Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиоценоз толстого кишечника детей с диарейными заболеваниями в процессе лечения иммунным лактоглобулином

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробиоценоз толстого кишечника детей с диарейными заболеваниями в процессе лечения иммунным лактоглобулином"

На правах рукописи

Алексанина Наталья Владимировна

МИКРОБИОЦЕНОЗ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА ДЕТЕЙ С ДИАРЕЙНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ В ПРОЦЕССЕ ЛЕЧЕНИЯ ИММУННЫМ ЛАКТОГЛОБУЛИНОМ

03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук ,

Л

Москва- 1998

Работа выполнена в Ростовском научно-исследовательском институте микробиологии и паразитологии.

Научный руководитель: доктор медицинских наук

Соболева C.B. !

Научный консультант: кандидат медицинских наук

Король В.В.

Официальные оппоненты: заслуженный деятель науки РФ, доктор

биологических наук, профессор Щербакова Э.Г.

кандидат медицинских наук Пожал остина JI.B.

Ведущая организация: Ростовский научно-исследовательский

противочумный ин£титут.

Защита состоится «__»___1998 г в_|час

на заседании Диссертационного совета Д.084.18.01. при Московском научно-исследовательском институте эпидемиологии.и микробиологии им.Г.Н.Габричевского (125212, г.Москва, ул.Адмирала Макарова, д.Ю).

С диссертацией можно ознакомиться в библио*еке Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского.'

Автореферат разослан «_»__1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д.м.н.

Горская ЕМ.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Продолжающееся в последние годы ухудшение экологической ситуации, сложная социалыю-экономическая обстановка, широкое часто бесконтрольное применение населением антибиотиков и химиопрепаратов, воздействие других неблагоприятных факторов, приводит к изменению иммунологической реактивности организма и нарушению микроэкологии пищеварительного тракта, которое характеризуется резким снижением содержания представителей анаэробных бактерий и возрастанием пропорции в общем пуле микроорганизмов условно-патогенных бактерий и грибов. В силу морфологической и функциональной незрелости пищеварительной и иммунной систем наиболее подвержены подобным воздействиям дети раннего возраста, у которых нарушение баланса между организмом и его микрофлорой сопровождается различными клиническими проявлениями, среди которых наиболее распространены кишечные заболевания, сопровождающиеся диарейным синдромом (С.Д.Митрохин, 1990; А.А.Морунова, 1990; И.Б.Куваева, К.С.Ладодо, 1991; Б.А.Шендеров, 1987, 1994; O.II.Braun, 1988; A.Lidbeck et al., 1991).

Исследованиями последних лет установлено, что в этиологии диарейных заболеваний у детей раннего возраста важная роль принадлежит условно-патогенным энтеробактериям родов Proteus, Klebsiella, Citrobacter, Salmonella и их ассоциациям ( Е.П.Хубка и соавт., 1990; Э.Н.Симованьян и соавт., 1990; Г.А.Бокова, 1991; В.И.Кузнецов и соавт., 1991; Е.А.Семенова и соавт., 1993; H.E.Muller, 1989; P.Williams, J.M.Tomas, 1990).

В структуре сальмонеллезов превалируют заболевания, вызванные S.typhimurium (так называемыми «госпитальными штаммами»), однако в настоящее время увеличивается процент " других видов сальмонелл (В.И.Покровский и соавт., 1989; О.В.Нарвская, В.В.Бабков, 1990; Б.И.Маракуша и соавт., 1995; В.А.Петрюк и соавт., 1996; Л.Б.Хазенсон и соавт., 1996; I.S.Hyam et al., 1980; R.Helmuth et al., 1985; Gories Bradley D. et a!., 1994). : Условно-патогенные микроорганизмы, попадая в организм ребенка, способны вызывать инфекционный процесс благодаря наличию у них факторов патогенностй. К таким факторам относят способность к адгезии и колонизации кишечника, синтез энтеротоксинов, ферментов патогенносги, различные внеклеточные структуры, обеспечивающие селективное преимущество и лекарственную устойчивость (Ю.В.Е:епчук, 1985; С.С.Гизатулина il соавт.,

1988; Е.А.Семенова и соавт., 1993; Л.В.Пархоменко и соавт., 1993;

B.В.Высоцкий, 1994; В.М.Бондаренко и соавт., 1994, 1996; Ю.А.Белая, О.Ф.Белая, 1996; Ш .Тота$ & а!., 1986; Р.У/иЦатБ, Ш.Тотаз, 1990; 1Х.гаг8еп, 1992; 8.Опте!, А.БеПег, 1993; С.Ь.\Уе1Ь ЛаК, 1993).

Условно-патогенные энтеробактерии, вызывающие диарсйные заболевания, устойчивы к действию широкого спектра антибиотиков. В связи с этим применение последних в качестве этиотропных средств лечения малоэффективно, а также вызывает у детей раннего возраста нежелательные побочные реакции, приводит к дальнейшему формированию лекарственно устойчивых штаммов, снижению колонизационной резистентности кишечника, развитию дисбиозов (Б.В.Пинегин и соавт., 1984; А.МЛитяева, Е.С.Закопаева, 1989; А.М.Лянная, Э.П.Козлова, 1989; Л.Н.Милютина, Н.В.Воротынцева, 1993;

C.Е.Ыогс!, С.Е.Е<11ипа, 1991).

Сформировавшиеся'дисбиозы кишечника трудно поддаются лечению и для полного выздоровления, сопровождающегося нормализацией микрофлоры кишечника и восстановлением эубиоза, требуется длительное время. Используемые в настоящее время для лечения кишечных расстройств биологические препараты из микробов-эубиотиков, оказывают, в целом, благоприятный эффект, но требуют длительных курсов терапии и не всегда эффективны в остром периоде болезни (В.Г'.Дорофейчук и соавт., 1988; В.А.Новокшонова и соавт., 1994; В.М.Коршунов, 1995).

Учитывая, что число факторов, способствующих развитию заболеваний, сопровождающихся диарейным синдромом у детей раннего возраста велико и спектр их возрастает, разработка эффективных средств профилактики и лечения кишечных расстройств различной этиологии является одной из важнейших проблем современной медицины.

Коллективом авторов Ростовского-на-Дону НИИ микробиологии и паразитологии разработан и внедрен в практику здравоохранения новый класс безвредных, физиологичных, экологически чистых и высокоэффективных биопрепаратов - иммунных лактоглобулинов из молозива вакцинированных коров, основным действующим началом которых являются иммуноглобулины, адаптированные к пищеварительному тракту и обладающие антибактериальной активностью по отношению к целому ряду условно-патогенных энтеробак-терий. Эти разработки получили высокую оценку педиатров, коллектив авторов удостоен Государственной премии Российской Федерации в области науки и техники за 1996 год.

Являясь соавтором разработки второго препарата этого класса — лактогло-булина против условно-патогенных бактерий и сальмонелл, принимала участие в испытаниях препарата'на всех этапах его доклинического изучения на этапе государственных клинических испытаний. Итоги этой работы представлены в диссертации.

Цель исследования: охарактеризовать микробиоценоз толстого кишечника детей, больных диарейными заболеваниями, вызванными условно-патогенными энтеробактериями, в процессе лечения иммунным лактоглобулином, обосновать некоторые механизмы коррекции микробиоценоза кишечника препаратом.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи: ■ 1. Изучить специфическую антибактериальную активность препарата в эксперименте на животных и на клиническом материале.

2. Исследовать особенности качественного и количественного состава микробиоценоза толстого кишечника детей, больных диарейными заболеваниями, в динамике лечения лактоглобулином против условно-патогенных бактерий и сальмонелл.

3. Изучить динамику биологических свойств н факторов патогенности условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от детей до начала лечения и в процессе лечения препаратом.

4. Исследовать некоторые механизмы действия препарата на микробную клетку условно-патогенных энтеробактерий.

Научная новизна: Охарактеризованы факторы патогенности условно-патогенных энтеробактерий и сальмонелл при экспериментальной мопо- и ассоциированной сальмонеллезной инфекции, а также при диарейных заболеваниях у детей в процессе лечения препаратом - иммунным лактоглобулином. Выявлено значительное снижение токсигенных и вирулентных свойств, ДНК-азной и каталазной активности, повышение чувствительности к антибиотикам энтеробактерий, выделяемых в сроки, предшествующие полной элиминации возбудителя из организма. Показано, что утрата штаммами токсигенностн и повышение чувствительности к антибиотикам не связаны с элиминацией плазмид из бактериальной клетки.

Теоретическая и практическая значимость работы:

установлен высокий специфический антибактериальный эффект лактоглобулина в эксперименте, на разработанных пероралышх моделях моно-

и ассоциированной сальмонеллезной инфекций у животных, и на клиническом ма1ериапе;

в процессе лечения лактоглобулином против условно-патогенных бактерий и сальмонелл выявлено значительное снижение токсигенных и вирулентных свойств, ДНК-азной и каталазной активности, повышение чувствительности к антибиотикам выделяемых штаммов, с чем связана эффективность лечебного действия препарата;

показано, что утра га штаммами токсигенности и повышение чувствительности к антибиотикам не связаны с изменением плазмидного профиля бактериальной клетки;

полученные в результате работы данные о действии препарата на возбудителей инфекции вошли в отчет о государственных испытаниях препарата, обосновали критерии применения лактоглобулина, были использованы при составлении «Инструкции по применению лактоглобулина против условно-патогенных бактерий и сальмонелл».

Положения, выноснмые на защиту:

- Микрофлора толстого кишечника детей раннего возраста, больных диарейными заболеваниями, вызванными &.1урЫтипит, Р.уи^агй, Р.пигаЬПй, К.рпеитошае и их ассоциациями, характеризуется на фоне высокой высевае-мостн из кишечника детей возбудителей инфекции, нарушениями в микробиоценозе кишечника, характерными для 1-ой, 2-ой, 3-ей степени дисбактериоза.

под влиянием иммунного лактоглобулина штаммы условно-патогенных уробактерий - возбудители инфекций, выделяемые в сроки, предшествующие полной элиминации из организма, теряют токсигенность, снижается вирулентность, ДНК-азная и каталазная активность, повышается чувствительность к антибиотикам.

- у грага штаммами токсигенности и повышение чувствительности к антибио-шкам не связаны с изменением плазмидного состава бактериальной клетки.

Апробация работы. Материал диссертации доложен на II Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, апрель 1995 г.); всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию основания МНИИЭМ им. Габричевского «Дисбактериозы и эубиотики» (Москпа. март 1996 г.). Апробация диссертации проведена на конференции лаборатории микробиологии и разработки иммунобиологических препаратов

Ростовского-на-Дону НИИ микробиологии и паразитологии 15 октября 1996 г., а также на заседании Ученого совета РНИИМГ1 22 октября 1996 г.

Публикация материалов иссчедования. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Габога изложена на 159 страницах машинописного текста, иллюстрирована П рисунками и 34 таблицами. Список литературы включает 145 отечественных н 68 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В диссертации нашли отражение результаты работ, проведенных нами совместно с сотрудниками РНИИМП (В.С.Гугуева, Т.Л.Федорова, Л.Д.Минеева, А.П.Шепелев, В.В.Король, С.В.Соболепа). Клинический раздел выполнен педиатрами' кафедры детских инфекций под руководством д.мл., профессора Симованьян Э.Н.

В работе использован препарат - лактоглобулии против условно-патогенных бактерий и сальмонелл, изготовленный в Ростовском-на-Доиу НИИМП по ВФС - 42 - 404ВС - 93. Лактоглобулии представляет собой лиофилизированную фракцию комплекса иммуноглобулинов молозивной сыворотки вакцинированных коров, содержит антитела к сальмонеллам групп В и Д, K.pneumoniae, P.vulgaris, P.mirabilis, Ps.aeruginosa, Staph.aureus, ротавирусу, безвреден, нетоксичен, отвечает требованиям, предъявляемым к медицинским иммунобиологическим препаратам.

Экспериментальные исследования выполнены на 4600 белых беспородных мышах. Для воспроизведения моно- и ассоциированной сальмонеллезном инфекции у мышей использовали вирулентные штаммы S.typhimurium и P.mirabilis. На этапе государственных клинических испытаний лактоглобулина против условно-патогенных бактерий и сальмонелл проведено бактериологическое обследование 140 детей в позрасте от 0 до 3 лет, больных диареГшымн

g

заболеваниями. Изучение биологических свойств и факторов патогенности проведено на 204 штаммах условно-патогенных энтеробактерий родов Salmonella, Klebsiella, Proteus, выделенных от детей в процессе лечения лактоглобулином.

Экспериментальное изучение специфической антибактериальной активности лактоглобулина проводили на моделях моно- и ассоциированной сальмонеллезной инфекции у мышей, представляющих собой авторскую разработку.

Качественный и количественный состав микрофлоры фекалий детей изучали методом серийных десятикратных разведений с последующим высевом на плотные питательные среды, согласно методическим рекомендациям по диагностике и лечению дисбактериоза (М., 1986). Выделение патогенных и условно-патогенных бактерий и их идентификацию проводили с использованием широкого набора питательных сред и диагностических тест-систем.

