Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Лантоглобулины направленного действия (микробиологические аспекты разработки и клинического применения препаратов)

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Лантоглобулины направленного действия (микробиологические аспекты разработки и клинического применения препаратов)"

¿Ж!СШ>СТБО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСК? РОСТОВСКИЙ ОРДЕНА ДРУЖЕН К1Р0Д&3 МВДЩИНСНЙ! ИНСТИТУТ

На правах рукзпиди.

Соболева Светлана Васильевна

ЛАКТОГЛОБУЛИНЫ НАПРАШШЮГО ДЕЙСТВИЯ (МОНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РАЗРАБОТКИ И КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМ2НЫ!ИЯ ПРЕПАРАТОВ).

03.00.07 - шкргбпологая

Диссертация в формз научного доклада на соиояажо ученой степе::И локтора

• медицинских наук.

Ростов-на-Дрну 1991

Работа выполнена з Xboi-^cKO» неучко-иеслрдоратальскон институте шшробиозопш я па.г^члто.чогш! ШО "Биопрепарат"

Офацйальннэ опг.ононти: доктэу медаданеккх кяук, cr^pr-Ul шучныЗ с о'¿'руд-! к Пзльнова Г.А., доктор медицине ккас ноуя, профессор Г«пезко Х.П.,

доктор цедицияекзи наук, профессор Грачега H.H.

Еедуцзд организация: Ростомкий ннучно-чседсугздгзльодо!)

прэизво'туынн* '«статут,

Залита состоится ЯМ&суьА 1992 г. з /<9 часов к а заседании спеццал5:з::ра санного соиета Л CS4.53.0I яра Ростовском ордзиа ДрулС-м народов ыздмулшои института (344713, РостаДону, НгэтшэпанскиЯ пер., 29).

' С диссертацией аоано агкакочиться в библиотеке >! з.п.'! цм i с у.о ¡ о лис та тут а.

Автореферат разослан - -iCh J/tfa/JiJ, 1991 г.

Ученый секрэтарь сп ецн ал п зи ро saimo го сосета, доцент

Н.Я.К0РГА1ЮВ

0В)1АЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ.

Актуальность проблема. Да настоящего времени остается пасокой заболеваемость детей раннего возраста кишечными инфекция!!?., вызванными энтерюпатогенными оперихиямн, сальмонеллами, клебсио.^-лаки, псездоюнадауи, протеем, другюлИ условно-патсненними знтз-робактеригми и ассоциациями этих микроорганизмов (Г.А. Тимофеева, Л.А.Антонова, 1985; Н.В.Воротшцева и соавт., 1987; Д.Б.Королева и соавт., 1987; Н.Н.Ваганов, 1988; С.С.Гизатулина и соазт.,1988; О.Е.Сергеев, Н.и.Головина, 1939).

В большом проценте случаев килечные инфекции у детей раннего созраста возникают на фоне или сопрэсоядыотся днсбактеркозом кишечника, который усугубляет течение основного заболевания.

Анатомические особенности и функциональная незрелость яелу-дочно-кишечного тракта новорожденных и детей раннего созраста, неполноценность их иммунной системы способствует т.ткелому клиническому течению ккиечкых инфекций и высокой летальности (В.В. ГаЕр:~-шоа, К.А.Сотникова, 1965; Л.А.Гульман и соавт., 1385; В.АД'азурнн, И.П.Воронцов, 1986; Н.Н.Володин и соив?., 1987).

Антибиотики и химиопрепараты, применяемые в качестве этнотроп-ных средств лечения кишечных инфекций, малоэффективны в связи с тем, что условно-патогенные эчтеробахторпи - возбудители диарей-ньк заболеваний, как правило, обладают широкой лекаре таенной ус-то йчивостьо.

Антибиотики и химиопрепараты не безвредна для организма ребенка, вызывают нежелательные побочные реакции, приводят к дальнейшему формированию антибкотикорезистентных штачмов-шкроорганиз-моз и развитию дмсбактериоэа. Бактерийные препараты из ¡лкробо^ зубиотиков, используемые для лечения дисбкотических состояний, требуют длительных курсов терапии и малоэффективны при дисбактериозах, сопровождающихся, массивным выделением протея. (Г.А.Тимофеева, 1984;

- 21984; Л. И. Черныше аа и со авт., ISB8; 0.Е.Сергеев,И.М. Голо вина, 1939)

Все вышесказанное определяет актуальность разработки безвредных и эффективных средств лечения к профилактики дмаройньк заболеваний у детей раннего возраста.

В этом аспекте перспективным направлением представляется разработка нового класса иммунных препаратов перор&льиого применения из молока и молозива коров. Основным действующим началом препаратов являются иммуноглобулины, которые в процессе эволюции выработали устойчивость к протеолнтическим ферментам, благодаря чему сохраняют антибактериальную и антитоксическую активность ка протяжении всего желудочно-кишечного тракта ребенка ( т. To^iaal et all., 1965; W. Kirsch, 1970; Ь. Kill et all,, 1974).

Теоретической ochodoü разработки и применения препаратов лак-тоглубулинов для лечения и профилактики кишечных заболеваний у детей раннего возраста является, с одной стороны, признание ведуксЯ роли в патогенезе этих заболеваний местных патологических процессов в стенке кишечника, а с другой - большее значение грудного вскармливания в формировании иммунитета новорожденных, в становлении нормального биоценоза кишечника и пассивной защите его от инфекционных агентов (Л.Б.Хазенсон, I9S9; В.И.Ермолов и соавт.1970).

По заданию ГК СМ СССР по науке"и технике да 334 от 24.06.75 г. под руководством и при непосредственном участии автора была разработана технология получения протнвоколипротейного лактоглобулкна в экспериментально-производственных условиях.

Для организации производственного выпуска этого препарата, внедрения его в практику здравоохранения, разработки новых препаратов лактоглобулинов направленного действия необходимо было решить ряд вопросов. Требовали существенной доработки способы получения иммунного сырья, обоснования критерии отбора атамнов для конструирования ассоциированных вакцин, уточнения оптимальные пара-

нетры производства и выпуска препаратов. Необходимо было определить и обосновать сф-зрц применения препаратов лактоглубултюв, изучить возможность обогащения ла.чтоглобулином молочных смесей для искусственного вскарнллвания детей с целью профилактики у них кишечных инфекций и дисбактериоэа.

Решение указанных вопросов имеет важное значение как в теоретическом, тая и в практическом плане, для определения принципиально новых подходов к лечению и профилактике кишечждс заболеваний у детей раннего возраста.

Цель исследования - теоретическое и экспериментальное обоснование разработки, производственного получения и применения энте-' ральных препаратов лактоглсгбулнноЕ для лечеки.я н профилактики наиболее распространенных кишечных инфекций и дисбактериоэов у детей посгнатального и раннего возраста.

В задачи исследования входило:

Г. Разработать методические подходу к кокструироволиэ вакцлч отработать технологию получения вакцин, способы и схе.ты иммунизации ими живо тньх-продуцентов с целью получения икмукного сырья.

Обосновать оптимальные технологические параметры проявленного производства и выпуска препаратов лактоглобулинов чапра?-ленного действия.

3. Оценить результаты клинической и бактериологической эффективности применения лактоглобулинов для лечения колиинфзкции, езль-монеллеза, кишечного дисбактериоэа.

4. Изучить возможность обогащения лактоглобулином иолочньк продуктов детского питания и оценить эффективность их применения для профилактики и лечения диарейних заболеваний у детей раннего возраста.

5. Изучить некоторые механизмы дей-твкя разработанных препара-

тов, как новых средств этиотропной терапии.

Диссертация выполнена по основному плану научно-исследовательских работ Ростовского НИИ эпидемиологии, микробиологии, паразитологии и гигиены в соответствии с заданиям! 2.11.03 научно-технической программы ПШТ СССР на IS8S-I9S0 годы 0.38.06, утвержденной 30.10.85 № 556, "Комплексной программой работ по усилению профилактики заболеваний и укрепления здоровья населения СССР на 1985-1990 г.г. (5.2.9 и II.18.24), по проблеме "Стандартизация медицинских иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики инфекционных болезней".

Исследования и разработка препаратов выполнялись под руководством и при личном участии автора с 1975 по 1990 год.

Научная новизна работы. Впервые в стране и за рубелом разработана и внедрена в практику здравоохранения промышленная технология получения безвредных и высокоэффективных препаратов лактоглобу-линов из молозива коров для лечения и профилактики острых кишечных инфекций и дисбактериоза у детей раннего возраста, обоснованы сферы применения препаратов.

Разработаны высокоиммуногенные ассоциированные вакцины, включающие штампы патогенных и условно-патогенных энтеробактерий - возбудителей диарейных заболеваний, спсгсобы и схемы иммунизации ими животных-продуцентов с целью получения иммунного сырья для промышленного производства препаратов лактошлобулинов направленного действия. Установлена возможность значительного усиления выработки специфических антител в молочной железе 'коров при внутримышечном способе вакцинации глубокостельнкх животных.

Разработаны эрптроцитарные моно диагностикумы на основе ЛЛС комплексов вакцинных итаммов, способ их стабилизации и высокоэкономичный микрометод реакции пассивной гемагглютинации для контроля специфической активности препаратов.

Впервые установлено, чю однии из механизмов действии лакю глобулинов, приводя^«: к нормализации биоценоза кишечника, является избирательное действие препаратов на токснгенныз клоны эн-теробактерий.

Решена проблема обогащения молочных продуктов детского пита ни я для грудных детей групп риска молознвньши иммуноглобулинами в виде биологически активных добавок (ЕАД-ИГ, ВЩ-ИГЛ). Теоретически и экспериментально обоснована возможность введения лактслми булина в БАД совместно с лизоцимом, лактобектернями и бифидобак-терияш.

Новизна исследований подтверждена авторскими свидетельствами на изобретения:

1. "Способ лечения протейного дисбактарчоза" (;? 1266543).

2. "Способ моделирования дисбактериоза у крыс" (№ 1363291).

3. "Способ получения нетоксигекных субкультур бактерий рода У1Ь: и

или Аеготопао " (№ 1440026 "Т").

4. "Способ стабилизации О-эритроцитарпых диапюстикумов"

(» 1648173 "Т").

5. "Способ получения лактоглобулина (положительное решение

№ 472305/14 "Г).

Практическая значимость работы: определяется разработкой и ьпг;,1 рением в практику здравоохранения нового класса безвредных и коэффектиЕНЫх средств этиотропной терапии киаечных ьаболяваний у детей раннего возраста, разработкой и внедрением биологически активна добавок с лактоглобулином длп обоглщения продуктов детского питания детей групп риска.

Основные положения, яыносимые на защиту: I. Разработанные на основании проведенных исследований аесо циирсванные вакцины из штатов патогенных и условно-патогенных знтсробактегий, при внутримышечном ппеяении глубокостельннм коро-

-Б -

вам, обеспечивают выработку высокого уровня специфических антител . в молозиве растелившихся коров, что дает возможность пром'¿шлейного получения из него нового класса биопрепаратов - иммунных лакто-глобулинов для этиотропной терапии и профилактики ккшечних заболеваний у детей раннего возраста.

2. Препараты - иммунные лакто глобулины за^цаат экспериментальных животных от заражения вирулентныш штаммами патогенных и условно-патогенных энтеробактерий, входящих в состав ассоциированных вакцин, обладают антитоксическим эффектом, избирательно действуют на токсигенные клоны энтеробактерий, способствуют селекции нетоксигенных клонов.

3. Препараты лактоглобулинов при пероральноы введении детям раннего возраста, больным кишечными инфекциям и дисбактериозом, безвредны, нетоксична, способствуют восстановлении нормального биоценоза кишечника ребенка, высокоэффективна.

4. Целесообразно использовать препараты лактоглобулинов, в виде биологически активных добавок (ЕАДЬ для обогащения молочных продуктов, предназначенных для искусственного вскармливания недоношенных и детей раннего возраста групп риска по заболеваемости кишечными инфекциями и дисбактериозом.

Внедрение. I. Издан Приказ МЗ СССР о разрешении применения противоколипротейного лактоглобулина в практике здравоохранения № 12 от 5.01.87 г.

2. Утверждены Фармкомитетом МЗ СССР 29.05.90 г. ФС-42-328 ВС-90 на противоколипротейный лактоглобулин коровий сухой для эн-терального применения и "Инструкция по применению препарата".

3. Освоен серийный промышленный выпуск противоколипротейного лактоглобулина на 03П НПО "Ростэпидкомплекс" (1990). Утвержден РП № 328-91. Препарат внедрен в лечебные учреждения страны, направляется в первую очередь в зоны экологического бедствия (в об-

ласта, пострадавшие от Чернобыльской аварии и Алтайский край).

4. Утверждены ТУ 10.02.02 и "Технологическая инструкция" на добавки сухие молочные биологически активные для детского питания ССоюзконсервмолоко" 29.11.89 г.). Освоение серийного выпуска ЕАД--ИГ осуществляется на Омутнинском химическом заводе ПО "Восток".

5. Изданы методические рекомендации "Применение биологически активных добавок к детскому питанию". Й., 1988 (утв. 13 СССР 8.09. 88, № 11-4.3/5-33).

6. ВФС и ЭПР на лактоглобулкн против условно-патогенных бактерий и сальмонелл представлены в Комитет по МИШ ¿13 СССР 9.07.90г., находятся на рассмотрении.

7. Утверждена Комитетом по МИЕП ИЗ СССР программа государственных испытаний лактоглобулина против условно-патогенных бактерий и сальмонелл. Испытания проводятся на клинических базах Ленинградского НИИ детских инфекций, ЦОЛИУВ, института педиатрии и детской хирургии МЗ РСФСР, кафедры детских инфекций Ростовского медицинского института.

Апробация работы. Материалы диссертации долокенн и сбсулж на Северо-Кавказской конференции "Актуальные проблемы им^унологги, аллергологии и молекулярной биологии" (1978), на У научной конференции Дагестанского ПИ, Северо-Корказского центра высшей пколы, Проблемной комиссии по иммунологии и иммунопатологии л!3 РО*СР (1979), на У1 Всесоюзном симпозиуме по физиологии и биохп.ши лактации (1982), на Всесоюзном симпозиуме, посвященном 60-летию Тбилисского ШИВС: "Актуальные вопросы бактериофагии и прикладной иммунологии" (1984), на заседании Ростовского отделения Всесоюзного микробиологического общества (1935), на областной конференции "Проблемы медицинской и санитарной бактериологии" (1987), на Ш съезде детских врачей .Узбекистана (1988), на заседании Союзной проблемной комис-

- в -

■ ни института питания АМН СССР (1986), на Всесоюзной научной конференции с международным участием "Питание: здоровье к болезнь",

(1990), на координационных совещаниях в ГКНТ СССР по проблеме обогащения продуктов питания для детей первого года жизни защитными (■акторами (1982, 1983, 1984, 1985, 1986).

Апробация диссертации проведена на заседании Ученого Совета НПО "Ростэпидкомплекс" 27 декабря 1990 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 28 научных рчбот.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТУ.

Материалы и методы исследования. В связи с многоплановостью «•"■-следований работ?* велась в комплексе .с различными специалистами. В диссертации нашли отражение результаты работ, проведенных нами совместно с сотрудниками лабораторий лактоглобулинов, микробиологии кишечных инфекций, холеры Ростовского.РНИИЭМПГ НПО "Ростопид-комплекс", лабораторией биологии бифидобактерий МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского, лабораторией контроля и стандартизации вакцин и вакцин-п'к препаратов ГИСК им.Л.А.Тарасевича, Нижегородским НИИЭМ, ВНИИВС им.И.И.Мечникова, Институтом питания АМН СССР, ВНИИД1 (г. Истра), непиатрами клиник Ростовского и Саратовского медицинских институтов, Центрального института эпидемиологии МЗ СССР, ЦОЛИУВ, Института п?лиатрии и детской хирургии МЗ РСФСР, Ленинградского НИИ детских инфекций, а также рядом лечебно-профилактических учреждений г.Ростова и Ростовской области.

Для решения поставленных задач объектами исследования служили

■ Г- штаммов эгперихий, протея, сальмонелл, клебсиелл, псевдомонад;

".егиГ! колипротейной вакцины и вакцины из условно-патогенных баки сальмонелл; 46 экспериментальных и 240 производственных с^'Г ниепарвюв лактогяобулинов из молозива 5700 коров, идауни-

зировашых ассоциированный! вакцинами; 12 серий биологически активной добавки с лактоглобулином (ВАД-ИГ), с лактоглубулииом и лизоцимом (ЕАД-ИГЛ).

Экспериментальные исследования выполнен!! на 15000 белых мышей, 350 белых крысах, 220 кроликах, в том числе крольчатах-сосунках. На этапах клинической апробации препаратов и ЕАД проведено клинико-бактериологическоС обследований 579 детей раннего возраста (от I мес. до 1,5 лет) с диагнозом колиинфекция, дисбактериоз, протейная инфекция, 30 детей с диагнозом сальмонеллез, 150 новорояден-иых и детей первых месяцев ??изки с диагнозом сепсис, пневмония, ОРВИ, 210 недоношенных, новорожденных, детей раннего возраста с различной патологией.

Выделение и исследование патогенных и условно-патогенных зн-теробактерий осуществлялось с использованием широкого набора питательных сред и диагностических тест-систем. Вирулентность штаммов изучалась при внутрибрюшинном введении различных доз культур белым мышам и оценивалась по летальному исходу в W^q, иммукоген-ность штаммов и вакцин оценивалась по защитному эффекту от вьутри-брюишного заражения белых мышей 4-5 соответствующих штам-

мов на 10 день после предварительного подкожного введения этим г\-вотным различных доз убитой нагреванием культура или ассоциированной вакцины, выраналась в ЕД^. ЬД^ и Ii<%o рассчитывались по методу Цербера в модификации И.А.Аимарина (I96'i). Способность штаммов продуцировать энтеротексины и токсиннейтралисующее действие препаратов оценивались на модели перевязанной петли кролика ( De S.N. Chatterje D.N. , 1953).

Определение степени энтеротоксигенности условно-патогенных микроорганизмов при пассажах в лактоглобулине проводили методом подавления дегидрогеназной активности УФ-мутанта Staphylococcus aureus ¿09Р. (Т.Э.Калинина, Л.Н.Терновская, И.Т.Андрусенко и соавт., 1У90).

Исследование специфической антибактериальной и антитоксической активности сырья и препаратов осуществляли макро и микрометодами РПГА, ИФА, определение количества иммуноглобулинов методом радиальной имыунодиффузии по 1.1анчини, количество лизоцима по методу Б.И.Сто гний в нашей модификации. Защитное действие вакцин и препаратов изучали на экспериментальных моделях.

Клинические исследования выполнены по программам, составленным нами совместно с клиницистами и утвергадекндаи Комитетом по МИШ МЗ СССР. Качественный и количественный состав фекальной ки-крофлоры изучен с использованием методик, изложенных в приложении к Приказу МЗ СССР № 1307 от 22.12.61 г.

Статистическая обработка материала проведена по методикам, изложенным в монографии (Аамарин И.А., Воробьев A.A., 1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Положение первое. Этиологическая структура диарейных заболеваний детей раннего возраста определила специфическую направленность разрабатываемых препаратов. Учитывая ведущую роль в этиологии этих заболеваний различных вариантов ассоциаций патогенных и условно-патогенных энтеробактерий, мы пошли по пути создания препаратов лактоглобулинов, обладающих широким сектром антибактериального и антитоксического действия.

лонструируя ассоциированную вакцину для введения её животным-продуцентам с целью получения иммунного молозива для изготовления первого препарата - противоколипротейного лактоглобулина, мы включили в неё корпускулярные моновакцины из штаммов Е. coli серо-варов 026, 0Ь6, OUI, 0119, наиболее распространенных и вызывающих тяжелое течение болезни (по данным эиерихиозного центра Союза), а также часто сочетающихся с ними бактерий рода Prote-дз ■■ ми раби лис и вул ь гари с ).

Во Вторую ассоциированную вакцину для иммунизации коров с целью получения сырья для изготовления лактоглобулина против условно-патогенных бактерий и сальмонелл включили корпускулярные моновакцины из штаммов S. typTaidurium, S. enteritidis, S. dublin, К, pneumoniaa, P..mirabilis, P. Tulgerin и растворимую

химическую вакцину (пиоиммуноген) из ытаммов P. acruginosa сероваров 02, 05, 011, разработанную и изготовленную ВНИИВС им. И.И.Мечникова. Эта вакцина, содержащая антигены слизи и капсул P.aoruginosa , хорошо сочетается с вакцинами из штаммов условно-патогенных знтеробактерий и сальмонелл. При введении кивотным-про-дуцентам ассоцииированные вакцины не вызывают побочных реакций.

Критериями отбора штаммов знтеробактерий для включения их в ассоциированные вакцины слукили высокая иммуногенность, полноценная антигенная структура и наличие комплекса патогенетически значимых компонентов.

Все вакци/ннне штаммы типичны по морфологическим, культураль-ным, биохимическим, серологическим свойствам, обладают резистентностью к широкому набору антибиотиков. Штамму P. mirabilis, S. typhimuriurn, 3. enteritidis, 3. dublin, К. pneumoniaa продуцируют знтеротоксины, гемолизины. Штампы s. typhiir.urium, 3. dublin, 3. enteritidi3, E. pneurroni ae содержат адгезины типов Cf 1, Cf П, К 99. Вирулентность вакцинных штаммов, выраженная в находится в пределах от 30 до 560 млн. КОЕ на мышь, колебания ее при повторных определениях у отдельных штаммов незначительны (Р^О.Об). Иммуногепнэсть вакцинных штаммов (ЕД^у) составляет для различных штаммов от 26 до 45 млн КОЕ/кыиь. Анализ материала, полученного при сравнительном изучении иммуно-генности моно и ассоциированных вакцин показал, что,несмотря на уменьшение дозы каждой моновакцины в ассоциации от 4 до 6 раз, иммуногенность ассоциированных вакцин по отношению к различным

вакци'нным штаммам сохраняется на том же уровне, (р 0,05).

Эти данные обосновали целесообразность включения ассоциированных вакцин в технологические схемы получения иммунного сырья для изготовления препаратов лактоглобулинэв.

Отработанная технология изготовления убитых ассоциированных вакцин из штаммов энтеробактерий - возбудителей диарейних заболеваний у детей раннего возраста, а также характеристика вакцинных штаммов изложены в экспериментально-производственных ОДР) и производственном (ПР) регламентах изготовления препаратов лактоглобулинов направленного действия.

На следующем этапе работы были определены оптимальные схемы и дозы введения ассоциированных вакцин коровам-продуцентам, позволившие достигнуть высокого иммунизаторного оффекта. Уровень специфических антител к вакцинным штаммам в молозивных лактосыворотках, полученных от иммунизированных животных, в 8-16 раз превысил уровень аналогичных антител в молозивньк лактосыворотках от неиммунизиро-ванных животных.

Подтверждением иммунизаторного эффекта вакцин послужили данные о снижении в 3-4 раза падежа новорожденных телят от диарейных заболеваний за счет выпойки иммунного молозива. Применение ассоциированных вакцин позволило значительно сократить время на выработку специфических антител одновременно к нескольким возбудителям, избежать неблагоприятного воздействия стресс-факторов.

Используемый на этапе экспериментальной разработки противоколи-протейного лактоглобулина способ введения вакцил, сочетающий внутримышечную и внутривыменную иммунизацию, оказался трудоемким, нетехнолог ичным и тормозил промышленное внедрение препаратов. При массовой иммунизации животных в 20-25% случаев приводил к травма-тизации вымени и развитию маститов, что в дальнейшем влияло на молочную продуктивность животных. Это обстоятельство заставило нас

отказаться от комбинированного способа вакцинации и поставило задачу поиска безвредного, менвз трудоемкого и технологичного способа введения животном ассоцииродшших вакцин, дающего икмунизаторный эффект, аналогичный эффекту, получаемому при комбинированном способе введения вакцины. В результате проведенных исследований наиболее оптимальным оказался способ внутримышечной иммунизации животных. Способ апробирован более чзм на 5 ООО глубоко с тельных коров. Установлено, что трехкратное внутримышечное введение животным разработан-них наи» ассоциированных вакцин обеспечивает накопление в секрете молочной железы специфических антибактериальных и антитоксических антител, уровень которых достаточно высок и мало чем отличается • при обоих способах вакцинации. Как видно из таблицы I, препараты лак то глобулинов, изготовленные из молозива коров, иммунизированных комбинированным и внутримышечным способами, практически идентичны по специфической активности и защитному действию а эксперименте на лабораторных животных.

Полученнне результаты обосновали введение в НТД внутримышечного способа иммунизации животных-продуцентов и сделали реальном промышленный выпуск препаратов.

На этапе освоения промышленного выпуска препарата противоко-липротейного лактоглобулина для контроля специфической активности препаратов нам! разработан и отстандартизовая еысокозкономичный, простой о исполнении микрометод РПГЛ. Из-за отсутствия коммерческих диагностикумов для постановки РПГА, на основа ЛИС комплексов 4-х вакци^нных штаммов эшерихий и 2-х-протея получены эритрецитар-ные О-монодиагностикумы. (ФС-42-328 ВС-30, РП-328-Э1).

Результаты одновременной тит рации 15 промышленных серий лакто-глобулина макро- и микроыетодом РИГА показали, что разница уровня специфической активности, выраженной в МКГ лактоглобулина, выявленная при титрации обоими методами, несущественна 0,05). Результаты сопоставимы. Эти двяныо позволили ввести микрометод для

Характеристика противоколипротейного лактоглобулина, полученного * из молозива коров, вакцинированных разню® способами.

Таблица I ...........

— — — Яр — — — -у — — — — — — — — — — — — —— —— —— — — -у — — — — — — — — — - - — — — — .

Пока- ¡Ноличе-) Специфическая активность в мкг/мкл ( Защитное действие (£%д) в мг

Способ вакцинации

затели;ство ¡серий препарата

к ать-ммам______________}_______ к штаммам

Е.

coli

026

Е. ! Е. coli ¡coli

055 '¡Olli

Е. ! Р. ! Р. ! Е. ! Е. ! Е. ! Е. ! Р. ! Р.

coli tmira- Jvulga-j coli ! coli ! coli ! coli Imira- ! vulga-0119 jbiüa j ria j Q26 ] C55 ¡Olli ¡0119 jbilia j ris

Сочетание внутримышечной и внутри-вмменной

2,6+ 3,1+ 3,1+ 2,7+ 2,2+ 2,6+ 4,1+ 5,2+ 5,1+ 5,5+ 2,9+ 5,5+ +0,2 +0,18 +0,21 +0,18 +0,3 +0,2 +0,15 +0,2 +0,2 +0,31 +0,1 +0,25

Внутримышеч- . 2,8+ 3,1+ 3,1+ 3,1+ 2,3+ 2,7+ 4,0+ 5,3+ 4,8+ 4,9+ 3,2+ 4,8+ ная 15 +0,17 +0,21 +0,21 +0,2 +0,2" +0,18 +0,11 +0,13 +0,15 +0,16 +0,09 +0,13

I

Примечание: разница показателей специфической активности и защитного действия препаратов, полученных из молозива коров, вакцинированных разнши способа.'.';! сгатистически недостоверна (р Р' 0,05).

контроля специфической активности в £0-42-328 ВС-90 на противоколи-протойпый лактоглобулин и в В?С на лактоглобулин против условно-патогенннх бактерий и саяыгонеял. Расход jyiai кости кумов при контроле специфической активности микрометодом РПГЛ уменьшился в 10 рас.

йшрометод введен не только для контроля го товогс препарата, но такте сырья и полуфабриката на этапам изготовления.

В исследованиях, вьподне^инх на первых этапах разработки лак-то глсбулиновых препаратов, было выявлено, что специфическая актив-кость препарата тесно коррелирует с защитным-, действием его на модели внутрибршинного заражения белых г'.ькей. Определена прямая корреляционная зависимость, индэкс корредлции г = 0,88 i 0,08.

На вснозании этих исследований установлен нижний предел специфической активности препарата, который но доякен превышать 6,25 мкг/м!сл. Экспериментальные данные, подтвержденные практически на всех этапах клинических испытаний лактоглобулина, включены, кок нормативные, з ФС 42-328 BG-90.

Детальное исследование спрцифчческой активности прзпарато,-лактоглобулинов (противоколипротейного и против условно-пагош;:!".1лс бактерий ü сальмонелл), полученных методом спиртового осаждения иммуноглобулинов молозива, выявило, что помимо антибактериальных антител к штаммам, входящим в ассоциированные вакцины, все серии препаратов содержат антитоксические и антибактериальные антитела к стафилококку. Препараты содержат антитела к ротагирусу в титрах 1:160 - 1:320. Противоколипротейный лактоглобулин содержит, выявленные методом ИФА, антитела к LT-токсину Е. coli , а лактоглобулин против, условно-патогенных бактерий и сальмонелл- антитела к ЛПС клебсиелл. Характеристика специфической активности препаратов дана в табл.2. Препараты содержат лизоцим в количестве 1,2-1,6 мкг/мл

Таким образом, проведенные исследования впервые теоретически

Таблица 2

Сравнительная характеристика специфической активности препаратов лактоглобулинов

пиименова ниц препарата

Кол-! Специфическая активность препарата в мкг/мкл (М+м) к штаммам во серий

Титры антитокси-

I

1 Е' • | Е. ! Е" 1 Е* ! р- ! } э. ^у^ 3. ! к* •Р.ав- ! я 1ческих антител ) в ИФА

1 сон I 026 | оон | 055 1 оо11 I ош \ 0011 | 0119 | га!га-| ЪШв | г1а ¡рМти-(в^вг1+ рпеи-|г1иш |1;1<11з |топ!ее 'поза (аигв-| из ¡Е.соН^ ^ ¡ЬТ-1;о-1К. рпеито ' п1аа

2,6+ 2,7+ 2,6+ 2,6+ 0,78+ 1,56+ ^ 50,0 25,0+ 50,0+ 12,5+ 1,56+ 1:320 1:40

0,18 0,17 0,18 0,18 0,1 0,1 0 0 0 0,2

50,0+ 25,0+ 750,0 25,0+ 0,25+ 0,61+ 1,56+ 2,45+ 1,45+ 1,78+ 1.1+ 1:160 1:160

0 0 0 0,04 0,08 0 0,3 0,11 0,22" 0,2 1

11|)ОТИШ-

колипро-тейный лактоглобулин

15

Лактогло- 7 булин против условно-патогенных бактерий и сель-монелл

5?

Неиммун- 3 ный лак-то Iлобулин

^50,0 750,0 ^50,0 25,0 10,4 12,5 24,5 25,0 25,0 8,3 1,59 +0 +0,6 +0 3,1+0 +0 +0,7 +0

1:40

и экспериментально обосновали целесообразность использования разработанных нами ассоциированных вакцин из штаммов патогенных и условно-патогенных энтеробзктерий путем внутримышечного вакцинирования глубокостельных короз с цельа получения иммунного сырья в технологической цепи промышленного производства нового класса биопрепаратов, направленных против патогенных и услозно-п?.то генных возбудителей наиболее часто встречающихся диарейных заболеваний у детей раннего возраста.

Положение второе. Для доказательства этого положения представляется анализ результатов доклинического изучения препаратов лактоглобулинов.Выше было показаю, что разработанные препараты со-' держат в высоких титрах специфические антитела к вакцинным штаммам и продуцируемым ш.и токсинам.

На экспериментальных моделях подтвержден высокий специфический антибактериальный эффект лактоглобулинов направленного действия по отношению к вирулентным штаммам патогенных и условно-патогенных энтеробактерий, входящих в состав ассоциированных вакцин (рис.1).

Как еидно из рисунка, зсгсдтнае действие иммунных препаратов лактоглобулинов, введенных за 2 часа до внутрибрюшннного заражения бельм мышам, в 6-13 раз превышает эффект препарата, изготовлениеi-o из неиммунного молозива. Данные статистически достоверны (р< 0,01).

Аналогичные результаты получены при изучении антибактериального действия препаратов лактоглобулинов на кроликах-сосунках, зараженных пероралыю вирулентными штаммами E.coli Olli, Р. niraMlia 035 через 2 часа после введения противоколипротейного лактоглобули-на. Все животные опытной группы (20) выжили, а при бактериологическом исследовании внутренних органов кроликов, забитых под эфирным наркозом по истечении срока наблюдения (5 сут.), введенные культуры не выделены. Все животные 1-ой контрольной группы, (20), которым

30 25 20 15 10

Ш

ш

■

т

и

i

t-4

cd I

Е. ooli £. coli . E. coli E. coli P. vulgaris P. mirabi- S. typhi- S. ente- К. pne- P. aeru-OIII 055 026- 0119 Iis . muriun ritidis uaoniae ginosa

Рис. I. Защитный эффект препаратов лактоглобулинов от заражения вакцвпннми штаммами

y,%sA ~ пР°ТИВОК0ЛШ1Р0'гейный лактоглобулян - неиммунннй лактоглобулян

Ü

лактоглобулин против условно-патогенных бактерий и сальмонелл

до заражения был введен 0,9% раствор натрия хлорида, пали через I сут. после заражения. Из печени, селезенки, кишечника и легких павших животных были высеяны введенные энтеробактерии. Из числа животных 2-ой контрольной группы (20), которым вводили неиммунный лакто-глобулин, выжили 5 кроликов, зараженных штаммом зшерихий, и 3 кролика, зараженных штаммом протея. Из кишечника и селезенки павших животных также были выделены соотяетствуюсзие культуры.

Подобный протективнай эффект лактоглобулина против условно-патогенных бактерий и сальмонелл установлен при инфш^провгнии крольчат вирулентным штаммом S.typhirsuriua в дозе,вызывающей 100% заражение интактных животных.

Учитывая педуцую роль э патогенезе диарейных заболеваний токсинов, продуцируемых патогенными :i уелоенэ-пьтогенничи энтеробахте-раями, исследовали токсиннейтрализутацее действие кммушда лакто-глэбулннов на модели изолированной петли тонкого кишечника кролика. Объектом исследования служили онтеротокенгенныз штаммы эшерихий и протек, a также холерный токсин, механизм действия и структура которого сходны с тормолабильными знтсротоксинами условно-патогенных энтеробактерий. Во всех случаях иммунный лактоглобулин в дозе 50 мг полностью нейтрализовал токсин и предотвращал развитие эффекта ди-лятации кишечника кролика.

Подходя к изучения механизмов действия препаратов, исследовали энтеротоксигенность штаммов е. coli 0II4K90 № 714 (депонирован в ГИСК им.JI.А.Тарасовича Л.Д.Акртыненко и соавт., как стойкий продуцент энтеротоксина), p. mirabilis 035, S. typhimurium 67 • (вакцинные штаммы) в условиях длительного воздействия на них препаратов лактоглобулинов.

Проведено до 14 пассажей культур в лактоглобулине. Исследование популяции на наличие субкультур разной степени токсигеннос-

ти методом подавления дегидрогеназной активности У4-мутанта S. aureus 209Р осуществляли до и после 5-го, 10-го и 14-го пассажей. Результаты исследования представлены на рис.2.

Анализ материала показал, что уже через 5 пассажей в иммунном лактоглобулине происходит значительное снижение токсигенных клоков в популяции всех изученных штаммов, которое достигает максимума к 14 пассажу. Неиммунный лактоглобулин обладает в этом отношении меньшим потенциалом и после 14 пассажей вызывает утрату токсиген- • ности лишь у 20-25% субкультур. Утрата штаммами токсигенности подтверждена в тесте отека лапки белой мыши и в ИФА. Пассированные штаммы сохраняют культуральные и биохимические свойства, вирулентность штаммов падает. Пассажи культур в питательных средах не изменяют степень их токсигенности.

' Определив токсигеннейтрализующее действие иммунного лактоглобулина по отношению к холерному токсину, совместно с ¡'.Т.Андрусенко, провели пассирование в лактоглобулине 3 штаммов V. cholerao claasica , 7 штаммов V. cholerae Eltor , 3 штаммов V. cholerae не 01 группы. Так же, как и в случае энтеробактерий, препарат избирательно воздействовал на токсигенные клоны холерных вибрионов и способствовал селекции нетоксигенных субкультур.

Избирательное действие иммунных препаратов лактоглобулинов на токсигенные клоны энтеробактерий ведет, по-видимому, к селекции нетоксигенных клонов и является одним из универсальных механизмов нормализации биоценоза кишечника ребенка.

Результаты доклинического исследования, выявившие высокую антибактериальную и антитоксическую активность иммунных лактоглобу-линов к штаммам-возбудителям диарейных заболеваний, вошедшим в состав ассоциированных вакцин, послужили основанием для проведения дальнейших испытаний препаратов в клинической практике.

Рис. 2. Избирательное действае препаратов лактоглобулинов на токсигенныз клоны энтеробактерий. _________ - токдигенные клоны

_____ - слаботоксигешше клоны

- нетоксигеннае клоны

- 22 -

Положение третье. Это положение, вынесенное на завету, подтверждается анализом результатов полученных на этапах клинической апробации препаратов.

Контроль 46 экспериментальных и 240 производственных серий препаратов лактоглобулинов не выявил ни одной токсичной серии препарата. Безвредность к аректогенность препаратов, установленная при введении различным экспериментальным животным на первых этапах разработки, была подтверждена в условиях клинических испытаний. Пе-роральное введение лактоглобулина недоношенным, новорожденным, детям раннего возраста, больным диарейными заболеваниями, вызванны-ш- энтеропатогенными эшерихиями и условно-патогенными энтерсбак-терцяии, в количестве 10 мл раствора лактоглобулина от одного до четырех раз в сутки в течение 2-х - 3-х недель, не вызвало ни в одном случае каких-либо отрицательных побочных реакций. Отсутствие сенсибилизирующего действия препарата подтверждено при анализе результатов реакции дегрануляции тучных клеток крысы с сыворотками кровл 80 детей, обследованных в динамике лечения. Этот показатель практически не претерпел изменений в процессе лечения и составил 2,58+0,31 до при а»: а препарата и 3,12+0,33 после окончания лечения. Разница показателей статистически недостоверна (р ;> 0,05).

Клинпко-бактериологическая эффективность применения протиео-колипротейного лактоглобулина изучена на контингенте детей раннего возраста (469 человек), больных колиикфекцией и дисбактериоэом, сопровождающимся массовым выделением бактерий протея, в шифрованном опыте с использованием в качестве плацебо глюконата кальция и нормального лактоглобулина.

Основные и контрольные группы детей, подобранные методом случайной выборки, были однородны по возрасту, тяжести течения болезни, сопутствующим заболеваниям, характеру вскармливания, методам

терапии. Более 5Q® детей составили дети пер otee шеста месяцев киз-ш,- преобладающее большинство детей находилось на искусственном вскармливании. У В7,Ш дотей опытной и у 84,3% детей контрольной груши колшшфекция протекала в тяжелой к средне-тлделой форма, у 12,9% и 15,7,0 детей соответствусздх групп заболевание имело легкое течение. В группах детей с диагнозом дисбачтериоз 23,5а дз-vrfi опытной группы и 22$ - контрольной группы имели дзксяенс.чро-в&ннуа (тяжелую) форму дисбактериоза, у сстальнсй часта детей заболевание протекало з субксмпенсировонной (ередне-тяхелой) форме.

В этиологической структуре кочиинфекции в сбеих группах преобладали эшер»хг.озн, обусловлен:-;^ ЭПКП сыроваров Olli и 0119. Дисбактериозы у детей опытной группа в 65,8% сопровождались иал-сквнш! выделегшем бактерий г. rairebiiio я 34,Р. -л-1 -.ario. В контрольной группе это соотнопэннз сохранялось, з 60,9% случаев вциелили V, ísirs-bilia и в 39,1% - Р. vulgaris.

IIa всех пяти клинических базах, испытывавших противоколипро-тейный лактоглобулин на зтапэ государственных испытаний, были получены идентичные результаты. Это позволило нам обобщить материалы дня анализа и заключения об сффектавности препарата.

Анализ результатов nnpoôaiçm показал, что клинический эффект применения лак-то глобулина, как при лечении колиинфекции, так и дисбактериоза, несколько опережает процесс норлализацин микрофлоры кишечника. Благодаря антитоксическому действию препарата, в 1,52,0 раза ускоряется снятие яилений токсикоза и эксикоза.

Более быстрая нормализация всех клинических и бактериологических показателей у детей, леченных противоколипротейкым лакто-глобулином, приводит п конечном итоге к сокращению пребывания детей в стационаре в среднем на 5-6 дней при колиинфекции и на 10-II дней - при дисбактериозах. Данные статистически достоверны

(р< 0,05).

Анализ результатов применения препаратов показал, что специфическое антибактериальное действие лактоглобулина на ЭПК11 и бактерии' рода Протея, в подавляющей большинстве случаев, выявляется к 7 дню от начала лечения, в то время, как в контрольных группах такой эффект наблюдается на 1-2 недели позже (рис.3).

К 21 дни от начала лечения лактоглобулином в группе больных с колиинфекцией специфический антибактериальный эффект был отмечен в 97,9% случаев. В контрольной группе детей, получающих базисную терапию (антибиотики) в этот срок возбудитель болезни не был выделен у 62% больных. В опытной группе не наблюдали рецидивов ко-лиинфекции.

В группе больных с протейным дасбактериозом к 21 дню от начала лечения иммунным лактоглобулином протей был выделен в 4,3,5 случаев в количестве, но превышающем 2-3 в I г фекалий. В то же время в контрольной группе больных, принимающих препараты норыо-флоры, он был выделен в этот срок у 45,6% детей в количестве 78 в I г фекалий.

В момент уменьшения в фекалиях детей опытных групп возбудителей болезни установлено восстановление нормального биоценоза кишечника, в том числе анаэробного компонента. В обеих опытных группах отмечено к моменту выздоровления увеличение количества бифидофлори (до Ю8 - ЮИ КОЕ/г) и лактобацил (до Ю8 - Ю9 КОЕ/г). У 45 % детей с протейным дкебактериозом в контрольной группе облига-тная флора кишечника не восстановилась до выписки из стационара.

Одной из задач нашего исследования явилось дальнейшее выявление терапевтических возможностей применения препарата.

Установлено, что применение препарата для лечения III детей с острыми протейными гастроэнтероколитами дало аналогичный описанному выше эффект. В результате более быстрой нормализации клиничес-

Частота Ьыдепеиия ЭПКП %

Опы т

___контроль

Дни от начала лечения

Частота выделения протея

Опыт

___Контроль

„ Дни от начала

7 31 леченая

Рис. 3. Дин атака выделения ЭПКП и протея в процессе летания против'околппротейным лактоглобугшном.

кого состояния и очищения от возбудителя, срок пребывания больных в стационаре сокращался на 5-6 дней, не развивались явления дис-бактериоза кишечника.

Исходя из анализа данных о положительном влиянии лактоглобулина на процессы нормализации микрофлоры кишечника, нами изучены результаты его применения в комплексной терапии 150 новорожденных и детей первых месяцев жизни, госпитализированных с диагнозом пнев иония, сепсис, острыс распирйторние инфекции, подвергнутых массивной антибиотико- и химиотерапии. Исследования показали, что применение лактоглобулина в сочетании с антибиотиками с первых дней лечения предотвращало или значительно уменьшило развитие диарейного синдрома, как дисбиотического.осложнения антибиотикотерапии. В слу чаях применения препарата на фоне развившегося дисбактериоза отмечена нормализация биоценоза кишечника.

Так, после применения лактоглобулина количество лактозоотрл. -цательних кишечных палочек в фекалиях (в lg КОЕ/г) снизилось с 7,0+0,4 до 3,0+0,2, протея - с 7,2+0,4 до 1,3+0,3, стафилококк кэ-ьгулазоположительный - с 4,7+0,3 до 2,1+0,5, грибы рода Кандида -с 4,2+0,3 до 1,8+0,2. Повысилось содержание лактобацилл с 5,2+0,6 до 8,1+0,3, бифидобактерий с 7,1+0,5 до 9,4Г0,4.

Полученные данные обосновывают целесообразность применения им мунного лактоглобулина во всех случаях интенсивной антибиотико- и химиотерапии.

Ограниченные клинические испытания препарата против условно-патогенных бактерий и сальмонелл на группе детей в Еозрасте от 3-х месяцев до 2 лет с тяжелым, рецидивирующим, затяжным течением саль монеллеза подтвердили безвредность применения лактоглобулина, а также его эффективность в нормализации клинических, бактериологических, иммунологических показателей. Ь 60% случаев s. typhimuriu:

(госпитальный штамм) был выделен в ассоциации с протеем, клебси-еллой пневмония, стафилококком. Специфический антибактериальный эффект был получен в отношении всех микроорганизмов к 14-21 дао от начала лечения в 96,7% случаев.

Таким образом, результаты клинической апробации подтвердим безвредность, специфическую антибактериальную и антитоксическую активность лактоглобулинов, выявленные в процессе экспериментального изучения препаратов.

Положение четвертое. Значительное преобладание среди заболевших кишечными инфекциями детей первого года жизни, находящихся на искусственном вскармливании (Р.А.Рашдоза и соазт., 1980; Н.Р.Иванов, И.А.Зайцева, 1981; О.Е.Сергеев, Н.М.Головина, 1989), ставит задачу обогащения молочных смесей для этих детей пащитныш факторами. Исследования последних лет, проведенные в нашей страна и за рубежом, позволили создать ряд «елочных продуктов, обогащенных лактобациллами, бифпдобактериями, а также неспецифическим фактором защиты - лизоцимом.

Попытки обогатить продукты детского питания специфическими защитными компонентами молока - иммуноглобулинами имеются за рубежом (патент Франции * 1599671, патент Великобритании № 1581900, патент ФРГ № 2318645, патент Швейцарии !? 627079); однако в нашей стране такие продукты отсутствуют.

Установив безвредность и высокую лечебную эффективность препарата - противзколипротеймого лактоглобулина, содержащего не менее 96% иммуноглобулинов молозива коров, мы предприняли попытку использовать его в качестве источника обогащения молочных смесей иммуноглобулинами.

Проведенные исследования теоретически обосновали и экспериментально подтвердили целесообразность введения препарата лакто-

- Ш - '

глобулина в сладкие и кисломолочные смеси. Разработана технология обогащения препаратом питательных смесей, позволявшая сохранять все свойства катанного лактоглобулина (ТУ 10.02.02).

Наиболее рациональным признано обогащение молочных продуктов защитными компонентами в виде биологически активных добавок (БЛД).

В кашей стране в настоящее время выпускается 3 вида БАД-ов: БАД-1Б (с бифидобактериями), ЕЛД-1Л (с лизоцимоы) и БАД-2 (содержащий оба компонента).

Учитывая универсальность сухих биологически активных добавок, содержащих защитные факторы, возможность их применения для обогащения большого ассортимента молочных и других продуктов питания детей раннего возраста, а тшоке донорского молока, стандартность по составу питательных и биологически активных компонентов,технологичность и обеспечение в процессе производства необходимой микробиологической чистоты, мы пошли по пути получения биологически активной добавки с лактоглобулином, условно названной ЕАД-ИГ.

При обследовании 52 детей специализированного по кишечным инфекциям дошребенка, в возрасте ог 3 мес. до 2,5 лет, с отягощенным анамнезом, были выявлены изменения качественного и количественного состава микрофлоры толстого кишечника.

Дисбактериоз был обусловлен снижением уровня бифидобактеркй у 100% детей, лактобацилл у 75%, кишечной палочки у Зь%, выделе* нием прочих онтеробактерий (лактозострицательной кишечной палочки, протея, клебсиеллы, цитробактера) в количестве 5-8 1£ /г у 41% детей, стафилококка с признаками патогенности у 61% детей, грибов рода Кандида у 83% детей. У 58% детей на фене снижения бифидо-и лактофлоры были обнаружены ассоциации из 2-4 видов условно-патогенных микроорганизмов. У б детей энтеробактерии выделялись из зева. У 88,4% детей отмечены клинические проявления дисбактериоза

_2У _

в виде дисфункции кишечника, метеоризча, попиленного аппетита, полигиповиташноза. У 12% детей выявлены проявления экссудатив-ного диатеза.

При фоновом обследовании детей обнаружены значительные 07"гонения от возрастных норм некоторых показателей общего и местного иммунитета.

Содержание как , так и в сыворотке крови де-

тей в 2-4 раза превышало норму, что вероятно,«являлось следствием перенесенных инфекционных заболеваний. Выявление в копрофильтра-тах детей , ^и , лизоцима при одновременном отсутствии

у. большинства детей секреторного ^а , свидетельствовало о воспалительном процессе в кишечнике на фоне подавления мести. го иммунитета.

Проведено два двухнедельны?: курса вскармливания детей молочники продуктами, обогащенными ЕАД-НГ. Интервал ме ду курсами составил 3 месяца.

Применение БАД-ЙГ дало значительный и многосторонний нормализующий эффект. Так, после проведения первого курса вскармливания обогащенными продуктами, у детей полностью нормализовалось количество условно-патогенных энтеробактерий, частота обнаружения лакто%трицательной кишечной палочки снизилась с -3б до 5 %, ста-фмлококка с признаками патогенности с 61 до 13 %, грибов рода Кандида - с 83 до 31%. Ассоциация из двух условно-патогенных микроорганизмов (лактозоотрицательной кишечной палочки и золотистого стафилококка) выделена только у I ребенка. Содержание лактобацмлл и бифидобактерий возросло в 10-100 раз. Проведение второго курса Ессармливания продукта™, обогащенными БАД-ИГ, привело к восстановлению уровня микроорганизмов - зубиотикон, к дальнейшей положительной динамике других .компонентов чикрофлорн. Клиническое обсле-

довшше показало, что у ззох дзтей нормализовался стул, купировались симптомы полн-гипо-витаминоза, уменьшились явления экссуда-тивного диатеза, у Ь0% детей улучшился аппетит. Одновременно с восстановлением микрофлоры нормализовался уровень сывороточных иммуноглобулинов, значительно улучшились показатели местного иммунитета, снизилась частота обнаружения в копрофильтратах , , восстановилась продукция 3 ^А у части детей, особенно младшего Еозраста. В д§ме ребенка за весь период наблюдения (в течение I года) не зарегистрировано ни одного случал острых кишечных инфекций, а возникновение респираторных заболеваний в коллективе и лечение детей в этот период антибиотиками нв сопровождалось раз-' витием у них диарейного синдрома. В последующие 2 года было продолжено применение БАД-ИГ в доме ребенка в весенне-осенний период, что способствовало нормализации микрофлоры и препятствовало развитию у детей кишечных инфекций.

Аналогичные результаты были получены при апробации ЕАД-ИГ для обогащения донорского молока и вскармливания им недоношенных детей и детей с патологией новорожденных. Длительность применения БАД-ИГ составила от 7 до 14 дней. При анализе материала у всех детей бил отмечен положительный эффект от применения БАД-ИГ. На 3-й - 4-й день начиналась пр1бавка массы тела, а на 5-6 день нормализовался стул. На фоне применения БАД-ИГ и после окончания применения у детей не появлялось новых патологических очагов. Происходила нормализация микрофлоры кишечника, переставали выделяться условно-патогенные онтеробактерии, восстанавливалась бифидофлора, улучшался иммунный статус. В контрольной группе летей нормализация всех показателей затягивалась на одну-две недели.

Переносимость БАД-ИГ была хорошей во всех возрастных группах цетей.

Отсутствие в молочных продуктах дал искусственного вскармливания детей не только специфических, но и неслецифических компонентов защиты, содержавшихся и осуществляющих свое действие в грудном молоке в комплексе и тесной взаимосвязи, обосновывает перспективу и целесообразность разработки комплексной БАД к продуктам детского питания, содержащей помимо иммуноглобулинов, лизоцим, а также лактобактерии и блфидобактерии.

Изучено взаимное влияние лактоглобулина и штаммов бифидобак-терлй (№ I, ЛВА-3 и В379М), относящихся к видам В, ЬШаив и В. 1опгиш , лактобацилл 5Е и АС42, 336, КЗ, а также лизоцима

с.целью решения вопроса о возможности их совместного применения, При совместном инкубировании лактоглобулина противоколипротейного и каждого из этих штаммов при 37° в течение 24 ч и при дальнейшем их хранении в течение 1-2 суток при 4°С угнетения инте сишгасти размножения, кислотообразопания и антагонистической активности культур не наблюдалось.

Лактоглобулин при совместно»- инкубировании с указанными штампами микроорганизмов полностью сохраняет специфическую активность и икмунохимические свойства.

Анализ результатов, полученшгх при совместном инкубировшшн лш{тоглобулина с лизоцимом не выявил изменений специфической актив-кости и иммунохнмических свойств лактоглобулина, лизоцим также сохранил свою активность.

Проведенные исследования открыли перспективу обогащения лак-тоглобулином не только сладких, но кисломолочных смесей, заквашенных лактобациллпми и бифидобактериями, а также легли в основу разработки комплексной биологически активной добавки, содержащей лактоглобулин и лизоцим под условным названием БАД-ИГЛ. Исследования в этом направлении выполнены совместно с НОЛИУВ, МНИИЭМ им.

Габрнчевского и ВШИДМП.

Апробация комплексной БАД-ИГЛ в лечебном питании недоношенных детей с кишечной патологией (26 детей),осуществленная ь условиях клиники института педиатрии и детской хирургии МЗ РСФСР, показала ее безвредность и высокую клинико-бактериологическую эффективность.

Таким образом, в эксперименте и в клинических условиях определена целесообразность обогащения детских молочных смесей для детей групп риска препаратом лактоглобулином в виде ЕАД-ИГ или комплексной БАД-ИГЛ с целью коррекции микрофлоры и снижения заболеваемости кишечными инфекциями.

Проведенные исследования, обосновавшие промышленную технологию получения нового класса биопрепаратов из молозива коров, иммунизированных ассоциированными вакцинами из штаммов патогенных и условно-патогенных энтеробактерий, позволили найти новые подходы к лечению и профилактике диарейных заболеваний у детей раннего возраста. Безвредность и физиологичность перорального применения препаратов лактоглобулинов, их специфическое антибактериальное действие, в тоа числе на антибиотикорезистентные штаммы-возбудители, токсикпейтрализующий эффект и избирательное действие на токсиген-ные субкультуры, ведущее к нормализации биоценоза кишечника, выдвигает лактоглобулины на одно из первых мест среди средств этио-тронной терапии кишечных заболеваний в педиатрической практике.

ВЫВОДЫ:

I. Шервыэ в отечественной практике теоретически и экспериментально обоснована промышленная технология получения нового класса биопрепаратов - лактоглобулинов для лечения диарейных заболеваний у детей раннего возраста из молозива коров, иммунизированных внутримышечно двумя вариантами ассоциированных вакцин.

2. Ассоциированные вакцины, разработанные в процессе исследования, включахлсие ноновакцины из штаммов патогенных и условно-патогенных энтеробактерий, отобранных по наличия комплекса патогенетически-значимых свойств, высокоиммукогенны в эксперименте на лабораторных животных, безвредны и могут быть использованы для вакцинации коров-продуцентов с целью получения иммунного сырья.

3. Внутримышечная иммунизация глубоко с тельных коров ассоциированными вакцинами, по разработанной схеме, обеспечивает выработку

в молозиве специфических антител з? вакцннным штаммам на уровне, получаемом при комбинированном (внутримышечной и знутривыменном) способе вакцинации, что обосновывает ее включение в технологическую схему про.чьтаенного получения препаратоЕ-лактоглобушнов.

4. Препараты лактоглобуликэо (прстивоколипротейный н против условно-патогенньк бактерий и сальмонелл) э эксперимент-.: на животных безвредны, нетоксичны, обладают высоким протектавным эффектом, нейтрализуют действие токскноь янтерсбакчерий, при пассажах токси-генных культур в лактоглсбулине избирательно действуют на токси-генныэ клоны, способствуют выжизекив и размножению кетоксигеннкх субкультур снтеробактерий.

. 5. Препараты лактоглобулинов при пероральном введешш детям раннего возраста нетоксичны, безвредны, ареактогенны, за счет содержания в препаратах в высоких татрах антител к вакцинным штаммам оказывают специфическое антибактериальное и антитоксическое действие на возбудителя болезни, в том числе на антнбиотикорезис-тентные дтаммы, нормализуют биоценоз кишечника ребенка, ускоряют выздоровление.

б. Целесообразно применение препаратов лактоглобулинов направленного действия в педиатрической практике во всех случаях интенсивной антибиотикотерапии для профилактики иисбиотических ос-

ложнений последней.

7. Препараты лактоглобулинов целесообразно использовать, в • качестве биологически активной добавки, с целью обогащения молочных продуктов для искусственного вскармливания детей групп риска по и,щечным заболеваниям. Разработана технология получения биологически активной добавки с лактоглобулином (БАД-ИГ), Лактоглобу-ш может быть введен в БАД в сочетании с лизоцимом, бифидобакте-рияыи и лактобациллами.

8. Применение биологически активной добавки с лактоглобулином (БАД-ИГ) в питании недоношенных новорожденных, детей раннего возраста с патологией новорожденноети, находящихся в стационарах и домах ребенка, приводит-к нормализации биоценоза кишечника, иммунного статуса, улучшает общее состояние и физическое развитие детей.

Считаю приятным долгом выразить свою глубокую благодарность и признательность моим коллегам и соавторам по работе, всем, кто принимал участие в этом разноплановом многолетнем исследовании и без которых работа в данном объеме, разработка к внедрение препаратов в широкую практику здравоохранения не могла быть выполнена.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Экспериментальное изучение защитного действия иммунного коли-протейного лактоглобулина /В.И.Ермолов, В.Е.Валенцев, Н.А.Конюхова и др./. - //в кн.: Актуальные проблемы иммунологии, аллергологии и молекулярной биологии: Труды Кубанского государственного медицинского института, Краснодар, 1978,- Т.68,- С.119— - 121.

2. Изучение сенсибилизирующих свойств иммунного колипротейного лак-тоглобулина (энтерального) в опыте на добровольцах /Б.Д.Раби-

но бич, В.Ii.Ермолов, Л.И.Поляк и др./. - /У В кн.: Актуальные проблемы иммунологии, аллергологии и .молекулярной биологии: Труды Кубанского государственного медицинского института, Краснодар, 1978. - Т 68,- С. 183-184.

3. Физиологические аспекты иммуногенеза у ."леотных и человека во лремя лактации /В.И.Ермолов, Л.К. Величко, И.м.Сзетова, и др./.// В кн. Тезисы докладов у Всесоюзного сшдюэнуыга по физиологии и биохимии лактации, Ленинград, 1978» - С.56.

4. Препзративное разделение белкез молозива крупного рог.чтого скота на классы иммуноглобулинов /Л.Д.йшеева, П.А.Конюхова,

■ В.И.Ермолов/. - // Рукспись депонир. во ВИНИТИ. - 1S32. -& 4302-82.

5. Динамика изменения микрофлоры кишечника при лечении кишечных инфекций у детей энтеральннм препаратом иммуясглобу* -асв /H.A. Конюхова, В.Я.Ермолов, А.Л.Ленинер/. - // 3 кн.: Материалы 6-го Всесоюзного съезда ''Иммунзлогичее.^о аспекты инфекционной патологии", Таллин, IS8I. - С. 151-153.

6. 1кмунологические аспекты биосг.нгвза антител иммуноглобулинов молока /В.И.Ермолов, Н.Ф.Морозов, Л.Д.Фадеева и др./. - //В кн. Тезисы докладов У1 Всесоюзного симпозиума по физиологии и биохимии лактации (Львов, 1982), il, 1982. - С.59-С0.

7. Экспериментальное изучение иммунологических свойств биопрепарата дактоглобулина при совместном кнкуи-ироЕании с бифидобактери-ями /Е.Ю.Златник, А.М.Лянная/. - // В кн.: ¿!атериалы Всесоюзного сн'.'лоЕиума, посвященного 60-летию Тбилисского НИИВС: Актуальные вопросы бактериофагии и прикладной иммунологии, Тбилиси, 1934. - С. 367-370.

8. Экспериментально-биологические основы разработки иммунных препаратов молока (Сообц. I). /В.И.Ермолов, З.Д.Рабинович, Н.М.

Попова и др./. - 11 В кн.: Современные вопросы гигиены села: Сборник научных трудов НИИ гигиены им.Ф.О.Зрисмана, М,, 1985,- с. за-37.

9. Разработка кисломолочных бифидосодержащих продуктов и биологически активных добавок к детскому питанию на основе изучения биологических свойств бифидобактерий. /Л.П.Семенова, Т.А.Груздева, Г.Н.Шаманова и др./. - У/ В кн.: Бифидобактерии и их использование в клинике, медицинской промыоленности и сельском хозяйстве: Сб.научных трудов МШШ им.Габричевского, М.,1986. -

- С. 82-89.

10.Обогащение молочных продуктов детского питания иммунным лакто-глобулином для коррекции микрофлоры кишечника детей раннего возраста, перенесших ОКИ./ Е.Ю.Златник, Л.Д.Минеева, М.М.Кап-лин,/. -Л В кн.: Проблемы медицинской и санитарной микробиологии города: Тезисы докладов областной научно-практической конференции, г.Ростов-на-Дону, 1987. - С. 30-31.

11. Эффективность комплексной патогенетической терапии при острых кишечных инфекциях у детей (Р.Г.Ловердо, А.Д.Пласкачев, В.Е. Шарова./. - // В кн.: Новое в диагностике, клинике, лечении и профилактике заболеваний детского возраста: Сб.научных трудов Ростовского медицинского института, г.Росгов-на-Дрну, 1968. -

- С. 38-41.

12. Клиническая эффективность биологически активных добавок, содержащих иммуноглобулины и лизоцим у недоношенных детей /В.В.Гав-рюшев, А.И.Большакова, 0.Г.Щербакова и др./. - // В кн.: Тезисы Ш съезда детских врачей Узбекистана, Тьлшент, 1988. - С. 52.

13. Экспериментальное изучение нового биологического препарата для лечения колиинфекции и протейного дисбактериоза у детей раннего возраста. /Л.Д.Минеева, В.Д.Рабинович, Т.А.Федорова./. - // Кури, микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 1989. - № 8. -

- С. 7-И.

I. Использование иммуноглобулинов молозива п качестве защитного фактора для обогащения молочных продуктов детского питания. /Е.Ю.Златшк, Л.Д.Млнееза, Г.!'.Шаманова./. - // Б кн.: Передовой научно-производственный опыт, рекомендуемый для внедрения: Научно-технический информационный еборняк. !&>а:ва, 1989. - еыпЛ -

- С. 35-37.

). Опыт применения противоколипротейноги ла::то глобулина в качестве добавки к молочным продукта« датского питания в спекализнроЕЯМ-нса детскок коллективе. /Е.Ю.Златншс, Л.Д.:'кневза, М.М.Каплг.н и др./. - // Нурн. "Бэпросы пи тел; ¡я", 1989. - * I. - С. 36-39. I; Особенности развития лактобацилл в присутствии иммугтногэ лакто-глобулчна в процессе скапливания. /Г.П.Иванова, Т.Г.Гаязэпа, Н.К.Ннхоновг./. - // В кг.: Питание: гдоровьс я болезнь: Материалы Всесоюзной Н&уЧКОЙ ^СИфсфЭНЦ^И С иЭ.^ДуН йрЭ дн' ¿м ушетием, П., 1990*. - С.224.

Перспективы прккенешш лактоглобулинов наппаг-летюго дсйстгия для лечения ОНИ и дисбактериоза у детей рапного ьозрзста. -

- // К.Педиатрия. - 1290. - * 11. - С.48-51.

I. Детские иолочшв продукте, обегавенние ишгутюглобулииамя /Е.Ю. Златник, Г.П.Шакакоза./. - // Обзорная информация, Изд.Нолоиная промышленность, 1991. - 20 с. К Способ лечения протейного дисбактериоза /В.И.Ермолов, А.Г.Еоз-кун, В.Д.Рабинович и др./. - //Лбт.свидетельство !? 1266543» 1995.

Способ моделирования дисбактериоза у крыс (Е.й.Злачнкк/. - Азт. сгидетелъство № 1363291, 1937.

Способ получения нетоксигеннюс субкультур бактерий рода У1Ъг1о или Аогоиспаз /И.Т.Андрусенко.А.П.Шепелев, Л.Д.Мшеева/. -// Авторское свидетельство р 1440026 "Т", 1988.

22, Способ стабилизации О-орктроцлтирких даагностккудов /Н.П.Шуллк, Л.Д.Минеева, Л.Н.ЧернавскЕл/^. - /Авт.свидетельство » 1640173"! 1939.

23. Способ получения лак то глобулина УС.Г.Елагородов, Л.Д.Йшеова, Л.З.Сьечшкова и др./ - //Полоттельное решение В 4?23050/14"Т" 074456" Т"/.

24, Способ количественного определения иммуноглобулинов молока (Е.К Здатник, Л.Н.Черпапская/. - // Респ.сб.научн.тр.Изсбротательств и рационализация а медицине. 1.1., 1990. - СД56-157.

25^ Экспериментальное изучение препарата лактоглобулина против уело но-патогенных бактерий и сальмонелл /Л.Д.Минеова, Н.З.Алексаш Т.А.^сдороьа и др./. - !/ &.Ш, 1991. - )? 9 - С.54-56.

26. Изучение пммуно г ешю ста ко но и ассоциированных вакцин из шташю . условно-патогенных бакторШ/ - 1/ НЫ311, 1991. - » 10. - С.31-34

27. К проблеме бактериальной терапии новорожденных из групп риска внутриутробной бактериальной икфзкцни /Г.Л.Линчевский, Ю.С.Ва-ренко, Н.С.Лаврова.У. - // В кн.: Тезисы докладов Всесоюзной ко ференции "Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций" ч.2, Москва, 1991. - С. 333-384."

28. Алиментарные биологически активные вещества и их значимость в формировании мпкробиоценоза кишечника детей /ЭЛ'.Щербакова, М.В.Кушнарева, В.В.Гаврэиов и др./. - // В кн.: Тезисы докладов У1 Всероссийского съезда микробиологов, эпидемиологов, паразитологов, Нижний Новгород, 1991. - т.2. - С.138,

РОУС ПК. 22-18 тир. 100

\