Изучение поверхностных полисахаридных антигенов штаммов Vibrio cholerae O139 различного происхождения с использованием моноклональных антител

Чемисова, Ольга Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение поверхностных полисахаридных антигенов штаммов Vibrio cholerae O139 различного происхождения с использованием моноклональных антител
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение поверхностных полисахаридных антигенов штаммов Vibrio cholerae O139 различного происхождения с использованием моноклональных антител"

На правах рукописи

^^ □03054436

ЧЕМИСОВА ОЛЬГА СЕРГЕЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ ПОВЕРХНОСТНЫХ ПОЛИСАХАРИДНЫХ АНТИГЕНОВ ШТАММОВ У1ВЮО СНОЬЕЯАЕОХУ) РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону 2007 г.

Работа выполнена в Ростовском-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском противочумном институте Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Алексеева Людмила Павловна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Девдариани Зураб Леванович

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Прохватилова Елена Валерьевна

Ведущая организация: ФГУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится « часов на заседании

диссертационного совета Д 208.678.01 по присуждению ученой степени доктора (кандидата) наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб»

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета:

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник

А.А. Слудский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Традиционно возбудителем холеры считались только штаммы Vibrio cholerae Ol серогруппы. Однако в 1992 году в Индии и Бангладеш были зарегистрированы случаи заболевания холерой, вызванные вибрионами, не агглютинирующимися Ol-сывороткой (Albert M.J. et al., 1993; Ramamurthy Т. et al., 1993), впоследствии обозначенными как V. cholerae 0139 синоним Бенгал (Shimada Т. et al., 1993). Эпидемические проявления холеры, обусловленной холерными вибрионами 0139, ежегодно отмечают в Индии и Бангладеш с заносами и распространением по странам Азии. Зарегистрированы без распространения завозы холеры Бенгал в Великобританию, Германию, Данию, Казахстан, Киргизию, Россию, США, Японию (Москвитина Э.А. с соавт., 2003)

В результате молекулярно-генетических исследований были получены данные, указывающие на большое сходство холерных вибрионов 0139 с возбудителем холеры 01 серогруппы биовара eltor (Cholerae Working Group, 1993; Calia K.E. et al., 1994; Johnson J.A. et al., 1994; Waldor M.K., Mekalanos J.J., 1994 и др.). В то же время выявлены и важные отличительные особенности нового возбудителя холеры, а именно - продукция ранее неизвестного О-антигена и наличие полисахаридной капсулы (Hisatsune К. et al., 1993; Johnson J.A. et al., 1994; Weintraub A. et al., 1994 и др.).

Характеристике свойств вибрионов «Бенгал», в том числе липополисахариду и капсуле, посвящено большое количество публикаций. Так, установлено, что отличительной чертой ЛПС V. cholerae 0139 является короткая О-боковая цепь и отличный от 01 серогруппы углеводный состав. Рядом авторов показано наличие сходных повторяющихся единиц в структуре О-цепи ЛПС и капсульном полисахариде (Waldor M.K. et al., 1994; Comstock L.E. et al., 1995). Выявлены общие антигенные детерминанты с другими микроорганизмами: V.cholerae 022 и 0155, Aeromonas trota, V mimicus, Escherichia coli 055, Salmonella greenside (Albert M.J. et al., 1995; Knirel Y.A. et al., 1996; Oscarson S. et al., 1997; Landersjo C. et al., 1998). Обнаружено, что капсула маскирует О-антигенные цепи ЛПС, а также рецепторы к некоторым холерным фагам, на основании чего был предложен метод идентификации капсульных и бескапсульных штаммов при помощи умеренных холерных бактериофагов (20 и Инаба), полученных Н.М. Остроумовой из штамма холерного вибриона 01 (Щелканова Е.Ю., 1998; Чеховская Г.В. с соавт., 2000). Применение молекулярно-генетических методов позволило установить, что продукция 0139-антигена и капсулы контролируется как общими, так и различными хромосомными генами (Waldor М.К., Mekalanos J.J., 1994; Bik E.M. et al., 1995; Смирнова Н.И. с соавт., 1995). Определена локализация на хромосоме генов rjb 0139 и cap, контролирующих синтез 0139-антигена и капсулы, соответственно (Чеховская Г.В., - 1997). Имеются данные, указывающие на определенную связь между продукцией капсулы и вирулентностью V.cholerae 0139 благодаря ее участию в защите от бактерицидного действия нормальной человеческой сыворотки, в адгезии и

колонизации кишечника человека и экспериментальных животных (Waldor M. et al., 1994; Johnson I. et al., 1994; Смирнова Н.И. с соавт., 1995). Показано, что капсула является протективным антигеном (Sengupta D.K. et al., 1996; Федорова В .A. с соавт., 1997).

Однако, с момента первоначального обнаружения V. cholerae 0139 в 1992 году появились новые варианты возбудителя с измененными генетическими и фенотипическими характеристиками. Изолированы и охарактеризованы штаммы с новыми риботипами, СТХ-генотипами, измененной антибактериальной чувствительностью (Mitra R. et al., 1996; Faruque S.M. et al., 1997,1999). В 1993 г. в Аргентине впервые был выделен авирулентный штамм 0139 серогруппы, лишенный генов холерного токсина ctxAB (Rivas М.С. et al., 1993). Нетоксигенные холерные вибрионы 0139 были изолированы и из воды поверхностных водоемов на территории Российской Федерации: в Московской, Новосибирской, Ростовской областях, а также в Республике Калмыкия (Ганин B.C. с соавт., 1997; Кюрегян A.A. с соавт., 1999, 2000, 2002; Ломов Ю.М. с соавт., 2000; Крутиков В.Д. с соавт., 2002). В результате многочисленных исследований установлено, что отсутствие в хромосоме структурных генов холерного токсина является основной причиной авирулентности большого числа штаммов 0139 серогруппы (Albert M.J. et al., 1996). Показано, что штаммы, выделенные из объектов окружающей среды, лишены 70 % тестируемых генов, связанных с вирулентностью, тогда как клинические обладали полным набором этих детерминант (Осин A.B. с соавт., 2003). Выявлены различия в ПЦР-генотипах (Мишанькин Б.Н. с соавт., 2000), подвижности вибрионов, продукции маннозочувствительных гемагглютиниру-ющих пилей адгезии и белка внешней мембраны OmpU (Осин A.B. с соавт.,

1999), субстратном спектре и структуре нейраминидаз вибрионов 0139, выделенных из клинического материала и воды поверхностных водоемов (Шиманюк Н.Я. и др., 1999; Дуванова О.В., 2001). Ерошенко Г.А. с соавт. (2002) была разработана модификация метода риботипирования для изучения генетического родства штаммов V. cholerae и созданы зонды на гены 16S и 32S рРНК, позволяющие дифференцировать вирулентные и авирулентные штаммы 0139 серогруппы. В то же время, обнаружены и сходные признаки: экспрессия внеклеточных протеаз, наличие полисахаридной капсулы (Осин A.B. с соавт.,

2000). Показана способность авирулентных вибрионов 0139 агглютинироваться поликлональной сывороткой, полученной к вирулентному штамму «Бенгал», что указывает на структурное сходство О-антигенов, определяющих их серологическую специфичность. Однако данных о более детальном исследовании антигенных детерминант, входящих в состав клеточной поверхности вибрионов 0139 серогруппы, выделенных из воды, в доступной литературе мы не обнаружили.

Наряду с типичными из объектов окружающей среды могут выделяться штаммы холерных вибрионов атипичные по серологическим свойствам, в том числе со сниженной агглютинабельностью холерными О-сыворотками (Стогова А.Г. с соавт., 1989; Кожухов И.Г. с соавт., 1991; Ломов Ю.М. с соавт., 1994; Подосинникова Л.С. с соавт., 2000; Кюрегян A.A. с соавт., 2002; Безсмертный

В.Е. с соавт., 2003 и др.). И если изучению ЛПС таких измененных вариантов V. cholerae 01 серогруппы посвящено большое число работ (Shimada Т. el al., 1973; Hisatsune К., Kondo S., 1980; Сомова А.Г. с соавт., 1978; Гальцева Г.В. с соавт., 1989; Седина С.Г., Цитцер А.О., 1990; Черепахина И.Я. с соавт., 1994, 1996, 1999; Алексеева Л.П. с соавт., 1998 и др.), то сведения о поверхностных полисахаридных антигенах слабо- или инагглютинабельных штаммов V. cholerae 0139 практически отсутствуют.

Использование поликлональных О-специфических сывороток не всегда позволяет выявить особенности антигенной структуры различных вариантов вибрионов 0139 серогруппы. В большей степени для этой цели пригодны моноклональные антитела (МКА). В отечественной литературе на момент начала нашего исследования отсутствовали сведения о получении МКА к ЛПС V. cholerae 0139. Нам представляется, что привлечение последних для более детального исследования антигенной структуры штаммов 0139, выделенных из воды, поможет установить их подлинное место среди представителей вида V. cholerae.

Цель работы:

Получение моноклональных антител к липополисахариду V. cholerae 0139 и их применение для изучения антигенной структуры штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы различного происхождения и разработки экспериментальных диагностических препаратов.

Задачи исследования:

1. Выделить и очистить препараты ЛПС из клеток штаммов V. cholerae 0139, выделенных от человека и из воды, изучить их состав и иммунохимические свойства.

2. Получить гибридомы-продуценты МКА к ЛПС V. cholerae 0139, охарактеризовать их свойства.

3. Использовать МКА к ЛПС для иммунохимического анализа поверхностных полисахаридов вибрионов 0139 серогруппы различного происхождения.

4. Сравнить иммунохимические свойства штаммов V. cholerae 0139, выделенных из различных источников, в иммунологических реакциях.

5. Изучить изменения антигенной структуры у инагглютинабельных и некультивируемых форм холерных вибрионов 0139 серогруппы с помощью МКА.

6. Исследовать возможность использования МКА в качестве диагностических реагентов, разработать на их основе препараты для детекции штаммов V. cholerae 0139.

Научная новизна и теоретическая значимость

Впервые создана панель гибридом-продуцентов моноклональных антител строго специфичных в отношении ЛПС и микробных клеток возбудителя холеры 0139 серогруппы. Показано отсутствие перекрестной активности МКА с микроорганизмами, имеющими антигенное родство с холерными вибрионами

«Бенгал». Установлено, что МКА направлены к эпитопам полисахаридной части ЛПС-0139.

Получены приоритетные сведения, касающиеся структуры ЛПС штаммов V. cholerae 0139, выделенных от человека и из воды поверхностных водоемов России. Установлено, что штаммы водного и клинического происхождения имеют сходный эпитопный состав ЛПС, однако клинические штаммы проявляют более высокую антигенную активность в иммуноферментных методах, что обусловлено более плотным экспонированием полисахаридных детерминант на клеточной поверхности. С помощью иммуноблота получены новые данные, свидетельствующие о способности ЛПС холерных вибрионов 0139 серогруппы, выделенных от человека и из воды, образовывать комплексы с протеинами разной молекулярной массы.

Показана возможность применения полученных МКА для изучения вариабельности антигенной структуры у инагглютинабельных штаммов и вибрионов в некультивируемом состоянии.

Практическая ценность работы

Получены и выведены в массовую культуру гибридомы, продуцирующие МКА к серовароспецифическим антигенным детерминантам ЛПС V. cholerae 0139, которые хранятся в жидком азоте в РостНИПЧИ.

Гибридный клон D11/0139, продуцирующий моноклональные антитела к ЛПС V. cholerae 0139, депонирован в специализированной коллекции клеточных культур позвоночных Института цитологии АН России под номером РККК(П) 674Д от 17.05.2002.

На основе МКА разработан экспериментальный диагностический препарат для идентификации штаммов V. cholerae 0139 в реакции прямой иммунофлюоресценции и оформлена «Инструкция по изготовлению и контролю иммуноглобулинов холерных 0139 моноклональных люминесцирующих сухих», одобренная Ученым советом Ростовского НИПЧИ (протокол № 4 от 27.06.2002) и утвержденная директором института. На базе института проведены испытания экспериментальных серий препарата на широком наборе штаммов.

По материалам диссертации составлены методические рекомендации «Дифференциация штаммов Vibrio cholerae 0139, выделенных из клинического материала и воды, в реакции преципитации с использованием моноклональных антител» и «Выявление некультивируемых форм холерных вибрионов с помощью моноклональных антител к О-антигену в экспериментальных микрокосмах», одобренные Ученым советом Ростовского НИПЧИ (протокол № 8 от 17.06.2004 г.) и утвержденные директором института.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Полученные гибридные культуры продуцируют моноклональные антитела к ЛПС, отличающиеся строгой специфичностью в отношении холерных вибрионов 0139 серогруппы и высокой активностью в серологических реакциях, используемых в лабораторной диагностике холеры.

2. Исследование фракции деградированного полисахарида V.cholerae 0139 в твердофазном иммуноферментном анализе показало, что МКА

направлены к полисахаридной части ЛПС, а с помощью иммуноблота установлена их направленность к эпитопам структурных компонентов, локализованных в области с мол. массой ниже 16 кДа, что соответствует О-полисахариду и кору.

3. Штаммы V. cholerae 0139, выделенные от человека и из воды рек на территории России, имеют сходный эпитопный состав поверхностных полисахаридов, однако наблюдаются различия в плотности экспонирования ряда эпитопов у вибрионов этих групп, в связи с чем чувствительность иммуноферментных методов на основе моноклональных антител выше в отношении клинических штаммов по сравнению со штаммами, выделенными из воды.

4. С помощью высокоспецифичных МКА можно выявить изменения антигенной структуры у инагглютинабельных штаммов и вибрионов в некультивируемом состоянии.

5. На основе МКА созданы экспериментальные серии диагностических люминесцирующих моноклональных иммуноглобулинов, отличающиеся высокой чувствительностью и строгой специфичностью в отношении V. cholerae 0139, предназначенные для ускоренной идентификации возбудителя холеры 0139 серогруппы, и оформлена соответствующая нормативная документация.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены на научных конференциях и конкурсах молодых ученых РостНИПЧИ (2000-2003), представлены на Проблемной комиссии по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ «Холера и патогенные для человека вибрионы», Ростов-на-Дону, 2000-2002, 2005, 2006; VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера», Ростов-на-Дону, 2003; IV Межгосударственной научно-практической конференции государств участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекций», Саратов, 2003; II Межвузовской Международной конференции молодых ученых «Обмен веществ при адаптации и повреждении», Ростов-на-Дону, 2003. Исследования выполнены в рамках плановой научной темы «Антигены поверхностных структур холерных вибрионов 0139 серогруппы различного происхождения» (№ гос. регистрации 01.200.2 12989).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 16 научных работ, из них 5 статей - в центральной печати.

Структура диссертации Работа изложена на 148 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 200 источников, в том числе зарубежных - 123. Диссертация иллюстрирована 16 рисунками и 13 таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы

В работе использовали 54 штамма V. cholerae 0139 серогруппы, выделенных от человека и из воды, имеющиеся в музее живых культур Ростовского НИПЧИ. Кроме того, в исследование были включены не агглютинирующиеся диагностической сывороткой-0139 субкультуры штамма V. cholerae 0139 Р-16064, обработанного 0,01% раствором нитрозогуанидина (НГ-16064), и штамма V. cholerae 0139 Р-16077, пассированного в желчном бульоне в течение 135 дней (Ж-16077), любезно предоставленные зав. лабораторией микробиологии холеры, к.м.н. Б.Л. Мазрухо (РостНИПЧИ). В работе были использованы некультивируемые формы штамма V. cholerae 0139 Р-17673, любезно предоставленные к.б.н., ст.н.с. РостНИПЧИ А.В. Соколенко. С целью контроля специфичности препаратов МКА использовали 35 штаммов V. cholerae 01 серогруппы, 20 штаммов V. cholerae не 01/не 0139, 2 штамма V. parahaemolyticus, 8 - Е. coli, 3-Я abortus, I - A. hydrophila, 3-5. typhi, 1 - S. dysenteriae, 2 - Y enterocolitica, 2 - Y. pseudotuberculosis. Вибрионы культивировали на агаре Хотгингера, рН 7,6, при температуре 37°С в течение 16-18 ч, остальные бактерии - на агаре Хотгингера, рН 7,2, при температуре 37°С в течение 48 ч. Для постановки твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА), дот-иммуноанализа (ДИА) и иммунизации животных использовали бактериальные взвеси, обеззараженные добавлением мертиолата натрия в концентрации 1:10000 или кипячением в течение 30 мин.

Донорами иммунных спленоцитов и асцитических жидкостей служили мыши инбредной линии Balb/c. Гибридизацию иммунных спленоцитов с мышиной миеломной линией NS0/1 проводили в соответствии с методикой Fazekas de St. et al. (1980). Миеломные и гибридомные клетки выращивали на среде RPMI-1640 {«Flow Laboratories») с добавлением 15 % эмбриональной телячьей сыворотки («Биолот») и 3 мМ глутамина («Serva»). Селекцию гибридных клеток проводили на среде с добавлением гипоксантина, аминоптерина и тимидина. Клонирование и реклонирование гибридных культур осуществляли методом предельных разведений (Underwood Р.А., Bean Р.А., 1988).

Первичный скрининг МКА, изучение их активности, специфичности, определение изотипов проводили в различных вариантах ТИФА (иммуноферментным набором для скрининга гибридом, «Calbiochem») и ДИА (по Chaicumpa W. et al., 1998). Реакцию непрямой иммунофлюоресценции и реакцию агглютинации (РА) на предметном стекле проводили по общепринятым методикам. Иммунодиффузию в геле выполняли по О. Ouchterlony (1949).

Выделение иммуноглобулиновой фракции из культуральных супернатантов гибридом и асцитических жидкостей мышей осуществляли преципитацией сульфатом аммония (Reik L.M et al., 1987). Очищенные препараты иммуноглобулинов консервировали добавлением мертиолата натрия до конечной концентрации 1:10000 и хранили при температуре -20°С.

Препараты ЛПС получали водно-фенольной экстракцией по О. Westphal и К. Jann (1965). Полисахаридные фракции ЛПС выделяли мягким кислотным гидролизом препаратов (1% уксусная кислота, 100°С, 1 час 30 мин), с последующим диализом гидролизатов против дистиллированной воды и лиофильным высушиванием.

Гидролиз полисахарида для высвобождения колитозы вели 0,2 М уксусной кислотой (при 100°, 2 часа). Качественный анализ моносахаридного состава гидролизатов проводили на пластинах целлюлозы фирмы «Мегск» методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) в системе бутанол-пиридин-вода-уксусная кислота (4:6:3:1). Аминосахара окрашивали нингидрином, нейтральные сахара - анилин-дифениламиновым реактивом (Захарова И.Я., Косенко Л.В., 1982).

Препараты белков наружной мембраны получали из клеток штаммов V. cholerae 0139 Р-16064, Р-16077 (клинические) и Р-17674, Р-17916 (водные) по методу В. Lugtenberg et al. (1975). Концентрацию белка в полученных препаратах определяли по О.Н. Lowry et al. (1951).

Изучение антигенной структуры холерных вибрионов 0139 серогруппы осуществляли методом иммуноблотгинга по Н. Towbin et al. (1984). Электрофоретическое разделение цельноклеточных лизатов V. cholerae 0139 и препаратов ЛПС и белков наружной мембраны проводили в 12.5 % ПААГ с ДСН по методу U.K. Laemmli (1970). Для окрашивания белков использовали краситель Coomassie Brilliant Blue R-250.

Статистическую обработку полученных результатов проводили по И.П. Ашмарину, А.А. Воробьеву (1962).

Результаты и обсуждение

1. Получение и характеристика маноклональных антител к липополисахариду V. cholerae 0139. Препараты ЛПС были получены классической водно-фенольной экстракцией по О. Westphal, К. Jann (1965) из штаммов V. cholerae 0139 Р-16064 (выделен от человека) и Р-17916, Р-17786 (выделены из воды) и охарактеризованы по химическому составу.

С помощью реакции диффузионной преципитации был проведен сравнительный анализ препаратов ЛПС. В , результате были выявлены некоторые отличия этих образцов. ЛПС, выделенный из штамма V. cholerae Р-16064, образовывал с цельной кроличьей 0139-сывороткой две линии, в то время как ЛПС-Р-17916 - только одну. Линии преципитации, расположенные ближе к лункам с антигенами, были тождественны, что свидетельствует о наличии общих компонентов в структуре ЛПС обоих штаммов. Линия, специфичная для ЛПС из клинического штамма, находилась ближе к лунке с сывороткой.

С целью выяснения, чем обусловлены различия между препаратами ЛПС, выделенные из штаммов V cholerae 0139 различного происхождения, нами был исследован углеводный состав ЛПС методом тонкослойной хроматографии. Исследование моносахаридного состава деградированных полисахаридов ЛПС не выявило каких-либо различий. Так, в соответствующих гидролизатах штаммов вибрионов 0139 серогруппы, выделенных от человека и

из воды, обнаружена быстромигрирующая колитоза. В солянокислотных гидролизатах деградированных полисахаридов обнаружены глюкозамин, квинозамин, галактозаминуроновая кислота и неидентифицированный аминосахар с подвижностью меньшей, чем у квинозамина.

Для дальнейшего изучения особенностей антигенной структуры штаммов V. скокгае 0139, выделенных от человека и из воды, мы получили МКА к ЛПС. Иммунные спленоциты получали путем иммунизации мышей линии Ва1Ь/с клетками штамма V. скокгае 0139 Р-16064, убитыми нагреванием (при 100°С, в течение 30 минут) и мертиолатом натрия в конечном разведении 1:10000. Иммунизацию мышей проводили по двум схемам. По первой схеме каждому животному трехкратно с интервалом 2 недели вводили внутрибрюшинно в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ) 0,1 мл инактивированной взвеси холерных вибрионов (108 м.кл./мл). Вторая схема предусматривала еженедельное, в течение месяца, одновременное внутрибрюшинное и внутривенное введение иммуногена в дозе 108 м.кл./мышь. Перед слиянием в ТИФА проверяли титры антител в сыворотках иммунизированных мышей, значения которых колебались в пределах 1:50001:30000.

Первичный скрининг специфических антител, продуцируемых гибридомами, проводили на 14-21 день иммуноферментным методом. В качестве антигена использовали бактериальную взвесь V. скокгае 0139 Р-16064 в дозе 106-107 м.клУлунку или раствор ЛПС 0139 из расчета 0,1-0,5 мкг/лунку. Отбор гибридных культур, продуцирующих МКА, проводили также методом непрямой иммунофлуоресценции. Проведение гибридизаций позволило получить и исследовать антителообразующую активность в общей сложности 510 первичных культур. Итоговые результаты гибридизации отражены в таблице 1. Как видно из таблицы, доля антителопродуцентов, выявленных при первичном тестировании, колебалась от 10,0 до 36,7 % в зависимости от способа инактивации иммуногена и схемы его введения. Наибольшее число гибридных культур, продуцирующих МКА, зарегистрировано, если мышей иммунизировали по первой схеме клетками V. скокгае 0139, убитыми мертиолатом натрия. При этом с целью получения активированных лимфоцитов предпочтение следует отдать схемам с интервалами 2-3 недели между инъекциями и более низкой долей иммуногена порядка 106-107 м.кл./мышь, что подтверждается показателями титров антител в сыворотках иммунных мышей в ТИФА (1:10000-1:30000).

Большая часть полученных нами первично положительных клонов (около 60%) в первые недели после слияния утрачивала способность продуцировать антитела. Этот процесс протекал особенно интенсивно в течение первых трех недель. С целью достижения стабилизации антителопродукции, а также пролиферативной активности культуры были клонированы.

В результате, из имеющихся в нашем распоряжении гибридом, было отобрано девять клеточных линий - стабильных продуцентов МКА.

Таблица 1

Выход гибридных клонов в результате слияния миеломных клеток со спленоцитами мышей, иммунизированных клетками V. cholerae 0139

Схемы иммунизации Иммуноген Титр антител в сыворотках мышей в ТИФА Количество культур-продуцентов МКА

Абсолютное число* Эффективность гибридизации в %

I V. cholerae Р-16064, инактивированный нагреванием 1:10000 130/27 20,8

V. cholerae Р-16064, инактивированный мертиолатом натрия 1:30000 180/66 36,7

II V. cholerae Р-16064, инактивированный нагреванием 1:5000 80/8 10,0

V. cholerae Р-16064, инактивированный мертиолатом натрия 1:10000 120/19 15,8

Примечание: * - в числителе — количество лунок с гибридными клонами; в знаменателе - количество лунок с положительными клонами

Определение специфичности МКА проводили в ТИФА и ДИА. Изучали способность антител взаимодействовать с микробными клетками V. cholerae 0139, холерными вибрионами 01 серогруппы, V. cholerae 022 и V. cholerae classica СА-385 в R-форме. В результате было показано, что все МКА взаимодействуют со штаммами 0139 серогруппы, но МКА трех гибридом — A3, 2С2, 2D3 - дают перекрестную положительную реакцию с V. cholerae 01, 022 и RCA-385. Остальные шесть МКА строго специфичны к изучаемому серовару, однако различаются по активности связывания с клетками вибрионов. Оптическая плотность (ОП) реакции МКА гибридом ЗА9, Dil и 4Н5 с V. cholerae 0139 колеблется в пределах от 1,658+0,028 до 1,928±0,051, в то время как показатели для 4А7, 4А8 и ЗА7 изменяются от 0,612±0, 01 до 0,804±0,009. Титры антител в КЖ разных гибридом варьировали в весьма широких пределах от 1:20 до 1:500 при сравнительно одинаковых размерах гибридных клонов. Наиболее высокая антителопродукция наблюдалась у гибридом ЗА9 и Dil (титр в ТИФА ~ 1:500). Антитела пяти наиболее активных в ТИФА гибридных культур взаимодействовали с бактериальными антигенами в реакции иммунофлюоресценции. Только два МКА обладали преципитирующей активностью - ЗА9 (до разведения 1:2) и Dil (1:4). Способность МКА к агглютинации клеток холерных вибрионов 0139 серовара, была характерна

также только для этих двух гибридом. В РА титр КЖ гибридом 3A9hD11, обеспечивающих положительную реакцию, составил 1:10. Это свидетельствует о значительной концентрации специфических иммуноглобулинов в КЖ указанных гибридом.

Результаты анализа показали, что МКА гибридом ЗА9 и Dil относятся к классу IgM. Все остальные МКА являются иммуноглобулинами класса IgG.

Число антигенных детерминант, выявляемых МКА гибридом ЗА9, Dil, 4Н5 и A3 определяли с помощью конкурентного варианта ТИФА (Friquet В. et al., 1983). Для количественной оценки экспериментальных результатов теста вычисляли индекс аддитивности МКА (AI). Высокие значения AI свидетельствуют об аддитивном связывании исследуемых МКА, то есть об их разной эпитопной специфичности. Тогда как низкие значения AI характерны для неаддитивных пар МКА. Если величина AI близка к 50%, то возможно два МКА распознают две антигенные детерминанты, которые различны, но их близость создает препятствия между молекулами антител.

В результате конкурентного связывания пар МКА с клетками V. cholerae 0139 высокие показатели индекса аддитивности (AI) в диапазоне 68,4-74,7% получены при комбинациях всех МКА с антителами гибридомы A3, что говорит о пространственной удаленности соответствующих им эпитопов. Индексы аддитивности 51,6 % для пары 4H5-D11, и менее 50% для пар МКА 3A9-D11 (20,1%) и ЗА9-4Н5 (39,9%) свидетельствуют о близком расположении выявляемых ими антигенных детерминант. Таким образом, можно утверждать, что исследованные в тесте аддитивности антитела направлены, по крайней мере, к трем различным эпитопам.

Для выяснения, какой из структурных частей ЛПС принадлежат эпитопы, узнаваемые МКА, из клеток V. cholerae 0139 Р-16064 в результате мягкого кислотного гидролиза выделили деградированный полисахарид (ДПС) (Hisatsune К. et al., 1985). Согласно этому методу, полученные фракции содержат: I - преимущественно липиды; II - белки и нуклеиновые кислоты; III - деградированный полисахарид (ДПС). В ТИФА оценивали активность взаимодействия МКА с вышеуказанными фракциями. Результаты ТИФА показали, что достоверное отличие оптической плотности от контроля (0,1620,195) наблюдалось при взаимодействии всех исследованных МКА с фракцией, содержащей ДПС (0,956-0,803), в то время как ОП для I и II фракций (0,1890,268) не превышала достоверно контроль. Это свидетельствует о направленности полученных МКА к полисахаридной части ЛПС.

Наряду с гель - фильтрацией было проведено также разделение ЛПС в ДСН-ПААГ электрофорезе. После электропереноса на нитроцеллюлозную мембрану отдельных фрагментов и взаимодействия их с МКА обнаружили тонкую полосу в пределах маркерных белков 60-80 кДа и широкую интенсивную полосу на уровне 16 кДа и ниже. Ранее М.Н. Джапаридзе с соавт. (1996) указывали на адсорбцию белков на липополисахариде V. cholerae 0139 с образованием комплексов с м.м. примерно 50 кДа. Можно предположить, что в верхней части иммуноблота МКА обнаруживают углеводные эпитопы, ассоциированные с белками с м.м. 60-80 кДа, в нижней - углеводную

структуру, состоящую из низкомолекулярных гомологичных фрагментов, аналогично фракциям гель - фильтрации, которые, по-видимому, соответствуют О-полисахариду и кору ЛПС У.сИокгае 0139. Известно, что области кор холерных вибрионов 01 и 0139 серогруппы сходны по строению и химическому составу (Кшге1 У.А. е/ а1., 1997), и отрицательная реакция испытуемых МКА с представителями V. сИокгае 01 дает основание предположить, что они направлены к О-полисахариду ЛПС-0139.

Таким образом, первичный скрининг позволил выявить МКА, отвечающие требованиям диагностики, и МКА, которые могут быть широко использованы, как инструменты в изучении детерминант поверхностных структур V. сИокгае 0139.

2. Антигенные свойства штаммов V. с!ш1егае 0139 различного происхождения. МКА являются ценным инструментом для иммунохими-ческого анализа, в связи с этим мы провели сравнительный анализ антигенной активности холерных вибрионов 0139, выделенных из различных источников, с помощью полученных препаратов МКА в различных иммунологических методах.

Объектом исследования служили представители У.скокгае 0139 из коллекции музея живых культур РостНИПЧИ, включающей 24 штамма вибрионов, выделенных от человека, и 30 штаммов вибрионов, изолированных из рек Москва, Ока, Темерник, Дон, Обь, Иня на территории России. Результаты ТИФА показали, что в реакцию с МКА, полученными к ЛПС штамма Р-16064 «Бенгал», вступали холерные вибрионы серогруппы 0139 независимо от их происхождения (таблица 2). Исходя из показателей ОП, которые колебались в пределах от 1,5 до 2,1, эпитопы, узнаваемые МКА ЗА9, 011, по-видимому, с высокой плотностью экспонированы на поверхности клинических и «водных» штаммов серогруппы 0139. Эпитопы, соответствующие МКА 4Н5, судя по значениям ОП, реже встречаются в составе ЛПС, особенно у вибрионов водного происхождения. Стоит также отметить, что только среди штаммов V.сИокгае 0139 из внешней среды обнаружены вибрионы, которые не связываются ни с одним из испытуемых МКА, что может быть обусловлено утратой или изменением отдельных полисахаридных антигенных детерминант в составе ЛПС. В ТИФА с поликлональной сывороткой-0139 также зарегистрированы более низкие показатели ОП у большинства штаммов из воды. Таким образом, можно предположить, что различия между вибрионами, выделенными из различных источников, носят преимущественно количественный характер. Обращает внимание, кроме того, высокая гетерогенность «водных» штаммов в отношении частоты экспонирования отдельных эпитопов ЛПС на их поверхности.

Таблица 2

Анализ эпитопного состава ЛПС холерных вибрионов 0139 серогруппы с помощью МКА в ТИФА

№ Штаммы МКА к ЛПС-0139 МКА к ЛПС-О! Поликло-нальная сыворотка 0139

ЗА9 4Н5 Дп Р8012 1Е5

От человека

1 Р-16485 4+ ' 3+ 4+ - - 4+

2 Р-16486 4+ 3+ 4+ - - 4+

3 Р-16063 3+ 2+ 3+ - - 3+

4 Р-16064 4+ 3+ 4+ - - 3+

5 Р-16065 • 4+ 3+ 4+ - - 4+

6 Р-16070 4+ 3+ 4+ - - 4+

7 Р-16072 4+ 3+ 4+ - - 4+

8 Р-16073 3+ 2+ 3+ - - 3+

9 Р-16075 4+ 3+ 4+ - - 4+

10 Р-16076 4+ 3+ 4+ ' - - 4+

11 Р-16077 4+ 3+ 4+ - - 4+

Из воды

12 Р-17676 - - - - - -

13 Р-17679 - - - - - 2+

14 Р-17680 3+ 2+ 3+ - - 3+

15 Р-17682 - - - - - 2+

16 Р-17684 3+ 2+ • 3+ - - 3+

17 Р-17780 2+ 2+ 3+ - - 3+

18 Р-17788 4+ 3+ 4+ - - 3+

19 Р-17915 3+ 3+ 4+ - - 3+

20 Р-17916 4+ 3+ 4+ - - 4+

21 Р-17918 4+ 3+ 4+ - - 4+

22 Р-17919 4+ 3+ 4+ - - 4+

Примечание: "4+"- показатели ОП от 1,5 и выше;

"3+" - показатели ОП от 0,8 до 1,5; "2+" - показатели ОП в пределах 0,4-0,8; "-" - реакция отрицательная, ОП менее 0,4.

Оценку антигенной активности ЛПС штаммов V. скокгае 0139 проводили также в ДИА. По интенсивности окраски пятна можно судить о количестве и частоте встречаемости эпитопов ЛПС на поверхности вибрионов и прочности связывания последних с антителами. Принимая во внимание количественные различия между штаммами различного происхождения, мы сравнили чувствительность ДИА в их отношении, снизив

количество сенситина до 107 м.кл./мл. Едва заметное окрашивание пятен на НЦМ у подавляющего числа холерных вибрионов 0139 из воды, в случае снижения их количества до 107м.кл./мл в тестируемых пробах вероятно является следствием низкой плотности экспонирования детерминант ЛПС, узнаваемых МКА.

В меньшей степени, как видно, количество клеток в опытных образцах отражается на результатах ДИА в отношении вибрионов от человека. Так при нагрузке 107 м.кл./мл (104 м.кл./точку) регистрируется слабое, но заметное прокрашивание пятен в случае МКА ЗА9 у 87,5% клинических и 60,0% водных вибрионов, для МКА Dil, соответственно, 79,2% и 56,7%. В тоже время, если использовать в тестировании дозу 109 м.кл./мл, то все холерные вибрионы 0139 от человека и 90,0% и 86,7 % «водных» штаммов вступают в реакцию со специфическими антителами ЗА9 и Dil, соответственно (таблица 3).

Таблица 3

Взаимодействие МКА с микробными клетками

Штаммы МКА ЗА9 МКА Dil

и концентрации микробных клеток/мл Количество штаммов, связавшихся с МКА, абсол. число Позитивные реакции, в% Количество штаммов, связавшихся с МКА, абсол. число Позитивные реакции, в%

V.cholerae 0139 от человека (24 штамма)

109 24 100,0 24 100,0

108 22 91,7 21 87,5

107 21 87,5 19 79,2

V.cholerae из воды штаммов) 0139 (30

109 ю8 27 22 90,0 73,3 26 20 86,7 66,7

ю7 18 60,0 17 56,7

Мы продолжили исследование холерных вибрионов 0139 серогруппы в тесте иммунодиффузии. При постановке этого метода использовали 1 млрд. взвеси вибрионов, МКА 011 и поликлонапьную сыворотку 0139. Как отражено в таблице 4, связывание вибрионов с МКА сопровождалось образованием преципитата у 20 из 24 штаммов от человека (исключение составили штаммы Р-16063, Р-16073, Р-16074 и Р-16484), тогда как у всех водных вибрионов линии преципитации отсутствовали. Имея в виду данные ТИФА и ДИА о

количественных различиях в представленности эпитопов ЛПС на клеточной поверхности, мы повысили количество клеток в опытных образцах до Ю10 м.кл./мл. Это не отразилось на преципитирующей активности МКА Dil в отношении водных вибрионов, но увеличило число позитивных штаммов от человека до 22 (не преципитировали штаммы Р-16063 и Р-16073). Взаимодействие вибрионов с сывороткой 0139 не показало таких четких различий между ними, как в случае МКА Dil, так как у ряда штаммов «водных» вибрионов, наиболее активных в ДИА, наблюдалось формирование линий преципитации. Метод преципитации с использованием полученных нами препаратов антител может быть использован для дополнительной характеристики антигенной структуры и дифференциации штаммов Vibrio cholerae 0139, выделенных из клинического материала и воды.

Таблица 4

Взаимодействие моно- и поликлональных антител с клетками

V. cholerae 0139 в реакции преципитации

Штаммы Кол-во исследованных штаммов Количество штаммов с положительной реакцией преципитации

1 млрд М.К./МЛ 5 млрд м.к./мл

МКА Dil сыворотка 0139 МКА Dil сыворотка 0139

V. cholerae 0139 от человека 24 20 10 22 18

V. cholerae 0139 из воды 30 _ 4 _ 9

Различная активность в серологических методах штаммов, выделенных от человека и из воды, обусловила интерес к исследованию структурных особенностей ЛПС более тонкими иммунохимическими методами, в частности иммуноблоттингом. Последний позволяет получить информацию о спектре эпитопов изучаемого антигена в результате их соединения со специфическими моно- или поликлональными антителами. Для этого клеточные лизаты четырех штаммов (Р-16077, Р-16486, Р-17677, Р-17915) электрофоретически разделили в ДСН-ПААГ, затем осуществили перенос на НЦМ и проинкубировали ее с МКА Dil. В результате было обнаружено, что зона, соответствующая О-полисахариду и кору, локализована у всех штаммов в нижней части мембраны, соответствующей мол. массе ниже 16 кДа. Кроме того, на НЦМ у вибрионов из воды были выявлены полосы в районе маркерных белков 20-30 кДа, тогда как у вибрионов от человека аналогичные линии отсутствуют. У последних связывание с МКА проявляется в виде четко выраженной полосы в районе 6080 кДа. Мы предположили, что штаммы холерных вибрионов 0139 серогруппы, выделенные из различных источников, могут отличаться по белковому спектру наружных мембран, а области на имуноблоте с различной молекулярной массой у изученных штаммов представляют собой соответствующие ЛПС-белковые комплексы. Для подтверждения этой гипотезы был проведен иммуноблоттинг клеточных лизатов вышеуказанных

штаммов, подвергнутых протеолитической обработке. В результате на иммуноблотах при обработке МКА Dil была выявлена только одна диффузная полоса в низкомолекулярной области.

Следующим этапом работы был сравнительный анализ белков наружной мембраны штаммов V. cholerae 0139 от человека и из воды в ДСН-ПААГ электрофорезе. На электрофореграммах препаратов обнаружены две общие белковые полосы в районе м.м. 40-45 кДа. Кроме того, у клинических штаммов зарегистрированы 2 четко выраженные полосы в области м.м. 60-80 кДа, тогда как у штаммов из воды представлены белковые антигены с м.м. 20-30 кДа.

Таким образом, с помощью МКА в иммуноблоттинге нам удалось идентифицировать полисахаридные эпитопы ЛПС в составе клеточных лизатов холерных вибрионов 0139 и одновременно обнаружить, что они могут быть в комплексе с белковыми молекулами, имеющими различные молекулярные массы. Эти результаты, по нашему мнению, дают основание предположить, что положительная реакция преципитации у клинических штаммов V. cholerae 0139 обусловлена копреципитацией ЛПС и белковых компонентов, имеющих м.м. 60-80 кДа. Таким образом, вибрионы из воды содержат, по-видимому, недостаточное для осаждения МКА количество полисахаридного антигена, несмотря на его агрегацию с протеинами, мол. масса которых колеблется в пределах м.м. 20-30 кДа.

3. Практическое применение моноклональных антител к ЛПС-0139. Появление в 1992 году нового возбудителя холеры, не вступающего в серологические реакции с Ol-холерной сывороткой в силу индивидуальной структуры ЛПС, потребовало разработки новых диагностических препаратов. Одной из задач работы стала разработка диагностикумов на основе полученных нами МКА.

Метод люминесцентной микроскопии - один из ведущих методов экспресс-диагностики возбудителей инфекционных заболеваний. К его преимуществам относятся быстрота выполнения и чувствительность. Наиболее распространенным в лабораторной практике вариантом является прямая иммунофлуоресценция, то есть выявление антигена с помощью антител, конъюгированных с флуорохромом.

Нами для получения диагностического люминесцирующего реагента были использованы МКА гибридомы Dil класса IgM. После процедуры флуоресцентной метки с флуоресцеина изотиоцианатом определяли рабочее разведение. Установлено, что препарат ФИТЦ-МКА имел рабочее разведение 1:16. Препараты ФИТЦ-МКА 0139, содержащие в качестве консерванта мертиолат натрия в разведении 1:10000, лиофилизировали и хранили при +4°С. Сухой препарат растворяли в дистиллированной воде в объеме, указанном на ампуле и хранили в цельном виде при + 4°С не более месяца. В рабочем разведении флуоресцирующие иммуноглобулины хранению не подлежат.

Специфичность и активность ФИТЦ-МКА исследовали на 54 штаммах V. cholerae 0139, выделенных из различных источников, а также штаммах V. cholerae Ol, не Ol/не 0139 и представителях гетерологичных микроорганизмов. Содержание вибрионов в пробах, подлежащих тестированию

должно быть не ниже 104-105 м.кл./мл. В каждом препарате просматривали несколько полей зрения, отмечая характер и интенсивность свечения микробных клеток. Интенсивность свечения вибрионов оценивали по четырехкрестовой системе, положительным результатом считали наличие флюоресценции на «4+» и «3+». Результаты испытаний представлены в таблице 4. Положительная иммунофлюоресценция на «4+» с четко выраженной формой клеток отмечена у большинства (66,7%) холерных вибрионов 0139 серогруппы. Меньшая часть штаммов (27,8%), вступая в реакцию с мечеными иммуноглобулинами, обеспечивала свечение на «3+». При этом эффективность выявления штаммов различного происхождения отличалась. Так, специфическое свечение наблюдалось у 100% штаммов V. сЬокгае 0139, выделенных от человека, и только у 90,0% «водных» штаммов. Перекрестные реакции с гетерологичными микроорганизмами отсутствовали.

Таблица 5

Оценка специфичности препарата ФИТЦ-МКА 0139 в реакции прямой

иммунофлуоресценции

Процент штаммов с

положительной

Кол-во флюоресценцией

Штаммы штаммов Всего %

на «4+» на «3+» положит.

реакций

V. cholerae 0139 54 66,7 27,8 94,5

в том числе от человека 24 75,0 25,0 100

из воды 30 60,0 30,0 90,0

V. cholerae cholerae 15

V. cholerae eltor 20

V. cholerae не Ol/не 0139 20

V. cholerae RCA-385 1

V. parahaemolyticus 2

E. coli 8 Результаты в ПИФ

B. abortus 3 отрицательные

A. hydrophila 1

S. typhi 3

S. dysenteriae 1

Y. enterocolitica 2

Y. pseudotuberculosis 2

Таким образом, нами получен препарат диагностических люминесци-рующих моноклональных иммуноглобулинов, отличающийся чувствительностью и строгой специфичностью в отношении V. сИо1егае 0139, который может быть использован для ускоренной идентификации возбудителя холеры 0139 серогруппы. Препарат прошел комиссионные испытания и «Инструкция по изготовлению и контролю иммуноглобулинов холерных 0139 моноклональных люминесцирующих сухих», одобрена Ученым Советом (протокол № 4 от 27.06.2002) и утверждена директором РостНИПЧИ.

Следующим этапом нашего исследования стало изучение изменений антигенной структуры штаммов, не агглютинирующихся поликлональной сывороткой-0139, и оценка возможности применения имеющихся в нашем распоряжении МКА для их идентификации.

Исследование проводилось на субкультурах штамма V. cholerae 0139 Р-16064, обработанного 0,01% раствором нитрозогуанидина (16064-НГ), и штамма V. cholerae 0139 Р-16077, пассированного в желчном бульоне в течение 135 дней (16077-Ж). Культуры характеризовались изменением ряда исходных признаков (аглютинабельности, морфологии колоний, фаголизабельности). При этом они сохранили кассету вирулентности и поэтому представляют эпидемическую опасность. Полученные субкультуры были изучены в РА, ТИФА, реакции иммунофлуоресценции, иммунодиффузии в геле и иммуно-блоттинге с привлечением препаратов МКА и поликлональной диагностической сыворотки 0139.

Оценка штаммов в реакции агглютинации показала, что все полученные МКА, как и сыворотка-0139, не агглютинировали измененные субкультуры 0139, в то время как с типичными штаммами 0139 реакция наблюдалась. Не отмечалось у измененных субкультур и образование линий преципитации с МКА к ЛПС в РИД. В то же время использование таких высокочувствительных методов, как ТИФА и ДИА с применением МКА позволяло выявить все изученные субкультуры. Однако положительные реакции регистрировались при условии концентрации микробных взвесей культур порядка 10® м.кл./мл и выше, в то время как большую часть типичных штаммов, выделенных от человека, выявляли при концентрации 107 м.кл./мл. Изучение в иммуно-флуоресцентном методе субкультур 16064-НГ и 16077-Ж с использованием МКА-ФИТЦ показало их разнородность: наряду с формами флюоресцирующими на исходном уровне, выявлены варианты с менее ярким свечением на 2-3 «+».

Сравнительное исследование клеточных лизатов исходного штамма Р-16064 и субкультуры 16064-НГ в иммуноблотгинге с МКА Dil, показало, что кроме низкомолекулярной зоны (ниже 16 кДа), соответствующей ЛПС, у инагглютинабельной субкультуры не выявлялась, в отличие от исходного клинического штамма, высокомолекулярная диффузная линия в районе маркеров мол. массы 60 кДа, которая соответствует, как было рассмотрено выше, комплексу ЛПС с белками наружной мембраны. Воздействие различных факторов могло привести к утрате или структурным изменениям эпитопов О-полисахарида и кора, и как следствие, снижению активности рекции испытуемых субкультур с МКА и сывороткой. Кроме того, изменения произошли, видимо, и в составе белков наружной мембраны, что отразилось на взаимодействии бактериальных клеток с антителами в трехмерных методах (РА и РИД). Можно заключить, что использование различных серологических методов дает широкую информацию о свойствах ЛПС типичных и измененных штаммов вибрионов 0139 серовара. Результаты исследования показывают, что МКА могут использоваться для идентификации слабо- и инагглютинабельных форм холерных вибрионов 0139 серогруппы.

Возникают сложности и в идентификации так называемых некультиви-руемых форм (НФ) микроорганизмов. Переход в НС затрагивает все уровни организации: молекулярный, клеточный, метаболический, популяционный (Соколенко A.B., Ломов Ю.М., 2003). В том числе изменения претерпевают и состав и структура клеточной поверхности (Kondo К. et al., 1994). Нами была предпринята попытка исследовать у НФ V. cholerae 0139 серогруппы сохранность эпитопов ЛПС. В работе были использованы некультивируемые формы штамма V. cholerae 0139 Р-17673, любезно предоставленные к.б.н., ст.н.с. РостНИПЧИ Соколенко A.B.. В качестве среды микрокосмов для получения НФ использовали обеззараженную автоклавированием дистиллированную воду и морскую воду (Черное море, район г. Туапсе). Пробы помещали в холодильник при температуре +4-6°С. Некультивируемыми считались образцы, которые на плотных средах не образовывали колоний, но при витальном окрашивании акридиновым оранжевым выявлялись как подвижные и/или зеленые клетки. Переходными считались пробы, которые на агаризованной питательной среде формировали 102—103 КОЕ/мл.

Результаты ТИФА показали, что НФ V. cholerae 0139 Р-17673 взаимодействовали с МКА ЗА9, но интенсивность реакции зависела от возраста и среды микрокосма. Наиболее высокая активность была зарегистрирована для переходных форм из морской и дистиллированной воды - значение ОП составляло 1,382±0,028 и 0,915±0,016, соответственно. Для НФ были зарегистрированы более низкие показатели ОП: от 0,695±0,013 у НФ из морской воды (7 месяцев) до 0, 745±0,021 у НФ из проб с дистиллированной водой (29 месяцев). Взаимодействие НФ V. cholerae Р-17673 в ТИФА свидетельствует о наличии в среде микрокосма детерминант ЛПС соответствующих МКА ЗА9, однако, частота их встречаемости, вероятно, низка, в результате чего наблюдается существенное снижение активности взаимодействия культур с МКА. При изучении культур в методе иммуно-флюоресценции с ФИТЦ-МКА, наблюдали свечение на +++ и ++. Таким образом, МКА, имеющиеся в нашем распоряжении, позволяют обнаружить НФ вибрионов в микрокосмах разного состава и подтвердить видовую принадлежность клеток.

ВЫВОДЫ

1. Впервые получены и выведены в массовую культуру стабильные гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела специфические только в отношении V. cholerae 0139, не обладающие перекрестной активностью со штаммами холерных вибрионов 01 и не 01/не 0139 серогрупп и гетерологичными микроорганизмами.

2. Анализ деградированного полисахарида в ТИФА и ЛПС в иммуноблоте с помощью МКА показал, что они направлены к эпитопам полисахаридной части ЛПС.

3. Штаммы V. cholerae 0139, выделенные от человека и из воды на территории РФ, имеют сходную антигенную структуру поверхностных полисахаридов, однако наблюдаются различия в плотности экспонирования ряда эпитопов у вибрионов этих групп, что обусловливает их неодинаковую активность в иммунохимических методах.

4. При сравнении в ПАГЭ-ДСН цельно-клеточных лизатов холерных вибрионов 0139 серогруппы обнаружена способность ЛПС образовывать комплексы с белками в пределах м.м. 60-80 кДа у штаммов V. cholerae 0139, выделенных от человека, и м.м. 20-30 кДа у штаммов V. cholerae 0139, выделенных из воды.

5. Установлено, что высокоспецифичные МКА позволяют оценить наличие или изменение соответствующих им эпитопов в структуре ЛПС у инагтлютинабельных штаммов V. cholerae 0139 и вибрионов в некультиви-руемом состоянии.

6. Набор МКА, охарактеризованный по специфичности, серологической активности, классу иммуноглобулинов, эпитопной направленности может быть использован для изучения антигенной структуры и идентификации V. cholerae 0139 в реакции агглютинации, дот-иммунологическом и твердофазном иммуноферментном анализе, реакции непрямой иммунофлуоресценции.

7. Реакцию преципитации с использованием моноклональных антител можно применять для дополнительной характеристики антигенной структуры штаммов V. cholerae 0139, выделенных из клинического материала и воды.

8. Созданы и успешно .апробированы экспериментальные серии препарата иммуноглобулинов холерных 0139 моноклональных люминесцирующих сухих, предназначенного для экспресс-диагностики V. cholerae 0139 в реакции прямой иммунофлуоресценции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Алексеева Л.П., Сальникова О.И., Чемисова О.С., Смирнова О.В., Мазрухо Б.Л., Лобанов В.В. Моноклональные антитела к ЛПС V.cholerae 0139 и их характеристика // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». - Ростов н/Д, 2000. - Вып.13. - С. 71-72.

2. Сальникова О.И., Алексеева Л.П., Мазрухо Б.Л., Лобанов В.В., Чемисова О.С., Смирнова О.В. Использование МКАТ для анализа поверхностных полисахаридов вибрионов 0139 серовара различного происхождения // Там же. -С. 72-73.

3. Алексеева Л.П., Мазрухо Б.Л., Сальникова О.И., Маркина О.В., Лобанов В.В., Чемисова О.С. К вопросу о полисахаридных антигенах холерных вибрионов 0139 серогруппы различного происхождения // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». — Ростов н/Д, 2001. - Вып.14. — С. 50-52.

4. Алексеева Л.П., Сальникова О.И., Мазрухо Б.Л., Маркина О.В., Чемисова О.С., Лобанов В.В. Моноклональные антитела к липополисахариду V. cholerae 0139 // Биотехнология. - 2002. - № 2. - С. 79-84.

5. Алексеева Л.П., Мазрухо Б.Л., Чемисова О.С., Сальникова О.И., Маркина О.В., Лобанов В.В. Изучение с помощью моноклональных антител полисахаридных антигенов Vibrio cholerae 0139 различного происхождения // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2002. - № 4. - С. 25-29.

6. Алексеева Л.П., Мазрухо Б.Л., Маркина О.В., Чемисова О.С., Сальникова О.И., Ишина Е.В. Получение диагностических флюоресцирующих

моноклональных иммуноглобулинов к V. cholerae 0139 серовара // Клин. лаб. диагностика. - 2002. -№ 12. - С. 50-51.

7. Сальникова О.И., Лобанов В.В., Маркина О.В., Алексеева Л.П., Мазрухо Б.Л., Аронова Н.В., Агафонова В.В., Чемисова О.С., Шестиалтынова И.С., Кудрякова Т.А. Изучение измененных по признаку агглютинабельности субкультур V. cholerae 0139 с помощью различных серологических методов // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». - Ростов н/Д, 2002. - Вып.15. - С. 77-78.

8. Алексеева Л.П., Чемисова О.С., Мазрухо Б.Л., Ишина Е.В. Антигенные свойства штаммов Vibrio cholerae 0139, выделенных из различных источников // Биотехнология. - 2003. - № 3. - С. 90-95.

9. Алексеева Л.П., Чемисова О.С., Мазрухо Б.Л., Ишина Е.В. Флуоресцирующие моноклональные иммуноглобулины для ускоренной диагностики холерных вибрионов Ol и 0139 серогрупп // Матер. 4-й Межгос. научно-практ. конф. государств участников СНГ «Соврем, технологии в диагн. ООИ». - Саратов, 2003. - С. 13-17.

10. Алексеева Л.П., Чемисова О.С., Мазрухо Б.Л., Яговкин М.Э., Ишина Е.В. Антигенный анализ вирулентных и авирулентных вибрионов серогруппы 0139 на основе моноклональных антител // Матер. VIII Российской научно-практ. конф. по проблеме «Холера». - Ростов н/Д, 2003. - С. 166-169.

11. Чемисова О.С., Алексеева Л.П., Мазрухо Б.Л., Ишина Е.В. Дот-иммуноанализ на основе моноклональных антител в диагностике Vibrio cholerae 0139 // Там же. - С. 233-234.

12. Маркина О.В., Алексеева Л.П., Соколенко A.B., Чемисова О.С., Агафонова В.В. Флюоресцирующие моноклональные антитела в изучении некультивируемых и инагглютинабельных вариантов штаммов Vibrio cholerae Ol и Vibrio cholerae 0139 // Там же. - С. 243-244.

13. Соколенко A.B., Алексеева Л.П., Ломов Ю.М., Чемисова О.С. Изучение взаимодействия некультивируемых форм холерных вибрионов с моноклональными антителами к липополисахариду Ol и 0139, серогрупп // Биотехнология. - 2004. - № 3. - С. 87-92.

14. Соколенко A.B., Миронова A.B., Меньшикова Е.А., Титова C.B., Чемисова О.С., Михась Н.К. Индукция реверсии некультивируемых форм холерных вибрионов в эксперименте // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». - Ростов н/Д, 2005. - Вып.18. - С. 88-92.

15. Чемисова О.С., Алексеева Л.П., Мазрухо Б.Л., Татаренко O.A., Ишина Е.В. Сравнительный анализ белковых антигенов щтаммов Vibrio cholerae 0139 // Там же.-С. 101-102.

16. Чемисова О.С., Алексеева Л.П., Мазрухо Б.Л. Сравнительный анализ полисахаридных антигенов вирулентных и авирулентных штаммов Vibrio cholerae 0139 // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». -Ростов н/Д, 2006. - Вып.19. - С. 83-86.

Печать цифровая Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Формат 60x84/16. Объем 1,0 уч.-изд -л. Заказ № 21. Тираж 100 экз. Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Суворова, 19, тел 247-34-88

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чемисова, Ольга Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Характеристика липополисахарида и капсулы V cholerae 0139.

1.2. Серологические методы диагностики возбудителя холеры

0139 серогруппы.

1.3. Моноклональные антитела в изучении холерных вибрионов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Лабораторные животные.

2.2. Бактериальные штаммы.

2.3. Клеточные линии позвоночных.

2.4. Питательные среды и реактивы.

2.5. Гибридизация клеток.

2.6. Клонирование гибридом.

2.7. Культивирование гибридом in vitro и in vivo.

2.8. Криоконсервирование гибридом.

2.9. Очистка иммуноглобулинов.

2.10. Конъюгирование иммуноглобулинов с ФИТЦ.

2.11. Метод иммунофлюоресценции.

2.12. Иммуноферментные методы

2.13. Иммунодиффузия в геле по Оухтерлони.

2.14. Реакция агглютинации.

2.15. Методы получения препаратов ЛПС и оценки их чистоты.

2.16. Метод получения белков наружной мембраны.

2.17. Электрофорез в полиакриламидном геле.

2.18. Метод тонкослойной хроматографии.

2.19. Иммуноблоттинг.

2.20. Методы статистической обработки результатов.

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ЛИПОПОЛИ

САХАРИДУ V. CHOLERAE 0139.

3.1. Характеристика препаратов ЛПС, выделенных из клеток холерных вибрионов 0139 серогруппы.

3.2. Получение гибридом-продуцентов моноклональных антигел к ЛПС V cholerae 0139 и их первичный скрининг.

3.3. Изучение специфичности и активности МКА в серологических методах.

3.4. Определение класса и подкласса моноспецифических иммуноглобулинов.

3.5. Исследование эпитопной направленности МКА.

3.6. Получение препаративных количеств МКА, их очистка.

ГЛАВА 4. АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА ШТАММОВ

V. CHOLERAE 0139 РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ.

4.1. Характеристика иммунохимической активности штаммов V cholerae 0139, выделенных от человека и из воды.

4.2. Сравнительное изучение антигенной структуры клинических и водных штаммов V cholerae 0139.

ГЛАВА 5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ

МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ЛПС-0139.

5.1. Иммунофлуоресцентный диагностикум на основе

МКА для идентификации штаммов V cholerae 0139.

5.2. Исследование полисахаридных антигенов штаммов

V. cholerae 0139, измененных по признаку агглютинабельности, и некультивируемых форм.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение поверхностных полисахаридных антигенов штаммов Vibrio cholerae O139 различного происхождения с использованием моноклональных антител"

Традиционно возбудителем холеры считались только штаммы Vibrio cholerae 01 серогруппы. Однако в 1992 году в Индии и Бангладеш были зарегистрированы случаи заболевания холерой, вызванные вибрионами, не агглютинирующимися 01-сывороткой (Albert M.J. et al., 1993; Ramamurthy Т. et al., 1993), впоследствии обозначенными как V cholerae 0139 синоним Бенгал (Shimada Т. et al., 1993). Эпидемические проявления холеры, обусловленной холерными вибрионами 0139, ежегодно отмечают в Индии и Бангладеш с заносами и распространением по странам Азии. Зарегистрированы без распространения завозы холеры Бенгал в Великобританию, Германию, Данию, Казахстан, Киргизию, Россию, США, Японию (Москвитина Э.А. с соавт., 2003)

В результате молекулярно-генетических исследований были получены данные, указывающие на большое сходство холерных вибрионов 0139 с возбудителем холеры 01 серогруппы биовара eltor (Cholerae Working Group, 1993; Calia K.E. et al, 1994; Johnson J.A. et al., 1994; Waldor M.K., Mekalanos J.J., 1994 и др.). В то же время выявлены и важные отличительные особенности нового возбудителя холеры, а именно - продукция ранее неизвестного О-антигена и наличие полисахаридной капсулы (Hisatsune К. et al., 1993; Johnson J.A. et al., 1994; Weintraub A. et al., 1994 и др.).

Характеристике свойств вибрионов «Бенгал», в том числе липополисахариду и капсуле, посвящено большое количество публикаций. Так, установлено, что отличительной чертой ЛПС V cholerae 0139 является короткая О-боковая цепь и отличный от 01 серогруппы углеводный состав. Рядом авторов показано наличие сходных повторяющихся единиц в структуре О-цепи ЛПС и капсульном полисахариде (Waldor М.К. et al., 1994; Comstock L.E. et al., 1995). Выявлены общие антигенные детерминанты с другими микроорганизмами: V.cholerae 022 и 0155, Aeromonas trota, V mimicus, Escherichia coll 055, Salmonella greenside (Albert M.J. et al., 1995; Knirel Y.A. et al., 1996; Oscarson S. et al., 1997; Landersjo C. et al., 1998). Обнаружено, что капсула маскирует О-антигенные цепи ЛПС, а также рецепторы к некоторым холерным фагам, на основании чего был предложен метод идентификации капсульных и бескапсульных штаммов при помощи умеренных холерных бактериофагов (20 и Инаба), полученных Н.М. Остроумовой из штамма холерного вибриона 01 (Щелканова Е.Ю., 1998; Чеховская Г.В. с соавт., 2000). Применение молекулярно-генетических методов позволило установить, что продукция 0139-антигена и капсулы контролируется как общими, так и различными хромосомными генами (Waldor М.К., Mekalanos J.J., 1994; Bik Е.М. et al., 1995; Смирнова Н.И. с соавт., 1995). Определена локализация на хромосоме генов ф 0139 и cap, контролирующих синтез 0139-антигена и капсулы, соответственно (Чеховская Г.В., 1997). Имеются данные, указывающие на определенную связь между продукцией капсулы и вирулентностью V cholerae 0139 благодаря ее участию в защите от бактерицидного действия нормальной человеческой сыворотки, в адгезии и колонизации кишечника человека и экспериментальных животных (Waldor М. et al., 1994; Johnson I. et al., 1994; Смирнова Н.И. с соавт., 1995). Показано, что капсула является протективным антигеном (Sengupta D.K. et al., 1996; Федорова В.А. с соавт., 1997).

Однако, с момента первоначального обнаружения V cholerae 0139 в 1992 году появились новые варианты возбудителя с измененными генетическими и фенотипическими характеристиками. Изолированы и охарактеризованы штаммы с новыми риботипами, СТХ-генотипами, измененной антибактериальной чувствительностью (Mitra R. et al., 1996; Faruque S.M. et al., 1997,1999). В 1993 г. в Аргентине впервые был выделен авирулентный штамм 0139 серогруппы, лишенный генов холерного токсина ctxAB (Rivas М.С. et al., 1993). Нетоксигенные холерные вибрионы 0139 были изолированы и из воды поверхностных водоемов на территории Российской Федерации: в Московской, Новосибирской, Ростовской областях, а также в Республике Калмыкия (Ганин B.C. с соавт., 1997; Кюрегян А.А. с соавт., 1999, 2000, 2002; Ломов Ю.М. с соавт., 2000; Кругликов В.Д. с соавт., 2002). В результате многочисленных исследований установлено, что отсутствие в хромосоме структурных генов холерного токсина является основной причиной авирулентности большого числа штаммов 0139 серогруппы (Albert M.J. et al, 1996). Показано, что штаммы, выделенные из объектов окружающей среды, лишены 70 % тестируемых генов, связанных с вирулентностью, тогда как клинические обладали полным набором этих детерминант (Осин А.В. с соавт., 2003). Выявлены различия в ПЦР-генотипах (Мишанькин Б.Н. с соавт., 2000), подвижности вибрионов, продукции маннозочувствительных гемагглютинирующих пилей адгезии и белка внешней мембраны OmpU (Осин А.В. с соавт., 1999), субстратном спектре и структуре нейраминидаз вибрионов 0139, выделенных из клинического материала и воды поверхностных водоемов (Шиманюк Н.Я. и др., 1999; Дуванова О.В., 2001). Ерошенко Г.А. с соавт. (2002) была разработана модификация метода риботипирования для изучения генетического родства штаммов V cholerae и созданы зонды на гены 16S и 32S рРНК, позволяющие дифференцировать вирулентные и авирулентные штаммы 0139 серогруппы. В то же время, обнаружены и сходные признаки: экспрессия внеклеточных протеаз, наличие полисахаридной капсулы (Осин А.В. с соавт, 2000). Показана способность авирулентных вибрионов 0139 агглютинироваться поликлональной сывороткой, полученной к вирулентному штамму «Бенгал», что указывает на структурное сходство О-антигенов, определяющих их серологическую специфичность. Однако данных о более детальном исследовании антигенных детерминант, входящих в состав клеточной поверхности вибрионов 0139 серогруппы, выделенных из воды, в доступной литературе мы не обнаружили.

A.Г. с соавт., 1989, Кожухов И.Г. с соавт., 1991; Ломов Ю.М. с соавт., 1994; Подосинникова Л.С. с соавт., 2000; Кюрегян А.А. с соавт., 2002; Безсмертный

B.Е. с соавт., 2003 и др.). И если изучению ЛПС таких измененных вариантов V. cholerae 01 серогруппы посвящено большое число работ (Shimada Т. et al, 1973; Hisatsune К., Kondo S., 1980, Сомова А.Г. с соавт., 1978; Гальцева Г.В. с соавт., 1989; Седина С.Г., Цитцер А.О., 1990; Черепахина ИЛ. с соавт., 1994, 1996, 1999; Алексеева Л.П. с соавт., 1998 и др.), то сведения о поверхностных полисахаридных антигенах слабо- или инагглютинабельных штаммов V cholerae 0139 практически отсутствуют.

Цель исследования;

Получение моноклональных антител к лииополисахариду V cholerae 0139 и их применение для изучения антигенной структуры штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы различного происхождения и разработки экспериментальных диагностических препаратов. Задачи исследования:

1. Выделить и очистить препараты ЛПС из клеток штаммов V cholerae 0139, выделенных от человека и из воды, изучить их состав и иммунохимические свойства.

2. Получить гибридомы-продуценты МКА к ЛПС V cholerae 0139, охарактеризовать их свойства.

4. Сравнить иммунохимические свойства штаммов V cholerae 0139, выделенных из различных источников, в иммунологических реакциях

Научная новизна и теоретическая значимость

Получены приоритетные сведения, касающиеся структуры ЛПС штаммов V cholerae 0139, выделенных от человека и из воды поверхностных водоемов России. Установлено, что штаммы водного и клинического происхождения имеют сходный эпитопный состав ЛПС, однако клинические штаммы проявляют более высокую антигенную активность в иммуноферментных методах, что обусловлено более плотным экспонированием полисахаридных детерминант на клеточной поверхности. С помощью иммуноблота получены новые данные, свидетельствующие о способности ЛПС холерных вибрионов 0139 серогруппы, выделенных от человека и из воды, образовывать комплексы с протеинами разной молекулярной массы.

Практическая ценность работы

Получены и выведены в массовую культуру гибридомы, продуцирующие МКА к серовароспецифическим антигенным детерминантам ЛПС V cholerae 0139, которые хранятся в жидком азоте в РостНИПЧИ.

Гибридный клон D11/0139, продуцирующий моноклональные антитела к ЛПС V cholerae 0139, депонирован в специализированной коллекции клеточных культур позвоночных Института цитологии АН России под номером РККК(П) 674Д от 17 05.2002.

На основе МКА разработан экспериментальный диа1 ностический препарат для идентификации штаммов V cholerae 0139 в реакции прямой иммунофлюоресценции и оформлена «Инструкция по изготовлению и контролю иммуноглобулинов холерных 0139 моноклональных люминесцирующих сухих», одобренная Ученым советом Ростовского НИПЧИ (протокол № 4 от 27.06.2002) и утвержденная директором института. На базе института проведены испытания экспериментальных серий препарата на широком наборе штаммов.

Основные положения,выносимые на защиту

2. Исследование фракции деградированного полисахарида V.cholerae 0139 в твердофазном иммуноферментном анализе показало, что МКА направлены к полисахаридной части ЛПС, а с помощью иммуноблота установлена их направленность к эпитопам структурных компонентов, локализованных в области с мол. массой ниже 16 кДа, что соответствует О-полисахариду и кору.

5. На основе МКА созданы экспериментальные серии диагностических люминесцирующих моноклональных иммуно1лобулинов, отличающиеся высокой чувствительностью и строгой специфичностью в отношении V cholerae 0139, предназначенные для ускоренной идентификации возбудителя холеры 0139 серогруппы, и оформлена соответствующая научно-техническая документация.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены на научных конференциях и конкурсах молодых ученых РостНИПЧИ (2000-2003), представлены на Проблемной комиссии по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ «Холера и патогенные для человека вибрионы», Ростов-на-Дону, 2000-2002, 2005, 2006; VIII Российской научно-практической конференции но проблеме «Холера», Ростов-на-Дону, 2003; IV Межгосударственной научно-практической конференции государств участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекций», Саратов, 2003; II Межвузовской Международной конференции молодых ученых «Обмен веществ при адаптации и повреждении», Ростов-на-Дону, 2003. Исследования выполнены в рамках плановой научной темы «Антигены поверхностных структур холерных вибрионов 0139 серогруппы различного происхождения» (№ гос. регистрации 01.200.2 12989).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано в соавторстве 16 научных работ, из них 5 - в центральной печати.

Структура диссертации

Работа изложена на 148 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка лигературы. Библиография включает 200 источников, в том числе зарубежных - 123. Диссертация иллюстрирована 16 рисунками и 13 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Чемисова, Ольга Сергеевна

ВЫВОДЫ

1. Впервые получены и выведены в массовую культуру стабильные гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела специфические только в отношении V cholerae 0139, не обладающие перекрестной активностью со штаммами холерных вибрионов 01 и не 01/не 0139 серогрупп и гетерологичными микроорганизмами.

4. При сравнении в ПАГЭ-ДСН цельно-клеточных лизатов холерных вибрионов 0139 серогруппы обнаружена способность ЛПС образовывать комплексы с белками в пределах м.м. 60-80 кДа у штаммов V cholerae 0139, выделенных от человека, и м.м. 20-30 кДа у штаммов V cholerae 0139, выделенных из воды

5. Установлено, что высокоспецифичные МКА позволяют оценить наличие или изменение соответствующих им эпитопов в структуре ЛПС у инагглютинабельных штаммов V. cholerae 0139 и вибрионов в некультивируемом состоянии.

7. Реакцию преципитации с использованием моноклональных антител можно применять для дополнительной характеристики антигенной структуры штаммов Vibrio cholerae 0139, выделенных из клинического материала и воды.

8. Созданы и успешно апробированы экспериментальные серии препарата иммуноглобулинов холерных 0139 моноклональных люминесцирующих сухих, предназначенного для экспресс-диагностики V cholerae 0139 в реакции прямой иммунофлуоресценции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

До недавнего времени возбудителями холеры считались только вибрионы 01 серогруппы, в то время как представители других серогрупп вызывали в основном только спорадические случаи диарейных заболеваний (Blake Р.А. et al., 1980; Safrin S. et al., 1987; Morrib J.G., 1994). Поэтому появление в 1992 г. в Индии и Бангладеш нового возбудителя холеры 0139 серогруппы (Бенгал) и его быстрое распространение на территории других стран, в частности Российской Федерации, привлекло внимание специалистов. Всестороннее изучение бенгальских штаммов выявило несколько значительных отличий от V cholerae 01. Было установлено, что вибрионы 0139 серогруппы продуцируют ранее неизвестный О-антиген и капсульное вещество (Johnson J.A. et al., 1994; Weintraub A. et al., 1994; Bik E.M. et al., 1995; Comstock L.E. et al., 1995). Российскими и зарубежными исследователями была расшифрована их структура (Knirel Y.A. et al., 1995; Preston L.M. et al., 1995; Cox A.D. et al., 1996). Показано, что О-полисахарид ЛПС-0139 представлен более короткими цепями и имеет иной состав: один из основных компонентов ЛПС-01 - перозамин - отсутствует, а 0139-специфические детерминанты включают галактозу и колитозу (Hisatsune К. et al., 1993; Knirel Y.A. et al., 1997; Stroeher U.A. et al., 1997). Капсула представляет собой высокополимеризованные О-цепи, не связанные ковалентно с кором и липидом А, свободно лежащие на поверхности бактериальной клетки (Waldor М.К. et al., 1994). Появление этих новых структур на поверхности клетки привело к приобретению вибрионами ряда биологически важных свойств, в частности, резистентности к литическому действию сыворотки (Johnson J.A. et al., 1994; Смирнова Н.И. с соавт., 1995, 2002), более высокой способности к колонизации тонкого кишечника человека и новорожденных мышей (Waldor М К. etal., 1994; YamamotoT. etal., 1994).

Между тем, с 1996 года на территории РФ (в Московской, Новосибирской, Ростовской областях, в Республике Калмыкия) из воды открытых водоемов выделяют авирулентные штаммы холерных вибрионов 0139 серогруппы (Ганин B.C. с соавт, 1997; Кюрегян А.А. с соавт., 1999, 2000, 2002; Ломов Ю.М. с соавт., 2000; Кругликов В.Д. с соавт, 2002), агглютинирующиеся поликлональной сывороткой, полученной к вирулентному штамму «Бенгал», что косвенно указывает на структурное сходство О-антигенов, определяющих их серологическую специфичность. Молекулярно-генетические исследования, проведенные в первую очередь, показали различия в ПЦР-генотипах и отсутствие клональности вирулентных и авирулентных штаммов (Мишанькин Б.Н. с соавт., 2004). Установлено, что штаммы, выделенные из внешней среды, лишены 70 % генов, связанных с вирулентностью, тогда как клинические обладали полным набором этих детерминант (Ерошенко Г.А. с соавт., 2001; Осин А.В. с соавт., 2003). На основании этих и ряда других исследований сделано предположение об их различном происхождении. В то же время данных об антигенах, входящих в состав клеточной поверхности вибрионов 0139 серогруппы, выделенных из воды поверхностных водоемов, в доступной литературе мы не обнаружили. Известно, что структура наружной мембраны, в состав которой входит и ЛПС, зависит от действия факторов окружающей среды (Skorupski К. and Taylor R.K., 1997; Provenzano D. et al., 2000), в связи с чем можно предположить наличие особенностей в строении поверхностных полисахаридов у штаммов V cholerae

0139, выделенных из различных источников. Отсутствие сведений по этим вопросам и определило цели и задачи настоящего исследования.

Первым этапом нашей работы было выделение и характеристика препаратов ЛПС из штаммов V cholerae 0139 различного происхождения. ЛПС экстрагировали из бактериальной массы клинического штамма V. cholerae 0139 Р-16064 и «водных» штаммов Р-17916 и Р-17786 по методу Вестфаля и охарактеризовали по химическому составу.

Известно, что липид А и коровый олигосахарид являются наиболее консервативными структурами ЛПС (Книрель Ю.А., Кочетков Н.К., 1993). Поэтому мы попытались найти отличия в составе О-полисахаридной цепи среди штаммов различного происхождения. Анализ моносахаридного состава ЛПС не выявил каких-либо различий. В гидролизатах всех штаммов были обнаружены глюкозамин, квиновозамин, колитоза, галактозаминуроновая кислота.

В иммунодиффузии с цельной кроличьей О-специфической сывороткой у штамма Р-16064 были выявлены две линии преципитации, в то время как у штаммов Р-17916 и Р-17786 - только одна. С одной стороны, это может быть связано с различиями в количестве полисахаридных эпитопов в структуре ЛПС. Возможно, что отличия обусловлены также белковой компонентой, поскольку сыворотка содержит пул антител к веществам различной химической природы.

Для дальнейшего изучения особенностей полисахаридных антигенных детерминант штаммов V cholerae 0139 нам представилось перспективным применение моноклональных антител, направленных к специфических детерминантам холерных вибрионов 0139 серогруппы. В литературе присутствуют данные о получении МКА к V cholerae 0139 (Qadri F. et al., 1994,

1995; Hasan J.A. et al., 1995; Chaicumpa W. et al., 1998 и др.). В отечественных публикациях имеются сообщения о получении МКА к возбудителю холеры 0139 серогруппы. Так, Терешкиной Н.Е. (2004) была генерирована панель стабильных гибридом, продуцирующих МКА к различным эпитопам ЛПС и капсульного антигена V. cholerae 0139, направленных к общим эпитопам гликопептидной природы у V. cholerae 01, 022 и 0139 серогрупп. Однако препаратов МКА выявляющих детерминанты уникальные для вибрионов 0139 серогруппы автором получено не было.

Поэтому следующим этапом нашей работы было получение панели гибридом-продуцентов моноклональных антител. Известно, что качество МКА зависит от различных факторов, включая источник, форму, дозу, природу иммуногена, схемы иммунизации (Goding J.W., 1986). Исследования W. Chaicumpa et al. (1994) показали, что при получении МКА к V. cholerae 01 предпочтительна была иммунизация цельноютеточным лизатом, а не очищенным ЛПС. Иммунизация мышей очищенным ЛПС привела к низкому титру антител, преимущественно IgM, которые обладают сравнительно низкой аффинностью. Нами в качестве иммуногена были выбраны бактериальные клетки V cholerae 0139 Р-16064 обеззараженные нагреванием (100°С, 30 мин.) и мертиолатом натрия в концентрации 1:10000. Иммунизация проводилась по двум схемам. Определение титра антител в сыворотках иммунных мышей показало, что наиболее эффективной была трехкратная внутрибрюшинная иммунизация с интервалом 2 недели клетками инактивированные мертиолатом натрия. Эффективность гибридизации также была максимальной в случае использования этой схемы.

В результате было получено 510 гибридных культур и после первичного скрининга было отобрано 9 продуцентов, отличающихся стабильной пролиферацией и секрецией антител. Изучение специфичности показало, что все препараты МКА взаимодействуют с микробными клетками V. cholerae 0139, однако антитела 3-х гибридом перекрестно реагировали и с вибрионами 01, 022 серогрупп и RCA-385. Для дальнейшей работы были отобраны гибридомы, продуцирующие МКА, строго специфичные в отношении холерных вибрионов 0139 серогруппы. С помощью иммуноблота было установлено, что все МКА выявляли область в нижней части нитроцеллюлозной мембраны, соответствующую О-полисахариду и кору ЛПС, а также полосу в районе соответствующей мол. массе 60-80 кДа, которая, возможно, соответствует комплексу ЛПС-белок, что согласуется с данными литературы (Джапаридзе М.Н. с соавт., 1996; Henderson В. et al., 1996). Методом конкурентного ИФА и иммуноблота установлено, что все МКА направлены по крайней мере к трем специфическим эпитопам. Полученные МКА относятся к классам lgG и IgM. Дальнейшие исследования проводили с концентрированными препаратами МКА, выделенными из культуральной жидкости путем высаливания сульфатом аммония, и асцитическими жидкостями, полученными путем культивирования гибридом in vivo.

Следующим этапом работы стал сравнительный анализ антигенной структуры 24-х штаммов клинического и 30-ти штаммов водного происхождения с использованием МКА к ЛПС и различных иммунохимических методов. Из результатов ТИФА следует, что МКА к ЛПС клинического штамма V. cholerae 0139 Р-16064 вступают в реакцию и с вибрионами 0139 из воды, то есть их полисахаридные структуры, включающие О-антиген и кор, индуцирующие синтез серологически специфических антител, принципиально не отличаются. В то же время использование в работе МКА и разных иммунологических методов позволило выявить более высокую антигенную активность вибрионов 0139 человеческого происхождения, обусловленную количественным преобладанием у них комплементарных МКА эпитопов в структуре ЛПС. Было показано, что чувствительность ДИА примерно на 2 порядка выше в отношении штаммов от человека по сравнению со штаммами из воды, а именно - 107 м.кл./мл. Большую часть авирулентных вибрионов 0139, выделенных из рек на территории России, согласно полученным данным, выявить в ДИА представляется возможным, если их содержание в опытных образцах будет 109 м.кл./мл и выше, что связано, по-видимому, с низкой плотностью экспонирования эпитопов ЛПС на поверхности клетки. Подтверждение тому - неспособность вибрионов 0139 водного происхождения преципитировать МКА в пределах концентрации 1-10 млрд. м.кл./мл. Штаммы V. cholerae 0139 от человека, в отличие от «водных», образуют преципитат с МКА, свидетельствуя, что в структуре ЛПС соответствующие им детерминанты повторяются с высокой частотой.

Изучение структурных особенностей ЛПС штаммов V cholerae 0139, выделенных от человека и из воды, в иммуноблотинге с МКА D11 выявило, у вибрионов из воды полосы в районе маркерных белков 20-30 кДа, тогда как у вибрионов от человека аналогичные линии отсутствовали. У последних связывание с МКА проявлялось в виде четко выраженной полосы в районе м.м. 60-80 кДа. Известно, что эндотоксины грамотрицательных бактерий представляют собой мультимолекулярные комплексы, состоящие из липополисахарида и структурно связанных с ним специфических белков (Hitchcock P.J. et al., 1986; Henderson В. et al., 1996). Мы предположили, что области на имуноблоте с различной мол. массой у изученных штаммов представляют собой соответствующие ЛПС-белковые комплексы. Для подтверждения этой гипотезы мы провели иммуноблоттинг клеточных лизатов вышеуказанных штаммов, подвергнутых протеолитической обработке. В результате на блотограммах при обработке МКА Dl 1 была выявлена только одна диффузная полоса в низкомолекулярной области. Вполне возможно, что реакции преципитации МКА с клиническими штаммами холерных вибрионов 0139 серогруппы, способствуют высокомолекулярные белки.

Принимая во внимание неодинаковую чувствительность ДИА и иммунопреципитации относительно холерных вибрионов серогруппы 0139 от человека и из воды, обусловленную количественными различиями в эпитопном составе их ЛПС, эти методы можно рекомендовать к использованию при анализе материала из внешней среды. Количественные различия в эпитопном составе ЛПС у человеческих и водных вибрионов 0139 послужили основанием для оформления методических рекомендаций «Дифференциация штаммов Vibrio cholerae 0139, выделенных из клинического материала и воды, в реакции преципитации с использованием моноклональных антител», одобренные Ученым советом Ростовского НИПЧИ (протокол № 8 от 17.06.2004 г.) и утвержденные директором института. Данные методические рекомендации могут быть использованы для дополнительной характеристики антигенных детерминант штаммов V cholerae 0139.

В целом, результаты анализа антигенной стрктуры свидетельствуют о количественном преобладании ЛПС, плотном экспонировании его эпитопов на клеточной поверхности и arpei ировании с протеинами разной молекулярной массы у клинических штаммов V cholerae 0139. Вероятно, поэтому они проявляют более высокую иммунохимическую активность по сравнению с водными штаммами 0139 в реакциях точечной иммунодетекции и микропреципитации. Возможно, снижение содержания О-антигена и корового олигосахарида у штаммов V. cholerae 0139, выделенных из воды, является следствием изменения не только количественного, но и качественного состава углеводов, что приводит к укорочению этой структурной части ЛПС и влечет за собой повышение гидрофобности клеток, способствующей их устойчивости к действию неблагоприятных экологических факторов. Возможно этим и объясняется распространение на территории РФ и сохранение в условиях окружающей среды жизнеспособной популяции авирулентных вибрионов 0139 серогруппы.

Следующим этапом нашей работы стала разработка диагностических препаратов на основе МКА. Первоначально для идентификации холерных вибрионов 0139 серогруппы исследователи использовали поликлональные сыворотки, полученные путем повторных иммунизаций животных-продуцентов целыми клетками V. cholerae 0139 (Мазрухо Б.Л. с соавт., 1994; Сыворотка диагностическая холерная 0139 адсорбированная жидкая для реакции агглютинации на стекле, 1994; Shimada Т. et al., 1994; Ломов Ю.М. с соавт., 1995; Щуркина И.И. с соавт., 1995). Однако эти препараты отличались наличием перекрестнореагирующих антител, адсорбция которых гетерологичными антигенами представляла собой достаточно трудоемкий процесс и приводила к существенному снижению специфического титра иммуноглобулинов. Дальнейшее совершенствование диагностических препаратов проходило по двум направлениям: разработка новых схем получения сывороток и получение моноклональных антител.

С целью исключения этапа адсорбции антисывороток ряд авторов использовали в качестве иммуногена препараты клеточных оболочек (Ишина Е.В., Мазрухо Б.Л., 1998), белки внешней мембраны (Martinez-Govea A. et al., 2001), КПС (Sengupta D.K. et al, 1996; Федорова B.A. с соавт., 1997), ЛПС, изолированный различными химическими методами (Федорова В.А. с соавт., 1996; Громова О.В. с соавт., 2002).

Первые сообщения о получении МКА и их успешном применении для дигностики холерных вибрионов 0139 серогруппы появились еще в 1994 (Garg S. et al, 1994; Qadri F. et al, 1994-1995; Hasan J.A. et al., 1995; Chaicumpa W. et al, 1998). Российскими исследователями препаратов на основе МКА для идентификации V. cholerae 0139 разработано не было.

Одним из наиболее распространенных иммунологических методов лабораторной диагностики холеры является реакция иммунофлуоресценции благодаря высокой чувствительности (104-105 м.к./мл) и быстроте постановки. Первоначально отечественными исследователями была сделана попытка получения флуоресцирующего диагностикума к V cholerae 0139 на основе моноварной кроличьей холерной агглютинирующей сыворотки (Аленкина Т.В. с соавт., 2000). Иммуноглобулины выделяли из сыворотки с титром антител в объемной реакции агглютинации 1:200. В предварительном эксперименте в

НИФМ отмечались перекрестные реакции с V. cholerae 01, не 01 40 и 105. Удаление гетерологичных антител адсорбцией микробными клетками по двум схемам (S. sonneilXA, V cholerae не 01 105 и V. cholerae не 01 169-68) приводило к снижению диагностического титра до 1:32 и 1:16, соответственно, при этом использование второй схемы адсорбции сохраняло присутствие перекрестнореагирующих антител в титре 1:8.

С целью повышения специфичности препаратов флуоресцирующих антител было необходимо получение высокоактивных кроличьих сывороток. Е.Г. Абрамова с соавт. (2002) сравнили показатели активности и специфичности сывороток кроликов, иммунизированных двумя различными антигенами -корпускулярным О-антигеном бескапсульного варианта штамма V cholerae 0139 Р-16064 и О-антигеном из культуральной жидкости штамма V cholerae 0139 МО-45. Использование последнего позволило получить более активные сыворотки с невысоким содержанием перекрестнореагирующих антител, которые были отобраны для дальнейшей работы. В результате из холерной сыворотки 0139 с активностью 1:1600 после осаждения сульфатом аммония, конъюгации с ФИТЦ и однократной адсорбции V cholerae 01 и 022 удалось получить препарат, характеризующийся специфической иммунофлуоресценцией на 3-4+ в разведении 1:64 - 1:128. Как видно, биотехнологическая схема получения флуоресцирующих диагностикумов на основе поликлональной агглютинирующей сыворотки отличается трудоемкостью, значительным снижением специфического титра и нестандартностью препаратов. Решением этих проблем могут стать моноклональные антитела. Нами были разработаны препараты ФИТЦ-МКА 0139. Специфическое свечение наблюдалось у 100% штаммов V. cholerae 0139, выделенных от человека, и у 90,4% «водных» штаммов. Перекрестные реакции с гетерологичными микроорганизмами отсутствовали. Результаты экспериментальных исследований легли в основу разработки «Инструкции но изготовлению и контролю иммуноглобулинов холерных 0139 моноклональных люминесцирующих сухих», одобренной Ученым Советом (протокол № 4 от 27.06.2002) и утвержденой директором РостНИПЧИ.

При идентификации холерных вибрионов с помощью поликлональной сыворотки в реакции агглютинации специалисты сталкиваются с проблемой слабо- и инагглютинабельных штаммов. Нами предпринята попытка, оценить эффективность использования препаратов МКА для выявления измененных форм V. cholerae 0139. Результаты показали, что МКА не агглютинируют антигенноизмененные экспериментальные субкультуры, однако взаимодействуют с ними в ТИФА, ДИА и ПИФ. Для характеристики и идентификации некультивируемых форм V. cholerae 01 и 0139 разработаны методические рекомендации «Выявление некультивируемых форм холерных вибрионов с помощью моноклональных антител к О-антигену в экспериментальных микрокосмах», одобренные Ученым советом Ростовского НИПЧИ (протокол № 8 от 17.06.2004 г.) и утвержденные директором института.

119

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чемисова, Ольга Сергеевна, Ростов-на-Дону

1. Абрамова Е.Г., Аленкина Т.В., Бочкарева Г.В., Громова О.В. Получение диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов к Vibrio cholerae 0139// Сб. науч. трудов, посвящ. 50-летию Дагестанской противочумной станции. Махачкала, 2002. - С. 96-99.

2. Абрамова Е.Г., Аленкина Т.В., Бочкарева Г.В., Громова О.В. Экспресс-диагностика Vibrio cholerae 0139 методом флуоресцирующих антител// Матер, пробл. комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2002. - Вып. 15. - С. 85-86.

3. Адамов А.К. Иммунология холеры. Саратов: Изд-во СГУ, 1981.-319 с.

4. Алексеева Л.П., Николенко О.Б Человеческие моноклональные антитела к О-антигену возбудителя холеры // Биотехнология. 1992. - № 3. - С. 30-34.

5. Алексеева Л П., Бурлакова О С., Балахнова В.В. К вопросу об агглютинабельности холерных вибрионов моноклональными иммуноглобулинами // Журн. микробиол -1992.-Т. 54, № 6. С. 50-54.

6. Алексеева Л.П., Сальникова О.И., Бурлакова О.С. Моноклональные антитела к О-полисахариду холерного вибриона и их иммунобиологические свойства // Биотехнология. 1997. -№ 9-10. - С. 30-34.

7. Алексеева Л.П., Черепахина И .Я., Сальникова О.И., Бурлакова О.С. Изучение антигенных взаимосвязей типичных и R-форм холерных вибрионов на основе моноклональных антител // Журн. микробиол. 1998. - № 4. - С. 9-12.

8. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. JI.: Медгиз. - 1962. - 180 с.

9. П.Белов Л.Г. Системные функциональные расстройства при эндотоксикозе// Матер, науч.-практ. конф., посвящ. 100-лет. образов, противочум. службы России. Саратов, 1997а.-т. 1. - С. 183.

10. Белов Л.Г. Токсикология бактериального липополисахарида// Там же, 19976. -С. 184-185.

11. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М.: МИА, 2002.-356 с.

12. Бурлакова О.С., Алексеева Л.П., Новохатский А.С. и др. Моноклональные антитела к антигенам холерных вибрионов серовара Огава // Журн. микробиол. 1989. - Т. 51, № 3. - С. 56-60.

13. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М.: Мир, 1982. - 448 с.

14. Ганин B.C., Урбанович Л.Я., Марамович А.С. и др. Vibrio cholerae 0139 («Бенгал») в Сибири// Матер, науч.-практ. конф., посвящ. 100-лет. образов, противочум. службы России. Саратов, 1997. - Т. 1. - С. 30.

15. Громова О.В, Джапаридзе М.Н., Дятлов И.А., Киреев М.П., Федорова В.А., Алеикина Т.В., Абрамова Е.В. Новый способ получения О-антигена холерного очищенного с целью создания холерных диагностических антисывороток// Биотехнология. 2002. - №2. - С. 42-46.

16. Девдариани З.Л., Аленкина Т.А., Федорова В.А. Экспресс-диагностика токсигенных штаммов Vibrio cholerae в дот-иммунологическом анализе с помощью моноклональных антител // Клин. лаб. диагн. 1999. - № 8. - С. 24, 33.

17. Дуванова О.В. Нейраминидаза холерных вибрионов 0139 серогруппы: Автореф. дисс. канд. биол. наук. Ростов-на-Дону, 2001. - 20 с.

18. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высш. шк , 1991 - 288 с.

19. Ерошенко Г.А., Осин А.В., Челдышова Н.Б., Смирнова Н.И. Генетические особенности авирулентных и вирулентных штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы, выделенных на территории России // Пробл. особо опасных инф. 2001, Вып. 1 (81). - С. 69-75.

20. Ерошенко Г.А., Осин А.В., Смирнова Н.И. Риботипирование штаммов Vibrio cholerae 0139, полученных из различных источников // Пробл. особо опасных инф. 2002. - Вып. 1 (83). - С. 80-85.

21. Захарова И.Я. Эндотоксины О-антигены кишечной палочки. - Киев, 1980.

22. Захарова И.Я., Косенко JI.B. Методы изучения микробных полисахаридов.

23. Киев: Наукова думка, 1982. 192 с.

24. Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г., Болтовская М.Н. Гибридомы и моноклональные антитела в биотехнологии и медицине // Итоги науки и техники. Биотехнология. Москва, 1989 - Т.20. - С. 3-96.

25. Иммунологические методы / под ред. Г. Фримеля. М.: Медицина, 1987. -472 с.

26. Иммунология инфекционного процесса / Под ред. В.И. Покровского, С.П. Гордиенко, В.И. Литвинова. М.:Наука. - 1993. - 308 с.

27. ЗГКнирель Ю.А., Кочетков Н К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. I. Общая характеристика липополисахаридов и структура липида А (Обзор)//Биохимия.- 1993.-Т.58, вып.2.-С. 166-181.

28. Книрель Ю.А., Кочетков НК. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. II. Структура кора (Обзор) // Биохимия. 1993. -Т.58, вып.2. - С. 182-201.

29. Кюрегян А.А., Иванова С.М., Мазрухо Б.Л. и др. Характеристика культур холерных вибрионов 01 и 0139, изолированных от людей и из объектов окружающей среды на территории Российской Федерации в 2001 году //

30. Матер, пробл. комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы». -Ростов-на-Дону 2002. - С. 34-39.

31. Ломов Ю.М., Мазрухо Б.Л., Воронежская Л.Г. и др. Эпидемически опасные холерные вибрионы нового серовара 0139 «Бенгал» // Сб. науч. тр. / Причерноморская ПЧС. Новороссийск, 1994. - Вып.1. - С. 92-97.

32. Ломов Ю.М., Мазрухо Б.Л., Мишанькин Б.Н. и др. Случай завоза на террторию России холеры, вызванной новым сероваром // Журн. микробиол. -1995. -№ 2 (приложение), март-апрель. С. 97-101.

33. Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Беспалов И.А. и др. Холера в 1990-1999 гг.: состояние и тенденция заболеваемости в мире, странах СНГ, России. Прогноз// Матер, пробл. комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону - 2000. - С. 11-16.

34. Ломов Ю.М. Пандемии холеры и эволюция возбудителя // Матер. VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера». -Ростов-на-Дону, 2003 -С. 13-31.

35. Мазрухо Б.Л., Ломов Ю. М., Воронежская Л.Г. Перспективы серодиагностики холеры, обусловленной холерными вибрионами 0139 «Бенгал»//Сб.науч.тр./Причерноморская ПЧС. Новороссийск, 1994. - Вып. 1. - с.123-124.

36. Мазрухо Б.Л., Ишина Е.В. Холерный эритроцитарный диагностикум на основе лнзата холерных вибрионов 0139 серогруппы// Материалы науч.-практич. конф., поев. 100-летию образов, противочумн. службы России. Т. 2. -Саратов, 1997.-С. 193.

37. Мазрухо Б.Л., Ишина Е.В. Серодиагностика холеры, обусловленной вибрионами «Бенгал»: препараты для идентификации// Матер. Второй Всероссийск. конф. «Гомеостаз и инфекционный процесс», 20-21 мая 1998 г. -Саратов, 1998.-С. 45.

38. Медицинская микробиология/ под ред. Королюка A.M. и Сбойчакова В.Б. -СПб, 1999.-272 с.

39. Мишанькин Б.Н., Романова Л.В., Ломов Ю.М. Vibrio cholerae 0139, выделенные от людей и из во'ды открытых водоемов: сравнительное генотипирование// Журн. микробиол. 2000. - №3. - С. 3-7.

40. Моноклональные антитела: Гибридомы: новый уровень биологического анализа/ под ред Кеннета Р.Г. М.:Медицина. - 1983. - 416 с.

41. Москвитина Э.А., Ломов Ю.М., Беспалов И.А. Холера Бенгал// Матер. VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера».-Ростов-на-Дону, 2003 С. 31-34.

42. Осин А.В., Ерошенко Г.А., Коннов Н.П. и др. Фенотипический и генотипический анализ штаммов Vibrio cholerae 0139 серогруппы, выделенных из внешней среды // Пробл. особо опасных инф. 2000. - Вып. 80.-С. 93- 100.

43. Осин А.В., Ерошенко Г.А., Лазовский Ю.В., Смирнова НИ. Сравнительный ПЦР-анализ структуры генома вирулентных и авирулентных штаммов Vibrio cholerae серогруппы 0139 // Пробл. особо опасных инф. 2003. - Вып. 85. - С. 97-103.

44. Романова Ю.М., Чегаева Е.В., Гинцбург А.Л. Некультивируемое состояние у патогенных бактерий: известные и возможные факторы индукции обратимого процесса // Молекул, генетика. 1998. - № 3. - С. 3-8.

45. Седина С.Г., Цитцер А.О. Об антигенных свойствах RO-вариантов холерного вибриона // XIII конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахстана: Тез. докл. -Алма-Ата, 1990.-С. 189-192.ч

46. Семенов Б.Ф. Использование продуктов гибридомной технологии в медицине // Моноклональные антитела в микробиологии и вирусологии, сб. тр. -Москва, 1985.-С. 3-6.

47. Смирнова Н.И., Чеховская Г.В., Давыдова Н.И., Ливанова Л.Ф. Фенотипический анализ двух морфологически разных типов колоний V. cholerae 0139 // Молекул, генетика. 1995. -№3. - С.30-33.

48. Смирнова Н.И. Генетический контроль патогенности V. cholerae: умеренный нитевидный фаг ctx, кодирующий холерный токсин и "остров патогенности" // Молекул, генетика. 1999. - №4. - С. 3-11.

49. Смирнова Н.И. Возбудитель холеры новой 0139 серогруппы: молекулярно-генетические особенности и происхождение // Молекул, генетика. 2002. - № З.-С. 23-33.

50. Соколенко А.В., Ломов Ю.М., Алексеева Л.П. Индикация некультивируемых форм холерных вибрионов // Матер. VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера». Ростов-на-Дону, 2003. - С. 156-160.

51. Стукалова Н.В., Карабак В.И., Алексахина Н.Н. и др. Выделение и изучение липополисахарида Klebsiella pneumoniae вакцинного штамма 204// Журн. микробиол. 1997. - №1. - С. 39^2.

52. Сухарь В.В., Лобанов В.В., Ишина Е.В. К вопросу капсулообразования у Vibrio cholerae 0139 // Матер, пробл. комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2001. - Вып. 14 - С. 47-48.

53. Сыворотка диагностическая холерная 0139 адсорбированная жидкая для реакции агглютинации на стекле // Здоровье населения и среда обитания. -1994.-№4.-С. 22.

54. Ткаченко В.В. Липолисахариды холерного вибриона и некоторых энтеробактерий // Журн. микробиол. 1982. - №9. - С. 20-28.

55. Терешкина Н.Е. Изучение капсульных и бескапсульных форм Vibrio cholerae 0139 с использованием поли-и моноклональных антител: Автореф. дисс. . канд. мед. наук. Саратов, 2004. - 24 с.

56. Федорова В.А., Девдариани З.А., Громова О.В., Ливанова Л.Ф. Некоторые иммунохимические и иммунобиологические свойства капсульного антигена V. cholerae 0139 серовара//Молекул, генетика. 1997. -№3. - С. 18-19

57. Черепахина И.Я., Балахнова В.В., Подосинникова Л.С. и др. Современные подходы к изучению антигенной вариабельности V. cholerae // Журн. микробиол. 1996. -№ 4. - С. 85-86.

58. Шиманюк Н.Я., Дуванова О.В., Сучков И.Ю. Нейраминидаза Vibrio cholerae 0139 «Бенгал»: обнаружение, очистка и некоторые свойства// Биотехнология.- 1999. -№3. С. 56-62.

59. Щелканова Е.Ю. Молекулярно-генетический анализ хромосомной Сар-области Vibrio cholerae 0139: Автореф. дисс. . канд. мед. наук. Саратов, 1998.-24 с.

60. Щуркина И.И., Адамов А.К., Лукьянова О.И., Казакова Е.С. Антигенная структура холерного вибриона не 01 группы М045 0139 серовара // Деп. в ВИНИТИ 19.07.95 г. № 2220. В95., 1995.

61. Яровая Л.М., Алешкин В.А. Новые данные о химической структуре липополисахаридов и практические перспективы// Журн. микробиол. 1991. -№ 3. - С. 73-78.

62. Adams L.B., Henk М.С., Siebeling R.J. Detection of Vibrio cholerae with monoclonal antibodies specific for serovar 01 lipopolysaccharide // J. Clin. Microbiol. 1988. - Vol. 26, № 9. - P. 1801-1809.

63. Albert M.J., Siddique A.K., Islam M.S. Large outbreak of clinical cholera due to V. cholerae non 01 in Bangladesh // Lancet. 1993. - Vol. 341, № 8846. - P.704.

64. Albert M.J., Ansaruzzaman M., Shimada Т., Rahman A., Bhuiyan N.A., Nahar S., Qadri F., Islam M.S. Characterization of Aeromonas trota strains that cross-react with V. cholerae 0139 Bengal // J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol. 33, №12. - P. 3119-3123.

65. Albert M.J., Bhuiyan N.A., Rahman A. Phage specific for Vibrio cholerae 0139 Bengal // Clin. Microbiol. 1996. - Vol. 34, № 7. - P. 1843-1845.

66. Albert M.J., Qadri F., Bhuiyan N.A., Ahmad S.M., Ansaruzzaman M., Weintraub A. Phagocytosis of Vibrio cholerae 0139 Bengal by human polymorphonuclear leukocytes // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1999. - Vol. 6, № 2. - P. 276-278.

67. Aldova E., Laznickova K., Stepankova E., Lietava J. Isolation of nonagglutinable vibrios from an enteritis outbreak in Czechoslovakia // J. Infect. Dis. 1968. - Vol. 118, № 1. - P. 25-31.

68. Ansaruzzaman M., Shimada Т., Bhuiyan N.A., Nahar S., Alam K., Islam M.S., Albert M.J. Cross-reaction between a strain of Vibrio mimicus and V. cholerae 0139 Bengal // J. Med. Microbiol. 1999. - Vol. 48, № 9. - P. 873-877.

69. Attridge S.R., Qadri F., Albert M.J., Manning P.A. Susceptibility of Vibrio cholerae 0139 to antibody-dependent, complement-mediated bacteriolysis // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2000. - Vol. 7, № 3. - P. 444-450.

70. Bik E.M., Mooi F.R., Gouw R.D., Bunschoten A.E. Genesis of the novel epidemic Vibrio cholerae 0139 strain: evidence for horizontal transfer of genes involved in polysaccharide synthesis // EMBO J. 1995. - Vol. 14 № 2. - P. 209 - 216.

71. Blake P.A, Weaver R.E., Hollis D.G. Diseases of humans (other than cholera) caused by vibrios // Annu. Rev. Microbiol. 1980. - Vol. 34. - P. 341-367.

72. Brayton P.R., Tamplin M.L., Huq A., Colwell R.R. Enumeration of Vibrio cholerae 01 in Bangladesh waters by fluorescent-antibody direct viable count// Appl. Environ. Microbiol. 1987. - Vol. 53., № 12. - P. 2862-2865.

73. Brown P.K., Romana L.K., Reeves PR. Molecular analysis of the rfb gene cluster of Salmonella serovar muenchen (strain M67): the genetic basis of the polymorphism between groups C2 and В // Mol. Microbiol. 1992. - Vol. 6, № 10. - P. 13851394.

74. Calia K.E., Murtagh M., Ferraro M.J., Calderwood S.B. Comparison of Vibrio cholerae 0139 with V. cholerae 01 classical and El Tor biotypes // Infect. Immun. -1994.-Vol. 62, №4.-P. 1504-1506.

75. Chaicumpa W., Srimanote P., Sacolvaree Y. Rapid diagnosis of cholera caused by V. cholerae 0139 // J. Clin. Microbiol. 1998. - Vol. 36. - №12. - P. 3595-3600.

76. Cholera Working Group, International Centre for Diarrhoeal Diseases Research, Bangladesh. Large epidemic of cholera-like disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal // Lancet 1993. - Vol. 342. - P. 387-390.

77. Chongsa-nguan M., Chaicumpa W., Moolasart P., Kandhasingha P., Shimada Т., Kurazono H., Takeda Y. Vibrio cholerae 0139 Bengal in Bangkok // Lancet. -1993.- Vol. 342.-P. 430-431.

78. Comstock L. E., Maneval D.Jr. The capsule and O-antigen in V. cholerae 0139 Bengal are associated a genetic region not present in V. cholerae 01 // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63, №1. - P. 317-323

79. Cox A.D., Brisson J.-R., Varma V., Perry M.B. Structural analysis of the lipopolysaccharide from Vibrio cholerae 0139 // Carbohydr. Res. 1996. - Vol. 290.-P. 43-58.

80. Fazekas de St., Groth S. Production of monoclonal antibodies: strategi and tactica// J. Immunol. Meth.- 1980.- Vol. 35.-P. 1-21.

81. Fomsgaard A., Freudenberg M., Galanos C. Modification of the silver staining technique to detect lipopolysaccharide in polyacrilamide gels // J. of Clin. Microbiol. 1990. - V. 28, № 12. - P. 2627-2631.

82. Garg S., Saha P.K., Ramamurthy Т., Deb B.C., Nair G.B., Shimada Т., Takeda Y. Nationwide prevalence of the new epidemic strain of Vibrio cholerae 0139 Bengal in India//J. Infect. 1993. - Vol. 27, № l.-P. 108-109.

83. Goding J.W. Monoclonal antibodies: principles and practice. Academic Press Inc. (London) Ltd. - 1986. - 315 p.

84. Gustafsson В., Rosen A., Holme T. Monoclonal antibodies against Vibrio cholerae lipopolysaccharide // Infect. Immun. 1982. - Vol. 38, № 2. - P. 449-454.

85. Gustafsson В., Holme T. Monoclonal antibodies against group- and type-specific lipopolysaccharide antigens of Vibrio cholerae 0:1 // J. Clin. Microbiol. 1983. -Vol. 18, №3.-P. 480-485.

86. Gustafsson B. Monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assays for identification and serotyping of Vibrio cholerae 01 //J. Clin. Microbiol. -1984.-Vol. 20, №6.-P. 1180-1185.

87. Gustafsson B. Detection and characterization of lipopolysaccharide antigens in V. cholerae 01. Stockholm. - 1985. - 41 p.

88. Gustafsson В., Holme T. Immunological characterization of V. cholerae 01 lipopolysaccharide, O-side chan and core with monoclonal antibodies //Infect. Immun. 1985. - Vol. 49,№2. - P. 275-280.

89. Hasan J.A., Hug A. Development and testing of monoclonal antibidy-based rapid immunodiagnostic test kits for direct detdction of V. cholerae 0139 synonym Bengal // J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol. 33, №11.- P. 2935-2939.

90. Henderson B, Poole S, Wilson M. Bacterial modulins: a novel class of virulence factors which cause host tissue pathology by inducing cytokine synthesis // Microbiol Rev. 1996. - Vol. 60, № 2. - P. 316-41.

91. Hisatsune K., Kondo S. Lipopolysaccharides of R mutants isolated from Vibria cholerae // Biochem. J. 1980. - Vol. 185, № 1. - P.77-81.

92. Hisatsune K., Kondo S., Iguchi T. A chemical identification method of V. cholerae // In: Advances in Research on cholera and related diarrheas. Proceeding of the 18th Joint Conference on Cholera. 1985. - P.9-15.

93. Hisatsune K., Jamamoto F., Kondo S. Lipopolysaccharide of V. cholerae -chemical and serological properties // In: Advances in Research on cholera and related diarrheas. Proceeding of the 18th Joint Conference on Cholera. 1985. -P. 17-24.

94. Hitchcock P.J., Leive L., Makela P.H., Rietschel E.T., Strittmatter W., Morrison D.C. Lipopolysaccharide nomenclature past, present, and future// J. Bacteriol. -1986. - Vol. 166, № 3. - P. 699-705.

95. Holmes R.K., Twiddy E.M. Characterization of monoclonal antibodies that react with unique and cross-reacting determinants of cholera enterotoxin and its subunits // Infect. Immun. 1983. - Vol. 42, № 3. - P. 914-923.

96. Jennings H.J., Bhattacharjee A.K., Kenne L The R-type lipopolysaccharides of Neisseria meningitidis // Can. J. Biochem. 1980. - Vol. 58. - P. 128-136.

97. Jesudason M.V., Cherian A.M., John T.J. Blood stream invasion by Vibrio cholerae 0139 // Lancet. 1993. - Vol. 342. - P. 431.

98. Jonson G., Osek J., Svennerholm A.-M., Holmgren J. Immune mechanisms and protective antigens of Vibrio cholerae 0139 as a basis for vaccine development // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64. - P. 3778-3785.

99. Johnson J.A., Panigrahi P., Morris J.G. Non-01 Vibrio cholerae NRT36S produces a polysaccharide capsule that determines colony morphology, serum resistance and virulence in mice // J. Infect. Immunol. 1992. - Vol. 60. - P. 864869.

100. Kaper J.B., Morris J.G., Levine M.M. Cholera // Clin. Microbiol. Rev. 1995. -Vol. 8. P. 48-86.

101. Kenne L., Lindberg B. Bacterial polysaccharides // The polysaccharides / Ed. Aspinall G.O. New York-London: Academic Press. - 1983.

102. Kessler A.C., Haase A., Reeves P.R. Molecular analysis of the 3,6-dideoxyhexose pathway genes of Yersinia pseudotuberculosis serogroup IIA // J. Bacter.- 1993.-Vol. 175.-P. 1412-1422.

103. Khan A.M., Albert M.J., Sarker S.A., Bhattacharya M.K., Azad A.K. Septicemia due to Vibrio cholerae 0139 Bengal // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1995. - Vol. 22,№4.-P. 337-338.

104. Knirel Y.A.,Paredes L.,Jansson P.E. Structure of the capsular polysaccharide of V. cholerae 0139 synonym Bengal contaning D-galactose 4,6-cyclophosphat // Eur. J. Biochem. 1995. -Vol. 232. -P. 391-396.

105. Knirel Y.A., Senchenkova S.N.,Jansson P.E. Structure of the O-specific polysaccharide of an Aeromonas trota strain cross-reactive with V. cholerae 0139 Bengal // Eur. J. Biochem. 1996. - Vol. 238. - P. 160-165.

106. Knirel Y.A., Widmalm G., Senchenkova S.N. Structural studies of the short chain lipopolysaccharide of V. cholerae 0139 Bengal // Eur. J. Biochem. 1997. -Vol. 247. -P.402-410.

107. Kohler G., Milstien C. Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tuinor lines by cell fusion // Eur. J. of Immunol. 1976. - Vol. 6. - P.511-519.

108. Kondo K., Takade A., Amako K. Morphology of the viable but nonculturable Vibio cholerae as determined by the freeze fixation technique// FEMS Microbiol. Lett.- 1994.-Vol. 123, № 1-2.-P. 179-184.

109. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature 1970. - Vol. 227, №5259. - P. 680 - 685.

110. Landersjo С., Weintraub A., Ansaruzzaman M., Albert M.J., Widmalm G. Structural analysis of the O-antigenic polysaccharide from Vibrio mimicus N-1990 // Eur. J. Biochem. 1998. - Vol. 251, № 3. - P 986-990.

111. Le Dur A., Chaby R., Szabo L. Isolation of two protein-free and chemically different lipopolysaccharides from Bordetella pertussis phenol-extracted endotoxin// J. Bacteriol. 1980. - Vol. 143, № 1. - P. 78-88.

112. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Ferr A.L. et al. Protein mesurment with the folin phenol reagent// J. Biol. Chem. 1951. - Vol. 193. - P. 265.

113. Luderitz O., Freudenberg M.A., Galanos Ch. Lipopolysaccharides of gram-negative bacteria // Current topics in membranes and trnsport/ Eds. Razin S., Rottem S.-New York: Academic Press, 1982.-Vol 17. P. 79-151.

114. Lugtenberg В., Meijers J., Peters R., van der Hoek P., van Alphen L. Electrophoretic resolution of the "major outer membrane protein" of Escherichia coli K12 into four bands // FEBS Lett. 1975. - Vol. 58, № 1. - P. 254-258.

115. MacLachlan P.R., Keenleyside W.J., Dodgson C., Whitfield C. Formation of the K30 (group I) capsule in Escherichia coli 09:K30 does not require attachment to lipopolysaccharide lipid A-core // J. Bacteriol. 1993. - Vol. 175. - P. 7515-7522.

116. Manning P. A., Stroeher U. H., Morona R. Molecular basis for O-antigen biosynthesis in Vibrio cholerae 01: Ogawa-Inaba switching// In I. K. Wachsmuth,

117. P. A. Blake, and 0. Olsvik (ed.), Vibrio cholerae and cholera: molecular to global perspectives. ASM Press, Washington, D.C., 1994. p. 77-94.

118. Martinez-Govea A., Ambrosio., Guttierez-Cogco L., Flisser A. Identification and strain differentiation of Vibrio cholerae by using polyclonal antibodies against outer membrane proteins // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2001. Vol. 8. - P. 768-771.

119. Meno Y., Waldor M.K. Mekalanos J.J., Amako K. Morphological and physical characterization of the capsular layer of Vibrio cholerae 0139 // Arch. Microbiol. -1998. Vol. 170, № 5. - P. 339-344.

120. Mitra R., Basu A., Dutta D., Nair G.B., Takeda Y. Resurgence of Vibrio cholerae 0139 Bengal with altered antibiogram in Calcutta, India // Lancet. 1996. -Vol. 348.-P. 1181.

121. Morris J. G., Jr. Non-0 group 1 Vibrio cholerae strains not associated with epidemic disease // In I. K. Wachsmuth, P. A. Blake, and 0. Olsvik (ed.), Vibrio cholerae and cholera. American Society for Microbiology, Washington, D.C. -1994.-P. 103-115.

122. Nair G.B., Ramamurthy Т., Bhattacharya S.K., Mukhopadhyay A.K., Garg S., Bhattacharya M.K., Takeda Т., Shimada Т., Takeda Y., Deb B.C. Spread of Vibrio cholerae 0139 Bengal in India // J. Infect. Dis. 1994. - Vol. 169, № 5. - P. 1029-1034.

123. Nesper J., Schild S., Lauriano C.M., Kraiss A., Klose K.E., Reidl J. Role of Vibrio cholerae 0139 surface polysaccharides in intestinal colonization// Infect. Immun. 2002. - Vol. 70, № 11. - P. 5990-5996.

124. O'Hare M.J. Monoclonal antibodies of murine and human origin: their genegation, characterization and use // In "Immunogenetics". Ed. by G.S.Panayi. -London. 1984.-P. 296-399.

125. Oscarson S., Tedebark U., Turek D. Synthesis of colitose-containing oligosaccharide structures found in polysaccharides from Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal using thioglycoside donors // Carbohydr. Res. 1997. - Vol. 299, №3.-P. 159-164.

126. Ouchterlony O. Antigen-antibody reactions on gels // Acta path microbiol. Scand. 1949. - Vol. 49. - P.5007-5017.

127. Pollitzer R., Swaroop S., Burrows W. Cholera // Monogr. Ser. World Health Organ.- 1959.-Vol. 58.-P. 1-1019.

128. Preston L.M., Xu Q., Johnson J.A. Preliminary structure determination of the capsular polysaccharide of V. cholerae 0139 Bengal A11837 // J. of Bacter. -1995. Vol.177, №3. - P.835-838

129. Proctor R.A. Handbook of endotoxin. Vol. 1 Chemistry of endotoxin / Ed. Rietschel E. Th. Amsterdam: Elsevier, 1984. - 419 p.

130. Provenzano D., Klose K.E. Altered expression of the ToxR-regulated porins OmpU and OmpT diminishes Vibrio cholerae bile resistance, virulence factor expression, and intestinal colonization // PNAS. 2000. - Vol. 97. - P. 1022010224.

131. Qadri F., Azim Т., Chowdhury A., Hossain J., Sack R.B., Albert M.J. Production, characterization and application of monoclonal antibodies to Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal // Clin, and Diagn. Immunol. 1994. - Vol. 1. - P. 51-54.

132. Ried G., Hindennach I., Henning U. Role of lipopolysaccharide in assembly of Escherichia coli outer membrane proteins OmpA, OmpC and OmpF // J. Bacteriol. -1990.-Vol. 172.-P. 6048-6053.

133. Reik L.M., Maines S.L. A simple non-chromatographic purification procedure for monoclonal antibodies//J. Immunol. Meth. 1987. - Vol. 100.-P.123.

134. Remmers E.F., Colwell R.R., Goldsby R.A. Production and characterization of monoclonal antibodies to cholera toxin // Infect. Immun. 1982. - Vol. 37, № 1. -P. 70-76.

135. Rietschel E.T., Brade H. Bacterial endotoxins // Amer. Scientist. 1984. - Vol. 267.-P.54-61.

136. Rietschel E.T., Mayer H., Wollenweber H.W. Bacterial lipopolysaccharides and their lipid A component // Bacterial endotoxin: chemical, biological and clinical aspects / Eds. Homma Y. et al. F.R.G., Weiheim: Verlag Chemie, 1984. - P. 11-22.

137. Riordan S.M., Mclver C.J., Wakefield D., Andreopoulos P.C., Duncombe V.M., Bolin T.D., Thomas M.C. Local and systemic complement activity in small intestinal bacterial overgrowth // Dig. Dis. Sci. 1997. - Vol. 42. - P. 1128-1136.

138. Rivas M., Toma C., Miliwebsky E., Caffer M.I., Galas M., Varela P., Tous M , Bru A.M., Binsztein N. Cholera isolates in relation to the "eighth pandemic" // Lancet. -1993. Vol. 342. - P. 926-927.

139. Robb M., Nichols J.C., Whoriskey S.K., Murphy J.R. Isolation of hybridoma cell lines and characterization of monoclonal antibodies against cholera enterotoxin and its subunits // Infect. Immun. 1982. - Vol. 38, № 1. - P. 267-272.

140. Safrin S., Morris J. G., Adams M., Pons V., Jacobs R., Conte J. E. Non-01 Vibrio cholerae bacteremia: a case report and review // Rev. Infect. Dis. 1987. -Vol. 10.-P. 1012-1017.

141. Sengupta D.K., Boesman-Finkelstein M, Finkelstein RA Antibody against the capsule of Vibrio cholerae 0139 protects against experimental challenge// Infect. Immun. 1996.-Vol. 64, № 1. - P. 343-345.

142. Shimada Т., Sakazaki R. R antigen of vibrio cholerae // Jpn. J. Med. Sci. Biol. -1973.-Vol. 26,№4.-P. 155-160.

143. Shimada Т., Nair G.B., Deb B.C., Albert M.J., Sack R.B., Takeda Y. // Lancet. 1993.-Vol. 341.-P. 1347.

144. Shimada Т., Arakawa E., Takeda Y. Epidemic of cholera due to a new serogroup Vibrio cholerae 0139 Bengal //Nippon. Saikingaku. Zasshi. 1995. - Vol. 50, № 4. -P. 1005-1017.

145. Simoons-Smit A.M., Verweij-van Vught A.M.J.J., MacLaren D.M. The role of К antigens as virulence factors in Klebsiella// J. Med. Microbiol. 1986. - Vol. 21. -P. 133-137.

146. Sinha S., Chakraborty R., Khan A., Datta S., Ramamurthy Т., Bhattacharya S.K., Takeda Y., Nair G.B. Escalating association of Vibrio cholerae 0139 with cholera outbreaks in India // J. Clin. Microbiol. 2002. - Vol.40, № 7. - P. 2635-2637.

147. Skorupski, K., and R. K. Taylor. Control of the ToxR virulence regulon in Vibrio cholerae by environmental stimuli// Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 25. - P. 1003— 1009.

148. Stroeher U.A., Parasivam G., Dredge B.K., Manning P.A. Novel Vibrio cholerae 0139 genes involved in lipopolysaccharide biosynthesis // J. Bacteriol. 1997. -Vol. 179.-P. 2740-2747.

149. Sutherland I.W. Surface carbohydrate of the procariotic cell // Academic Press, Inc., New York, N.Y., 1978.

150. Taylor C.M., Roberts I. S. Capsular polysaccharides and their role in virulence // Concepts in bacterial virulence Contrib Microbiol. / Eds Russell W., Herwald H. -Basel, Karger/ 2005. - Vol. 12. - P. 55-66.

151. Towbin H., Gordon J. Immunoblotting and dot immunobinding Current status and outlook // J. Immunol. Methods - 1984. - Vol. 72. - P. 313 - 340.

152. Underwood P.A., Bean P.A. Hazards of the limiting-dilution method of cloning hybridomas // J. Immunol. Meth. 1988. - Vol. 107.-P. 119-128.

153. Vetterlein D. Monoclonal antibodies: production, purification, and technology // Adv. Clin. Chem. 1989. - Vol. 27. - P. 303-354.

154. Waldor M.K. & Mekalanos J.J. ToxR regulates virulence gene expression in non-01 strains of Vibrio cholerae that cause epidemic cholera // Infect. Immun. -1994.-Vol. 62.-P. 72-78.

155. Waldor M.K. & Mekalanos J.J. Emergence of a new cholera pandemic: molecular analysis of virulence determinants in Vibrio cholerae 0139 and development of a live vaccine prototype // J. Infect. Dis. 1994. - Vol. 170. - P. 278-283.

156. Waldor M.K., Colwell R., Mekalanos J.J. The Vibrio cholerae 0139 serogroupantigen includes an O-antigen capsule and lipopolysaccharide virulence »Ideterminants // PNAS. 1994. - Vol. 91, № 24. - P. 11388-11392.

157. Weintraub A., Widmalm G., Jansson P.E., Jansson M., Hultenby K., Albert M.J. Vibrio cholerae 0139 Bengal possesses a capsular polysaccharide which may confer increased virulence // Microb. Pathog. 1994. - Vol. 16, № 3. - P. 235-241.

158. Westphal 0., Jann K. Bacterial lipopolysaccharides. Extraction with phenol-water and further applications of the procedure// Methods Carbohydr. Chem. -1965.-Vol. 5.-P. 83-91.

159. Yamamoto Т., Albert M.J., Sack R.B. Adherence to human small intestines of capsulated Vibrio cholerae 0139 // FEMS Microbiol Lett. 1994. - Vol. 119, № 1-2.-P. 229-235.

160. Yoshida S., Ogawa M., Mizuguchi Y. Relation of capsular materials and colony opacity to virulence of Vibrio vulnificus // Infect. Immun. 1985. - Vol. 47, №2.-P. 446-451.

Информация о работе

Чемисова, Ольга Сергеевна
кандидата биологических наук
Ростов-на-Дону, 2007
ВАК 03.00.07

Диссертация

Изучение поверхностных полисахаридных антигенов штаммов Vibrio cholerae O139 различного происхождения с использованием моноклональных антител - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы