Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антигенные свойства и серотипирование новых штаммов неагглютинирующихся вибрионов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Антигенные свойства и серотипирование новых штаммов неагглютинирующихся вибрионов"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОТИВОЧУМНЫЙ г ' ИНСТИТУГ "МИКРОБ"

, 3 «0«

На правах рукописи

Сомова Галина Анатольевна

АНТРЕГЕННЫЕ СВОЙСТВА И СЕРОТИПИРОВАНИЕ НОВЫХ ШТАММОВ НЕАГГЛЮТИНИРУЮЩИХСЯ ВИБРИОНОВ

03.00.07 —микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов — 1998

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении "Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб"МЗ РФ

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, с.н.с. Елисеев Ю.Ю. Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель наук Российской Федерации, доктор медицинских наук, профессор Л.В.Самойлова,

кандидат биологических паук, старший научный сотрудник Г.М.Сергеева

Ведущая организация:

Ростовский научно-исследовательский противочумный институт

Защита состоится « » ¿¿¿¿Ьо/кг 1998 г. в . часов на заседании диссертационного совета Д 07>02.01-Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб"по адресу 410005,г.Саратов, ул.Университетская, 46.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб".

Автореферат разослан «_ »/-¿¿¿¿¿/¿с/11998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Г.А.Корпсев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Диарейные заболевания, вызываемые энтеропатогенными вибрионами относятся jc одной из проблем, затрагивающих интересы всех стран. Эпидемические вспышки и спо-родические заболевания, вызываемые этими вибрионами, ригист-рируются во многих странах мира: Индии, Судане, Восточном Пакистане, СНГ, Чехословакии, Болгарии, Венгрии, Мексике, США,-Бразилии и других (Воронежская Л.Г. с соавт.,1986; Ломов Ю.М. с соавт.,1992; Марамович А.С. с соавт., 1992; Онищенко Г.Г с со-авт.,1994; Bik Е.М. et ai.,1995).

По официальным данным ВОЗ с 1 января по 30 декабря 1993 года, общее число заболеваний холерой в мире все еще превышало показатели за прошедшие 30 лет. Отличительной чертой последнего времени явилось распространение во многих странах нового энтсропа-тогенного серовара V.cholerae, отличающегося от известных до сих пор 138 сероваров;в настоящее время он обозначен как V.cholerae 0139. Отсутствие иммунитета к новому эпидемическому штамму, а также диагностических препаратов для его своевременного обнаружения создает реальную угрозу дальнейшего распространения вызываемых им заболеваний. Последнее обстоятельство открывает новую страницу в более, чем столетней истории холерных вибрионов не 01 группы со времени их обнаружения и повышает актуальность этой проблемы.Тенденция к распространению нового вибриона вызвала опасение,что он может заменить V.Cholerae эльтор таким же образом, как с- середины 60-х годов последний заменил классический биовар V.cholerae (Воронежская Л.Г. 1994; Altman L.K.1993; Jesudason M.V. et al.1993; Swerdiow D.L. 1993).

Если вызвавший 7 пандемию штамм холерного вибриона 01 распространился с о.Целебес в Индонезии через Бангкок в Индию в течение трех лет, то штамм 0139 распростроняется быстрее.

Появление нового возбудителя эпидемий холеры изменяет представление об эпидемиологии, поскольку новый штамм вызывает не

отличимое от холеры заболевание и обладает сходным эпидемическим потенциалом.

Холерные вибрионы не 01 группы широко распространены на территории России и СНГ (Адамов А.К. с соавт.,1974; Андросова-С.В. ссоавт., 1989; Тепляков А.Б. 1991;Щуркина И.И. ссоавт., 1991).

Ежегодно их выделяли из объектов окружающей среды в различных климатогеографических зонах страны, но наиболее часто в южных регионах. Vibrio cholerae non 01 представляют интерес для исследователей, с одной стороны, как постоянные обитатели различных водоемов, с другой - как возможный показатель циркуляции при некоторых условиях и в определенный период холерных вибрионов 01 группы.

Установление серологического О-варианта у неагглютинирую-щихся вибрионов имеет важное значение для расшифровки связей в микроочагах вызываемых ими заболеваний.

Единых критериев для идентификации холерных вибрионов не 01 группы на сегодняшний день не разработано, и проблема таксономии обширной группы указанных микроорганизмов, не агглю-ТНШфУЮШПХСЛ ХОЛ^рКОЙ О-Сызоротко* Е il Ci СТО i7 III5 С от своего решения (Адамов А.К. с соавт., 1973; Адамов А.К. с со-авт., 1984; Пшшпенко В.И. с соавт., 1996).

В результате длительных исследований было установлено, что энтеропатогенные вибрионы не агглютинирующиеся холерной О-сывороткой, могут быть идентифицированы с помощью специфических вибрионных О-агглютипирующнх сывороток (Киятхано-в Б.А. с соавт., 1975; Люкъянова О.И. с соавт., 1987; Казакова Е.С. 1990; Щуркина И.И.с соавт., 1991 ; Shimada Т et al., 1982).

К началу проводимых исследований в нашей стране было обнаружено 79 серологических вариантов энтеропатогенных вибрионов.

Использование в практике новых монорецепторных сывороток позволяет расширить лабораторную диагностику кишечных заболеваний, вызываемых энтеропатогенными вибрионами.

С помощью имеющегося набора сывороток типирустся до 80 % штаммов вибрионов, выделяемых от больных диареями людей (Воронежская Л.Г. с соавт., 1985; Иванов JI.В. ссоавт., 1988;Тепляков -А.Б. 1988).

Цель работы. Выделение новых сероварнантов энтеропатогенных вибрионов, изучение их свойств, антигенной структуры, разработка и получение моноварных сывороток для их идентификации.

Задачи исследования:

1. Выделить ранее неизвестные серовары неагглютинирующихся вибрионов от больных диареями людей и из источников окружающей среды.

2. Изучить морфологические и биохимические свойства нетипи-рующихся имеющимися моноварными сыворотками вибрионов не 01 группы.

3. Изучить термостабильные и термолабильные антигены энтеропатогенных вибрионов новых сероваров.

4 Рязпяботять методы получения монопепептопных сывоооток

А ' • V X • Л. ж

против вибрионов новых сероваров.

5. Изучить токеннообразование у штаммов новых сероваров с помощью дот-иммуноанализа и метода ПЦР.

Научная новизна. Выделены от больных диареями людей четыре штамма V. cholerac поп 01 группы ранее неизвестных сероваров.

Bncpsbic получены данные об антигенном строении энтеропатогенных вибрионов новых 076,078,082,083 сероваров.

Впервые разработаны методики приготовления и получены моноспецифические диагностические О-агглютинирующие сыворотки для серологической идентификации энтеропатогенных вибрионов новых сероваров.

Практическая значимость работы.

1. Моноспецифические диагностические О-агглютинирующие сыворотки новых сероваров расширили возможности серологической идентификации вибрионов, неагглютинирующихся О-холерной сывороткой.