Вирулентность штаммов изучали при внутрибрюшинном введении различных доз исследуемых культур белым мышам и оценивали по летальному исходу в LD50. LDjo рассчитывали по методу Кербера в модификации Ашмарина (1962). Способность продуцировать энтеротоксины изучали путем внутрибрюшинного введения культуральных жидкостей суточных агаровых культур животным (В.А.Ушаков и соавт., 1992). Активность энтеротоксинов оценивали в тесте отека лап белой мыши по Ю.П.Вартанян и соавт., (1978). Определение степени энтеротоксигенности условно-патогенных микроорганизмов проводили методом подавления дегидрогеназной активности УФ-мутанта Staph.aureus 209Р (Т.Э.Калинина и соавт., 1990).

Определение чувствительности к антибиотикам осуществляли методом диффузии в агар с помощью стандартных дисков, согласно соответствующей инструкции (1986), и методом серийных разведений (О.М.Биргер и соавт., 1982). Адгезивную способность бактерий определяли по методу В.И.Бриллиса и соавт., (1986). Изучение ДНК-азной активности микроорганизмов - по методу C.D.Jeffries et al., (1957), гемолитическую активность - на среде М-9, содержащей 1,5% агар Дифко и 3% дефибринированной крови (О.М.Черневская и соавт., 1991), протеолитическую активность учитывали по способности бактерий разжижать желатину (О.М.Биргер и соавт., 1982).

Для исследования профиля плазмидной ДНК использовали метод вертикального электрофореза в 0,7% агарозном геле (M.A.Serghini et al., 1989).

Определение каталазной активности энтеробактерий проводили по мсю ty Т.Н.Варвашевич и соавт., (1989).

Статистическая обработка материала проведена по методикам, изложенным в монографиях И.А.Ашмарин, Л.Л.Воробьев, (1962); Г.Ф.Лакин, ( 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Предварительное изучение специфической антибактериальной акшвиост я лактоглобулина и его влияния на возбудителей кишечных инфекций проводили на экспериментальных моделях мояо- и ассоциированной сальмонеллезной инфекции у мышей. Для этого нами были разработаны модели, которые позволяли воспроизвести моно- и ассоциированную сальмопеллечпую инфекцию различной тяжести, длительностью до 21 суток. В результате эксперимента установлено, что лечение лактоглобулииом в течение 7 дней уменьшало тяжесть и длительность течения диареи и блокировало дальнейшее развитие инфекционного процесса, способствовало эффективному и быстрому очищению организма животных от возбудителей инфекции. Изучение биологических свойств и факторов патогенности условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от животных на 7 сутки лечения препаратом, выявило снижение ДШС-азной активности у S.typhimuriimi, выраженное и уменьшении зоны деполимеризации нуклеиновой кислоты, усиление сахаролитических свойств у P.mirabilis, снижение в 5-7 раз вирулентных свойств энтеробактерий. Исследование степени энтеротоксигенности штаммов показало, что наблюдается значительное снижение количества шкеигенныч клонов в популяциях изученных культур у S.typhimurium с 92% до 44%, у P.mirabilis — с 87% до 5%, одновременно увеличивалось число нетоксигенных субкультур.

Таким образом, на экспериментальных моделях моно- и ассоциированной сальмонеллезной инфекции подтверждена высокая специфическая антибактериальная активность лактоглобулина, полученная нами ранее в опытах при внутрибрюшшшом заражении мышей. Лечение препаратом способствовало эффективному и быстрому очищению организма от возбудителен инфекции, снижению патогенных свойств энтеробактерий.

Полученные в эксперименте данные явились основанием -для дальнейшею изучения микробиологической эффективности применения лактоглобулина при лечении детей, больных диарейными заболеваниями, и его нлннннн на

качественный и количественный состав микробиоценоза толстого кишечника в клинических условиях. Испытания препарата проводили на 140 детях в возрасте от 0 до 3 лет, больных острыми кишечными инфекциями, вызванными условно-иагогеннымн энтеробактернями и сальмонеллами, на базе 2-го детског о инфекционного отделения БСМП №1 г.Ростова-на-Дону. Дети были нодрлделены на 2 группы в зависимости от характера лечения. Первая группа помимо традиционной симптоматической и, по показаниям, антибиотикотера-нии, получала лактоглобулнн. Вторая группа - базисную терапию. В обеих группах доминировали среднетяжелые и тяжелые формы болезни. Кишечная инфекция у этих детей в 28,6% случаев была вызйана S.typhimurium, в 33,6% случаев - К.pneumoniae, в 27,1% случаев — P.vulgaris и P.mirabilis. В 10,7% случаен ассоциированная инфекция характеризовалась выделением условно-патогенных энтеробактерий родов Klebsiella, Proteus, Citrobacter >i Enterobacter на фоне сальмонелле той инфекции.

Основными критериями микробиологической эффективности применения лактоглобулина явились сроки элиминации возбудителей инфекции и восстановления нормального микробиоценоза толстого кишечника детей в процессе лечения препаратом.

При бактериологическом исследовании у всех детей до начала лечения отмечалась высокая высеваемость из кишечника возбудителей инфекции в количествах lg 5-9 КОЕ/г. Анализ результатов применения препарата показал, что специфическое антибактериальное действие лактоглобулина на сальмонеллы и услоыно-пагогенные энтеробактерии, в подавляющем большинстве случаев, выявляется уже к 7 дню лечения, в то время как в контрольной группе детей подобный эффект наблюдали на 1-2 недели позже. К 21 дню от начала лечения лактоглобулином в первой группе детей специфический антибактериальный эффект был отмечен в 100% случаев. В контрольной группе детей, поручавших только базисную терапию, выделение возбудителей болезни у 3,3% де[ей продолжалось до 28-30 дня лечения. (Табл.1).

Таким образом, элиминация возбудителей инфекции в опытной группе наступала в 1,5 - 2 раза быстрее, чем в контрольной группе детей.

При исследовании состава микрофлоры толстого,кишечника детей, больных диарейными заболеваниями, в обеих группах до начала лечения, на фоне острой кишечной инфекции были выявлены нарушения в микробиоценозе, характерные для Н и III степени дисбактериоза в 69,3% случаев.

Дисбактериоз у детей характеризовался снижением уровня бифидобакгерий (у 61,4 %), лактобацилл (у28,6%), лактозоположителыюй кишечной палочки

Таблица !.

Динамика выделения услошго-патогенпых штеробактерчй и сальмонелл у детей с диарейными заболеваниями в про-

цессе лечения лактоглобулнном.

% детей, выделяющих возбудитель До начала лечения Сроки обследования

Группы Лии от начала лечения

3-5 7-10 14 21 28-30

Опытная п= 80 100 48,8+5,6 17,5 ±4,2 3,8±1,9 0 0

Контрольная п- 60 100 91,7J:J,7 46,6 i6.4 26,6+5,7 8,3+3.5 3,3+2.2

Р>0,05 Г<0,0()1 ¡'<0,001 j Р<0,001 Р<0,05 1»>0.05

(у 35%), выделением лактозоотрицателыюй и гемолизируюшей F-.coli (у 41,4%), Staph.aureus (у 29,3%) па фоне высокой высепасмости из кишечника детей возбудителей инфекции. Это позволило на основании данных бактериологических и клинических анализов при первичном обследовании у 30,7% детей (43) выявить дисбактериоз III степени, у 38,6% детей (54) - II степени, \ 30,7% детей (43) - I степени, что свидетельствовало о возникновении и развитии инфекционного процесса на фоне дисбактсриоза.

Применение лактоглобулина против условно-патогенных бактерий к сальмонелл сопровождалось наряду с более быстрой элиминацией возбудителей инфекции по сравнению с группой детей, леченных антибиотиками, положительной динамикой в составе фекальной микрофлоры детей, которая была обусловлена восстановлением аблигатной флоры (бифидо- и лактобакте-рий, лактозоположителыюй E.coli), элиминацией условно-патогенных микроорганизмов и Staph.aureus, нормализацией уровня кокковой флоры и грибов рода Candida. В то же время у детей контрольной группы, леченных антибиотиками и эубиогиками. улучшение в микробиоценозе толстого кишечника было менее выраженным и связано с элиминацией возбудителей инфекции, ростом количества бифидо- и лактобактерий в 10 -10' раз и частичной коррекцией аэробной флоры (рис.1 и 2).

Условно-патогенные энтеробастерии

БирИ-аигеиз

Лактозонегативная и гемолизнруюцая

Е.еоП

X

£

□ Опыт К Контроль

? О

5 ;

25

Рис. 1. Микрофлора кишечника детей в процессе лечения лактоглобулином X - Количество микроорганизмов КОЕ/г) У - Частота обнаружения (%)

Рис. 2. Микрофлора кишечника детей в процессе лечения лактоглобулином.

X - Количество микроорганизмов КОЕ/ г) У - Частота обнаружения (%).

Вместе с тем, стойкий нормобиоценоз у детей первой группы к окончанию лечения был достигнут у 62,5% детей, а во второй группе - лишь у 36,7% детей (Р<0,01). Анализ результатов исследования показал, что клинический эффект применения лактоглобулина несколько опережал процесс нормализации микрофлоры кишечника. Более быстрая нормализация всех клинических показателей и элиминация возбудителей инфекции у детей, леченных лактоглобулином, приводила к сокращению сроков пребывания детей в стационаре. В связи с чем, отсутствие полной нормализации микробиоценоза толстого кишечника у 37,5% детей первой группы связано, по-видимому, с короткими сроками лечения препаратом (7-10, а в отдельных случаях 5 суток) к выпиской детей из стационара при нормализации всех кчинических показателей и элиминацией возбудителей инфекции.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что микробиоценоз толстого кишечника детей, больных диарейными заболеваниями, характеризуется на фоне высокой высеваемости из кишечника возбудителей инфекции нарушениями, характерными для 1, 2, 3 степени дисбактериоза. Лечение лактоглобулином обеспечивало эффективную элиминацию из кишечника возбудителей инфекции и способствовало быстрой и стойкой нормализации микрофлоры толстого кишечника детей.

Наряду с изучением количества фекальной микрофлоры детей, больных диарейными заболеваниями, с целью изучения влияния лактоглобулина на микробную клетку возбудителей инфекции, нами были исследованы биологические свойства и факторы патогенности 204 штаммов условно-патогенных энтеробактерий родов Salmonella, Proteus, Klebsieila, выделенных от детей в процессе лечения препаратом. Все культуры, выделенные от детей до начала лечения были типичными по морфологическим, серологическим, биохимическим свойствам, обладали высокой гемолитической и протеолитической активностью, все изученные штаммы S.typhimurium и 63,3% штаммов K.pneumoniae образовывали ДНК-азу, 65,4% Proteus обнаруживали лецитиназ-ную активность. Все исследованные штаммы обладали средне- и высокоадгезивными свойствами, продуцировали энтеротоксины: S.typhimurium - ТЛЭ 100% и ТСЭ 81,3%, K.pneumoniae - ТЛЭ 100% и ТСЭ 4,1%, B.proteus - ТЛЭ 100% и ТСЭ 7,7%, обладали множественной лекарственной устойчивостью.

Анализ данных по изучению условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от детей до начала лечения и в процессе лечения лактоглобулином, выявил существенные различия в частоте обнаружения некоторых признаков

пагогенности. Так, были отмечены различия в частоте обнаружения ДНК-азоположительных штаммов у S.typhimurium в 1,3 раза (100% до начала лечения и 80% на 3-5 сутки лечения лактоглобулином), а среди К.pneumoniae -в 3 раза (68,2% и 27,7% соответственно). При этом, были обнаружены не только количественные, но и качественные различия в активности образуемого энгеробактериями фермента ДНК-азы, выраженные в уменьшении зон деполимеризации нуклеиновой кислоты. У штаммов S.typhimurium до лечения диаметр зон деполимеризации ДНК в среднем составлял 8,8+0,3 мм, у штаммов K.pneumoniae — 7,3+0,3 мм, а у культур, выделенных в процессе лечения препаратом, составил в среднем 6,2+0,3 мм и 5,7+0,3 мм соответственно. Различия статистически достоверны (Р<0,01).

Учитывая ведущую роль энтеротоксинов в патогенезе диарейных заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, изучили токсигенные и вирулентные свойства энтеробактерий. В результате выявлены существенные различия в частоте обнаружения штаммов, продуцирующих термолабильный и термостабильный эитеротоксины. Установлено, что после воздействия лактоглобулином культуры либо теряют способность продуцировать токсины, либо происходит статистически достоверное ее снижение, в 4-6 раз снижается вирулентность штаммов. Изучение степени энтеротоксигенности условно-патогенных энтеробактерий показало, что в процессе лечения препаратом происходит значительное снижение числа токсигенных клонов в популяциях всех изученных культур с 98-82% до 52-37% на 3-5 сутки лечения и до 32-15% на 7 сутки лечения. Утрата штаммами токсигенности подтверждена в тесте отека лап белой мыши.

Одним из важнейших механизмов, обеспечивающих колонизацию кишечника условно-патогенными микроорганизмами, является адгезия. К настоящему времени имеются литературные данные об антиадгезивном действии молочных иммуноглобулинов (МисниковаМ.А., 1980; Magnusson К., 1978; Svanborg-Eden.,1978), а также о влиянии противоколипротейного лакгоглобулина на колонизирующую способность патогенных микроорганизмов, в частности, E.coli Olli, с чем автор связывает один из механизмов лечебного действия препарата (Конюхова H.A., 1987). В связи с этим изучили адгезивные свойства энтеробактерий, выделенных от детей до начала лечения и в процессе лечения лактоглобулином. Анализ результатов исследования существенных различий не показал. Это позволяет заключить, что лактоглобулин не влияет на адк-шнм самих микроорганизмов, а его антиадгезчвиое действие, вероятно, заключимся

в том, что блокируя рецепторы на слизистой оболочке кишечг.ика, препятствует прикреплению и вторжению в нее инфекционных агентов.

Все изученные штаммы обладали ферментом каталазой. Выявлено статистически достоверное снижение.в 1,5-2 раза каталазной активности энтеробак-терий, выделенных от детей в процессе лечения лактоглобулином.

Таким образом, в результате исследования воздействия лактоглобулина на возбудителей диарейных заболеваний у детей в эксперименте на животных и на клиническом материале установлено негативное влияние препарата на условно-патогенные энтеробактерии, которое проявляется в снижении их патогенности для человека и животных перед элиминацией из организма больных.

Подходя к обоснованию механизмов действия препарата на микробную клетку условно-патогенных энтеробактерии исследовали 3 штамма БлурЫтипит, 1 штамм Р.уи^апэ и по 2 штамма 3.еп1егШсПз, К.рпеитошае, Р.гтгаЬШз в условиях длительного воздействия на них лактоглобулина. Провели 21 пассаж культур в препарате и изучили некоторые свойства энтеробактерии на популяционном уровне. Так, сравнение морфологии исходных и пассированных в лактоглобулине штаммов показало, что наблюдается переход культур из Б- в Я-форму. При этом, отмечено статистически достоверное снижение в 5-14 раз вирулентных свойств И-ьариантов в сравнении с исходными Б-вариантами. Все исследованные штаммы теряли к 21 пассажу способность продуцировать энтеротоксины. Изучение степени энтерогоксигенности этих микроорганизмов показало значительное снижение числа токсигенных клонов уже через 5 пассажей в лактоглобулине с 98-82% в популяциях исходных штаммов, которое к 21 пассажу уменьшалось до 0%, а количество нетоксигенных клонов возрастало до 100%. (рис. 3.). Известно, что условно-патогенные микроорганизмы - возбудители диарейных заболеваний у детей, в отличие от представителей нормальной микрофлоры кишечника, обладают множественной лекарственной устойчивостью, которая определяется рядом факторов. Определение чувствительности 204 штаммов условно-иагогенных энтеробактерий, выделенных от детей в процессе лечения лактоглобулином, к различным по механизму и спектру действия антибактериальным препаратам методом дисков выявило повышение чувствительности штаммов к тетрациклину, аминогликозидам, левомицетину и полимиксину. Эти данные получили дальнейшее подтверждение и подверглись детализации при изучении чувстшпелыюст методом серийных разведений. Так, исследование ашибиогикоренкмешносги проведенных через лакюглобулин энтеробактерии,

% S.typhlmufium 120

100 80 60 40 20 -\ 0

О 5 10 15 21

% K-pneumoniae 120 -i

100 80 во

40

20 -I О

120 100 80 -60 -40 20 О

P.mirabUia

к 1

4 V Пассажи

О 5 10 15 21

Рис. 3. Избирательное действие лактоглобулина на токсигенные клоны энтеробактерий.

/

обнаружило общую тенденцию к ее снижению. При пассировании штаммов в препарате наблюдали повышение чувствительности к тетрациклину, аминогликозидам, левомицетину и полимиксину в 2-8 раз. Полученные данные свидетельствуют о том, что лактоглобулин опосредованно принимает участие в ингибировании резистентности к различным по химическому составу и механизмам действия антибиотикам в разной степени. МГЖ (минимальная подавляющая концентрация) ряда антибиотиков значительно снижается после действия лактоглобулина на микробные клетки. Однако, не выявлено снижение резистентности у культур к определенному типу антибиотиков, а лишь отмечена общая тенденция повышения чувствительности всех исследованных штаммов к взятым б опыт антибиотикам. Полученные результаты позволяют объяснить установленное в клинике повышение эффективности антибактериальной терапии детей с ОРВИ и сепсисом при применении антибиотиков в сочетании с лактоглобулином, за счет снижения устойчивости условно-патогенных энтеробактерий к действию антибиотиков.

Несомненный интерес вызывает и факт снижения каталазной активности энтеробактерий. Как известно, каталаза играет значительную роль в обеспечении антиоксидантной защиты бактерий, катализируя реакцию разложения перекиси водорода (Е.Б.Мельникова и соавт., 1994; 0..1.Е\ут£, 1987). Изучение каталазной активности пассированных в лактоглобулине штаммов на популяционном уровне выявило динамичное снижение процента клонов, сохраняющих каталазную активность на уровне исходных штаммов, которое к 21 пассажу достигает максимума (у всех 100 изученных клонов каталазная

активность снижена) (рис. 4.).

Снижение каталазной активности условно-патогенных энтеробактерий уменьшает, по-видимому, защиту последних от фагоцитоза, что способствует повышению завершенности фагоцитоза при применении лактоглобулина, выявленное в клинике.

Таким образом, установлено, что основные изменения при воздействии лактоглобулина на микробную ютетку условно-патогенных энтеробактерий связаны с потерей штаммами токсигенности и снижением резистентности к антибиотикам. Поскольку эти факторы у микроорганизмов, согласно данным литературы, кодируются плазмидамк, был изучен плазмидный профиль штаммов. Изменения токсигенных свойств и степени резистентности к антибиотикам у исследованных культур могли быть связаны с элиминацией

Рис. 4. Популяционная неоднородность по каталазной активности условно-патогенных энтеробактерий после пассажей в лактоглобулине.

Примечание: по оси абсцисс - дни пассажей культур в лактоглобулине, по оси ординат - % клонов, сохраняющих каталошую активность на уровне исходных штаммов.

плазмид из бактериальной клетки, ответственных за данные признаки. Однако, изучение плазмидного профиля проведенных через лактоглобулин штаммов, не выявило различий в структуре плазмидной ДНК между пассированными и исходными штаммами. Не наблюдалось изменений в молекулярном весе этих внехромосомных репликонов, лишь подтвердилось наличие плазмид и их спектр. Это свидетельствовало о том, что утрата штаммами токсигенности и повышение чувствительности, к антибиотикам не связаны с изменением плазмидного состава бактериальной клетки. • •

Учитывая переход культур из Б- в Л-форму можно предположить, что при пассировании культур в лактоглобулине он действует на клеточную стенку бактерий, изменяя ее структуру и проницаемость. Это подтверждают данные литературы о том, что И-формы бактерий имеют дефектные оболочки, связанные с изменениями в О-специфичности и обладают меньшей патогенно-стыо (Ю.В.Галаев, 1983), становятся чувствительными к различным агентам, включая лнзоцим, антибиотики. Имеются данные, что за увеличение проницаемости клеток и повышение чувствительности к антибиотикам в основном ответственны изменения во внешней мембране и потеря связанных с ней лнпополисахаридов. Липополнсахариды грамотрицатсльных бактерий

являются главными детерминантами, определяющими чувствительность клеток ко многим антибактериальным агентам (Т.Франклин, Дж.Сноу, 1984; Л.Б.Бриан, 1984). Возможно этим можно объяснить снижение токсигенных и вирулентных свойств и повышение чувствительности к антибиотикам энгеробактерий после воздействия лактоглобулином.

Таким образом, проведенными исследованиями показано, что лактоглобу-лин против условно-патогенных бактерий и сальмонелл является высокоэффективным средством этиотропной терапии диарейных заболеваний и дисбакте-риоза у детей. Эффективность лечебного действия препарата связана с наличием специфических антител, защитное действие которых носит характер блокирующих), антиадгезивного, антиэнтеротоксического действия и направлено на элиминацию возбудителей инфекции из кишечника. Лечение детей иммунным лактоглобулином способствовало быстрой и стойкой нормализации микробиоценоза толстого кишечника.

ВЫВОДЫ

1. Микробиоценоз толстого кишечника детей, больных диарейными заболеваниями, вызванными S.typhimurium, К.pneumoniae, P.vulgaris, P.mirabilis и их ассоциациями, характеризуется высокой высеваемостью возбудителей инфекции на фоне нарушений микрофлоры, характерных для I, II, III степени диебактериоза. ' 1

2. На -экспериментальном и - клиническом материале выявлен высокий специфический антибактериальный эффект лактоглобулина. Установлено, что применение препарата обеспечивает в 1,5-2 раза более быстрое выведение из организма возбудителей инфекции, чем при лечений,; антибиотиками.

3. Применение лактоглобулина против условно-патогенных бактерий и сальмонелл при лечении больных диарейными заболеваниями способствует быстрой и ртойкой нормализации микробиоценоза толстого кишечника и оказывает благоприятное влияние на характер симбионтных отношений микроорганизмов, колонизирующих толстый кишечник детей.

4. Штаммы энтеробактерий, выделяемые из кишечника детей в процессе лечения лактоглобулином, характеризуются потерей токсигенности, снижением вирулентности, ДНК-азной и катапазной активности, повышением чувствительности к антибиотикам.