Молекулярно-генетические особенности устойчивости к бета-лактамным антибиотикам грамотрицательных микроорганизмов - возбудителей нозокомиальных инфекций

Мудрак, Дарья Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетические особенности устойчивости к бета-лактамным антибиотикам грамотрицательных микроорганизмов - возбудителей нозокомиальных инфекций
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические особенности устойчивости к бета-лактамным антибиотикам грамотрицательных микроорганизмов - возбудителей нозокомиальных инфекций"

На правах рукописи

□□34Э1ЭВ6

МУДРАК ДАРЬЯ ЕВГЕНЬЕВНА

Молекулярно-генетические особенности устойчивости к бета-лактамным антибиотикам грамотрицательных микроорганизмов - возбудителей нозокомиальных

инфекций

03.02.03 - Микробиология, 03.01.03 - Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 8 ФЕВ 20*9

Москва-2010

003491966

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Российская Медицинская Академия Последипломного Образования» (ГОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития)

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Сидоренко Сергей Владимирович

кандидат биологических наук, доцент Ильина Елена Николаевна

Официальные оппоненты: доктор биологический наук, профессор

Тартаковский Игорь Семенович

Кандидат биологических наук, Летаров Андрей Викторович

Ведущая организация: ФГУН Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера Роспотребнадзора

Защита диссертации состоится " 19 " февраля 2010 г. в И часов на заседании совета Д001.007.01 в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (г. Москва, 123098, ул. Гамалеи, д.18)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан "_18_" января 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного Д.м.н., проф. ' " Русакова Е.В.

Диссертационного совета ^

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Широкое применение в медицинской практике антибиотиков привело к значительным изменениям в этиологической структуре и росту антибактериальной резистентности возбудителей инфекционных болезней (Bradford P.A., 2001). Инфекции, вызванные резистентными штаммами, отличаются длительным течением, чаще требуют госпитализации, при этом увеличивается продолжительность пребывания в стационаре и ухудшается прогноз для пациентов (Spanu Т., 2002).

Многочисленные негативные социально-экономические последствия распространения антибактериальной резистентности вынудили Всемирную организацию здравоохранения (ВОЗ) разработать и опубликовать в 2001 году «Глобальную стратегию ВОЗ по сдерживанию устойчивости к противомикробным препаратам», в которой рекомендовано рассматривать указанную проблему в качестве одного из приоритетов национальных систем здравоохранения (ВОЗ, 2001). В приведенном документе указывается, что расшифровка молекулярных механизмов резистентности необходима для создания новых препаратов и средств диагностики, а также для оптимизации режимов этиотропной терапии.

Проблема антибактериальной резистентности представляется особо актуальной в лечении нозокомиальных инфекций, распространение которых лишь возрастает по мере совершенствования медицинских технологий, существенно расширяющих круг критических состояний, поддающихся эффективной терапии. Интенсивный селективный прессинг антибиотиков, обусловливает быструю эволюцию и распространение новых механизмов резистентности в медицинских учреждениях и, прежде всего, в отделениях реанимации и интенсивной терапии.

Одними из ведущих возбудителей нозокомиальных инфекций являются грамотрицательные бактерии (семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Acinetobacter и некоторые другие) (Бондаренко В.М., 2000).

Традиционно основу лечения, инфекций, вызываемых бактериями этой группы, составляли бета-лактамные антибиотики и, прежде всего, цефалоспорины III поколения. Однако эффективность этой группы антибиотиков в последние годы резко снизилась в связи с распространением среди возбудителей нозокомиальных инфекций бета-лактамаз расширенного спектра класса А (группа 2Ъе по К. Bush, 2009). Альтернативу цефалоспоринам III поколения составляют цефалоспорины IV поколения, карбапенемы и ингибитор-защищенные бета-лактамы, применение которых в медицинской практике постоянно расширяется.

В ответ на изменения в стратегии и тактике применения антибиотиков в различных регионах мира происходят изменения в распространении отдельных групп и классов бета-лактамаз — смена лидирующих групп (Сидоренко C.B., 2008). К наиболее важным тенденциям следует отнести увеличение частоты выделения бета-лактамаз класса С (группы 1 и le по

K.Bush, 2009) и появление карбапенемаз, прежде всего, относящихся к классу В (группы 3 и За по K.Bush, 2009) - металло-бета-лактамаз.

Своевременное выявление изменений в распространении бета-лактамаз имеет важное практическое и теоретическое значение, так как позволяет корректировать рекомендации по антибактериальной терапии нозокомиальных инфекций, разрабатывать экспрессные молекулярные методы детекции антибактериальной резистентности, дает важную информацию для создания новых препаратов, преодолевающих резистентность.

В настоящее время детекция бета-лактамаз основана на микробиологических методах, таких как диско-диффузионный, метод серийных разведений в бульоне, метод двух дисков, а также с применением различных коммерческих тестов, основанных на ферментативных колориметрических реакциях. Перечисленные традиционные микробиологические методы подходят для фенотипической характеристики микроорганизма. Однако, при детекции бета-лактамаз они, в лучшем случае, позволяют оценить факт наличия фермента, но не дают информацию о том, какой именно из нескольких сотен видов фермента присутствует. Ввиду этого одним из перспективных направлений в изучении и диагностики бета-лактамаз является использование молекулярно-генетических подходов: полимеразной цепной реакции (ПЦР), секвенирования, минисеквенирования (Малахова М.А., 2007).

Кроме того, при проведении мониторинга устойчивости микроорганизмов к бета-лактамазам важное место занимает адекватная видовая идентификация патогенов. Классические методы идентификации и типирования бактерий (бактериологический анализ) имеют ряд недостатков: сложность стандартизации, трудоемкость, время выполнения 48-72ч, необходимость поддержания жизнеспособности микроорганизма до проведения анализа и не всегда дают достоверную информацию о микробном агенте. Поэтому все большую популярность получают молекулярные методы идентификации микроорганизмов, в том числе масс-спектрометрический анализ (Wahl K.L., 2002).

В рутинной лабораторной практике из-за недостатка оборудования и отработанных протоколов исследования невозможно точно определить детерминанты устойчивости микроорганизмов к тем или иным антимикробным препаратам. С момента обнаружения первого фермента бета-лактамазы в 60-е годы эти ферменты эволюционировали, с каждым годом растет их разнообразие, происходит смена лидирующих групп (Сидоренко C.B., 2008). Поэтому изучение молекулярно-генетических механизмов устойчивости к бета-лактамным антибиотикам у грамотрицательных микроорганизмов методами бактериологического и молекулярно-генетического анализа является актуальным как в научном аспекте, так и в плане решения конкретных практических проблем.

Цель исследования: изучение молекулярно-генетических особенностей устойчивости к бета-лактамным антибиотикам у грамотрицательных микроорганизмов — возбудителей нозокомиальных инфекций - с помощью методов бактериологического и молекулярно-генетического анализа.

Для достижения поставленной цели были определены основные задачи:

1. Формирование лабораторной коллекции изолятов грамотрицательных бактерий, полученных из клиник различных городов Российской Федерации (РФ).

2. Видовая идентификация коллекции изолятов методом прямого белкового профилирования и оценка эффективности данного подхода для рутинного определения видовой принадлежности клинических изолятов.

3. Фенотипическая характеристика полученных изолятов и оценка чувствительности и специфичности фенотипических тестов для выявления бета-лактамаз различных классов у грамотрицательных микроорганизмов - возбудителей нозокомиальных инфекций.

4. Характеристика генетического разнообразия различных детерминант устойчивости грамотрицательных микроорганизмов - возбудителей нозокомиальных инфекций - к бета-лактамным антибиотикам.

Научная новизна.

• Показано преимущество метода прямого масс-спектрометрического профилирования для видовой идентификации бактерий семейства Enterobacteriaceae и неферментирующих грамотрицательных бактерий рода Pseudomonas или Acinetobacter.

• Установлено генетическое разнообразие всей совокупности генов бета-лактамаз, выявляемых среди изолятов семейства Enterobacteriaceae и неферментирующих грамотрицательных бактерий рода Pseudomonas и Acinetobacter.

• На основании анализа нуклеотидной последовательности геномной ДНК Enterobacter asburiae обнаружен ген blüAmpc, кодирующий не описанную ранее последовательность бета-лактамазы. Структура данного фермента изучена методом молекулярного моделирования.

• Впервые на территории РФ у представителя семейства Enterobacteriaceae, изолированного из мочи пациента интенсивной терапии Научно-исследовательского института нейрохирургии им. H.H. Бурденко РАМН, обнаружен ген Ь/а\тл-А, кодирующий металло-бета-лактамазу и описано его генетическое окружение.

Практическая значимость.

Результаты, полученные в ходе исследований по теме диссертационной работы, были использованы в клинической практике лаборатории микробиологии Национального агентства по клинической фармакологии и фармации для идентификации микроорганизмов и скрининга бета-лактамаз.

Результаты диссертационной работы были систематизированы и внедрены в педагогическую практику кафедры микробиологии РМАПО Минздравсоцразвития.

В приложении представлены копии документов, подтверждающих практическую значимость работы (справки от лаборатории микробиологии Национального агентства по клинической фармакологии и от кафедры микробиологии РМАПО Минздравсоцразвития).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Изучены молекулярно-генетические особенности устойчивости к бета-лактамным антибиотикам на основе сформированной коллекции из 145 изолятов грамотрицательных микроорганизмов - возбудителей нозокомиальных инфекций

2. Показана эффективность метода прямого белкового профилирования для видовой идентификации исследуемых грамотрицательных микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae и неферментирующих грамотрицательных бактерий рода Pseudomonas или Acinetobacter.

3. Фенотипическая характеристика полученных изолятов с применением панелей скрининговых и подтверждающих тестов с оценкой их чувствительности и специфичности показала большое разнообразие профилей антибиотикочувствительности у исследуемых возбудителей нозокомиальных инфекций.

4. С использованием оригинальных ПЦР тест-систем установлены генетические детерминанты (гены бета-лактамаз классов А, В, С и D), обусловливающие формирование устойчивости к бета-лактамным антибиотикам.

5. Установлены новые механизмы резистентности к бета-лактамным антибиотикам. На основании анализа нуклеотидной последовательности геномной ДНК изолята Е. asburiae обнаружен ген ^Атрс, кодирующий не описанную ранее аминокислотную последовательность фермента, структура белка изучена методом молекулярного моделирования. Впервые на территории РФ обнаружен клинический изолят Escherichia coü, содержащий ген металло-бета-лактамазы VIM-4, что свидетельствует о начавшемся процессе передачи этих генов от Pseudomonas spp к представителям семейства Enterobacteriaceae, потенциально приводящему к снижению эффективности карбапенемов в терапии инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены, обсуждены, опубликованы в материалах научно-практической конференции «Инфекции, вызываемые условно-патогенными микроорганизмами» (Россия, 2007), Международной конференции по антимикробным препаратам и химиотерапии (США, 2008), и одобрены на заседаниях кафедры микробиологии РМАПО Минздравсоцразвития в 20062009 гг..

Апробация диссертации состоялась на заседании кафедры микробиологии РМАПО Минздравсоцразвития 14 сентября 2009 года.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена самостоятельно.

Отдельные этапы работы были выполнены совместно с к.х.н. Икрянниковой JI.H., к.б.н. Эделынтейном М.В., к.б.н. Фурсовой Н.К. и соискателем Боровской А. Д.

Публикация научных исследований. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 работы опубликованы в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 140 листах и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, заключение по обзору литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и приложения. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 25 рисунками. Список использованной литературы включает 189 источник, из них 5 отечественных авторов, 184 - зарубежных авторов. 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы.