2. Типовые штаммы вибрионов 076, 078, 082, 083 сероваров депонированы в музее живых культур РНИПЧИ "Микроб"под номерами КМ-46 (2128), КМ-48 (1267), КМ-52 (2), КМ-54 (864).

3. Экспериментальные серии диагностических моноспецифических О-агглютиниругощих сывороток против вибрионов новых 076, 078, 082 и 083 сероваров прошли апробацию в лаборатории стандартизации и контроля препаратов особо опасных инфекций ГИСК

им. Л. А. Тарасевича и в лаборатории биологического контроля РНИПЧИ «Микроб».

4. Штаммы энтеропатогенных вибрионов КМ-46 (2128), КМ-48 (1267), КМ-52 (2), КМ-54 (864), используемые для приготовления моноварных диагностических О-ахтлютинирующих сывороток, зарегистрированы в качестве изобретений в Государственном Комитете России по делам изобретений и открытий (№ 4715422/13; № 4715377/13;№ 4856625/13;№ 4838851/13).

5. Составлен и утвержден регламент производства "Сыворотки холерные не 01 группы поливалентная, групповые и моноварные кроличьи жидкие для РА'ТП №541-95 от 10.11.1995.

6. Составлена и утверждена фармакопейная статья на производство диагностических сывороток 42/Д-052 ВС-95 от 01.12.1995.

Апробация. Материалы исследований были доложены па научных конференциях в институте "Микроб" в 1991, 1995 г,на съезде микробиологив и паразитологов - Нижний Новгород в 1991 г, на научно-практических конференциях в г.Новороссийске 1991 и 1994 гг., на научной конференции в г. Иркутске 1994 г, на Всеросий-ской научно-практической конференции 31 окт, 1994 г. в г.Махачкала, на научной конференции в г. Астрахани 1996 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных статей.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Доказательство существования новых ранее неизвестных серо-варов вибрионов неаггшотинирующихся холерной О-сывороткой.

2. Новые данные об антигенном строении изучаемых неагглюти-нирующихся вибрионов.

3. Технология получения монорецепторных диагностических виб-рионных О-аггшотинирующих сывороток к 076,078,082 и 083 серо-варам.

Объем и структура диссертации. Работа содержит 158 страниц печатного текста, иллюстрирована 21 таблицами, 7 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глаЕ собственных исследований, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего 426 источников, из них 244 работы отечественных и 182 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований. Для решения поставленных задач было идентифицировано 304 штамма энтеропатогенных вибрионов, полученных от больных диареями людей и из источников окружающей среды на территории нашей страны и государств СНГ. Свойства выделенных вибрионов новых 076, 078, 082 и 083 серова-ров изучали с помощью набора моносывороток против 78 типовых штаммов 02 - 075,077, 079 - 081 сероваров, в том числе штаммы полученные от доктора Р.Саказаки со 02 - 039.

Для исследований использовали стандартные питательные среды производства института "Микроб": агар из настоя сердечной мыпшы г>Н 7.6: 1 % пептонную nonv г>Н 7.6: бульоны Хоттингеоа и

А" - J J •VA.''«'

Мартена рН 7,4.

Исследования проводили с помощью микробиологических, биохимических, биологических,иммунологических,генетических, электронно-микроскопических и статистических методов.

Биохимические свойства исследуемых культур определят! согласно "Инструктивно-методическим указаниям по лабораторной диагностике холеры" (1984) и по методам, предложенным А.К.Адамовым, М.С.Наумшиной (1984).

Фаголизабельные свойства вибрионов новых сероваров изучали с помощью холерных фагов С, эльтор, ХДФ 3, 4, 5 и набора монофагов ТЭПВ 1 - 7.

Антигенную структуру вибрионов исследовали с помощью перекрестных реакций агглютинации, метода иммуносорбции по Кас-теллани и в модификации И.И.Щуркиной (1981).

Препараты О-антигенов готовили путем 2-х часового кипячения вибрионов, ОН-антигенов - добавления 2 % формалина.

Иммунные сыворотки получали методом 3-х кратной иммунизации кроликов породы шиншилла весом 2 - 2,5 кг О- или ОН-антиге-нами.

Токсинообразование вибрионов 076, 078, 082 и 083 сероваров определяли с помощью дот-иммуноанализа (ДИА) и метода ПЦР.

Электронно-микроскопические исследования проводили в электронном микроскопе JEM-7A.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием метода И.П.Лшмарина, А.А.Воробьева (1962).

Полученные результаты и их обсуждение.

При серотипировании нами 304 штаммов выделенных от больных диареями людей, а также из объектов окружающей среды с помощью набора диагностических О-агглготинирующих сывороток против 02 - 075, 077, 079 - 081 сероваров, были обнаружены 4 новых штамма 2128,1267,2 и 864 которые не агглютинировались комплектом сывороток против известных сероваров энтеропатогенных вибрионов.

В дальнейшем были изучены морфологичнекие, культуральные, физиологические, электронно-микроскопические свойства нетипи-рующихся штаммов вибрионов. Результаты исследований показали, что вибрионы штаммов 2128,1267,2 и 864 обладают совокупностью признаков, типичных для представителей рода Vibrio.

Термостабильные антигены и их свойства изучали в реакции агглютинации О-сывороток, полученных против вибрионов штаммов 2128,1267,2, 864 с типовыми штаммами 02-075, 077,079-081 сероваров. О-сыворотки получали путем иммунизации животных клетками изучаемых вибрионов, убитых 2-х часовым кипячением.

В сыворотках против вибрионов 2128 выявлены антитела к антигенам 26, 27 сероваров. Наиболее высокие титры антител уста...—,-----. ~—~—____________пн г\т> .. тс ____________ /\.лг\г\ i .оопт

пивл^пш npvjijno ашшсиис \) i, ujj И UJJ ^Сриварио ^i.tvvj - i

{табл. 1).

Адсорбция О-сыворотки клетками вибрионов 033 серовара (100 млрд.м.т.) убитыми 2 % формалином извлекла гетерологичные антитела полностью. Титр антител к гомологичному штамму был 1:400. Таким образом, сыворотка обладала строгой специфичностью. Исследованная иммунная сыворотка против вибрионов штамма 2128 имела в своей структуре не менее 2-х термостабильных антигенов. Один из которых строго специфичный для штамма 2128, второй общий с антигенами 07, 033 и 035 сероваров. Его детерминанты отличались по иммунологическим свойствам от детерминант термостабильных антигенов других сероваров, энтеропатогенных вибрионов, что позволило выделить вибрионы штамма 2128 в самостоятельный серовар, которому Государственным Комитетом по

Таблица J.

ГОМОЛОГИЧНЫЕ И ГЕТЕРОЛОГИЧНЫЕ АНТИТЕЛА В СЫВОРОТКАХ ЖИВОТНЫХ, ИММУНИЗИРОВАННЫХ О-АНТИГЕНОМ ШТАММА VIBRIO CHOLERaE NON-OI 2128 076 СЕРОВАРА

Сыво эотки Серовары вибрионов, агглютинирующихся при различных разведениях сывороток

Тип Номер 1:10 1:80 1:100,1:20Ci 1:400-1:3200 1:6400,1:12800

О 250 02,06,07,08,09, 02,07,011,014, 07,011,017, 07,033,035, 076

251 011,014,017,019, 017,019,020,023, 019,023,026, 076

252 020,022,023,025, 025,026,029,031, 029,031,033,

026,029,031,033, 033,035,036,037, 035,036,039,

035,036,037,039, 039,054,060,061, 054,060,061,

040,054,060,061, 064,069,076 076

064,069,076

Таблица 2.

ГОМОЛОГИЧНЫЕ И ГЕТЕРОЛОГИЧНЫЕ АНТИТЕЛА В СЫВОРОТКАХ ЖИВОТНЫХ, ИММУНИЗИРОВАННЫХ О-АН ГИГЕНОМ ШТАММА VIBRIO CHOLERAE NON-OI 1267 078 СЕРОВАРА

Сыворотки Серовары вибрионов, агглютинирующиеся при различных разведениях сывороток

Тип Номер 1:10 1:80 1:100,1:200 1:400-1:3200 1:6400,1:12800

О 255 06,07,017,025, 06,07,017,025, 035,078 078 078

256 030,034,043,044, 030,043,044,050,

257 045,046,047,048, 053,054,055,056,

050,051,053,054, 067,069,078

055,063,064,065,

066,067,068,069,

070,071,072,073,

074,075,076,077,

078

Таблица 3.

ГОМОЛОГИЧНЫЕ И ГЕТЕРОЛОГИЧИЫЕ АНТИТЕЛА В СЫВОРОТКАХ ЖИВОТНЫХ, ИММУНИЗИРОВАННЫХ О-АНТИГЕНОМ ШТАММА VIBRIO CHOLERAE NON-OI 2 082 СЕРОВАРА

Сыворотки Серовары вибрионов, агглютинирующиеся при различных разведениях сывороток

Тип Номера 1:10 1:80 1:100,1:200 1:400-1:3200 1:6400,1:12800

О 216 02,07,09,011, 02,07,09,011, 02,07,09,011, 033,082 082

283 014,017,026,027, 017,026,027,030, 026,027,033,036,

4450 030,031,033,036, 031,033,036,039, 040,041,050,055,

039,040,041,048, 040,041,048,049, 076,076,079,081,

049,050,052,054, 050,054,055,076, 082

055,059,061,076, 077,078,079,081,

077,078,079,081, 082

082

о

Таблица 4.

ГОМОЛОГИЧНЫЕ И ГЕТЕРОЛОГИЧИЫЕ АНТИТЕЛА В СЫВОРОТКАХ ЖИВОТНЫХ, ИММУНИЗИРОВАННЫХ О-АНТИГЕНОМ ШТАММА VIBRIO CHOLERAE NON-OI 864 083 СЕРОВАРА

Сыворотки Серовары вибрионов, аггютинирующиеся при различных разведениях сывороток

Тип Номера 1:10 1:80 1:100,1:200 1:400-1:3200 1:6400,1:12800

О 277 02,03,04,06,07,08, 02,03,04,07, 03,04,07, 04,07,033, 083

4451 09,011,017,-18,019, 08,011,017,026, 08,011,026, 083

4452 026,029,030,031,032, 027,029,030,031, 029,033,055,

033,035,038,039,040, 032,033,048,055, 061,068,083

048,049,051,052,054, 057,059,061,063,

055,057,059,061,063, 068,069,070,083

068,069,070,073,083

делам изобретений и открытий был присвоен номер 076.

Изучение термостабильных антигенов штамма 1267 посредством реакции агглютинации позволило выявить в них антигенные детерминанты общие с антигенами вибрионов 21 - 28 сероваров. Наличие низких титров антител против антигенов гетерологичных сероваров (1:10 - 1:80) позволило сделать вывод о том, что клеточная стенка вибрионов штамма 1267 содержит слабые термостабильные антигены, родственные антигенам гетерологичных сероваров (табл. 2).

Антиген 035 серовара вызывал образование антител в сыворотках изучаемого серовара, титр которых составлял ]; 100. В диагностическом титре (1:400) сыворотки нового серовара были моноспецифические и поэтому адсорбция не проводилась. Анализ антигенной структуры энтеропатогенных вибрионов штамма 1267, позволил выделить их в самостоятельный серовар, которому Государственным Комитетом по делам изобретений и открытий присвоен номер 078. Диагностическим титром моноварной сыворотки 078 серовара следует считать разведение 1:400.

При изучении термостабильных О-антигенов энтеропатогенных вибрионов штамма 2 с помощью реакции агглютинации выявлено наличие в клеточной стенке вибрионов этого штамма присутствие около 29 антигенных детерминант. Наиболее высокий титр антител установлен против антигена 033 серовара (1:800 -1:1600) (ршбл. 3). После адсорбции клетками вибрионов 033 серовара, гетерологич-ные антитела были извлечены полностью. Изучение антигенной структуры энтеропатогенных вибрионов штамма 2, позволило выделить их в самостоятельный серовар, которому Государственным Комитетом по делам изобретений и открытий присвоен номер 082.Диагностическим титром моноварной сыворотки 082 серовара следует считать разведение 1:400.

Термостабильные антигены вибрионов штамма 864 изучали также с помощью реакции агглютинации и иммуносорбции. Были обнаружены антигенные детераминанты, общие с антигенными детерминантами 36 известных сероваров (табл. 4). После адсорбции О-сыворотки ОН-антигенами 033 серовара гетерологичные антитела были извлечены полностью. Полученная сыворотка содержала антитела только против штамма 864, что позволило сделать вывод

о наличии в структуре этого штамма термостабильного антигена, отличающегося по своим свойствам от термостабильных антигенов других сероваров.

Таким образом, в клетках вибрионов штамма 864 содержался се-ровароспецифический термостабильный антиген иммунологически отличающийся от О-антигена вибрионов известных сероваров, а также небольшое количество термостабильных антигенов, которые являлись общими с антигеном 033 серовара. На основании полученных данных вибрионы штамма 864 выделены в самостоятельный се-ровар, которому Государственным Комитетом по делам изобретений и открытий был присвоен номер 083. Диагностическим титром моноварной сыворотки 083 серовара следует считать разведение 1:400.

Для изучения термолабильных антигенов вибрионов новых 076, 078.082 и 083 сероваров нами были приготовлены против них Н-аг-глютинирующие сыворотки. Они готовились из ОН-сывороток, полученных от кроликов, иммунизированных взвесью вибрионов, убитых 2 % формалином. ОН-сыворотка адсорбировалась клетками термостабильного антигена гомологичного штамма убитыми кипячением при температуре 100° С в течение 2-х часов.

Н-сьшоротка против термолабильных антигенов 076 серовара, агглютинировала живые клетки гомологичного штамма в разведении 1:160. При исследовании К-сьшоротки против вибрионов 076 серовара в реакции агглютинации с вибрионами 02 - 075, 077, 079 -081 сероваров было выявлено, что в ней содержались антитела против вибрионов 017, 026, 050, 061, 062 и 076 сероваров.

Для адсорбции термолабильных антигенов против вибрионов 050 и 061 сероваров были приготовлены ОН-антигены этих штаммов. Путем адсорбции Н-сыворотки клетками вибрионов 05 серовара удалось извлечь антитела против антигенов 017, 026 и 050 сероваров. После адсорбции клетками вибрионов 061 серовара были извлечены антитела к вибрионам 061 и 062 сероваров. Адсорбция смесью антигенов 050 и 061 сероваров привела к получению Н-сыворотки содержащей антитела только против штамма 2128.

Из приведенных данных следует, что в клетках вибрионов штамма 2128, являющегося новым 076 сероваром энтсропатогенных вибрионов содержались один строго специфичный для этого серовара

и не менее трех преобладающих, но различных по специфичности термолабильных антигенов.

Н-сыворотка против термолабильных антигенов вибрионов 078 серовара содержала антитела к вибрионам гомологичного штамма 1267 и к вибрионам 09, 025, 031,034, 035, 055, 060, 061, 064 серо-варов. После адсорбции Н-сыворотки клетками вибрионов 055 серовара из нее извлеклись антитела к термолабильным антигенам 025, 031,034,035 и 055 сероваров, после адсорбции клетками вибрионов 064 серовара - антитела против термолабильных антигенов 09, 025, 034, 060, 061 и 064 ссроваров; после адсорбции смесью клеток вибрионов 055 и 064 сероваров в Н-сыворотке сохранились специфические антитела против термолабильного антигена 078 серовара.

Таким образом, в клетках вибрионов штамма 1267, являющегося новым 078 сероваром энтеропатогенных вибрионов содержались один строго специфичный для этого серовара и не менее 3-х различных по специфичности термолабильных антигенов.

В Н-сыворотке против вибрионов 082 серовара, кроме антител к вибрионам гомологичного штамма содержались антитела к вибрионам 02,03,011,026, 030,033, 040,049,055,077, 078 и 081 сероваров. После адсорбции Н-сыворотки клетками вибрионов 03 серовара, из нее были извлечены антитела против антигенов 03, 011, 026, 033, 040,055 и 081 сероваров. После второй адсорбции Н-сыворотки клет-

---------------------Г\Л П----------------..„ „ — ,

tvciivm _Diivjpiiuiiui> V-TJ7 v^^vrmpa, WDIJIII riJDJiV/iunDi 1x111*1-

тела против антигенов 026, 030, 049, 055, 077 и 081 сероваров. Третья адсорбция была проведена клетками вибрионов 078 серовара, из сыворотки были извлечены антитела против 02,026,030,040,055, 077, 078 и 081 сероваров. Адсорбция смесью клеток вибрионов 03, 049,078 сероваров позволила извлечь антитела гстерологичных вибрионов и получить Н-сьшоротку содержащую только специфические антитела против термолабильного антигена 082 серовара.

Таким образом, в клетках вибрионов штамма 2 являющегося новым 082 сероваром энтеропатогенных вибрионов содержалось не менее четырех различных по специфичности термолабильных антигенов, в том числе одии строго специфичный для этого серовара.

В Н-сыворотке к штамму 864 083 серовара полученной по той же схеме также содержались антитела к другим сероварам. При проведении реакции иммуносорбции гегерологичных антител клетка-

ми вибрионов тех сероваров, которые агглютинировались Н-сы-вороткой,определилась специфичность термолабильных антигенов вибрионов штамма 864. После проведения адсорбции Н-сыворотки клетками вибрионов 050 серовара, из нее были извлечены антитела к антигенам 011, 025, 028, 031, 033, 034, 036, 055, 057, 059, 068, 077, 081 сероваров. При адсорбции Н-сыворотки клетками вибрионов 078 серовара, из нес были извлечены антитела к антигенам 09, 025, 028, 030,059, 061, 068,078 и 081 сероваров. После адсорбции Н-сы-воротки клетками вибрионов 050 серовара, из нее были извлечены антитела к антигенам 011, 034,036, 050, 055, 059, 068,073, 081 сероваров. Адсорбция смесью клеток вибрионов 055, 033 и 078 сероваров дала возможность полностью извлечь антитела гетерологичных вибрионов и получить Н-сыворотку против термолабильного антигена 083 серовара.

Из приведенных данных можно сделать вывод, что в клетках вибрионов штамма 864, являющегося новым 083 сероваром энтеропа-тогенных вибрионов содержалось не менее четырех различных по специфичности термолабильных антигенов, в том числе один строго специфичный для данного серовара.

При проведении дот-иммуноанализа у штаммов 2128, 1267, 2, 864 было обнаружено наличие холероподобного токсина в разных соотношениях; в среде культивирования (свободный), на наружных мембранах (связанный) и в лизатах клеточных взвесей (внутриклеточный).

В дот-иммуноанализе была установлена способность изучаемых штаммов продуцировать экзотоксин, эпитопы которого гомологичны моноклональным антителам к В субъединице холерного токсина.

При исследовании с помощью метода ПЦР было установлено, что все четыре штамма не содержали нуклеотидной последовательности характерной доя участка ctx А гена Y.cholerae (Тох+).

Изучаемые штаммы продуцировали токсин отличающийся от холерного токсина, так как в методе ПЦР к А субъединичному комплексу результат был отрицательный, в то время как в реакции дот-иммуноанализа к В субъединичному комплексу результат был положительный.

Таким образом, можно сделать вывод о том, что изучаемые штам-

мы продуцировали токсин отличающийся от холерного, но вызывающий онтеропатогенные заболевания у людей.

Проведенные исследования антигенной структуры энтеропато-генных вибрионов новых сероваров дали возможность для разработки методик получения вибрионных О-аггшотинирующих сывороток против 076, 078, 082 и 083 сероваров.

Новые диагностические сыворотки были применены в комплексе с экспериментально- производственными сыворотками (выпущенными институтом "Микроб") при идентификации 304 штаммов эн-теропатогенных вибрионов. Частота обнаружения штаммов 076 се-ровара составляла 2,96 %; 078 серовара - 0,65 %; 082 серовара - 2,96 %; 083 серовара - 3,94 %.

Следовательно, в результате произведенных исследований обнаружены 4 новых ссровара энтеропатогенных вибрионов, зарегистрированных в качестве изобретений (A.C. № 1632033, A.C. № 1668390, A.C. № 1733468, A.C. № 1726510).

Разработаны методики приготовления моноварных диагностических О-агглютинирующих сывороток 076,078,082,083 сероваров. Моноварные О-агглютинирующие сыворотки против вибрионов новых сероваров внедрены в работу лабораторий института "Микроб".

Обнаруженные новые серовары пополнили коллекцию отечественных типовых штаммов энтеропатогенных вибрионов и тем самым расширили возможности серотипирования выделяемых вибрионов и повысили надежность микробиологической диагностики.

Выводы

1. Выявлены новые, ранее не известные серовары 076, 078, 082 и 083 энтеропатогенных вибрионов выделенные от больных острыми кишечными инфекциями людей. Штаммы обладали типичными морфологическими, физиологическими и биохимическими свойствами.

2. С помощью иммунологических методов получены новые данные об антигенной структуре энтеропатогенных вибрионов 076,078, 082 и 083 сероваров. В клетках каждого из выделенных вибрионов новых сероваров обнаружено кроме одного строго специфичного для данного штамма термостабильного и термолабильного антигенов от 1 до 4 «О» и от 3 до 5 «ОН» антигенных комплекса известных

сероваров.

3. Разработана технология приготовления диагностических О-аг-гшотинирующих монорецепторных сывороток против вибрионов 076, 078, 082 и 083 сероваров для серологической идентификации энтеропатогенных вибрионов, выделенных от больных острыми кишечными инфекциями людей.

4. При серологической идентификации 304 штаммов энтеропатогенных вибрионов частота обнаружения вибрионов 076 серовара составляла - 2,96 %; 078 серовара - 0,65 %; 082 серовара - 2,96 %; 083 серовара - 3,94 %.

5. С помощью дот-иммуноанализа и реакции ПЦР установлено, что изучаемые штаммы продуцировали токсин отличающийся от холерного, но вызывающий энтеропатогенные заболевания у людей.

Работы, опубликованные по теме диссертации:

1. Щуркина И.И., Казакова Е.С., Лукьянова О.И., Елисеев Ю.Ю., Резников Ю.Б., Сомова Г.А. Совершенствование метода серологической идентификации энтеропатогенных вибрионов //Те-з.докл. 6 съезда микробиологов и паразитологов - Нижний Новгород, 1991. Т. 1-М.Д991-С.151-.

2 Адамов А.К., Казакова Е.С., Елисеев Ю.Ю., Резников Ю.Б. Щуркина И.И., Сомова Г.А. "Штамм бактерий Vibrio Nag серовара 076, используемый для приготовления диагностической сыворотки: A.C. 1632033 СССР,МКИс 12 № 1/20, А 61 К 39/104.-№4715422/ 13; Заявл.06.07.89; Опубл. 15.02.92. Бюл. №6 //Изобретения, -1992. -№ 6. - С.249

3. Адамов А.К., Резников Ю.Б., Елисеев Ю.Ю., Щуркина И.И., Сомова Г.А., Белоногова Г.И. "Штамм бактерий Vibrio Nag серовара 078, используемый для изготовления диагностической сыворотки" A.C.1668390 СССР. МКИ с 12 № 1/20, А 61 к 39/106. -№ 4715377/13; Заявл. 06.07.89; Опубл. 07.08.91, Бюл. № 29 //Открытия. Изобретения. 1991. -№29. - С. 110.

4. Адамов А.К., Щуркина И.И., Андрусенко И.Т.,Шепелев А.П. Фрунзе О.В., Корешкова Е.А., Елисеев Ю.Ю., Резников Ю.Б., Сомова Г.А., Белоногова Г.И. "Штамм бактерий Vibrio Nag серовара

082, используемый для изготовления диагностической сыворотки-"А.С. 1733468 СССР, МКИ С 12 № 1/20, А 61 к 39/40 -№4856625/13; Заявл. ¡2.06.90; Опубл. 15.05.92, Бюл. №18//Изобретения.-1992. - № 18.-С.96.

5. Адамов А.К., Елисеев Ю.Ю., Резников Ю.Б., Сомова Г.А., Бе-лоногова Г.И., Лукьянова О.И. "Штамм бактерий Vibrio Nag серо-вара 083, используемый для изготовления диагностической сыворотки" А.С. 1726510 СССР, МКИ с 12 № 1/20, А 61 К 39/40. -№ 4838851/13; Заявл. 12.06.90; Опубл. 15.04.92, Бюл. № 14 //Изобретения. -1992 - № 14. - С. 104.

6. Щуркина И.И.,Адамов А.К.,Лукьянова О.И., Казакова Е.С., Сомова Г.А., Малахаева А.Н. Активность диагностических сывороток против холерных вибрионов не 01 серологической группы 02-083 сероваров при длительном хранении //Сб.науч.трудов - Новороссийск, 1994-вып. 1, с. 135.

7. Сомова Г.А., Щуркина И.И., Адамов А.К. Антигенное строение 076,078,082 и 083 сероваров холерных вибрионов не 01 группы и их распространение //Сб.научн.трудов- Новороссийск-1994-

л п

ВЫП. 1-е. 14/.

8. Адамов А.К., Щуркина И.И., Сомова Г.А., Елисеев Ю.Ю., Об антигенах холерных вибрионов синтезируемых в организме лабораторных животных/УАктуал.пробл.профилакт.особо опасн. при— — .,..4, л i по л Т/Г.,,.,,™™- « п

ридпиича! un.Fiíiijj.uujiujnoii- i У JT JTl^IVУ 1 -

9. Сомова Г.А., Андрусенко И.Т., Лукьянова О.И., Щуркина И Адамов А .XV. свойства новых voz. и uuj сероваров знтеропа-тогенных вибрионов //Актуал.пробл.профилакт.оеобо опасн.при-род. очагов, инф.болезней- Иркутск- 1994- с. 139.

10. Адамов А.К., Щуркина И.И., Сомова Г.А. Некоторые особенности серолог ической диагностики холерных вибрионов не 01 группы. Принципы и практика борьбы с холерой в республике Дагестан //Актуальн.вопр.разработки микробиол.питат.сред и тестсистем: матер.докл.Всерос.науч-практ.конф., 31 окт.1994- Махачкала- 1994-с.64.

11. liaj.vlUD лдамиэ rv.iv., i i j; 1\ i 11 i 11 i-i.xx., ill unnna П.х».,

Резников Ю.Б., Лукьянова О.И., Казакова Е.С.,Сомова Г.А.,Зини-на О.С., Ломов Ю.В., Воронежская Л.Г., Андрусенко И.Т., Мазру-хо Б.А., Иванова Л.В., Медуницин Н.В., Озерецковский Н.А. Сыво-

ротки холерные не 01 группы поливалентная, групповые и моновар-ные кроличьи жидкие для РА //Регламент производства №54195 от 10.Х. 1995,срок действия до 9 окт.2000 года.

12. Адамов А.К.,Щуркина И.И., Казакова Е.С., Лукьянова О. И., Андрусенко И.Т., Сомова Г.А., Абрамова Е.Г., Маркова В.Ю. Термостабильные О-антигены холерных вибрионов не 01 группы 02-083 сероваров //УДК 616. 932; 576,851.3:576.8097,Российский н-и противочумн.ин-т "Микроб", Саратов,1995-Деп. в ВИНИТИ, 10.07.95, №2079-В95.

13. Сомова Г.А. Изучение термостабильных и термолабильных антигенов холерных вибрионов не 01 группы 076, 078, 082 и 083 сероваров //Эколого-эпид.надзор за природ-очаг. инф. в Сев. Прикас-пии: Сб.науч.тр,-Астрахань, 1996- с. 12314. Сомова Г.А. Получение новых диагностических моноварных

сывороток 076, 078, 082 и 083 сероваров для идентификации знте-ропатогенных вибрионов //Гомеостаз и инфекционный процессСа-

1 ППО „/Í jjaiOB- 1770- v,.0->.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сомова, Галина Анатольевна, Саратов

ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "РОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИМ ПРОТИВОЧУМНЫЙ ИНСТИТУТ "МИКРОБ" т РФ

На правах рукописи

СОМОВА ГАЛИНА АНАТОЛЬЕВНА

АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА И СЕРОТИПИРОВАНИЕ НОВЫХ ШТАММОВ НЕАГГЛШТИНИРУЮЩИХСЯ ВИБРИОНОВ

03.00.07 - микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук Ю.Ю.Елисеев

САРАТОВ - 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ................................................5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................11

ГЛАВА 1. СВОЙСТВА НЕАГГЛЮТИНИРУЮЩИХСЯ ВИБРИОНОВ И ИХ

АНТИГЕННОЕ СТРОЕНИЕ...........................И

1.1. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИБРИОНОВ И ИХ ИЗМЕНЧИВОСТЬ.........................................15

1.2. АНТИГЕННАЯ СТРУКТУРА НЕАГГЛЮТИНИРУЮЩИХСЯ ВИБРИОНОВ.....................................25

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...............31

2.1. МАТЕРИАЛЫ.....................................31

2.2. МЕТОДЫ........................................32

ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА СВОЙСТВ ШТАММОВ 2128, 1267, 2,

864 ЭН1ЕРОПАТОГЕННЫХ ВИБРИОНОВ...............40

3.1. КУЛЬТУРАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИБРИОНОВ ШТАММОВ 2128, 1267 , 2 , 864.................... 40

3.2. БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИБРИОНОВ ШТАММОВ 2128, 1267 , 2, 864.................................. 46

ГЛАВА 4. ТЕРМОСТАБИЛЬНЫЕ АНТИГЕНЫ ШГЕРОПАТОГЕННЫХ

ВИБРИОНОВ ШТАММОВ 2128, 1267, 2 и 864.........49

4.1. ИЗУЧЕНИЕ ТЕРМОСТАБИЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ ШТАММА

КМ 46(2128) 076 СЕРОВАРА......................49

4.2. ИЗУЧЕНИЕ ТЕРМОСТАБИЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ ШТАММА

КМ 48(1267) 078 СЕРОВАРА......................54

4.3. ИЗУЧЕНИЕ ТЕРМОСТАБИЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ ШТАММА

КМ 52(2) 082 СЕРОВАРА.........................55

4.4. ИЗУЧЕНИЕ ТЕРМОСТАБИЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ ШТАММА

КМ 54(864) 083 СЕРОВАРА.......................62

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ТЕРМОЛАБИЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ ЭНТЕРОПАТО-ГЕННЫХ ВИБРИОНОВ 078, 078, 082 И 083 СЕРОВА-

РОВ...........................................68

5.1. ТЕРМОЛАБИЛЬНЫЕ АНТИГЕНЫ ЭНТЕРОПАТОГЕННЫХ ВИБРИОНОВ 076 СЕРОВАРА........................68

5.2. ТЕРМОЛАБИЛЬНЫЕ АНТИГЕНЫ ЭНТЕРОПАТОГЕННЫХ ВИБРИОНОВ 078 СЕРОВАРА....................72

5.3. ТЕРМОЛАБИЛЬНЫЕ АНТИГЕНЫ ЭНТЕРОПАТОГЕННЫХ ВИБРИОНОВ 082 СЕРОВАРА........................74

5.4. ТЕРМОЛАБИЛЬНЫЕ АНТИГЕНЫ ЭНТЕРОПАТОГЕННЫХ ВИБРИОНОВ 083 СЕРОВАРА........................79

ГЛАВА 6. Т0КСИН00БРА30ВАНИЕ У ШТАММОВ НЕАГГЛЮТИНИ-РУЮЩИХСЯ ВИБРИОНОВ 2128 (076), 1267 (078), 2 (082), 864 (083)............................83

6.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ В Д0Т-ИММУН0АНАЛИЗЕ СПОСОБНОСТИ ШТАММОВ V.CHOLERAE поп 01 ГРУППЫ 2128, 1267, ПРОДУЦИРОВАТЬ ХОЛЕРНЫЙ ТОКСИН.................84

6.2. ИЗУЧЕНИЕ ТОКСИГЕННОСТИ ШТАММОВ V.CHOLERAE поп 01 ГРУППЫ 2128, 1267, 2 И 864 С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА ПЦР....................................88

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.............................................92

ВЫВОДЫ................................................101

СПИСОК ПРИНЯТЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИИ

АГ АТ

АЦФ(АЦМ) НЦФ(НЦМ) МКА ДИА ВЭА

В/бр

в/в А-СЕ В-СЕ ЩР ЭДТА ЕИБА РВЭ

антиген антитело

ацетатцеллюлозный фильтр (мембрана)

нитроцеллюлозный фильтр (мембрана)

моноклональные антитела

дот-иммуноанализ

бычий сывороточный альбумин

кроличьи иммуноглобулины против

иммуноглобулинов мыши

внутрибрюшинно

внутривенно

А субъединица

В субъединица

полимеразная цепная реакция этилендиаминтетраацетат Ыа иммуноферментный анализ фосфатно-солевой буфер

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Диарейные заболевания относятся к одной из проблем здравоохранения, затрагивающих интересы всех стран. Эпидемические вспышки и спородические заболевания, вызываемые этими вибрионами, регистрируются во многих странах мира: Индии, Судане, Восточном Пакистане, СНГ, Чехословакии, Болгарии, Венгрии, Мексике, США, Бразилии и других [61, 144, 149, 155, 165, 170, 258, 304, 315, 345].

По официальным данным ВОЗ с 1 января по 30 декабря 1993 года, общее число заболеваний холерой в мире все еще превышало показатели за прошедшие 30 лет. Отличительной чертой последнего времени явилось распространение во многих странах нового патогенного серовара V.cholerae, отличающегося от известных до сих пор 155 сероваров; в настоящее время он обозначен как V.cholerae 0139. Отсутствие иммунитета к новому эпидемическому штамму, а также диагностических препаратов для его своевременного обнаружения создает реальную угрозу дальнейшего распространения вызываемых им заболеваний. Последнее обстоятельство открывает новую страницу в истории холерных вибрионов не 01 группы со времени их обнаружения и повышает актуальность этой проблемы. Тенденция к распространению нового вибриона вызвала опасение, что он может заменить V.cholerae эльтор таким же образом, как с середины 60-х годов последний заменил классический биовар V.cholerae С62, 248, 319, 400, 413].

- б -

Если вызвавший 7 пандемию штамм холерного вибриона 01 распространился с о.Целебес в Индонезии через Бангкок в Индию в течение трех лет, то штамм V.cholerae 0139 распространяется быстрее. Появление нового возбудителя эпидемий холеры изменяет представление об ее эпидемиологии, поскольку штамм 0139 серова-ра вызывает не отличимое от классической холеры заболевание и обладает сходным эпидемическим потенциалом.

*

Холерные вибрионы не 01 группы широко распространены на территории России и СНГ [7, 18, 21, 59, 154, 218, 241, 244]. Ежегодно их выделяют из объектов окружающей среды в различных климатогеографических зонах страны, но наиболее часто - в южных регионах.Vibrio cholerae non 01 представляют интерес для исследователей, с одной стороны, как постоянные обитатели различных водоемов,с другой - как возможный показатель циркуляции при некоторых условиях и в определенный период холерных вибрионов 01 группы.

Установление серологического О-варианта у неагглютинирую-щихся вибрионов имеет важное значение для расшифровки связей в микроочагах вызываемых ими заболеваний.

Единых критериев для идентификации холерных вибрионов не 01 группы на сегодняшний день не разработано, и проблема таксономии обширной группы указанных микроорганизмов, не агглютинирующихся холерной 01 сывороткой, в настоящее время далека от своего решения С6, 7, 8, 174, 175, 243].

В результате длительных исследований было установлено, что энтеропатогенные вибрионы, не агглютинирующиеся холерной 0-сывороткой, могут быть идентифицированы с помощью специфических вибрионных 0-агглютинирующих сывороток [6, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 124, 127, 147, 183, 210, 240, 241, 243, 244, 260, 389,393, 3941.

К началу проведенных исследований в нашей стране было обнаружено 79 серологических вариантов энтеропатогенных вибрионов.

Использованные в практике новые монорецепторные сыворотки позволяют расширить лабораторную диагностику кишечных заболеваний, вызываемых энтеропатогенными вибрионами, в нашей стране.

С помощью имеющегося набора сывороток типируется до 80 % штаммов вибрионов, выделяемых от больных диареями людей и из источников окружающей среды С60, 119, 154, 217].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ.

Выделение новых сероваров энтеропатогенных вибрионов, изучение их свойств, антигенной структуры, разработка и получение моноварных сывороток для их идентификации.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Выделить ранее неизвестные серовары неагглютинирующихся вибрионов) полученных от больных диареями людей и из источников окружающей среды.

2. Изучить морфологические и биохимические свойства нетипи-рующихся имеющимися моноварными сыворотками вибрионов не 01 группы.

3. Изучить термостабильные и термолабильные антигены вьще-ленных вибрионов новых сероваров.

4. Разработать методы приготовления монорецепторных сывороток против вибрионов новых сероваров.

5. Изучить токсинообразование у штаммов новых сероваров с помощью дот-иммуноанализа и метода ЩР.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

Работа заключается в выделении от больных диареями людей четырех штаммов V.cholerae non 01 группы ранее неизвестных сероваров.

Впервые получены данные об антигенном строении энтеропато-генных вибрионов новых 076, 078, 082, 083 сероваров.

Впервые разработаны методики приготовления и получены мо-

V 1

носпецифические диагностические 0-агглютинирующие сыворотки

»

для серологической идентификации энтеропатогенных вибрионов новых сероваров.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

1. Моноспецифические диагностические 0-агглютинирующие сыворотки против вибрионов новых сероваров расширили возможности серологической идентификации вибрионов, не агглютинирующихся О-холерной сывороткой.

2. Типовые штаммы вибрионов 076, 078, 082, 083 сероваров депонированы в музее живых культур РНИПЧИ "Микроб" под номерами КМ-46 (2128), КМ-48 (1267), КМ-52 (2), КМ-54 (864).

3. Экспериментальные серий диагностических моноспецифических 0-агглютинирующих сывороток против вибрионов новых 076,078, 082 и 083 сероваров, прошли апробацию в лаборатории стандартизации и контроля препаратов особо опасных инфекций ГИСК им. Л.А.Тарасевича и в лаборатории биологического контроля РНИПЧИ "Микроб".

4. Штаммы энтеропатогенных вибрионов КМ-46 (2128), КМ-48 (1267), КМ-52 (2), КМ-54 (864) используемые для приготовления моноварных диагностических 0-агглютинирующих сывороток, зарегистрированы в качестве изобретений в Государственном Комитете

России по делам изобретений и открытий (И 4715422/13; N 4715377/13; N 4856625/13; N 4838851/13).

5. Составлен и утвержден регламент производства N 541-95 "Сыворотки диагностические холерные не 01 группы поливалентная, групповые и моноварные кроличьи жидкие для РА" РП N541-95 от 10.Х.1995 г.

6. Составлена и утверждена фармакопейная статья на производство диагностических сывороток 42/Д-052 ВС-95 от 01.12.1995.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Материалы исследований были представлены на научных конференциях в институте "Микроб" в 1991,1995 гг.,на съезде микробиологов и паразитологов - Нижний Новгород в 1991 г.,на научно-практических конференциях в г.Новороссийске 1991 и 1994 гг.,на научной конференции в г.Иркутске 1994 г.,на Всеросийской научно-практической конференции 31 окт.1994 г. в г.Махачкала,на научной конференции в г.Астрахани 1996 г.

ПУБЛИКАЦИИ.

По теме диссертации опубликовано 8 научных статей.

НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ СЛЕДУЮЩИЕ

ПОЛОЖЕНИЯ:

1. Доказательство существования ранее неизвестных серо-варов вибрионов, неагглютинирующихся холерной 0-сывороткой;

2. Новые данные об антигенном строении изучаемых неагглю-тинирующихся вибрионов;

3. Технология получения монорецепторных диагностических вибрионных 0-агглютинирующих сывороток к 076, 078, 082 и 083 сероварам.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Работа содержит 158 страниц печатного текста, иллюстрирована 21 таблицами, 7 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, описывающей материалы и методы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего 426 источников, из них 244 работы отечественных и 182 зарубежных авторов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ:

ГЛАВА 1. СВОЙСТВА НЕАГГЛЮТИНИРУЩИХСЯ ВИБРИОНОВ И ИХ

АНТИГЕННОЕ СТРОЕНИЕ

Проблема заболеваний острыми кишечными инфекциями остается актуальной в связи с особенностями их широкого распространения по странам и континентам. За 33 года седьмой пандемии (1961 -1993 г.г.) зарегистрировано 316 876 случаев холеры в 145 странах.

При анализе динамики заболеваемости холерой за 5 лет (1989 - 1993 г.г.) выявлена сохраняющаяся тенденция роста, что обусловлено участившимися эпидемиями и спорадическими вспышками в странах Центральной и Южной Америки и активизацией холеры в ряде регионов Азии и Африки С62, 161, 166, 170, 279, 400].

Распад Советского Союза повлек за собой и разрушение многих отлаженных механизмов слежения за инфекционными заболеваниями, в том числе и достаточно эффективной в прошлом системы противохолерных мероприятий. В связи с этим на территории России эпидемиологическая обстановка по холере остается напряженной [84, 135, 170].

В настоящее время род Vibrio широко распространен и представлен 207 видами микроорганазмов. Являясь составной частью ау-тохромной микрофлоры, они играют важную роль в экологии водоемов. Вибрионы, патогенные для человека, вызывают диарейные или

системные инфекции, встречающиеся спородически или в виде пандемий. Вспышки чаще связаны с водой из водоемов.

Среди распространенных в природе вибрионов, по данным зарубежных исследователей, до 1992 года насчитывалось 137 серова-ров (от 2 до 138) в отечественной коллекции- 78. Эти микроорганизмы способны вызывать спородические заболевания или локальные вспышки диарей, связанные общим источником инфицирования.

»

Подтверждение причастности холерных вибрионов не 01 гр. к массовой заболеваемости было выявлено (по информации ВОЗ) в октябре 1992 г., в г.Мадрасе на юге Индии, где вспыхнула эпидемия холероподобного заболевания, которое по клиническому течению практически не отличалось от холеры С144, 251, 370, 4243.

В начале 1993 г. сходные эпидемии начались в Калькутте, Бангладеш с летальностью до 5 %. Выделенные от больных штаммы были идентичны и обозначены как новая серогруппа 0139 "Бенгал". По многим странам и континентам прокатилась эпидемия, вызванная штаммом 0139 не агглютинирующегося холерной 0 - сывороткой, имеющего ген холерного токсина (уси С170, 248, 286, 289, 293, 316, 319, 340, 349, 370, 371, 386, 391, 400, 412]. Интересно, что за несколько лет до выделения представителей 0139 серовара холерные вибрионы не 01 группы, содержащие ген холерного токсина, удавалось выявлять на территории бывшего СССР [52].

Отдельные зарубежные авторы высказавают предположение о начале 8-й пандемии по аналогии с ситуацией, сложившейся в начале 7-й пандемии холеры, когда в пределах одной серогруппы холерных вибрионов 01 фактически произошло вытеснение классического биовара вибрионами эльтор [349, 400].

Широкое распространение в природе вибрионов, не агглютини-

рующихся холерной 0-сыворотко^ известно давно С107, 148, 239, 249, 265, 274, 280, 282, 284, 299, 322, 330, 339, 362, 372, 374, 410, 411].

Вибрионы этой группы выделяют от больных острыми кишечными инфекциями, из различных объектов окружающей среды, сточных вод, гидробионтов, птиц и млекопитающих С2, 7, 13, 17, 43, 57, 78, 90, 95, 99, 101, 107, 110, 126, 130, 138, 139, 178, 180, 181, 182, 186, 187, 192, 193, 195, 197, 199, 207, 213, 216, 218, 225, 226, 249, 265, 274, 280, 285, 304, 316, 321, 332, 335, 343, 357, 362, 372, 378, 379, 380, 389, 402, 404].

Учитывая то, что холерные вибрионы не 01 группы широко распространены в природе и являются естественными обитателями водоемов, вода рассматривается как наиболее вероятный источник инфицирования населения, проживающего на побережьях рек, озер, заливов, морей и океанов, а также регионов с арычной системой водоснабжения. Такие территории обозначают как территории "риска", а лиц, занятых рыбной ловлей, работающих на рыбообрабатывающих предприятиях, широко использующих в пищу продукты моря, а также контаминированную холерными вибрионами не 01 воду относят к контингентам "риска". Следует отметить, что при спорадической заболеваемости доказать водный путь передачи часто не представляется возможным. Косвенным подтверждением реализации этого фактора передачи инфекции является в ряде случаев выделение от больных и из используемых водоемов холерных вибрионов тех же сероваров. Роль неагглютинирующихся вибрионов в патологии человека не вызывает сомнений. Кроме спорадических заболеваний они вызывают вспышки, а также вибрионосительство. Клинические проявления кишечных заболеваний, вызываемых неагглюти-

нирующимися вибрионами^ вариабельны. Преобладают формы болезни по типу энтерита или гастроэнтерита [4, 7, 29, 93, 94, 99, 109, 120, 153, 155, 164, 168, 178, 195, 200, 240, 241, 264, 270, 274, 304, 315, 328, 377, 378, 379, 381, 389, 394].

По описанным в литературе данным вибрионы не 01 группы вызывают случаи тяжелой формы диареи, по типу токсикозов с летальным исходом. Они могут протекать с клиникой запоминающей холеру, или^как в случае со штаммом 0139 серовара, неотличимой от нее [246, 257, 293, 319, 342, 376, 404, 412, 424, 446].

Вариабельность клинических проявлений заболеваний, обусловленных холерными вибрионами не 01 группы, свидетельствует о характерном для них многообразии факторов вирулентности. Это в полной мере относится к холерным вибрионам 01 и не 01 групп. Наряду с подвижностью, положительным хемотаксисом на компоненты слизистой тонкого кишечника, комплексом транспортных трофических и дйструктивных ферментов, эндотоксином, способностью к ко- v" лонизации и адгезии, важную роль в развитии диарей играет способность продуцировать различные токсины:термолабильный токсин, сходный, но не идентичный холерному энтеротоксину, цитолизин, гемолизин, шигоподобный токсин, Nag - ST - токсин, способствующие накоплению жидкости в кишечнике экспериментально зараженных животных, и.по-видимому, ответственные за развитие диареи у людей. В последние годы описаны штаммы холерных вибрионов не 01, содержащие в геноме vct+ ген, и экспрессируюпдае этот признак на экспериментальных моделях [62].

Выделение неагглютинирующихся вибрионов идет как в период

эпидемий, так и в межэпидемический период. Для заболеваний, обусловленных вибрионами не 01 группы, так же как и для холерных вибрионов характерна сезонность [2, 13, 95, 151, 153, 179, 213, 216, 274, 281, 357, 3733.

Из воды поверхностных водоемов неагглютинирующиеся вибрионы выделяются преимущественно в летне - осенний период времени [25, 26, 28, 41, 54, 154, 162, 172, 182, 221, 232, 287, 298, 333, 337, 373, 403, 404].

В зимний период высеваемость неагглютинирующихся вибрионов резко снижается [37, 55, 57, 112, 125, 133, 179, 359].

Приведенные выше данные свидетельствуют о существовании тесной связи между частотой заболеваний людей острыми кишечными инфекциям