Vibrio cholerae he 01/he 0139: генетическое картирование хромосомы и изучение возможности обмена генами О-антигена между холерными вибрионами разных серогрупп

Шопырева, Софья Витальевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Vibrio cholerae he 01/he 0139: генетическое картирование хромосомы и изучение возможности обмена генами О-антигена между холерными вибрионами разных серогрупп
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Vibrio cholerae he 01/he 0139: генетическое картирование хромосомы и изучение возможности обмена генами О-антигена между холерными вибрионами разных серогрупп"

На правах рукописи

;тб од

ШОПЫРЕВА Софья Витальевна ,.

2 ¿ МАЯ 2000

VIBRIO CHOLERAE НЕ Ol/HE 0139: ГЕНЕТИЧЕСКОЕ

КАРТИРОВАНИЕ ХРОМОСОМЫ И ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ОБМЕНА ГЕНАМИ О-АНТИГЕНА МЕЖДУ ХОЛЕРНЫМИ ВИБРИОНАМИ РАЗНЫХ СЕРОГРУПП

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 2000

Работа выполнена в Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Смирнова Н.И.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Щербаков A.A.

кандидат медицинских наук, старший

научный сотрудник Саяпина Л.В.

Ведущая организация:

Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный

институт

Защита состоится "31" мая 2000 г. в 1300 часов на заседании диссертационного совета Д074.32.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" Министерства здравоохранения Российской Федерации (410005 Саратов, Университетская, 46)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб"

Автореферат разослан апреля 2000г.

___________

р 7/л у. //'

доктор биологических наук, профессор Корнеев Г.А.

fw. /ьь, о

Ученый секретарь диссертационного совета/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Vibrio cholerae является гетерогенным видом, состоящим из штаммов, относящихся к 200 различным серогруппам, каждая из которых характеризуется своим собственным О-антигеном (Beitran et al., 1999). До недавнего времени холерные эпидемии вызывались лишь токсигенными штаммами V. cholerae серогруппы 01. Холерные вибрионы других серогрупп, не агглютинирующиеся холерной видоспецифической Ol-сывороткой (неагппотинирующиеся или НАГ-вибрионы), вызывали лишь локальные вспышки или отдельные случаи гастроэнтеритов, энтеритов, энтероколитов и т.д.. (Дунаев, 1974; Щуркина И.И., 1982; Воронежская Л.Г., 1994; Back et al.,1974; Finch et al.,1987; Ka-mal, 1971; Kaper et al., 1986; Morris et al., 1981; Safnn et al., 1988; Holl et al., 1993). Однако к настоящему времени установлено, что существует по крайней мере два эпидемически опасных штамма, имеющих не 01-антиген: V. cholerae 0139 (Бенгал) и V.cholerae 031. Результаты молекулярно-генетических исследований указанных возбудителей холеры свидетельствуют о возможном их происхождении от холерных вибрионов 01-серогруппы, у которых собственные гены 01-антигена в процессе горизонтального переноса генов были замещены генами 0139- или 037-антигена (Bik ,1995).

Появление эпидемически опасных штаммов среди V. choleraeae 01-серогруппы обусловило большой интерес исследователей к этим вибрионам, которые были обозначены как V. cholerae не 01/ не 0139. К настоящему времени известно о присутствии в их хромосоме мобильных генетических элементов, с которыми могут быть связаны события, приводящие к формированию штаммов с новыми свойствами. Так, в 1994 году A.Baker et al. впервые обнаружили в хромосоме V. cholerae не 01/не 0139 большое число копий (60-100 копий) прямо повторяющихся последовательностей VCR, которые являются интегрон-подобными структурами, обеспечивающими интеграцию чужеродной ДНК в хромосому вибрионов. (Mazel et al, 1998). Особый интерес представляют данные о том, что некоторые штаммы V. cholerae не 01/не 0139 содержат в хромосоме гены двух умеренных нитевидных фагов СТХф и УР1ф с ключевыми генами вирулентности возбудителей холеры 01- и 0139-серогрупп ctxAB и tcp, кодирующими биосинтез холерного токсина и ток-

син-корегулируемых пилей адгезии ( Karáolis et al., 1999, Nováis et al., 1999). Обнаружение таких штаммов с фагами СТХф и УР1ф среди природных штаммов V. choleras не 01/не 0139, которые в более чем 90,0 % случаев не имеют структурных генов холерного токсина, может, видимо, указывать на существование формальной возможности переноса генов ctxAB и tcp от возбудителей холеры в ранее нетоксигенные штаммы неагглютинирующихся вибрионов.

Второй путь формирования, токсигенных штаммов V. cholerae не 01/не 0139 может, видимо, состоять в приобретении вирулентными штаммами V. cholerae 01 и 0139 генов rfb, контролирующих биосинтез О-антигенов других серогрупп, от V. cholerae не 01/не 0139 в процессе конъюгации или трансдукции. Однако прямых доказательств наличия указанных процессов в природе пока нет. Что касается сведений, полученных в модельных опытах in vivo и in vitro, то их очень мало. Лишь в работах К. Bhaskaran (1971) и Е.А. Журавлевой, Н.И. Смирновой (1992) показано, что V. cholerae 01 могут быть реципиентами rfb генов V. cholerae не 01/не 0139. Однако донором этих генов был штамм, являющийся производным холерного вибриона эльтор, спонтанно утратившим способность продуцировать 01-антиген. В этой связи существует принципиальная необходимость дальнейшего экспериментального исследования вопроса о генетических связях природных штаммов V. cholerae не 01/не 0139 с возбудителями холеры 01- и 0139-серогрупп. Одним из основных путей его решения является генетическое картирование хромосомы V. cholerae не 01/не 0139 и сопоставление полученных данных с ранее построенными генетическими картами хромосом V. cholerae 01 и 0139. Но проведение таких исследований невозможно без предварительного создания конъюга-ционной системы, состоящей из эффективных донорных и полимар-кированных реципиентных штаммов V. cholerae не 01/не 0139. Разработка конъюгационной системы переноса генетической информации у этих вибрионов, которая до сих пор отсутствует, позволит также получить важные сведения о возможности перехода эпидемически опасных штаммов 01- и 0139-серогрупп в V. cholerae не 01/не 0139, сохранившие их вирулентные свойства.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - генетическое картирование хромосомы природного авирулентного штамма У:Ьпо сИокгаг не 01/не 0139 с помощью конъюгационных скрещиваний и изучение возможности обмена генами О-антигена между холерными вибрионами разных серогрупп.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. На модели природного авирулентного штамма V. сЪокгае 02-серогруппы разработать конъюгационную систему, состоящую из донорных и реципиентных штаммов.

2. На основе конъюгационных скрещиваний построить генетическую карту двух хромосомных участков природного авирулентного штамма V. сЪокгае 02; сопоставить генетические карты V. сИокгае различных серогрупп для выявления сходства или различий между ними.

3. Изучить возможность обмена генами О-антигена между V. с1ю!егае разных серогрупп; выяснить влияние чужеродных генов О-антигена на экспрессию собственных генов вирулентности в клетках нового хозяина.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Для генетического анализа природных штаммов V. сЬо1егае не 01/не 0139-серогруппы впервые создана конъюгационная система, состоящая из изогенных реципиентных и донорных штаммов. В хромосому штамма V. с1ю!егае 02-серогруппы введено 36 мутаций в гены, контролирующие биосинтез различных аминокислот, оснований и витаминов, а также О-антигена и термолабильного гемолизина. Донорные штаммы, сконструированные с помощью бинарной системы Тп5-МоЬ-рКР4-4, соответствуют Шг-типу и имеют различные точки начала переноса хромосомы.

В результате использования разработанной конъюгационной системы впервые построена генетическая карта двух участков хромосомы природного авирулентного штамма V. сИокгае не 01/не 0139, включающая 22 генетических маркера. Сравнительный анализ генетических карт холерных вибрионов разных серогрупп (01, 0139, не 01/не 0139) выявил их значительное сходство. Установлена также локализация на хромосоме V. сИокгае не 01/не 0139 г/5-генов, контролирующих биосинтез О-антигена, вблизи генов ига, //у, риг. Эти

данные в сравнении, с результатами работ по картированию генов 01- и 0139-антигенов дают основание заключить, что независимо от серогруппы и эпидемической значимости различных штаммов холерных вибрионов гены О-антигенов расположены в одной и той же области хромосомы.

Новыми являются данные о переносе и экспрессии генов, контролирующих синтез О-антигена, от природных авирулентных штаммов V. cholerae не 01/не 0139 к токсигенным штаммам V. cholerae

01-серогруппы биоваров классического и эльтор в условиях in vivo и in vitro, а также к возбудителю холеры новой 0139-серогруппы. Установлено, что чужеродные гены О-антигена не влияют на экспрессию собственных генов вирулентности в клетках нового хозяина. Полученные результаты вносят существенный вклад в изучение механизма формирования токсигенных нсагглютинирующихся вибрионов, позволяя полагать, что в природных условиях источником таких штаммов могут быть вирулентные штаммы V. cholerae 01 и 0139, поскольку последние могут приобретать гены О-антигенов других серогрупп.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Депонирована в Государственной Коллекции Патогенных Бактерий РосНИПЧИ "Микроб" созданная коллекция изогенных штаммов V. cholerae не 01/не 0139, состоящая из двух Hfr-доноров с различными точками начала переноса хромосомных маркеров и восьми реципиентов, несущих мутации в генах, контролирующих различные факторы роста, О-антигена, термолабильного гемолизина.

Созданная уникальная коллекция штаммов является основой для последующего генетического анализа хромосомы неагглютинирующихся вибрионов и конструирования штаммов с заданными свойствами.

Сконструированные на основе вирулентных штаммов V. cholerae 01 и 0139 токсигенные штаммы V. cholerae не 01/не 0139 применяются в молекулярно-эпидемиологических исследованиях ряда лабораторий РосНИПЧИ "Микроб" для выяснения их роли в эпидемическом процессе при холере.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. На модели природного авирулентного штамма V. cholerae

02-серогруппы создана конъюгационная система переноса хромосомных генов, состоящая из донорных и реципиентных штаммов. Донорные

штаммы типа Hfr имеют разные точки начала переноса хромосомы. Полимаркированные штаммы несут мутации не только в генах, контролирующих биосинтез различных факторов роста (аминокислот, оснований, витаминов), но и в генах, определяющих биосинтез О-антигена и термолабильного гемолизина.

2. Построена генетическая карта двух участков хромосомы природного авирулентного штамма V. cholerae 02-серогруппы, на которой определена локализация 22 генов, участвующих в биосинтезе различных факторов роста, а также О-антигена.

3. Хромосомные гены ф02, контролирующие синтез 02-антигена природного авирулентного штамма V. cholerae 02, могут передаваться при конъюгации in vitro и in vivo в клетки токсигенных штаммов V. cholerae 01 классического и эльтор биоваров. Эффективная экспрессия генов rjb02 в новом хозяине не влияет на его вирулентные свойства, что приводит к формированию патогенных штаммов V. cholerae не 01/не 0139.

4. Возбудитель холеры новой 0139-серогруппы, содержащий гены холерного токсина ctxAB, может приобретать гены rfb V. cholerae не 01/не 0139 в коньюгационных скрещиваниях. В клетках нового хозяина чужеродные гены rjb не влияют на экспрессию изученных факторов вирулентности.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены на Российской научной конференции, Волгоград, 1992; на научно-практической конференции, посвященной 100-летто образования противочумной системы, Саратов, 1997.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 173 страницах машинописного текста, состоит из введения, двух глав обзора литературы, четырех глав собственных исследований ( в т.ч. одной главы с описанием материалов и методов), заключения и выводов. Работа иллюстрирована 8 рисунками и 23 таблицами. Список литературы включает 67 отечественных и 173 зарубежных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штаммы бактерий. Использовали природные и генетически маркированные штаммы, производные E.coli, V. cholerae Ol (569В, Дакка35, ЯК79), V. cholerae 0139 (Р16064), V. cholerae не Ol/не 0139 (19306). Часть штаммов получена из отечественных и зарубежных лабораторий, многие штаммы сконструированы в процессе работы.

Методы. В разделе содержится описание бактериологических методов, использованных при исследовании свойств холерных вибрионов 01- и не 01- серогрупп; иммунологических - иммуноферментного метода Gmi ELISA; генетических методов - индуцированного нитрозогуанидином мутагенеза, конъюгации, картирования хромосомных генов; молекуляр-но-бнологическнх - скрининг плазмидной ДНК, ДНК-ДНК гибридизация. Вирулентность и холерогенность определяли путем внутрикишечного заражения крольчат-сосунков и взрослых кроликов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Создание системы конъюгационного переноса хромосомных генов Vibrio cholerae не Ol/не 0139

Отсутствие к настоящему времени сведений о генетической организации природных штаммов V. cholerae не 01/не 0139 обусловлено, в первую очередь, тем, что до сих пор не создана эффективная система конъюгационного переноса хромосомных генов для этого вибриона. В этой связи основная задача состояла в конструировании эффективных донорных штаммов типа Hfr и получении набора полимаркированных штаммов, которые могли быть использованы как штаммы-реципиенты. В качестве модельного был взят авирулентный штамм 02-серогруппы V. cholerae 19306 pur, Н1у+, выделенный из внешней среды в 1971 г. в Астрахани, у которого, как было показано методом ДНК-ДНК гибридизации с СТ-зондом, отсутствовали структурные гены холерного токсина ctxAB. В результате многоэтапной обработки клеток штамма 19306 pur"Hly+StrR нитрозогуанидином (НГ) по методу Adelberg et al. (1965), получено 35 штаммов, несущих 3-7 мутаций в генах, контролирующих

:интез различных аминокислот, оснований и витаминов, а также гермолабильного гемолизина. Частота реверсии к прототрофности не тревышала 10"8-10~9.

Кроме того, одним из важных результатов явилось выделение клонов : мутациями в генах г1Ъ02, контролирующих биосинтез 02-антигена. С получением таких мутантов открывается возможность определения локализации на хромосоме генов, определяющих биосинтез одного из основных факторов иммуногенности. Характеристика некоторых реци-пиентных штаммов представлена в табл. 1.

Таблица I

Полиауксотрофные мутанты штамма 02-серогруппы V. с!ю1егае

19306 риг-101 БЬ*, полученные с помощью нитрозогуанидина

Штамм

Характеристика

КМ1228

КМ1251

КМ1489

КМ1480

КМ1509

КМ1468

КМ1451

КМ1461

КМ1453

КМ1465

КМ759

КМ1555

КМ1551

КМ1553

КМ1556

FCM1568

Ш1567

КМ1573

риг-10 риг-10 риг-10 риг-10 риг-10 риг-10 риг-10 риг-10 риг-10 риг-10 риг-10 риг-10 риг-10 риг-10 риг-10 риг-10 риг-10 риг-10

mei-102 trp-101 bio-101 Hly" trp-101 asp-103 cys-109 bio-101 Hly" thi-105 Hly" thi-105 leu-104 Hly" leu-104 ura-102 arg-102 Hly"

ile-101 ile-101

ile-101 leu-104 his-103 ile-101 ile-101 thi-105 his-102 met-101 ura-101 Hly" his-102 met-101 lys-102 Hly" his-102 met-101 ilv-102 Hly" his-102 met-101 cys-109 Hly" his-102 met-101 leu-101 Hly" ile-101 val-101

his-102 met-101 ura-101 Bir101 Hly" his-102 met-101 ura-101 arg-108 Hly" his-102 met-101 ura-101 ilv-105 rfl-101 Hly" his-102 met-101 ura-101 М-106Щ' his-102 met-101 ura-101 B12-101 aro-102 Hly" his-102 met-101 ura-101 Bn-101 trp-103 Hly" his-102 met-101 ura-101 B,r101 asp-102 Hly"

Донорные штаммы были сконструированы не традиционным способом, основанным на интеграции в хромосому коньюгативной плазмиды, а с помощью бинарной системы, состоящей из транспозона Tn5-Mob (KmR) и плазмиды-помощника pRP4-4 (ApRTcR) с tra-опероном, которая требует включения в хромосому лишь указанного Tn-элемента, несущего участок oriT из плазмиды pRP4 (KmRApRTcR) (Simon R.,1984). Вектором для введе-

ния в клетки исходного штамма 19306 pur Strs и его прототрофного производного КМ734 Strs транспозона Tn5-Mob служила плазмида pSUP5011, которая была передана коньюгативным путем из штамма Escherichia coli S17-1 (pSUP5011). Для: внедрения транспозона Tn5-Mob в хромосому НАГ-вибрионов, трансконъюганты были помещены в неблагоприятные условия, при которых бесплазмидные клетки получили бы селективное преимущество по сравнению с клетками, несущими плазмиду pSUP5011 (Бельков, 1983; Кутырев с соавт., 1982). Для этого штаммы 19306 pur (pSUP5011) и КМ734 (pSUP5011) выращивали при +4 °С в жидкой минимальной среде с добавлением канамицина, резистентность к которому обусловливает Тп5-Mob. В результате были выделены клоны, утратившие плазмидные маркеры резистентности к антибиотикам (ApR CmR), но сохранившие устойчивость к канамицину, определяемую транспозоном, что было подтверждено с помощью электрофореза в агарозном геле.

Для дальнейшей работы было произвольно выбрано по 6 KmR Aps Cms клонов 19306 pur chr::Tn5-Mob и KM734 chr::Tn5-Mob, несущих независимые внедрения транспозона Tn5-Mob в хромосому. Поскольку Tn5-Mob характеризуется низкой специфичностью транспозиции и может внедряться во многие сайты генома (Simon, 1984), то введение плазмиды-помощника pRP4-4 (Kms ApR TcR) в клетки указанных клонов позволяло надеяться на получение донорных штаммов с различными точками начала и направления переноса. Указанная плазмида-помощник была введена в клетки штаммов 19306 pur chr::Tn5-Mob и КМ734 chr::Tn5-Mob путем коныогационных скрещиваний их с донором плазмиды pRP4-4 штаммом E.coli С600 (pRP4-4). Селективной служила среда с добавлением канамицина и ампициллина. Контрселекция донора осуществлялась присутствием в среде канамицина. Частота переноса плазмиды в штаммы 19306 pur chr::Tn5-Mob (6 скрещиваний) и КМ734 clir::Tn5-Mob (6 скрещиваний) была примерно одинаковой и составляла 5 х 10'3 - 2 х 10'5. Все проверенные трансконъюганты (по 100 клонов от каждого скрещивания), помимо маркера транспозона Tn5-Mob (KmR), несли и маркеры плазмиды pRP4-4 (ApR TcR). Изучение плазмидного состава некоторых произвольно выбранных трансконъюгантов 19306 pur KmR ApR TcR и KM734 KmR ApR CmR с помощью электрофореза в агарозном геле показало присутствие у них плазмиды, соответствующей по мол. массе плазмиде pRP4-4.

Итак, в результате проведенных экспериментов на основе двух штаммов V. cholerae 02 получен ряд клонов 19306 pur Str5 chr::Tn5-Mob (pRP4-4) и KM734 Strs chr::Tn5-Mob (pRP4-4), которые могли обладать

донорными свойствами. При этом независимые внедрения транспозона To5-Mob в хромосому V. cholerae не 01/не 0139 позволяли полагать о том, что донорные штаммы могут иметь разные точки начала переноса хромосомы. Для проверки указанного предположения 24 независимо полученных клона 19306 chr::Tn5-Mob (pRP4-4) проверяли на донорные свойства в скрещиваниях с полиауксотрофным штаммом 02-серогруппы V. cholerae КМ1467 pur-101 his-102 met-101 arg-104 StA Анализ полученных данных свидетельствует о том, что вопреки ожидаемым результатам о внедрении транспозона Tn5-Mob в разные участки хромосомы, что определило бы получение донорных штаммов с различными точками начала переноса, во всех случаях внедрение транспозона произошло, видимо, в одно и то же место вблизи генов met и his, поскольку эти маркеры наследовались с большей частотой по сравнению с маркером arg. Эти данные, противоречащие известным сведениям о низкой сайт-специфичности внедрения транспозона Tn5-Mob в хромосому многих бактерий, можно, вероятно, объяснить тем, что в хромосоме V. cholerae не 01/не 0139 в отличие от других микроорганизмов имеется предпочтительный сайт интеграции этого мигрирующего элемента вблизи локусов met - his. Более того, предпочтительность внедрения транспозона Tn5-Mob отмечалась ранее и для хромосом штаммов V. cholerae Ol- и 0139-серогрупп (Журавлева, 1993; Давыдова, 1993; Чеховская, 1997; Щелканова, 1998).

Таким образом, были получены донорные штаммы, осуществляющие направленный перенос хромосомных маркеров и имеющие точку начала переноса бактериального генома вблизи генов his-met. Один из штаммов, обозначенный как КМ1560, был выбран для дальнейших экспериментов.

Аналогичным образом проверяли донорные свойства четырех независимо полученных клонов КМ734 chr::Tn5-Mob (pRP4-4). Оказалось, что у трех из них точка начала переноса была также локализована вблизи генов his-met. В то же время было обнаружено, что один клон, обозначенный как КМ2340, имеет, видимо, другую точку начала переноса хромосомы за счет включения транспозона Tn5-Mob в иной ее участок. Наиболее высокая частота образования селектируемых рекомбинантов класса Arg+ позволяет полагать о локализации точки начала переноса хромосомы вблизи гена arg.

Итак, итогом нашей работы по созданию конъюгационной системы переноса хромосомных генов на модели природного авирулентного штамма 02-серогруппы V. cholerae 19306 явилось конструирование эффективных донорных штаммов типа Hfr с двумя различными точками начала переноса хромосомы, а также получение коллекции множественномаркированных штаммов-реципиентов.

2. Генетическое картирование хромосомы природного штамма V. cholerae не 01/не 0139 с помощью созданных донорных и реципиентных штаммов

Создание донорных и реципиентных штаммов обеспечило реальную возможность генетического картирования хромосомы V. cholerae 02. Для проведения этих исследований мы проводили гомологичные скрещивания донорных штаммов КМ1560 и КМ2340 с 35 полимаркированными штаммами. У полученных рекомбинантов определяли показатели сцепленности селектируемых маркеров с неселектируемыми, на основе которых затем были определены относительные расстояния RD (от англ. relative distans) между генами в условных единицах по описанному ранее способу Parker et al. (1979). Показатели сцепленности генов между собой определялись в каждом скрещивании, однако в табл.2 приведены результаты, полученные лишь в скрещивании донорного штамма КМ2340 с реципиентом КМ1544.

Таблица 2

Показатели сцепления селектируемых и неселектируемых маркеров донорного штамма 02-серогруппы V. cholerae КМ2340 при скрещивании его с реципиентным штаммом 02-серогруппы V. cholerae КМ1544

Реципиент-ный штамм Селектируемый маркер Неселекгируемый маркер, с которым устанавливается сцепление Показатели сцепленности селектируемых маркеров с неселектируемыми RD*"

Кол-во % LF"

1 2 3 4 5 6 7

КМ1544 риг-101 ilv-102 73/130 56,15 0,56 0,58

arg-104 43/130 33,08 0,33 1,13

ilv-102 piir-101 80/120 66,66 0,66 0,42

arg-104 68/120 56,66 0,56 0,58

arg-104 pur-JOl 30/100 30,00 0,30 1,20

ilv-102 20/100 20,00 0,20 1,61

* В числителе - число рекомбинантов, получивших неселектируе-мый маркер донора, в знаменателе - число рекомбинантов с селектируемым маркером.

** и - отношение числа рекомбинантов с неселектируемым маркером к числу рекомбинантов с селектируемым маркером.

*** КО - относительное расстояние между генами, определенное по уравнению СЬ.Рагкег е1 а\. (1979): 1Ш=1п(1/ЬР). При определении КБ учитывали ЬР>0,01.

Таким образом, в результате анализа более 20000 различных рекомбинантов была впервые построена генетическая карта двух хромосомных участков природного штамма V. сИо1егае 02-серогруппы, на которой определено местоположение 21 гена, кодирующего биосинтез аминокислот, оснований и витаминов (рис.1). Особый интерес, на наш взгляд, представляют данные о локализации на хромосоме V. сЪо1егае не 01/не 0139 природной мутации риг-101, поскольку ранее среди других штаммов V. сЬокгае 01, 0139 и не 01/не 0139-серогрупп, выделенных из окружающей среды или от больных холерой, были обнаружены штаммы, также имеющие мутации в гене риг, Более того, результаты проведенного ранее генетического картирования таких природных мутаций у V. сИо!егае 01 биовара эльтор (штамм Ю/79) и его производных, а также у V. сИо1егае 0139 (штамм Р07) показали, что и у этих штаммов указанная мутация риг локализована в хромосоме также вблизи гена /7у, контролирующего биосинтез изолейцина и валина (Смирнова, 1989; Журавлева, 1993; Щелканова, 1998). Эти данные, видимо, могут свидетельствовать о том, что возникновение фенотипически одинаковой мутации, локализованной в определенном участке хромосомы у разных штаммов холерного вибриона, отличающихся друг от друга серогруппой, местом и временем выделения, может быть следствием одного и того же генетического события.

-Г т тчнч го*- К Г п й ? ООООг г о о 2

00 * 00 О " г

о"о

. о г о О

- - ггг ГГ г

V ' Г 1 г ,< г III II I

А в А0 а ^- - очоз е а

^ЗЕЯг 0.5 5 ЯЯ Я.2 0. Л

\\\\ /

и л

п о

Й N

0 0 г

г г

о о

Г Г £ £

Г1 г р>

0 • 0 0

г т* 1 т-

0 11 0

и 0 Е к. (0

Рис.1. Генетическая карта хромосомы штамма 02-серогруппы V. сЪо1егае 19306, составленная на основе результатов конъюгационных скрещиваний донорных и реципиентных штаммов.

Обнаружение эпидемических штаммов холерного вибриона не 01-серогрушш (V. cholerae 0139 и V. cholerae 037), обусловило повышенный интерес исследователей к изучению структуры хромосомной области, содержащей гены rfb, кодирующих биосинтез О-антигена. Однако данных о локализации генов rfb на генетической карте хромосомы природных штаммов V. cholerae не 01/не 0139 до сих пор нет.

Для определения местоположения генов rfb, контролирующих биосинтез 02-антигена, были проведены конъюгационные скрещивания донорных штаммов КМ1560 и КМ2340 с реципиентным штаммом КМ1553 pur-101 his-102 met-101 ura-101 ilv-105 rfb-101 Sti*, которые отличались друг от друга по антигенным свойствам. Донорные штаммы имели 02-антиген, агглютинируясь моноспецифической О-агглютинирующей сывороткой против вибрионов 02 серовара. В то же время полиауксотрофный штамм-реципиент КМ1553 в результате мутации одного из генов rfb приобрел способность продуцировать шероховатый или RO-антиген, поскольку этот штамм, в отличие от доноров, агглютинировался холерной RO-сывороткой. Введенная в хромосому мутация получила обозначение rjb-101. Так как V. cholerae не 01/не 0139 согласно точке зрения ряда исследователей могли возникнуть в результате различных мутаций в rfb-локусе V. cholerae 01, мы предположили, что гены rfb неагглютинирующихся вибрионов могут находиться в том же участке хромосомы, что и гены rfbOl, т.е. вблизи генов ilv, pur, ига. Поэтому в скрещиваниях указанных донорных штаммов с реципиентом КМ1553 мы анализировали следующие селектируемые классы рекомбинантов: Ilv+, Pur+, Ura+. В каждом из классов рекомбинантов определяли частоту наследования неселектируемых донорных маркеров, в том числе донорного аллеля rfb02. Наследование аллеля г]Ь02 выявляли путем агглютинации рекомбинантов RO-сывороткой на стекле. Рекомбинанты, получившие ф02, что определялось утратой способности агглютинироваться холерной RO-сывороткой, изучали затем на антигенные свойства в развернутой реакции агглютинации с моноспецифической холерной 02-сывороткой и холерной сывороткой R0 в пробирках. На основании данных о наследовании селектируемыми классами рекомбинантов неселектируемого маркера rfb-101 был сделан вывод о местоположении на хромосоме генов rfb02. Оказалось, что рекомбинанты всех трех изученных классов (Pur+, Ura+, Ilv4), полученных при скрещива-

ниях КМ2340 с КМ1553, наследуют донорный аллель ф02 с довольно высокой частотой. При этом наиболее высокий показатель сцепления rfb02 обнаружен с маркером ига-101 (74,74 %). В то же время маркер ига-101 тесно сцеплен с маркером ilv-105 (44,71-64,14%). При этом ген ига-101 является, видимо, дистальмым относительно точки начала переноса по сравнению с другими селектируемыми маркерами, поскольку частота наследования Ura+ рекомбинантами остальных маркеров всегда превышала показатели сцепления ilv-105 и риг-101 с маркером ига-101.

В целом полученные данные позволяют предположить следующий порядок генов на хромосоме V. cholerae не Ol/не 0139: ori...риг-101 - ilv-105 - ф-101 - ига-101.

Это предположение подтверждают результаты скрещиваний того же реципиента КМ1553 с другим донором КМ1560, у которого, как уже указывалось, точка начала переноса хромосомы локализована вблизи генов met и his.

Таким образом, установлено, что гены ф02, ответственные за биосинтез О-антигена, располагаются в той же хромосомной области (вблизи генов ilv, риг, ига), что и гены rjb, контролирующие у V. cholerae 01 и К cholerae 0139 продукцию 01- и 0139-антигенов, соответственно.

3. Обмен генами ф, контролирующими биосинтез О-антигена, между холерными вибрионами разных серогрупп

На основании полученных нами данных о значительном сходстве //¿-областей у V. cholerae 01-, 0139- и не Ol/не 0139-cepoipynn следует, видимо, полагать, что при совместном их обитании в тонком кишечнике человека или животных может происходить перенос генов ф не 01/не 0139 в клетки вирулентных штаммов холерных вибрионов 01-серогруппы, приводящий к образованию токсигенных штаммов V. cholerae не 01/не 0139. В этой связи изучение возможности конътогационного переноса генов ф от К cholerae 02-серогруппы к эпидемическим штаммам V. cholerae 01-серогруппы и V. cholerae 0139-серогруппы представляют, на наш взгляд, большой интерес.

Первые этапы наших исследований в этом направлении были связаны с выбором модели и методов, с помощью которых могла проводиться работа. В результате анализа серологических, токсигенных и вирулентных свойств различных полиауксотрофных штаммов V. cholerae

01, имеющихся, в лабораторной коллекции . и полученных при многоступенчатой обработке клеток НГ, в качестве реципиентных были взяты три штамма, относящиеся к разным биоварам и сероварам: КМ1937 his-54 îrp-54 pur-54 ilv-64 arg-62 Str* (производный штамма V. cholerae 569В Инаба классического биовара), КМ2274 ига- 90 ilv-90 Str* (производный штамма V. cholerae Дакка35 Огава классического биовара) и КМ800 pur-80 his-80 trp-87 ile-80 val-80 ura-80 Str* (производный штамма V. cholerae RV79 Огава биовара эльтор). Донором служил авирулентный нггамм 02-серогруппы V. cholerae КМ1560, не продуцирующий холерный токсин из-за отсутствия в его хромосоме структурных генов clxAB .

Кроме того, была разработана система отбора рекомбинантов, которые получили от донора неселектируемые гены ф02. Принимая во внимание полученные нами и другими исследователями данные о локализации генов ф в хромосомной области, содержащей строго определенные гены, для решения поставленной задачи мы отбирали и -анализировали лишь следующие селектируемые классы рекомбинантов, полученные при скрещивании указанных донорных и реципиентных штаммов: Ilv+, Ue+, Vaf, Arg+, Pur+, Ura+. Далее, наследование этими рекомбинантами неселекгируемого донорного маркера ф02 определяли путем агглютинации их на стекле холерной диагностической 01-антисывороткой, поскольку этот признак является более легко определяемым по сравнению с другими серологическими свойствами. Рекомбинанты, получившие донорный - аллель ф02, утрачивали способность агглютинироваться холерной 01-сывороткой, но приобретали способность агглютинироваться моноспецифической 02-сывороткой. Затем наследование донорного локуса ф02 рекомбинантами подтверждалось в развернутой реакции агглютинации в пробирках со всеми видо- и серовароспецифическими 01-антисыворотками (О, R0, Инаба, Огава), а также с антисывороткой к неагглютинирующимся вибрионам 02-серогруппы.

В результате конъюгационных скрещиваний между донорным штаммом КМ1560 и реципиентным штаммом КМ1937 his-54 trp-54 pur-54 ilv-64 arg-62 Str11 Инаба (классический биовар) было получено два класса рекомбинантов: Ilv+ и Arg+. Частота совместного наследования донорных генов arg и ilv+ в этих гетерологичных скрещиваниях была невысока и составила при отборе рекомбинантов по селектируемому маркеру arg -

0,57 %, а по селектируемому маркеру ilv+ - 2,87 %. Оба класса рекомбинантов, как и предполагалось, действительно наследовали в качестве неселектируемого маркера донорный аллель rfb02. Среди проверенных 222 рекомбинантов класса Arg+ 42 рекомбинанта (18,96 %) не агглютинировались Ol-сывороткой, т.е. были 01". Среди 174 рекомбинантов класса Ilv+ было обнаружено лишь 7 рекомбинантов Ilv+ 01 ~ (4,02 %). Аналогичная картина была получена и при скрещивании донора КМ1560 с V. cholerae 01 классического биовара серовара Огава.

Таким образом, проведенные эксперименты показали на возможность переноса генов rfb, контролирующих биосинтез не Ol/не 0139-антигена, от природных штаммов неагглютинирующихся вибрионов к V. cholerae 01 классического биовара.

С целью получения данных о возможности переноса генов rfb О2 к V. cholerae 01 биовара эльтор проводили конъюгационные скрещивания донора КМ1560 с реципиентным штаммом эльтор КМ800 pur-80 his-80 trp-87 ile-80 val-80 ura-80 Str1* Огава. Из трех селектируемых классов рекомбинантов, Ura+, Ile+, Val+, лишь два - 11е+ и Val+ наследовали маркер rfb02 . Вследствие, видимо, очень тесной сцепленности маркеров Не* и vaí* между собой на хромосоме как V. cholerae OI, так и V. cholerae не Ol/не 0139, в проведенных нами гетерологичных скрещиваниях эти два маркера одновременно наследуются рекомбинантами классов 11е+ и Val+ в 99,0100 % случаев . Частота наследования рекомбинантами 11е+ и Val+ rfb02 маркера была приблизительно одинаковой и составила в случае рекомбинантов 11е+ - 20 %, а в случае рекомбинантов Val+ - 17,6 %.

Поскольку холерные вибрионы разных серогрупп могут совместно обитать в организме человека или животных, то можно предполагать, что перенос хромосомных генов из одной клетки холерного вибриона в другие может происходить, видимо, и в условиях in vivo. Для подтверждения этого предположения мы ввели белым мышам внутрибрюшинно клетки донорного (КМ1560) и реципиентного (КМ1937) штаммов в соотношении 1:1. Через 18 часов был сделан высев из внутрибрюшинной жидкости на селективные чашки. Оказалось, что в условиях in vivo также происходит перенос хромосомных генов rfb от неагглютинирующихся вибрионов к возбудителю холеры Ol-серогруппы. Так, среди 23 рекомбинантов, отобранных по селектируемому маркеру arg, 2 Arg+ клона наследовали донорный аллель rfb02.

Положительные результаты, полученные нами по передаче генов 0-антигена от V. cholerae не 01/не 0139. к V. cholerae 01, позволили предположить возможность переноса указанных генов в обратных скрещиваниях, т.е. от холерных вибрионов 01- к холерным вибрионам не 01/не 0139-серогруппы. С целью подтверждения наших предположений были проведены коньюгационные скрещивания. В качестве доноров были выбраны два штамма V. cholerae 01, у которых точка начала переноса хромосомы была локализована вблизи гена ilv: КМ2075 Огава биовара эльтор и КМ2251 Инаба классического биовара (Давыдова, 1993). Реципиентами служили два штамма 02-серогруппы, производные V. cholerae 19306, несущие мутации в генах pur, ilv, ile, ига, локализованных в r/Ъ-области его хромосомы : КМ1552 pur-101 his-102 met-101 ura-101 ile-103 Sh*; KM1553 pur-101 his-102 met-101 ura-101 ilv-105 rfb-101 Str*. Контрселекцию доноров осуществляли путем добавления в селективную среду стрептомицина.

В результате были получены следующие классы рекомбинантов: Pur+, Ura+, Ile+, Пу+, которые затем проверяли на наследование неселектируемых маркеров. Наследование донорного аллеля rfbO 1 определяли с помощью агглютинации клеток на стекле холерной диагностической 01-антисывороткой.

Оказалось, что наследование рекомбинантами селектируемых маркеров ауксотрофности донора V. cholerae КМ2075 биовара эльтор происходило примерно с такой же частотой, как и в скрещиваниях донора 02-серогруппы V. cholerae КМ1560 с реципиентом Ol-серогруппы V. cholerae КМ800 биовара эльтор (n х Ю"6 - n х 10~5). Однако, несмотря на довольно высокое сцепление маркеров ауксотрофности риг+ и ile+ (34,66 % и 22,0 %) в скрещиваниях донора V. cholerae КМ2075 с реципиентом V. cholerae КМ1552 и маркеров риг и ilv (41,00 % и 35,97 %) в скрещиваниях донора V. cholerae КМ2075 с реципиентом V. cholerae КМ1553, ни один из полученных рекомбинантов не наследовал донорный аллель rfbOl.

Неудачной оказалась попытка передачи генов rfbOl в V. cholerae 02-серогруппы и при использовании в качестве донора штамма 01-серогруппы V. cholerae КМ2251 классического биовара. Частота возникновения селектируемых классов рекомбинантов (n х 10~7) была заметно ниже таковой при скрещиваниях донора 02-серогруппы с

реципиентом V. cholerae 01 классического биовара. Более того, показатели совместного наследования селектируемых и неселектируемых маркеров ауксотрофности были также в целом невысоки. Изучение серологических свойств показало, что и в этих скрещиваниях ни один из полученных рекомбинантов не агглютинировался холерной диагностической 01-антисывороткой . Это указывает на отсутствие переноса генов 01-антигена в штаммы V. cholerae не 01/не 0139.

Таким образом, использование сконструированного нами эффективного донорного штамма 02-серогруппы V. cholerae КМ1560 позволило получить данные о том, что по крайней мере в условиях эксперимента происходит перенос хромосомных генов rjb от авирулентных штаммов V. cholerae не 01/не 0139 ктоксигенным штаммам V. cholerae 01 обоих биоваров. Это событие приводит к формированию штаммов, утративших такое основное свойство возбудителя холеры, как агглютинабельность холерной 01-антисывороткой, но сохранивших в хромосоме гены холерного токсина.

С целью изучения возможности обмена генетической информацией между V. cholerae 02 и V. cholerae OI39 были использованы сконструированные доноры 02-серогруппы КМ1560 и КМ2340, которые, как указывалось выше, отличались друг от друга разными точками начала переноса хромосомных маркеров. В качестве реципиентов V. cholerae 0139 были выбраны полученные ранее в лаборатории (Чеховская, 1997) полиауксотрофные токсигенные штаммы, которые несли мутации в определенных генах (ига, lys, ilv, pur, arg), локализованных вблизи генов фО!39: КМ2363 lys-90 ura-90 ilv-95 StrR, KM2364 pur-90 ura-90 his-90 arg-90 ilv-90 Sti*.

Наследование маркера г/Ю139 определяли путем агглютинации на стекле клеток различных классов рекомбинантов с поликлональной 0139-аптисывороткой и с антисывороткой к неагглютинирующимся вибрионам 02-серогруппы.

В результате конъюгационных скрещиваний были получены селектируемые классы рекомбинантов Lys+, Ura+, Ilv+, Arg+, Pur+, частота образования которых составляла n х 10' - n х 10". Изучение серологичесюгх свойств указанных рекомбинантов показало, что перенос генов ф02 в клетки V. cholerae 0139 действительно возможен. Среди Lys+, Ura+ и Ilv+ клонов были обнаружены рекомбинанты, утратившие

способность агглютинироваться О139-антисывороткой, но агглютинирующиеся 02-антисывороткой. Анализ полученных данных позволил определить примерную область локализации генов ф02 между ига* и ilv* маркерами.

Таким образом, показано, что ' конъюгационный перенос генов, контролирующих биосинтез О-антигена, может происходить, от авирулентных штаммов V. cholerae не 01/ не 0139 к возбудителям холеры новой 0139-серогруппы, в результате чего формируются штаммы неагглюгинирующихся вибрионов, содержащие структурные гены холерного токсина.

Для определения возможности обратного переноса генов rfb были также проведены конъюгационные скрещивания. Донором служил ранее сконструированный Hfr-штамм 0139-серогруппы КМ2362 (Чеховская, 1997). Реципиентами были выбраны 3 полимаркированные штамма, производные холерного вибриона 02-серогруппы 19306, которые несли мутации в генах ауксотрофности ига, ilv, lys, pur, локализованных в интересующей нас r/Ь-области: КМ1553 pur-lQl his-102 met-101 ura-101 ilv-105 Str* Rif; KM1008 pur-101 his-101 met-101 ilv-101 lys-101 Sti* Rif; KM1568 pur-101 his-102 met-101 ura-101 aro-102 Str* Rif. Контрселекцию донора осуществляли добавлением в селективную среду рифампицина. Селектируемые классы рекомбинантов Lys+, Ilv+, Pur+, Ura+ образовывались с частотой n х 10"7 - n х 10~5, но при их серологическом анализе (изучено всего 676 рекомбинантов) не было обнаружено ни одного клона, агглютинирующегося холерной О139-антисывороткой . Из этого следует, что перенос генов г/Ь0139 не происходит. При этом нужно отметить более слабую сцепленность маркеров ауксотрофности между собой по сравнению с этими показателями, полученными в скрещиваниях донорного штамма 02-серогруппы и реципиента 0139-серогруппы.

Таким образом, показано, что перенос хромосомных генов rfb от авирулентных штаммов неагглютинирующихся вибрионов может происходить не только к традиционным возбудителям холеры 01-серогруппы, но и к возбудителю холеры новой 0139-серогруппы. Эти данные, во-первых, свидетельствуют о том, что перенос rfb генов может быть одной из причин О-антигенной вариабельности холерных вибрионов. Во-вторых, приобретение генов не 01/ не 0139-серогрупп токсигенными пггаммами возбудителя холеры как 01-, так и 0139-серогрупп, возможно,

является одним из реальных путей формирования природных штаммов неагглготинирующихся вибрионов, содержащих в хромосоме гены холерного токсина ахАВ.

ВЫВОДЫ

1. На модели природного авирулентного штамма V. скокгае не 01/не 0139, относящегося к 02-серогруппе, разработана конъгогационная система переноса хромосомных генов, состоящая из донорных штаммов типа Н& с различными точками начала переноса хромосомы, а также полимаркированных реципиентных штаммов, несущих мутации в генах, контролирующих синтез различных аминокислот и оснований, О-антигена, термолабильного гемолизина.

2. В результате использования созданной конъюгационной системы построена генетическая карта двух участков хромосомы природного авирулентного штамма V. с)ю!сгае не 01/не 0139 , на которой определена локализация 21 гена, участвующего в биосинтезе различных факторов роста. Показано значительное сходство генетических карт холерных вибрионов 01-, 0139- и не 01/ не О139-серогрупп.

3. Установлена локализация на хромосоме природного авирулентного штамма V. скокгае не 01/не 0139 генов ф, контролирующих биосинтез 02-антигена. Показано, что указанные гены тесно сцеплены с генетическими маркерами ига, Ну, риг, локализованными в той же хромосомной области, что и гены 01- и 0139-антигенов у эпидемических штаммов V. сЬокгае 01 и V. скокгае 0139.

4. Показано, что при конъюгации возможен перенос хромосомных генов ф, контролирующих биосинтез О-антигена, от природного авирулентного штамма V. с!ю!егае не 01/не 0139 к У.сЬокгае 01 классического и эльтор биоваров. В результате переноса указанных генов формируются токсигенные штаммы неагглютинирующихся вибрионов.

5. Проведенные конъюгационные скрещивания указывают на возможность приобретения токсигенными штаммами возбудителя холеры новой 0139-серогруппы генов О-антигена неагглютинирующихся вибрионов. Получение чужеродных генов ф штаммами У.сЬокгае 0139 не оказывает влияния на экспрессию ряда собственных генов, кодирующих факторы вирулентности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Давыдова Н.И., Шопырева С.В., Смирнова Н.И. Генетическое картирование хромосомной мутации, определяющей повышенную продукцию холерного токсина у Vibrio cholerae II Генет. и биохим. возбудителей особо опасн. инф.. Метер. Рос. науч. конф. - Волгоград, 1992,-С.15.

2. Шопырева С.В., Смирнова Н.И. Создание конъюгационной системы, состоящей из донорных и реципиентных штаммов Vibrio cholerae не 01 серогруппы // Пробл. ООИ. - 1994. - N4. - С. 173-179.

3. Шопырева С.В., Смирнова Н.И. Построение генетической карты Vibrio cholerae не 01 серогруппы//Пробл. ООИ. - 1994. - N4. - С.180-185.

4. Smimova N.I., Zhuravlyova Е.А., Livanova L.F., Shopyreva S.V.// Construction and characterization of recombinant Vibrio cholerae strains earring heterologous genes encoding non-01 antigene or cholera enterotoxin// Microb. pathogenes. - 1995. - V.19. -P.65-72.

5. Смирнова Н.И., Шопырева C.B., Ливанова Л.Ф., Журавлева Е.А. Возникновение токсигенных штаммов Vibrio cholerae не Ol-серогруппы в результате обмена генетической информацией // Генетика. - 1996. - Т.32, N6. - С.744-749.

6. Смирнова Н.И., Ерошенко Г.А., Чеховская Г.В., Ливанова Л.Ф., Давыдова Н.И., Шопырева С.В. Создание системы конъюгационного переноса хромосомы и генетическое картирование хромосомы Vibrio cholerae серогруппы 0139 // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. -1996. - N2,-С. 14-18........

7. Шопырева С.В., Смирнова Н.И. Конъюгационный перенос хромосомных генов rib, определяющих биосинтез О-антигена, от авируленгных штаммов V. cholerae не Ol к эпидемическим штаммам V. cholerae 0139// Мат-лы научно-пракг. конф., посвящ. 100-летию обр-я противочумной системы. - Саратов,1997.- Т.2.- С.153.

8. Шопырева С.В. Локализация генов rfb, контролирующих биосинтез О-антигена, на хромосоме природного штамма Vibrio cholerae не Ol-серогруппы. Федерал, гос. учрежд. Рос. н- и. противочум. ин-т "Микроб". - Саратов, 2000. - 12с,- Библиогр.: 25 назв. - Рус. - Деп. в ВИНИТИ 28.03.00, N796 - BOO.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шопырева, Софья Витальевна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ VIBRIO CHOLERAЕ НЕ 01/НЕ

0139 И ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ИХ БИОСИНТЕЗА.

1.1. Токсины,.

1.2. Факторы колонизации.

Глава 2. ОБМЕН ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИЕЙ МЕЖДУ ХОЛЕРНЫМИ

ВИБРИОНАМИ РАЗНЫХ СЕРОГРУПП.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Бактериальные штаммы и плазмиды.

3.2. Питательные среды и реактивы.

3.3. Методы.

Глава 4. СОЗДАНИЕ СИСТЕМЫ КОНЪЮГАЦИОННОГО ПЕРЕНОСА

ХРОМОСОМНЫХ ГЕНОВ У V.CHOLERAЕ НЕ 01/НЕ 0139.

4.1. Получение полимаркированных штаммов

V.ehoterae 02-серогруппы.

4.2. Конструирование и характеристика Hfг-донорных штаммов V.ehoterae 02-серогруппы.

Глава 5. ГЕНЕТИЧЕСКОЕ КАРТИРОВАНИЕ ХРОМОСОМЫ ПРИРОДНОГО ШТАММА V.CHOLERAE НЕ 01/НЕ 0139 С ПОМОЩЬЮ СОЗДАННЫХ ДОНОРНЫХ И РЕЦИПИЕНТНЫХ ШТАММОВ.

5.1. Выявление групп сцепленных генов, контролирующих биосинтез различных аминокислот и оснований, на хромосоме природного штамма V.ehoterae 02-серогруппы.

- 3

5.2. Определение локализации генов rfb, контролирующих биосинтез 0-антигвна, на хромосоме природного штамма V. choierae 02-серогруппы.

Глава 6. ОБМЕН ГЕНАМИ RFB, КОНТРОЛИРУЮЩИМИ БИОСИНТЕЗ О-АНТИГЕНА, МЕЖДУ ХОЛЕРНЫМИ ВИБРИОНАМИ РАЗНЫХ

СЕРОГРУПП.

6.1. Обмен генами rfb между V. choierae 02-серогруппы и V.choierae 01-серогруппы при конъюгации.

6. 2. Изучение влияния чужеродных генов г Л) на вирулентные свойства полученных рекоибинантов. НО

6.3. Обмен генами rfb между V.choierae 02-серогруппы и У.choierae 0139-серогруппы при конъюгации.

ОБСУЖДЕНИЕ. вывода.из

Введение Диссертация по биологии, на тему "Vibrio cholerae he 01/he 0139: генетическое картирование хромосомы и изучение возможности обмена генами О-антигена между холерными вибрионами разных серогрупп"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Vibrio cholerae является гетерогенным видом, состоящим из штаммов, относящихся к 200 различным се-рогруппам, каждая из которых характеризуется своим собственным 0-антигеном (BeItran et ah, 1999). До недавнего времени холерные эпидемии вызывались лишь токсигенными штаммами V. cholerae серогруппы 01. Холерные вибрионы других серогрупп, не агглютинирующиеся холерной видоспецифической 01-сывороткой (V. cholerae не 01, неагглютинитующиеся или НАГ-вибрионы), вызывали лишь локальные вспышки или отдельные случаи гастроэнтеритов, энтеритов, энтероколитов и т.д. (Дунаев, 1974; Щуркина, 1982; Сакварелидзе с соавт., 1987; Воронежская Л.Г., 1994; Aldova et al., 1968; Dutt et al.,1971; Finch et al., 1987; Kamal, 1971; Kaper et al., 1986; Morris et al., 1981; Spira et al., 1978; Wistorom, 1989; Hall et al., 1993). Однако, к настоящему времени установлено, что суiHAAmm t Am rtri ггпл г"» »лм ь «А Л А ППЛ ЛП»! TTAI « и tA/^n't » АГ» AAI »Т И* тшл » л/-ч I/ Л цсоТоу с i ии араИпсИ Мере доа oi тдемичеиКп ипаьпнл ш i<а.мма v . uituterae, несущих не 01-антиген. Наиболее известным из них является V.cholerae, принадлежащий к новой недавно обнаруженной серогруп-пе 0139, который неожиданно для всех в 1992 г. вызвал большую эпидемию холеры в Индии и Бангладеш. Вторым эпидемически значимым является штамм V. cholerae 037 Sudan, ставший причиной большой вспышки холеры в Судане в 1968 г. Результаты молекулярно-генетических исследований указанных возбудителей холеры свидетельствуют о возможном их происхождений от холерных вибрионов 01-се-рогруппы, у которых собственные гены 01-антигена в процессе горизонтального генетического переноса были замещены генами 0139-или 037-антигена, полученными ими от пока неизвестных штаммов не

Ol-серогрупп (Bik, 1995).

Появление эпидемически опасных штаммов среди V. cholerae не 01-серогруппы обусловило большой интерес исследователей к ним. К настоящему времени уже имеются определенные сведения о структуре генома этих вибрионов, которые были обозначены как V. cholerae не 01/ не 0139.

Большой интерес представляют данные о присутствии в хромосоме V.cholerae не 01/не 0139-серогрупп мобильных генетических элементов, поскольку они могут быть связаны с событиями, приводящими к формированию штаммов с новыми свойствами. В 1994 году А.Baker с соавторами впервые обнаружил в хромосоме V, cholerae не 01-серогруппы большое число копий (60-100 копий) прямо повторяющихся последовательностей размером 124 т.п.н., которые получили обозначение VCR (от англ. Vibrio cholerae repeated sequences). Поразительной особенностью этих IS-подобных элементов является их локализация в одном участке хромосомы. Результаты последних исследований показали, что VCR являются интегрон-подобными структурами, которые обеспечивают интеграцию чужеродной ДНК в лрими^иму Drtuphunuts h mui у i ш раТо jajj ib Б paonpuoTpancrmn i шив

Mazel et al,1998).

Установлено также, что в хромосоме V.cholerae не 01/не 0139 могут присутствовать гены, кодирующие известные факторы патоген-ности. Так, у ряда штаммов, выделенных от больных диареей, обнаружено наличие генов stn, контролирующих биосинтез термостабильного токсина, которые окружены с обеих сторон VCR, и, следовательно, обладают свойствами транспозонов (Mallard, 1995).

Некоторые вирулентные штаммы НАГ-вибрионов несут в составе хромосомы гены термостабильного гемолизина fcdh, также относящиеся к мобильным генетическим элементам, поскольку они фланкированы двумя IS-подобными последовательностями, названными ISV (Nis-hibuchi et al, 1995).

Помимо названных факторов вирулентности, у V.choleras не 01/не 0139 могут присутствовать гены, ответственные за синтез

ГГ8 Г, Г, I 1П ^^ I I Т11 ТЛЛ1 <Т#-\ ТТ I f Jf I / 1 I \ п V~\ п t ,Г tJ F I | Т-* f»» «Ч Т-» ГГПШ » 11 Г I Л t f ^ i c(jMUJjaumlDnui и гсмилиоИпй \пиу), раолглпил i Ьмеи i jiiuj ппппив, нейраминидазы и т.д.(Brown, Manning, 3985; Datta-Roy et al., 1986; Hase et al., 1993; Власов с соавт., 1999).

Что касается структурных генов холерного токсина ctxAB и токсин-корегулируемых пилей адгезии tcp (ключевых генов патоген-ности V.choterae 01- и 0139-серогрупп, обеспечивающих колонизацию тонкого кишечника и развитие диареи), то было установлено, что V.choterae не 01/не 0139, выделенные из внешнем среды, представлены тремя группами. Во-первых, это вибрионы, лишенные генов ctxAB и tcp, которые входят в состав двух умеренных нитевидных фагов, обозначенных, соответственно как СТХф и УР1ф (Ка-raolis et al., 1999). Во-вторых, выявлены штаммы, содержащие в хромосоме гены ctxAB и tcp (Said et al., 1995). И наконец, в третьих, недавно обнаружены нетоксигенные V.choterae не 01/не 0139, имеющие лишь гены tcp (Novais et al., 1999), В связи с этими данными возникает вопрос об эпидемической значимости V.choterae не 01/не 0139, имеющих гены холерного токсина и ток-син-корегулируемых пилей адгезии, и об их генетической связи с возбудителями холеры 01- и 0139-серогрупп.

Недавно обнаруженная локализация основных генов патогенное-ти (ctx^B и tcp) на мобильных генетических элементах (умеренные нитевидные фаги) в хромосомах V.choleras 01 и 0139 и возможность тесного контакта этих вибрионов с V.choterae не 01/не 0139 в воде открытых водоемов и в кишечнике человека указывает на существование принципиальной возможности переноса генов ctxAB и top от возбудителей холеры в ранее нетоксигенные штаммы V.choierae не 01/не 0139.

Второй путь формирования токсигенных штаммов V.choierae не 01/не 0139, обладающих эпидемическим потенциалом, состоит, видимо, в приобретении токсигенными штаммами V. choierae 01 и 0139 генов г/Ь, контролирующих биосинтез 0-антигенов других серог-рупп, от V.choierae не 01/не 0139 в процессе конъюгации или трансдукции. Однако прямых доказательств наличия указанных процессов в природе нет. Что касается сведений, полученных в модельных опытах in vivo и in pitго, то их очень мало. Лишь в работах К. Bhaskaran (1971) и Журавлевой Е. А., Смирновой Н.И. (1992) показано, что V.choierae 01 могут быть реципиентами rfb генов для НАГ-вибрионов, Однако в последнем случае донором зтих пЛ» »л snm * л п гч пп«лн11ni^rvTr^nn т* II rut «?/-> nAr^i «^-нл m n, ni

1 ehud исш ш 1 atiife, лвллллДНпип i !риИооидпЬ»л Aujiepnui и пиирпипа cMiD~~ тор, спонтанно утратившим способность продуцировать 01-антиген (возможно, в результате точковой мутации). В этой связи существует принципиальная необходимость дальнейшего экспериментального исследования вопроса о генетических связях природных штаммов V.choleraeHe 01/не 0139 с возбудителями холеры 01- и 0139-серог-рупп. Одним из основных путей его решения является генетическое картирование хромосомы вибрионов V. choierae не 01/не 0139 и сопоставление полученных данных с ранее построенными генетическими г\<ар l ами лримиъиш v . ыси lew uc Ui И uj ос». пи приведепис jaKtiA ии^ ледований невозможно без предварительного создания конъюгацион-ной системы, состоящей из эффективных донорных и полимаркирован-ных реципиентных штаммов V.choierae не 01/не 0139. Разработка конъюгационной системы переноса генетической информации у НАГ-вибрионов, которая до сих пор отсутствует, позволит также получить важную информацию о возможности перехода эпидемически опасных штаммов 01- и 0139-серогрупп в V. ehoterae не 01/не 0139, сохранившие их вирулентные свойства.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ- генетическое картирование хромосомы природного авирулентного штамма Vibrio ehoterae не 01 /не 0139 с помощью конъюгационных скрещиваний и изучение возможности обмена генами 0-антигена между холерными вибрионами разных серогрупп.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. На модели природного авирулентного штамма V.ehoterae 02-серогруппы разработать конъюгационную систему, состоящую из донорных и реципиентных штаммов.

2. На основе конъюгационных скрещиваний построить генетическую карту двух хромосомных участков природного авирулентного штамма V. ehoterae 02-серогруппы; сопоставить генетические карты V.ehoterae различных серогрупп для выявления сходства или различий между ними.

3. Изучить возможность обмена генами 0-антигена между V.ehoterae разных серогрупп; выяснить влияние чужеродных генов

П!гп»хпл» тл I ►■чг/^пп Алл»1»л г» и »и п^игчг» nurtiT г»Л1 итн г* г/-г*/~*т u-aninj cna па лиои^сььйш шиивеплмл i спио оирулеп i пиь i и о ках нового хозяина.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

Для генетического анализа природных штаммов V.ehoterae не 01/не 0139-серогруппы впервые создана коныогационная система, состоящая из изогенных реципиентных и донорных штаммов. В хромосому штамма V.ehoterae 02-серогруппы введено 36 мутаций в гены, контролирующие биосинтез различных аминокислот, оснований, витаминов, а также 0-антигена и термолабильного гемолизина. Донорные штаммы, сконструированные с помощью бинарной системы Tn5~Mob-pRP4-4, соответствуют Hfr-типу и имеют различные точки начала переноса хромосомы.

В результате использования разработанной конъюгационной системы впервые построена генетическая карта двух участков хромосомы природного авирулентного штамма V.cholerae не 01/не 0139, включающая 22 генетических маркера. Сравнительный анализ генетических карт холерных вибрионов разных серогрупп (01, 0139, не 01/не 0139) выявил их значительное сходство. Установлена также локализация на хромосоме V.cholerae не 01/не 0139 гЛьгенов, контролирующих биосинтез 0-антигена, вблизи генов ига. ilv, риг. Эти данные в сравнении с результатами работ по картированию генов 01- и 0139-антигенов дают основание заключить, что независимо от серогруппы и эпидемической значимости различных штаммов холерных вибрионов гены 0-антигенов расположены в одной и той же области хромосомы.

Новыми являются данные о переносе и экспрессии генов, контролирующих синтез 0-антигена, от природных авирулентных штаммов V. ch.ot.erae не 01/не 0139 к токсигенным V. cholerae 01 -серогруппы классического и эльтор биоваров в условиях in vivo и in vitro, а также к токсигенным штаммам возбудителя холеры новой 0139-серог-руппы. Установлено, что чужеродные гены 0-антигена не влияют на экспрессию собственных генов вирулентности в клетках нового хозяина. Полученные результаты вносят существенный вклад в изучение механизма формирования токсигенных неагглютинирующихся вибрионов, позволяя полагать, что в природных условиях источником таких штаммов могут быть вирулентные штаммы V.cholerae 01 и

- и

0139, поскольку последние могут приобретать гены 0-антигенов других серогрупп.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Депонирована в Государственной Коллекции Патогенных Бактерий РосНИПЧИ "Микроб" созданная коллекция изогенных штаммов V.choterae не 01/не 0139, состоящая из двух Hfг-доноров с различными точками начала переноса хромосомных маркеров и восьми реципиентов, несущих мутации в генах, контролирующих различные факторы роста, Q-антигена, термолабильного гемолизина.

Созданная уникальная коллекция шташов является основой для последующего генетического анализа хромосомы неагглютинирующихся вибрионов и конструирования штаммов с заданными свойствами.

Сконструированные на основе вирулентных штаммов V. cho terae 01 и 0139 токсигенные штаммы V. choterae не 01/не 0139 применяются в молекулярно-зпидемиологических исследованиях ряда лабораторий РосНИПЧИ "Микроб" для выяснения их роли в эпидемическом процессе при холере.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ

НА ЗАЩИТУ

1. На модели природного авирулентного штамма V. choterae 02-серогруппы создана конъюгационная система переноса хромосомных генов, состоящая из донорных и реципиентных штаммов. Донор-ные штаммы типа Hfг имеют разные точки начала переноса хромосомы. Полимаркированные штаммы несут мутации не только в генах, т^гмттпгчпктгтлт!»" ^firi/Mn»mr*n г^л^штт и; лл/чтп / i щг я1 tr\l гч noil nun i {jujтjf>у илцил unuc.nr» i со уаоличпил фсимирио риь i а \шЛИпип.пили I, оснований, витаминов), но и в генах, определяющих биосинтез 0-антигена и термолабильного гемолизина.

2. Построена генетическая карта двух участков хромосомы природного авирулентного штамма V. cho lerae 02-серогруппы, на которой определена локализация 22 генов, участвующих в биосинтезе различных факторов роста, а также О-антигена.

3. Хромосомные гены г/Ь02, контролирующие синтез 02-антиге-на природного авирулентного штамма V.cholerae 02, могут передаваться при конъюгации in vitro и in vivo в клетки токсигенных штаммов V,cholerae 01 классического и эльтор биоваров. Эффективная экспрессия генов г/Ь02 в новом хозяине не влияет на его вирулентные свойства, что приводит к формированию патогенных штаммов V. cholerae не 01/не 0139.

4. Возбудитель холеры новой 0139-серогруппы, содержащий гены холерного токсина ctxAB, может приобретать гены rfb V.cholerae не 01/не 0139 в конъюгационных скрещиваниях. В клетках нового хозяина чужеродные гены rfb не влияют на экспрессию изученных факторов вирулентности.

АПРОБАЦИЙ РАБОТЫ.

Материалы диссертации доложены на Российской научной конференции, Волгоград, 1992; на научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной системы, Саратов, 1997.

П У Б Л И К А Ц И И.

По теме диссертации опубликовано 8 научных работ,

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Шопырева, Софья Витальевна

ВЫВОДЫ,

1. На модели природного авирулентного штамма V. choierae не 01/не 0139, относящегося к 02-серогруппе разработана конъюгаци-онная система переноса хромосомных генов, состоящая из донорных штаммов типа Hfr с различными точками начала переноса хромосомы, а также полимаркированных реципиентных штаммов, несущих мутации в генах, контролирующих биосинтез различных аминокислот и оснований, 0-антигена, термолабильного гемолизина.

2. В результате использования созданной конъюгационной системы построена генетическая карта двух участков хромосомы природного авирулентного штамма V.choterae не 01/не 0139 , на которой определена локализация 21 гена, участвующего в биосинтезе различных факторов роста. Показано значительное сходство генетических карт холерных вибрионов 01-, 0139- и не 01/ не 0139 се-рогрупп.

3. Определена локализация на хромосоме природного авирулентного штамма V. choterae не 01/не 0139 генов г Л), контролирующих биосинтез 0-антигена. Показано, что указанные гены тесно сцеплены с генетическими маркерами ura, itv, pur, локализованными в той же хромосомной области, что и гены 01- и 0139-антигенов у эпидемических штаммов V.choierae 01 и V. choierae 0139.

4 Показано, что при конъюгации возможен перенос хромосомных генов rfb, контролирующих биосинтез 0-антигена, от природного авирулентного штамма V.choterae не 01/не 0139 к V. choierae 01 классического и эльтор биоваров. В результате переноса указанных генов формируются токсигенные штаммы неагглютинирующихся вибрионов.

- 144

5. Проведенные конъюгационные скрещивания указывают на возможность приобретения токсигенными штаммами возбудителя холеры новой 0139-серогруппы генов 0-антигена неагглютинирующихся вибрионов. Получение новых генов rfb штаммами V.ehoterae 0139 не оказывает влияния на экспрессию ряда собственных генов, кодирующих факторы вирулентности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шопырева, Софья Витальевна, Саратов

1. Адамов А.К., Наумшина М. С. Холерные вибрионы. Саратов, 1984. - 328 с.

2. Андросова С. В., Быстрый Н.Ф., Хотько Н.И. идр. Изучение влияния природных экологических факторов на микроорганизм рода Vibrio в открытых водоемах// Микробиол.лаб.диагност, и специфич. профилакт. карантин, инф. Саратов, 1989. - С. 126-132.

3. Бельков В, В. Нестабильность рекомбинантных молекул// Генетика. 1983, - Т. 19, R10. - С. 1573-1581.

4. Власов В.П,, Воронежская Л.Г., Михасъ Н.К. и др. Выделение и характеристика токсигенных (vet4} штаммов энтеропатогенных холерных вибрионов не 01 группы на различных территориях// В кн.: Холера. Ростов- на-Дону, 1992. - С. 144-147.

5. Воронежская Л Г. Холерные вибрионы не 01 группы (биологическая характеристика)// Дис. в форме науч докл. на соиск. уч. ст. док. мед. наук. Саратов, 1994. - 65 с.

6. Ганин В. С., Голубинский Е. П., Пинигин. А. Ф. и др. Сравнительная чувствительность к антибиотикам НАГ-вибрионов// Антибиотики и мед. биотех. 1987.- Т. 32, N4. - С. 272-275.

7. Гончарова Н. С., Карасева З.Н. Генетическая передача R-элисом от кишечной папочки колерному вибриону// Пробл. 00И. Саратов, 1970. - Вып. 6. - С. 24-26.

8. Гончарова Н. С., Смирнова Н. И., Коннов Н, П. Фертильность и система скрещивания у холерного вибриона // ЖМЭИ. 1978,N9. -С. 26—28.

9. Гордеева Л. А., Седова А.Г., Ковтун А.И. Эпидемиология НАГ-инфекций в Астраханской обл.// Тез. докл. обл. науч.-практ. конф. "Итоги и перспективы профилакт 00И". Астрахань, 1989. -С.43-44.

10. Давыдова Н.И. Генетический анализ хромосомной области, определяющей серологическую специфичностьвозбудителя холеры// Авто-реф. дис. . .канд.биол. наук. Саратов, 1993. - 22с.

11. Дунаев Г.С. Изучение патогенных своцств и энтеротоксина НАГ-вибрионов// Автореф. дис. .канд. мед. наук. Саратов, 1974. - 15 с.

12. Дунаев Г. С., Зыкин Л. Ф. НАГ-инфекция самостоятельная ноо-зоологическая единица// Особо опасные и редко встречающиеся тропические инф. - Волгоград, 1980. - С. 28-29.

13. Ерошенко Г.А., Смирнова И.И. Трансдукция у холерного вибриона классического и эльтор биоваров// Проблемы ООН. 1993. - N3. - С. 202-205.

14. Журавлева Е. А. Обмен генетической информацией между V. choterae 01 и не 01// Автореф. дис к. б. н. Саратов, 1993. -С. 18.

15. Зинина 0.С., Мороз В.П., Остроумова Н.М. и др. Поиск умеренных фагов У.choterae 06, 024, 037, 042, 043 и некоторых другихсероваров// Микробиол. и биохим. СОИ, Саратов, 1988. - С. 83-87.

16. Ивашина Т. В., Золотников К. М. Картирование хромосомы Шио-Ыит leguminisaniw biovar phaseoU 693// Генетика. 1989. -Т. XXV, N11 -С, 1960- 1967,

17. Ивашина Т.В., Золотников К. М. Идентификация симбиотической активности Rhizobiion phaseoU 693// Генетика 1990. - Т.26,N2. -С. 215-221.

18. Казакова Е.С. Исследование антигенов энтеропатогенных вибрионов 067, 068, 071 и 072 сероваров и усовершенствование методики их серологической идентификации// Автореф. дис. к б.н.- Саратов, 1990. 20 с.

19. Киселев Ю.Л., Цитцер А, 0. Определение цитотоксической активности холерных вибрионов// Лаб. дело. 1991. - N10 - С.57-58.

20. Кутырев 8. В , Филиппов А. А Проценко 0. А. Изучение плазмиды F 1ас как вектора транспозонов для чумного микроба// Молекул, биол. и ген. возбудителей 00И, Саратов, 1982. - Ч. 1 - С. 40-42.

21. Либинзон А.Е., Гапьцева Г,В. 0 таксономии холерных вибрионов// Тез. докл. науч.-практ. конф. по актуал. вопр. пробл. "Холера" . Ростов-на Дону, 1984. - С. 34-36.

22. Лукьянова 0. И., Щуркина И. И Антигенное строение энтеропато-генного вибриона 060 серовара// Актуальн. вопр. микробиол., лаб. диагн. и профил. холеры; Тез. Всесоюз. науч. конф. (16-17но-яб.1988). Ростов-на-Дону, 1988. - С.271-273.

23. Маниатис Т., Фрич 3., Сэмбрук Дж, Методы генетической инженерии// Москва. 1984. - С. 479.

24. Мединский Г.М., Воронежская Л.Г., Сомова А.Г. Диарейные заболевания, вызванные холерными вибрионами не 01 группы// Актуальные вопр. микробиол., лаб. диагн. и профилакт. холеры: Тез. Всесоюс. науч. конф. Ростов-на-Дону, 1988. - С. 276-279.

25. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М. 1976. - 396 с.

26. Оленичева Д. С., Непомнящая Л. Б. Авроров В. П. и др. Гликоп-ротеин и фосфолипаза из клеточных стенок холерных вибрионов -рецепторы в адгезии к клеткам эпителия кишечника и лимфоцитам// Тез. докл. V Всесоюз. Биохим. съезда. М., 1986. - Т. 3. - С. 22.

27. Осин А. В., Щелканова Е.Ю., Заднова С. П., Ерошенко Г. А. Изучение фенотипических особенностей авирулентного штамма 0139 се-рогруппы V.choierae КМ115// Пробл. 00И. Саратов, 1999. С.169-175.

28. Поздеева Т.Н. Влияние R-плазмид на биологические свойства холерных вибрионов//Автореф. дис. к. б. н.- Саратов, 1991. С.18.

29. Пономарева Л. Н., Текнаджян В. Г., Капустина М. Д. и др. Профилактика холеры на курорте Сочи// Матер, науч. -практ. конф., поев. 100-летию образов, противочумной службы России (16-18 сент. 1997). Саратов, 1997. - Т. 1. - С. 122.

30. Развых В. М. Биологические свойства НАГ-вибрионов и особенности их циркуляции// Автореф. дис. к. м. н. М. J984. - С. 22.

31. Романова Ю. Б., Гинцбург А.Л. Участие мобильных элементов в формировании свойств патогенных бактерий// Мол. генет., микроби-ол. и вирусол, 1999. - N2. - С. 22-29.

32. Смирнова Н. И,, Ильина Т. С., Ливанова Л. Ф., Смирнов Г. Б. Генетический анализ мутаций, влияющих на синтез соматического 0-антигена у холерного вибриона// Мол. ген., микробиол. и виру-сол. 1985а. - N10. ~ С. 3-8.

33. Смирнова Н. И., Ильина Т.С., Ерошенко Г. А. и др. Построение генетической карты хромосомы холерного вибриона на основе конъ-югационных скрещиваний// Генетика. ~ 19856. Т.XXXI, N7. -С. 1090-1098.

34. Смирнова Н. И., Ильина Т. С., Гончарова Н.С. и др. Генетические перестройки, индуцируемые транспозонами на хромосоме V. ettor и их использование для построения генетической карты холерного вибриона// Генетика. 1980. - Т.16, N11. - С.1987-1994.

35. Смирнова Н И., Ливанова Л.Ф. Изучение возможности генетического обмена между V.choterae ettor и НАГ-вибрионами// Вопр. генетики, молекул, биол. и микробиол. чумы и холеры. Саратов, 1985в. - С. 58-61.

36. Смирнова Н.И., Ливанова Л. Ф., Давыдова Н. И., Журавлева Е. А.

37. Использование бинарной системы, состоящей из плазмиды RP4-4 и транспозона Tn5-Mob, для создания донорных штаммов V. cholerae 01 и не 01// Бактериальные плазмиды: Тез. докл. "Плазмида XII". -Нальчик, 1990. С. 12-13.

38. Смирнова Н. И., Ерошенко Г. А., Ливанова/!. Ф. и др. Создание системы конъюгационного переноса хромосомы и генетическое картирование хромосомы V.cholerae 0139// Ж. Мол. генет. микробиол., вирусол. 1996. - N2. - С. 14-18.

39. Смирнова Н. И., Кириллина 0. А., Бирюкова Н. В., Кутырев В. В. Генетические маркеры эпидемических штаммов холерных вибрионов// Пробл, 00И: Сб. науч. тр., Вып. 79/ под ред. Кутырева В. В. Саратов, 1999. - С. 25-35.

40. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования// М: Медицина. 1982. - С. 463.

41. Суходолец В. В. Организация генома Escherichia соШ/ Генетика. 1985.- Т. 21, N5. - С. 693-705.

42. Тихомиров Е.Д., Мамонтова Т.Н., Буркин В. С. 0 формировании лекарственной устойчивости у холерных вибрионов, не относящихся 01 группе// Тез. науч.-практ. конф. по пробл. "холера". Ростов-на-Дону. - 1984. - С.163-165.

43. Фрунзе 0.В., Андрусенко И.Т., Шепелев А. П. и др. Оценка адгезивных свойств V.cholerae не 01 группы, изолированных от людей из вод открытых водоемов// Микробиол. жур. 1988. - Т.50,N3. -С. 55-58.

44. Цитцер А.0., Езепчук Ю.В., Никисбеков И.0. и др, Очистка и некоторые свойства цитолизина V. cholerae не 01// Молекуляр.генетика, микробиол. и вирусол. 1990. - N9. - С.14-18.

45. Чеховская Г. В. Генетический анализ хромосомной области

46. V.choterae 0139, содержащей гены 0-антигена// Автореф, дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1997. - С. 20.

47. Шагинян И. А., Гайлонская И. Н., Бондаренко В.М. Характеристика термостабильного энтеротоксина НАГ-вибрионов// ЖМЗИ. ~ 1980.- N6. С.71-76.

48. Шарыпова J1. А. Получение и анализ Тп-бмутантов Rhizobium те~ titofci с измененной симбиотической активностью// Дис. к.б.н.- ВНИТИЦ, копия отчета НИР, 1990.

49. Шоумаров С. Б., Хакимов М.М., Миртозаев 0. М. Эпидемиология диарей, вызываемых в Узбекистане холерными вибрионами не 01 се-рогруппы// Эпидемиол. и инфекцион. болезни. 1997. - N6. -С, 27-29.

50. Й|уркина И. И., Казакова Е. С., Лукьянова 0. И. и др. Новые се-ровары энтеропатогенных вибрионов// В кн.: Холера. Ростов-на Дону, 1992. - с. 144.

51. Adelberg Е.А., Mande М., Chen G.С. Optimal conditions for mutagenezis by N-mettiil-N' -nitro-N-nitrosoguanidine in Escheri~ hia coti K12//Biochem. Bioptus. Res. Coramun. 1965. V. 18, N5-6.- P.788-792.

52. Aidara A., Koblavis S., Boyl C.S. et al. Фенотипическая и генотипическая характеристика изолятов V. choterae от недавней вспышке в Сенегале: сравнение с изолятами от Гвинеи-Бисау//

53. Am. J. Trop. Med. Hug. 39,98. - V. 58, N2. - P. 363-367.

54. Albert M. J., Siddique A. K., Islam M.S. et al. Large out Drear of clinical cholera due to V. cholerae non-03 in Bangladesh//1.ncet. 1993. - V. 343, - P. 704.

55. Aldova E., Laznickova K., Stepankova E. et al. Isolation of nonagglutmable vibrios from an enteritis outbreak in Czechoslovakia// J. Infect. Bis. 3968. - V. 138. - P. 25-33.

56. Amaro C., Azanar R., Garay E. et al. R plasmids In environmental V. cholerae non-01 strains// Appl. Environ. Microbiol. -1988. V. 54,N11. - P. 2771-2776.

57. Arita M., Takeda T. et al. Purification and characterisation of V. choterae non-01 heat-stable enterotoxin// Infect. Irnmun. -3986. V. 52, N1. - P. 45-49.

58. Bachman B. J. Linkage шар of Escherichia coli K-12, Edition 8.// Microbiol , Rev. 1990. - V. 54, N2. - P. 130-197.

59. Bagchi K., Echveria P., Arthur J. et al. Epidemic of d iarrho-ea caused by V.choterae non-01 that produced heat-stable toxin among Khmers in a camp in Таiland// J. CI in. microbiol. 1993. -V.31. - P. 1315-1317.

60. Banerjee К.K., Choash A.N., Datta-Roy K.et al. Purification and characterization of a novel hemagglutinin from V. cholerae// Infect. Immun. 1990. - V. 58,Nil. - P. 3698-3705.

61. Baker A., Clark C.A., Manning P.A. Identification of VCR, arepeated sequence associated with a locus enoding a hemagglutinin in V.choterae 01// J. Bacteriol. 1994. -V.176. P. 5450-5458.

62. Baudry B., Fasano A., Ketlely J., Kaper J.B. Cloning of a gene (sot) encoding a new toxin produced by V.choterae// Infect. Immun. 1992. - V.60, N2. - P. 428-434.

63. Beltran P. ,Delgado G., Navarro A., Trujillo P., Selander R., Cravioto A. Genetic diversity and population structure of Vibrio choterae//J. Clin. Microbiol. 1999. - V, 37, N3. - P. 581-590.

64. Bhadra R. K., Roychoudhury S., Banerjee R.K, et al. Cholera toxin (CTX) genetic element in V. choterae 0139// Microbiol.-1995. V. 141. - P. 1977-1983.

65. Bhaskaran K., Rowley D. Nutrional stadies on V. choterae// J. Gen. Microbiol. 1956. - P.417.

66. Bhaskaran K. Recombination of characters betweem mutant stocks of V.choterae strain 162// J.Gen.Microbiol. -1960. -V.23.N1. P. 47-54.

67. Bhaskaran K., Sinha V.B. Transmissible plasmid factors and fertility inhibition in V.choterae// J.Clin. Microbiol. 1971. -V. 69, N1. - P. 89-97.

68. Bik E.M., Bunschoten A.E., Gouw R.D. et al. Genesis of the novel epidemic V.choterae 0139 strain: evidance for gorizontaltransfer of genes involved in polysacharide syntesis// EMBOJ. -1995.- V. 14, N2. P. 209-216.

69. Bik E. M., Gouw R.D., Mooi F.R. DNA fingerprinting of V. cholera в strains with a novel insertion sequenct element: A tool to edentity epidemic strains// J. Clib. Microbiol. 1996. - V.34. - P. 1453-1461.

70. Booth B.A., Finkelstain R. A. Presense of hemagglut inin/pro-tease and other potential virulence factors in 01 and non-01 V. choterae// J. Infect. Dis. 1986. - V. 154. - P. 183-186.

71. Boyd E.F., Hartl D.L. Chromosomal regions specific to pathogenic isolates of E.coti have a phylogenetically clastered distribution// J. Bacteriol. 1998. - V. 180,N5. - P. 1159-1165.

72. Boyd E.F., Waldor M. K. Alternative mechanism of cholera toxin acquisition by Vibrio choterae generalised transduction of СТХФ by bacteriophage CP-T1.//Infec. Imraun. 1999. - V.67, N11. -P. 5898-5905.

73. Boyd E.F., Moyer K.E., Shi L., Waldor M. K. Infect ious СТХФ and the Vibrio pathogenecity island prophage in Vibrio mimicus: Evidence for recent horizontal transfer between V.mirnicus and Vibrio choterae. //Infec. Immun. 2000. - V.68.N3. - P. 1507-1513.

74. Brown M. N. arid Manning P. A. Haemolysin genes of V. choterae: presence of homologous DNA in non-haemoiytic 01 and haemolytic non-01 strains// FEMS Microbiol.Let. 1985. - V.30. - P. 197-201.

75. Chakarbarty A.N., Chaundhuri S., Ganguii M. et al. Transformation of Vibrios with R-factors from enterobacterialInd. J. Med. Res. 1977. - V.66.N1. - P. 14-22.

76. Chakarbarty A.N., Sen M., Balganesh T.S. et al. Transfer of

77. R-plasmid from Staphitoeосcus aureus to E. coii and V. ehoterae//1.dian, J. Exp. Biol. 1987. - V.19,N6. - P. 511-515.

78. Chatterjee S. Mondal A.K. Begum N. A., Roychoudhury S,, Das

79. J. Ordered cloned DШ шар of the genome of Vibrio ehoterae 589B and localization of genetic markers// J, Bacterid. 1998.и ton MЛ n ЛП4 rsno v. i ou, и*±, г . duj-wo.

80. Chowdhary V A.R., Mijoshi S., Yamada H. Ecology and distribution of toxigenic V. ehoterae in aquatic environments of a temperate region// Microbiol. 1992. - V.72,N292-293. - P.203-213.

81. Craig J. P., Yamamoto R., Takeda Y et al. Production of cholera-.ike toxin by V.ehoterae non-01 strains Isolated from environment// Infect. Immun. 1981. - V.34,N1. - P.90-97.

82. Crowther R.S., Roomi N. W., Fahim R.E. V. ehoterae metal lop-rot ease degrades intestinal mucin and facilitated enterotoir I J л^нп г* 5 лмч f" vn/мп «л + 5 f 5 юП / / D 5 л /чЬ i m D J яЬ ? <'v

83. Л.ПГ шшЬси осы el ЮГ» i j urn i<at- mvetn/ii its/ i Diutiiiiil. DiupiiiD. ~1987. V.924. - P.393-402.

84. Dastidar S.G., Mitra S., Kumar R. et al. Genetic transformation of enterobacteria and vibrios to streptomycin resusten/ т^; i r.,r Kirti л o^0 \/ i а мс n аапаал

85. KjKJ / LiAAldU. и . С.лр, UlUl, J3IO. v. JO, no. r.uw Uui

86. Datt A. K., Alva S.« Velanthan T. A shellfish-borne cholera outbreak in Malaysia// Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1971. - V. 65. - P. 815-818,

87. Datta-Roy K., Dasgupta 0., Chos A.G. Haemagglutination and intestinal adherence properties of clinical and environmental isolates of non-01 V.cholerae// Appl. Envuron. Microbiol. -1989. V. 55, N9. - P. 2403-2406.

88. De S.N., ChatterJее D.N. An experimental stady of the mechanism of action of V.cholerae on the intestinal mucous membrane// J. Pathol, and Bacteriol. 1953. - V. 66. - P. 559-562.

89. Dhar R., Mahbool A., Thafoor A. Unusual non-serogroup 01 Vibrio cholerae bacteremia associated with liver siseases// J. Clin. Microbiol. 1989. - V.63. - P.2853-2855.

90. Dumontier S., Trieu-Cuot P., Berche P. Structural and functional chsracterization of ISI358 from Vibrio cholerae// J. Bacteriol. 1998. - V. 180, N23. - P. 6101-6106.

91. Dutta N.K,, Habbu M. K. Experimental cholera in infant rabbits: a method for chemotherapeutic investigation// Brit. J. Pharmacol. 1955. - V.10,N2. - P. 153-159.

92. Fallarino A., Mavragelos C., Stroeher U.H., Manning P.O. Identification of additional genes required for 0-antigen bio-sinthesis in Vibrio cholerae 01// J. Bacteriol. 1997. - V.179, N7. - P. 2147-2153.

93. Far is A., Lindahi M., Wadstrom T. High surface hidrophobity of haemagglutinsting V.cholerae and other vibrios// Curr. Microbiol. 1982. - V. 7, N6. - P. 357-362.

94. Faruque S.M., Abdulalim A. R., Roy S.K. et al Molecular analysis of rRNA and cholera toxin genes, carried by the new epidemic strain of toxigenic V.choterae 0139 synonim Bengal//J. Clin. Microbiol. 1994. - V.32. - P. 1050-1053.

95. Faruque S.M., Albert M.J., Mekalanos J.J. Epidemiology, genetics and ecology of toxigenic V.choterae// Microbiol, and Mol. Biol. Rev. 1998. - V.62.N4. - P. 1303-1314.

96. Faruque S.M., Rahman M.M., Asadulghani et al. Lysogenic conversion of environmental Vibrio mimicus strains by СТХФ// Infect. Immun. 1999. - V. 67, Nil. - P. 5723-5729.

97. Fernandez N. I., Alcoba L.M. Non-01 V. choterae bacteraemia will tout diarrhoea// Lancet. 1996. - V. 348. - P. 6.

98. Finch M.J., Valdespino J.L., Wells J.G. et al. Non-01 V. choterae infection in Cancun, Mexico// Am. J. Trop. Med. Hyg. -1987. V.36. - P. 383-387.

99. Finkelstain R.A., Atthasampunna P., Chulasamaya M. et al. Pathogenesis of experimental cholera: biological activites of purified procholerogen A// I. Immunol. 1966. - V.96,N3. -P.440-449.

100. Firikelstain R. A., Boesman-Finke.1 stain M., Chang Y, et al. V.choterae hemagglutinin/protease, colonial variation, virulence and detachment// Infect. Immun. 1992. - V.60. - P. 472-478.

101. Gardner A.D., Venkataram К. V. The antigens of cholera group of Vibrios// J. Hug. 1935. - V. 35, N2. - P. 262-282.

102. Ghosh A.R., Koley H., De D. et al. Incidence and toxigenici-ty of V.choterae in a frashwater lake during the epidemic of cholera caused by serogroup 0139 Bengal in Calcutta, India// FEMS Microbiol. Ecol. 1994. - V. 14. - P. 285-291.

103. Gardner A. D,, Venkatraman V. K. The ant igenes of the cholera group of vibrios// J. Hyg. 1935. - V. 35. - P. 262-282.

104. Gugllmetti P., Bravo L., Zanchi A. et al. Detection of V. choterae heat-stable enterotoxin gene by polymerase chain reaction.// Mol. Cel. Prob. 1994, V.8. - P. 39-44.

105. Hall R.N., Khambaty F.M., Kothary M.K. Non-01 V. choterae//t л^пл^ 4 ЛЛО \! ОАО n /ton ucu tut; L . ~ JWO. ~ V . oic. г . 4ovj.

106. Hacker J., Blum-Ocher G., Muhldorfer I.; Tschape H. Pathoge-nesity islands of virulent bacteria: structure, function and impact on microbial evolution// Mol. Microbiol. 1997.1. V.23.N6. P. 308.9-1097.

107. Hanchellay S., Seriwatana J., Eclieveria P. et al. Non-01 V. choterae In Та 11 and: homo 1 ogy with с 1 oned cho 1 era toxin genes// J. Clin. Microbiol. . -1985. - V. 21, N2. - P. 288-289.

108. Hanne L.P., Finkelstain R.A. Characterization and distribution of the hemagglutinins produced by V. cholerae// Infect. Im~ mun. 1982. - V.36. - P. 209-214.

109. Hase C.C., Finkelstain R.A. Bacterial extracellular zinc-containing metalloproteases// Microbiol, Rev. 1993. -V. 57, N4. - P. 823-837.

110. Herrington D. A., HallR.H., Losonsky G. et al. Toxin, to-xin-coregulated pi 1i, and the ToxR regulon are essential for V.choterae pathogenesis in human// 3. Exp. Med. 1988. - V.168, - P.1487-1492.

111. Hoge C,W,, Sethabutr 0., RodhidaUa L. et al. Use of synthetic oligonucleotide probeto detect strains of non-serovar 01 V.cholerae earring the gene heat-stable enterotoxin (NAG-ST)// J. Clin. Microbio. 1990. - V. 28. - P. 1473-1476.

112. НоШday R.A. A new method fore the identification of biochemical mutants of microorganisas// Nature. 1956. -V. 178, N4540. - P. 987.

113. Johnson S. R., Romig W. R. Transposon-faci1i tated recombi nat i-on of V.choterae// Mol. Gene. Genet. 1979. - V.170, N1. -P.93-101.

114. Johnson S.R., Romig W. R. V. choterae conjugative piasmid pSJ15 contains transposable prophage dVCl// J. Bacteriol.981. V. 146, N2. - P. 632-638.j Q£

115. Johnson J.A., Panigrahi P., Morris G. Non-01 V. choterae NRT36S a polysaccharide capsule that determines colony morphology, serum resistence and virulence in mice// Infect. Immun -1992. V.60, N3. - P. 864-869.

116. Johnson J.A., Hopkins R.J., Panigrahi P , Morris J. Evidance that polisaccharide capsul of the non-01 V. choterae NRT-36S mediates to epitelial cells// In Abstr. of the 93 General Meeting of the American Society For Microbiol. 1993. - P.83.

117. Johnson J. A., Sailes C. A., Panigrahi P. et al. V. choterae 0139 synonim Bengal i s closly related to V. choterae El Tor but has important differences// Infect. Immun. 1994. ~ V.62. -P. 2108-2110.

118. Kado СЛ., Lin S.7. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmid// J. Bacteriol. 1981. -V. 145, N3. - PI365-1373,

119. Kama! A.M. Outbreak of gastroenteritis by nonagglu.Unable (NAG) vibrios in the republic of Sudan// J. Egypt. Public. Health. Assoc. 1971. - V. 46. - P. 125-173.

120. Kaper J.B., Nataro J.P., Roberts N. C. et al. Molecular epidemiology of non-01 V.cholerae and V.mimicus in the US Gulf Coast region// J, Clin, microbiol. Lett. 1986. - V 30,N1-2. -P. 197-201.

121. Kaper J,B., Fasano A., Trucks is M. Toxins of V cholerae and cholera: molecular to global perspectives. 1994. - P. 145-176.

122. Kaper J.B., Morris J, G., Levin M.ML Cholera// CI in. Microbiol. Rev. 1995. - V.8. - P. 48-86.

123. Kar S., Ghosh R.K., Ghosh A.N, Ghosh A. Integration of the DNA of the novel fiiaiaentous bacteriophage VSK from Vibrio cholera e 0139 into the host chromosomal DNA// FEMS Microbiol. Lett. 1996. - V. 145. - P. 17-22.

124. Karaolis D. K. R., Lan R., Reeves P R, The sixth and seventh cholera pandemics are due to independent clones separately derived from environmental, попtoxigenic, non-01 V.cholerae// J. Bacteriol. 1995. - V.177,N11. - P3191-3198.

125. Karaolis D.K.R., Johnson j.A,, Bally С,C. et al. Vibrio cholerae pathogenecity island associated with epidemic pandemic strains// proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V95.N6. -P. 3134-3139.

126. Karaolis D.K.R., Samara S., Maneval D,R. et al. A bacteriophage encoding a pathogenecity island, a type IV pilus and phage receptor in cholera bacteria// Natur. 1999. - V.399, N6734.- P. 375-379.

127. Khetawat. G., Bhadra R.K., Kar S., Das J. Vibrio choterae 0139 Bengal: combined physical and genetic map and comparative analysis with the genome of V.choterae 01// J. Bakteriol. -1998. V. 180, N17. - P. 4516-4522.

128. Kontoyiannis D., Calia K., Basgoz N. Primari septecimia caused by V. choterae non-01 acquired on Cape Cod, Massachusetts// Clin. Inf. Des. 1995. - V. 21, N5. - P. 1330-1333.

129. Majtan V., Urbova L., Karolchek J. Hemolytica aktivita V.choterae non-01// Cesk. Epidemiol. Microbiol. Immunol 1984.- V. 33, N6. P. 332-337.

130. Majumder R., Sengupta S., Khetawat G., Bhadra R. K., Roycho-udhury S., Das J. Physical map of genome of Vibrio choterae 569B and localization of genetic markers//J. Bakteriol. 1996. -V. 176. P. 1105-1112.

131. Mallard К.E., Desmarcheiier P.M. Detection of heat-stable enterotoxin genes among Australian V.choterae 01 strains// FEMS

132. Microbiol. Lett. 1995. - V. 127. - 111-115.

133. Matsushita S., Noguchi J., Yanagawa Y. et al. Sporadic diarrhoea caused by V. cholerae non-01 and the characteristics of the isolates// Kansenshogaku Zassh i. 1997. - V.71,N12. -P. 1204-1209.

134. Mazel D., Dychinco В., Webb V.A., Davies J. A distinctive class of integron in the V.cholerae genome// Science. 1998. -V. 280. - P. 605-608.

135. McCardel1 B. A., Madden A. Isolation and characterisation of a cytolysin prodused by V. cholerae serogroup non-01// Can. J. Microbiol. 1985. - V.31. - P.711-720.

136. Mel S.F. and Mekalanos J.J. Modulation of horizontal gene transfer in pathogenic bacteries by in vivo signals// Cell. -1996. V. 87. - P. 795-798.

137. Mizuguchi Y., Taniguchi H. Analysis of thermostable direct hemolysin and thermostable hemolysin genes of V. parahemolyticus// Jap. J. Med. Sci. Biol. 1985. - V. 38, N5-6. - P. 265.

138. Mooi F. R., Bik E.M. The evolution of epidemic Vibrio cholerae strains// Trand. Microbiol. 1997. - V. 5, N4. - P. 161-165.

139. Morris J.G., Wilson R., Davis B.R. et al. Non-0 group 1 Vibrio cholerae gastroenteritis in the US// Ann. Intern. Med. -1981. V. 93. - P. 656-658.

140. Morris J.G. Non-01 group 1 Vibrio cholerae: a look at the epidemiology of an occasional pathogen// Epidemiol. Rev. 1990. - V. 12. - P. 179-191.

141. Morris J.G., Takeda T., Tall B.D. et al. Experimental non-0 group 1 Vibrio cholerae gastroenteritis in humans// J. Clin. Invest. 1990. - V. 85. - P. 697-705.

142. Mukhopadhyay А.К., Garg S., Mitra R, et al. Tamporal shifts in traits of V. ehoterae strains isolated from hospitalizated pe-tients in Calcutta: a 3-year (1993 to 1995) analysis// J.Clin. Microbiol. 1996. - V. 34,NIG. - P. 2537-2543.

143. Murase M., Nakanisci H., Sakazaki R. CT-lire enterotoxinл uUuoeu и4. i tui rui *, (jlbj I erf u.c? i buiatdu i .1 uui Г i Vfca waLca , I. iondfvjishrimps in Kobe City// Jap. J. Vet. Sci. 1987. - V.50,N2,

144. P. 363-370. Реф. в РЖБ. - 1989. - С. 93.

145. Nair G.B., Оку Y., Takeda Y. et al. Toxin profiles of V.ehoterae non-01 from environmental sourses in Calcutta, India// Appl. Environ. Microbiol. 1988. - V.54,N12. - P. 3180-3182.

146. Nishibuchi M., Seudler R.J., Rollins D.M. et al. Vibrio factors cause rapid fluid accumulation In suckling raice// Infect I шип. 1983. - V. 40, N3. - P, 1083-1091.

147. Nishibuchi M., Kaper J.B. Xermostable direct hemclysin gene of V-.parahemolyticus: a virulence gene asquired by a marine bacterium// Infect. Inroun. 1995. - V. 63, N6. - P. 2093-2099,

148. Novais R.S., Сое 1 ho A., Salles C. A., Vicente A. C, Toxin-co-regulated pilus claster in non-01, non-toxigenic Vibrio ehoterae; evidence of a third allele gene// PEMS Microbiol.Lett. -1999. V. 171, N1. - P. 49-55,

149. O'Brien A.D., Chen M.E,, Holmes R. et al. Environmental and huiaan isolates of V. ehoterae and V. parahemolyticus produ.se a

150. Л»/", 1 1 Л Пигр л-ч-vn. ! ^ 4 / PVv 1 .|-#Л ^ 1 ?1/fS 1 / / t «^учг»/"»! 4 OQJIoiiifedi ia uy^t'iilu ia. i xoui&dj ~ А ДЛСГ lui/Олхп/ ' uci iLcv, ido^,1. V. 14, N3368. P. 77-78.

151. Ogawa A., Kato J., Watanabe H. et al. Cloning and nucleotide sequence of heat-stable enterotoxine gene from V. ehoterae non-01 isolated from patient with travellers diarrhoae// Infect, Immun.1990. ~ V. 58. Р. 3325-8329.

152. Ogava A, and Takeda Т. The gene encoding the heat-stable en-terotoxin of V.choterae is flanked by 123-base pair direct repeats// Microbiol. Immunol. 1993. - P.607-616.

153. Parker Ch., Gautier D., Tate et al. Expanded linkage map of Vibrio choterae// Genetic. 1979, - V. 91, N2. - P. 191-214.

154. Pearson G. D. N., Woods A., Chaing S. L., Mekalanos J. J. CTX genetic element encodes a site-specific recombination system and an intestinal colonization factor// Proc. Nath. Acad. Sci. USA. 1993. - V. 90. - P. 3750-3754.

155. Pollitzer R. Cholera. // Geneva: WHO. 1959. - 1019 p.

156. Ramamurthy T., Garg S., Sharma R. et al. Emegrence of novel strain of V.choterae with epidemic potential in southen and eastern India// Lancet. 1993. - V. 341. - P. 703-704.

157. П, iK . n T Г* ft 1 4* млл T Cnm 1 л T Ул 1 D U tf лмл л мг>nuiun , ni Uiion о. , iLjjfji с о . , lUifttttl rv. п. у, uiiu vbf ticningitis in a neonate// J. Pediatr. 1931. - V.98. - P.940-942.

158. Saha P. K., Koley H., Nair G. B. Purification and characterization of a extracellular secretogenic non-membrane-damaging cy- ш totoxin produced by clinical strains of V.choierae non-01// In-feet. Imm. 1996. •• V. 64, N8. - P. 3101-3108.

159. Said. В., Smith H.R., Scotland 5. M., Rowe B. Detection and differentiation of the gene for toxin co-regulated pill (tcp4) in V. choierae non-01 using the polymerase chain reaction// FEMS Microbiol. Lett, 1995. - V. 125. - P. 205-210.

160. Sakazak i R, Gomes C.Z,, Sabald M. Taxonomic stadies of the so-called NAG-vibrios// Jap. J, Med. Sci. BioL- 1967. V.20,N4.- P.265-280.

161. Sharma C., Thungapathra M., Ghosh A. et al. Molecular analysis of non-01, non~0139 V.choterae associated with unicual upsurge in the incidence of cholera-like disease in Calcutta, India // J. Clin. Microbiol, 1998. - V.36JI3. - P. 756-763.

162. Sfcehabi A.A., Drexler H., Richardson S.H. Virulence mechanisms associated with clinical isolates of non-01 У. choterae// Zent. Bacterid., Microbiol. Hyg. 1986. - N2. - P. 232-239.

163. ShHiiada T., Arakawa E., I tor K. et al. Extended serotyping scheme for V. choterae/./ Curr. Microbiol. 1994. - V.28. -P. 175-178.

164. Sen M., Balganesh T.S., Dastidar S.G. et al. Transfer of polymyxin-res! stance fro® BaciUum potpixa: transforation of gram-positive and grass-negative bacteria// Indian J. Exp. Biol.- 1980. У. 18, N11. - P, 1256-1259.

165. Simon R., Priefer U., Puhler A. Vector piasmids for in vitro шалipuIations of gram-negative bacteria// In: Mol. Gen. of the Bacteria Plant Integration, ed. byA. Puhter Springer - Verlag, Berlin, Heidelberg. - 1983. - P. 98-106.

166. Simon R High frequency mobilyzation of gram-negative bacterial replicons by the in vitro constructed Tn5-Mob transposon// Mgg. 1984. - V-196. - P. 413-420.

167. Singh D. V. > Shukea B.N., Sanyal S.C. Haesiolysin produced by V.choterae non-01 is not enterotoxic// J. Med. Microbiol. -1996. V. 45. - P. 35-39.

168. Singh 3., Bora D., Sachdeva V. et al. V.choterae 01 -and 0139 in less than five years old children hospitalised for water diarrhoea in Delhi, 1993// J. Diarrhoeal Dis. Res. 1997. -V. 15, N1. - P. 3-6.

169. Stroeher U.H., Parasivam G., Dredge В.K. et al// J. Bacterial, 1997, - V.179. - P.2740-2747.

170. Sublett R.D., Roffiig W.R. Transposon-facilitated recombination in classical biotypes of V.cholerae// Infect. Immun. 1981.- V.32,N3. P. 1132-И38.

171. Simdaram S. P., Murthy К V, Occurence of transferable multi-drag res 1stence in V,choterae in a epidemic area// Indian. J. Med. Res. 1984. - V.79. - P.722-727.

172. Svenerholm A.M., Wiklund G., Rapid (^ц-enzimel inked immunosorbent assey with visual reading for identification of S.coti heat-labile enterotoxin// J. Clin. Microbiol. 1983, - V.17,N1,- P.238-241.

173. Takao T,, Shimoniski Y.3 Kobayashi M. et al. Amino acid sequence of heat-stable enterotoxin produced by p.choterae non-01// FEBS Lett. 1985. - V. 193, N2. - P. 250-254.

174. Taylor R.K., Miller V.L., Furlong D. В., Mekaianos J.J. Use of pho4 gene fusions to identify a pilus colonization factor co-ordinately regulated with cholera toxin// Proc. Natl. Acad. SCi. USA. 1987. - V. 84. - P. 2833- 2837

175. Taylor R.K., Miller V. L , Furlong D.B., Mekaianos J.J. Safe, live V. choterae vaccines// Vaccine. ~ 1988. V. 6. - P. 151-154.

176. Tsutsuroi H., Hodate Y., Okata M., Shimada Т. Изучение V. choterae не 01, выделенных от больных диареей, прибывших из-за границы// Kansen. Z. asshi.J. Jap. Assoc. Infect. Dis. 1995. -V. 69, N6. - P. 637-641.

177. Trucksis M., Michalski J., Deng Y.K., Kaper J.B. The Vibrio choterae genome contains two unique circular chromosome//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V.95. - P. 144464-144469.

178. Voller A., Bidwel1 D.E., Bartlett A. Enzyme immunoasseys in diagnostic medicine// Bull WHO. 1976. - V.53,N1. - P. 55-65.

179. WHO report. Outbreak of gastroenteritis by non agglutinable (NAG) vibrios// Wkly Epidemic. Rec 1969 - V.44. - P. 1-28

180. Waldor U.K., Mekaianos J.J. ToxR regulates virulence gene expression in non-01 strains of V.choterae that caused epidemic cholera// Infect.Immun. 1994a - V.62. - P. 72-78.

181. Waldor M.K., Mekaianos J.J. Emegrence of a new cholera pandemic: molecular analysis of virulence determinants in V. choterae 0139 and development of a live vaccine prototype// J. Infeet. DIs. 5994b. - V. 170. - P.278-283.

182. Waldor M. K., Mekalanos J.J, Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin// Science. 1996. - V.272,- P. 1910-1914.

183. Walia S.K., Madhavan T., Chugh T.D. et al. Characterization of self-transmissible piasmids determining lactose fermentation and multiple resistance in clinical strains of Klebsiella pneu-maniae/f Plasmid. 1987. - V. 17,N1. - P. 3-12.

184. Wang R., Wang Z., Dai X. et al. Исследование передачи путем конъюгации от E.coti к V. cholerae плазмид/ZActa Microbiol. Sin.- 1983. V.23,N2. - P. 188-174.

185. Ward H.M., Manning P. A. Mapping of chromosomal loci associated with lipopolysaccharid.es sinthesis an.d serotype specificity in V. cholerae by transposone Bouthagenesis using Tn5 and Tn2680// Mol. Gen. Genet. 1989. - V. 218. - P. 367 -370.

186. Wikstrom M., Jonson G., Svennerholm A.M. Production and characterization of monoclonal antibodies to V.cholerae soluble hemagglutinin// APMJS. 1991. - V.99. - P. 249-256.

187. Wistorom J. A case of non-01 V.cholerae bacteremia from Mot-hen Europe// J. Infect. Dis. 1989. - V. 160, N4. - P. 732.

188. WHO. Epidemic diarrhoea due to V.cholerae non-01// Weekly1.i^nni^ ЫЦП Л ППО \/ СО Г) A 4 Л ОopiucjiHlv. u wtlu. - Do, r« *i-«to.

189. Yamai S., Okutsu T., Murase Т., Katsube Y. Studies of V.cholerae 0140 (serogroup Hakata) isolated from river water// Kans. Zasshi. 1997a. - V.71.N9. - P. 928-934.

190. Yamasaki S., Garg S., Nair G. B., Takeda Y. Distribution ofr <,ui lu utiutui uc ui antigen ulu&yiМ/нсоло gdiibo as liung, U sod as iu ulher non-01 serogroups of Vibrio cholerae//FEMS Microbiol. Lett.- 1999. V. 179. - P. 115-121.

191. Yamamoto К., Ichinose Y., Nakasone N. et al. Identity of hemolysin produced by V. choterae non-0i and V,choterae 01, biotype El Tor// Infect. Immun. 1986. - V.51. - P.927-931.

192. Yamamoto K., Al-Omani M., Honda T. Non-01 V. choterae haemo-lysin: purification, partial characterization and immunological relatedness to El Tor haemolysin// Infect. Immun. 1984. -V. 45. - P. 192-196.

193. Yamamoto K., Takeda Т. , Miwatani T. et al. Purification and some properties of a non-01 V.choterae: enterotoxin that is identical to cholera enterotoxin// Infect. Immun. 1983. -V. 39, N3. - P. 1128-1135.

194. Yoh M., Honda Т., Miwatani T. Production by non-01 V. choterae of hemolysin related to thermostable direct hemolysin of V.parahaemolyticus// FEMS Microbiol. Lett. 1985. - V. 29, N1-2.- P. 197-200.

195. Yoh M., Honda T., Miwatani T. Purification and characterization of V, parahaemilyticus termostable direct hemolysin- relatedhemolysins prodused by V. choterae non-01 and V.hollisae// Jap. J. Med. Sci. Biol. 1985. - V.38,N5-6. - P.265-266.

196. Yoh M., Honda Т., Miwatani T. Purification and partial characterization of non~01 V.choleras hemolysin that cross reacted with thermostable direct hemolysin of V. parahaemolyticus// Infect. Immun. 1986. - V.52, N1. - P. 319-322.

197. Yoh M., Kongwuang II., Honda T. et al. Characterization of V. parahaeTJiotyticus thermostable direct hemolysins produced by V. choterae non-01 and V.hottisae// Abstr. Annu. Met. Amer. Soc. Microbiol. 1987. - P. 30.

198. Yoh M., Honda T., Miwatani T. Comparison of hemolysin of V. choterae non-01 and V.hottisae with thermostable direct hemolysin of У. parahaemolyticus// Can. J. Microbiol. 1988. -V. 34, N12. - P. 1321-1324.

199. Yoshimora S., Takao T., Shimonishi Y. et al. A heat-stable enterotoxin of V,choterae non-01: Chemical syntesis and biological and biochemical properties// Biopolymers. 1986. - V.25. -P. 69-83.

Информация о работе

Шопырева, Софья Витальевна
кандидата биологических наук
Саратов, 2000
ВАК 03.00.07

Диссертация

Vibrio cholerae he 01/he 0139: генетическое картирование хромосомы и изучение возможности обмена генами О-антигена между холерными вибрионами разных серогрупп - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы