируют состав флоры, но и принимают самое непосредственное участие в регуляции многих физиологических процессов (Л.Г. Перетц, 1955; Г.Н. Гончаров с соавт., 1989; И.А. Бочков с соавт, 1991; В.А. Гриценко, 1994; 1996; 2000; С.Д. Митрохин, 1994; Н.Э. Ляшенко, 1996; Б.А. Шендеров, 1998; Б.Л. Черкасских, 2002; J. Nowrouzian et al., 2003; A. Cassamu-Sov et al., 2004; Т. Hayshi, 2006).

Одним из постоянно пребывающих бактерий в кишечном биоценозе являются эшерихии. Эти микроорганизмы как убиквитарные представители флоры обладают высокой степенью биологической пластичности, позволяющей длительно циркулировать и колонизировать широкий круг биологических хозяев, адаптируясь к специфическим условиям среды обитаниия. Этому способствует ярко выраженный внутривидовой полиморфизм Е. coli по комплексу фенотипических характеристик (А.Х. Рахимов, 1987; С.С. Белокрысенко, 1993; Н.А. Нуралиев с соавт, 1993; Л.С. Зыкова, 1997; М.М. Писаренко, 2000; Е.И. Рындина, 2001; Н.В. Рудаков с соавт., 2001; В.М. Бондаренко с соавт., 2002; R. Goldman, 2006).

А.А. Воробьев с соавт., 2000, полагают, что эволюционно сформировавшиеся отношения между человеком и Е. coli носят в большинстве случаев исключительно взаимовыгодный характер.

Однако возможен и иной тип взаимодействия между партнерами, о чем свидетельствует наличие заболеваний эшерихиозной этиологии (A.M. Касьяненко, 1989; И.А. Бочков с соавт., 1991; Н.В. Гусева, 1994; В.Г. Петровская с соавт., 1994; Е.В. Резников, 1999; М.В. Zaidi et al., 2003; K.W. Simpson et al., 2006).

В результате осмысления накопленных данных о политипичности эшерихий была сформулирована концепция клонально-популяционной организации вида Escherichia coli как таксономической единицы, объединяющей в своем составе большое количество бактериальных клонов, полиморфных по комплексу биохимических, антигенных, патогенных и иных свойств. Причем к возбудителям эшерихиозов относилась группа относительно изолированных в генетическом отношении клонов Е. coli, обладающих комплексом факторов патогенности. Из этого можно заключить, что на характер взаимоотношений между макроорганизмом и Е. coli оказывают влияние не только состояние иммунобиологической реактивности хозяина, но и качественные характеристики эшерихий (М.В. Степанова, 1999; О.С. Журлов, 2000; T.V. Nguyen et al., 2005; J.L. Mellies et al., 2006).

Показано, что наряду с известными "классическими" признаками патогенности (адгезины, капсулы, токсины) у E.coli присутствуют свойства, направленные на ингибирование ряда факторов естественной противоинфекционной резистентности хозяина (лизоцим, комплемент и другие) и отражающие персистентный потенциал бактерий. Подчеркнуто, что изучение патогенетического значения данных свойств (факторов персистенции) Е. coli в развитии эшерихиозов пока находится на начальном этапе (И.В. Биленко с соавт., 1996; Ю.А. Брудастов, 1992; 1998; Э.С. Белебеева, 1998; И.Э. Борисова с соавт., 1998; У.Ф. Загороднева, 2002; Ф.Н.Ш. Мохаммед, 2006; G.T. Esmon, 2004; T.V. Nguyeen, 2006).

Мало исследован вопрос об изменении биологических характеристик у эшерихий при внегостальном их обитании, в том числе, в условиях техногенной метаморфизации окружающей среды. Перспективным подходом к решению данного вопроса, по мнению А.Р. Мавзютова (2001), может служить разработка системы мониторинга за природными популяциями эшерихий с кластерным анализом популяционного биопрофиля у изолятов E.coli с позиции его кластерной структурированности.

- Таким образом, изучение особенностей биологии и экологии эшерихий остается актуальной проблемой современной микробиологии. В ее рамках значительный научный интерес вызывает анализ механизмов персистенции E.coli в макроорганизме, способный прояснить природу многовариантности эффектов бактериально-гостальных взаимоотношений эшерихий с организмом человека. В теоретическом отношении важно определить патогенетическую роль факторов бактериальной персистенции в развитии эшерихиозов и изучить степень фенотипического полиморфизма гостальных и внегостальных субпопуляций Е. coli, в том числе, по персистентным характеристикам; а в прикладном плане представляется необходимым оценить информативность персистентных характеристик и на этой основе разработать новые диагностические технологии для клинической, эпидемиологической и экологической практики.

В связи с изложенным целью работы явился анализ структуры бактериальных популяций эшерихий, колонизирующих различные экологические ниши людей, живущих в крупном промышленном городе в условиях измененной микроэкосистемы кишечника и разработка критериев оценки состояния биоценоза по биологическим и персистентным признакам бактерий.

Для достижения этой цели требовалось решение ряда задач:

1. Сбор коллекции и фенотипическая характеристика эшерихий, выделенных из различных экологических ниш (здоровый человек, больной при инфекционном процессе различной локализации, внешняя среда).

2. Оценка особенностей биоценозов, сочленом которых являются эшерихии.

3. Определение биопрофиля Е. coli, колонизирующих здорового и больного человека, а также причастных к внекишечному эшерихиозу, кроме того бактерий из внешней среды.

4. Выявление гетерогенности популяций эшерихий, используя факторы персистенции, биологические свойства и генотипические маркеры.

5. Определение критериев микробиологического мониторинга за уровнем техногенного воздействия городской среды крупного промышленного города на основе изучения биологических факторов бактериальной персистенции.

Научная ценность диссертационной работы состоит, прежде всего, в теоретическом вкладе в проблему изучения взаимоотношений и взаимосвязей экологических показателей среды и биосферы, представителем которой являются эшерихии (как одной из составляющих биоценоза).

Впервые дана оценка распространенности эшерихий в различных биотопах организма человека, внешней среде, изучен качественный и количественный состав этих бактерий в различных экологических нишах.

Впервые установлены корреляционные связи между экологическим прессингом среды и биологическими функциями эшерихий, колонизирующих различные экологические ниши.

Показано, что эшерихии при увеличении показателей адгезии усиливают антилизоцимную и антиинтерфероновую активности и способны заселять кожу и полость рта; входят в состав микроэкосистемы, персистируя в них.

Выявлено, что активное увеличение факторов, способствующих персистенции у эшерихий, обратно пропорционально степени нарушений микроэкологии кишечника.

Обнаружено, что антилизоцимная активность эшерихий, колонизирующих нишу, в которой отсутствует тканевой лизоцим, создает преимущество в процессе конкуренции в биоценозе с целью антагонистической функции.

Практическая значимость работы заключается в ряде предложений при внедрении в медицинскую науку и практику:

- Установлены группы людей с нарушениями микроэкосистемы организмов, живущих в экологически неблагополучных районах города.

- Выявлены биологические характеристики эшерихий, являющихся чувствительными индикаторами антропогенно-техногенной нагрузки на окружающую среду.

Предложены рационализаторские усовершенствования по исследованию персистентных свойств эшерихий. Все они защищены авторскими удостоверениями патентного отдела ВолГМУ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Изменения колонизационной резистентности кишечника приводит к активации аутофлоры, что сопровождается расселением эшерихий на коже и слизистой оболочки полости рта и внутренних органах, при этом местом оживленного обмена бактериями с внешней средой являются биотопы кожи (кисти рук, лоб).

2. Наличие у эшерихий персистентных характеристик рассматривается как необходимая предпосылка для выживания этого микроорганизма в контакте с эффекторами гостального иммунитета, а сами факторы персистенции в качестве свойств, ответственных за адаптацию бактерий к условиям внутренней среды макроорганизма.

Апробация работы. Материалы исследования доложены и обсуждены на конференциях молодых ученых (2003, 2004, 2005, 2006), а также на научных сессиях Волгоградского государственного медицинского университета в 2003 - 2006 годы.

По материалам диссертации опубликовано 6 статей, 2 учебно-методических пособия для студентов, аспирантов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, обсуждения результатов и выводов, указателя литературы, включающего 295 источников, в том числе 201 отечественных и 94 зарубежных. Работа изложена на 115

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Лиманская, Ирина Васильевна

ВЫВОДЫ

1. Результаты проведенных исследований дали основание представить экологию эшерихий в популяции людей, живущих в крупном промышленном городе

2. Проведенное биологической типирование эшерихий свидетельствует о многовариантности этого микроорганизма. Частота обнаружения атипичных форм и факторов, способствующих патогенности и персистенции, тесно связаны с экологической напряженностью в исследуемых регионах.

3. Обсемененность эшерихиями различных биотопов макроорганизма зависит от состояния микроэкологии кишечника, нарушения которой способствуют колонизации этим микроорганизмом кожи, полости рта и внутренних органов, вызывая внекишечный эшерихиоз.

4. Эшерихии, вегетирующие на биотических и абиотических нишах в больничных стационарах, различаются по большому числу признаков, что является проявлением межпопуляционной изменчивости, вызванной адаптацией бактерий к существованию в больничной среде. Выраженность отклонения от типовых штаммов варьирует в широком диапазоне, ' что позволяет дифференцировать циркулирующие эшерихии больничные от внебольничных.

5. Сравнительный анализ персистентных свойств эшерихий продемонстрировал достоверно большую антилизоцимную активность у микроорганизмов, выделенных из микрофлоры людей, живущих в экологически неблагоприятных районах города.

6. Обнаружена высокая пенентрантность и выраженность экспрессии факторов персистенции у возбудителей эшерихиозов, выявлена их интегрированность в единый комплекс, характерный для условно-патогенных микроорганизмов.

7. Рост эшерихий в периодических культурах зависит от антилизоцимной активности бактерий; высокий уровень которой способствует их персистенции в макроорганизме. Начало экспрессии антилизоцимного признака у микроорганизмов ассоциируется с переходом бактериальных культур в фазу медленного роста.

8. Изоляты E.coli, полученные от пациентов с различной патологией содержали в составе своего генома как внехромосомные ДНК различного размера, так и гены различных энтеротоксинов кишечной палочки. Однако корреляция между наличием плазмидной ДНК и генами энтеротоксинов не выявлено.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Лиманская, Ирина Васильевна, Волгоград

1. Аваева С.М., Воробьева Н.Н., Курилова С.А. и др. Механизм ингибирования неорганической пирофосфатазы Escherichia coli ионами кальция // Биохимия. - 2000. - 65. - 33. - С.442 - 458.

2. Адгамагбетов К.Х., Горская Е.М., Бондаренко В.М. Транслокация кишечной микрофлоры и ее механизм // ЖМЭиИ. 1991. - №10. -С.74-78.

3. Акайзин Э.С. Исследование индуцированного автолиза E.coli М-17: Автореф. дис.канд.мед.наук.-Челябинск, 1989.-21 с.

4. Акайзин Э.С. Влияние рН среды на индуцированный автолиз популяций энтеробактерий // ЖМЭиИ. 1998. - №4. - С. 6 - 8.

5. Акайзин Э.С. Управляемая дезинтеграция популяций энтеробактерий: Автореф. дис.д-ра мед.наук. -М., 2000. 35 с.

6. Андреева Е.А., Костров С.В., Носовская Е.А. и др. Исследование влияния повышенного давления и измененной газовой среды на биологические свойства микроорганизмов // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2000. - №4. - С. 20 - 24.

7. Арутюнян Н.М., Лалаян А.А., Алексанян Ю.Т. Биологические свойства условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от больных и здоровых детей: ЖМЭиИ. 2001. - №2. - С. 124 - 125.

8. Ахмедов У.У. Циркуляция микроорганизмов в хирургических стационарах и их гигиеническое и эпидемиологическое значение: Дис. .канд.мед.наук. Душанбе, 2000. - 117 с.

9. Байбеков И.М., Мавлян-Ходжаев P.M., Ирсалиев Х.И. Взаимодействие индигенных и пристеночных микроорганизмов с клеткой слизистой оболочки пищеварительного тракта // Архив патологии. 1992. - Т.54. - №5. - С. 18 - 24.

10. Балута И.М. Морфологические варианты эшерихиозного энтероколита у детей раннего возраста // Медицина сегодня и завтра. 1999. - №3-4. - С. 13 - 15.

11. Баранов А.А., .Щеплягина JI.A. Экологические и гигиенические проблемы здоровья детей и подростков. М., 1998. — 329 с.

12. Баснакьян И.А. Холодовой шок у бактерий // Вестн. РАМН. — 2001. №3. - С. 18-21.

13. Белая О.Ф. Клинико-патогенетические, иммунологические и диагностические аспекты циркуляции в организме антигенов и токсинов энтеробактерий как факторов патогенности возбудителей при острых кишечных заболеваниях: Дис.д-ра мед.наук. — М., 1994.-426 с.

14. Белая Ю.А., .Белая О.Ф. Вирулентность энтеробактерий и иммунитет: Обзор // ЖМЭиИ. 1996. - №4. - С. 108 - 112.

15. Белокрысенко С.С. Этиологическое значение, экология и генетические механизмы формирования госпитальных штаммов бактерий семейства Enterobacteriaceae: Автореф. дис.д-ра мед.наук. М., 1993.-51 с.

16. Бембеева Е.С. Биологическая характеристика штаммов энтеробактерий, выделенных при пиелонефритах у детей: Дис.канд.мед.наук. Ростов н/Дону, 1998. - 111 с.

17. Бернасовская Е.П., Сельникова О.П. Этиологическое значение эшерихий в свете современных данных о факторах патогенности условно-патогенных энтеробактерий // Кишечные инфекции. -Киев, 1986.-Вып. 18.-С. 32-34.

18. Бидненко Е.М!, Ахвердян В.З., Крылов В.Н. Клонирование и изучение экспрессии гена cipl фага — транспозона D3112 Pseudomonas aeruginosa в гомологичном хозяине и в Escherichia coli // Генетика. 1996. - Т.32. - №7. с. 914 - 921.

19. Богданов М.Б., Черненькая Т.В. Влияние «антибактериального анамнеза» на устойчивость возбудителей // Клинич. Фармакология и терапия. 2000. - Т.9. - №2. - С. 33 - 35.

20. Бозиев В.Б. Антилизоцимная активность энтеробактерий: Автореф. дис.канд.биол.наук. Ростов н/Дону, 1995. — 16 с.

21. Большаков A.M., Черепанов Е.М., Акимова Е.И. О комплексной гигиенической оценке состояния окружающей среды и ее влияния на здоровье населения области // Гигиена и санитария. 1999. - №2. -С. 47-49. "

22. Бондаренко В.М. Общий анализ представлений о патогенных и условно-патогенных бактериях // ЖМЭиИ. 1997. - №4. — С. 20 — 26.

23. Бондаренко В.М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса // Ж.микробиол. 1999. - №5. -С.34-39.

24. Бондаренко В.М. «Острова патогенности» бактерий // ЖМЭиИ. -2001.-№4.-С. 67-74.

25. Бондаренко В-.М., Мавзютов А.Р., Агапова О.В. Сериновые протеазы грамотрицательных бактерий: структура, механизмысекреции и биологическая активность // Ж.микробиол. 2002. - №6. -С. 80-85.

26. Бондаренко В.М., Мавзютов А.Р., Габидуллин З.Г. Термостабильные энтеротоксины условно-патогенных представителей Enterobacteriaceae // ЖМЭиИ. 1998. - №3. - С. 104 -107.

27. Бондаренко В.М., Мавзютов А.Р., Golkocheva Е. Секретируемые факторы патогенности // ЖМЭиИ. 2002. - №1. - С. 84 - 90.

28. Бондаренко В.М., Петровская В.Г. Маркеры вирулентности условно-патогенных энтеробактерий // Актуальные проблемы нозокомиальных инфекций и лекарственной- устойчивости микроорганизмов. — Минск, 1986. — С. 33 34.

29. Борисова И.Э., Юркив В.А. Фимбрии Escherichia coli // Деп.рук. в ЦНИИ эпидемиологии. М., 1998. - 47 с.

30. Бочков И.А., Овчарова Н.М. Бактериальная колонизация и сукцессия у новорожденных в аспекте проблемы госпитальной инфекции // Ж. микробиол. 1991. - №8. - С. 71 - 75.

31. Брилис В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.П., Ленцнер А.А. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов // Лаб. Дело. — 1986. -34. С. 210-212.

32. Брудастов Ю.А. Антикомплементарная активность бактерий: Автореф. дис.канд.мед.наук. Челябинск, 1992. — 19 с.

33. Брудастов Ю.А. Механизмы уропатогенности бактерий // ЖМЭиИ.- 1998.-№6.-С. 93-98.

34. Брудастов Ю.А., Дерябин Д.Г. Биологическое значение антикомплементарной активности бактерий // Ж.микробиол. — 1994.