Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение препаратов О-антигенов Vibrio cholerae для производства холерных химических вакцин

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Получение препаратов О-антигенов Vibrio cholerae для производства холерных химических вакцин"

На правах рукописи

Алешина Юлия Александровна

ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ О-АНТИГЕНОВ VIBRIO CHOLERAE ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ХОЛЕРНЫХ ХИМИЧЕСКИХ ВАКЦИН

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г 11,оя 2013

Саратов - 2013

005539564

Работа выполнена в Федеральном казенном учреждении здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:

кандидат медицинских наук,

старший научный сотрудник Еремин Сергей Александрович

кандидат технических наук,

доцент Комиссаров Александр Владимирович

Официальные оппоненты:

Девдариани Зураб Леванович, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, главный научный сотрудник организационно-методического отдела

Давыдкин Валерий Юрьевич, доктор биологических наук, доцент, Федеральное бюджетное учреждение науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, руководитель отдела медицинской биотехнологии Ведущая организация:

Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится 26 декабря 2013 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора.

Автореферат разослан

2013 г.

Ученый секретарь диссертационного доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Слудский А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. На современном этапе холера продолжает оставаться одной из актуальных, социально-значимых и имеющих международное значение особо опасных инфекционных болезней, единичные случаи и вспышки которой рассматриваются как чрезвычайная ситуация [Онищенко Г.Г. и др., 2011]. Заслуживает внимания, что возбудитель холеры отнесен к категории В - высокоприоритетных патогенов, которые могут быть использованы в качестве биологического оружия [Ломов Ю.М. и др., 2007; Онищенко Г.Г. и др., 2000].

О-антиген холерного вибриона является одним из основных протективных антигенов, отвечающих за формирование антибактериального иммунитета [Freter R., 1976; Johnson G. et al., 1996; Meeks M.D. et al., 2004] и входит в состав практически всех вакцин, предназначенных для специфической профилактики холеры [Онищенко Г.Г. и др., 2011]. Медицинские иммунобиологические препараты являются наиболее эффективными средствами профилактики холеры [Кутырев В.В. и др., 2006]. В Российской Федерации вакцинация против холеры входит в календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям.

Российская холерная химическая вакцина, сконструированная и производимая в институте «Микроб» [Анисимов П.И. и др., 1997;, Джапаридзе М.Н. и др., 1991], основными компонентами которой являются холероген-анатоксин и О-антигены, продуциремые токсигенными клетками холерного вибриона сероваров Инаба и Огава, не уступает по эффективности оральной холерной вакцине WC-rBS [Онищенко Г.Г. и др., 2011; Щуковская Т.Н. и др., 2009]. В технологии производства холерной химической таблетированной вакцины института «Микроб» используются токсигенные штаммы Vibrio cholerae. Работа с вирулентными штаммами в условиях производства повышает риск заражения персонала при возникновении аварийных ситуаций.

В РосНИПЧИ «Микроб» сконструированы авирулентные атоксигенные штаммы холерного вибриона V. cholerae eltor KM 263 Инаба [Ливанова Л.Ф. и др., 2011], V. cholerae eltor KM 262 Огава [Стрельникова-Ааб E.H. и др., 2011], являющиеся продуцентами Ol антигенов. Для продукции 0139 антигена возможно использование авирулентного атоксигенного штамма V. cholerae М 377 0139. Эти штаммы холерного вибриона перспективны для создания отечественной современной химической вакцины против холеры. Однако на данный момент отсутствует масштабируемая технология глубинного культивирования атоксигенных штаммов V. cholerae — продуцентов О-антигенов.

В 90-ых годах прошлого столетия были проведены исследования по концентрированию и очистки О-антигена с использованием ультрафильтрации на полых волокнах [Громова О.В. и др., 1999], что позволило создать промышленную технологию концентрирования О-антигена, продуцируемого клетками холерного вибриона штамма М41 серовара Огава [Дятлов И.А. и др., 2011; Нижегородцев С.А., 2003]. Однако используемый метод имеет ряд недостатков, связанных с тем, что фильтрация протекает в тупиковом режиме: значительные потери полуфабри-

ката, низкая удельная скорость фильтрации. Таким образом, актуальность научных исследований по совершенствованию технологии концентрирования О-антигенов холерного вибриона является очевидной.

В этой связи разработка экспериментальной масштабируемой технологии глубинного культивирования атоксигенных штаммов холерного вибриона -продуцентов О-антигенов и совершенствование процесса концентрирования нативных О-антигенов является важным и перспективным направлением научных исследований.

Цель работы. Исследовать процесс глубинного культивирования атоксигенных штаммов V. сИо1егае - продуцентов О-антигенов и оптимизировать процесс концентрирования нативных О-антигенов.

Задачи исследования:

1. Изучить основные микробиологические свойства атоксигенных штаммов холерного вибриона - продуцентов О-антигенов после длительного хранения.

2. Исследовать физиологические и морфологические особенности атоксигенных штаммов холерного вибриона - продуцентов О-антигенов в ходе их глубинного культивирования.

3. Выявить биокинетические особенности процесса глубинного культивирования атоксигенных штаммов холерного вибриона - продуцентов О-антигенов.

4. Определить оптимальные технологические параметры процесса культивирования атоксигенных штаммов V. с1ю1егае - продуцентов О-антигенов.

5. Усовершенствовать технологию концентрирования О-антигенов холерного вибриона методом ультрафильтрации.

6. Изучить антигенные, биохимические, физико-химические и иммунобиологические особенности О-антигенов, полученных с использованием экспериментальной технологии.

7. Изучить нормируемые свойства коммерческого препарата таблетированной холерной вакцины, полученного по усовершенствованной технологии.

Научная новизна работы заключается в том, что изучены основные морфологические и фенотипические свойства атоксигенных штаммов V. с1го1егае — продуцентов О-антигенов после длительного (36 месяцев) хранения. Показано, что штаммы сохраняют свои основные культуралыю-морфологические свойства и высокий уровень биосинтеза О-антигенов.

Впервые исследованы физиологические и морфологические особенности атоксигенных штаммов холерного вибриона — продуцентов О-антигенов в ходе их глубинного культивирования. Показано, что при введении основного источника углеводного питания (глюкозы) происходит закисление культуральной жидкости, что требует добавления корригирующего раствора.

Впервые с помощью атомно-световой микроскопии проведен сравнительный анализ морфологических особенностей бактериальных клеток атоксигенных штаммов V. сИо1егае КМ 263 биовара Эль Тор серовара Инаба, V. с!ю!егае КМ 262 биовара Эль Тор серовара Огава и V. сИокгае М 377 0139 серогруппы, выращен-

пых в условиях глубинного культивирования. Выявлено, что клетки всех трех штаммов холерного вибриона, выращенных при температурах 30 °С и 37 °С, имеют сходный размер и морфологию.

Экспериментально обоснованы оптимальные технологические параметры (температура, продолжительность, профиль введения глюкозы, время добавления аммиака и пеногасителей) процесса культивирования атоксигенных штаммов холерного вибриона - продуцентов О-антигенов, позволяющие получать нативные О-аптигены в препаративных количествах.

Впервые показано, что рост атоксигенных штаммов возбудителя холеры — продуцентов О-антигенов зависит не только от концентрации субстрата, но и от концентрации продукта биосинтеза, причем его накопление снижает скорость роста микроорганизмов.

Усовершенствована технология концентрирования О-антигенов холерного вибриона тангенциальной ультрафильтрацией, защищенная патентом на изобретение № 2445116 «Способ концентрирования нативного холерного О-антигена Vibrio cholerae». Определено, что наиболее эффективно концентрирование О-антигенов V. cholerae с использованием мембран с НОММ, равной 500 кДа.

Установлены оптимальные параметры процесса концентрирования: напор на входе ультрафильтрационного аппарата - 2,5 бар, давление на выходе - 0,5 бар; температура продукта - 37 °С.

Впервые изучен химический состав сублимационно высушенных О-антигенов, полученных из атоксигенных штаммов холерного вибриона. Показано, что препараты О-антигены, полученные из атоксигенных и токсигенных штаммов имеют сходный белковый и полисахаридный состав.

В результате сравнительного анализа иммунохимических и физико-химических свойств О-антигенов V. cholerae М-41 серовара Огава, полученных по регламентной и усовершенствованной технологиям концентрирования, выявлено подобие их характеристик.

Практическая значимость работы заключается в том, что разработана масштабируемая технология глубинного культивирования атоксигенных штаммов холерного вибриона - продуцентов О-антигенов, позволяющая получать полуфабрикаты протективных антигенов соответствующих показателям качества на коммерческую холерную вакцину.

На основании проведенных исследований по разработке технологии получения О-антигенов из атоксигенных штаммов холерных вибрионов выработаны рекомендации по её использованию в технологии приготовления холерной вакцины. Усовершенствованная технология концентрирования О-антигена V. cholerae М-41 серовара Огава внедрена в технологию производства коммерческой холерной вакцины.

Разработаны методические рекомендации:

«Концентрирование протективных антигенов холерного вибриона методом тангенциальной фильтрации», одобренные Учёным советом РосНИПЧИ «Мик-

роб» (протокол № 2 от 18 марта 2011 г.) и утверждённые директором института 11 июня 2011 г.;

«Аппаратное культивирование атоксигенных штаммов холерного вибриона -продуцентов О-антигенов», одобренные Учёным советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 8 от 26 декабря 2012 г.) и утверждённые директором института 27 декабря 2012 г.

Результаты исследований использовались при разработке регламента производства № ПР 01898109-39-12 «Вакцина холерная бивалентная химическая, таблетки, покрытые кишечнорастворимой оболочкой», утвержденного директором РосНИПЧИ «Микроб» 11 июля 2012 г.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Атоксигенные штаммы V. скокгае - продуценты О-антигенов сохраняют высокий уровень биосинтеза О-антигенов и свои основные микробиологические свойства в процессе длительного (36 месяцев) хранения.

2. Разработана масштабируемая технология глубинного культивирования атоксигенных штаммов холерного вибриона - продуцентов О-антигенов.

3. Технология концентрирования нативных холерных О-антигенов тангенциальной ультрафильтрацией обладает преимуществом перед процессом, протекающим в тупиковом режиме.

4. Коммерческая серия вакцины холерной бивалентной химической таблетированной, полученная по усовершенствованной технологии концентрирования О-антигена V. с!ю1егае серовара Огава, соответствует требованиям нормативной документации.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и представлены на 14 и 15 международных школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века», (Пущино, 2010, 2011); Международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения-2010», (Саратов, 2010); Совещаниях специалистов Роспотребнадзора по вопросам совершенствования эпидемиологического надзора за холерой (Ростов-на-Дону, 2013); VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011); научно-практической конференции молодых ученых «Инновационные технологии в противоэпидемической защите населения» (Нижний Новгород, 2011); III научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, Московская область, 2011); XI Межгосударственной научно-практической конференции «Современные технологии в совершенствовании мер предупреждения и ответных действий на чрезвычайные ситуации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения» (Саратов, 2012); Международной научно-практической конференции «Биотехнология: реальность и перспективы», (Саратов, 2013), на научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных

исследований в институте «Микроб» (Саратов 2011-2013 гг.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, их них 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК, 1 патент на изобретение.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 223 цитируемых работы, из них 140 отечественных и 83 зарубежных. Общий объем диссертации составляет 140 страниц. Текст иллюстрирован 28 таблицами и 15 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Для продукции О-антигена (О-АГ) использовали штаммы холерного вибриона:V.cholerae М-41 классического биовара серовара Огава, V.cholerae КМ262 биовара Эль Тор серовара Огава, V.cholerae КМ263 биовара Эль Тор серовара Инаба, V.cholerae М377 0139 серогруппы. Для контроля иммуногенности вакцины использовали штаммы холерного вибриона: V.cholerae . М879 Эль Тор биовара серовара Инаба и V.cholerae Р-3122 Эль Тор биовара серовара Огава.

Выращивание клеток V. cholerae штаммов КМ 263 и КМ 262, а также V. cholerae М 377 0139 осуществляли на пилотном ферментере вместимостью 20 л. Культивирование штамма V. cholerae М-41 серовара Огава с целью получения О-АГ проводили на биореакторах марки РЗРЯ 6/0,5 (Химмаш, Россия) и BioFors Pilot 300 (Biotron, Южная Корея).

Морфологические свойства атоксигенных штаммов холерных вибрионов проводили на атомно-силовом микроскопе Solver P47-PRO (NT-MDT, Россия). Обработка изображений выполнялась в программе Nova (NT-MDT, Россия).

Концентрирование О-АГ холерного вибриона осуществляли на ультрафиль-трациопных установках на базе фильтродержателя АСФ-009, снаряженной мембранными модулями с номинальной отсечкой пл молекулярной массе (НОММ) 20, 50, 300 и 500 кДа, с площадью фильтрации равной 0,1 м2; Vivaflow-200 (Sartorius, Германия) с мембранными модулями 30 и 100 кДа, с площадью фильтрации равной 0,02 м2 и Сартокон-2+, снаряженной мембранами 30 кДа (площадь фильтрации каждой составляет 0,6 м2).

Выделение О-АГ после осаждения сернокислым аммонием выполняли на проточных высокоскоростных трубчатых центрифугах Сера Z81(Cari Padberg Zentrifugenbau, Германия) при 15000 g, а также высокоскоростной центрифуге Avanti J-301 (Beckman, США) при 10000 g.

Определение оптической плотности и концентрации белка проводили на фото-электроколориметре КФК-2МП (Загорский оптико-механический завод, Россия). Хроматографическое фракционирование выполняли на комплекте оборудования фирмы LKB (Pharmacia LKB Biotechnology, Швеция) применяя колонки длиной 16 см и диаметром 2,0 см с TSK-гелем HW-65. Анализ электрофоретической подвиж-

ности проводили на электрофоретическом аппарате Mini protean II (Bio-Rad, США).

Установление иммуногенной и антигенной активности, токсичности, специфической стерильности, микробиологической чистоты проводили по методам, изложенным в фармакопейной статье предприятия на вакцину холерную бивалентную химическую таблетированную.

Определение концентрации формалина, содержания ионов аммония и сульфат-ионов, водородных ионов, прозрачности (мутности), белка, остаточной влажности осуществляли по методикам, представленным в «методических указаниях...» [МУК 4.1/4.2.588-96]. Установление содержания перекиси водорода проводили по ГОСТ 177-88, гидроксида натрия по ГОСТ 2263-79.

Измерение концентрации клеток V. cholerae проводили по отраслевому стандартному образцу мутности на 5 (10) ед. Содержание нуклеиновых кислот проводили по методике, предложенной A.C. Спириным [Спирин A.C., 1958]. Содержание общих липидов определяли с использованием биотеста «Lachema» (Erba Lachema, Чехия). Для определение гептозы использовали цистеин-сернокислотного метод, описанный M.G. Osborn [Osborn M.G., 1963]. Количество углеводов устанавливали фенолсернокислотным методом описанным M. Dibois [Dibois M. Etal., 1956].

Молекулярную массу определяли методом электрофореза по U.K. Laemmli [Laemmli U.K., 1970] в 12% полиамилакридном геле в присутствии додецил сульфата натрия в миниэлектрофорезной камере (Hoefer, Германия), с использованием маркеров молекулярной массы. Для обнаружения белков использовали окраску Кумасси синим R-250. Для выявления углеводов гели окрашивали азотнокислым серебром с помощью набора фирмы «Bio-Rad Silver Stain» (США).

Активность О-АГ уставливали в реакции иммунной диффузии (РИД) с 01 сывороткой. Для измерения содержания О-АГ также использовали реакцию непрямой гемагглютинации (РИГА) с диагностикумом эритроцитарным холерным антительным. Специфическую активность О-АГ in vitro устанавливали с применением дот-иммуноанализа (ДИА), используя конъюгат диагностикума эритроцитарного холерного антительного с коллоидным золотом.

Количество О-АГ в сухих фракциях измеряли иммуноферментным методом ИФА ELISA, при постановке которого в качестве положительного контроля и для определения чувствительности метода использовали хроматографически очищенный препарат О-АГ, полученный из эталонного штамма V. cholerae М41 классического биовара серовара Огава. Статистическую обработку результатов экспериментов осуществляли по стандартным методикам [Ашмарин И.П., Воробьёв A.A., 1962].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Выявление особенностей глубинного культивирования атоксигеиных штаммов холерного вибриона — продуцентов О-антигенов

Учитывая возможность появления фенотипической гетерогенности популяции

бактерий штаммов V. choleras КМ262, КМ263 и 0139 М377 после длительного (36 месяцев) хранения, изучена стабильность их популяционного состава. Изучение 20 независимо выбранных макроколоний в развернутой реакции агглютинации с сыворотками 01, Инаба, Огава и 0139 показало, что все колонии агглютинируются в тех же титрах, что и исходные штаммы до хранения (таблица 1).

Также было определено, что не происходит изменений культурально-морфологических признаков и физиологических свойств. Таким образом, в условиях производства можно установить срок хранения атоксигенных штаммов V. cholerae - продуцентов О-АГ в течение, как минимум, 36 месяцев.

Таблица 1. Продукция О-антигенов, определенный в реакции агглютинации

Штамм V. cholerae Продукция О-антигенов, определенная в реакции агглютинации с холерными сыворотками, обратный титр

01 Инаба Огава RO 0139

КМ262 1 3200 отсутствует 1600 отсутствует н/о

2 3200 отсутствует 1600 отсутствует н/о

КМ263 1 3200 3200 отсутствует отсутствует н/о

2 3200 3200 отсутствует отсутствует н/о

М377 1 н/о н/о н/о н/о 6400

2 н/о н/о н/о н/о 6400

Примечание. 1 и 2 - продукция О-АГ перед началом хранения и через 36 месяцев соответственно

С целью выбора оптимальной температуры культивирования атоксигенных штаммов V. с!ю1егае, было изучено ее влияние на рост биомассы и продукцию О-АГ. Полученные данные (таблица 2) свидетельствуют о том, что при температурах (30±1) и (37±1) °С накопление биомассы практически одинаковое, ее повышение до (42±1) °С снижает уровень накопления холерных вибрионов. Максимальная продукция О-АГ наблюдается при культивировании холерных вибрионов с температурой, равной (37±1) °С. Данная температура была выбрана в качестве оптимальной для культивирования атоксигенных штаммов холерного вибриона.

Таблица 2. Данные по влиянию различных температур культивирования атоксигенных штаммов холерного вибриона на рост биомассы и накопление О-антигенов

Температу- Содержание О-АГ, мкг/мл Концентрация холерных вибри-

ра проведе- онов, млрд м.к./мл

ния процесса, °С Г. chol- V. chol- V. chol- V. chol- V. chol- V. chol-

erae erae erae erae erae erae

М 263 КМ 262 М377 КМ 263 КМ 262 М377

(30±1) 26,0 11,0 0,2 3,5 3,5 10,0

(37±1) 50,0 16,0 0,4 3,7 3,6 10,2

(42±1) 20,0 3,8 0,18 2,0 2,2 9,0

Изучение морфометрических особенностей бактерий методом атомно-силовой

микроскопии показало, что все три штамма холерного вибриона, выращенные при температурах 30 °С и 37 °С, имеют сходный размер и морфологию поверхностных структур клеток. При культивировании изучаемых штаммов в непермессив-ных условиях (при температуре 42 °С) происходит изменение поверхности клеток, увеличивается их шероховатость и зафиксировано изменение их размеров. Данное обстоятельство подтверждает правильность выбора температуры (37±1) °С для выращивания атоксигенных штаммов холерного вибриона.

В начале исследований по разработке масштабируемой технологии глубинного культивирования атоксигенных штаммов холерного вибриона - продуцентов О-АГ обосновали параметры данного процесса. Было отдано предпочтение периодическому культивированию с подпиткой источником углеводного питания (глюкозой). Выбрана питательная среда на основе ферментативного перевара казеина следующего состава: аминный азот — 200 мг%; №2НР04 — 0,06%; №С1 — 0,5%; пептон — 1 %. Режимы аэрации и перемешивания соответствовали массообмену по растворенному кислороду в пределах 2,2-3,1мМоль 02/лхмин. Скорость подачи глюкозы (40 % раствор) в процессе выращивания была определена следующей: в первые 2 ч роста 0,8-1,0 мл/мин, далее до 6 ч роста-0,4-0,5 мл/мин, далее до 9 ч роста - 0,3-0,4 мл/мин в зависимости от рН среды. При снижении уровня рН ниже 7,6 вводили 10 % раствор аммиака со скоростью подачи 0,2-0,3 мл/мин до восстановления уровня рН 8,0. Выращивание культуры в биореакторе прекращали при достижении стационарной фазы роста микробной популяции.

При исследовании процесса культивирования атоксигенных штаммов холерного вибриона - продуцентов О-АГ было установлено, что холерные вибрионы развиваются на жидкой питательной среде, практически полностью подчиняясь общеизвестным закономерностям развития микроорганизмов в периодической культуре: лаг-фаза длится до 1 часа, фаза ускоренного роста продолжается 3 часа; экспоненциальная фаза до 4 часа; 1 час продолжается фаза замедления роста и далее микроорганизмы, почти минуя стационарную фазу, переходят в фазу отмирания культуры. Максимальный выход О-АГ наблюдается при переходе в стационарную фазу. При этом необходимо отметить, что продукция О-АГ штаммами КМ 263 и КМ 262, определенная в РИД с 01 сывороткой, в 4-8 раз превышает нормируемые значения при выращивании производственных вирулентных штаммов, применяемых в технологии приготовления вакцины холерной бивалентной химической таблетированной (в таблице 3 для примера показаны данные, полученные при выращивании штамма КМ 263).

С целью исследования физиологических особенностей углеводного питания атоксигенных штаммов V. скокгае было изучено изменение рН культуралыюй среды в ответ на введение глюкозы. Проведенные исследования показали, что временные профили рН среды культивирования, количества глюкозы и аммиака при выращивании холерных вибрионов показывают на их схожесть (на рисунке 1 для примера показаны данные, полученные при выращивании штамма КМ 263). Максимальное снижение рН культуралыюй среды происходит к 2 и 4 ч выращи-

вания, которое восстанавливается до 8,0 введением аммиака в первом случае в течение часа, а во втором на протяжении 2 ч. После 6 ч культивирования наблюдается возрастание рН, достигающего максимума к 8 ч.

Таблица 3. Кинетика накопления О-антигена штаммом V. cholerae КМ 263

Продолжительность выращивания, ч Содержание О-АГ

в РИД, обратный титр в ДИА, обратный титр

с 01 сывороткой с сывороткой Инаба с 01 сывороткой с сывороткой Инаба

4 2 1 80 10

5 8 2 120 20

6 12 4 160 40

7 12 4 240 80

8 16 8 320 160

8,5 32 16 640 320

9 32 16 640 320

Для уменьшения процесса ценообразования было апробировано использование следующих пеногасителей — подсолнечное масло и неорганический антипенник Antifoam-204 (Sigma). Проведение исследований показало, что применение пеногасителей как органической (для штамма КМ 263), так и минеральной природы (для всех штаммов) позволило устранить обильное образование пены и восстановить более высокую скорость мешалки, что позволяет улучшить газо- и массооб-менные характеристики процесса культивирования.

6,0

¡4.5

о

1,5

Рисунок

На заключительном этапе первой стадии исследований были определены биокинетические особенности культур атоксигенных штаммов холерного вибриона -продуцентов О-АГ в процессе глубинного культивирования. Было выявлено, что скорость роста холерных вибрионов зависит от концентраций субстрата (глюкозы) и синтезируемого продукта (О-АГ), что удовлетворительно описывается зависи-

О - концентрация водородных ионов □ - количество глюкозы - количество аммиака

1 - Изменение рН среды культивирования, количества глюкозы и аммиака при выращивании штамма КМ 263

мостью Моно-Иерусалимского. При этом экономический коэффициент по глюкозе для биомассы составлял от 4,35 до 5,44 и для целевого продукта (О-АГ) от 0,112 до 0,28.

Таким образом, в ходе данного этапа исследований была разработана масштабируемая технология глубинного культивирования атоксигенных штаммов холерного вибриона - продуцентов О-АГ и изучены их основные свойства после длительного хранения.

2. Совершенствование технологии концентрирования О-антигенов холерных вибрионов

Следующим этапом работы стало совершенствование технологии концентрирования О-АГ холерных вибрионов методом ультрафильтрации. Для проведения исследований был выбран метод тангенциальной ультрафильтрации с применением плоскорамных (кассетных) систем.

Первым этапом исследований стало отработка параметров и режимов стерилизации мембранных модулей с НОММ 20 кДа и установки. Были использованы (2,5±0,5) % раствор формальдегида; 1 М раствор гидроксида натрия и (5,5±0,5) % раствор перекиси водорода. Было показано, что проведение данного процесса способом рециркуляции указанными дезинфектантами при напоре на входе ультрафильтрационного аппарата - 2,5 бар и давлении на выходе - 0,5 бар, обеспечивает стерильность системы.

Далее оценивали возможность использования мембран с НОММ 20 кДа для концентрирования О-АГ V. сИокгае М41 серовара Огава. Было показано, что О-АГ концентрировался в 8 раз и отсутствовал в фильтрате. Средняя удельная скорость фильтрации составила 12,85 л/м2/ч. Свойства лиофильно высушенных О-АГ приготовленных по предложенной технологии соответствовали нормируемым и значимо не отличались от показателей О-АГ полученных по регламентной технологии. Кроме того при проведении данного этапа исследований было выявлено, что оптимальной степенью концентрирования О-АГ является уменьшение объема БМЦ в 10 раз, так как проведенные исследования показали, что при концентрировании О-АГ в 15 и 20 раз происходили его потери.

Был отработан процесс очистки и консервации мембранных модулей и в целом установки для хранения между технологическими циклами. Установлено, что обработка мембранных модулей и установки способом рециркуляции (5,5±0,5) % раствора перекиси водорода в течение (35±5) мин, с последующей очисткой системы от дезинфектанта очищенной водой, не оказывает влияния на скорость отведения фильтрата. В качестве консерванта обосновано использование (2,5±0,5) % раствор формальдегида.

При проведении экспериментов по увеличению производительности технологического процесса концентрирования О-АГ по скорости удаления фильтрата была исследована возможность использования мембран с различными НОММ и обоснованы оптимальные параметры процесса концентрирования по давлению и температуре.

При использовании мембранных модулей с НОММ 30, 50, 100, 300 и 500 кДа для концентрирования О-АГ установлено, что его содержание увеличивалось в 8 раз, при этом О-АГ в фильтрате отсутствовал. Была показана предпочтительность использования мембранного модуля с НОММ 500 кДа, так как при использовании наблюдалась наибольшая производительность по скорости удаления фильтрата (таблица 4). Необходимо отметить, что процесс ультрафильтрации проводили при напоре на входе ультрафильтрационного аппарата - 1,5±0,1 бар, давлении на выходе - 0,5±0,1 бар и температуре продукта - 8±2 °С. Было определено, что активность лиофилизированных препаратов полученных в экспериментах, практически не отличалась между собой и соответствовала нормируемым значениям.

Таблица 4. Данные, полученные при ультрафильтрации (п=3)

Показатель Значение характеристики, определенной при использовании мембраны с НОММ, кДа

30 50 100 300 500

бмц ф к бмц ф к бмц ф к бмц ф к бмц ф к

Активность О-АГ в РИД с 01 сывороткой, обратный титр 8 0 64 8 0 64 8 0 64 8 0 64 8 0 64

Средняя удельная скорость фильтрации, л/м2/ч 14,9 16,3 20,6 24,9 36,2

Примечание. БМЦ - безмикробный центрифугат, К - концентрат, Ф - фильтрат.

На следующем этапе исследований по интенсификации процесса концентрирования О-АГ были экспериментально обоснованы технологические параметры процесса по давлению и температуре. Было выявлено, что проведение концентрирования при напоре на входе ультрафильтрационного аппарата - 2,5 бар, давлении на выходе — 0,5 бар и температуре продукта - 37 °С являются наиболее оптимальными, так как при их использовании наблюдалась максимальная скорость удаления фильтрата (таблицы 5 и 6). При этом активность концентрированных натив-ных и лиофильно высушенных О-АГ не отличалась друг от друга и соответствовала нормируемым требованиям.

Таблица 5. Данные экспериментов по определению оптимальных барометрических характеристик концентрирования О-антигена V. с!ю1егае М41 серовара Огава с применением мембран 20, 30, 50, 100, 300 и 500 кДа_

Значения давления, бар Удельный расход фильтрата (л/м2/ч) при использовании разных мембран

на вхо- на вы- 20 30 50 100 300 500

де в ходе

уста- уста-

новку новки

1 2 3 4 5 6 7 8

1,5±0,1 0 9,6 11,2 12,25 15,5 18,6 27,15

1 2 3 4 5 6 7 8

2,0±0,1 0 10,3 11,8 13 16,5 19,8 29

2,5±0,1 0 11,5 13,4 14,7 18,5 22,4 32,5

3,0±0,1 0 11,0 12,2 13,4 16,9 20,4 29,7

1,5±0,1 0,5±0,1 12,9 14,9 16,3 20,6 24,9 36,2

2,0±0,1 0,5±0,1 14,1 16,4 18 22,7 27,3 39,9

2,5±0,1 0,5±0,1 18,0 21,2 23.1 29,3 35,0 51,4

3,0±0,1 0,5±0,1 14,5 16,8 18,4 23,3 28,1 40,2

1,5±0,1 1,0±0,1 10,7 11,8 13,6 17,2 20,7 30,2

2,0±0,1 1,0±0,1 11,7 13,5 14,9 18,7 22,6 32,9

2,5±0,1 1,0±0,1 14,3 16,6 18,2 22,9 25,1 40,2

3,0±0,1 1,0±0,1 12,2 14,2 15,5 19,6 23,7 34,5

Таблица 6. Данные экспериментов по использованию различных температур при концентрировании О-антигена V. сИокгае М-41 серовара Огава с применением мембран 20 30, 50, 100, 300 и 500 кДа_

Показатель Значение характеристики, определенной при разных температурах, "С

20±2 | 37±2

с применением мембран с НОММ, кДа

20 30 50 100 300 500 20 30 250 100 300 500

Содержание О-АГ в РИД с 01 сывороткой, обратный титр 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64

Удельный расход фильтрата, л/м2/ч 28.1 32,8 35,8 45,2 54,7 79 40,2 46,9 51,0 64,5 78,2 114

Одним из заключительных этапов совершенствования технологии являлась апробация экспериментально обоснованных технологических режимов концентрирования О-ЛГ штамма V. сИоІегае М41 серовара Огава проведения в производственном процессе получения вакцины холерной бивалентной химической табле-тированной. Было показано, что скорость удаления фильтрата сопоставима с результатами полученными ранее. На всех технологических этапах проверки качества концентрированные О-ЛГ соответствовали требованиям нормативных документов.

Была установлена возможность применения усовершенствованной технологии для концентрирования О-АГ, продуцируемых атоксигенными штаммами холерного вибриона V. с/юіегае М 377 0-139, V. сіюіегае КМ 263 биовара Эль Тор серовара Инаба, V. с/юіегае КМ 262 биовара Эль Тор серовара Огава.и получены их лио-фильно высушенные формы. Показано, что качество О-АГ V. сИоІегае КМ 262 биовара Эль Тор серовара Огава и У.сіюіегае КМ 263 биовара Эль Тор серовара Инаба соответствует требованиям регламента производства на вакцину бивалентную химическую таблетированную. При этом данные проведенных экспериментов в дальнейшем можно использовать для отработки производства и конструирования готовой формы новой холерной химической вакцины.

3. Изучение свойств препаратов О-антигенов холерного вибриона и холерной химической вакцины

Определенный научно-практический интерес представляло изучение антигенных, биохимических и физико-химических особенностей сублимационно высушенных О-АГ, полученных с использованием экспериментальной технологии культивирования. В результате сравнительного анализа О-АГ, полученных из не-токсигенных и токсигенных штаммов У.скоіегае (таблица 7), была выявлена схожесть содержания химических компонентов в препаратах.

Таблица 7. Характеристики препаратов, полученных из токсигенных и неток-сигенных штаммов холерного вибриона_

Наименование характеристики Значение характеристики препарата О-АГ, полученных из штаммов холерных вибрионов

КМ 262 Огава М41 Огава КМ 263 Инаба 569В Инаба М 377 0139 М045 0139

Белок, % 48,1±4,5 48,5±4,8 44,2±4,3 38,2±3,9 46,0±4,4 48,0±5,6

Углеводы, % 20,2±0,9 14,0±2,2 24,3±2,1 17,3±1,5 31,0±4,2 30,0±4.1

Липиды, % 15,3±1,3 10,0±1,4 14,4±1,1 12,4±1,3 12,0±1,5 12,0±1,4

Нуклеиновые кислоты, % 4,8±0,2 3,9±0,6 4,6±0,3 4,1 ±0,3 4,8±0,5 5,0±0,8

Альдогентоза, % 4,0±0,3 1,5±0,2 3,5±0,2 3,5±0,3 5,1±0,5 5,0±0,6

Содержание О-АГ, определенное в ИФА ELISA, мг/мл 0,24±0,02 0,22±0,02 1,7±0,1 н/о 0,22±0,02 н/о

Изучение препаратов методом гель-хроматографии, показало, что профили элюции представляли собой подобные пики, препараты выходили с колонки практически с одинаковой задержкой во времени (на рисунке 2 для примера показаны данные по О-АГ штамма КМ 263 и О-АГ токсигенного штамма 569В Инаба). Проведенный анализ электрофоретической подвижности препаратов (рисунок 3) свидетельствовал о том. что их белково-углеводные комплексы практически идентичны.

Рисунок 2 — Хроматограммы препаратов. 1- О-АГ КМ 263; //-О-АГ 569В

Рисунок 3 - Результаты анализа электрофоретической подвижности препаратов с окраской по кумасси 11250 (Г) и азотнокислым серебром (//). 1 - маркеры молекулярной массы от 10 до 300 кДа. 2 - О-АГ 569В; 3 - О-АГ КМ 263; 4 - О-АГ М41; 5 - О-АГ КМ 262; 6 - О-АГ М045; 7 - О-АГ М 377

С применением О-АГ, полученных из атоксигенных штаммов холерных вибрионов были сформированы прототипы новой холерной химической вакцины и оценены их свойства в сравнении с коммерческим препаратом российской холерной химической вакцины (таблица 8). По всем показателям экспериментальные препараты соответствовали требованиям нормативной документации на коммерческий препарат, при этом иммуногенность, как минимум, в 2,5 раза превышала установленные в качестве нормирующих значения, но была ниже в сравнении с контролем. На наш взгляд, это связано с неоптимальным количественным содержанием иммуногенных компонентов.

Проведенный сравнительный анализ иммунохимических, химических и биохимических свойств О-АГ полученных по традиционной и экспериментальной технологиям их концентрирования (рисунки 4 и 5, таблица 9) показал, в основном, на их подобие, что дает основания для внедрения разработанных приемов в технологический процесс производства холерной химической вакцины. Необходимо отметить, что профили элюции для препаратов О-АГ, полученных при использовании мембран с НОММ, равными 20, 50. 100 и 300 кДа были одинаковы и не различались от таковых для О-АГ, полученных при использовании мембран с НОММ 500 кДа, поэтому на рисунке 4 они не приведены.

Таблица 8. Результаты исследования свойств прототипов новой холерной химической вакцины

Наименование показателя Требования нормативной документации Значение показателя

контроль экспериментальная

прототип 1 прототип 2

Формалин Не более 0,2% 0,011 0,014 0.012

1 2 3 4 5

Ионы аммония и сульфат-ионы Не допускается наличия ионов аммония и сульфат-ионов отсутствуют

1 2 3 4 5

рН растворенного препарата от 6,7 до 7,4 7,1 6,9 6,7

Потеря в массе при высушивании Не более 5% 4.2 4,15 4,6

Специфическая безопасность Вакцина должна быть специфически безопасной специфически безопасны

Иммуноген-ность ЕД50 должна быть не более 1/20000 части таблетки 1/13548 3 1/58182 1/55556

Рисунок 4 — Хроматограммы препаратов. / - препарат, полученный традиционным способом; //- препарат, полученный разработанным способом (с использованием мембран с НОММ 500 кДа)

Таблица 9. Сравнительная характеристика препаратов, полученных по производственной и усовершенствованной технологии

Наименование характеристики Значение характеристики препарата О-АГ

полученного по регламентному способу полученного по экспериментальной технологии при использовании мембран с НОММ, кДа

20 50 100 300 500

Белок. % 62,0±5,2 48,5±4,8 45,3±4,4 39,0±4,9 53,5±5,0 45,0±4,5

Углеводы, % 20,0*2,3 14,0±2,2 22,0±2,5 15,0±2,2 18,0±2,2 14,0±2,1

Лигшды, % 14,0±1,5 10,0±1,4 15,0±1,5 10,5±1,3 13,0±1,2 13,5±1,4

Нуклеиновые кислоты, % 5,1 ±0,8 3,9±0,6 4,9±0,5 5,0±0,5 4,9±0,6 4,8±0,б

Альдогептоза, % 1,3±0,2 1,5±0,2 1,85±0,3 2,0±0,2 2,3±0,3 2,3±0,2

Содержание О-А Г, определенное в ИФА ELISA, мг/мл 0,18±0,02 0,22±0,0 2 0,24±0,0 3 0,2±0,03 0,19±0,0 2 0,19±0,0 2

50 — 40 $м

тт зо ||р|

2345 671 12345 6 7

І II

Рисунок 5 - Результаты анализа электрофоретической подвижности препаратов с окраской по кумасси 11250 (Г) и азотнокислым серебром (II). 1 - маркеры молекулярной массы от 10 до 300 кДа, 2 - препарат, полученный традиционным способом; 3-7 - препараты, полученные разработанным способом (с использованием мембран с НОММ 20, 50, 100, 300 и 500 кДа соответственно)

На завершающем этапе исследований исследованы свойства коммерческой холерной вакцины, приготовленной по усовершенствованной технологии концентрирования О-АГ штамма V. скоіегае М41 серовара Огава. Полученные данные (таблица 10) показали, что производственная серия удовлетворяет требованиям нормативных документов.

Таблица 10. Результаты исследования основных нормируемых физико-химических и иммунобиологических свойств вакцины _

Наименование показателя Требования нормативной документации Значение показателя

1 2 3

Формалин Не более 0,2% 0.02

Ионы аммония и сульфат-ионы Не допускается наличия ионов аммония и сульфат-ионов отсутствуют

рН растворенного препарата от 6,7 до 7,4 7,14

Потеря в массе при высушивании Не более 5% 2,97

Токсичность Вакцина должна быть нетоксичной нетоксична

Специфическая безопасность Вакцина должна быть специфически безопасной специфически безопасна

1 2 3

Специфическая

активность:

антигенная актив- Должна содержать (100

ность по анатокси- 000+20 000) единиц связыва- 80000

но-связыванию; ния анатоксина (ЕС),

содержание О-антигена; не менее 2000 ус. ед. О- антигена штаммов V. сИокгае 01 6485

иммуногенность ЕД50 должна быть не более 1/20000 части таблетки 1/55978 (сер. Огава) 1/96618 (сер. Инаба)

Подводя итоги выше сказанному, можно утверждать, что разработанная экспериментальная технология глубинного культивирования атоксигенных штаммов -продуцентов О-АГ послужит основой при создании технологии приготовления отечественной современной химической вакцины против холеры. Предложенная усовершенствованная технология концентрирования О-АГ холерного вибриона методом ультрафильтрации используется в производстве вакцины холерной химической бивалентной таблетированной.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что после длительного (36 месяцев) хранения атоксигенных штаммов V. с1ю1егае - продуцентов О-антигенов не происходит изменений их культурально-морфологических признаков и физиологических свойств, а продукция О-антигенов остается на прежнем уровне.

2. Установлено, что атоксигенные штаммы холерного вибриона - продуценты О-антигенов, выращенные глубинным культивированием при температурах 30 °С и 37 °С, имеют сходный размер и морфологию поверхностных структур клеток. Выявлено также, что клетки V. ско1егае штаммов КМ263 и КМ262 в 1,25 раза больше потребляют глюкозу, чем клетки V. с!ю1егае штамма М377.

3. Разработана экспериментальная технология глубинного культивирования атоксигенных штаммов холерного вибриона, позволяющая получать нативные О-антигены не в меньшем количестве, чем при использовании вирулентных штаммов, при условии поддержания температуры процесса равной 37 °С; прекращения культивирования микроорганизмов при переходе их роста в стационарную фазу; применения пеногасителей органической, и/или минеральной природы, дающих возможность поддерживать оптимальные массо- и газообменные характеристики процесса в ходе всего периода культивирования.

4. Определены биокинетические особенности процесса глубинного культивирования атоксигенных штаммов холерного вибриона - продуцентов О-антигенов. При этом выявлено, что скорость роста холерных вибрионов зависит от концентраций субстрата (глюкозы) и синтезируемого продукта (О-антигена), что удовлетворительно описывается зависимостью Моно-Иерусалимского.

5. Усовершенствована технология концентрирования О-антигенов холерного вибриона методом ультрафильтрации, заключающаяся в применении мембран 500 кДа; установлении напора на входе ультрафильтрационного аппарата - 2,5 бар, давления на выходе - 0,5 бар и температуры продукта - 37 °С, обеспечивающих наибольшую скорость процесса.

6. Установлено, что препараты О-антигенов, полученные по экспериментальной технологии из атоксигенных штаммов V. cholerae имеют сходный белковый и полисахаридный состав с аналогичными препаратами, полученными из токсиген-ных штаммов по регламентной технологии. Определено, что прототипы новой холерной химической вакцины соответствуют нормируемым требованиям на коммерческую вакцину.

7. При проведении сравнительного анализа препаратов О-антигена штамма К cholerae М41 серовара Огава, полученных с использованием традиционной и усовершенствованной технологиям концентрирования, по биохимическим и физико-химическим свойствам получены идентичные результаты.

8. Качество коммерческой холерной вакцины, полученной по усовершенствованной технологии концентрирования О-антигена штамма V. cholerae М41 серовара Огава, соответствует требованиям фармакопейной статьи предприятия.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Еремин С.А., Алешина Ю.А., Комиссаров A.B., Никифоров А.К. Использование метода ультрафильтрации по принципу «кросс-флоу» для концентрирования О-антигена холерного вибриона // Материалы 14 международной школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пущино. - 2010. - Т. 1. - С. 77.

2. Алешина Ю.А., Никифоров А.К., Комиссаров A.B., Еремин С.А., Крайнова А.Г. Экспериментальная оценка использования мембран с различными номинальными отсечками по молекулярной массе для концентрирования О-антигена холерного вибриона серовара Огава методом ультрафильтрации по принципу "cross-flow" в производстве холерной бивалентной химической вакцины // Материалы международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения-2010», Саратов. - 2010. - Т.2. - С. 116.

3. Громова О.В., Захарова Т.Л., Комиссаров A.B., Волох O.A., Клокова О.Д., Белякова Н.И., Кузьмиченко И.А., Киреев М.Н., Еремин С.А., Алешина Ю.А. Разработка технологической схемы получения протективных антигенов холерного вибриона с помощью ультрафильтрации // Материалы международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения-2010», Саратов. - 2010. - Т.2. - С. 138-140.

4. Алешина Ю.А., Крайнова А.Г., Еремин С.А., Комиссаров A.B., Белякова Н.И., Клокова О.Д. Интенсификация процесса мембранного концентрирования протективных антигенов в технологии производства холерной бивалентной химической вакцины // Материалы VI Московского международного конгресса «Био-

технология: состояние и перспективы развития», М. - 2011. - Часть 1. - С. 310-311.

5. Комиссаров A.B., Еремин С.А., Алешина Ю.А., Васин Ю.Г., Клокова О.Д., Белякова Н.И. Экспериментальная оценка использования метода ультрафильтрацип по принципу «кросс-флоу» для концентрирования О-антигена в производстве холерной бивалентной химической вакцины // Проблемы особо опасных инфекций - 2011. - Вып 2(108). - С. 83-86. (журнал из перечня ВАК)

6. Алешина Ю.А., Еремин С.А., Комиссаров A.B., Громова О.В., Белякова Н.И., Клокова О.Д., Крайнова А.Г. Оптимизация технологического процесса концентрирования О-антигенных компонентов холерной химической вакцины // Материалы научно-практической конференции молодых ученых «Инновационные технологии в противоэпидемической защите населения», посвященной 90-летнему юбилею академика РАМН И.Н. Блохиной, Нижний Новгород. - 2011. - С. 91-93.

7. Алешина Ю.А., Крайнова А.Г., Еремин С.А., Комиссаров A.B., Громова О.В., Белякова Н.И., Клокова О.Д., Васин Ю.Г. Определение оптимальной степени концентрирования протективных антигенов холерных вибрионов в технологии производства холерной бивалентной химической вакцины // Материалы 15 международной школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пущино. - 2011. - С. 317.

8. Алешина Ю.А., Еремин С.А., Комиссаров A.B., Волох O.A., Шепелев И.А., Громова О.В., Никифоров А.К., Авдеева Н.Г., Белякова Н.И. Исследование процессов культивирования атоксигенных штаммов холерного вибриона и концентрирования их О-антигенов // Материалы III научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности», Оболенск. - 2011 - С. 251-254.

9. Павлова В.И., Лобовикова O.A., Громова О.В., Киреев М.Н., Алешина Ю.А., Комиссаров, A.B. Никифоров А.К., Еремин С.А. Изучение О-антигенов холерного вибриона Vibrio cholerae М41 Огава, полученных по производственной и усовершенствованной технологии // Материалы XI Межгосударственной научно-практической конференции «Современные технологии в совершенствовании мер предупреждения и ответных действий на чрезвычайные ситуации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения», Саратов. - 2012. - С. 190-191.

10. Комиссаров A.B., Никифоров А.К., Алешина Ю.А., Еремин С.А., Громова О.В., Васин Ю.Г., Клокова О.Д., Белякова Н.И., Крайнова А.Г. Способ концентрирования нативного холерного О-антигена Vibrio cholerae (Патент РФ на изобретение № 2445116)// Бюллетень Российского агентства по патентам и товарным знакам №8 от 2012 г.

11. Еремин С.А., Алешина Ю.А., Ливанова Л.Ф., Комиссаров A.B., Миронова Н.П., Никифоров А.К. Выбор оптимальной температуры культивирования

атоксигенных штаммов холерного вибриона // Материалы Международной научно-практической конференции «Биотехнология: реальность и перспективы», Саратов. - 2013. - С. 31-32.

12. Комиссаров A.B., Никифоров А.К., Еремин С.А., Громова О.В., Алешина Ю.А., Васин Ю.Г., Волох O.A., Бронникова B.C., Лобовикова O.A., Задохин С.Н., Ливанова Л.Ф., Гаева A.B. Материалы Международной научно-практической конференции «Биотехнология: реальность и перспективы», Саратов. - 2013. - С. 65-67.

13. Еремин С.А., Комиссаров A.B., Волох O.A., Шепелев И.А., Громова О.В., Никифоров А.К., Алешина Ю.А., Авдеева Н.Г., Белякова Н.И. Экспериментальная технология получения О-антигенов атоксигенных штаммов холерного вибриона // Проблемы особо опасных инфекций - 2013. - Вып 1. - С. 85-87. (журнал из перечня ВАК)

14. Алешина Ю.А., Ливанова Л.Ф., Комиссаров A.B., Громова О.В., Еремин С.А. Изучение свойств атоксигенных штаммов Vibrio cholerae — продуцентов О-антигенов после длительного хранения // Материалы совещания специалистов Роспотребнадзора «Холера и патогенные для человека вибрионы», Ростов-на-Дону. - 2013. - №. 26. - С. 194-196.

15. Еремин С.А., Щуковская Т.Н., Комиссаров A.B., Волох O.A., Громова О.В., Клюева С.Н., Алешина Ю.А., Шмелькова Т.П., Ливанова Л.Ф., Бронникова B.C., Лобовикова O.A., Васин Ю.Г., Никифоров А.К. Технология производства новой холерной химической вакцины с использованием атоксигенных штаммов Vibrio cholerae И Материалы совещания специалистов Роспотребнадзора «Холера и патогенные для человека вибрионы», Ростов-на-Дону. - 2013. - №. 26. - С. 232-234.

16. Алешина Ю.А., Павлова В.И., Комиссаров A.B., Громова О.В., Никифоров А.К., Киреев М.Н., Еремин С.А., Волох O.A., Гаева A.B., Ливанова Л.Ф. Свойства экспериментальных и производственных препаратов протективно-го О-антигена Vibrio cholerae М41 Огава // Проблемы особо опасных инфекций - 2013. - Вып 2. - С. 70-72. (журнал из перечня ВАК)

Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная.

Гарнитура Тайме. Усл. п. л. 1,0. Тираж 100 экз. Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора. 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Алешина, Юлия Александровна, Саратов

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА ФКУЗ «РОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОТИВОЧУМНЫЙ ИНСТИТУТ «МИКРОБ»

04201455000

На правах рукописи

ЮОиГ

Алешина Юлия Александровна

ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ О-АНТИГЕНОВ VIBRIO CHOLERAE ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ХОЛЕРНЫХ ХИМИЧЕСКИХ

ВАКЦИН

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник С.А. Еремин

кандидат технических наук, доцент

A.B. Комиссаров

Саратов - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ 5

ВВЕДЕНИЕ 6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14

1.1. Протективные антигены холерных вибрионов 14

1.2. Методы и технологии культивирования холерного вибриона 16

1.3. Применение ультрафильтрации для концентрирования

и очистки антигенов 29

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 40

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 40

2.1. Оборудование и приборы 40

2.2. Материалы 42

2.2.1. Бактериальные штаммы 42

2.2.2. Лабораторные животные 44

2.2.3. Сыворотки, питательные среды, реактивы и растворы 44

2.3. Методы исследования 46

2.3.1. Биологические методы 46

2.3.2. Физико-химические и биохимические методы 47

2.3.3. Статистическая обработка результатов 49 ГЛАВА 3. ВЫЯВЛЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АТОКСИГЕННЫХ ШТАММОВ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА - ПРОДУЦЕНТОВ О-АНТИГЕНОВ 50

3.1. Изучение микробиологических свойств атоксигенных штаммов Vibrio cholerae - продуцентов О-антигенов 50

3.2. Исследование процесса культивирования атоксигенных штаммов Vibrio cholerae - продуцентов О-антигенов 53

3.3. Определение биокинетических особенностей процесса глубинного культивирования атоксигенных штаммов холерного вибриона - продуцентов О-антигенов 67 ГЛАВА 4. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ О-АНТИГЕНОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ 73

4.1. Определение эффективности мембран 20 к Да для концентрирования О-антигена штамма Vibrio cholerae М41 серовара Огава 73

4.2. Интенсификация процесса ультрафильтрации 80

4.2.1. Определение эффективности различного типа мембран для концентрирования О-антигена штамма Vibrio cholerae М41 серовара Огава 80

4.2.2. Установление оптимальных барометрических характеристик процесса ультрафильтрации 82

4.2.3. Изучение влияния температуры на эффективность концентрирования О-антигена штамма Vibrio cholerae М41 серовара Огава 84

4.2.4. Использование усовершенствованной технологии концентрирования О-антигена штамма Vibrio cholerae М41 серовара Огава в производственном процессе получения коммерческой холерной химической вакцины 87

4.3. Применение метода тангенциальной ультрафильтрации для концентрирования О-антигенов атоксигенных штаммов холерных вибрионов 88 ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ПРЕПАРАТОВ О-АНТИГЕНОВ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА И ХОЛЕРНОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ 92

5.1. Характеристики препаратов О-антигенов атоксигенных штаммов холерного вибриона, полученных по разработанной технологии культивирования 92

5.2. Контроль прототипа новой холерной химической вакцины 95

5.3. Изучение свойств препаратов О-антигена штамма Vibrio cholerae М41 серовара Огава, полученных по усовершенствованной технологии концентрирования 97

5.4. Свойства коммерческой холерной вакцины, приготовленной по усовершенствованной технологии концентрирования 100 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 102 ВЫВОДЫ 110 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 112

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АЕ - антитоксическая единица

АСМ - атомно-силовая микроскопия

А-ХТ - А-субъединица холерного токсина

АХС - антихолерогенная сыворотка

БВМ - белки внешней мембраны

БМЦ - безмикробный детоксицированный центрифугат

В-ХТ - В-субъединица холерного токсина

ДИА - дот-иммуноанализ

ЕС - единицы связывания холерогена с сывороткой

ИФА - иммуноферментный анализ

ЛПС - липополисахарид

МИБП - медицинские иммунобиологические препараты

м.к. - микробные клетки

НОММ - номинальная отсечка по молекулярной массе

О-АГ - О-антиген

ОСО - отраслевой стандартный образец

ПА - протективные антигены

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РИД - реакция иммунодиффузии

РИГА - реакция непрямой гемагглютинации

ТКПА - токсин-корегулируемые пили адгезии

ХА - холероген-анатоксин

XT - холерный токсин

ЕД50 - доза вакцины, защищающая 50% животных от гибели при

заражении вирулентным штаммом

LD50 - летальная доза, вызывающая гибель 50% животных

цмах - максимальная удельная скорость роста клеток

ВВЕДЕНИЕ

На современном этапе холера продолжает оставаться одной из особо опасных инфекционных болезней, единичные случаи и вспышки которой рассматриваются как чрезвычайная ситуация [104]. Заслуживает внимания, что возбудитель холеры отнесен к категории В - высокоприоритетных патогенов, которые могут быть использованы в качестве биологического оружия [87, 103].

На основе строения О-антигенов V. ско1егае разделяют более чем 200 се-рогрупп, однако эпидемическое значение имеют 01 серогруппы классического и Эль Тор биоваров и 0139 серогруппы. В России эпидемиологическая ситуация оценивается как неустойчивая и нестабильная, что связано с заносными случаями и выявлениями холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп из объектов окружающей среды [86].

О-антиген холерного вибриона является одним из основных протектив-ных антигенов, отвечающих за формирование антибактериального иммунитета [163, 174, 187, 207, 219, 222] и входит в состав практически всех вакцин, предназначенных для специфической профилактики холеры [102, 104, 153].

Вакцины являются наиболее эффективными средствами профилактики холеры [80]. Российский календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям предусматривает вакцинацию против холеры [102].

За рубежом, согласно рекомендаций ВОЗ, используются три холерные вакцины: Бикога1 (\VC-rBS), тОЯСУАХ и 8ЬапсЬо1 [153]. Вакцина Эикога1 состоит из В-субъединицы холерного токсина и инактивированных клеток V. ско1егае 01 серогруппы обоих биоваров и сероваров. В состав 8ЬапсЬо1 и тОЯСУАХ входят только убитые клетки V. ско1егае 01 и V. ско1егае 0139 [104].

Российская холерная бивалентная химическая вакцина, сконструированная и производимая в институте «Микроб» [9, 44-48], основными компонентами которой являются холероген-анатоксин и О-антигены сероваров Инаба и

Огава, не менее эффективна, чем вакцина Оикога1 [104, 139]. При этом в состав вакцины возможно включение 0139 антигена [41].

В технологии приготовления российской коммерческой холерной вакцины используются токсигенные штаммы V. ско1егае 569В Инаба и М-41 Огава. Работа с вирулентными штаммами в условиях производства повышает риск заражения персонала при возникновении аварийных ситуаций.

В РосНИПЧИ «Микроб» сконструированы авирулентные атоксигенные штаммы V. ско1егае КМ 263 биовара Эль Тор серовара Инаба [85], V. ско1егае КМ 262 биовара Эль Тор серовара Огава [118], являющиеся продуцентами 01 антигенов. Для продукции 0139 антигена возможно использование авирулент-ного атоксигенного штамма V. ско1егае М 377 0139 серогруппы. Эти штаммы холерного вибриона перспективны для создания отечественной современной химической вакцины против холеры.

Однако на данный момент отсутствует масштабируемая технология глубинного культивирования атоксигенных штаммов V. ско1егае - продуцентов О-антигенов.

Имеющийся опыт работы [27, 30, 71, 76, 81, 92] по глубинному выращиванию различных штаммов холерного вибриона показывает, что при подборе определенных условий культивирования можно получать необходимые протективные антигены для конструирования новых вакцинных препаратов для профилактики холеры.

В 80-ых годах прошлого столетия в РосНИПЧИ «Микроб» были проведены исследования [120] по внедрению метода ультрафильтрации для очистки холерного токсина от О-антигена, в 90-ых годах - по концентрированию и очистки О-антигена с использованием ультрафильтрации на полых волокнах [40], что позволило создать промышленную технологию концентрирования О-антигена, продуцируемого клетками холерного вибриона штамма М41 серовара Огава [50, 97]. Однако используемый метод имеет ряд недостатков, связанных с

тем, что фильтрация протекает в тупиковом режиме: значительные потери полуфабриката, низкая удельная скорость фильтрации.

В производстве химических вакцин все более широкое применение находит концентрирование антигенов методом тангенциальной ультрафильтрацией. Широкий спектр мембран позволяет концентрировать антигены с различной молекулярной массой, при этом минимизируются технологические потери продукта. Таким образом, актуальность научных исследований по совершенствованию технологии концентрирования О-антигенов холерного вибриона является очевидной.

В этой связи важность и перспективность приобретают научные исследования по разработке экспериментальной масштабируемой технологии глубинного культивирования атоксигенных штаммов холерного вибриона - продуцентов О-антигенов и совершенствованию процесса концентрирования нативных О-антигенов.

Цель работы - Исследовать процесс глубинного культивирования атоксигенных штаммов V. ско1егае - продуцентов О-антигенов и оптимизировать процесс концентрирования нативных О-антигенов. Основные задачи исследования:

1. Изучить основные микробиологические свойства атоксигенных штаммов холерного вибриона - продуцентов О-антигенов после длительного хранения.

2. Исследовать физиологические и морфологические особенности атоксигенных штаммов холерного вибриона - продуцентов О-антигенов в ходе их глубинного культивирования.

3. Выявить биокинетические особенности процесса глубинного культивирования атоксигенных штаммов холерного вибриона - продуцентов О-антигенов.

4. Определить оптимальные технологические параметры процесса культивирования атоксигенных штаммов V. ско1егае - продуцентов О-антигенов.

5. Усовершенствовать технологию концентрирования О-антигенов холерного вибриона методом ультрафильтрации.

6. Изучить антигенные, биохимические, физико-химические и иммунобиологические особенности О-антигенов, полученных с использованием экспериментальной технологии.

7. Изучить нормируемые свойства коммерческого препарата таблетиро-ванной холерной вакцины, полученного по усовершенствованной технологии. Научная новизна работы заключается в том, что изучены основные морфологические и фенотипические свойства атоксигенных штаммов V. ско1егае - продуцентов О-антигенов после длительного (36 месяцев) хранения. Показано, что штаммы сохраняют свои основные культурально-морфологические свойства и высокий уровень биосинтеза О-антигенов.

Впервые исследованы физиологические и морфологические особенности атоксигенных штаммов холерного вибриона - продуцентов О-антигенов в ходе их глубинного культивирования. Показано, что при введении основного источника углеводного питания (глюкозы) происходит закисление культуральной жидкости, что требует добавления корригирующего раствора.

Впервые с помощью атомно-световой микроскопии проведен сравнительный анализ морфологических особенностей бактериальных клеток атоксигенных штаммов V. ско1егае КМ 263 биовара Эль Тор серовара Инаба, V. ско1егае КМ 262 биовара Эль Тор серовара Огава и V. ско1егае М 377 0139 се-рогруппы, выращенных в условиях глубинного культивирования. Выявлено, что клетки всех трех штаммов холерного вибриона, выращенных при температурах 30 °С и 37 °С, имеют сходный размер и морфологию.

Экспериментально обоснованы оптимальные технологические параметры (температура, продолжительность, профиль введения глюкозы, время добавления аммиака и пеногасителей) процесса культивирования атоксигенных штаммов холерного вибриона - продуцентов О-антигенов, позволяющие получать нативные О-антигены в препаративных количествах.

Впервые показано, что рост атоксигенных штаммов возбудителя холеры -продуцентов О-антигенов зависит не только от концентрации субстрата, но и от концентрации продукта биосинтеза, причем его накопление снижает скорость роста микроорганизмов.

Усовершенствована технология концентрирования О-антигенов холерного вибриона тангенциальной ультрафильтрацией, защищенная патентом на изобретение № 2445116 «Способ концентрирования нативного холерного О-антигена Vibrio cholerae». Определено, что наиболее эффективно концентрирование О-антигенов V. cholerae с использованием мембран с НОММ, равной 500 кДа.

Установлены оптимальные параметры процесса концентрирования: напор на входе ультрафильтрационного аппарата - 2,5 бар, давление на выходе - 0,5 бар; температура продукта - 37 °С.

Впервые изучен химический состав сублимационно высушенных О-антигенов, полученных из атоксигенных штаммов холерного вибриона. Показано, что препараты О-антигены, полученные из атоксигенных и токсигенных штаммов имеют сходный белковый и полисахаридный состав.

В результате сравнительного анализа иммунохимических и физико-химических свойств О-антигенов V. cholerae М-41 серовара Огава, полученных по регламентной и усовершенствованной технологиям концентрирования, выявлено подобие их характеристик.

Практическая значимость работы заключается в том, что разработана масштабируемая технология глубинного культивирования атоксигенных штаммов холерного вибриона - продуцентов О-антигенов, позволяющая получать полуфабрикаты протективных антигенов соответствующих показателям качества на коммерческую холерную вакцину.

На основании проведенных исследований по разработке технологии получения О-антигенов из атоксигенных штаммов холерных вибрионов выработаны рекомендации по её использованию в технологии приготовления холер-

ной вакцины. Усовершенствованная технология концентрирования О-антигена V. ско1егае М-41 серовара Огава внедрена в технологию производства коммерческой холерной вакцины.

Разработаны методические рекомендации:

«Концентрирование протективных антигенов холерного вибриона методом тангенциальной фильтрации», одобренные Учёным советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 2 от 18 марта 2011 г.) и утверждённые директором института 11 июня 2011 г.;

«Аппаратное культивирование атоксигенных штаммов холерного вибриона - продуцентов О-антигенов», одобренные Учёным советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 8 от 26 декабря 2012 г.) и утверждённые директором института 27 декабря 2012 г.

Результаты исследований использовались при разработке регламента производства № ПР 01898109-39-12 «Вакцина холерная бивалентная химическая, таблетки, покрытые кишечнорастворимой оболочкой», утвержденного директором РосНИПЧИ «Микроб» 11 июля 2012 г. Положения, выносимые на защиту:

1. Атоксигенные штаммы V. ско1егае - продуценты О-антигенов сохраняют высокий уровень биосинтеза О-антигенов и свои основные микробиологические свойства в процессе длительного (36 месяцев) хранения.

2. Разработана масштабируемая технология глубинного культивирования атоксигенных штаммов холерного вибриона - продуцентов О-антигенов.

3. Технология концентрирования нативных холерных О-антигенов тангенциальной ультрафильтрацией обладает преимуществом перед процессом, протекающим в тупиковом режиме.

4. Коммерческая серия вакцины холерной бивалентной химической таб-летированной, полученная по усовершенствованной технологии концентрирования О-антигена V. ско1егае серовара Огава, соответствует требованиям нормативной документации.

Работа выполнена в ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» в рамках научно-исследовательских тем № 40-2-09 «Оптимизация технологических этапов производства МИБП и разработка новых препаратов для диагностики ООИ» (номер госрегистрации: 0120.0853923) и «Разработка современных безопасных химических вакцин против холеры и создание универсальной технологии их производства» выполняемой согласно распоряжению Правительства Российской Федерации № 1426-р от 02.10.2009 г. о выделении финансовых средств на проведение научно-исследовательских работ, направленных на разработку новых средств диагностики и профилактики тропических болезней. Апробация работы

Основные результаты работы представлены на: 14 и 15 международных школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века», (Пущи-но, 2010, 2011); Международной научно-практической конференции «Вавилов-ские чтения-2010», (Саратов, 2010); Совещаниях специалистов Роспотребна-дзора по вопросам совершенствования эпидемиологического надзора за холерой (Ростов-на-Дону, 2013); VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (М., 2011); научно-практической конференции молодых ученых «Инновационные технологии в противоэпидемической защите населения» (Нижний Новгород, 2011); III научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, Московская область, 2011); XI Межгосударственной научно-практической конференции «Современные техноло