Бактерии. В работе были использованы 145 изолятов грамотрицательных бактерий, собранных в период с мая 2005 по апрель 2009 из ожоговых, хирургических отделений, отделений интенсивной терапии шести медицинских центров города Москвы, трех центров Пермской области, а также в больницах Санкт-Петербурга, Ярославля, Томска, Иркутска, Владивостока и Саратова.

Критериями включения изолятов в исследование были: принадлежность к семейству Enterobacteriaceae, либо к неферментирующим грамотрицательным бактериям рода Pseudomonas или Acinetobacter, а также снижение чувствительности хотя бы к одному из цефалоспоринов Ш поколения до уровня, предлагаемого Национальным комитетом по клиническим лабораторным стандартам США - CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institution, 2007).

Для идентификации бактерий в бактериологических лабораториях лечебных учреждений были использованы микроскопический и культуралыгый методы, а также коммерческие тест-системы, основанные на биохимических реакциях - MDCRO-LA-TEST (PLIVA-Lachema Diagnostika S.T.O., Чехия), BBL Crystal (BD, США), анализатор ATB-Expression (BioMerieux, Франция).

Также в работе были использованы референтные контрольные штаммы: Escherichia coli АТСС 25922, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853.

Определение чувствительности к антимикробным препаратам.

Чувствительность изолятов к ампициллину, амоксициллин с добавлением клавулановой кислоты, цефокситину,

цефоперазону/сульбактаму (2:1), цефотаксиму, цефепиму, цефепиму/сульбактаму (2:1) цефтазидиму, меропенему, имипенему, а также

гентамицину, амикацину, хлорамфениколу, ципрофлоксацину была определена методом серийных микроразведений в бульоне Мюллера-Хинтона (BBL, США) согласно рекомендациям и критериями, изложенных в Методических указаний по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (Методические указания, утвержденные Г.Г. Онищенко, 2004), а также CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institution, 2007) в 96-лунковых планшетах для иммунологических исследований.

Фенотипические тесты на наличие бета-лактамаз.

Была использована комбинация цефтазидим/клавуланат для детекции бета-лактамаз расширенного спектра методом серийных микроразведений в бульоне Мюллера-Хинтона (BBL, США) согласно рекомендациям и критериям CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institution, 2007). Для детекции бета-лактамаз AmpC был использован трехмерный АтрС-тест, который являлся адаптацией методов, описанных ранее для детекции бета-лактамаз класса А и С (P.E. Coudron, 2000; V. Manchanda, 2003). Изоляты с повышенной устойчивостью к карбапенемам были тестированы на продукцию металло-бета-лактамаз. Для определения присутствия металло-бета-лактамаз был использован метод двойных дисков с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) (О.В. Шевченко, 2007).

Идентификация изолятов методом прямого белкового профилирования. Масс-спектрометрический анализ был осуществлен в ФГУ НИИ ФХМ ФМБА России с использованием MALDI-TOF масс-спектрометра Microflex («Bruker Daltonics», Германия). Для записи, обработки и анализа масс-спектров было использовано программное обеспечение фирмы «Bruker Daltonics» (Германия): flexControl 2.4 (Build 38) и flexAnalysis 2.4 (Build 11). Кластерный анализ, сопоставление получаемых масс-спектров с имеющимися базами данных производили с помощью программного пакета Biotyper 2.0 (Bruker Daltonics, Германия).

Генетический анализ исследуемых изолятов.

Изоляты, подозрительные согласно критериям CLSI на продукцию бета-лактамаз, были исследованы методом полимеразной цепной реакции для детекции генов бета-лактамаз 1-ой группы, а также групп 2Ь (ТЕМ, SHV, СТХ), 2d (ОХА) и группы 3 (металло-Р-лактамазы) по классификации К. Bush (К. Bush, 1995). В исследовании были использованы оригинальные праймеры (Мудрак Д.Е., Сидоренко C.B., Ильина E.H., 2007), а также из работ Ellington et al. (M.J. Ellington, 2007), Perez-Perez et al. (F.J. Perez-Perez, 2002).

Для изучения генетического окружения бета-лактамаз у изолята Е. coli (№ 55) был применен метод ПЦР-картирования и секвенирования. В исследовании были использованы праймеры из работы Степановой М.Н. (Stepanova, 2008).

Выделение ДНК. ДНК из суточной культуры, выращенной на твердом агаре Мюллера-Хинтона (BBL, США), была выделена с помощью набора «ДНК-экспресс» (ООО НПФ «Литех», г. Москва), согласно инструкции.

Полимеразная цепная реакция была проведена в амплификаторе РТС-240 DNA Engine Tetrad2 (MJ Research Bio-Rad, США) с последующим анализом продуктов амплификации в 2%-ном агарозном геле.

Определение нуклеотидной последовательности генов проводили модифицированным методом Сенгера с использованием прибора ABI Prism® 3100 Genetic Analyzer ("Applied Biosystems", США; "Hitachi" Япония). Полноразмерную последовательность генов получали путем склеивания нуклеотидных фрагментов с использованием программного продукта «Vector NTI® Suite v. 9» (Informax Inc, США).

Для поиска гомологичных нуклеотидных или аминокислотных последовательностей в международных базах данных GenBank и EMBL была использована программа BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

Моделирование пространственной структуры новой бета-лактамазы AmpC-new методом предсказания структуры по гомологии.

Поиск пространственного шаблона для построения модели белка был произведен с помощью сервера FASTA

(http://www.ebi.ac.uk/Tools/fasta33/index.html) в базе структур белков PDB. В качестве пространственного шаблона был выбран белок бета-лактамаза АСТ-1, выделенный из штамма Klebsiella pneumoniae (A. Shimizu-Ibuka, 2008). Построение выравнивания аминокислотных последовательностей шаблон-модель было проведено с помощью сервера CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/V Для моделирования структуры бета-лактамазы AmpC-new был использован веб-сервис SWISS-PROT, (http://www.swissprot20.org/ ).

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. I. Использование метода прямого белкового профилирования для

идентификации микроорганизмов, включенных в исследование.

По результатам идентификации методами классической микробиологии, проведенной в местных лабораториях, полученные изоляты относились к видам К pneumoniae, Proteus spp, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae, E. coli, Citrobacter freundii, Providencia spp., Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescens. После идентификации методом прямого белкового профилирования, показано, что данный массив отличался большим видовым разнообразием и включал помимо представителей рода Klebsiella (К. oxytoca - 2 изолята, К. pneumoniae - 46 изолятов), 14 изолятов Proteus mirabilis, 21 изолят A. baumanii, 43 изолята Р. aeruginosa, 1 изолят Pseudomonas hibiscicola, 3 изолята Е. cloacae, 8 изолятов Е. coli, 3 изолята S. marcescens, также изоляты E. asburiae (1 изолят), Providencia rettgeri (1 изолят), Pro videncia Stuart i i (2 изолята).

Для подтверждения результатов идентификации методом прямого белкового профилирования проведен анализ нуклеотидной

последовательности амплифицированных фрагментов гена 168 рРНК методом секвенирования. Сравнение результатов видовой идентификации методами классической микробиологии, прямым белковым профилированием и секвенированием гена 16Б рРНК представлены в табл. 1.

Таблица 1. Сопоставление результатов видовой идентификации бактерий

различными методами

Микроорганизм Первичная идентификация (n, изолятов) Прямое белковое профилирование (п, изолятов) Анализ последовательности гена ШрРНК

Совпадения Различия

Рез-т белкового

£'. cloacae 2 1 A. ЬаитапИЛ профилирования подтвержден

Е. coli 6 6 0

К. аху/оса 2 2 0

К. pneumoniae 53 45 A. baumanii-tr, F. cloacae- 2, £. asburiae-1, E.coli-1 Рез-ты белкового профилирования подтверждены

Рез-т белкового

С. /reundii 1 0 Л coli- 1 профилирования подтвержден

Рез-ты белкового

P. mirabilis 16 14 P. aeroginosa-l. профилирования подтверждены

S. marcescens 3 3 0

Рез-т белкового

P. aeruginosa 42 41 P. hibiscicola-1 профилирования подтвержден

Рез-т белкового

A. èaumanii 17 16 Á' pneumoniae - 1 профилирования подтвержден

Providencia spp 3 3 0

Таким образом, в ходе исследования метод прямого белкового профилирования зарекомендовал себя как быстрый и достоверный способ видоспецифической идентификации бактерий. Анализ микроорганизмов позволяет получать с достаточным разрешением и точностью, воспроизводимую в стандартных условиях карту (профиль) белковых масс, которая является уникальной характеристикой для данного микроба по типу "отпечатков пальцев". Безусловным преимуществом метода прямого белкового профилирования является простой технологический процесс, не требующий затрат времени и средств на пересев микроорганизма на селективные среды, высокая скорость получения результатов (~ б мин / образец) и высокая диагностическая чувствительность (98 % по данным клинических испытаний). Данные характеристики метода позволяют предполагать его широкое использование в медицинской практике в будущем.

П. Анализ чувствительности к антибиотикам грамотрицательных микроорганизмов - возбудителей нозокомиальных инфекций.

1. Анализ профилей чувствительности клинических изолятов К. pneumoniae.

Согласно измерению МПК к цефотаксиму и цефтазидиму, все изоляты К. pneumoniae следует отнести к «не дикому» типу, то есть к обладающим некими механизмами устойчивости. В то же время, по уровню чувствительности к цефепиму часть изолятов следует отнести к «дикому» типу, лишенному механизмов устойчивости. Результаты оценки чувствительности изолятов К.pneumoniae, использованием критериев CLSI и EUCAST представлены в таблице 2. Таблица 2.

Интерпретация результатов оценки чувствительности изолятов К. pneumonia (п=46) с использованием критериев CLSI и EUCAST

Антибиотик Количество микроорганизмов, %

Устойчивые и с пониженной чувствительностью Чувствительные

CLSI EUCAST CLSI EUCAST

Ампициллин 100 100 0 0

Амоксициллин/клавуланат 97,8 97,8 2,2 2,2

Цефокситип 60,9 - 39,1 -

Цефотаксим 89,1 100 10,9 0

Цефепим 78,2 84,8 21,8 15,2

Цефтазидим 97,8 100 2,2 0

Цефоперазон/сульбактам* 41,3 - 58,7 -

Цефешш/сульбактам 26,1 - 73,9 -

Имипенем 4,3 8,7 95,7 91,3

Меропенем 6,5 8,7 93,5 91,3

Гентамицин 91,3 91,3 8,7 8,7

Хлорамфеиикол 82,6 - 17,4 -

Ципрофлоксащш 82,6 82,6 17,4 17,4

Примечание: * для оценки чувствительности к цефоперазону/сульбактаму использовали критерии, рекомендованные для цефоперазона.

Среди 46 изолятов К. pneumoniae положительный тест с клавулановой кислотой был выявлен в 29 случаях, что с высокой вероятностью свидетельствовало о продукции этими бактериями бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС). Среди 17 изолятов с отрицательными результатами теста с клавулановой кислотой у 14 трехмерный AmpC-тест дал положительный результат, что позволило предположить наличие у них механизма устойчивости связанного с продукцией АтрС бета-лактамаз. У 6 изолятов с положительными результатами теста с клавулановой кислотой также трехмерный АшрС-тест дал положительные результаты. При использовании метода двойных дисков с ЭДТА у всех исследуемых изолятов К. pneumoniae синергизм между карбапенемами и ЭДТА не был выявлен.

Таким образом, в отношении проблемных микроорганизмов среди изолятов К. pneumoniae наибольшую активность проявляли карбапенемы.

Помимо карбапенемов достаточно эффективным представляется использование цефепима в комбинации с сульбактамом в терапии инфекций, вызванных К pneumoniae.

2. Анализ профилей чувствительности клинических изолятов представителей семейства Enterobacteriaceae (кроме К. pneumoniae).

В таблице 3 приведены результаты интерпретации чувствительности остальных представителей семейства Enterobacteriaceae к бета-лактамным и другим антибиотикам с применением критериев CLSI и EUCAST. К их числу относились следующие изоляты: К. oxytoca- 2 изолята, Р. mirabiiis -14 изолятов, Е. cloacae - 3 изолята, Е. coli - 8 изолятов, S. marcescens - 3 изолята, Е. asburiae-1 изолят, Р. rettgeri-1 изолят, Р. stuartii- 2 изолята. Таблица 3.

Интерпретация результатов оценки чувствительности представителей семейства Ег^егоЬайепасеае (п=34) с использованием критериев СЬБ1 и ЕиСАБТ

Антибиотик Количество микроорганизмов, %

Устойчивые и промежуточные Чувствительные

CLSI EUCAST CLSI EUCAST

Ампициллин 100 100 0 0

Амоксициллин/клавуланат 79,4 97,1 20,6 2,9

Цсфокситин 35.3 . 64,7 .

Цсфотаксим 91,2 94,1 8,8 5,9

Цефепим 55,9 85,3 44,1 14,7

Цефтазидим 44,1 61.8 55,9 38,2

Цефоперазон/сульбактам* 29,4 70,6 .

Цефешш/сульбактам 14.7 . 85,3 .

Имипенем 5.9 14,7 94,1 85,3

Меропенем 2,9 14,7 97,1 85,3

Гентамицин 73,5 73,5 26,5 26,5

Хлорамфеникол 79.4 79,4 20.6 20,6

Ципрофлоксацин 67.6 67.6 32.4 32,4

Среди 34 представителей семейства ЕгйегоЬа^епасеае положительный тест с клавулановой кислотой был выявлен в 13 случаях, что с высокой вероятностью свидетельствовало о продукции этими бактериями БЛРС. Среди 21 изолята с отрицательными результатами теста с клавулановой кислотой у 4 трехмерный АшрС-тест дал положительный результат, что позволило предположить наличие у них механизма устойчивости связанного с продукцией АтрС бета-лактамаз. Лишь у 2 изолятов с положительными результатами теста с клавулановой кислотой также трехмерный АтрС-тест дал положительные результаты. У большинства изолятов тесты на бета-

лактамазы расширенного спектра и АтрС прошли с отрицательным результатом. Однако в ходе исследования был выявлен положительный результат в тесте на металло-бета-лактамазы у изолята E.coli, который проявлял чувствительность к карбапенемам в соответствии с критериями EUCAST.

Таким образом, в отношении проблемных микроорганизмов среди представителей семейства Enterobacteriaceae, кроме изолятов К. pneumoniae, наибольшую активность проявляли карбаленемы. Помимо карбапенемов, достаточно эффективным представляется использование цефепима в комбинации с сульбактамом в терапии инфекций, вызванных энтеробактериями.

3. Анализ профилей чувствительности клинических изолятов А. baumanii.

Оценка и интерпретация результатов изучения

антибиотикочувствительности A. baumanii представляет собой достаточно сложную задачу, поскольку для многих антибиотиков (включая все цефалоспорины) EUCAST не определил эпидемиологические точки отсечения. Таким образом, на сегодняшний день определить уровень природной чувствительности ацинетобактерий к цефлоспоринам не представляется возможным.

Результаты оценки чувствительности изолятов A. baumanii с использованием критериев CLSI и EUCAST представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Интерпретация результатов оценки чувствительности изолятов A. baumanii (п=21) с использованием критериев CLSI и EUCAST.

Антибиотик Количества микроорганизмов, %

Устойчивые и промежуточные Чувствительные

CLSI EUCAST CLSI EUCAST*

Цефепим 89,5 100* 10,5 0*

Цефтазидим 100 100* 0 0*

Цефоперазоц/сульбаетам - - - -

Гентамицин 89,5 89,5 10,5 10,5

Амтсацин 78,9 85,7 21,1 14,3

Ципрофлоксацин 100 100 0 0

Ишшенем 10,5 10,5 89,5 89,5

Меропенем 5,3 23,8 94,7 76,2

При использовании метода двойных дисков с ЭДТА среди исследуемых изолятов синергизм между карбапенемами и ЭДТА не был выявлен. Таким образом, в отношении проблемных микроорганизмов среди изолятов A. baumanii наибольшую активность проявляли карбапенемы. 4. Анализ профилей чувствительности клинических изолятов P. aeruginosa

Результаты оценки чувствительности изолятов P. aeruginosa с использованием критериев CLSI и EUCAST представлены в таблице 5. Таблица 5.

Интерпретация результатов оценки чувствительности изолятов P. aeruginosa (п = 44) с использованием критериев CLSI и EUCAST.

Антибиотик Количество микроорганизмов, %

Устойчивые и промежуточные Чувствительные

CLSI EUCAST CLSI EUCAST

Гентамицин 85,4 88,6 14,6 11,4

Амикацин 58,5 70,5 41,5 29,5

Ципрофлоксацин 90,3 95,5 9,7 4,5

Цефепим 65,9 65,9 34,1 34,1

Цефоперазон/сульбактам 78 - 22,0 -

Цефтазидим 73,2 70,5 26,8 29,5

Имипенем 65,9 65,9 34,1 34,1

Меропенем 78,1 79,5 21,9 20,5

При использовании метода двойных дисков с ЭДТА среди 44 исследуемых изолятов синергизм между карбапенемами и ЭДТА был выявлен в 5 случаях (11,4 %), что с высокой степенью вероятности свидетельствовало о продукции металло-бета-лактамаз этими микроорганизмами.

П1. Расшифровка механизмов устойчивости к бета-лактамным антибиотикам у грамотрицательных микроорганизмов - возбудителей нозокомиальных инфекций. 1. Расшифровка механизмов устойчивости К. pneumoniae к бета-лактамным антибиотикам

Наиболее очевидным результатом детекции основных детерминант резистентности к бета-лактамным антибиотикам у К pneumoniae и анализа полученных данных является большое разнообразие генотипов. Среди 46 изолятов обнаружено 18 различных комбинаций генов бета-лактамаз. Среди генов bla^c группа CMY оказалась наиболее часто встречающейся (обнаружены у 7 из 46 изолятов (15,2 %) и была распространена на территории всей Российской Федерации от Санкт-Петербурга (северозападный регион) до Владивостока (Дальний Восток). Изоляты, продуцирующие бета-лактамазы этой группы, проявляли высокий уровень резистентности к цефепиму, цефотаксиму и цефтазидиму. У трех изолятов тест с клавулановой кислотой дал положительный результат. У пяти изолятов был обнаружен низкий уровень чувствительности к меропенему (спектр

минимальной подавляющей концентрации (МПК) от 0,5 до 128,0 мкг/мл), однако генов металло-бета-лактамаз обнаружено не было.

Гены группы DHA были обнаружены у 9 изолятов (19,5 %), при этом 7 из них были получены из 1 центра в Томске. Все изоляты с ¿/оола были устойчивы к цефтазидиму, но большинство из них проявляли высокие или промежуточные уровни чувствительности к цефепиму и цефотаксиму согласно критериям CLSI. Ни у одного изолята тест с клавулановой кислотой не дал положительный результат. У 2 изолятов был обнаружен низкий уровень чувствительности к меропенему (спектр МПК от 1,0 до 16,0 мкг/мл).

Гены группы МОХ были обнаружены у 2 изолятов (4,3 %). Все изоляты с генами группы МОХ проявляли высокий уровень устойчивости к цефотаксиму и цефтазидиму. У одного изолята с blauох тест с клавулановой кислотой дал положительный результат. Уровень устойчивости к меропенему был достаточно высокий у этих групп изолятов (спектр МПК от 0,12 до 2,0 мкг/мл).

Гены группы MIR были обнаружены у 3 изолятов (6,5%), при этом 2 из них были получены из одного города - Санкт-Петербург. Изоляты с генами группы MIR проявляли различные уровни чувствительности к цефепиму, цефтазидиму и цефотаксиму. У двух изолятов тест с клавуланатом был положительный. Уровень устойчивости к карбапенемам был достаточно низкий (спектр МПК от 0,0625 до 0,5 мкг/мл).

Таким образом, в отдельных медицинских учреждениях мы наблюдали клональное распространение определенных генотипов, что позволило предположить о наличии, так называемых, госпитальных изолятов.

2. Расшифровка механизмов устойчивости у представителей семейства Enterobacteriaceae (кроме К pneumoniae к бета-лактамным антибиотикам.

Среди 34 изолятов остальных представителей семейства Enterobacteriaceae обнаружено 12 различных комбинаций генов бета-лактамаз.

Среди бактерий семейства Enterobacteriaceae преобладали изоляты, несущие одновременно гены двух групп бета-лактамаз (ТЕМ-1, СТХ-М1 - 26,5%), другие комбинации встречались с меньшей частотой (СТХ-М1, ОХА -14,7%, ТЕМ-1, SHV-1, СТХ-М1 - 8,8%, ТЕМ-1 - 8,8%).

2.1. Случаи выявления AmpC у изолятов семейства Enterobacteriaceae.

В ходе исследования был выявлен изолят Klebsiella oxytoca, несущий ген бета-лактамазы класса С - blau.пы в комбинации с Ь1а$т-\ и blacrx-ui-

Также в ходе исследования был обнаружен изолят P. mirabilis, несущий ген бета-лактамазы DHA-1 в комбинации с генами Ыа^емл и bla^ssi-x- Этот изолят был выделен от пациента из города Томск, где была выявлена подобная комбинация генов у 9 изолятов К. pneumoniae.

Помимо локализованных в плазмидной ДНК генов Ыактрс в ходе исследования у 2 изолятов (Е. cloacae и Е. asburiae) были обнаружены хромосомные гены данной группы. У изолята Е. asburiae обнаруженный ген M^Ampc-new содержал множественные нуклеотидные замены, которые не описывались ранее.

2.1.1. Моделирование пространственной структуры белка АтрС

Построение ЗВ-модели белка AmpC-new

На основании анализа нуклеотидной последовательности гена выведена аминокислотная последовательность белка этой бета-лактамазы, которая была использована для построения пространственной модели белка методом предсказания структуры по гомологии (веб-сервис SWISS-PROT, http://www.swissprot20.orgl). В качестве пространственного шаблона был выбран белок бета-лактамаза ACT-1, выделенный из штамма К. pneumoniae. Структура данной бета-лактамазы была получена Shimizu-Ibuka с соавторами в 2007 году методом ренттеноструктурного анализа с разрешением 2.4 А (А. Shimizu-Ibuka, 2008).

Анализ пространственной структуры белка AmpC-new.

В ходе анализа пространственной структуры бета-лактамазы AmpC-new (рис. 1) было установлено, что большинство аминокислотных замен, обнаруженных у AmpC-new не должны приводить к серьезным изменениям пространственной структуры белка, по сравнению с изученной ранее бета-лактамазой АСТ-1.

Рисунок 1. Модель белка AmpC-new. Цветом помечены активные центры и аминокислотные замены. Активные центры: сайт карбонилирования/гидроксилирования (8ег77, А1а331) - красный; сайт связывания амида (Абп 165, 01п133) -серый; сайт связывания гидроксила

(Tyrl63) - оранжевый; гидрофобный центр (Leul32, Leu306) - розовый; арильный центр (Asnl65, Туг234) - бирюзовый; сайты связывания воды (М228, Туг247) - светло-синий. Аминокислотные замены: полярные -зеленый, катионные - синий, гидрофобные - белый. 14,126,249, 250 -положение значимых аминокислотных замен. Голубой рамкой отмечена петля, где располагаются 2 значимые аминокислотные замены.

Однако были выявлены две аминокислотные замены, которые могут в некоторой степени повлиять на конформацию молекулы. Во-первых, это замена Argl4Gln, вследствие которой утрачивается солевой мостик с глутаминовой кислотой в положении 10 (GlulO). Это, возможно, снижает стабильность N-концевой спирали белка. Другие значимые замены -Arg249Gly и Lys250Gln - располагаются в петле и, по всей видимости, ведут к утрате солевых мостиков с аспарагиновой кислотой в положении 245.

Также важно отметить, что практически все замены расположены далеко от активных центров фермента и, таким образом, мало влияют на гидролитические свойства данного фермента. Лишь одна замена располагается вблизи от одного из сайтов связывания с водой. Это Lysl26Thr, которая располагается вблизи сайта связывания воды (Met228), вследствие этой замены теряется заряд в данной области, белок становится менее гидрофильным.

2.2. Случай выявления металло-бета-лактамазы у изолята Е. coli

При проведении исследований межлабораторной рабочей группой был обнаружен один изолят Е. coli, выделенный от пациента интенсивной терапии Научно-исследовательского института нейрохирургии им. H.H. Бурденко, продуцирующий металло-бета-лактамазу. Тесты на

чувствительность к антибиотикам показали, что данный изолят имеет высокий уровень устойчивости к большинству бета-лактамов: ампициллину, цефотаксиму, цефтазидиму, цефепиму, цефокситину (МПК, 256 мг/л). Особо примечательно было то, что он демонстрировал пониженную чувствительность к карбапенемам, хотя значения МПК имипенема (4 мкг/мл), эртапенема (2 мкг/мл) и меропенема (0,5 мкг/мл), которые были измерены с помощью метода разведений в бульоне, были в пределах чувствительности в соответствии со стандартами CLSI.

Повышение активности оксимино-цефалоспоринов в присутствии клавулановой кислоты свидетельствовало о продукции БЛРС, а синергизм между карбапенемами и ЭДТА свидетельствовал о продукции МБЛ.

При проведении ПЦР и анализе нуклеотидной последовательности методом секвенирования было выявлено присутствие гена Ыастг-м-is. Он располагался под элементом ISEc/r/. Гены ¿/огем и Ь1а$нг обнаружены не были.

Также в ходе исследования было обнаружено наличие гена металло-бета-лактамазы VIM-4. При расшифровке генетического окружения данного гена было выявлено, что он располагается внутри генной кассеты интегрона 1-го класса. После этой кассеты расположена генная кассета аасА7, dhß-J-aadAI и далее - генная кассета smr. В этом интегроне отсутствовала характерная область З'-CS и вместо этого он содержал \SPa2J-\0ke элемент (рис. 2)

INT/5CS V1M-F VIM-Ra dhfr-fow dhfr-bi »adA1-fw MdAI-few SMR-fev

A Сза КДНГ77) gaaz> aac_> yaui£ji> Сввши

Б < ; :.....:;.'.........:,"ИВ W > ¡mW " > tsQ ato* ,!1" I

в £зн ssvinr;—:> ¡käz> Bfflzz> rasEzzz)

г < ■...:...:.•"; да шшг—"> ежгг> шшг> ssasdzj

»ООО 2000 MOO MOO 5000

Рисунок 2. Структура интегрона класса 1, несущего генную кассету Ыаугм^у Е. ¿»//(№55) и у других бактерий семейства Enterobacteriaceae в Европе. А -Е. со//(№55)', Б - 1п416 К. pneumoniae (AJ704863, Италия); В - К. pneumoniae (AMI 81293, Тунис); Г - Е. cloacae (YSГреция).

В ходе проведения сравнительного анализа с литературными данными было выявлено, что строение комплекса генных кассет идентично интегронам, кодирующих VIM-4, обнаруженных у Е. cloacae из Греции (GB Асс.# EF467306), К pneumoniae из Италии (In416, GB Асс.# AJ704863) и К. рпеитотаеш Туниса (GB Асс.# АМ181293).

3. Расшифровка механизмов устойчивости A. baumanii к бета-лактамным антибиотикам.

Среди 21 изолятов A. baumanii обнаружено 6 различных комбинаций генов бета-лактамаз.

Среди изолятов A. baumanii наибольшее количество было выявлено генов бета-лактамаз семейства ОХА, как отдельно (21,1%), так и в комбинациях с другими бета-лактамазами: ТЕМ+СТХ+ОХА (5,3%), ТЕМ+ОХА (52,6%). Среди обнаруженных генов Ь/огЕм превалировала подгруппа ТЕМ-1 (80,0%), подгруппа ТЕМ-2 была обнаружена у 3 изолятов A. baumanii. Ген blacrx-Mi был обнаружен у 1 изолята, также единичные случаи выявления были у генов b/as,hv-iH b/asm.5.

4. Расшифровка механизмов устойчивости P. aeruginosa к бета-лактамным антибиотикам.

Среди 44 изолятов P. aeruginosa обнаружено 3 различных комбинаций генов бета-лактамаз (рис. 11). У 35 изолятов P. aeruginosa механизмы резистентности расшифрованы не были. Резистентность у них может быть связана с нарушением системы пориновых каналов или активацией механизмов эффлюкса, и как следствие, понижение эффективности транспорта антибиотика.

Гены бета-лактамаз класса В были обнаружены у 5 изолятов P.aeruginosa (11,8%). Все эти изоляты проявляли повышенную устойчивость к карбапенемам (спектр МПК от 8,0 до более 32,0 мкг/мл) и демонстрировали синергизм между карбапенемами и ЭДТА. ПЦР с последующим секвенированием показало наличие у всех изолятов гена металло-бета-лактамазы VIM-4.

В ходе исследования у изолятов P. aeruginosa в одном случае (2,3 %) был обнаружен ген Ыахъы-и в трех случаях (6,8 %) - комбинация ГеНОВ bloy^A-l и ^^trrx-Mi-

V. Оценка чувствительности и специфичности фенотипических тестов

для выявления бета-лактамаз различных классов.

1. Применение теста с клавулановой кислотой для быстрого выявления

изолятов, продуцирующих бета-лактамазы расширенного спектра. Было исследовано 103 изолята, среди них 98 удовлетворяли критериям включения в исследование, то есть проявляли повышенную устойчивость к цефалоспоринам расширенного спектра в соответствии с критериями CLSI, а именно к цефотаксиму (спектр МПК от 64 мкг/мл), либо к цефтазидиму (спектр МПК от 32 мкг/мл).

По результатам ПЦР гены бета-лактамаз расширенного спектра содержали 55 из 91 исследуемых изолятов (60,4 %), из них 31 К. pneumoniae, 2 К oxytoca, 10 P. mirabilis, 8 Е. colivi 4 A. baumanii. Тест с клавулановой кислотой дал положительный результат с 45 изолятами, несущими гены бета-лактамаз расширенного спектра. Отрицательный результат теста был у 30 изолятов, не несущих по данным ПЦР-анализа гены БЛРС. Кроме того, у 10 изолятов, содержащих гены БЛРС, результат фенотипического теста был отрицательный, а у 6 изолятов, у которых не были найдены гены БЛРС, фенотипический тест дал положительный результат. Таким образом, исходя из экспериментальных данных, чувствительность данного теста составила 88,2 %, а специфичность 75 %.

2. Применение трехмерного AmpC-теста для быстрого выявления изолятов, продуцирующих бета-лактамазы класса С. Было исследовано 79 изолята, среди них 64 удовлетворяли критериям включения в исследование, то есть проявляли повышенную или промежуточную устойчивость к цефокситину в соответствии с критериями CLSI (спектр МПК от 16 до >128 мкг/мл), либо были устойчивы к цефтазидиму или цефотаксиму в соответствии с критериями CLSI (спектр МПК от 16 до >128 мкг/мл), а также показывали отрицательный результат в тесте на наличие БЛРС. В исследование были также включены изоляты, которые проявляли промежуточную резистентность или были устойчивы к цефокситину и, согласно тесту с клавулановой кислотой, продуцировали БЛРС.

По результатам ПЦР гены бета-лактамаз класса С содержали 24 из 72 исследуемых изолятов (33,3 %), из них 21 К. pneumoniae, 1 К. oxytoca, 1 Р. mirabilis, 1 Е cloacae, 1 Е. asburiae. Гены БЛРС присутствовали у 49 (68,1%)

исследуемых изолятов, из них 28 К. pneumoniae, 2 К. oxytoca, 1 P. mirabilis, 6 F. coli. Трехмерный AmpC-тест дал положительный результат с 27 изолятами, несущими гены бета-лактамаз класса С (рис. 2А). Отрицательный результат теста был у 36 изолятов, не несущих по данным ПЦР-анализа гены АтрС. Кроме того, у 1 изолята, содержащего ген ¿/йьна-ь результат трехмерного AmpC-теста был отрицательный. Таким образом, исходя из экспериментальных данных, чувствительность данного теста составила 97,9 %, а специфичность 100 %.

3. Применение метода двойных дисков с ЭДТА для выявления изолятов, продуцирующих металло-бета-лактамазы.

Было исследовано 145 изолятов, среди них 64 удовлетворяли критериям включения в исследование, то есть проявляли повышенную или промежуточную устойчивость к карбапенемам (имипенему или меропенему) в соответствии с критериями CLSI (спектр МПК от 4 до >32 мкг/мл). В исследование было включено 31 изолят Р. aeruginosa, 1 изолят Р. hibiscicola, 1 изолят Е. coli, 2 изолята P. mirabilis, 6 изолятов К. pneumoniae. По результатам ПЦР 6 из этих изолятов несли ген металло-бета-лактамазы VIM-4. При использовании методы двойных дисков с ЭДТА положительный результат был у 6 изолятов с подтвержденным наличием гена металло-бета-лактамазы, у остальных 25 изолятов гены МБЛ не были выявлены. Таким образом, исходя из экспериментальных данных, чувствительность и специфичность данного теста составила 100 %.

Выводы

1. Методом прямого белкового профилирования установлена видовая принадлежность 145 изолятов грамотрицательных микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, рода Pseudomonas и Acinetobacter, полученных из клиник различных городов РФ. Результаты идентификации полностью совпали с данными анализа нуклеотидной последовательности гена /rj-(16SpPHK) указанных микроорганизмов.

2. Проведена фенотипическая характеристика собранной коллекции изолятов грамотрицательных микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, рода Pseudomonas и Acinetobacter с применением панелей скрининговых и подтверждающих тестов с оценкой их чувствительности и специфичности. Показано большое разнообразие профилей антибиотикочувствительности у исследуемых возбудителей нозокомиальных инфекций.

3. С использованием оригинальных ПЦР тест-систем выявлены разнообразные генетические детерминанты, обуславливающие формирование устойчивости к бета-лакгамным антибиотикам исследуемых грамотрицательных микроорганизмов.

4. На основании анализа нуклеотидной последовательности геномной ДНК изолята Е. asburiae обнаружен ген АтрС, кодирующий не описанную ранее аминокислотную последовательность бета-лактамазы. Изучение структуры данного фермента методом

молекулярного моделирования выявила незначительные изменения в конформации белка, которые могут обусловливать новые свойства фермента.

5. Впервые на территории РФ обнаружен клинический изолят Е. coli, изолированный из мочи пациента интенсивной терапии Научно-исследовательского института нейрохирургии им. H.H. Бурденко, содержащий ген металло-бета-лакгамазы VTM-4. Эти данные свидетельствуют о начавшемся процессе передачи генов метало-бета-лактамаз от Pseudomonas spp к представителям семейства Enterobacteriaceae, потенциально приводящему к снижению эффективности карбапенемов в терапии грамотрицательных бактерий.

Список опубликованных работ

1. Мудрак, Д. Е. Изучение распространенности и молекулярных механизмов антибиотикорезистентности у грамотрицательных возбудителей нозокомиальных инфекций в стационарах Москвы и Перми /Д. Е. Мудрак, J1. Н. Икрянникова, С. В. Сидоренко, Е. Н. Ильина //Антибиотики и химиотерапия. — 2007. - Т. 52, №7/8. - C.IO-16.

2. Захарова, Ю. А. Распространенность полирезистентных изолятов условно-патогенной микрофлоры в многопрофильном хирургическом стационаре /Ю. А. Захарова, Д. Е. Мудрак //Вестник Российской военно-медицинской академии. -2008. -Приложение 2(22). - часть II. - С.459-460.

3. Миронов, А. Ю. Фенотипическое и генетическое изучение антибиотикочувствительности и молекулярных механизмов резистентности к ß-лактамам патогенов внутрибольничных инфекций /А. Ю. Миронов, И. В. Крапивина, Д. В. Иванов, Д. Е. Мудрак //Курский научно-практический вестник «Человек и здоровье». -2009. -№2. -С.78- 88.

4. Мудрак Д.Е., Икрянникова Л.Н. Механизмы устойчивости грамотрицательных бактерий возбудителей нозокомиальных инфекций к бета-лактамным антибиотикам // Тезисы Научно-практической конференции «Инфекции, вызываемые условно-патогенными микроорганизмами». - Москва, 2007.

5. Mudrak D., Ilina Е., Kruglov A., Fursova N., Sidorenko S. Diversity of class С ß-lactamases among Klebsiella spp. in Russia // Thesis from Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. -Washington, 2008.

6. Shevchenko 0., Edelstein M., Sidorenko S., Mudrak D., Ikiyannikova L., Alexandrova I. First report of the Escherichia coli co-producing CTX-M-15 ESBL and VIM-4 MBL in Russia // Thesis from Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - Washington, 2008.

Формат 60x90/16. Заказ 876. Тираж 100 экз.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, ул. Кедрова, д. 15, тел. 774-26-96

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мудрак, Дарья Евгеньевна

Введение.

Цель и задачи исследования.

Научная новизна.

Практическая значимость.

Основные положения, выносимые на защиту.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Механизм действия бета-лактамных антибиотиков.

1.2. Механизмы антибактериальной устойчивости.

1.3. Классификация и происхождение бета-лактамаз.

1.4. Характеристика сериновых бета-лактамаз.

1.4.1. Бета-лактамазы класса А.

1.4.2. Бета-лактамазы класса С.

1.4.3. Бета-лактамазы класса D.

1.5. Характеристика металло-бета-лактамаз (МБЛ).

1.6. Генетическая локализация бета-лактамаз.

1.6.1. Генетическая локализация сериновых бета-лактамаз класса А.

1.6.2. Генетическая локализация МБЛ.

1.6.3. Генетическая локализация сериновых бета-лактамаз класса С.

1.7. Клиническое значение бета-лактамаз.

1.7.1. Клиническое значение бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС).

1.7.2. Клиническое значение бета-лактамаз АтрС.

1.7.3. Клиническое значение МБЛ.

1.8. Детекция бета-лактамаз.

1.8.1. Критерии чувствительности грамотрицательных микроорганизмов к бета-лактамным антибиотикам (БЛА).

1.8.2. Фенотипические методы детекции бета-лактамаз

1.8.3. Молекулярные методы в исследовании феномена устойчивости к БЛА.

1.9. Белковое моделирование.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Бактериальные штаммы.

2.2. Анализ фенотипов антибиотикорезистентности.

2.2.1. Определение чувствительности к антимикробным препаратам.

2.2.2. Фенотипические тесты на наличие бета-лактамаз.

2.3. Идентификация штаммов методом прямого белкового профилирования.

2.4. Генетический анализ исследуемых штаммов.

2.4.1. Определение нуклеотидной последовательности гена 16SpPHK.

2.4.2. Выявление генетических маркеров устойчивости к

2.5. Моделирование пространственной структуры новой бета-лактамазы AmpC-new методом предсказания структуры по гомологии.

Глава 3. Результаты.

3.1 Использование метода прямого белкового профилирования для идентификации микроорганизмов, включенных в исследование.

3.2 Анализ чувствительности к антибиотикам грамотрицательных микроорганизмов - возбудителей нозокомиальных инфекций.

3.2.1. Анализ профилей чувствительности клинических изолятов К. pneumonia.

3.2.2. Анализ профилей чувствительности клинических изолятов представителей семейства Enterobacteriaceae (кроме К. pneumoniae).

3.2.3. Анализ профилей чувствительности клинических изолятов A. baumanii.

3.2.4. Анализ профилей чувствительности клинических изолятов P. aeruginosa.

3.3. Расшифровка механизмов устойчивости к БЛА у грамотрицательных микроорганизмов - возбудителей нозокомиальных инфекций.

3.3.1. Расшифровка механизмов устойчивости К. pneumoniae к БЛА.

3.3.2. Расшифровка механизмов устойчивости у представителей семейства Enterobacteriaceae (кроме

К. pneumoniae) к БЛА.

3.3.2.1. Случаи выявления AmpC у изолятов семейства Enterobacteriaceae.

3.3.2.2. Случай выявления МБЛ у штамма E.coli.

3.3.3. Расшифровка механизмов устойчивости A. baumanii к БЛА.

3.3.4. Расшифровка механизмов устойчивости Р. aeruginosa к БЛА.

3.4. Оценка чувствительности и специфичности фенотипических тестов для выявления бета-лактамаз различных классов.

3.4.1. Применение теста с клавулановой кислотой для выявления штаммов, продуцирующих БЛРС.

3.4.2. Применение трехмерного AmpC-теста для выявления штаммов, продуцирующих бета-лактамазы класса С.

3.4.3. Применение метода двойных дисков с этилен-диамин-тетрауксусной кислотой для выявления штаммов, продуцирующих МБЛ.

Глава 4. Обсуждение.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетические особенности устойчивости к бета-лактамным антибиотикам грамотрицательных микроорганизмов - возбудителей нозокомиальных инфекций"

Широкое применение в медицинской практике антибиотиков привело к значительным изменениям в этиологической структуре и росту антибактериальной резистентности возбудителей инфекционных болезней [33]. Инфекции, вызванные резистентными штаммами, отличаются длительным течением, чаще требуют госпитализации, при этом увеличивается продолжительность пребывания в стационаре и ухудшается прогноз для пациентов [164].

Многочисленные негативные социально-экономические последствия распространения антибактериальной резистентности вынудили Всемирную организацию здравоохранения (ВОЗ) разработать и опубликовать в 2001 году «Глобальную стратегию ВОЗ по сдерживанию устойчивости к противомикробным препаратам», в которой рекомендовано рассматривать указанную проблему в качестве одного из приоритетов национальных систем здравоохранения [1]. В приведенном документе указывается, что расшифровка молекулярных механизмов резистентности необходима для создания новых препаратов и средств диагностики, а также для оптимизации режимов этиотропной терапии.

Традиционно основу лечения инфекций, вызываемых бактериями этой группы, составляли бета-лактамные - антибиотики и, прежде всего, цефалоспорины 111 поколения. Однако эффективность этой группы антибиотиков в последние годы резко снизилась в связи с распространением среди возбудителей нозокомиальных инфекций штаммов, продуцирующих бета-лактамазы расширенного спектра класса А (группа 2Ье по К. Bush, [37]). Альтернативу цефалоспоринам III поколения составляют цефалоспорины IV поколения, карбапеиемы и ингибитор-защищенные бета-лактамы, применение которых в медицинской практике постоянно расширяется.

В ответ на изменения в стратегии и тактике применения антибиотиков в различных регионах мира происходят изменения в распространении отдельных групп и классов бета-лактамаз - смена лидирующих групп [4]. К наиболее важным тенденциям следует отнести увеличение частоты выделения бета-лактамаз класса С (группы 1 и le по K.Bush, [37]) и появление карбапенемаз, прежде всего, относящихся к классу В (группы 3 и За по K.Bush, [37]) -металло-бета-лактамаз.

Кроме того, при проведении мониторинга устойчивости микроорганизмов к бета-лактамазам важное место занимает адекватная видовая идентификация патогенов. Классические методы идентификации и типирования бактерий (бактериологический анализ) имеют ряд недостатков: сложность стандартизации, трудоемкость, время выполнения 48-72ч, необходимость поддержания жизнеспособности микроорганизма до проведения анализа и не всегда дают достоверную информацию о микробном агенте. Поэтому все большую популярпость получают молекулярные методы идентификации микроорганизмов, в том числе масс-спектрометрический анализ [180].

В рутинной лабораторной практике из-за недостатка оборудования и отработанных протоколов исследования невозможно точно определить детерминанты устойчивости микроорганизмов к тем или иным антимикробным препаратам. С момента обнаружения первого фермента бета-лактамазы в 60-е годы эти ферменты эволюционировали, с каждым годом растет их разнообразие, происходит смена лидирующих групп [4]. Поэтому изучение молекулярно-генетических механизмов устойчивости к бета-лактамным антибиотикам у грамотрицательных микроорганизмов методами бактериологического и молекулярно-генетического анализа является актуальным как в научном аспекте, так и в плане решения конкретных практических проблем.

Цель исследования: изучение молекулярно-генетических особенностей устойчивости к бета-лактамным антибиотикам у грамотрицательных микроорганизмов - возбудителей нозокомиальных инфекций - с помощью методов бактериологического и молекулярно-генетического анализа.

Для достижеиия поставленной цели были определены основные задачи:

4. Характеристика генетического разнообразия различных детерминант устойчивости грамотрицательных микроорганизмов — возбудителей нозокомиальных инфекций - к бета-лактамным антибиотикам.

Научная новизна.

• На основании анализа пуклеотидной последовательности геномной ДНК Enterobacter asburiae обнаружен ген blaAтрС, кодирующий не описанпую ранее последовательность бета-лактамазы. Структура данного фермента изучена методом молекулярного моделирования.

• Впервые на территории РФ у представителя семейства Enterobacteriaceae, изолированного из мочи пациента интенсивной терапии Научно-исследовательского института нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко РАМН, обнаружен ген bla.yiM-4, кодирующий металло-бета-лактамазу и описано его генетическое окружение.

Практическая значимость.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Изучены молекулярно-генстические особенности устойчивости к бета-лактамным антибиотикам па основе сформированной коллекции из 145 изолятов грамотрицательных микроорганизмов - возбудителей нозокомиальных инфекций

3. Фенотипическая характеристика полученных изолятов с применением панелей скринипговых и подтверждающих тестов с оценкой их чувствительности и специфичности показала большое разнообразие профилей антибиотикочувствительности у исследуемых возбудителей нозокомиальных инфекций.

5. Установлены новые механизмы резистентности к бета-лактамным антибиотикам. На основании анализа нуклеотидной последовательности геномной ДНК изолята Е. asburiae обнаружен ген ЫаАтрС, кодирующий не описанную ранее аминокислотную последовательность фермента, структура белка изучена методом молекулярного моделирования. Впервые на территории РФ обнаружен клинический изолят Escherichia coli, содержащий ген металло-бета-лактамазы VIM-4, что свидетельствует о начавшемся процессе передачи этих генов от Pseudomonas spp к представителям семейства Enterobacteriaceae, потенциально приводящему к снижению эффективности карбапенемов в терапии инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Мудрак, Дарья Евгеньевна

выводы

1. Методом прямого белкового профилирования установлена видовая принадлежность 145 изолятов грамотрицательных микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, рода Pseudomonas и Acinetobacter, полученных из клиник различных городов РФ. Результаты идентификации полностью совпали с данными анализа нуклеотидной последовательности гена rrs (16SpPHK) указанных микроорганизмов.

3. С использованием оригинальных ПЦР тест-систем выявлены разнообразные генетические детерминанты, обуславливающие формирование устойчивости к бета-лактамным антибиотикам исследуемых грамотрицательных микроорганизмов.

4. На основании анализа нуклеотидной последовательности геномной ДНК изолята Е. asburiae обнаружен геи АтрС, кодирующий не описанную ранее аминокислотную последовательность бета-лактамазы. Изучение структуры данного фермента методом молекулярного моделирования выявила незначительные изменения в конформации белка, которые могут обусловливать новые свойства фермента.

5. Впервые на территории РФ обнаружен клинический изолят Е. coli, изолированный из мочи пациента интенсивной терапии Научно-исследовательского института нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко, содержащий ген металло-бета-лактамазы VIM-4. Эти данные свидетельствуют о начавшемся процессе передачи генов метало-бета-лактамаз от Pseudomonas spp к представителям семейства Enterobacteriaceae, потенциально приводящему к снижению эффективности карбапенемов в терапии грамотрицательных бактерий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Изучение молекулярно-генетичееких особенностей формирования устойчивости к бета-лактамным антибиотикам у грамотрицательных микроорганизмов на территории Российской Федерации методами бактериологии и молекулярно-генетического анализа является актуальным как в научном аспекте, так и в плане решения конкретных практических проблем. Это обусловлено, во-первых, широким распространением в последнее время резистентности к антимикробным препаратам у грамотрицательных микроорганизмов; во-вторых, в клинической практике проблемные штаммы исследуются только с помощью традиционных микробиологических методов, зачастую устаревших, и мало информативных, поэтому очевидна необходимость в использовании молекулярно-генетичееких методов.

В представленной работе предложен комплексный подход к изучению основных детерминант резистентности грамотрицательных микроорганизмов к бета-лактамным антибиотикам. Представлены данные по обнаружению бета-лактамаз различных классов, в том числе класса С, который ранее на территории РФ практически не выявлялся.

В работе исследованы возможности прямого белкового профилирования для характеристики штаммов грамотрицательных бактерий, получены результаты, которые указывают на возможность использования этого подхода для видовой идентификации возбудителей.

В ходе исследования была проведена оценка нескольких подтверждающих тестов на присутствие бета-лактамаз, исследованы чувствительность и специфичность предложенных методик.

Впервые на территории РФ обнаружен и тщательно охарактеризован штамм E.coli, несущий МБЛ, что является клинически значимым явлением.

Также у штамма Е. asburiae выявлен ген бета-лактамазы AmpC, несущий множество нуклеотидных замен, не описанных ранее.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мудрак, Дарья Евгеньевна, Москва

1. Всемирная организация здравоохранения. Глобальная стратегия ВОЗ по сдерживанию устойчивости к противомикробным препаратам. Женева; 2001.

2. Бондаренко В.М., Петровская В.Г., Нестерова Н.И. Проблема патогенности клебсиелл. Ульяновск; 2000.

3. Малахова М.В., Верещагин В.А., Ильина Е.Н., Говорун В.М., Филимонова О.Ю. Грудинина С.А., Сидоренко С.В. MALDI-ToF масс-спектрометрия в анализе резистентности Streptococcus pneumoniae к фторхинолонам. Антибиотики и химиотерапия. 2007, 52 (1): 10-7.

4. Сидоренко С.В., Тишков В.И. Молекулярные основы резистентности к антибиотикам. Успехи биологической химии. 2004, 44: 263-306.

5. Шевченко О.В. Э.М.В., Степанова М.Н. Металло-бета-лактамазы: значение и методы выявления у грамотрицательных неферментирующих бактерий. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2007, 9(3): 211-219.

6. Abraham Е.Р. ,Chain Е. An enzyme from bacteria able to destroy penicillin. 1940. Rev Infect Dis. 1988, 10(4): 677-678.

7. Alvarez M., Tran J.H., Chow N.,Jacoby G.A. Epidemiology of conjugative plasmid-mediated AmpC beta-lactamases in the United States. Antimicrob Agents Chemother. 2004, 48(2): 533-537.

8. Ambler R.P. The structure of beta-lactamases. Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci. 1980, 289(1036): 321-331.

9. Anhalt J.P., Fenselau C. Identification of bacteria using mass spectrometry. Analytical Chemistry. 1975, 47 219-225.

10. Arakawa Y., Murakami M., Suzuki K., Ito H., Wacharotayankun R., Ohsuka S., Kato N.,Ohta M. A novel integron-like element carrying the metallo-beta-lactamase gene blalMP. Antimicrob Agents Chemother. 1995, 39(7): 1612-1615.

11. Arpin C., Labia R., Andre C., Frigo C., El Harrif Z.,Quentin C. SHV-16, a beta-lactamase with a pentapeptide duplication in the omega loop. Antimicrob Agents Chemother. 2001, 45(9): 2480-2485.

12. Babic M., Hujer A.M.,Bonomo R.A. What's new in antibiotic resistance? Focus on beta-lactamases. Drug Resist Updat. 2006, 9(3): 142-156.

13. Barcenilla Gaite F., Jover Saenz A., Vallverdu Vidal M.,Castellana Perello D. New therapeutic options for the treatment of multiresistant bacteria in the ICU. Rev Esp Quimioter. 2008, 21 Spec No 1: 9-13.

14. Barlow M. ,Hall B.G. Origin and evolution of the AmpC beta-lactamases of Citrobacter freundii. Antimicrob Agents Chemother. 2002, 46(5): 11901198.

15. Barnaud G., Arlet G., Verdet C., Gaillot O., Lagrange P.H.,Philippon A. Salmonella enteritidis: AmpC plasmid-mediated inducible beta-lactamase (DHA-1) with an ampR gene from Morganella morganii. Antimicrob Agents Chemother. 1998, 42(9): 2352-2358.

16. Bauernfeind A., Chong Y.,Lee K. Plasmid-encoded AmpC beta-lactamases: how far have we gone 10 years after the discovery? Yonsei Med J. 1998, 39(6): 520-525.

17. Bauernfeind A., Chong Y.,Schweighart S. Extended broad spectrum beta-lactamase in Klebsiella pneumoniae including resistance to cephamycins. Infection. 1989, 17(5): 316-321.

18. Bauernfeind A., Schneider I., Jungwirth R., Sahly H.,Ullmann U. A novel type of AmpC beta-lactamase, ACC-1, produced by a Klebsiella pneumoniae strain causing nosocomial pneumonia. Antimicrob Agents Chemother. 1999, 43(8): 1924-1931.

19. Bauernfeind A., Stemplinger I., Jungwirth R.,Giamarellou H. Characterization of the plasmidic beta-lactamase CMY-2, which is responsible for cephamycin resistance. Antimicrob Agents Chemother. 1996, 40(1): 221-224.

20. Bauernfeind A., Wagner S., Jungwirth R., Schneider I.,Meyer D. A novel class С beta-lactamase (FOX-2) in Escherichia coli conferring resistance to cephamycins. Antimicrob Agents Chemother. 1997, 41(9): 2041-2046.

21. Bellais S., Aubert D., Naas T.,Nordmann P. Molecular and biochemical heterogeneity of class В carbapenem-hydrolyzing beta-lactamases in

22. Chryseobacterium meningosepticum. Antimicrob Agents Chemother. 2000, 44(7): 1878-1886.

23. Bellais S., Girlich D., Karim A.,Nordmann P. EBR-1, a novel Ambler subclass B1 beta-lactamase from Empedobacter brevis. Antimicrob Agents Chemother. 2002, 46(10): 3223-3227.

24. Berezin A.G., Romashov O.M., Iakovlev S.V.,Sidorenko S.V. Characteristics and clinical value of extended-spectrum beta-lactamases. Antibiot Khimioter. 2003, 48(7): 5-11.

25. Bonnet R. Growing group of extended-spectrum beta-lactamases: the CTX-M enzymes. Antimicrob Agents Chemother. 2004, 48(1): 1-14.

26. Bonnet R., De Champs C., Sirot D., Chanal C., Labia R.,Sirot J. Diversity of ТЕМ mutants in Proteus mirabilis. Antimicrob Agents Chemother. 1999, 43(11): 2671-2677.

27. Bounaga S., Laws A.P., Galleni M.,Page M.I. The mechanism of catalysis and the inhibition of the Bacillus cereus zinc-dependent beta-lactamase. BiochemJ. 1998, 331 ( Pt 3): 703-711.

28. Boyer-Mariotte L.R., B. Hanau, A. Philippon, M. M. ,Sanson-LePors a.G.A. 38th Intersci. Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1998.

29. Bradford P.A. Extended-spectrum beta-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat. Clin Microbiol Rev. 2001, 14(4): 933-951, table of contents.

30. Brun-Buisson C., Abrouk F., Legrand P., Huet Y., Larabi S.,Rapin M. Diagnosis of central venous catheter-related sepsis. Critical level of quantitative tip cultures. Arch Intern Med. 1987, 147(5): 873-877.

31. Bush K. Characterization of beta-lactamases. Antimicrob Agents Chemother. 1989, 33(3): 259-263.

32. Bush K., Jacoby G.A.,Medeiros A.A. A functional classification scheme for beta-lactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrob Agents Chemother. 1995, 39(6): 1211-1233.

33. Cao V.T., Arlet G., Ericsson B.M., Tammelin A., Courvalin P.,Lambert T. Emergence of imipenem resistance in Klebsiella pneumoniae owing to combination of plasmid-mediated CMY-4 and permeability alteration. J Antimicrob Chemother. 2000, 46(6): 895-900.

34. Castanheira M., Toleman M.A., Jones R.N., Schmidt F.J.,Walsh T.R. Molecular characterization of a beta-lactamase gene, blaGIM-1, encoding a new subclass of metallo-beta-lactamase. Antimicrob Agents Chemother. 2004, 48(12): 4654-4661.

35. Chaibi E.B., Sirot D., Paul G.,Labia R. Inhibitor-resistant ТЕМ beta-lactamases: phenotypic, genetic and biochemical characteristics. J Antimicrob Chemother. 1999, 43(4): 447-458.

36. Chen Y., Cheng J., Wang Q., Ye Y., Li J.B.,Zhang X.J. ACT-3, a novel plasmid-encoded class С beta-lactamase in a Klebsiella pneumoniae isolate from China. Int J Antimicrob Agents. 2009, 33(1): 95-96.

37. Chen Y., Delmas J., Sirot J., Shoichet В.,Bonnet R. Atomic resolution structures of CTX-M beta-lactamases: extended spectrum activities from increased mobility and decreased stability. J Mol Biol. 2005, 348(2): 349362.

38. Chen Y., Sueci J., Tenover F.C.,Koehler T.M. Beta-lactamase genes of the penicillin-susceptible Bacillus anthracis Sterne strain. J Bacteriol. 2003, 185(3): 823-830.

39. CLSI. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. Sixteenth informational supplement. Clinical and Laboratory Standards Institution, Wayne, Pa. 2009.

40. Coudron P.E., Moland E.S.,Thomson K.S. Occurrence and detection of AmpC beta-lactamases among Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, and Proteus mirabilis isolates at a veterans medical center. J Clin Microbiol. 2000,38(5): 1791-1796.

41. Datta N. ,Kontomichalou P. Penicillinase synthesis controlled by infectious R factors in Enterobacteriaceae. Nature. 1965, 208(5007): 239-241.

42. Du Bois S.K., Marriott M.S.,Amyes S.G. ТЕМ- and SHV-derived extended-spectrum beta-lactamases: relationship between selection, structure and function. J Antimicrob Chemother. 1995, 35(1): 7-22.

43. Dubois V., Arpin C., Noury P.,Quentin C. Clinical strain of Pseudomonas aeruginosa carrying a bla(TEM-21) gene located on a chromosomal interrupted TnA type transposon. Antimicrob Agents Chemother. 2002, 46(11): 3624-3626.

44. Dubois V., Poirel L., Arpin C., Coulange L., Bebear C., Nordmann P.,Quentin C. SHV-49, a novel inhibitor-resistant beta-lactamase in a clinical isolate of Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother. 2004,48(11): 4466-4469.

45. Dubus A., Normark S., Kania M.,Page M.G. The role of tyrosine 150 in catalysis of beta-lactam hydrolysis by AmpC beta-lactamase from Escherichia coli investigated by site-directed mutagenesis. Biochemistry. 1994, 33(28): 8577-8586.

46. Egorova S., Kaftyreva L., Grimont P.A.,Weill F.X. Prevalence and characterization of extended-spectrum cephalosporin-resistant nontyphoidal Salmonella isolates in adults in Saint Petersburg, Russia (2002-2005). Microb Drug Resist. 2007, 13(2): 102-107.

47. Ellington M.J., Kistler J., Livermore D.M.,Woodford N. Multiplex PCR for rapid detection of genes encoding acquired metallo-beta-lactamases. J Antimicrob Chemother. 2007, 59(2): 321-322.

48. Fortineau N., Poirel L.,Nordmann P. Plasmid-mediated and inducible cephalosporinase DHA-2 from Klebsiella pneumoniae. J Antimicrob Chemother. 2001, 47(2): 207-210.

49. Garau G., Garcia-Saez I., Bebrone C., Anne C., Mercuri P., Galleni M., Frere J.M.,Dideberg O. Update of the standard numbering scheme for class В beta-lactamases. Antimicrob Agents Chemother. 2004, 48(7): 2347-2349.

50. Gazouli M., Kaufmann M.E., Tzelepi E., Dimopoulou H., Paniara 0.,Tzouvelekis L.S., Study of an outbreak of cefoxitin-resistant Klebsiella pneumoniae in a general hospital. J Clin Microbiol. 1997, 35(2): 508-510.

51. Ghuysen J.M. Molecular structures of penicillin-binding proteins and beta-lactamases. Trends Microbiol. 1994, 2(10): 372-380.

52. Giamarellou H. Multidrug resistance in Gram-negative bacteria that produce extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs). Clin Microbiol Infect. 2005, 11 Suppl 4: 1-16.

53. Ginalski K., Comparative modeling for protein structure prediction. Curr Opin Struct Biol. 2006, 16(2): 172-177.

54. Girlich D., Karim A., Spicq C.,Nordmann P. Plasmid-mediated cephalosporinase ACC-1 in clinical isolates of Proteus mirabilis and Escherichia coli. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2000, 19(11): 893-895.

55. Gniadkowski M. Evolution and epidemiology of extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs) and ESBL-producing microorganisms. Clin Microbiol Infect. 2001,7(11): 597-608.

56. Hall B.G., Salipante S.J.,Barlow M. The metallo-beta-lactamases fall into two distinct phylogenetic groups. J Mol Evol. 2003, 57(3): 249-254.

57. Hanson N.D., Thomson K.S., Moland E.S., Sanders C.C., Berthold G.,Penn R.G. Molecular characterization of a multiply resistant Klebsiella pneumoniae encoding ESBLs and a plasmid-mediated AmpC. J Antimicrob Chemother. 1999, 44(3): 377-380.

58. Helfand M.S. ,Bonomo R.A. Beta-lactamases: a survey of protein diversity. Curr Drug Targets Infect Disord. 2003, 3(1): 9-23.

59. Heritage J., M'Zali F.H., Gascoyne-Binzi D.,Hawkey P.M. Evolution and spread of SHV extended-spectrum beta-lactamases in gram-negative bacteria. J Antimicrob Chemother. 1999, 44(3): 309-318.

60. Hillisch A., Pineda L.F.,Hilgenfeld R. Utility of homology models in the drug discovery process. Drug Discov Today. 2004, 9(15): 659-669.

61. Honore N., Nicolas M.H.,Cole S.T. Inducible cephalosporinase production in clinical isolates of Enterobacter cloacae is controlled by a regulatory gene that has been deleted from Escherichia coli. EMBO J. 1986, 5(13): 3709-3714.

62. Horii Т., Arakawa Y., Ohta M., Sugiyama Т., Wacharotayankun R., Ito H.,Kato N. Characterization of a plasmid-bome and constitutively expressed blaMOX-1 gene encoding AmpC-type beta-lactamase. Gene. 1994, 139(1): 93-98.

63. Hossain A., Reisbig M.D.,Hanson N.D. Plasmid-encoded functions compensate for the biological cost of AmpC overexpression in a clinical isolate of Salmonella typhimurlum. J Antimicrob Chemother. 2004, 53(6): 964-970.

64. Hussain M., Carlino A., Madonna M.J.,Lampen J.O. Cloning and sequencing of the metallothioprotein beta-lactamase II gene of Bacillus cereus 569/H in Escherichia coli. J Bacterid. 1985, 164(1): 223-229.

65. Institute C.a.L.S. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; Approved standard seventh edition. Clinical and Laboratory Standards Institution, Wayne, Pa 2007.

66. Institute C.a.L.S. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. Sixteenth informational supplement. Clinical and Laboratory Standards Institution, Wayne, Pa. 2007.

67. Ivanov D.V. Antibiotic susceptibility and molecular mechanisms of cephalosporins resistance in Klebsiella isolates from patients with hospital-acquired infections. Antibiot Khimioter. 2006, 51(11-12): 29-36.

68. Jack G.W., Richmond M.H. A comparative study of eight distinct beta-lactamases synthesized by gram-negative bacteria. J Gen Microbiol. 1970, 61(1): 43-61.

69. Jacobs C., Frere J.M.,Normark S. Cytosolic intermediates for cell wall biosynthesis and degradation control inducible beta-lactam resistance in gram-negative bacteria. Cell. 1997, 88(6): 823-832.

70. Jacoby G.A. AmpC beta-lactamases. Clin Microbiol Rev. 2009, 22(1): 161182, Table of Contents.

71. Jacoby G.A. ,Medeiros A.A. More extended-spectrum beta-lactamases. Antimicrob Agents Chemother. 1991,35(9): 1697-1704.

72. Jacoby G.A. ,Tran J. Sequence of the MIR-1 beta-lactamase gene. Antimicrob Agents Chemother. 1999,43(7): 1759-1760.

73. James P.A.,Reeves D.S. Bacterial resistance to cephalosporins as a function of outer membrane permeability and access to their target. J Chemother.1996, 8 Suppl 2: 37-47.

74. Jaurin В., Grundstrom Т., Edlund T.,Normark S. The E. coli beta-lactamase attenuator mediates growth rate-dependent regulation. Nature. 1981, 290(5803): 221-225.

75. Jones R.N., Kirby J.T.,Rhomberg P.R. Comparative activity of meropenem in US medical centers (2007): initiating the 2nd decade of MYSTIC program surveillance. Diagn Microbiol Infect Dis. 2008, 61(2): 203-213.

76. Karas M. B.D., Bahr U., Hillenkamp F. Matrix-assisted ultraviolet laser desorption of non-volatile compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 1987, 78(24): 53-68.

77. Kaye K.S., Cosgrove S., Harris A., Eliopoulos G.M.,Carmeli Y., Risk factors for emergence of resistance to broad-spectrum cephalosporins among Enterobacter spp. Antimicrob Agents Chemother. 2001, 45(9): 2628-2630.

78. Knothe H., Shah P., Krcmery V., Antal M.,Mitsuhashi S. Transferable resistance to cefotaxime, cefoxitin, cefamandole and cefuroxime in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Serratia marcescens. Infection. 1983, 11(6): 315-317.

79. Koeck J.L., Arlet G., Philippon A., Basmaciogullari S., Thien H.V., Buisson Y.,Cavallo J.D. A plasmid-mediated CMY-2 beta-lactamase from an Algerian clinical isolate of Salmonella senftenberg. FEMS Microbiol Lett.1997, 152(2): 255-260.

80. Kohler T.M., Michea-Hamzehpour U., Henze N., Gotoh L., Curty K., Pechere J. C. Characterization of MexE-MexF-OprN, a positively regulated multidrug efflux system of Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol. 1997, 23(2): 345-354.

81. Kuga A., Okamoto R.,Inoue M. ampR gene mutations that greatly increase class С beta-lactamase activity in Enterobacter cloacae. Antimicrob Agents Chemother. 2000, 44(3): 561-567.

82. Kumar A. ,Schweizer H.P. Bacterial resistance to antibiotics: active efflux and reduced uptake. Adv Drug Deliv Rev. 2005, 57(10): 1486-1513.

83. Lee K., Lee W.G., Uh Y., Ha G.Y., Cho J.,Chong Y. VIM- and IMP-type metallo-beta-lactamase-producing Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp. in Korean hospitals. Emerg Infect Dis. 2003, 9(7): 868-871.

84. Levesque R., Roy P.H., Letarte R.,Pechere J.C. A plasmid-mediated cephalosporinase from Achromobacter species. J Infect Dis. 1982, 145(5): 753-761.

85. Livermore D.M. Beta-Lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin Microbiol Rev. 1995, 8(4): 557-584.

86. Livermore D.M. Interplay of impermeability and chromosomal beta-lactamase activity in imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. 1992, 36(9): 2046-2048.

87. Lynn E.C., Chung M.C., Tsai W.C.,Han C.C. Identification of Enterobacteriaceae bacteria by direct matrix-assisted laser desorptiom/ionization mass spectrometric analysis of whole cells. Rapid CommunMass Spectrom. 1999, 13(20): 2022-2027.

88. Manchanda V. ,Singh N.P. Occurrence and detection of AmpC beta-lactamases among Gram-negative clinical isolates using a modified three-dimensional test at Guru Tegh Bahadur Hospital, Delhi, India. J Antimicrob Chemother. 2003, 51(2): 415-418.

89. Marchandin H., Carriere C., Sirot D., Pierre H.J.,Darbas H. TEM-24 produced by four different species of Enterobacteriaceae, including Providencia rettgeri, in a single patient. Antimicrob Agents Chemother. 1999, 43(8): 2069-2073.

90. Massidda O., Rossolini G.M.,Satta G. The Aeromonas hydrophila cphA gene: molecular heterogeneity among class В metallo-beta-lactamases. J Bacteriol. 1991, 173(15): 4611-4617.

91. Massova I. ,Mobashery S. Kinship and diversification of bacterial penicillin-binding proteins and beta-lactamases. Antimicrob Agents Chemother. 1998, 42(1): 1-17.

92. Medeiros A. A. Beta-lactamases. Br Med Bull. 1984,40(1): 18-27.

93. Medeiros A.A. Evolution and dissemination of beta-lactamases accelerated by generations of beta-lactam antibiotics. Clin Infect Dis. 1997, 24 Suppl 1: S19-45.

94. Miriagou V., Carattoli A., Tzelepi E., Villa L.,Tzouvelekis L.S. IS26-associated In4-type integrons forming multiresistance loci in enterobacterial plasmids. Antimicrob Agents Chemother. 2005, 49(8): 3541-3543.

95. Miriagou V., Tzouvelekis L.S., Villa L., Lebessi E., Vatopoulos A.C., Carattoli A.,Tzelepi E. CMY-13, a novel inducible cephalosporinase encoded by an Escherichia coli plasmid. Antimicrob Agents Chemother. 2004, 48(8): 3172-3174.

96. Morosini M.I., Negri M.C., Shoichet В., Baquero M.R., Baquero F.,Blazquez J. An extended-spectrum AmpC-type beta-lactamase obtained by in vitro antibiotic selection. FEMS Microbiol Lett. 1998, 165(1): 85-90.

97. Mugnier P., Dubrous P., Casin I., Arlet G.,Collatz E. A TEM-derived extended-spectrum beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. 1996, 40(11): 2488-2493.

98. Nathisuwan S., Burgess D.S.,Lewis J.S. 2nd, Extended-spectrum beta-lactamases: epidemiology, detection, and treatment. Pharmacotherapy. 2001, 21(8): 920-928.

99. Nukaga M., Haruta S., Tanimoto K., Kogure K., Taniguchi K., Tamaki M.,Sawai T. Molecular evolution of a class С beta-lactamase extending its substrate specificity. J Biol Chem. 1995, 270(11): 5729-5735.

100. Owens J., Robert С. ,Rice L. Hospital-Based Strategies for Combating Resistance. Clinical Infectious Diseases. 2006, 42(s4): SI73-S181.

101. Page M.I. The mechanisms of reactions of beta-lactam antibiotics. Advances in physical organic chemistry. 1987, 23: 165-270.

102. Palzkill Т., Thomson K.S., Sanders C.C., Moland E.S., Huang W.,Milligan T.W. New variant of ТЕМ-10 beta-lactamase gene produced by a clinical isolate of Proteus mirabilis. Antimicrob Agents Chemother. 1995, 39(5): 1199-1200.

103. Partridge S.R. ,Hall R.M. Evolution of transposons containing blaTEM genes. Antimicrob Agents Chemother. 2005, 49(3): 1267-1268.

104. Payne D.J., Woodford N.,Amyes S.G. Characterization of the plasmid mediated beta-lactamase BIL-1. J Antimicrob Chemother. 1992, 30(2): 119127.

105. Perez-Perez F.J. ,Hanson N.D. Detection of plasmid-mediated AmpC beta-lactamase genes in clinical isolates by using multiplex PCR. J Clin Microbiol. 2002, 40(6): 2153-2162.

106. Philippon A., Arlet G.,Jacoby G.A. Plasmid-determined AmpC-type beta-lactamases. Antimicrob Agents Chemother. 2002, 46(1): 1-11.

107. Philippon A., Labia R.,Jacoby G. Extended-spectrum beta-lactamases. Antimicrob Agents Chemother. 1989, 33(8): 1131-1136.

108. Poirel L., Decousser J.W.,Nordmann P. Insertion sequence ISEcplB is involved in expression and mobilization of a bla(CTX-M) beta-lactamase gene. Antimicrob Agents Chemother. 2003, 47(9): 2938-2945.

109. Poirel L., Heritier C., Podglajen I., Sougakoff W., Gutmann L.,Nordmann P. Emergence in Klebsiella pneumoniae of a chromosome-encoded SHV beta-lactamase that compromises the efficacy of imipenem. Antimicrob Agents Chemother. 2003, 47(2): 755-758.

110. Poirel L., Mammeri H.,Nordmann P. TEM-121, a novel complex mutant of TEM-type beta-lactamase from Enterobacter aerogenes. Antimicrob Agents Chemother. 2004, 48(12): 4528-4531.

111. Poirel L., Naas T.,Nordmann P. Genetic support of extended-spectrum beta-lactamases. Clin Microbiol Infect. 2008, 14 Suppl 1: 75-81.

112. Preston K.E., Venezia R.A.,Stellrecht K.A. The SHV-5 extended-spectrum beta-lactamase gene of pACMl is located on the remnant of a compound transposon. Plasmid. 2004, 51(1): 48-53.

113. Prinarakis E.E., Miriagou V., Tzelepi E., Gazouli M.,Tzouvelekis L.S. Emergence of an inhibitor-resistant beta-lactamase (SHV-10) derived from an SHV-5 variant. Antimicrob Agents Chemother. 1997, 41(4): 838-840.

114. Prinarakis E.E., Tzelepi E., Gazouli M., Mentis A.F.,Tzouvelekis L.S. Characterization of a novel SHV beta-lactamase variant that resembles the SHV-5 enzyme. FEMS Microbiol Lett. 1996, 139(2-3): 229-234.

115. Quiroga M.I., Franceschini N., Rossolini G.M., Gutkind G., Bonfiglio G., Franchino L.,Amicosante G. Interaction of cefotetan and the metallo-beta-lactamases produced in Aeromonas spp. and in vitro activity. Chemotherapy. 2000, 46(3): 177-183.

116. Rasmussen B.A. ,Bush K. Carbapenem-hydrolyzing beta-lactamases. Antimicrob Agents Chemother. 1997, 41(2): 223-232.

117. Rasmussen B.A., Gluzman Y.,Tally F.P. Cloning and sequencing of the class В beta-lactamase gene (ccrA) from Bacteroides fragilis TAL3636. Antimicrob Agents Chemother. 1990, 34(8): 1590-1592.

118. Recchia G.D. ,Hall R.M. Gene cassettes: a new class of mobile element. Microbiology. 1995, 141 (Pt 12): 3015-3027.

119. Richmond M.H. ,Sykes R.B. The beta-lactamases of gram-negative bacteria and their possible physiological role. Adv Microb Physiol. 1973, 9: 31-88.

120. Rossolini G.M., D Andrea M.M.,Mugnaioli C. The spread of CTX-M-type extended-spectrum beta-lactamases. Clin Microbiol Infect. 2008, 14 Suppl 1: 33-41.

121. Saavedra M.J., Peixe L., Sousa J.C., Henriques I., Alves A.,Correia A. Sfh-I, a subclass B2 metallo-beta-lactamase from a Serratia fonticola environmental isolate. Antimicrob Agents Chemother. 2003, 47(7): 23302333.

122. Sanger F., Nicklen S.,Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA. 1977, 74(12): 5463-5467.

123. Shimizu-Ibuka A., Bauvois C., Sakai H.,Galleni M. Structure of the plasmid-mediated class С beta-lactamase ACT-1. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2008, 64(Pt 5): 334-337.

124. Simm A.M., Higgins C.S., Pullan S.T., Avison M.B., Niumsup P., Erdozain O., Bennett P.M.,Walsh T.R. A novel metallo-beta-lactamase, Mbllb, produced by the environmental bacterium Caulobacter crescentus. FEBS Lett. 2001,509(3): 350-354.

125. Stapleton P.D., Shannon K.P.,French G.L., Carbapenem resistance in Escherichia coli associated with plasmid-determined CMY-4 beta-lactamase production and loss of an outer membrane protein. Antimicrob Agents Chemother. 1999, 43(5): 1206-1210.

126. Sturenburg E. ,Mack D. Extended-spectrum beta-lactamases: implications for the clinical microbiology laboratory, therapy, and infection control. J Infect. 2003, 47(4): 273-295.

127. Sykes R.B., K. Bush. Physiology, biochemistry and inactivation of beta-lactamases, ed. M.G. R. B. Morin. Vol. 3. 1982, London: Academic Press.

128. Tanaka K. W.H., Ido Y., Akita S., Yoshida Y., Yoshida T. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 1988, 2(20): 151-153.

129. Tessier F., Arpin C., Allery A.,Quentin C. Molecular characterization of a TEM-21 beta-lactamase in a clinical isolate of Morganella morganii. Antimicrob Agents Chemother. 1998, 42(8): 2125-2127.

130. Toleman M.A., Bennett P.M.,Walsh T.R. Common regions e.g. orf513 and antibiotic resistance: IS91-like elements evolving complex class 1 integrons. J Antimicrob Chemother. 2006, 58(1): 1-6.

131. Toleman M.A., Bennett P.M.,Walsh T.R. ISCR elements: novel gene-capturing systems of the 21st century? Microbiol Mol Biol Rev. 2006, 70(2): 296-316.

132. Turner P.J. MYSTIC Europe 2007: activity of meropenem and other broad-spectrum agents against nosocomial isolates. Diagn Microbiol Infect Dis. 2009, 63(2): 217-222.

133. Tzouvelekis L.S. ,Bonomo R.A. SHV-type beta-lactamases. Curr Pharm Des. 1999, 5(11): 847-864.

134. Tzouvelekis L.S., Tzelepi E., Tassios P.T.,Legakis N.J. CTX-M-type beta-lactamases: an emerging group of extended-spectrum enzymes. Int J Antimicrob Agents. 2000, 14(2): 137-142.

135. Van Bambeke F., Balzi E.,Tulkens P.M. Antibiotic efflux pumps. Biochem Pharmacol. 2000, 60(4): 457-470.

136. Walsh T.R., Gamblin S., Emery D.C., MacGowan A.P.,Bennett P.M. Enzyme kinetics and biochemical analysis of ImiS, the metallo-beta-lactamase from Aeromonas sobria 163a. J Antimicrob Chemother. 1996, 37(3): 423-431.

137. Walsh T.R., Hall L., Assinder S.J., Nichols W.W., Cartwright S.J., MacGowan A.P.,Bennett P.M. Sequence analysis of the LI metallo-beta-lactamase from Xanthomonas maltophilia. Biochim Biophys Acta. 1994, 1218(2): 199-201.

138. Walsh T.R., Toleman M.A., Poirel L.,Nordmann P. Metallo-beta-lactamases: the quiet before the storm? Clin Microbiol Rev. 2005, 18(2): 306-325.

139. Watanabe M., Iyobe S., Inoue M.,Mitsuhashi S. Transferable imipenem resistance in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. 1991,35(1): 147-151.

140. Weldhagen G.F. Integrons and beta-lactamases~a novel perspective on resistance. Int J Antimicrob Agents. 2004, 23(6): 556-562.

141. Wiedemann В., Dietz H.,Pfeifle D. Induction of beta-lactamase in Enterobacter cloacae. Clin Infect Dis. 1998, 27 Suppl 1: S42-47.

142. Woese C.R. A New Biology for a New Century. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2004, 68(2): 173-186.

143. Woese C.R. ,Fox G.E. Phylogenetic structure of the prokaryotic domain: the primary kingdoms. Proc Natl Acad Sci USA. 1977, 74(11): 5088-5090.

144. Zhang Y. ,Skolnick J. Automated structure prediction of weakly homologous proteins on a genomic scale. Proc Natl Acad Sci USA. 2004, 101(20): 7594-7599.

Информация о работе

Мудрак, Дарья Евгеньевна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.00.07

Диссертация

Молекулярно-генетические особенности устойчивости к бета-лактамным антибиотикам грамотрицательных микроорганизмов - возбудителей нозокомиальных инфекций - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы