Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический анализ хромосомной области VIBRIO CHOLERAE O139, содержащей гены О-антигена

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Генетический анализ хромосомной области VIBRIO CHOLERAE O139, содержащей гены О-антигена"

РГ6 од

1 о ФЕВ «97

На правах рукописи

ЧеХОВСКАЯ Галина Викторовна

ГЕНЕТИЧЕСК'Ий АНАЛИЗ ХРОМОСОМНОЙ

ОБЛАСТИ УП)ШО СНОЬЕИАЕ 0139, СОДЕРЖАЩЕЙ ГЕНЫ О-АНТИГЕНА

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов -1997

Работа выполнена в Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" Министерства Здравоохранения России

Научный руководитель: доктор биологических нзу

Н.И.Смирнова

Официальные оппонента: академик, профессор, док. док. чед. наук

£Д. паук i .М•Шуб

A.C.Степанов

Ведущая организация: Ростовский на-Дону научно-исследовательский противочумный институт

на заседании Диссертационного Совета Д 074.32.01 по присуждению ученой степени доктора наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" Министерства здравоохранения России ( 410005 Саратов, Уиверситетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб".

Защита диссертации состоится "J0J' uiii/j/a 1997 г. в^"'

часов

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор биологических наук

Г.А.Корнеев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. На протяжении всех семи пандемий холеры возбудителями этой особо опаной инфекции были Vibrio cholerae 01 серогрупп классического и эльтор био-варов. Холерные вибрионы других серогрупп (V. cholerae не 01 или НАГ-вибрионы) могли быть причиной лишь локальных вспышек или отдельных случаев диарейных заболеваний, а также раневых инфекций , септицемий и т.д. ( Ермольева З.В., Краснова И.Н. с соавт.,1970; Дунаев Г.С., Зыкин Л.Ф., 1Э30; Мединский Г.М., Воронежская Л.Г., Сомова А.Г. с соавт.,1988;Honda Т., Both В.A., Bossman-Finkelste-in М., Finkelstein R.А.,1987; Dhar R. et al.,1989).

Первая большая эпидемия холеры, вызванная НАГ-вибрионами была зарегистрирована в 1992 -1993 гг. в Индии и Бангладеш. Возбудителем этой эпидемии стал штамм новой ранее не-известной серог-руппы 0139. Возбудитель холеры новой серогруппы из Индии и Бангладеш проник в Пакистан, Китай, Таиланд, Афганистан, Казахстан и другие страны, вызвав там вспышки холеры. В этой связи, ряд исследователей считают,что V. cholerae 0139 серогруппы может стать возбудителем 8ой пандемии холеры.

Новый НАГ-вибрион по ряду биохимических и молекулярно-биологических свойств сходен с холерными вибрионами 01 серогруппы биовара эльтор. TaK,V. cholerae 0139 продуцирует холерный токсин, не отличимый от холерного токсина вибрионов эльтор. Кассета вирулентности, включающая структурные гены трех токсинов ctxAB,zot,ace, а также гены фактора колонизации сер, окружены, так же как у эльтор вибрионов, двумя копиями IS-подобной последовательности RSI (Hall R.H.et al.,1993; Waldor M.K., Mekalanos 3.3,1994; Manning P.A.,Stroecher V.H.,1994; Bik E.M. et al.,1995). Ряд штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы продуцируют такой же термолабильный гемолизин, что и вибрионы биовара эльтор и т.д.

В тоже время,в отличие от традиционных возбудителей холеры обоих биоваров,V.cholerae 0139 продуцирует полисахаридную капсулу и новый соматический антиген 0139 серогруппы. Гены, контролирующие биосинтез 0139-антигена (rfb0139) и капсулы (cap), являются новыми генами вирулентности и иммуногенности для возбудителей холеры , происхождение которых до сих пор не известно.

В настоящее время высказано два предположения относительно происхождения холерных вибрионов 0139 серогруппы. Согласно данным Johnson З.А. с соавт.(1992,1994),холерные вибрионы 01J9 серогруппы существовали во внешней среде, но не имели генов токсигеннос-ти. В результате обмена генетической информации гены токсигеннос-ти были приобретены ими от циркулирующих в этом районе продуцирующих энтеротоксин холерных вибрионов. Вместе с тем, Morris J.G. с соавт.( 1994 ) , Bik Е.М. с соавт.(1995) и Pajni S. с соавт. ( 1995) предпологают, что НАГ-вибрион новой серогруппы является мутантом V. cholerae биовара эльтор по продукции О-антигена, который одновременно приобрел от других вибрионов ген cap. Однако, до сих пор механизм такого преобразования не известен.

Несмотря на огромный интерес многих исследователей к V. cholerae 0139 серогруппы, к настоящему времени достигнуты лишь определенные успехи в изучении структуры генома нового возбудителя холеры. Проведенная рядом зарубежных исследователей работа по клонированию и секвенированию отдельных генов вирулентности не смогла дать необходимую информацию о генетической организации V. cholerae 0139. Из-за отсутствия эффективных методов обмена генетической информацией до сих пор неизвестна локализация на хромосоме генов rfb0139 и cap.Неизученным также остается один из интереснейших вопросов, касающийся экспрессии в клетках V. cholerae 0139 чужеродных генов вирулентности.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - генетическое картирование генов, контролирующих синтез 0139-антигена и капсулы;

изучение особенностей наследования и экспрессии клонированных генов холерного токсина и В-субъединицы холерного токсина V. colerae биовара эльтор в клетках V. cholerae серогруппы 0139.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Получить спонтанные и транспозонные мутанты V. cholerae серогруппы 0139 с измененной продукцией капсулы и 0139-антигена; выявить роль капсулы в вирулентности V. cholerae 0139.

2. Создать систему коньюгационного переноса хромосомных генов V. cholerae серогруппы 0139,состоящую из донорных и реципиен-тных штаммов.

3. Определить участок хромосомы V. cholerae серогруппы 0139,

содержащий гены 0139-антигена и капсулы.

4. Изучить особенности наследования и экспрессии клонированных генов холерного токсина и его В-субъединицы в клетках V. cholerae серогруппы 0139.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

Впервые установлено, что формирование спонтанных бескапсуль-ных мутантов V. cholerae серогруппы 0139 сопровождается утратой клетками умеренного 0139-фага. Впервые выделен транспозонный мутант ,лишенный капсулы, но сохранивший 0139-антиген.

Получены новые данные о вирулентности бескапсульнных мутантов. Показано, что значительное снижение их вирулентности связано не только с отсутствием капсулы,которая обеспечивает резистентность холерных вибрионов 0139 серогруппы к бактерицидному действию нормальной человеческой сыворотки, но и с пониженной продукцией маннозо-чувствительных геагглютинирующих пилей адгезии, а также с уменьшением подвижности, которые являются факторами пато-генности.

Впервые для генетического анализа V. cholerae серогруппы 0139 создана система коньюгационного переноса хромосомных генов, состоящая из донорных и реципиентных штаммов. Донорные штаммы соответствуют типу Hfr и имеют различные точки начала переноса. Поли-маркированные реципиентные штаммы несут мутации как в различных генах ауксотрофности, так и в ряде генов вирулентности.

В результате применения созданной коньюгационной системы впервые построена генетическая карта участка хромосомы V.cholerae 0139, включающая 23 генетических маркера. Определена также локализация на хромосоме генов rfb 0139 и cap, контролирующих синтез 0139-антигена и капсулы, соответственно.

Впервые показано стабильное наследование и эффективная экспрессия в клетках V. chlerae 0139 клонированных генов ctxAB и ctxB, определяющих биосинтез холерного эльтор токсина и его Всубъединицы. Показано, что присутствие чужеродных генов вирулентности в составе рекомбинантных плазмид не влияет на экспрессию ряда собственных факторов патогенности.Важным итогом этой работы явилось получение двух штаммов V. cholerae серогруппы 0139 с повышенной продукцией холерного токсина и иммуногенной В-субъеди-ницы холерного токсина.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ .

Создана коллекция генетически маркированных штаммов V. cho-lerae 0139 серогуппы два донорных и семь реципиентных штаммов, которая депонирована в Российской коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ "Микроб". Данные штаммы могут быть использованы для изучения генетической организации холерных вибрионов 0139 серогруппы и создания штаммов с необходимыми свойствами. Полученные штаммы V. cholerae серогруппы 0139 с повышенной продукцией холерного токсина и его В-субъединицы могут быть использованы для приготовления вакцинных препаратов.

По материалам диссертации написаны методические рекомендации" Идентификация капсульных и бескапсульных штаммов V. cholerae 0139 серогруппы с помощью 0139-агглютинирующей сыворотки.", которые были одобрены Ученым советом Российского науцно-исследова-тельского противочумного института "Микроб".

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Получены спонтанные и транспозонный мутанты , утратившие капсулу , но сохранившие 0139-антиген. Образование спонтанных бескапсульных мутантов сопровождалось потерей клетками умеренного 0139-фага. Низкая вирулентность бескапсульных мутантов связана не толеко с утратой капсулы, которая обеспечивает резистентность холерных вибрионов к бактерицидному действию нормальной человеческой сыворотки, но и понижением продукции таких факторов патоген-ности, как маннозо-чувствительные гемагглютинирующие пили адгезии, а также с уменьшением их подвижности.

2. На модели V. cholerae 0139 серогруппы создана коньюгаци-онная система, включающая донорные штаммы типа Hfr , имеющие две различные точки начала переноса хромосомных генов, и реципиентные штаммы, несущие мутации в различных генах ауксотрофности, а также в генах, контролирующих биосинтез 139-антигена, капсулы, гемолизина, маннозо-чувствительных пилей адгезии и определяющих подвижность вибрионов .

3. Построена генетическая карта участка хромосомы V. cholerae 0139 серогруппы, на котором определена локализация генов rfb0139 и cap, контролирующих синтез 0139-антигена и капсулы, соответс-

твенно, а также 21 генетического маркера ауксотрофности.

4. Структурные гены холерного эльтор токсина и его В-субъ-единицы, стабильно наследуются и эффективно экспрессируются в клетках V. cholerae 0139. Присутствие чужеродных генов вирулентности в клетках холерных вибрионов 0139 серогруппы не влияет на экспрессию ряда собственных генов патогенности.

АПРОБАЦИЯРАБОТЫ. Материалы диссертации доложены на научных конференциях РосНИПЧИ "Микроб", Саратов, 1994, а также на 1-ом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Саратов, 1994 г.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 5 научных статей.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, трех глав обзора литературы, описания материалов и методов, трех глав собственных исследований, заключения, выводов. Работа изложена на 153 страницах машинописного текста, иллюстрирована 11 рисунками и 17 таблицами. Список литературы включает 215 работ.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Штаммыбактерий. Использовались генетически маркированные штаммы, производные Е. coli, а также штаммы V. cholerae Ol серогруппы (569В, МАК757) и V. cholerae 0139 серогруппы (PI6064, М0-45), которые были получены из отечественных и зарубежных лабораторий. Кроме того в работе были использованы сконструированные нами штаммы V. cholerae 0139 серогруппы, отличающиеся вирулентностью, содержанием плазмид и генетическими маркерами.

Методы. В разделе содержится описание бактериологических методов , используемых при исследовании свойств холерных вибрионов; иммунологических - реакция пассивного иммунного гемолиза на плотной среде, реакция преципитации, получение 0139-агглютини-рующей холерной антисыворотки, определение продукции маннозо-чув-ствительных пилей адгезии; биохимических- определение гидрофоб-ности клеточной стенки вибрионов; генетических методов- индуциро-

ванный нитрозогуанидином мутагенез, конъюгации, картирование хромосомных генов; молекулярно-биологических - выделение и скрининг анализ плазмидной ДНК. Вирулентность изучаемых штаммов проверяли путем внутрибрюшинного заражения белых мышей и внутрикишечного заражения крольчат-сосунков.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Получение и свойства спонтанных и транспозонных мутантов V. cholerae 0139 серогруппы с измененной продукцией капсулы и 0139-антигена.

В работе был использован штамм V. cholerae 0139 серогруппы Р16064 Н1у", Тох+, прототроф , выделенный в 1993 году в г. Азове Ростовской области из испражнений больного с типичной клиникой холеры, прибывшего из Бангладеш.

Исходный штамм V. cholerae Р16064 продуцировал полисахарид-ную капсулу и при рассеве на плотных питательных средах формировал непрозрачные колонии , которые были обозначены как Р16064-0 (от англ. opacity - непрозрачный). Однако популяционный состав данного штамма был неоднороден и среди плотных непрозрачных колоний, нами были обнаружены колонии с типичной для холеры прозрачной, голубоватой морфологией , получившие обозначение Р16064-Т (от англ. translucent -прозрачный), частота образования которых составляла 3 х 10"3 . Реверсия к исходному непрозрачному фенотипу при выращивании in vitro и пассажах на животных не наблюдалось. При использовании электронной микроскопии было обнаружено, что морфология колоний штамма Р16064 четко коррелирует с продукцией вибрионами капсулы. Непрозрачные клоны продуцировали выраженную капсулу, тогда как прозрачные были лишены ее. Продукция капсулы была также подтверждена при изучении гидрофобности поверхности клеток двух морфологически разных клонов штамма Р16064.

Принимая во внимание тот факт, что капсульный слой, находясь на поверхности бактериальной клетки, может маскировать 0-боковые цепи ЛПС, а также рецепторы для холерных фагов, мы провели сравнительный анализ серологических и фаголизабельных свойств О- и Т-клонов штамма Р16064 . Оказалось, что продуцирующие капсулу клоны имеют более замедленную реакцию агглютинации на стекле с

0139-антисывороткой, а в развернутой реакции титр агглютинации клеток капсульных клонов антисывороткой к V. cholerae серогруппы 0139 был в 8 раз ниже такового в случае бескапсульных вариантов.

Кроме того, было обнаружено, что колонии спонтанно утратившие капсулу, приобрели чувствительность к некоторым холерным фагам ( ХДФ 4, 5 и ТЭПВ 1,4 ).

Практически важным результатом этого исследования явилась разработка методического приема для идентификации капсульных и бескапсульных клонов V. cholerae серогруппы 0139 по интенсивности реакции агглютинации с поликлональной антисывороткой к 0139-анти-гену.

Высокая частота возникновения спонтанных бескапсульных мутантов, а также их неспособность к реверсии позволяют предположить участие в этом событии генетических механизмов. Поскольку Н.М.Остроумова и ряд зарубежных исследователей обнаружили присутствие в клетках НАГ-вибриона 0139 серогруппы умеренного фага, относящегося ко II серотипу III иммунотипу, мы проверили О- и Тклоны штамма Р16064 на лизогенность. Оказалось, что все имеющие капсулу клетки являются лизогенными по умеренному фагу, тогда как клетки бескапсульных клонов не содержали фаг ( эти данные в дальнейшем были подтверждены сотрудниками нашей лаборатории с помощью метода ДНК/ДНК гибридизации).

Появление спонтанных бескапсульных мутантов обусловлео, видимо, неточным вырезанием профага, сопровождающимся хромосомными перестройками в участках, прилегающих к сайту локализации фага. В результате такого события спонтанные мутанты утратили не только капсулу, но и прототрофность, став зависимыми по пурину. Кроме того,у спонтанных мутантов заметно снизилась подвижность, а также продукция маннозо-чувствительных пилей адгезии, протеазы, фосфо-липазы, нейраминидазы. Плейотропный характер спонтанной мутации к фенотипу Сар" позволяет высказать предположение о том, что гены, участвующие в синтезе пурина, а также указанных факторов вирулентности (МЧПА, протеазы, фосфолипазы, нейраминидазы и подвижности) могут быть локализованы в одном участке хромосомы V. cholerae серогруппы 0139 вблизи генов cap. В этой связи, перспективным направлением дальнейших исследований является проведение более тонкого картирования сар-области с целью выяснения взаимоотношений между названными генами патогенности.

Спонтанных мутантов с нарушенной продукцией 0139-антигена нам выделить не удалось.

Для получения мутантов с измененной продукцией капсулы и 0139-антигена мы также использовали транспозонный мутагенез. Для проведения указанной работы были взяты транспозоны Тп5-МоЬ и TnphoA, определяющие устойчивость к канамицину. Вектором для введения в клетки НАГ-вибриона транспозона TnphoA служила плазми-да-"самоубийца" pRT733, а транспозона Tn5-Mob - плазмида pSUP5011. Так как указанные транспозоны способны внедряться во многие сайты бактериальной хромосомы, все полученные нами клоны штамма Р16064 , несущие транспозоны в хромосоме, проверяли на продукцию 0139-антигена, капсулы, ряда ферментов, подвижность и питательные потребности. Среди 157 клонов, несущих TnphoA в хромосоме было обнаружено лишь три мутанта: 1) бескапсульный, 2) неподвижный и 3) ауксотроф, нуждающийся в изолейцине.

Среди клонов штамма Р16064, несущих в хромосоме транспозон Tn5-Mob, был выделен только один мутант с нарушенной продукцией 0139-антигена, который имел шероховатую форму ЛПС.

У транспозонных бескапульных мутантов^ выделенных ранее группой зарубежных исследователей ( Comstock L.E. et al.,1995 ), утрата капсулы сопровождалась нарушением синтеза 0139-антигена на основании чего предполагалось, что синтез обоих полисахаридов контролирует один ген. Впервые выделенный нами бескапсульный транспозонный мутант, сохранивший 0139-антиген, появился, видимо, в результате внедрения транспозона TnphoA в ген cap, послольку этот мутант оставался прототрофом, лизогенным по фагу 0139 и с неизмененной продукцией ферментов. В то же время у этого бескап-сульного мутанта понизилась подвижность и продукция маннозо-чувс-твительных пилей адгезии, что может быть обусловлено индуцированием транспозоном, включившимся в ген cap, вторичных перестроек в хромосомном участке, прилегающем к сайту внедрения этого Тп-эле-мента. Получение транспозонного мутанта, утратившего капсулу, но сохранившего 0139-антиген, является свидетельством того, что синтез полисахаридной капсулы и 0139-антигена контролируют разные гены. Маркированный Tn-элементом ген cap может быть использован далее в экспериментах по его клонированию.

Большой интерес представляет изучение роли капсулы в вирулентности нового НАГа. Было установлено, что продуцирующие капсу-

лу клоны Р16064 в отличие от спонтанных и транспозонного мутантов были резистентны к бактерицидному действию нормальной человеческой сыворотки (НЧС), за счет чего приобрели способность размножаться в кровяном русле.

Кроме того, высокая вирулентность капсульных клонов подтверждается тем, что LD50 для них значительно ниже ( 1,0 х 106 м.т.), чем У бескапсульных спонтанных (1,0 х 108 м.т.) и транспо-зонных (3,1 х 108м.т.) мутантов. Вместе с тем, нельзя исключать и той возможности, что высокая вирулентность клонов Р16064 Сар+ обеспечивается не только капсулой, но также подвижностью вибрионов и их маннозо-чувствительными пилями адгезии, поскольку транс-позонный бескапсульный мутант имел пониженный уровень продукции этих факторов. В этой связи, перспективным является дальнейшее изучение вклада капсулы в патогенность вибрионов 0139 серогруппы путем получения и всестороннего анализа либо неподвижных и не продуцирующих МЧПА мутантов, но сохранивших капсулу, либо бескапсульных мутантов, имеющих указанные детерминанты вирулентности (Mostow P., Richardson К.,1990; Johnson J.A. et al.,1992,1994; Ichinose Y. et al.,1994; Kaper J.B. et al.,1995).

Таким образом, итогом исследований, представленных в первом разделе экспериментальной части, является выделение двух типов бескапсульных мутантов ( спонтанных и транспозонного) и получение сведений об их серологических, фаголизабельных и вирулентных свойствах.

2. Генетическое картирование г!:Ы39-локуса, определяющего синтез 0139-антигена.

Отсутствие единого мнения относительно генетического контроля биосинтеза 0139-антигена и капсулы, а также отсутствие информации о локализации генов rfb0139, ответственных за синтез 0139-антигена и cap, определяющего синтез полисахаридной капсулы, на хромосоме послужило основанием для создания коньюгационной системмы переноса хромосомных генов V. colerae серогруппы 0139, состоящей из донорных и реципиентных штаммов. Для решения этой задачи впервые на основе штамма Р16064 серогруппы 0139 при использовании индуцированного нитрозогуанидином мутагенеза было создано более 60 полимаркированных штаммов, которые помимо мута-

ций в генах ауксотрофности имели повреждения в генах, контролирующих биосинтез некоторых факторов патогенности и иммуногенности, а именно, в генах ответственных за синтез 0139-антигена, капсулы, протеазы, подвижности и адгезинов. Частота реверсии большенства введенных мутаций не превышала 10~8 - 10~9 . Полученные штаммы были использованы в качестве реципиентов.

Для конструирования донорных штаммов была использована предложенная в 1984 году R.Simon бинарная система, состоящая из транспозона Tn5-Mob ( KmR) и плазмиды-помощника pRP4-4 (Kms TcR ApR)• Указанную плазмиду-помощник вводили в клетки 6 независимо полученных нами ране клонов V. cholerae ehr::Tn5-Mob путем коньюгационного скрещиванния их с E.coli С600(pRP4-4). При проверке созданных трансконьюгантов Р16064 ehr : :Tn5-Mob(pRP4-4) на донорные свойства в скрещиваниях их с полиауксотрофным реципиентом V. cholerae КМ2367 his-91, trp-90, ilv-93, RifR было обнаружено, что все б донорных штаммов обладали способностью к переносу хромосомных маркеров. Анализ данных о частоте наследования рекомбинантами селектируемых маркеров доноров, а также о частоте совместного наследования ими селектируемых и неселектируемых маркеров позволил сделать вывод о том, что создано две группы Hfr-доноров, отличающихся друг от друга точкой начала и направлением переноса хромосомных маркеров. В первую группу входят 5 донорных штаммов, у которых точка начала переноса хромосомы локализовалась в районе trp-90, а перенос осуществляется в направлении trp-his-ilv. Для последующей работы из этой группы донорных штаммов был выбран один штамм, который мы обозначили КМ2362. Во вторую группу входил лишь один донорный штамм, который был обозначен как КМ2370. Точка начала переноса хромосомы у данного донора была локализована в районе ilv-93, а перенос хромосомы происходил в направлении ilv-his-trp.

Принимая во внимание данные о значительном генетическом сходстве V. cholerae 0139 с холерными вибрионами биовара эльтор мы предположили, что локус rfb-0139, определяющий синтез 0139-антигена, может быть локализован в том же районе хромосомы, что и локус rfb-01, детерминирующий синтез Ol-антигена у вибрионов эльтор. Анализ генетических карт хромосомы холерных эльтор вибрионов, построенных разными группами исследователей ( Смирнова Н.И. с соавт.,1980; Guidolin A.,Manning Р.А.,1987 ) свидетельствует о

том, что локус rfb-01 располагается в хромосомной области, содержащей следующие гены ауксотрофности: ile, val, ilv, lys, arg, pur, thi. В этой связи, на первом этапе работы были проведены эксперименты по определению порядка локализации указанныых маркеров ауксотрофности на хромосоме штамма Р16064. Были проведены гомологичные скрещивания донорных штаммов КМ2362 и КМ2370 с реципи-ентными штаммами КМ2363, КМ2368, КМ2383, Км237б, КМ2367, КМ2364, КМ2389, КМ2387, КМ2365, характеристика которых дана в таблице 1.

Построение генетической карты хромосомы НАГ-вибриона осуществлялось на основе данных о частоте образования селектируемых классов рекомбинантов ипоказателей совместного наследования селектируемых маркеров с неселектируемыми, которые определялись в каждом скрещивании. Однако в таблице 2 приведены результаты полученные лишь в скрещиваниях донорного штамма КМ2362 с реципиентным штаммом КМ2364. На основе показателей сцепленности двух маркеров (см. табл.2, графа 4) были определены растояния (RD) между генами в условных единицах (табл.2, графа 5) и построены по описанному ранее способу ( Parker Ch. et al.,1979 ) диаграммы, показывающие локализацию генов на хромосоме. В результате анализа диаграмм.

Таблица 1.

Полиауксотрофные мутанты О- и Т-клонов V. cholerae Р16064 RifR , полученные с помощью нитрозогуанидина

1 1 Штаммы 1 1 1 1 Характеристика 1

1 1КМ2363 i llys- 90 ura- 90 ilv-95

1КМ2383 llys- 90 ura- 90 ilv-95 his-92

1КМ2376 1 lys- 90 arg- 92 ile-90 val-90 hly- 90 msh- 92

1КМ2389 1 lys- 90 ura- 90 ilv-95 his-92 pur- 92 cap- 91 rfb- 96 1

1КМ2367 1 his- 91 trp- 90 ilv-93

1КМ2368 Ihis- 91 trp- 90 ilv-93 arg-93 lys- 91 mot- 90

1КМ2365 1 pur- 90 ilv- 97 arg-97 cap-90

1КМ2387 Ipur- 90 ura- 91 his-90 cap-90

1КМ2364 Ipur-1 90 ura- 91 his-90 arg-90 ilv- 91 cap- 90 rfb- 90 msh-901 i

Таблица 2 .

Показатели сцепления маркеров донора V. сЬо1егае 0139 серогруппы КМ2362 при скрещивании его с реципиентным штаммом У.с1ю1егае 0139 серогруппы КМ2364

Г

Селектируемый маркер

|Неселекти-Iруемый мар-Iкер, с ко-Iторым уста-|навливается |сцепление

Показатели сцепленности селектируемых маркеров с неселектируемыми

"Т"

количество*

LF* *

RD* * *

pur-90

ura-91

his-90

arg-90

ilv-91

Iura-91

Ihis-90

Iarg-90

Iilv-91

Ipur-90

Ihis-90

Iarg-90

Iilv-91

Ipur-90

Iura-91

Iarg-90

Iilv-91

Ipur-90

Iura-91

Ihis-90

Iilv-91

Ipur-90

Iura-91

Ihis-90

Iarg-90 J_

1 /121 1 0,008 1 4 ,82

68/121 1 0,56 1 0,57

102/121 1 0,84 1 0,17

21/121 1 0,17 1 1,70

16/22 1 0,72 1 0, 32

19/22 I 0,86 1 0,15

16/22 1 0,72 1 0, 32

15/22 | 0,68 | 0,38

39/242 1 0,16 1 0,18

1/242 I 0,004 1 5,52

41/242 1 0,16 1 0,18

28/242 1 0,11 1 0,22

96/181 1 0,53 1 0 ,63

5/181 1 0,03 1 3 , 50

86/181 1 0,48 1 0,73

53/181 1 0,29 1 1,20

152/154 1 0,98 1 0,02

3/154 I 0,02 1 3,90

42/154 1 0,27 1 1,30

115/154 1 0,75 1 0, 28

Примечание: * В числителе-число рекомбинантов, получивших неселектируемый маркер донора, в знаменателе-число рекомбинантов с селектируемым маркером.

** LF - отношение числа рекомбинантов с неселек-тируемым маркером к числу рекомбинантов с селектируемым маркером.

*** RD - относительное растояние между генами определенное по уравнению Ch. Parker et al.(1979). При определении RD учитывали LF>0,01.

впервые была установлена локализация на хромосоме V. cholerae 0139 20 генов, контролирующих синтез аминокислот и оснований (рис.1). Выявлено две группы сцепленных генов. Первая группа включает маркеры trp-90, his-90,91,92, вторая - arg-90,92,93,97, pur-90,92, lys-90,91, ilV-91,93,95,97, val-90, ile-90, ura-90,91.

Сопоставление полученных данных с результатами картирования хромосомы V. cholerae биовара эльтор показало, что существует значительное сходство между генетическими картами двух возбудителей холеры. Эти данные подтверждают полученные ранее сведения о филогенетическом родстве этих вибрионов.

Для определения локализации на хромосоме V. cholerae 0139 серогруппы генов, ответственных за синтез 0139-антигена и полиса-харидной капсулы, были проведены скрещивания донорного штамма КМ2370, продуцирующего неизмененный 0139-антиген и полисахаридную капсулу, имеющий точку начала переноса хромосомы вблизи ilv, с полиауксотрофным бескапсульным реципиентом КМ2364, несущим также мутацию в rfb-области. Анализ данных о частоте наследования селектируемых маркеров и результатах совместного наследования селектируемых маркеров с неселектируемыми показал, что маркер ura-91 является проксимальным по отношению к точке начала переноса хромосомы за которым происходит последовательный перенос генов i1v-pur-arg-his. Донорный аллель rfb0139 наследовался рекомбинан-тами, получившими маркеры ura+,ilv+, arg+, pur* (Табл.3). Причем, наиболее высокий показатель сцепления (20%) обнаружен между маркерами rfb0139 и ilv-91. В тоже время маркер ilv-91 был тесно сцеплен с маркером pur-90, указанные гены совместно наследовались в 51 - 62 X случаев. При этом ген pur-90 является по сравнению с геном ilv-91 более дистальным по отношению к точке начала переноса хромосомы, т.к. частота совместного переноса этих маркеров в случае отбора Pur+-рекомбинантов (62,0%) была выше таковой при селекции клонов Ilv* (51,0%). Однако Pur+-рекомбинанты наследовали донорный аллель rfb0139 лишь в 3,6 % случаев, при этом все Pur+ rfbol39+ -рекомбинанты одновременно приобрели маркер Ilv+. Эти данные могут указывать на то, что гены rfb0139 локализованы, видимо, проксимальнее маркера ilv-91. На такую локализацию указывает также тот факт, что среди рекомбинантов, получивших маркеры arg-90 и rfb0139, более половины клонов получили аллель ilv-91. Таким образом было показано, что ген rfb0139 локализован вблизи

Таблица 3.

Показатели сцепления маркеров донора КМ2370 при скрещивании его с реципиенто КМ2364

1 1Селекти- i l |Неселекти- | Показатели сцепленности 1 1 1

1руемый 1руемый мар-| селектируемых маркеров с 1

1 маркер |кер,с кото-1 неселектируемыми I RD* * *| 1 1

1 рым уста- 1 1 1

1навливается| Количество * 1 LF** 1

1 сцепление | 1 1 1 1 |

| 1 1 1 1 2 | I I 1 3 I I 4 1 1 5

Ipur-90 1 1 1 ura-91 | 1 1/191 1 0,005 1 1 5, 29 |

1 h is-9 0 | 2/191 | 0,010 1 4, 60 |

1 arg-90 | 20/191 | 0,110 1 2, 20 |

1 ilv-91 | 111/191 | 0,620 1 0, 47 |

1 cap-90 | 63/191 | 0,330 1 1 , 10 |

I rfb-90 | 7/191 1 0,030 1 з. 50 |

1ura-91 1 pur-90 | 13/235 | 0,050 1 2, 99 |

1 h is-90 | 5/235 | 0,020 1 з. 91 |

1 arg-90 | 15/235 | 0,060 1 2, 81 |

1 ilv-91 | 2/235 | 0,005 1 5, 29 |

I cap-90 | 15/235 | 0,063 1 2, 76 |

1 rfb-90 | 5/235 | 0,021 1 з, 86 |

1arg-90 I pur-90 I 44/210 | 0,200 1 1, 60 |

1 ura-91 | 2/210 | 0,010 1 4, 60 |

i his-90 | 8/210 | 0,030 1 з, 50 |

1 ilv-91 | 30/210 | 0,140 1 1 96 |

1 cap-90 | 108/210 | 0,520 1 0, 65 |

i rfb-90 | 13/210 | 0,062 1 2, 78

Iilv-90 I pur-90 I 154/209 | 0,510 1 0, 67 |

1 ига-У1 | 0/209 | 0,000 1 0, 00 |

I his-90 | 9/209 | 0,040 1 3, 21 !

i arg-90 I 24/209 | 0,110 1 2 20 |

I cap-90 i 36/209 | 0,170 1 1 77 |

i | rfb-90 1 i i 42/209 | 1 0,200 | 1 1 60 | 1

Примечание: * В числителе -число рекомбинантов, получивших неселектируемый маркер донора, в знаменателе -число рекомбинантов с селектируемым маркером.

** LF - отношение числа рекомбинантов с неселек-тируемым маркером к числу рекомбинантов с селектируемым маркером *** RD - относительное растояние между генами, определенное по уравнению Ch. Parker et al.(1979) . При определении RD учитывали LF>0,01.

гена ilv-91 ( рис.1), что совпадает с локализацией гена rfbOl на хромосоме V. cholerae биовара эльтор.

Для определения локализации гена cap, ответственного за синтез капсулы, на хромосоме V. cholerae 013 9 серогруппы, у всех полученных рекомбинантов определяли морфологию колоний , а в ряде случаев наследование гена cap подтверждали с помощью электронной микроскопии. Оказалось, что ген cap наследовался в качестве несе-лертируемого маркера 4я классами рекомбинантов

Ura+ , Ilv+ , Arg+ , Pur+ Среди указанных классов наиболее часто наследовали неселектируемый маркер cap рекомбинанты Arg+(52 %) и Pur+(33 %).Кроме того, Агд+-рекомбинанты с большей частотой наследовали маркер cap (52 %), чем маркер pur-90 (20 %). Эти данные свидетельствуют о том, что на хромосоме штамма Р16064 ген cap локализован между генами arg и pur (рис.1).

Полученные нами данные показывают, что биосинтез капсулы и 0139-антигена контролируют разные хромосомные гены, которые находятся в одной группе сцепления, однако отдалены друг от друга , по крайней мере, двумя генами ауксотрофности ( ilv и pur ).

Учитывая данные о том, что на хромосоме вибрионов биовара эльтор в rfb- области локализованы также другие гены патогеннос-л.

ГЪ

^— —.

<=> О --

CJ1 \гг» oï

! I I

а) — >

(_ч" СЭ

\zr> СП 1 СП «=г>

о. m 1 о

>> ni <L. с.

о 1 <4 « « г* •

Рис.1. Генетическая карта хромосомы V. cholerae 0139 серогруппы, составленная на основе результатов коньюгацион-ных скрещиваний донорных и реципиентных штаммов.

* Маркеры, точная локализация которых от близь лежащих генов ауксотрофности не установлена .

В скобки заключены маркеры точная локализация которых на хромосоме не известна.

ти, можно предположить, что в хромосоме холерных вибрионов 0139 серогруппы, как и у других патогенных вибрионов, имеется " остров патогенности", содержащий блок тесно сцепленных генов, контролирующих синтез различных факторов вирулентности.

Разработанная нами коньюгационная системма может быть использована в дальнейших экспериментах по изучению структуры и функции генома.нового возбудителя холеры.

3. Изучение особенностей наследования и экспрессии клонированных генов холерного токсина и его В-субъединицы в клетках V.cholerae 0139 серогруппы.

Высокая вирулентность V. cholerae 0139 серогруппы и отсутствие на сегодняшний момент коммерческих профилактических препаратов может привести к значительным эпидемическим осложнениям, вызванным новым возбудителем холеры. Одним из возможных направлений в решении данной проблеммы является получение химической вакцины холероген-анатоксин на основе штамма V. cholerae 0139 серогруппы, содержащей 0139-антиген и В-субъединицу холерного токсина, которая обеспечит формирование как антибактериального, так и антитоксического иммунитета в отношении вибриона 0139 серогруппы. Однако, холерные вибрионы 0139 серогруппы продуцируют и секретируют в среду выращивания незначительное количество холерного токсина (1мкг/мл). В связи с этим перед нами была поставлена задача, изучить особенности наследования и экспрессии клонированных генов ctxAB и ctxB V. cholerae биовара эльтор в клетках нового хозяина с целью выявления клонов с повышенной продукцией холерного токсина и его В-субъединицы. Для этого в клетки исходного продуцирующего капсулу штамма Р16064 и его спонтанного бескапсульного мутанта были введены ранее сконструированные ( Гинцбург А.Л. с со-авт.,1984; Ильина Т.е. с соавт.,1990) рекомбинантные коинтеграт-ные коньюгативные плазмиды рСОЮ7-2 и р1ЕМЗ, содержащие клонированные гены ctxAB и ctxB соответствнно.

Плазмида рС0107-2 состоит из двух плазмид: 1) рекомбинантной плазмиды рСТ105, содержащей ген устойчивости к Тс, транспозон mini-kan, обеспечивающий резистентность к канамицину, и вставку хромосомной ДНК размером 7,0 т.п.н., несущую оперон ctxAB и прилегающую к нему RS1 последовательность; 2) коньюгативной плазмиды

рОХ38. Объединение репликонов происходит за счет последовательностей RS1.

Плазмида р1ЕМЗ также состоит из двух плазмид: 1) рекомби-нантной плазмиды pIEMl , меченной транспозоном mini-kan, детерминирующим резистентность к канамицину, и содержащей ISl-последова-тельность; 2) плазмиды рСТд27, которая несет ген устойчивости к Тс и клонированный фрагмент с геном ctxB. Формирование коинтегра-та происходит за счет IS1 элементов.

На присутствие рекомбинантных плазмид в клетках V. cholerae Р16064 указывала резистентность трансконьюгантов к канамицину и тетрациклину, а также данные полученные при определении плазмид-ного состава KmRTcR клонов с помощью электрофореза в агарозном геле. Однако, при пересевах и повторных проверках полученных клонов по маркерам резистентности к антибиотикам было обнаружено, что все продуцирующие капсулу трансконьюганты утратили маркер резистентности к Km, кодируемый транспозоном mini-kan. Появление TcR Kms клонов было связано с разъединением коинтеграта и сохранением в клетках лишь рекомбинантных плазмид, несущих гены холерного токсина или его В-субъединицы. В случае плазмиды рСОЮ7-2, разъединение коинтеграта сопровождалось также утратой транспозона mini-kan. Эти данные были подтверждены при изучении плазмидного состава трансконьюгантов по методу Kado C.I, Liu S.Т.(1981). В клетках бескапсульных клонов коинтеграт сохранялся стабильно.

Полученные трансконьюганты, несущие рекомбинантные плазмиды, продуцировали и секретировали в среду выращивания около 8 -10 мкг/мл холерного токсина или его В-субъединицы, что было определено в реакции пассивного иммунного гемолиза и реакции преципитации в геле с антисывороткой к холерному токсину в сравнении с вы-сокотоксигенным штаммом V. cholerae 569В.

Учитывая тот факт, что в производственных условиях для приготовления вакцины холероген-анатоксин выращивание штаммов производят на полноценной среде без добавления антибиотиков, мы определили стабильность наследования рекомбинантных плазмид в неселективных условиях. Наиболее стабильными сказались лишенные капсулы трансконьюганты, у которых значительная часть клеток ( 87 -100 %) в неселективных условиях сохраняла меченные тетрациклином плазмиды с клонированными генами ctxAB и ctxB , либо в составе коинтеграта либо как самостоятельный репликон. Что касается имею-

щих капсулу трансконьюгантов, то появления Тск Кт5-клонов, утративших плазмиду, происходило чаще (16 -61 %). Добавление в среду выращивания тетрациклина приводило к 100 % стабильности рекомби-нантных плазмид.

Для выяснения, влияют ли чужеродные гены сЪхАВ и с!хВ на экспрессию собственных генов V. с1ю1егае 0139, у полученных трансконьюгантов изучалась продукция ряда антигенов. Оказалось, что присутствие рекомбинантных плазмид практически не влияет на продукцию таких факторов патогенности и иммуногенности как проте-аза, фосфолипаза, нейраминидаза, маннозо-чувствительные пили адгезии, 0139-антиген и подвижность.

Таким образом, с помощью рекомбинантных плазмид были созданы штаммы холерного вибриона 0139 серогруппы, продуцирующие и секре-тирующие в среду выращивания значительное количество холерного токсина и его В-субъединицы. Эти штаммы, продуцирующие холерный токсин и другие протективные антигены, на наш взгляд могут, быть использованы для создания химических вакцин.

ВЫВОДЫ.

1. Выделены спонтанные и транспозонный мутанты, V. cholerae серогруппы 0139, утратившие капсулу но сохранившие 0139-антиген. Показано, что потеря капсулы спонтанными мутантами сопровождается утратой ими умеренного фага. Обнаружено, что капсула маскирует О-антигенные цепи ЛПС, а также рецепторы к некоторым холерным фагам.

2. Капсула является фактором патогенности V. cholerae серогруппы 0139, обеспечивающим резистентность клеток к бактерицидной активности нормальной человеческо сыворотки. Низкая вирулентность бескапсульных мутантов для белых мышей обусловлена как утратой капсулыы, так и снижением подвижности, а также продукцией маннозо-чувствительных пилей адгезии.

3. Создана система коньюгационной передачи хромосомных генов V. cholerae 0139 серогруппы. Сконструированы эффективные Hfr-донорные штаммы с различными точками начала передачи хромосомы. Получен набор множественно маркированных штаммов холерного вибриона серогруппы 0139, состоящий из 61 полиауксотрофного мутанта, которые могут быть использованы в качестве реципиентов.

4. С помощью коньгационных скрещиваний определена локализация на хромосоме V. cholerae 0139 серогруппы 23 генов. Показано, что биосинтез капсулы и 0139-антигена контролируют разные гены, локализованные в одном участке хромосомы .

5. Клонированные гены ctxAB и ctxB, кодирующие синтез холерного токсина и его В-субъединицы, в клетках V. cholerae биовара эльтор, стабильно наследуются и эфферктивно экс-прессируются в клетках V. cholerae серогруппы 0139. Введенные в клетку гены не влияют на экспрессию ряда собственных генов вирулентности возбудителя холеры новой серогруппы.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Чеховская Г.В., Смирнова Н.И. Создание и свойства штаммов Vibrio cholerae серовара 0139 с повышенной продукцией холерного токсина // Генетика.-1994.- Том 30.- с.177-178.

2. Смирнова Н.И., Чеховская Г.В., Давыдова Н.И. и др. Филогенетический анализ двух морфологически разных типов колоний Vibrio cholerae 0139 //Ж. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология .- 1995 . - N 3.-с.30-34.

3. Смирнова Н.И., Ерошенко Г.А., Чеховская Г.В., Ливанова Л.Ф., Давыдова Н.И., Шопырева С.В.. Создание системы коньюгацион-ного переноса хромосомы и генетическое картирование хромосомы Vibrio cholerae серогруппы 0139 //Ж. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.-1996.- N2.- с.14-18.

4. Щелканова Е.Ю.,Чеховская Г.В., Давыдова Н.И., Заднова С.П., Коннов Н.П., Смирнова Н.И. Получение и свойства двух типов бескапсульных мутантов Vibrio cholerae 0139 //Тез. докл. к Между-нар. конф."Гомеостаз и инфекц. процесс".-Саратов.-1996.-Ч.2-е.307.

5. Smirnova N.I., Chkhovskaya G.V., Davidova N.I., Livanova L.F., Yeroshenko G.A. Virulence-associated characteristics and phage lysogenicity of two morphologically distinct colonies of Vibrio cholerae 0139 serogroup // FEMS Microbiology letters .-1996.-Vol.136.-p. 175-180.