Разработка биотехнологической схемы получения флуоресцирующих иммуноглобулинов для идентификации холерных вибрионов О139 серогруппы

Абрамова, Елена Геннадьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка биотехнологической схемы получения флуоресцирующих иммуноглобулинов для идентификации холерных вибрионов О139 серогруппы
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка биотехнологической схемы получения флуоресцирующих иммуноглобулинов для идентификации холерных вибрионов О139 серогруппы"

На правах рукописи

АБРАМОВА Елена Геннадьевна

РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ СХЕМЫ ПОЛУЧЕНИЯ

ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ 0139 СЕРОГРУППЫ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 2005

Работа выполнена в ФГУЗ "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук Аленкина Татьяна Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

старший научный сотрудник Саяпина Лидия Васильевна

кандидат биологических наук Шарова Ирина Николаевна

Ведущая организация:

Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт

Защита состоится 21 июня 2005 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по присуждению ученой степени доктора (кандидата) наук при ФГУЗ "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РосНИПЧИ "Микроб".

Автореферат разослан ^^ _2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук,

старший научный сотрудник

Слудский А.А.

гьтг

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В основе целенаправленной научно обоснованной борьбы с холерой лежит ее своевременная диагностика. Для холеры, как карантинной инфекции, очень важна постановка диагноза в кратчайшие сроки с целью определения объема проведения противоэпидемических и профилактических мероприятий.

Начиная с 1992 г., когда эпидемиологическая ситуация по холере на побережье Бенгальского залива была серьезно осложнена эпидемиями диарейных заболеваний, вызванных представителями новой, ранее не известной 0139 серогруппы, данный патоген привлекает к себе внимание исследователей в связи с опасностью его распространения. Вспышки, обусловленные У1Ьгю с!ю1егае 0139, продолжают фиксироваться в странах Юго-Восточной Азии. В 2003 г. зарегистрирована крупная эпидемия (30 ООО больных) в Дакке и примыкающих территориях, связанная с новым появлением холерных вибрионов 0139 (Москвитина Э.А. с соавт., 2004).

Учитывая интенсивные миграционные процессы населения (туризм, коммерция, трудовая и политическая миграция) (МаИоп В.Е. е! а1., 1996), не исключена вероятность завоза данного бактериального агента на территорию Российской Федерации. Подтверждением этому являются события 1993 г., когда впервые в нашей стране был зарегистрирован случай холеры "Бенгал" (Ломов Ю.М. с соавт., 1999).

Практические лаборатории Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и лечебно-профилактические учреждения располагают широким спектром диагностических препаратов для выявления и идентификации холерных вибрионов 01 серогруппы, в то время как диагностика холеры, вызванной V сИокгае 0139, требует дальнейшего совершенствования, поскольку данные микроорганизмы являются относительно новым этиологическим агентом эпидемической холеры. На сегодняшний день единственным в Российской Федерации лицензированным препаратом для детекции V сИокгае 0139, внесенным в перечень препаратов для лабораторной

РОС. м 1 -'-ЧАЛЬНАЯ

1- '^КА

у С.

Ш^РК

диагностики холеры (МУ 4.2.1097-02), является кроличья агглютинирующая сыворотка для ориентировочной РА на стекле.

Достоверность лабораторной диагностики холеры "Бенгал" может быть достигнута при комплексном применении различных методов - от классической реакции агглютинации до тест-систем, разработанных на основе современных технологий, таких, как гибридомная (Маркина О.В. с соавт., 2001; Алексеева Л.П. с соавт., 2002; Терешкина Н.Е., 2004; Feodorova V.A. et al, 2001), а также генодиагностических методов - ПЦР (Давыдова H.A. с соавт., 2001). В то же время при конструировании диагностических препаратов немаловажным фактором является их доступность для практического здравоохранения (Покровский В.И., Онищенко Г.Г., 2004). К числу таких МИБП относятся препараты для диагностики бактериальных инфекций методом флуоресцирующих антител (МФА). Этот метод занимает одно из ведущих мест в экспресс-диагностике особо опасных инфекций благодаря высокой иммунологической чувствительности в сочетании с точностью микроскопического анализа. Чувствительность МФА при приготовлении мазков непосредственно из взвеси бактерий находится в пределах 1х105 - 5x105 м.кл./мл (Гольдин Р.Б. с соавт., 1977). Данный метод надежно зарекомендовал себя при диагностике холеры, обусловленной V. cholerae Ol серогруппы (Чибрикова Е.В. с соавт, 1962; Щуркина И.И., 1967; Formosan J., 1965).

Неблагоприятный прогноз по холере "Бенгал" в мире, в том числе странах СНГ (Марамович A.C. с соавт., 1999, 2002; Онищенко Г.Г. с соавт., 1999, 2000; Ломов Ю.М. с соавт., 2000; Покровский В.И., 2000; Федоров Ю.М. с соавт., 2000; Москвитина Э.А. с соавт., 2003, 2004), ограниченный выбор препаратов для детекции V. cholerae 0139 дают основания считать актуальной проблему разработки новых диагностических препаратов для выявления и идентификации холерных вибрионов "Бенгал", которой и посвящена настоящая работа.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - усовершенствование лабораторной диагностики холеры, вызванной V. cholerae 0139, путем конструирования препарата флуоресцирующих иммуноглобулинов.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Изучить способность к индукции специфических антител в организме биопродуцента препаратов холерного О-антигена, приготовленных различными способами, и оценить их эффективность для получения сывороток с высоким уровнем активности.

2. Отработать оптимальную схему гипериммунизации кроликов-продуцентов холерной 0139 сыворотки с минимальным содержанием гетерологичных антител.

3. Экспериментально обосновать выбор оптимального метода фракционирования кроличьих иммуноглобулинов, не влияющего на их специфическую активность и характеризующегося высоким выходом белка.

4. Получить флуорохромные конъюгаты холерных 0139 кроличьих иммуноглобулинов и охарактеризовать их специфическую активность.

5. Отработать рациональный режим адсорбции ФИТЦ-меченых иммуноглобулинов с целью повышения специфичности препарата.

6. Отработать оптимальные условия стабилизации кроличьх флуоресцирующих холерных 0139 иммуноглобулинов.

7. Определить диагностическую ценность препарата в МФА, а также в других методах экспресс-анализа.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Впервые, на основе сравнительного анализа препаратов О-антигена холерного вибриона 0139 сероварианта, полученных различными способами, показано, что с наибольшей эффективностью в схеме изготовления флуоресцирующих иммуноглобулинов может быть использован препарат, полученный с помощью комбинации методов ультрафильтрации на полых волокнах и гель-хроматографической очистки.

Впервые, на основе экспериментальных исследований по индуцированию у лабораторных животных антител к О-антигену, предложена эффективная схема гипериммунизации кроликов, позволяющая получать холерные 0139 сыворотки с высокой активностью и низким уровнем содержания гетерологичных антител.

Впервые разработаны общие принципы и методические приемы изготовления кроличьих флуоресцирующих иммуноглобулинов к V. скокгае 0139,

заключающиеся в выделении активной фракции иммуноглобулинов сульфатом аммония, обессоливанием гель-фильтрацией, выборе оптимальных соотношений флуорохрома и иммуноглобулинов, адсорбции неспецифических антител из препарата экспериментально установленным спектром штаммов холерных вибрионов 01 и не 01 серогрупп, стерилизующей фильтрации, применении наиболее эффективных стабилизаторов при проведении процесса лиофилизации.

Впервые показана возможность использования препарата флуоресцирующих иммуноглобулинов в других эффективных тестах экспресс-выявления возбудителя холеры "Бенгал": реакции слайд-агглютинации, иммуноферментном и дот-иммуноанализе, что существенно расширяет сферы его применения в лабораторной практике.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Разработана биотехнологическая схема серийного изготовления нового препарата для выявления V сИокгае 0139 в реакции иммунофлуоресценции, определены условия его стабилизации.

Подтверждена авторскими исследованиями и комиссионными испытаниями высокая диагностическая эффективность применения препарата для выявления патогенных вибрионов 0139 серогруппы методом флуоресцирующих антител (Акт о проведении комиссионных испытаний иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих холерных 0139 адсорбированных кроличьих сухих от 02.02.04).

Составлен проект нормативной документации - экспериментально-производственный регламент (ЭПР), фармакопейная статья предприятия (ФСП), инструкция по применению на иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие холерные 0139 адсорбированные кроличьи сухие, одобренный Ученым советом РосНИПЧИ "Микроб" (протокол № 5 от 25.06.04).

Материалы, представленные в диссертационной работе, получены в процессе реализации исследований, выполненных в рамках плановых тем НИР: "Совершенствование технологии производства и системы контроля качества медицинских иммунобиологических препаратов", № 036-2-00 (№ Госрегистрации 01.20.0010636); "Создание банка антигенов возбудителей ООИ и антител к ним,

стандартных по своим физико-химическим и иммунобиологическим характеристикам", № 005-2-01 (№ Госрегистрации 01.20.0010635).

Разработанный препарат используется на курсах первичной специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования врачей по бактериологии при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" при проведении практических занятий в цикле изучения микробиологии и лабораторного диагноза холеры.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Сконструированный препарат "Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие холерные 0139 адсорбированные кроличьи сухие" предназначен для детекции холерных вибрионов "Бенгал" методом прямой иммунофлуоресценции.

2. О-антиген холерного вибриона 0139, полученный способом ультрафильтрации на полых волокнах, является оптимальным препаратом для гипериммунизации кроликов-продуцентов с целью получения сыворотки-полуфабриката для изготовления флуоресцирующих иммуноглобулинов.

3. Рациональная схема иммунизации кроликов-продуцентов позволяет получать активные холерные 0139 сыворотки с минимальным уровнем содержания гетерологичных антител.

4. Разработанная биотехнологическая схема экспериментально-производственного изготовления холерных 0139 флуоресцирующих иммуноглобулинов позволяет получать препарат, характеризующийся высокой активностью и специфичностью, сохраняющий основные свойства в течение 2,5 лет (срок наблюдения).

5. Диагностические холерные 0139 флуоресцирующие иммуноглобулины могут быть использованы для детекции холерных вибрионов 0139 серогруппы в других методах экспресс-анализа, включающих слайд-агглютинацию, иммуноферментный и дот-иммуноанализ.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Материалы диссертации представлены на: межрегиональной научно-практической конференции "Медицинские, экологические и социальные аспекты

формирования здоровья населения (Челябинск, 2001); юбилейной научно-практической конференции "Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы", посвященной 50-летию Ставропольского НИПЧИ (Ставрополь, 2002); юбилейной научно-практической конференции "Инфекционные болезни в регионах Северного Кавказа: эпидемиология, лабораторная диагностика, профилактика", посвященной 50-летию Дагестанской противочумной станции (Махачкала, 2002); VIII Российской научно-практической конференции "Холера и патогенные для человека вибрионы" (Ростов-на-Дону, 2003); научно-практических конференциях РосНИПЧИ "Микроб" "Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте "Микроб" (Саратов, 2001, 2002, 2004); Всероссийской научно-практической конференции "Медицинская микробиология -XXI век" (Саратов, 2004).

Диссертационная работа обсуждена и одобрена на межлабораторной научной конференции РосНИПЧИ "Микроб" 22.03.2005 г., протокол № 8.

ПУБЛИКАЦИИ.

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация состоит из введения; 2 глав обзора литературы; 5 глав собственных исследований, включающих описание материалов и методов исследований и экспериментальную часть; заключения; выводов; списка литературы, включающего 241 источник, из них зарубежных - 95. Объем диссертации составляет 151 страницу машинописного текста, включая 9 рисунков и 17 таблиц.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

Изучение специфической активности гипериммунных сывороток и экспериментальных серий сконструированного на их основе препарата иммуноглобулинов холерных 0139 диагностических флуоресцирующих кроличьих адсорбированных сухих проведено на 42 штаммах V. cholerae 0139 серогруппы, в

том числе 22 вирулентных, изолированных от больных и вибриононосителей, и 20 авирулентных, выделенных из объектов окружающей среды.

Специфичность полученного препарата изучали с использованием 120 штаммов микроорганизмов различных таксономических групп: V. сИокгае 01 серогруппы - 18 штаммов, V. скокгае 02-083 серогрупп - 83 штамма, других представителей семейств УЛгюпасеае, Р.чеиЛотопасеае и Еп1егоЬас1епасае - 19 штаммов.

Для выращивания культур холерных вибрионов использовали жидкие и плотные щелочные среды рН 7,6-7,8 - 1 % пептонную воду, мясо-пептонный бульон Мартена, бульон из перевара Хоттингера, агар Мартена. Условно-патогенные микроорганизмы выращивали на бульоне и агаре Хоттингера рН 7,2.

Бактериальные суспензии с концентрацией 1x109 м.к./мл готовили на 0,9 % растворе натрия хлорида, используя оптический стандарт мутности бактериальных взвесей ГИСК им. Л А. Тарасевича 5 единиц (ОСО 42-28-86П). Для приготовления мазков из культур холерных вибрионов взвеси бактерий разводили 0,9 % раствором натрия хлорида в 2 раза до концентрации 5x10* м.к./мл.

В качестве животных-продуцентов иммунных сывороток были использованы 68 кроликов породы "Шиншилла" массой 2,5-3,0 кг.

Для получения кроличьей холерной 0139 агглютинирующей сыворотки в качестве антигенов апробировали корпускулярные антигены, приготовленные на основе штамма V сИокгае 0139 Р-16064 (РП № 541-95) и его бескапсульных вариантов КМ-137 и КМ-138 (РП № 973-00; Чеховская Г.В. с соавт., 2000); растворимые антигены: препараты ЛПС трихлоруксусной экстракции (Вотп А. е/ а/., 1933) и О-антигена, выделенного способом ультрафильтрации из формалинизированного безмикробного супернатанта штамма V. сИокгае 0139 МО-45 (Громова О.В. с соавт., 2000).

Активность и специфичность иммунных кроличьих сывороток определяли в классической объемной реакции агглютинации и оценивали в соответствии с ВФС 42-3466-99.

Иммуноглобулиновую фракцию из сывороток выделяли с помощью сернокислого аммония (Kekwick R., 1940), полиэтиленгликоля-6000 (Bergquest N.R. etal., 1970), каприловой кислоты (Steinbuch М. el al„ 1969).

Конъюгацию холерных 0139 иммуноглобулинов с ФИТЦ осуществляли по методу Marshall J.D. et al. (1958). Активность и специфичность флуорохромных конъюгатов определяли прямым методом флуоресцирующих антител.

Иммунопероксидазные конъюгаты получали методом перйодатного окисления по Nakane Р.К., Kawaoi А. (1974). Уровень активности иммуноглобулинов с двойной меткой (ФИТЦ и ферментом) выявляли в различных вариантах иммуноферментного и дот-иммуноанализа.

Экспериментальные данные были обработаны методами вариационной статистики, изложенными в работе Ашмарина И.А. и Воробьева А.А. (1962).

Результаты исследований и их обсуждение

Первый этап исследований заключался в определении способности к индукции специфических антител в организме животных препаратов О-антигена V. cholerae 0139, полученных различными способами, и отработке оптимальной схемы иммунизации продуцентов с целью получения высокоактивной холерной 0139 сыворотки, которая могла бы стать полуфабрикатом для изготовления флуоресцирующих иммуноглобулинов.

Выбор кроликов в качестве продуцентов сывороток обусловлен их более высокой по сравнению с другими видами животных иммунореактивностью (Смирнов В.В. с соавт., 1980; Михайлова В.А., 1998; Гефан Н.Г. с соавт., 1999). Экономическую целесообразность использования кроликов в качестве доноров определяют относительная простота их содержания и достаточный для мелкосерийного производства объем получаемой сыворотки - в среднем 40 мл сыворотки от каждого кролика.

антигены, экстрагированные по методу A. Boivin et al. из штамма V. cholerae 0139 МО-45, а также способом ультрафильтрации через полые волокна форма-линизированного безмикробного супернатанта штамма V. cholerae 0139 МО-45.

Примененные схемы иммунизации варьировали в зависимости от дозы антигена, способа и кратности его введения, числа курсов иммунизации.

Иммунизация кроликов корпускулярным кипяченым антигеном, приготовленным на основе штамма V. cholerae 0139 Р-16064, не позволила получить активные сыворотки с уровнем содержания специфических антител более, чем 1:100, определяемого в объемной реакции агглютинации. Увеличение антигенной нагрузки, а также изменение схемы иммунизации не способствовали повышению активности гипериммунных сывороток. Полученные экспериментальные данные согласуются с мнением о том, что капсульный полисахарид бенгальских штаммов маскирует поверхностные антигенные структуры микроба, снижая уровень иммунологических реакций со стороны макроорганизма (Чеховская Г.В. с соавт, 2000; Смирнова Н.И., 2002).

Поскольку отсутствие капсулы усиливает иммуногенные свойства антигена, применение корпускулярного антигена, приготовленного из бескапсульных вариантов штамма V cholerae 0139 Р-16064, способствовало повышению активности гипериммунных сывороток. Наиболее эффективной оказалась схема иммунизации, предусматривающая только внутривенное введение антигена, при которой были получены сыворотки, характеризующиеся уровнем содержания специфических антител (600 + 40) (здесь и далее указаны значения обратных титров антител в объемной реакции агглютинации) Показатель активности сывороток, полученных при использовании схемы с подкожным введением антигена, составил (333 + 67). Содержание гетерологичных антител к V. cholerae 022 серогруппы составило (580 + 50) и (666 + 133), соответственно.

Наличие большого количества гетерологичных антител обусловлено, во-первых, значительной гомологией хромосом холерных вибрионов 0139 и 022 серогрупп (Yamasaki S et al., 1997, 1999; Dumontier S. et al., 1998). Во-вторых, введение корпускулярного антигена в организм продуцента вызывает антительный ответ, являющийся суммарным на весь комплекс термостабильных компонентов, в

том числе и балластных, содержащихся в целой микробной клетке, что индуцирует выработку неспецифических антител (Смирнов В.В. с соавт., 1980) Кроме того, традиционное приготовление корпускулярного О-антигена путем длительного кипячения приводит к частичному обнажению участков молекулы соматического антигена, содержащих группоспецифические антигенные детерминанты, которые при иммунизации животных стимулируют выработку перекрестнореагирующих антител (Яровая Л.М. с соавт., 1991; Федорова В.А. с соавт., 1996).

Несмотря на то, что гипериммунные сыворотки кроликов, полученные при использовании корпускулярного антигена на основе бескапсульного варианта штамма V сИокгае 0139 Р-16064, характеризовались более высоким уровнем активности, они были малоэффективны в качестве полуфабриката для изготовления флуоресцирующих иммуноглобулинов из-за высоких титров гетерологичных антител к V сИокгае 022 серогруппы. При изготовлении высокоспецифичного препарата флуоресцирующих иммуноглобулинов из таких сывороток неизбежна процедура неоднократной адсорбции, что, как правило, приводит к значительному снижению уровня специфической активности готового препарата. Чтобы сократить до минимума количество адсорбций на этом этапе биотехнологической схемы, в качестве полуфабриката предпочтительнее использовать сыворотки с высокой специфической активностью и минимальным содержанием гетерологичных антител, одним из путей получения которых является использование максимально очищенных антигенов. В качестве таких препаратов были испытаны растворимые антигены.

При сравнении препаратов О-антигена, экстрагированного по Буавену и О-антигена, выделенного методом ультрафильтрации на полых волокнах, выявлены преимущества второго в стимуляции продукции специфических антител -соответственно (400 + 0) и (666 + 67) при использовании одинаковой схемы иммунизации. По-видимому, воздействие на О-антиген органическими растворителями (трихлоруксусной кислотой) вызывает глубокую деградацию О-антигена, денатурируя белковые компоненты, в значительной мере обусловливающие антигенность ЛПС.

О-антиген, выделенный методом ультрафильтрации из формалинизиро-ванного безмикробного супернатанта штамма V. cholerae 0139 МО-45, максимально сохраняет свою нативность, а, следовательно, обладает наибольшей антигенной активностью (Громова О.В. с соавт., 1999, 2000, 2002).

Таким образом, препаратом выбора для гипериммунизации кроликов явился растворимый О-антиген, полученный способом ультрафильтрации на полых волокнах (рис. 1).

При выборе оптимальной схемы иммунизации животных важно было подобрать такие условия (доза антигена, кратность инъекций, количество циклов), которые бы способствовали выработке у доноров наибольшего количества специфических антител и наименьшего - гетерологичных антител.

При иммунизации кроликов растворимым О-антигеном, полученным методом ультрафильтрации, были использованы схемы №№ 1, 2, 3. Животным первой группы О-антиген вводили шестикратно: первую инъекцию делали подкожно с адъювантом Фрейнда в количестве 2 мг; через 12 дней - внутривенные инъекции с трехдневным интервалом в дозах 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 мг (схема № 1). Кроликам второй группы О-антиген вводили шестикратно внутривенно в дозах 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 2,0; 2,0 мг с интервалом между инъекциями в четыре дня (схема № 2). Животные третьей группы получали высокие дозы антигена: 2; 4; 8 мг внутривенно с интервалом в четыре дня с проведением повторного курса иммунизации через месяц (схема № 3).

Результаты сравнения активности и специфичности полученных сывороток показали, что наиболее эффективна схема иммунизации № 3. Специфическая активность сывороток, полученных при такой схеме иммунизации - (743 + 164), была сравнима с активностью сывороток, полученных при иммунизации по схемам №№ 1 и 2 - (666 ± 67) и (800 ± 0), однако, титр гетерологичных антител в этих сыворотках был значительно ниже - (129 + 19), (211 + 39) и (533 + 136), соответственно (рис. 2).

□ специфические антитела ■ неспеинфичекие ашитела

1 2 3

Рис 1. Соотношение титров специфических и неспецифических антител при иммунизации кроликов различными антигенами

По оси ординат - значения обратных среднеарифметических титров антител; по оси абсцисс - группы кроликов:

1 - иммунизация корпускулярным О-антигеном на основе V cholerae Ol39 КМ-137 и КМ-138;

2 - иммунизация растворимым О-антигеном (метод Буавена) на основе V cholerae 0139 МО-45;

3 - иммунизация растворимым О-антигеном (метод ультрафильтрации) на основе V cholerae Ol 39 МО-45.

800-f' 700 600 500 400 300200 100-

О специфические антитела ■ неспецифические антитела

Рис 2. Влияние схем иммунизации кроликов на интенсивность иммуногенеза при введении О-антигена, полученного методом ультрафильтрации

По оси ординат- значения обратных среднеарифметических титров антител; по оси абсцисс - группы кроликов.

1 - иммунизация п/к с адыоваитом I в/в умеренными дозами (до 2,5 мг),

2 - иммунизация в/в умеренными дозами (до 2,0 мг),

3 - двухцикловая иммунизация в/в большими дозами (2-4-8 мг)

Таким образом, полуфабрикатом для изготовления препарата флуоресцирующих иммуноглобулинов к V. cholerae 0139 явились холерные 0139 сыворотки, полученные при двухцикловой гипериммунизации кроликов 0-антигеном, выделенным способом ультрафильтрации.

Для получения флуоресцирующих конъюгатов мы использовали выделенную из цельной гипериммунной сыворотки иммуноглобулиновую фракцию, не содержащую иммунологически инертный, но высокореакционный альбумин. При выделении иммуноглобулиновой фракции различными методами - осаждение сульфатом аммония, фракционирование ПЭГ-6000 и каприловой кислотой -предпочтение было отдано первому способу, т.к. он обеспечивал наибольший выход специфически активного белка - (2,9 + 0,65), (1,6 + 0,49) и (1,0 + 0,25) мг/мл, соответственно. Иммуноглобулины, выделенные осаждением сульфатом аммония, характеризовались в непрямом методе иммунофлуоресценции достаточно высокой активностью - (333 + 34,6) (величина обратных титров антител).

Далее, на основе выделенных иммуноглобулинов были изготовлены флуорохромные конъюгаты. Конъюгацию 2 % раствора иммуноглобулинов с ФИТЦ осуществляли по методу J.D. Marshall et al. (1958) с нагрузкой красителя 2 и 3 мг на 100 мг белка. С целью удаления избытка красителя для получения очищенного конъюгата осуществляли гель-фильтрацию реакционной смеси на колонке с сефадексом G-50.

При люминесцентной микроскопии мазков, приготовленных из 18-20-часовых культур холерных вибрионов 0139, была выявлена высокая активность (1:641:128 и 1:128-1:256) всех серий изготовленных ФИТЦ-конъюгатов. Наиболее активные ФИТЦ-конъюгаты, обеспечивающие и более яркую флуоресценцию, были получены при нагрузке красителя, равной 3 мг/100 мг белка.

Вместе с тем, полученные конъюгаты в разведениях 1:8-1:16 положительно реагировали с холерными вибрионами 022 и 01 серогрупп. С целью повышения специфичности конъюгатов была проведена адсорбция меченых иммуноглобулинов. В качестве адсорбентов использовали штаммы холерных вибрионов 01 и 022 серогрупп: V cholerae 022 169-68 (30 мг на 1 мл

иммуноглобулинов), V сИокгае 01 М-41 Огава (15 мг/мл), V сИокгае 01 569В Инаба (15 мг/мл), инактивированные формалином (0,5 %).

В результате адсорбции было достигнуто повышение специфичности флуоресцирующих иммуноглобулинов, которые характеризовались иммуно-флуоресценцией на три-четыре креста в разведении 1:32 - 1:64 со штаммами V. сИокгае 0139 при отсутствии перекрестных реакций с холерными вибрионами 01 и 022 серогрупп не только в рабочем, но и в начальных разведениях препарата.

Для сохранения функциональной активности холерных 0139 флуоресцирующих иммуноглобулинов в процессе длительного хранения были использованы различные приемы стабилизации, включающие, помимо добавления консерванта, стерилизующую фильтрацию через нитроцеллюлозные фильтры фирмы "МППроге" с размером пор 0,22 мкм и лиофильное высушивание препарата с предварительным добавлением стабилизатора, состоящего из 2,5 % сахарозы и 0,75 % тиосульфата натрия (Андреевская Н.М. с соавт., 1997, 1998). Перечисленные методы стабилизации обеспечивали сохранение диагностической ценности флуоресцирующих иммуноглобулинов в течение 2,5 лет (срок наблюдения).

На следующем этапе работы было проведено определение активности экспериментальных серий иммуноглобулинов флуоресцирующих холерных 0139 адсорбированных кроличьих сухих, минимальной концентрации клеток V. сИокгае 0139, которую можно выявить с их помощью (чувствительность метода), а также 4

изучение специфичности препарата и оценка эффективности идентификации культур холерных вибрионов 0139 серогруппы методом прямой иммунофлуоресценции. Чувствительность МФА при приготовлении мазков непосредственно из взвеси холерных вибрионов 0139 серогруппы определяли по минимальной дозе, при которой обнаруживали не менее 1-5 светящихся вибрионов в каждом поле зрения. Все экспериментальные серии препарата в рабочем разведении (1:32-1:64) позволяли обнаруживать клетки холерных вибрионов 0139 в концентрации 1х105 м.к./мл - единичные клетки при просмотре 4-5 полей зрения, в то время как при концентрации холерных вибрионов 5x105 м.к./мл обнаруживаются 1-2, реже 3, клетки в каждом поле зрения. Выявление холерных вибрионов в меньшей концентрации было возможным, но требовало значительного напряжения

зрения исследователя и просмотра большого числа полей зрения. Таким образом, чувствительность прямого МФА с применением флуоресцирующих холерных 0139 иммуноглобулинов была определена в пределах IxlO5 - 5x10s м.к./мл, что вполне соответствует общепринятым значениям чувствительности данного метода (Гольдин Р.Б. с соавт., 1977).

Результаты собственных исследований, продемонстрировавших высокую специфичность и диагностическую значимость разработанного препарата, были подтверждены комиссионными испытаниями трех серий флуоресцирующих иммуноглобулинов, полученных в условиях экспериментального производства (Акт о проведении комиссионных испытаний иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих холерных 0139 адсорбированных кроличьих сухих от 02.02.04) Активность препарата определяли на 42 штаммах холерных вибрионов "Бенгал", в том числе 22 штаммах, выделенных от больных и вибриононосителей, и 20 штаммах - из объектов внешней среды Все указанные штаммы холерных вибрионов "Бенгал", независимо от источника выделения, характеризовались свечением периферии микробной клетки с интенсивностью на 4+ и 3+ при разведении флуоресцирующих иммуноглобулинов 1:32 - 1: 64, в зависимости от серии препарата. По результатам комиссионных испытаний были установлены величины красящего титра и рабочего разведения для каждой серии препарата Красящий титр для серий 02 и 05 составил 1:128, для серии 03 - 1:64. Рабочее разведение соответствовало 1:64 для серий 02 и 05 и 1:32 для серии 03.

Специфичность препарата флуоресцирующих иммуноглобулинов была испытана на наборе из 120 штаммов, включающем холерные вибрионы различных серогрупп: 02-083 - 83 штамма, Ol - 16 штаммов классического и эльтор биоваров сероваров Инаба и Огава и 2 штамма в R-форме, а также представителей других родов семейства Vibrionaceae (Comamonas - 3, Aeromonas - 3, Plesiomonas shigelloides - 3), микроорганизмов семейства Pseudomonaceae (Pseudomonas - 3), семейства Enterobacteriacae (Yersinia enterocolitica - 2, Escherichia coli - 1, Shigella sonnei - 2, Salmonella typhimurium - 1, Salmonella paratyphi В- 1).

Результаты испытаний подтвердили высокую специфичность сконструированного препарата флуоресцирующих иммуноглобулинов - ни с одним

из представителей вышеперечисленных микроорганизмов не зарегистрировано положительных реакций иммунофлуоресценции в рабочем разведении, установленном для каждой серии иммуноглобулинов (табл. 1).

На следующем этапе исследования были проведены эксперименты по обнаружению холерных вибрионов 0139 в искусственно инфицированных образцах биологического материала (испражнений и рвотных масс) и объектов внешней среды (воды из р. Волга). Готовили 72 пробы биологического материала и 36 проб речной воды, в которые вносили микробные клетки в концентрации 5x105, 5x106, 5x107, 5x10® м.к./мл (табл.2) Исследования показали, что препарат флуоресцирующих холерных 0139 иммуноглобулинов позволяет выявлять холерные вибрионы 0139 серогруппы как в материале от людей, так и из объектов внешней среды при концентрации патогена в образце 5х105 м.к./мл и выше, что подтверждает возможность его применения в схеме экспресс-диагностики холеры "Бенгал". При обнаружении возбудителя в нативном материале время проведения анализа составляет 1,5 - 2 ч, что имеет важное значение для принятия решения о проведении противоэпидемических мероприятий.

Кроме того, была исследована возможность использования флуоресцирующих иммуноглобулинов к V сИокгае 0139 в других методах экспресс-диагностики - в реакции слайд-агглютинации, прямом и непрямом вариантах иммуно-ферментного и дот-иммуноанализа Установлено, что сконструированные флуоресцирующие иммуноглобулины 0139 могут быть в случае необходимости использованы для слайд-агглютинации. Данный препарат в разведении 1:10 при взамодействии с культурами холерных вибрионов "Бенгал" дает четкую, крупнозернистую агглютинацию на стекле, не уступающую по качеству таковой при использовании коммерческой агглютинирующей сыворотки 0139. С V. сИо1егае 022 и 01 реакция была отрицательной.

При постановке дот-иммуноанализа в непрямом варианте активность флуоресцирующих иммуноглобулинов 0139 имела значение 1:4000, а чувствительность метода составила 1,5x107 мк/мл при отсутствии перекрестных реакций с V с!ю1егае 022 и 01. В непрямом варианте иммуноферментного анализа

Таблица 1

Эффективность применения иммуноглобулинов флуоресцирующих холерных 0139 для выявления V. сИокгае 0139 серогруппы в прямом МФА

Наименование микроорганизмов Количество штаммов* Количество позитивных реакций, % Рабочее разведение препарата

Серия 02 Серия 03 Серия 05

V. cholerae 0139 (вирулентные) 22 100 1:64 1:32 1:64

V. cholerae 0139 (авирулентные) 20 100 1:64 1:32 1:64

V. cholerae 02-083 83 0 - - -

V. cholerae Ol 18 0 - - -

Comamonas 3 0 - - -

Aeromonas 3 0 - - -

Plesiomortas shigelloides 3 0 - - -

Pseudomonas 3 0 - - -

Escherichia coli 1 0 - - -

Shigella sonnae 2 0 - - -

Salmonella typhimurium 1 0 - - -

Salmonella paratyphi В 1 0 - - -

Yersinia enterocolitica 2 0 - - -

Таблица 2

Результаты выявления V. сИокгае 0139 в искусственно инфицированных образцах биологического материала и объектов внешней среды

Наименование Кол-во Число Концентрация Количество

исследуемого штаммов проб микробных клеток позитивных

материала V. cholerae 0139 в пробе, м.к./мл реакций, %

/•а/сел 3 36 5x105 100

5х106

5x10'

5x10"

Рвотные массы 3 36 5x105 100

5x10"

5x10'

5x10*

Вода из р. Волга 3 36 5x105 100

5x10"

5х107

5x10"

Контроль - 9 - 0

активность флуоресцирующих иммуноглобулинов имела значение 1:8000, чувствительность - I х 109 — 5х108м.к./мл.

Прямой вариант как ИФА, так и ДИА, позволяет значительно ускорить получение результатов. В связи с этим особый интерес вызывают препараты с двойной меткой - ферментно-флуорохромные комплексы (Аленкина Т.В., 1996). С целью получения таких конъюгатов нами проведено конъюгарование флуоресцирующих иммуноглобулинов с пероксидазой хрена. Иммуноглобулины с двойной меткой были активны в прямых вариантах ИФА и ДИА в разведениях 1:4000 и 1:1000, соответственно. Чувствительность методов составила соответственно 1х109 - 5x10* и 1,5х107 - 7,8х106 м.к./мл. Перекрестные реакции с гетерологичными штаммами V. сИо1егае 01 и 022 отмечены только в ИФА при разведениях конъюгата 1:2 - 1:16, при разведении конъюгата выше 1:16 неспецифические реакции отсутствовали.

Необходимо отметить, что после конъюгирования с ферментом флуоресцирующие иммуноглобулины, помимо приобретения новых свойств, полностью сохраняли свою первоначальную активность и специфичность в МФА, т.е. выявляли клетки холерных вибрионов 0139 в рабочем разведении.

Таким образом, разработанная биотехнологическая схема изготовления холерных 0139 флуоресцирующих иммуноглобулинов включала в себя следующие этапы: получение антигена, гипериммунизацию кроликов-продуцентов с целью получения сыворотки-полуфабриката; выделение из гипериммунной сыворотки серологически активной иммуноглобулиновой фракции; конъюгирование иммуноглобулиновой фракции с флуорохромом; адсорбцию конъюгата с целью удаления гетерологичных антител; контроль уровня специфической активности и специфичности конъюгата; стабилизацию препарата флуоресцирующих антител (рис. 3).

Рис. 3. Биотехнологическая схема получения флуоресцирующих холерных 0139 кроличьих иммуноглобулинов

требованиям нормативной документации, предъявляемым к диагностическим флуоресцирующим иммуноглобулинам, в том числе выпускаемым РосНИПЧИ "Микроб" (ФСП №№ 42-0020-5926-04, 42-0020-5927-04, 42-0020-2422-02). Препарат в рабочем разведении 1:32 - 1:64, в зависимости от серии, позволяет выявлять холерные вибрионы 0139 серогруппы прямым методом флуоресцирующих антител и не проявляет перекрестных реакций с другими микроорганизмами семейств УШпопасеае, Ряеис/отопасеае, Еп1егоЬас1епасае.

Учитывая, что МФА является экспрессным методом, внедрение препарата в практику будет способствовать повышению эффективности диагностики холеры "Бенгал". Кроме того, в зависимости от оснащенности лабораторий, разработанный препарат может быть применен для обнаружения V. скокгае 0139 в реакции слайд-агглютинации и в непрямых вариантах иммуноферментного и дот-иммуноанализа. Двойные ферментно-флуорохромные конъюгаты, полученные в результате присоединения к флуоресцирующим иммуноглобулинам фермента, позволят с одинаковым успехом выявлять соответствующий патоген в прямых вариантах ИФА и ДИА, сохранив при этом активность в МФА.

Разработан проект нормативной документации, включающий экспериментально-производственный регламент "Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие холерные 0139 адсорбированные кроличьи сухие", фармакопейную статью предприятия, инструкцию по применению. Нормативная документация одобрена Ученым Советом РосНИПЧИ "Микроб" (протокол № 5 от 25.06.04).

ВЫВОДЫ

1. На основе поликлональных иммуноглобулинов впервые сконструирован диагностический препарат "Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие холерные 0139 адсорбированные кроличьи сухие", предназначенный для детекции холерных вибрионов "Бенгал" прямым методом флуоресцирующих антител.

сыворотки-полуфабриката; выделение из гипериммунной сыворотки серологически активной иммуноглобулиновой фракции; конъюгирование иммуноглобулиновой фракции с флуорохромом; адсорбцию конъюгата с целью удаления гетерологичных антител; контроль уровня специфической активности и специфичности конъюгата; стабилизацию свойств препарата.

3. Проведено сравнительное изучение антигенных свойств четырех препаратов корпускулярных и растворимых О-антигенов холерного вибриона 0139. Препаратом выбора явился О-антиген, выделенный способом ультрафильтрации на полых волокнах из безмикробного супернатанта штамма V cholerae 0139 МО-45. Отработана оптимальная схема гипериммунизации животных данным антигеном и определены условия выделения из сывороток иммуноглобулиновой фракции.

4. Диагностическая ценность сконструированного препарата подтверждена комиссионными испытаниями трех экспериментально-производственных серий препарата с использованием 42 штаммов V. cholerae 0139 и 120 штаммов холерных вибрионов 01, 02 - 083 серогрупп и других микроорганизмов семейств Vibrionaceae, Pseudomonaceae и Enterobacteriacae, а также установлено рабочее разведение препарата, которое составляет 1:32 - 1:64 в зависимости от серии.

5. Показана возможность использования сконструированного препарата для детекции V. cholerae 0139 в других тестах экспресс-анализа, включая реакцию слайд-агглютинации и непрямые варианты иммуноферментного и дот-иммуноанализа; изготовленные на основе препарата двойные ферментно-флуорохромные конъюгаты также позволяют выявлять холерные вибрионы "Бенгал" в прямых вариантах иммуноферментного и дот-иммуноанализа.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Аленкина Т.В., Бочкарева Г.В., Абрамова Е.Г., Ливанова Л.Ф., Смирнова Н.И. Разработка метода получения иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих к Vibrio cholerae non 01 0139 серовара // Холера и патогенные для человека вибрионы. Мат. межвед. науч. совета по сан.- эпид. охране террит. РФ. - Ростов-на-Дону, 2000. - Вып. 13. - С. 73-74.

2 Абрамова Е Г., Аленкина Т В., Бочкарева Г.В., Громова О.В. Возможность экспресс-диагностики Vibrio cholerae 0139 серогруппы методом иммунофлуоресценции // Медицинские, экологические и социальные аспекты формирования здоровья населения. Материалы научно-практической конференции. - Челябинск, 2001 г. - С. 80-83.

3. Громова О.В., Джапаридзе М.Н., Дятлов И.А., Киреев М.Н., Федорова В.А., Аленкина Т.В., Абрамова Е.Г. Новый способ получения О-антигена холерного очищенного с целью создания холерных диагностических антисывороток // Биотехнология. - 2002, № 2. - С. 42-46.

4. Абрамова Е.Г., Аленкина Т.В., Бочкарева Г.В., Громова О.В. Создание препарата диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов для идентификации Vibrio cholerae 0139 II Методические документы и отчеты по сан.эпид. охране террит. РФ: реф. сб. - Саратов, 2002. - С. 20.

5. Абрамова Е.Г., Аленкина Т.В., Бочкарева Г.В., Громова О.В. Экспресс-диагностика Vibrio cholerae 0139 методом флуоресцирующих антител II Холера и патогенные для человека вибрионы. Материалы межвед. науч. совета по сан,- эпид. охране террит. РФ. - Ростов-на-Дону, 2002. - Вып. 15. - С. 85-86.

6. Абрамова Е.Г., Аленкина Т.В., Бочкарева Г.В., Громова О.В. Получение диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов к Vibrio cholerae 0139 II Инфекционные болезни в регионах Северного Кавказа- лечение, лабораторная диагностика, профилактика. Материалы юбилейной научно-практической конференции, поев. 50-летию Дагестанской ПЧС. - Махачкала, 2002. - С. 96-99.

7. Абрамова Е.Г., Аленкина Т.В., Громова О.В. Применение О-антигена, полученного новым способом, в производстве препаратов для диагностики Vibrio cholerae 0139 II Актуальные проблемы эпидемиологической безопасности. Материалы юбилейной научно-практической конференции, поев. 50-летию Ставропольского научно-исследовательского противочумного института. -Ставрополь, 2002. - С. 5-7.

8. Абрамова Е.Г, Аленкина Т В., Бочкарева Г.В., Громова О.В. Создание препарата диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов для иден-

тификации Vibrio cholerae 0139 // Холера и патогенные для человека вибрионы Мат. VIII Всерос. науч.-практ. конф. - Ростов-на-Дону, 2003. - С. 198-200.

9. Абрамова Е.Г., Аленкина Т.В., Бочкарева Г.В., Громова О.В. Возможность применения иммуноглобулинов флуоресцирующих холерных 0139 для детекции Vibrio cholerae 0139 различными методами экспресс-анализа II Холера и патогенные для человека вибрионы. Мат. межвед. науч. совета по сан.-эпид. охране террит. РФ. - Ростов-на-Дону, 2004. - Вып. 17. - С. 84-85.

10. Абрамова Е.Г., Аленкина Т.В., Бочкарева Г.В., Громова О.В. Применение флуоресцирующих холерных 0139 иммуноглобулинов для выявления Vibrio cholerae 0139 различными методами экспресс-анализа // Медицинская микробиология - XXI век. Мат. Всерос. науч.- практ. конф - Саратов, 2004. -С. 10-11.

г>

Сдано в набор 12.05.05 г. Подписано к печати 13.05.05 г. Формат 84x108 1/6. Печать лазерная. Объем 1,1 усл. п. л. Тираж 100 экз.

Отпечатано на полиграфическом оборудовании РосНИПЧИ "Микроб" 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46.

РНБ Русский фонд

2007-4 1427

'г Í

0 9 И ЮН 2005 0 , '

- , 5 /

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Абрамова, Елена Геннадьевна

Список принятых сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. ХОЛЕРНЫЙ ВИБРИОН 0139 СЕРОГРУППЫ: ХАРАКТЕРИСТИКА СВОЙСТВ И ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА.

Глава 2. ПРИНЦИПЫ КОНСТРУИРОВАНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНО-ВЫХ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Бактериальные штаммы.

3.2. Питательные среды и условия культивирования.

3.3. Антигены.

3.4. Экспериментальные животные.

3.5. Реактивы и растворы.

3.6. Оборудование и приборы.

3.7. Методы выделения и очистки иммуноглобулинов

3.8. Получение флуорохромных конъюгатов.

3.9. Изготовление пероксидазных конъюгатов.

3.10. Серологические и иммунохимические методы исследования

3.11. Статистическая обработка

Глава 4. ПОЛУЧЕНИЕ ГИПЕРИММУННЫХ ХОЛЕРНЫХ АГГЛЮТИНИРУЮЩИХ СЫВОРОТОК К VIBRIO CHOLERAE 0139.

4.1. Подбор животных-продуцентов.

4.2. Получение и физико-химическая характеристика антигенов для иммунизации животных-продуцентов.

4.3. Схемы иммунизации продуцентов.

4.4. Иммуногенные свойства антигенов и эффективность различных схем иммунизации

4.5. Изучение стабильности нативных иммунных кроличьих сывороток в процессе хранения.

Глава 5. ИЗГОТОВЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ К VIBRIO CHOLERAE 0139.

5.1. Сравнительная характеристика эффективности методов фракционирования холерных 0139 кроличьих иммуноглобулинов.

5.2. Флуоресцентная метка иммуноглобулинов.

5.3. Изучение активности и специфичности флуорохромных конъюгатов.

5.4. Повышение специфичности холерных 0139 флуоресцирующих иммуноглобулинов.

5.5. Стерилизующая фильтрация иммуноглобулинов

Глава 6. СТАБИЛИЗАЦИЯ СВОЙСТВ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ К VIBRIO CHOLERAE 0139.

6.1. Лиофилизация препарата.

6.2. Использование протекторов для стабилизации иммуноглобулинов.

6.3. Изучение влияния температурного режима и сроков хранения на основные свойства холерных 0139 флуоресцирующих иммуноглобулинов.

Глава 7. ПРИМЕНЕНИЕ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ VIBRIO CHOLERAE 0139.

7.1. Эффективность скрининга чистых культур V. cholerae 0139 прямым методом флуоресцирующих антител

7.2. Обнаружение V. cholerae 0139 в искусственно инфицированных образцах биологического материала и объектов внешней среды.

7.3. Идентификация V. cholerae 0139 различными методами экспресс-анализа с применением флуоресцирующих иммуноглобулинов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка биотехнологической схемы получения флуоресцирующих иммуноглобулинов для идентификации холерных вибрионов О139 серогруппы"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В основе целенаправленной научно обоснованной борьбы с холерой лежит ее своевременная диагностика. Для холеры, как карантинной инфекции, очень важна постановка диагноза в кратчайшие сроки с целью определения объемов проведения противоэпидемических и профилактических мероприятий.

Начиная с 1992 г., когда эпидемиологическая ситуация по холере на побережье Бенгальского залива была серьезно осложнена крупными вспышками диарейных заболеваний, вызванных представителями новой, ранее не известной 0139 серогруппы, данный патоген привлекает к себе внимание исследователей в связи с его способностью к длительному существованию в эндемичных по холере районах в межэпидемический период, а также к распространению на другие континенты (154, 208). Вспышки, обусловленные Vibrio cholerae 0139, продолжают фиксироваться в странах Юго-Восточной Азии. В 2003 г. зарегистрирована крупная эпидемия (30 ООО больных) в Дакке и примыкающих территориях, вызванная холерными вибрионами 0139 (98).

Учитывая интенсивные миграционные процессы населения, связанные с туризмом, коммерцией, трудовой и политической миграцией (26, 206), не исключена вероятность завоза данного бактериального агента в другие страны, в том числе и на территорию Российской Федерации. Подтверждением этому являются события 1993 г., когда впервые в нашей стране был зарегистрирован случай холеры "Бенгал" (77).

Практические лаборатории Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и лечебно-профилактические учреждения располагают широким спектром диагностических препаратов для выявления и идентификации холерных вибрионов 01 серогруппы, однако, диагностика холеры, вызванной V. cholerae 0139, требует дальнейшего совершенствования, поскольку данные микроорганизмы являются относительно новым этиологическим агентом эпидемической холеры. На сегодняшний день единственным в Российской Федерации лицензированным препаратом для детекции V. cholerae 0139, внесенным в перечень препаратов для лабораторной диагностики холеры (МУ 4.2.1097-02), является кроличья агглютинирующая сыворотка для РА на стекле.

Достоверность лабораторной диагностики холеры "Бенгал" может быть достигнута при комплексном применении различных методов - от классической реакции агглютинации Видаля до тест-систем, разработанных на основе современных технологий, таких, как гибридомная (5, 85, 128, 180), а также генодиагностических методов - ПЦР (24, 33). В то же время при конструировании диагностических препаратов немаловажным фактором является их доступность для практического здравоохранения. К числу таких МИБП относятся препараты для диагностики бактериальных инфекций методом флуоресцентной микроскопии. Этот метод занимает одно из ведущих мест в экспресс-диагностике особо опасных инфекций благодаря высокой иммунологической чувствительности в сочетании с точностью микроскопического анализа (168, 169). Чувствительность МФА при приготовлении мазков непосредственно из взвеси бактерий колеблется в пределах 1x105 - 5x105 м.кл./мл (28). МФА надежно зарекомендовал себя при диагностике холеры, обусловленной V. cholerae 01 серогруппы (135, 136,143, 182,218).

Неблагоприятный прогноз по холере "Бенгал" в мире, в том числе странах СНГ (59, 78, 83, 84, 95, 96, 97, 98, 101, 102, 109, 126), ограниченный выбор препаратов для детекции V. cholerae 0139 дают основания считать актуальной проблему разработки новых диагностических препаратов для выявления и идентификации холерных вибрионов "Бенгал", которой и посвящена настоящая работа.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ - усовершенствование лабораторной диагностики холеры, вызванной V. cholerae 0139, путем конструирования препарата флуоресцирующих иммуноглобулинов.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

6. Отработать оптимальные условия стабилизации кроличьх флуоресцирующих холерных 0139 иммуноглобулинов.

7. Определить диагностическую ценность препарата в МФА, а также в других методах экспресс-анализа.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые, на основе сравнительного анализа препаратов О-антигена холерного вибриона 0139 сероварианта, полученных различными способами, показано, что с наибольшей эффективностью в схеме изготовления флуоресцирующих иммуноглобулинов может быть использован препарат, полученный с помощью комбинации методов ультрафильтрации на полых волокнах и гель-хроматографической очистки.

Впервые разработаны общие принципы и методические приемы изготовления кроличьих флуоресцирующих иммуноглобулинов к V. ско1егае 0139, заключающиеся в выделении активной фракции иммуноглобулинов сульфатом аммония, обессоливанием гель-фильтрацией, выборе оптимальных соотношений флуорохрома и иммуноглобулинов, адсорбции неспецифических антител из препарата экспериментально установленным спектром штаммов холерных вибрионов 01 и не 01 серогрупп, стерилизующей фильтрации, применении наиболее эффективных стабилизаторов при проведении процесса лиофилизации.

Впервые показана возможность использования препарата флуоресцирующих иммуноглобулинов в других эффективных „тестах экспресс-выявления возбудителя холеры "Бенгал": реакции слайд-агглютинации, иммуноферментном и дот-иммуноанализе, что существенно расширяет сферы его применения в лабораторной практике.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Разработана биотехнологическая схема серийного изготовления нового препарата для выявления V. сИо1егае 0139 в реакции иммунофлуоресценции, определены условия его стабилизации.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

2.0-антиген холерного вибриона 0139, полученный способом ультрафильтрации на полых волокнах, является оптимальным препаратом для гипериммунизации кроликов-продуцентов с целью получения сыворотки-полуфабриката для изготовления флуоресцирующих иммуноглобулинов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации представлены на:

- межрегиональной научно-практической конференции "Медицинские, экологические и социальные аспекты формирования здоровья населения (Челябинск, 2001);

- юбилейной научно-практической конференции "Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы", посвященной 50-летию Ставропольского НИПЧИ (Ставрополь, 2002);

- юбилейной научно-практической конференции "Инфекционные болезни в регионах Северного Кавказа: эпидемиология, лабораторная диагностика, профилактика", посвященной 50-летию Дагестанской противочумной станции (Махачкала, 2002);

- VIII Российской научно-практической конференции "Холера и патогенные для человека вибрионы" (Ростов-на-Дону, 2003);

- научно-практических конференциях РосНИПЧИ "Микроб" "Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте "Микроб" (Саратов, 2001, 2002, 2004);

- Всероссийской научно-практической конференции "Медицинская микробиология - XXI век" (Саратов, 2004).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения; 2 глав обзора литературы; 5 глав собственных исследований, включающих описание материалов и методов исследований и экспериментальную часть; заключения; выводов; списка литературы, включающего 241 источник, из них зарубежных - 95. Объем диссертации

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Абрамова, Елена Геннадьевна

ВЫВОДЫ

2. Разработана биотехнологическая схема изготовления холерных 0139 флуоресцирующих иммуноглобулинов, включающая в себя следующие этапы: получение антигена, иммунизацию продуцентов-кроликов с целью получения сыворотки-полуфабриката; выделение из гипериммунной сыворотки серологически активной иммуноглобулиновой фракции; конъюгирование иммуноглобулиновой фракции с флуорохромом; адсорбцию конъюгата с целью удаления гетерологичных антител; контроль уровня специфической активности и специфичности конъюгата; стабилизацию свойств препарата.

3. Проведено сравнительное изучение антигенных свойств четырех препаратов корпускулярных и растворимых О-антигенов холерного вибриона 0139. Препаратом выбора явился О-антиген, выделенный способом ультрафильтрации на полых волокнах из безмикробного супернатанта штамма V. ско1егае 0139 МО-45. Отработана оптимальная схема гипериммунизации животных данным антигеном и определены условия выделения из сывороток иммуноглобулиновой фракции.

4. Диагностическая ценность сконструированного препарата подтверждена комиссионными испытаниями трех экспериментально-производственных серий препарата с использованием 42 штаммов V. ско1егае 0139 и 120 штаммов холерных вибрионов 01, 02 - 083 серогрупп и других микроорганизмов семейств УЛпопасеае, Ряеис1отопасеае и ЕШегоЬаМепасае, а также установлено рабочее разведение препарата, которое составляет 1:321:64 в зависимости от серии.

5. Показана возможность использования сконструированного препарата для детекции V. ско1егае 0139 в других тестах экспресс-анализа, включая реакцию слайд-агглютинации и непрямые варианты иммуноферментного и дот-иммуноанализа; изготовленные на основе препарата двойные ферментно-флуорохромные конъюгаты также позволяют выявлять холерные вибрионы "Бенгал" в прямых вариантах иммуноферментного и дот-иммуноанализа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ г

В последние десятилетия эпидемиологическая обстановка в мире по холере значительно осложнена в связи с появлением холерных вибрионов нового сероварианта 0139 ("Бенгал"), являющихся с 1992 г. причиной крупных эпидемий холеры в регионах Юго-Восточной Азии с завозами в отдаленные страны, в том числе и Россию (77, 95, 192, 199, 221).

С установлением роли V. ско1егае 0139 в развитии значительных эпидосложнений была пересмотрена позиция, что только холерные вибрионы 01 серогруппы могут вызывать эпидемии холеры. Появление нового этиологического агента эпидемической холеры поставило перед исследователями задачу его своевременной диагностики с целью проведения комплекса противоэпидемических мероприятий.

На сегодняшний день единственным в Российской Федерации лицензированным препаратом для детекции V. ско1егае 0139, внесенным в перечень препаратов для лабораторной диагностики холеры МУ 4.2.1097-02, является холерная 0139 кроличья адсорбированная сыворотка для РА на стекле.

Неблагоприятный прогноз по холере "Бенгал" в мире, в том числе странах СНГ, придает актуальность проблеме совершенствования лабораторной диагностики холеры, вызванной V. ско1егае 0139, путем конструирования новых препаратов для детекции данного патогена, в связи с чем и были определены цели и задачи настоящего исследования.

Цель работы состояла в конструировании нового диагностического препарата для детекции V. ско1егае 0139 методом флуоресцирующих антител и разработке биотехнологической схемы его изготовления.

Первый этап наших исследований заключался в определении способности к индукции специфических антител препаратов О-антигена V. ско1егае 0139, полученных различными способами, и отработке оптимальной схемы иммунизации продуцентов с целью получения высокоактивной холерной

0139 сыворотки, которая могла бы стать полуфабрикатом для изготовления флуоресцирующих иммуноглобулинов.

Выбор кроликов в качестве продуцентов сывороток обусловлен их более высокой по сравнению с другими видами животных иммунореактивностью (27, 94, 116). Экономическую целесообразность использования кроликов в качестве доноров определяют относительная простота их содержания и достаточный для мелкосерийного производства объем получаемой сыворотки - в среднем 40 мл сыворотки от каждого продуцента.

В качестве гипериммунизирующих препаратов были исследованы корпускулярные антигены, инактивированные кипячением при 100 °С в течение 2 ч, приготовленные на основе капсульного штамма V. ско1егае 0139 Р-16064 и бескапсульных вариантов этого штамма; растворимые О-антигены, экстрагированные по методу А. Вомп а/., а также способом ультрафильтрации на полых волокнах формалинизированного безмикробного супернатанта штамма V. ско1егае 0139 МО-45.

Иммунизация кроликов корпускулярным кипяченым антигеном, приготовленным на основе капсульного штамма V. ско1егае 0139 Р-16064, не позволила получить сыворотки с уровнем содержания специфических антител 1:400 и более, определяемого в объемной реакции агглютинации. Увеличение антигенной нагрузки, а также изменение схемы иммунизации не способствовали повышению активности гипериммунных сывороток. Полученные данные согласуются с мнением о том, что капсульный полисахарид бенгальских штаммов маскирует поверхностные антигенные структуры микроба, снижая уровень иммунологических реакций со стороны макроорганизма (118,133).

Поскольку отсутствие капсулы усиливает иммуногенные свойства антигена, применение корпускулярного антигена, приготовленного из бескапсульных вариантов штамма V. ско1егае 0139 Р-16064, способствовало повышению активности гипериммунных сывороток. Наиболее эффективной оказалась схема иммунизации, предусматривающая только внутривенное введение антигена, при которой были получены сыворотки, характеризовавшиеся уровнем содержания специфических антител (600 + 40) (указаны обратные титры антител в объемной РА). Показатель активности сывороток, полученных при использовании схемы с подкожным введением того же антигена, составил (333 + 67). Содержание гетерологичных антител в обоих случаях было на одном уровне: (580 ± 50) и (666 + 133) соответственно.

Наличие большого количества гетерологичных антител обусловлено, во-первых, значительной гомологией хромосом холерных вибрионов 0139 и 022 серогрупп (174, 239, 241). Во-вторых, введение корпускулярного антигена в организм продуцента вызывает антительный ответ, являющийся суммарным на весь комплекс термостабильных компонентов, в том числе и балластных, содержащихся в целой микробной клетке, что индуцирует выработку неспецифических антител (116). Кроме того, традиционное приготовление О-антигена путем длительного кипячения, видимо, приводит к частичному обнажению участков соматического антигена, содержащих группоспецифические антигенные детерминанты, на которые вырабатываются перекрестнореагирующие антитела (146).

Несмотря на то, что гипериммунные сыворотки кроликов, полученные при использовании корпускулярного антигена на основе бескапсульного варианта штамма V. cholerae Ol39 Р-16064, характеризовались достаточно высоким уровнем активности, они были малоэффективны в качестве полуфабриката для изготовления флуоресцирующих иммуноглобулинов из-за высоких титров гетерологичных антител к V. cholerae 022 серогруппы. При изготовлении высокоспецифичного препарата флуоресцирующих иммуноглобулинов из таких сывороток неизбежна процедура неоднократной адсорбции, что, помимо усложнения технологии, привело бы к снижению уровня специфической активности препарата. Чтобы сократить до минимума количество адсорбций на этом этапе биотехнологической схемы, для гипериммунизации животных был необходим препарат, содержащий наибольшее количество нативного типоспецифического компонента и минимальное - балластных примесей. В качестве таких препаратов были испытаны растворимые антигены.

При сравнении иммуногенной активности О-антигена, экстрагированного по Буавену и О-антигена, выделенного методом ультрафильтрации на полых волокнах, нами выявлены преимущества второго в стимуляции продукции специфических антител - соответственно (400 + 0) и (666 + 67) при применении в равных условиях. По-видимому, воздействие на О-антиген органическими растворителями (трихлоруксусной кислотой) вызывает глубокую деградацию О-антигена, денатурируя белковые компоненты, в значительной мере обусловливающие антигенность ЛПС (91).

О-антиген, выделенный методом ультрафильтрации из формалинизированного безмикробного супернатанта штамма V. cholerae 0139 МО-45, максимально сохраняет свою нативность, а, следовательно, обладает наибольшей антигенной активностью (29, 30, 31, 180).

Таким образом, препаратом выбора для гипериммунизации кроликов явился растворимый О-антиген, полученный способом ультрафильтрации на полых волокнах.

При иммунизации кроликов растворимым О-антигеном, полученным методом ультрафильтрации, использовали три различные схемы. Как и в случае иммунизации продуцентов корпускулярными антигенами, при использовании растворимых антигенов более эффективными оказались схемы, предусматривающие только внутривенное введение препарата. При таком способе иммунизации получены наиболее активные сыворотки - величина содержания специфических антител в них составила (800 + 0) и (743 + 164).

При использовании схемы, комбинирующей подкожное и внутривенное введение антигена, активность иммунных сывороток была несколько ниже -(666 + 67). Результаты сравнения активности и специфичности гипериммунных сывороток, полученных при использовании различных схем, позволили определить оптимальную схему гипериммунизации кроликов, которая состояла в трехкратном внутривенном введении антигена в количестве 2 — 4 - 8 мг с интервалом в 4 дня с проведением повторного цикла иммунизации через месяц. Такая схема позволила получить сыворотки с уровнем активности (743 + 164), характеризующиеся самым низким титром гетерологичных антител - (129 + 19).

Таким образом, полуфабрикатом для изготовления препарата флуоресцирующих иммуноглобулинов к V. ско1егае 0139 явились холерные 0139 сыворотки, полученные при гипериммунизации кроликов О-антигеном, выделенным способом ультрафильтрации.

Для получения флуоресцирующих конъюгатов использовали выделенную из цельной гипериммунной сыворотки иммуноглобулиновую фракцию, не содержащую иммунологически инертный, но высокореакционный альбумин. При выделении ^в-фракции различными методами (осаждение сульфатом аммония, фракционирование ПЭГ-6000 и каприловой кислотой) предпочтение было отдано первому способу, т.к. он обеспечивал наибольший выход специфически активного белка - (2,9 + 0,65), (1,6 + 0,49) и (1,0 + 0,25) мг/мл, соответственно. Иммуноглобулины, выделенные способом осаждения сульфатом аммония, характеризовались в НМФА достаточно высокой активностью - (333 + 34,6).

Далее, на основе выделенных иммуноглобулинов были изготовлены флуорохромные конъюгаты. Конъюгацию 2 % раствора иммуноглобулинов с ФИТЦ осуществляли по методу Маршалла (207) с нагрузкой красителя 2 и 3 мг на 100 мг белка. С целью удаления избытка красителя для получения очищенного конъюгата осуществляли гель-фильтрацию реакционной смеси на колонке с сефадексом С-50.

При люминесцентной микроскопии мазков, приготовленных из 18-20-часовых культур холерных вибрионов 0139, была выявлена высокая активность (1:64-1:128 и 1:128-1:256) всех серий изготовленных ФИТЦ-конъюгатов. Наиболее активные ФИТЦ-конъюгаты, обеспечивающие и более яркую флуоресценцию, были получены при нагрузке красителя, равной 3 мг/100 мг белка.

Вместе с тем, полученные конъюгаты в разведениях 1:8-1:16 положительно реагировали в реакции прямой иммунофлуоресценции с холерными вибрионами 022 и 01 серогрупп. С целью повышения специфичности конъюгата была проведена адсорбция меченых иммуноглобулинов. В качестве адсорбентов были использованы штаммы холерных вибрионов 01 и 022 серогруппы: V. сИо1егае 022 169-68 (30 мг на 1 мл иммуноглобулинов), V. ско1егае 01 М-41 Огава (15 мг/мл), V. ско1егаг 01 569В Инаба (15 мг/мл), инактивированные формалином (0,5 %).

В результате адсорбции нам удалось добиться повышения специфичности препарата, который обеспечивал иммунофлуоресценцию на три-четыре креста в разведении 1:32 - 1:64 со штаммами V. ско1егае 0139 при отсутствии перекрестных реакций с холерными вибрионами 01 и 022 серогрупп не только в рабочем, но и в начальных разведениях препарата.

Для сохранения функциональной активности препарата холерных 0139 флуоресцирующих иммуноглобулинов в процессе длительного хранения были использованы различные приемы стабилизации, включающие, помимо добавления консерванта, стерилизующую фильтрацию через нитроцеллюлозные фильтры фирмы "МППроге" с размером пор 0,22 мкм и лиофильное высушивание препарата с предварительным добавлением стабилизатора, состоящего из 2,5 % сахарозы и 0,75 % тиосульфата натрия (10, 11, 94). Перечисленные методы обеспечивали стабильность флуоресцирующих иммуноглобулинов в течение 2,5 лет (срок наблюдения).

Результаты собственных исследований, продемонстрировавших высокую специфичность и диагностическую значимость разработанного препарата, были подтверждены комиссионными испытаниями трех серий флуоресцирующих иммуноглобулинов, полученных в условиях экспериментального производства (Акт о проведении комиссионных испытаний иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих холерных 0139 адсорбированных кроличьих сухих от 02.02.04). Активность препарата определяли на 42 штаммах холерных вибрионов "Бенгал", в том числе 22 штаммах, выделенных от больных и вибриононосителей, и 20 штаммах - из объектов внешней среды. Все указанные штаммы холерных вибрионов "Бенгал", независимо от источника выделения, характеризовались свечением интенсивностью на 4+ и 3+ при разведении флуоресцирующих иммуноглобулинов 1:32 (серия 03) и 1: 64 (серии 02 и 05).

Специфичность препарата флуоресцирующих иммуноглобулинов была испытана на наборе из 120 штаммов, включающем холерные вибрионы различных серогрупп: 02-083 - 83 штамма, Ol - 16 штаммов классического и эльтор биоваров сероваров Инаба и Огава и 2 штамма в R-форме, а также представителей других родов семейства Vibrionaceae (Comamonas — 3, Aeromonas - 3, Plesiomonas shigelloides — 3), микроорганизмов семейства Pseudomonaceae (Pseudomonas — 3), семейства Enterobacteriacae (Yersinia enterocolitica — 2, Escherichia coli — 1, Shigella sonnei — 2, Salmonella typhimurium — 1, Salmonella paratyphi В— 1).

Результаты испытаний подтвердили высокую специфичность полученного препарата флуоресцирующих иммуноглобулинов - ни с одним из представителей вышеперечисленных микроорганизмов не зарегистрировано положительных реакций иммунофлуоресценции в рабочем разведении, установленном для каждой серии иммуноглобулинов.

Проведенные эксперименты по обнаружению холерных вибрионов 0139 в искусственно инфицированных образцах биологического материала (испражнения, рвотные массы) и объектов внешней среды (вода из р. Волга) продемонстрировали возможность применения разработанного препарата в схеме экспресс-анализа холеры "Бенгал", позволяющей обнаружить присутствие микробов в исследуемом материале в короткое время — за 1,5 — 2 часа, что имеет важное значение для определения объема проведения противоэпидемических мероприятий.

Таким образом, разработанная нами биотехнологическая схема изготовления холерных 0139 флуоресцирующих иммуноглобулинов включала в себя следующие этапы: получение антигена, гипериммунизацию кроликов-продуцентов с целью получения сыворотки-полуфабриката; выделение из гипериммунной сыворотки серологически активной иммуноглобулиновой фракции; конъюгирование иммуноглобулиновой фракции с флуорохромом; адсорбцию конъюгата с целью удаления гетерологичных антител; контроль уровня специфической активности и специфичности конъюгата; стабилизацию препарата флуоресцирующих антител.

В результате проведенных исследований впервые был получен новый диагностический препарат - "Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие холерные 0139 адсорбированные кроличьи сухие", который по своим параметрам - рН, растворимости, содержанию белка, молярному соотношению ФИТЦ/белок, потере в массе при высушивании, сроку годности, соответствует требованиям НД, предъявляемым к диагностическим флуоресцирующим иммуноглобулинам, выпускаемым РосНИПЧИ "Микроб" (ФСП №№ 42-0020-5926-04, 42-0020-5927-04, 42-00202422-02). Препарат в рабочем разведении 1:32 - 1:64 позволяет выявлять холерные вибрионы 0139 серогруппы в прямом МФА и не проявляет перекрестных реакций с другими микроорганизмами семейств У1Ъпопасеае, Рзеис1отопасеае, ЕЫегоЪаШпасае. Результаты комиссионных испытаний, подтвердивших диагностическую значимость сконструированного препарата, дают основания считать его перспективным для внедрения в практику, что будет способствовать повышению эффективности обнаружения холерных вибрионов "Бенгал". Кроме того, была продемонстрирована возможность применения разработанного препарата не только в МФА, но и в других методах экспресс-анализа - реакции слайд-агглютинации, непрямых вариантах ИФА и ДИА, в зависимости от оснащенности лабораторий. Изготовленные на основе препарата двойные ферментно-флуорохромные конъюгаты позволят с одинаковым успехом выявлять соответствующий бактериальный агент в прямых вариантах ИФА и ДИА.

Разработан проект нормативной документации, включающий экспериментально-производственный регламент "Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие холерные 0139 адсорбированные кроличьи сухие", фармакопейную статью предприятия, инструкцию по применению, одобренный Ученым Советом РосНИПЧИ "Микроб" (протокол № 5 от 25.06.04).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Абрамова, Елена Геннадьевна, Саратов

1. Адамов А.К., Щуркина И.И., Гончарова Н.С., Карасева З.Н. Изучение антигенов холерных, НАГ и нехолерных вибрионов // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1973. - Вып. 2 (30). - С. 148-156.

2. Адамов А.К., Наумшина М.С. Холерные вибрионы. Саратов, 1984. -328 с.

3. Адамов А.К. Иммунология холеры. Саратов, 1981. - 320 с.

4. Алексеева Л.П., Мазрухо Б.Л., Маркина О.В. и др. Получение диагностических флюоресцирующих моноклональных иммуноглобулинов к Vibrio cholerae 0139 серовара // Клиническая лабораторная диагностика.2002.-№ 12.-С. 50-51.

5. Алексеева Л.П., Сальникова О.И., Мазрухо Б.Л. и др. Моноклональные антитела к липополисахариду Vibrio cholerae 0139 // Биотехнология. 2002. -№ 2. - С. 79-84.

6. Алексеева Л.П., Чемисова О.С., Мазрухо Б.Л., Ишина Е.В. Антигенные свойства штаммов Vibrio cholerae 0139, выделенных из различных источников // Биотехнология. 2003. - № 3. - С. 90-95.

7. Аленкина Т.В. Усовершенствование лабораторной диагностики холеры с помощью антиэнтеротоксических моноклональных антител: Дисс.канд. мед. наук. Саратов, 1996. - 236 с.

8. Андреевская Н.М., Михайлова В.А., Каретникова Э.С. Влияние антиоксидантов на стабильность диагностических сывороток в процессе их хранения // Биотехнология. 1998. - № 4. - С. 68-71.

9. Антитела. Методы: Кн. 1 / Пер. с англ. Под ред. Д. Кетти. М.: Мир, 1991.-287 с.

10. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях//J1., Медгиз, 1962. 180 с.

11. Бернгоф Ф.Г. Специфические диагностические сыворотки и их применение в лабораторной практике // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1944. - № 12. - С. 62-64.

12. Бернет Ф. Клеточная иммунология / Пер. с англ. Меклера Л.Б. Под ред. Гурвича А.Е. М., "Мир", 1971.-542 с.

13. Благовещенский В.А., Кульберг А.Я. Флуорохромы и методы их соединения с белками иммунных сывороток / В кн.: Люминесцирующие антитела в микробиологии. М.: Медицина, 1962. - С. 25-38.

14. Бланков Б.И., Клебанов Д.Л. Применение лиофилизации в микробиологии. М.: Медгиз, 1961. - 263 с.

15. Богоявленская Л.Б. Стандартизация диагностических реагентов на модели 0-сальмонеллезных сывороток: Автореф. дисс. . докт. мед. наук. М., 1973. -23 с.

16. Бондаренко В.М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунол. -1999. -№ 5. С. 34-39.

17. Брумберг Е.М. Флуоресцентный микроскоп // Природа. 1940. - № 3. -С. 18-35.

18. Веренков М.С. Флюоресцирующие антитела для идентификации возбудителя чумы: Дисс.канд. мед. наук. Саратов, 1970. - 201 с.

19. Водопьянов С.О., Мишанькин М.Б., Олейников И.П. и др. Разработка способа выявления гена tep А холерного вибриона биотипа эльтор и сероварианта 0139 Бенгал с помощью полимеразной цепной реакции // Биотехнология. 1999. - № 6. - С. 19-23.

20. Воробьев A.A. Современные направления в разработке новых иммунологических препаратов // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунол. -1999.-№5.-С. 16-21.

21. Ганин B.C., Марамович A.C. Клинико-эпидемиологическая связь заболеваний, вызванных вибрионами Ol и не Ol групп (обзор) // Журнал инфекц. патологии. 1998. - Т. 5. - № 1. - С. 3-8.

22. Гольдин Р.Б., Белецкая Л.В., Крюкова И.Н. и др. Иммунолюминесценция в медицине. М.: Медицина, 1977. - 240 с.

23. Громова О.В., Джапаридзе М.Н., Дятлов И.А. и др. Получение и изучение

24. Громова О.В., Джапаридзе М.Н., Дятлов И.А. и др. Новый способ получения О-антигена холерного очищенного с целью создания холерных диагностических сывороток // Биотехнология. 2002. - № 2. - С. 42-46.

25. Давыдова H.A., Жилченко Е.Б., Брюханов А.Ф., Куличенко А.Н. ПЦР-анализ с магноиммуносорбционной подготовкой проб для детекции возбудителя холеры в воде // Проблемы особо опасных инфекций. — Саратов, 2000. Вып. 80. - С. 143-147.

26. Девдариани 3.JL, Аленкина Т.В., Федорова В.А. Экспресс-диагностика токсигенных штаммов Vibrio cholerae в ДОТ-иммуноанализе с помощью моноклональных антител // Клиническая лабораторная диагностика. 1999. -№8. -С. 24-34.

27. Денисова Е.П. Опыт применения блокированных антигенов в производствехолерных агглютинирующих сывороток. Проблемы особо опасных инфекций. - Саратов, 1973. - Вып. 4. - С. 86-87.

28. Дертева И.И., Веренков М.С., Щуркина И.И., Табаков П.К. Принципы приготовления специфических препаратов люминесцирующих холерных антител // Проблемы особо опасных инфекций. — Саратов, 1969. Вып. 3 (7). -С. 100-103.

29. Дертева И.И. Агглютинационные титры сывороток кроликов при различных схемах иммунизации холерным О-антигеном // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1969. - Вып. 4. - С. 120-124.

30. Дертева И.И., Веренков М.С. Активность люминесцирующих холерных антител, приготовленных из различных белковых фракций иммунных лошадиных сывороток // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1970. -Вып. 5.-С. 128-132.

31. Дертева И.И., Попов A.A., Трифонова A.A. и др. Пути повышения активности и специфичности агглютинирующей холерной О-сыворотки // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1972. — Вып. 3. - С. 181-188.

32. Дертева И.И., Джапаридзе М.Н., Попов A.A. и др. Антигенность корпускулярного и растворимых антигенов холерного вибриона / В кн.: Иммунология и иммунопрофилактика чумы и холеры. Саратов, 1980. - С. 170-172.

33. Дуванова О.В., Шиманюк Н.Я., Мишанькин Б.Н. Способность расщеплять твин-20 как дифференциальный тест для вибрионов 0139 серовара различного происхождения // Клин. лаб. диагностика. 2000. - № 5. - С. 44-46.

34. Джапаридзе М.Н., Наумов A.B., Никитина Г.П. и др. Оральная химическая вакцина из гипертоксигенных штаммов КМ-76 Инаба и КМ-68 Огава возбудителя холеры // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунол. — 1991. № 4.-С. 31-33.

35. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высш. шк. - 1991. - 288 с.

36. Ефременко В.И., Тюменцева И.С., Афанасьев E.H. и др. Новые препаратыдля экспресс-диагностики опасных инфекционных заболеваний и их применение в чрезвычайных ситуациях // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунол. 2001. - № 6, прил. - С. 55-58.

37. Ерошенко Г.А., Осин A.B., Челдышова Н.Б. и др. Генетические особенности авирулентных и вирулентных штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы, выделенных на территории России // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 2001. - Вып. 1 (81). - С. 69-75.

38. Жилченко Е.Б. Выявление эпидемически значимых холерных вибрионов с использованием афинных магносорбентов: Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Ставрополь, 2001. - 22 с.

39. Здоровенко E.JL, Позур В.К., Кучеренко М.Е. Биологическая активность липополисахаридов грамотрицательных бактерий. Бюлопчна актившеть лшополюахарщцв грамнегативних бактерш // Биополимеры и клетка. — 2000. -Вып. 16.-№ 1.-С. 5-15.

40. Иммунологические методы / Пер. с нем. под ред. Г. Фримеля. М.: Мир, 1979.-518 с.

41. Иммунологические методы / Пер. с англ. под ред. Г. Фримеля. М.: Медицина, 1987. - 472 с.

42. Екатеринбург). Екатеринбург, 1999. - С. 74-75.

43. Калинин Ю.Т., Злобин В.Н., Храмов E.H. и др. Проблемы биологической безопасности на пороге XXI века // Вестник Рос. АМН. 1999. - № 8. - С. 3-8.

44. Карагозова A.B., Сальникова О.И. Экспрессия патогенных свойств холерных вибрионов 0139 серогруппы in vitro II Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунол. 2000. - № 3. - С. 7-10.

45. Карпов С.П., Прегер С.М., Синельников Г.Е. и др. Гипериммунные сыворотки. Томск: Издательство Томского университета, 1976. - 377 с.

46. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. I. Общая характеристика липополисахаридов и структура липида А (обзор) // Биохимия. 1993. - Т. 58. - Вып. 2. - С. 166-181.

47. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. II. Структура кора (обзор) // Биохимия. 1993. -Т. 58.-Вып. 2.- С. 182-201.

48. Колиснык A.B. Иммуноглобулиновый спектр и серологическая активность специфических антител к некоторым антигенам холерного вибриона: Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Саратов, 1981.-21 с.

49. Леви М.И. Общие закономерности и классификация серологических реакций // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунол. — 1967. № 7. - С. 104109.

50. Лобанов В.В., Марченков В.И. Современное состояние проблемы изменчивости Vibrio cholerae II Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунол.1999.- №4. -С. 103-106.

51. Лобанов В.В., Мазрухо Б.Л., Сухарь В.В. и др. Изменчивость холерных вибрионов 0139 серогруппы // Холера и патогенные для человека вибрионы. Матер, межвед. науч. совета по сан.-эпид. охране террит. РФ. — Ростов-н/Д, 2000.-Вып. 13.-С. 68-69.

52. Лобанов В.В., Сухарь В.В. Особенности липополисахарида Vibrio cholerae II Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунол. 2002. - № 2. - С. 102-107.

53. Лобанов В.В., Сухарь, Мазрухо Б.Л. Исследование Vibrio cholerae 0139 вреакциях вибриолиза и агглютинации // Холера. Матер. VIII Росс, науч.-практ.конф. по проблеме "Холера" (4-5 июня 2003 г., Ростов-н/Д). Ростов-н/Д,2003.-С. 181-183.

54. Лобанова Л.Н., Сомова А.Г., Смоликова Л.М. и др. Факторы вирулентности холерных вибрионов // Проблемы особо опасных инфекций. -Саратов, 1994. № 6 (76). - С. 136-143.

55. Ломов Ю.М., Онищенко Г.Г., Москвитина Э.А. и др. Эпидемиологическая обстановка по холере в 90-е годы в мире, странах СНГ и России // Эпидемиология и инфекц. бол. 1999. - № 3. — С. 17-21.

56. Ломов Ю.М., Мишанькин Б.Н., Москвитина Э.А. и др. Роль холерных вибрионов не 01 в этиологии септицемий // Холера и патогенные для человека вибрионы. Матер, межвед. науч. совета по сан.-эпид. охране террит. РФ. — Ростов-н/Д, 2001. Вып. 14. - С. 78-79.

57. Лузина Е.В., Гамимид В.К., Богоявленская Л.Б. Принципы получения специфических сывороток для идентификации энтеробактерий без адсорбции / в сб.: "Стандарты, штаммы и методы контроля бактерийных и вирусных препаратов". -М., 1978.-С. 161-170.

58. Мазрухо Б.Л., Ишина Е.В. Серодиагностика холеры, обусловленной вибрионами "Бенгал": препараты для идентификации // Гомеостаз и инфекц. процесс. Матер. Второй Всерос. конф. 1998. - С. 45.

59. Майборода Г.М. Электронная и люминесцентная микроскопия реакции антиген-антитело // Материалы I Всеросс. съезда врачей, эпидемиологов, микробиологов, инфекционистов. М., 1961. - С. 91.

60. Марамович А.С., Ганин B.C., Урбанович Л.Я., Погорелов В.И. Актуальные вопросы эпидемиологического надзора за холерой // Эпидемиол. и инфекц. бол. 1999. - № 5. - С. 54-57.

61. Марамович А.С., Погорелов В.И., Урбанович Л.Я. и др. Генез эпидемиtческих вспышек холеры // Материалы VIII съезда Всеросс. об-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., 2002. - Т. 1. - С. 74.

62. Мейсель М.Н. Флуоресцентная микроскопия и ее применение в микробиологии // Микробиология. 1947. - Т. XVI. - Вып. 6. - С. 527-544.

63. Меньшикова Е.А., Подосинникова Л.С. Изучение гемолитической активности штаммов Vibrio cholerae 01 и 0139 серогрупп // Проблемы особо опасных инфекций.-2001. Вып. 1 (81).-С. 85-89.

64. Месробяну И., Берчану Шт. Иммунобиология. Иммунохимия. Иммунопатология. — Изд-во Академии Соц. респ. Румынии. 1977. - 521 с.

65. Михайлов И.Ф. О критериях специфического свечения бактерий, окрашенных флуоресцирующими антителами // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1963. - № 7. - С. 94-97.

66. Михайлова В.А. Разработка технологии получения кроличьей холерной агглютинирующей О-сыворотки: Автореф. дисс. . канд. биол. наук. -Иркутск, 1998.-20 с.

67. Москвитина Э.А., Ломов Ю.М., Беспалов И.А. Холера Бенгал // Холера. Матер. VIII Росс, науч.-практ. конф. по проблеме "Холера" (4-5 июня 2003 г., Ростов-н/Д). Ростов-н/Д, 2003. - С. 31-34.

68. Мулик А.Б. Критерии стандартизации животных и оптимизация величины антигенного раздражения при производстве различных иммунобиологических препаратов для диагностики некоторых особо опасных инфекций: Дисс. канд. биол. наук. Волгоград, 1992. - 127 с.

69. Онищенко Г.Г., Черепов В.М. Эпидемиологическая ситуация по холере и чуме на территории Сибири // Эпидемиол. и инфекц. бол. 2000. - № 2. -С. 7-11.

70. Онищенко Г.Г., Шестопалов Н.В., Монисов A.A. Работа Госсанэпид-службы России по профилактике наиболее распространенных заболеваний в 1996-1997 г.г. // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунол. — 1999. № 3. -С. 31-37.

71. Осин A.B., Ерошенко Г.А., Коннов Н.П. и др. Фенотипический и генетический анализ штаммов Vibrio cholerae 0139 серогруппы, выделенных из внешней среды // Проблемы особо опасных инфекций. — Саратов, 2000. -Вып. 80.-С. 93-101.

72. Пастер Е.У., Овод В.В., Позур В.К. и др. Иммунология: практикум. -Киев: Выща школа, издательство при Киевском ун-те, 1989. — 304 с.

73. Петрухин В.Г., Белая Ю.А., Иванов К.К. Получение очищенных препаратов индивидуальных К- и О-антигенов шигелл Ньюкасл сиспользованием метода центрифугирования // Журнал микробиол., эпидемиол.и иммунол. 1975. - № 5. - С. 78-82.

74. Пинчук JI.М. Методы выделения и характеристика сальмонеллезных Н-антигенов // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1971. - № 7. — С. -26-29.

75. Покровский В.И. Инфекционные болезни в России: оценка ситуации // Рус. мед. журн. 2000. - Т. 8, № 17. - С. 666-667.

76. Руководство по вакцинному и сывороточному делу / Под ред. Н.И. Власьевского, В.А. Любарского, Л.М. Хатеневера. М.- Л.: Гос. издательство биол. и мед литературы, 1934. - 617 с.

77. Руководство по вакцинному и сывороточному делу / Под ред. П.Н. Бургасова. М.: Медицина, 1978. — 439 с.

78. Савельев В.Н., Ефременко В.И., Савельева И.В. и др. Состояние и перспектива серологической диагностики холеры // Холера. Матер. VIII Росс, науч.-практ. конф. по проблеме "Холера" (4-5 июня 2003 г., Ростов-н/Д). — Ростов-н/Д, 2003.-С. 193-195.

79. Смирнов В.В., Чаплинский В.Я., Андреева З.М. и др. Научные основы производства диагностических препаратов. Киев: Наукова думка, 1980. -195 с.

80. Смирнова Н.И. Основные факторы патогенности холерных вибрионов и их генетический контроль // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунол. -1987.- №7.-С. 102-108.

81. Смирнова Н.И. Возбудитель холеры новой 0139 серогруппы: молекулярно-генетические особенности и происхождение // Молекул, генет., микробиол. и вирусол. 2002. - № 3. - С. 23-33.

82. Смирнова Н.И., Ливанова Л.Ф., Чеховская Г.В. и др. Штаммы V. cholerae серогрупп Ol и 0139 продуценты основных протективных антигенов // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунол. - 2000. - № 3. - С. 47-51.

83. Сомова А.Г., Эмдина И.А., Смоликова Л.М. и др. Основные факторы патогенности Vibrio cholerae II Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунол. -1985.-№5.-С. 104-109.

84. Станиславский Е.С., Едвабная Л.С., Мешалова А.Н. и др. Молекулярно-весовая гетерогенность изолированных антигенных комплексов и их иммунохимическая активность // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1975.- №5. -С. 89-94.

85. Сухарь В.В., Лобанов В.В., Ишина Е.В. К вопросу капсулообразования у Vibrio cholerae 0139 II Холера и патогенные для человека вибрионы. Матер.межвед. науч. совета по сан.-эпид. охране террит. РФ. Ростов-н/Д, 2001. -Вып. 14.- С. 47-48.

86. Федоров Ю.М., Кокушкин А.М., Омариева Э.Я. и др. Особенности эпидемиологии холеры на современном этапе седьмой пандемии // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 2000 - Вып. 80. - С. 35-39.

87. Федорова В.А., Громова О.В., Девдариани 3.JI. и др. Иммунохимическая характеристика липополисахарида Vibrio cholerae 0139 сероварианта и диагностическая значимость полученных к нему антител // Биотехнология. -1996.-№ 11.-С. 33-37.

88. Федорова В.А., Громова О.В., Девдариани 3.JI. Иммуноферментная тест-система для детекции Vibrio cholerae 0139 II Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1998. - № 5. - С. 77-80.

89. Федорова В.А., Пуденкова О.С., Громова О.В., Девдариани 3.JT. Эпитопный анализ липополисахарида Vibrio cholerae 0139 II Сборник научных трудов, поев. 50-летию Дагестанской противочумной станции. -Махачкала, 2002. С. 99-101.

90. Чеховская Г.В. Генетический анализ хромосомной области Vibrio cholerae 0139, содержащей гены О-антигена: Дисс. . канд. мед. наук. -Саратов, 1996. 136 с.

91. Чибрикова Е.В., Щуркина И.И., Табаков П.К. и др. Возможность использования специфических флуоресцирующих антител для быстрого обнаружения холерных вибрионов в воде // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1962. - № 3. - С. 9-14.

92. Шаханина К.Л. Люминесцирующие сыворотки и биохимические методы их контроля / В кн.: Метод иммунофлюоресценции в диагностике инфекционных заболеваний. М., 1969. - С. 18-21.

93. Шиманюк Н.Я., Шишияну М.В., Дуванова О.В., Мишанькин Б.Н.

94. Уреазная активность V. cholerae 0139 "Бенгал" // Холера и патогенные для человека вибрионы. Матер, межвед. науч. совета по сан.-эпид. охране террит. РФ. Ростов-н/Д, 1999. - Вып. 12. - С. 75-76.

95. Шобухова Т.С. Метод оксидативного расщепления специфических Сахаров при изучении О-монорецепторных корпускулярных антигенов из сальмонелл // Лаб. дело. 1970. - № 4. - С. 211-214.

96. Щуркина И.И. Применение иммунофлуоресцентного метода для обнаружения холерных вибрионов в искусственно зараженных объектах: Дисс. . канд. мед. наук. Саратов. - 1967. - 226 с.

97. Щуркина И.И. Усовершенствование серологической идентификации энтеропатогенных вибрионов: Дисс. . докт. мед. наук. Саратов, 1981.-381 с.

98. Щуркина И.И., Адамов А.К., Лукьянова О.И., Казакова Е.С. Антигенная структура холерного вибриона не Ol группы МО-45 0139 серовара // Деп. в ВИНИТИ 19.07.95 г. № 2220::В 95, 1995.

99. Яровая Л.М., Алешкин В.А. Новые данные о химической структуре липополисахаридов и практические перспективы // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1991. - № 3. - С. 73-78.

100. Albert М. Vibrio cholerae 0139 Bengal И J. Clin. Microbiol. 1994. - V. 32. - P. 2345-2349.

101. Albert M. Epidemiology & molekular biology of Vibrio cholerae Ol39 Bengal//Indian J. Med. Res. 1996.-V. 104.-P. 14-27.

102. Albert M., Bhuiyan N.A., Talukder K.A. et al. Phenotypic and genotypic changes in Vibrio cholerae 0139 Bengal // J. Clin. Microbiol. 1997. - V. 35, № 10.-P. 2588-2592.

103. Ansaruzzaman M., Shimada T., Bhuiyan N.A. et al. Cross-reaction between a strain of Vibrio mimicus and V. cholerae 0139 Bengal II J. Med. Microbiol. 1999.- V. 48, №9.-P. 873-877.

104. Attridge S.R., Voss E., Manning P.A. Pathogenic and vaccine significance of toxin-coregulated pili of Vibrio cholerae El Tor I I J. Biotechnol. 1999. - V. 73, №2-3.-P. 109-117.

105. Attridge S.R., Fazeli A., Manning P.A. et al. Isolation and characterization of bacteriophage-resistant mutant of V. cholerae 0139 // Microb. Pathog. 2001. -V. 30, №4.-P. 237-246.

106. Bag P.K, Maiti S., Sharma C. et al. Rapid spread of the new clone of Vibrio cholerae Ol biotype El Tor in cholera endemic areas in India // Epidemiol. Infect. — 1998. V.121, № 2. -P. 245-251.

107. Basu A., Gard P., Chakraborty S., Bhattacharya S.K. et al. Vibrio cholerae 0139 in Calcutta, 1992-1998: Incidence, Antibiograms, and Genotypes // Emerg. Infect. Dis. 2000. - V. 6, № 2. - P. 139-147.

108. Beltran P., Delgado G., Navarro A. et al. Genetic diversity and population structure of Vibrio cholerae II J. Clin. Microbiol. 1999. - V. 37, № 3. - P. 581590.

109. Bergquest N.R., Schilling W.G. Preparation of antihuman immunoglobulin for indirect fluorescent tracing of antibodies // Standartisation in immunofluorescence. Oxford, 1970.— P. 19-65.

110. Bik E.M., Bunschoten A.E., Gouw R.D., Mool F.R. Genesis of the novel epidemic Vibrio cholerae 0139 strain: evidence for horizontal transfer of genes involved in polysaccharide synthesis // The EMBO Journal. 1995. - V. 14. - P. 209-216.

111. Bik E.M., Gouw R.D., Mool F.R. DNA fingerprinting of Vibrio cholerae ^ strains with a novel insertion sequence element: a tool to identify epidemic strains //

112. J. Clin. Microbiol. 1996.-V. 34,№6.-P. 1453-1461.

113. Boivin A., Mesrobeany L., Mesrobeany F. Extraction d'un complexe toxicue et antigenigue a partir du bacille d'Aertrycre // C.R. Soc.Biol. 1933. - V. 114.-P. 307-310.

114. Calia K.E., Muratagh M., Ferraro M.J., Calderwood S.B. Comparison of Vibrio cholerae 0139 with V. cholerae Ol classical and El Tor biotypes // Infect. Immun. 1994. - V. 62. - P. 1504-1506.

115. Calia K.E., Waldor M.K., Calderwood S.B. Use of representational difference analysis to identify genomic differences between pathogenic strains of Vibrio cholerae II Infect. Immun. 1998. - V. 66, № 2. - P. 849-852.

116. Castellani A. Die Agglutination bei gemischter Infection und die Diagnose der letzteren // Z. Hyg., 1902. -V. 40.- P. 1-21.

117. Chaicumpa W., Srimanote P., Sakolvaree Y. et al. Rapid diagnosis of cholera caused by Vibrio cholerae 0139 // J. Clin. Microbiol. 1998. - V. 36, № 12.r1. P. 3595-3600.

118. Colwell R., Hug A., Russek-Cohen E. et al. Global climate and human health: V. cholerae as the paradigm // Thirty-third Joint Conference on Cholera and4k Related Diarrheal Diseases: Abstracts. Clearwater Beach, Florida, Dec. 3-5, 1997.-P. 161.

119. Comstock L.E., Maneval D., Panigrahi P. The capsule and O-antigen inf

120. Vibrio cholerae 0139 Bengal are associated with a genetic region not present in Vibrio cholerae 01 // Infect. Immun. 1995. - V. 63. - P. 317-323.

121. Coons A.H., Creech H.I., Jones R.N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group // Proc. Soc. exp. Biol, and Med., 1941. -V. 47. P. 200-202.

122. Coons A.H., Creech H.I., Jones R.N. et al. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. — J. Immunol. 1942. - V. 45, № 1-3. - P. 159-170.

123. Coons A.H., Kaplan M.H. Localization of antigen in tissues cells. II. Improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody // J. Exp. Med. 1950. - V. 91, № 1. - P. 1 -13.

124. Curling J.M. Methods of plasma protein fractionation // Academic Press, * New York.- 1980.-13 p.

125. Curtain C.C. The chromatographic purification of fluorescein antibody. -J. Histochem. and Cytochem. 1961. - V. 9, № 5. - P. 484-486.

126. Dalsgaard A., Skov M.N., Serichantalergs O. et al. Comparison of pulsed-field gel electrophoresis and ribotyping for subtyping of Vibrio cholerae 0139 isolated in Thailand//Epidemiol. Infect. 1996.-V. 17, № l.-P. 51-58.

127. Dumontier S., Berche P. Vibrio cholerae 022 might be a putative source of V exoqenous DNA resulting in the emergence of the new strain of Vibrio cholerae0139//FEMS Microbiol. Lett.- 1998.-V. 164,№ p. 91-98.

128. Dumontier S., Trieu-Cuot P., Berche P. Structural and functional characterization of IS 1358 from Vibrio cholerae II J. Bacteriol. 1998. - V. 180, №23.-P. 6101-6106.

129. Ehara M., Iwami M., Ichinose Y. et al. Induction of fimbriated Vibrio cholerae 0139 // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998. - V. 5, № 1. - P. 65-69.

130. Ewald P.W., Sussman J.B., Distler M.T. et al. Evolutionary control of ^ infections disease: prospects for vectorborne and waterborne pathogens // Mem.1.st. Oswaldo Cruz. 1998. - V. 93, № 5. - P. 567-576.

131. Faruque S.M., Albert M.J., Mekalanos J.J. Epidemiology, genetics, and ecology of toxigenic Vibrio cholerae II Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - V. 62, № 4.- P. 1301-1314.

132. Feodorova V.A., Gromova O.V., Devdariani Z.L. et al. Immunochemical characterization of Vibrio cholerae 0139 O antigens and production of a diagnostic antiserum without absorption // J. Med. Microbiol. 2001. - V. 50. - P. 499-508.

133. Flodin P., Killinder S. Fractionation of human-serum proteins by gelfiltration // Biochim. et biophys. acta. 1962. - V. 63. - Suppl. 3. - P. 403-410.

134. Formosan J. Rapid detection of V. cholerae by fluorescent antibody technique II Med. Ass. 1965. - V. 64, № 6. - P. 313-317.

135. Fothergill J.E., Nairn R.C. Purification of fluorescent conjugates: comparison of charcoal and sephadex. Nature. - 1961. - V. 192, № 4807. - P. 1073-1074.

136. Gunawardena S., Fiore C.R., Johnson J.A. et al. Conformation of a rigid tetrasaccharide epitope in the capsular polysaccharide of Vibrio cholerae 0139 // Biochemistry. 1999. - V. 38, № 37. p. 12062-12071.

137. Gutfreund H., Ogston A. C. Physical properties of bovine serum after heating with formaldehyde // Biochem. J. 1945. - V. 39. - Suppl. 2. - P. 186-188.

138. Hisatsune K., Kondo S., Isshiki Y. et al. O-antigenic lipopolysaccaride of Vibrio cholerae 0139 Bengal, a new epidemic strain for recept cholera in the India subcontinent // Biochem. Biophys. Res. Com. 1993. - V. 196. - P. 1306-1315.

139. Horejsi T., Smetana R. The isolation of gammaglobulin from blood-serum by rivanol II Acta med scand. 1956. - V. 155. - Suppl. 1. - P. 65-69.

140. Ingole K.V., Jalgaonkar S.V., Fule C. et al. Changing pattern of Vibriotcholerae serotype El Tor and 0139 in Yavatmal (Maharashtra, India) during 1992 to 1994 // Indian J. Pathol. Microbiol. 1997. - V. 40, № 3. - P. 369-371.

141. Jouravleva E.A., Mc Donald G.A., Marsh J.W. et al. The Vibrio cholerae mannose-sensitive hemagglutinin is the receptor for a filamentous bacteriophage from V. cholerae 0139 // Infect. Immun. 1998. - V. 66, № 6. - P. 2535-2539.

142. Kaper J.B., Morris J.G., Levine M.M. Cholera // J. Clin. Microbiol. Rev. -1995.-V. 8.-P. 48-86.

143. Karaolis ,D.K., Johnson J.A., Bailey C.C. et al. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains // Proc. Natl, acad. Sci. USA. 1998. - V. 95, № 6. - P. 3134-3139.

144. Karaolis D.K., Kaper J.B. Vibrio cholerae TCP a Afunctional virulence factor? Response // Trends. Microbiol. 1999. - V. 7, № 10. - P. 393.

145. Kaur H., Lai M. Reappearance of Vibrio cholerae 0139 during MarchAugust, 1998 in Ludhiana (Punjab), India// Indian J. Med. Res. 1999. - V. 109. -P. 3-4.

146. Ketyi I. Progress in the research of virulence factors of enteric pathogens offering new perspectives in the specific prevention // Ann. Immunol. Hung. — 1986. V. 26, № 1.-P. 25-46.

147. Killander J., Ponten J., Roden L. Rapid preparation of fluorescent antibodies using gel-filtration.-Nature.-1961.-V. 192, № 4798.-P. 182-183.

148. Kirn T.J., Lafferty M.J., Sandoe C.M., Taylor R.K. Delineation of pilin domains required for bacterial association into microcolonies and intestinal colonization by Vibrio cholerae // Mol. Microbiol.- 2000. V. 35, № 4. - P. 896

149. Khan A., Malik T., Fisher-Hoch S.P. Cholera in a developing megacity; Karachi, Pakistan // Epidemiol. Infect. 1997. - V. 119, № 3. - P. 287-292.

150. Knirel Y.A., Paredes L., Jansson P.E. et al. Structure of the capsular polisaccaride of Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal containing D-galactose 4,6-cyclophosphate // Eur. J. Biochem. 1995. - V. 232. - P. 391-396.

151. Kohler G., Milstein C. Continious cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity // Nature. 1975. - V. 256. - P. 495.

152. Lee S.N., Lai S.T., Lai J.Y., Leung N.K. Resurgence of cholera in Hong Kong // Epidemiol. Infect. 1996. - V. 117 (1). - P. 43-49.

153. Lewi S. Apparation d'une properite anti-agglutinante spesifique dans certains serums agglutinants traites par le formol // C. r. Soc. biol. 1952. — V. 146. -P. 1706-1708.

154. Mahajan R., Goel M., Mathur M. et al. Characterization of Vibrio cholerae 0139 isolated from diarrhoeal stools // Indian J. Pathol. Microbiol. 1996. - V. 39, №2.-P. 121-125.

155. Mahon B.E., Mintz E.D., Greene K.D. et al. Reported cholera in the United States, 1992-1994: a reflection of global changes in cholera epidemiology // JAMA.-1996. V. 276 (4). - P. 307-312.

156. Marshall J.D., Eveland W.C., Smith C.W. Superiority of fluorescein isothiocyanate (Riggs) for fluorescent-antibody technic with a modification of its application // Proc. Soc. exp. Biol, and Ved. 1958. - V. 98, № 4. - P. 898-900.

157. Mukhopadhyaya A.K., Basu A., Gard P. et al. Molecular epidemiology of reemergent Vibrio cholerae 0139 Bengal in India // J. Clin. Microbiol. 1998. - V. 36, № 7. - P. 2149-2152.

158. Nakane P.K., Kawaio A. Peroxidase-labelled antibody. A new method of conjugated // J. Histochem. Cytochem. 1974. - V. 22, № 12. - P. 1084-1091.

159. Pal A., Saha P.K., Nair G.B. et al. Clonal analysis of non-toxigenic Vibrio cholerae 01 associated with an outbreak of cholera // Indian J. Med. Res. 1999. — V. 109.-P. 208-211.

160. Pal S., Datta A., Nair G.B. et al. Use of monoclonal antibodies to identify phospholipase C as the enterotoxic factor of bifiinctional hemolysinphocpholipase C molecule of Vibrio cholerae 0139 // Infect. Immun. 1998. - V. 66, № 8. -P. 3974-3977.

161. Patel M., Isaacson M. The effect of iron on the toxigenicity of Vibrio cholerae //Amer. J. Trop. Med. Hug. 1999. - V. 60, № 3. - P. 392-396.

162. Pillot J. Spécificité et fidélité des reactions d 1 immunofluorescence // Bull. Inst. Pasteur. 1972. - V. 70, № 4. - P. 353-374.

163. Raut S., Jalgaonkar S.V., Tankhiwale N.S. et al. Reemergence of Vibrio cholerae 0139 serogroup during 1998 in Nagpur (Maharashtra), India // Indian J. Med. Res. 1999. - V. 109. - P. 1 -2.

164. Riggs I.L., Seiwald H.I., Burckaster I.H. et al. Isothiocyanate compounds as fluorescent labelling agents for immune serum // Amer. J. Pathol. 1958. - V. 34, №6.-P. 1081-1097.

165. Sack R.B., Barua D. The fluorescent antibody technique in the diagnosis of cholera // J. Ind. Med. Res. 1964. - V. 52, № 8^ - P. 848-854.

166. Sechi L.A., Dupre I., Deriu A. et al. Distribution of Vibrio cholerae virulence genes among different Vibrio species isolated in Sardinia, Italy // J. Appl. Microbiol. 2000. - V. 88, № 3. p. 475-481.

167. Siddique A.K., Akram K., Zaman K. et al. Vibrio cholerae Ol39: how greattis the threat of a pandemic? // Trop. Med. Int. Health. 1996. - V. 1, № 3. - P. 393398.

168. Singh J., Bora D., Khanna K.K. et al. Epidemiology and transmission of V. cholerae 01 and V. cholerae 0139 infections in Delhi in 1993 // J. Diarrhoeal. Dis. Res. 1996. -V. 14, №3.-P. 182-186.

169. Shinoda S. Protein toxins produced by pathogenic vibrios // J. Nat. Toxins. — 1999.-V. 8, № 2.-P. 259-269.

170. Staub A.M., Tinelli R. Etude immunochemique sur les Salmonelles. 4. Structure chimique de certains motifs antigeniques presents dans les "antigenes" 09 et 12 du tableau de White-Kauffmann. Bull. Soc. chim. biol. - 1957. - V. 39, Suppl. l.-P. 65-83.

171. Staub A.M. Bases chimiques de la specifite immunologique des antigenes des salmonella. Ann. Inst. Pasteur. - 1960. - V. 98, Suppl. 6. - P. 814-828.

172. Staub A.M. The role of the polysaccharide moiety in determining the specificity and immunological activity of the O-antigen complex of Salmonella / In: Bacterial endotoxins. New Brunswic: Rutguers Inst. Microbiol. 1964. — P. 38-48.

173. Staub A.M., Westphal O. Etudes chimique et biochimique de la spécificité immunologique des polyosides bacteriens // Bull. Soc. chim. biol. 1964. - V. 46, Suppl. 12.-P. 1647-1684.

174. Steinbuch M., Andran R. The isolation of TyG from mammalin sera with the aid of caprille acid // Arch. Biochem. Biophys., 1969. № 134. - P. 279-284.

175. Svehag S.E., Mandel B. The formation and properties of poliovirus-neutralising antibody. I. 19S and 7S antibody formation: differences in kinetics and antigen dose requirement // J. Exp. Med., 1964. V. 119, № 1. - P. 1-19.

176. Swerdiow D.L., Ries A. Vibrio cholerae non-01 the eighth pandemic? // Lancet. - 1993. - V. 342, № 8868. - P. 382-383.

177. Tacket C.O., Taylor R.K., Losonsky G. et al. Investigation of the roles of TCP and MSHA pili in the pathogenesis of V. cholerae Ol39 infection // Thirtythird Joint Conference on Cholera and Related Diarrheal Diseases: Abstracts. t

178. Clearwater Beach, Florida, Dec. 3-5, 1997. P. 22-25.

179. Tacket C.O., Taylor R.K., Losonsky G. et al. Investigation of the roles of toxin-corregulated pili and mannosesensetive hemagglutinin pili in the pathogenesis of Vibrio cholerae 0139 infection // J. Bacteriol. 1998.-V. 66, № 2. - P. 692-695.

180. Tanabe K., Nakamura S., Kunjj O. Bacteriological survey of diarrheal epidemics in the 1998 Bangladesh floods // Kansenshogaku. zasshi. 1999. - V. 73, №9.-P. 918-922.

181. Tsuchiya T., FukazawaJ., Shinoda T., Okoshi T. Response and specificity of anti-shigella rabbit antibody // J. Immunol. 1967. - V. 98. - P. 1085-1092.

182. Valdoianu J.R. Preparation of anti-H-salmonella agglutinating serum // Progr. Immunobiol. Scaud. 1970. V. 40. - P. 501-578.

183. Vergara M., Maestre J., Suarez O. et al. Toxigenic Vibrio cholerae: identification of the ctx B gene // Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 1997. - V. 15, № 4. -P. 181-185.

184. Waldor M.K., Colwell R., Mekalanos J.J. The Vibrio cholerae 0139 sero-group antigen includes an O-antigen capsula and lipopolysaccaride virulence determinants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - V. 91. - P. 11388-11392.

185. Waldor M.K., Mekalanos J.J. ToxR regulates virulence gene expression in non-Ol strains of Vibrio cholerae that cause epidemic cholera // Infect. Immun. -1994.-V. 62, № 1.-P. 72-78.

186. Yamamoto T., Albert M.J., Sack R.B. Adherence to human small intestines of capsulated Vibrio cholerae 0139 // FEMS Microbiol. Lett. 1994. - V. 119, № 1-2.-P. 229 -235.

187. Yamasaki S., Gard S., Nair G.B., Takeda Y. Distribution of Vibrio choleraei

188. Ol antigen biosythesis genes among 0139 and other non-Ol serogroups of Vibrio cholerae IIFEMS Microbiol. Lett. 1999. - V. 179, № 1. - P. 115-121.

189. Yamasaki S., Shimizu, Hoshino K. et al. The genes responsible for O-antigen synthesis of Vibrio cholerae 0139 are closely related to those of Vibrio cholerae 022 // Gene. 1999. - V. 237, № 2. - P. 321-322.

Информация о работе

Абрамова, Елена Геннадьевна
кандидата биологических наук
Саратов, 2005
ВАК 03.00.07

Диссертация

Разработка биотехнологической схемы получения флуоресцирующих иммуноглобулинов для идентификации холерных вибрионов О139 серогруппы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы