Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка новых препаратов на основе моноклональных антител для диагностики холерных вибрионов O1, O139 серогрупп ускоренными методами

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка новых препаратов на основе моноклональных антител для диагностики холерных вибрионов O1, O139 серогрупп ускоренными методами"

На правах рукописи

КРЕТЕНЧУК Оксана Федоровна

РАЗРАБОТКА НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ 01, 0139 СЕРОГРУПП УСКОРЕННЫМИ МЕТОДАМИ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

13 ПАР 2ии

Ставрополь - 2014

005545886

Работа выполнена в Федеральном казённом учреждении здравоохранения «Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Алексеева Людмила Павловна

Официальные оппоненты:

Ляпустина Лариса Вениаминовна - доктор медицинских наук, Федеральное казённое учреждение здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, заведующая лабораторией подготовки специалистов.

Марков Евгений Юрьевич - доктор биологических наук, Федеральное казённое учреждение здравоохранения «Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, заведующий биохимическим отделом.

Ведущая организация: Федеральное казённое учреждение здравоохранения «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Защита состоится «18» апреля 2014 г. в 14-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.109.01 при Федеральном казённом учреждении здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 355035, г. Ставрополь, ул. Советская, д.13-15.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора.

Автореферат разослан «/£» февраля 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного

совета, доктор биологических наук Сарникова Ирина Викторовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Трудность в борьбе с холерой, как отмечалось на 64-ой сессии Всемирной ассамблеи здравоохранения, вызвана недостаточным количеством диагностических экспресс-тестов для выявления холерных вибрионов и своевременного принятия мер, что определяет необходимость дальнейших научных исследований по разработке таких тестов. К настоящему времени для диагностики возбудителя холеры рекомендованы к практическому использованию препараты, в основе которых поликлональные иммунные сыворотки лошадиного происхождения, имеющие ряд недостатков: разнородность и гетерогенность популяции антител, низкие титры специфических иммуноглобулинов и, как следствие, наличие перекрестных реакций при их применении внутри вида и с гетерологичными микроорганизмами. Предпринимались попытки улучшения качества препаратов за счет получения кроличьих сывороток (Мазрухо Б.Л., Ишина Е.В., 1998; Абрамова Е.Г. с соавт., 2002; Аленкина Т.В. с соавт., 2010, 2012). Однако проблема обеспечения высокоспецифичными препаратами остается актуальной. Привлечение МКА в лабораторную диагностику холеры позволяет решить проблему качества реагентов. Так, первые публикации, касающиеся использования МКА в серодиагностике холеры, появились за рубежом еще в начале 80-х годов (Gustafsson В. et al., 1982; Robb М. et al., 1982; Gustafsson В., 1984, 1985). Позже другие зарубежные авторы сконструировали на основе МКА высокоэффективные тест-системы: для слайд-агглютинации (Adams L.B. et al., 1988), набор CholeraeScreen для реакции коагглютинации (Colwell R.R. et al., 1992), дот-блот-ИФА (Supawat К. et al., 1994), флуоресцирующие иммуноглобулины (Hasan J.A. et al., 1994; Castillo L. et al., 1995). В отечественной практике сведения о холерных моноклональных препаратах, имеющих диагностическую значимость, представлены в работах Л.П. Алексеевой с соавт. (1988), О.С. Бурлаковой (1993), З.Л. Девдариани с соавт. (1999), Н.Е. Терешкиной (2004), Н.А.Сыровой (2005), О.С. Чемисовой (2006), В.А. Федоровой с соавт. (2007), О.В. Маркиной (2008). Начиная с 2000 г. в ГНЦ ФГУП «ГосНИИ биологического приборостроения» (г. Москва) ведутся работы в области создания отечественных иммунохроматографических (ИХ) тест-систем, чувствительность и специфичность которых повышается, если используются МКА (Шиленко И.В. с соавт., 2007; Ярков С.П. с соавт., 2008). В рамках совместной темы нашего института с ГНЦ ПМБ (г. Оболенск) разработана моноклональная ИХ тест-система для выявления V. cholerae 01 (Хомяков А.Е. с соавт., 2009; Баранова Е.В. с соавт., 2010, 2013). Однако проблема обеспечения высокоспецифичными диагностикумами сохраняет актуальность. В первую очередь это касается препаратов, широко используемых в лабораторной практике, в частности для постановки слайд-

агглютинации и иммунофлуоресценции. Потребность в таких препаратах диктуется и современной ситуацией. Так, в ходе мониторинга водных объектов наблюдается увеличение числа штаммов холерных вибрионов не01/не 0139, которые давали положительную слайд-агглютинацию на стекле с 01 холерной сывороткой, причем у части штаммов зарегистрировано образование агглютината при постановке развернутой реакции в пределах титров от 1/100 до 1/200, у отдельных до 1/400 и типоспецифическими сыворотками Инаба - от 1/50 до 1/100 (Григоренко Л.В. с соавт., 2011). Этот факт не исключает возможности диагностических ошибок при проведении исследований на наличие возбудителя холеры лабораториями территориального уровня, что подтверждает необходимость введения либо дополнительного теста дифференциации, например реакции иммунофлуоресценции (РИФ), либо высокоспецифичных диагностикумов. Одновременно существует и проблема низкоагглютинабельных штаммов холерных вибрионов 01 серогруппы, их идентификация на этом фоне представляется возможной только при условии использования препаратов, отличающихся высокой чувствительностью и специфичностью, применение которых в перспективе позволит исключить постановку развернутой реакции агглютинации, что сократит объем лабораторных исследований.

Цель исследования - совершенствование лабораторной диагностики холеры путем конструирования диагностических препаратов на основе МКА для идентификации холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп в реакциях прямой иммунофлуоресценции и слайд-агглютинации.

Задачи исследования:

1. Расширить спектр имеющихся гибридом за счет получения новых, продуцирующих МКА к видоспецифическим эпитопам холерных вибрионов 01 серогруппы, охарактеризовать их изотип, направленность, аффинность, наличие перекрестной активности внутри вида, рода.

2. Получить в препаративных количествах видоспецифические МКА, провести их очистку с помощью различных методов, оценить их специфическую активность в реакциях непрямой иммунофлуоресценции, слайд-агглютинации, преципитации и иммуноферментном анализе.

3. Разработать на основе охарактеризованных МКА биотехнологическую схему получения флуоресцирующих моноклональных иммуноглобулинов для выявления V. с1го1егае 01 и 0139 в реакции прямой иммунофлуоресценции, наработать экспериментальные серии препаратов в лиофилизированном виде.

4. Изучить агглютинирующие свойства видоспецифических МКА 01, МКА 0139, выделенных из культуральных и асцитических жидкостей, в реакции слайд-агглютинации на наборе штаммов гомологичных и

гетерологичных микроорганизмов, отобрать диагностически значимые агглютинирующие МКА. 5. Провести лабораторные испытания экспериментальных серий видоспецифических флуоресцирующих и агглютинирующих МКА 01, МКА 0139, оформить нормативную документацию для их государственной регистрации.

Научная новизна. Набор видоспецифических гибридом, которыми располагает лаборатория, расширен за счет получения новых, продуцирующих МКА, направленные к детерминантам О-антигена ЛПС V, cholerae Ol. На основании иммунохимического анализа штаммов холерных вибрионов Ol и 0139 серогрупп установлены диагностически значимые МКА, отличающиеся тем, что они выявляют консервативные эпитопы ЛПС, с высокой плотностью представленные на клеточной поверхности, пространственно расположенные так, что при взаимодействии с антителами не возникает стерических помех. Установление эпитопов, в меньшей степени подверженных модификации и утрате при воздействии различных факторов, способствует повышению диагностической ценности препаратов.

Впервые показана возможность использования в качестве полноценного источника МКА для изготовления препаратов не только асцитической, но и культуральной жидкости, которая в больших объемах накапливается при пассировании гибридом-продуцентов in vitro.

Отработана и оптимизирована технология изготовления моноклональных флуоресцирующих иммуноглобулинов к V. cholerae 01 и 0139, заключающаяся в выделении активной фракции иммуноглобулинов сульфатом аммония, обессоливании диализом, выборе оптимального соотношения флуорохрома и МКА, стабилизации конъюгатов путем лиофильного высушивания.

Теоретическая и практическая значимость работы. Набор гибридом, стабильно продуцирующих видоспецифические МКА Ol и 0139, является источником стандартных моноклональных иммуноглобулинов, на основе которых сконструированы диагностические препараты нового поколения.

Разработана экспериментально-производственная технология изготовления моноклональных флуоресцирующих конъюгатов для диагностики холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп в реакции прямой иммунофлуоресценции. Создан диагностический набор агглютинирующих МКА для идентификации и дифференциации V. cholerae Ol и 0139 в реакции слайд-агглютинации. По результатам проведенных исследований оформлен комплект нормативной документации, включающий в себя инструкцию по применению, справку об изделии медицинского назначения и технические

условия на наборы реагентов «Иммуноглобулины моноклональные диагностические флуоресцирующие сухие для серологической идентификации V. cholerae 01 и 0139 (in vitro) методом РИФ «Иг - V. cholerae 01/0139 - РИФ» и «Иммуноглобулины моноклональные диагностические сухие для серологической идентификации V. cholerae 01 и 0139 (in vitro) методом РА «ИГ -V.cholerae 01/0139 — РА», которые в настоящее время находятся на регистрации в Росздравнадзоре.

На гибридомы, стабильно продуцирующие МКА к видоспецифическим эпитопам возбудителя холеры 01 и 0139, получены два патента на изобретение №2425874 от 13.04.2010 «Штамм культивируемых гибридных клеток животных Mus. musculus L-продуцент моноклональных антител, специфичных к О-антигену холерных вибрионов 01 серогруппы» и №2425875 от 07.06.2010 «Штамм культивируемых гибридных клеток животных Mus. musculus L-продуцент моноклональных антител, специфичных к ЛПС холерных вибрионов 0139 серогруппы».

Экспериментальные серии флуоресцирующих МКА 01 и МКА 0139 были использованы при выполнении кандидатской диссертационной работы Куликаловой Е. С. на базе ФГУЗ «Иркутского научно-исследовательского противочумного института». Разработанные наборы используются при выполнении научно-исследовательских работ во ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, в работе СПЭБ, также для оценки качества препараты в коммерческом виде переданы в Волгоградский и Ставропольский противочумные институты, в ГНЦ ПМБ (г. Оболенск).

Методология и методы исследования. В работе использованы различные методы исследования: микробиологические (культивирование штаммов микроорганизмов), гибридомная технология, методы иммунохимии (ИФА, РИФ, слайд-агглютинация, преципитация, иммуноблот), биохимические и микроскопические.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Набор гибридом-продуцентов обеспечивает получение диагностически значимых, стандартных, воспроизводимых МКА, узнающих видоспецифические эпитопы О-антигена холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп, позволяет конструировать диагностические препараты нового поколения.

2. Видоспецифические МКА выявляют консервативные эпитопы ЛПС, с высокой плотностью представленные на клеточной поверхности вибрионов и в меньшей степени подверженные модификации или утрате при воздействии различных факторов, что способствует повышению диагностической ценности препаратов.

3. Для создания диагностических препаратов впервые использована культуральная жидкость, являющаяся полноценным источником

иммуноглобулинов, получение которой не требует привлечения лабораторных животных.

4. Разработанная биотехнологическая схема экспериментально-производственного изготовления холерных 01, 0139 флуоресцирующих иммуноглобулинов позволяет получать препараты, характеризующиеся высокой специфичностью и чувствительностью.

5. Набор диагностических агглютинирующих МКА без дополнительной постановки развернутой реакции агглютинации обеспечивает выявление холерных вибрионов 01, 0139 серогрупп.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на научных конференциях: проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы» (г. Ростов-на-Дону, 2009 - 2013); научно-практическая конференция «Современные аспекты эпидемиологического надзора и профилактики особо опасных природноочаговых болезней», посвященная 75-летнему юбилею ФГУЗ Иркутского НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока (г. Иркутск, 2009); конференция молодых ученых ФГУЗ РостНИПЧИ (г. Ростов-на-Дону, 2011); Всероссийская научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора с международным участием: «Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения» (г. Пермь, 2012).

Диссертационная работа выполнена в рамках государственной темы № 121-4-10 «Создание видоспецифических моноклональных препаратов для идентификации холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп с помощью тестов слайд-агглютинации, прямой иммунофлуоресценции и иммунохроматографии (2010 - 2014)» (номер государственной регистрации 01200907528).

Личный вклад соискателя. Основные разделы диссертационной работы выполнены Кретенчук О.Ф. самостоятельно на базе группы гибридом Ростовского-на-Дону противочумного института. Разработка идей, постановка научных задач, методическая часть работы, конструирование препаратов, получение научных результатов и их обоснование были выполнены автором под руководством д.б.н., профессора Л.П. Алексеевой.

Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, 5 из них в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК РФ. Получены 2 патента на изобретение № 2425874 (13.04.2010 г.) и №2425875 (07.06.2010 г.).

План диссертационной работы утвержден на заседании Ученого совета ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора (протокол № 8 от 19.06.2012 г.)

Структура диссертации. Работа изложена на 134 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 156 источников, в том числе зарубежных - 37. Диссертация иллюстрирована 21 рисунками и 19 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. Для получения перитонеальных макрофагов, иммунных спленоцитов и асцитических жидкостей использовали инбредных мышей линии Balb/c и беспородных белых мышей массой 16-20 грамм в возрасте 6—10 недель.

В работе были использованы 90 штаммов V. cholerae Ol, 40 штаммов V. cholerae 0139, 100 штаммов V. cholerae не Ol /не 0139, 10 штаммов V. cholerae RO. С целью контроля специфичности препаратов МКА также использовали 12 штаммов V. parahaemolyticus, 4 — Е. coli, 4 - Brucella spp., 4 — Salmonella spp., 108 - Aeromonas, 1 — Plesiomonas, 30 - Comamonas, 1 -V. mimicus, 1 - V. vulnificus. Все штаммы микроорганизмов получены из Музея живых культур Ростовского-на-Дону противочумного института.

Слияние иммунных спленоцитов мыши с миеломой проводили в соответствии с методикой Fazekas de St. et al. (1980). В работе использовали мышиные миеломные линии NS0 и P3-X63/Ag8.653, которые не синтезируют собственные иммуноглобулины или их цепи, дефектны по ферменту гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза (ГГФРТ), резистентны к 8-азагуанину и погибают в селективной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ-среда). В качестве продуцентов специфических иммуноглобулинов дополнительно использовали гибридому-продуцент МКА Ol TX-F8/01, депонированную ранее в «Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных» Института Цитологии (г. Санкт-Петербург) под номером РККК (П) 386Д, и набор гибридом-продуцентов МКА 0139, имеющийся в криохранилище Ростовского-на-Дону противочумного института.

Миеломные и гибридомные клетки выращивали в СОг-инкубаторе (Nuaire) на среде RPMI-1640 («Sigma») и DMEM («Sigma») с добавлением 10 - 15 % сыворотки плода коровы («HyClone»), 2 мМ глутамина («Serva»), 120 мкг/мл гентамицина. Среды готовили из сухого порошка на деионизированной воде по инструкции изготовителя. Стерилизацию сред проводили фильтрованием через мембранные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм.

В работе использовали химические реактивы отечественного и импортного производства со степенью очистки — «х.ч.», «rein», «analytical grade».

Культивирование гибридных клеток in vivo проводили в организме беспородных и линейных мышей Balb/c, предварительно за 14 дней до введения гибридом праймированных пристаном («Sigma») в дозе 0,5 мл/мышь. Гибридомы вводили в культуральной среде внутрибрюшинно в количестве 107 клеток на мышь. Иммунную асцитическую жидкость собирали по мере формирования опухолей через 2-4 недели.

Выделение иммуноглобулиновой фракции из культуральных супернатантов гибридом и асцитических жидкостей мышей осуществляли преципитацией сульфатом аммония. После проверки титра антител препараты разливали по аликвотам и хранили при температуре -20 °С.

Для изучения свойств полученных МКА OI и МКА 0139 применяли разнообразные серологические методы: иммуноферментный анализ (ИФА), дот-иммуноанализ (ДИА), реакцию агглютинации (РА), реакцию непрямой (РНИФ) и прямой иммунофлуоресценции (РПИФ), реакцию преципитации (РП). Постановку иммуноблоттинга осуществляли, как описано Н. Towbin et. al. (1984). Электрофоретическое разделение клеточных лизатов бактерий проводили по Laemmli U.K. (1970).

Конъюгацию МКА с ФИТЦ осуществляли с некоторыми модификациями: концентрация белка не ниже 5 мг/мл, ФИТЦ - 5 мг на 100 мг белка, 10% карбонат-бикарбонатного буфера (КББ), рН реакционной смеси 9,0. Процесс происходил при температуре 6 ± 2 °С в течение 18 ч или при комнатной температуре в течение 4 ч при постоянном перемешивании на магнитной мешалке.

Статистическую обработку полученных результатов проводили по И.П. Ашмарину, А.А. Воробьёву (1962).

Результаты исследований и их обсуждение

Для решения поставленных перед нами задач требовалось получить набор гибридом, стабильно продуцирующих МКА OI и 0139, поэтому на первом этапе исследований была проведена гибридизация, в результате которой для работы отобрали гибридомы Е9, А5 и Fl 1. Одновременно в этот набор была включена гибридома TX-F8/01, депонированная ранее в Институте Цитологии. Что касается гибридом, продуцирующих иммуноглобулины, узнающие антигенные детерминанты в составе поверхностных структур V. cholerae 0139, то в работе исследовали полученные ранее гибридомы ЗЕ4, ЗВ5, ЗА9, 2F6, ЗЕ8. Для выбора источников специфических иммуноглобулинов, пригодных для конструирования диагностических препаратов, проводили целенаправленный отбор клонов гибридом-продуцентов МКА, взаимодействующих с антигенными детерминантами всех исследуемых штаммов V. cholerae OI и OI39. Кроме того, учитывали данные о стабильности антителопродукции при культивировании и после криохранения гибридом. Результаты

специфической активности МКА в различных серологических реакциях явились основанием для отбора продуцентов видоспецифических МКА О] -rX-F8/01 и F11, МКА 0139 - ЗЕ4 и ЗВ5.

Следующим этапом было получение МКА в препаративных количествах. Пассирование гибридом in vitro позволило накопить не только клетки для последующего введения мышам с целью получения асцитов (таблица 1), но и культуральную жидкость, являющуюся источником МКА.

Таблица 1 - Сроки образования и активность АЖ в ТИФА

Название гибридомы Срок образования АЖ Процент получения АЖ V АЖ, мл Содержание белка, мг/мл Титр Ат в ИФА

rX-F8/01 2-4 недели 60 % 5 - 10 15 1:200- 1:400 тыс.

Fil 4-7 недель 20% 2-4 7 1:10- 1:40 тыс.

ЗЕ4 2-4 недели 50 % 5-7 10 1:100-1:200 тыс.

ЗВ5 2-4 недели 50% 5-7 10 1:100 - 1:200 тыс.

Данные таблицы 1 свидетельствуют о том, что из четырех испытуемых гибридом F11 оказалась менее эффективной для получения препаративного количества МКА в виде АЖ. Как было отмечено, при культивировании in vitro происходит накопление КЖ, которая является полноценным источником МКА при условии ее концентрирования преципитацией раствором сульфата аммония. Далее такие препараты исследовали в различных серологических реакциях для определения активности и специфичности иммуноглобулинов, синтезируемых гибридомами TX-F8/01, Fil, ЗЕ4, ЗВ5. Наиболее высокая антителопродукция МКА OI наблюдалась у TX-F8/01, так как титры препаратов в ТИФА, ДИА, РНИФ, РА значительно превышали показатели активности антител, синтезируемых F11. Кроме того, F11 не обладала преципитирующей активностью в отличие от rX-F8/01 (рис. 1) и в ДИА (рис. 2) МКА, синтезируемые F11, только в титре не более 1/100 обеспечивали положительную реакцию со всеми исследуемыми штаммами V. cholerae OI.

А Б В Г

Рисунок 1 - Титры МКА, выделенных из КЖ гибридом, в реакции преципитации: А - взаимодействие МКА ГХ-Fl 1/01 с V. cholerae Ol 5879; Б - взаимодействие МКА F11 с V. cholerae Ol 5879; В - взаимодействие МКА ЗЕ4 с V. cholerae 0139 16064,- Г - взаимодействие МКА ЗВ5 с V. cholerae 0139 16064

m ф

Рисунок 2 - Результаты определения специфичности МКА гибридом в ДИА: I ряд — МКА TX-F8/01 (1/1000), II ряд-MKAFll (1/100), III ряд-МКАЗЕ4 (1/1000), IV ряд - МКА ЗВ5 (1/1000); 1 - V. cholerae cholerae 569В, 2 -V. cholerae eltor 5879, 3 - V. cholerae eltor 14863, 4 - V. cholerae eltor 13813J,, 5 - V. cholerae eltor 15960J,, 6 - V. cholerae 0139 P-16064, 7 - V. cholerae 0139 MO-45, 8 - V. cholerae 01 17905 RO, 9 - V. cholerae Ol 17685 RO, 10 -V. cholerae не Ol/ не 0139 5444, 11 - V. parahaemolyticus 17094, 12 - V. mimicus 16466, 13 - V. vulnificus 17518, 14 - Comamonas P-229, 15 - Aeromonas P-143, 16 - Plesiomonas 101

На рис. 3 представлен ДИА, свидетельствующий о недостаточно высокой активности МКА F11, которые в титре 1/1000 не обеспечивают положительную реакцию с V. cholerae Ol, характеризующимися сниженной агглютинабельностью видовой Ol сывороткой.

»1 VO

J3

it t t. t

a ст. •S 90

"S

5 m

В чо

с — с •

Рисунок 3 - Оценка активности МКА гибридомы Fl 1 (титр 1/1000) в ДИА

Активность и специфичность иммуноглобулинов, продуцируемых гибридомами ЗЕ4 и ЗВ5 в отношении V. cholerae 0139, была сопоставимой во всех серологических реакциях (рис. 1, рис. 2).

Результаты ТИФА с препаратами ЛПС V. cholerae Ol (ЛПС Ol) и V. cholerae 0139 (ЛПС 0139) показывают, что МКА Ol, синтезируемые гибридомами rX-F8/01 и Fil, специфически взаимодействуют с ЛПС Ol, причем показатели ОП в случае rX-F8/01 оказались выше, чем у F11. Гибридомы ЗЕ4 и ЗВ5 продуцировали МКА 0139, обеспечивающие положительную реакцию с ЛПС 0139. Ни один из препаратов видоспецифических МКА не взаимодействовал с коммерческим ЛПС Е. coli 055:В5 (Fluka, Израиль).

Тонкая характеристика МКА в реакциях конкурентного ИФА (рис. 4) и иммуноблота (рис. 5) свидетельствует о пространственной разобщенности детерминант, узнаваемых МКА Ol гибридом TX-F8/01 и Fl 1, а в случае ЗЕ4 и ЗВ5 эпитопы оказались пространственно сближенными на молекуле антигена.

ЭЕ4* 3BS 3BS

ЗЕ4

=1*

=ig

Рисунок 4 - Показатели ОП в ТИФА при совместной инкубации МКА

Результаты иммуноблота, представленного на рис. 5, также показывают, что связывание МКА ГХ-Р8/01 с клеточными лизатами холерных вибрионов происходило в области 35 -40 кДа, МКА 1 - в районе 25 - 35 кДа. Данные литературы (Ткаченко В.В., 1982; Яровая Л.М. с соавт., 1991; Книрель Ю.А. с соавт., 1994; Лобанов В.В. с соавт., 2002; Алешина Ю.А. с соавт., 2013) и локализация в нижней трети блотограммы эпитопов, узнаваемых видоспецифическими МКА, дают основание предполагать, что последние принадлежат О-полисахаридной цепи ЛПС. Иммуноблот с МКА 0139 гибридом ЗЕ4 и ЗВ5 позволил выявить интенсивную полосу на уровне ниже 14 кДа. В исследованиях К. Ш5а18ипе е1. а1. (1993) было показано, что ЛПС V. сИо1егае 0139 имеет короткий О-полисахарид с небольшой молекулярной массой, подобно Я-формам У.сИо1егае 01.

5879 5879

116,0

66.2

45,0

35.0

25.0

18,4

14,4 ^ 2 3

Рисунок 5 - Иммуноблоттинг клеточных лизатов штаммов V. cholerae OI (5879) и V. cholerae 0139 (Р-16064): 1 — маркеры молекулярных весов, 2 — МКА TX-F8/01, 3 - МКА F11, 4 - МКА OI с V. cholerae 0139 (Р-16064), 5 -МКА ЗЕ4, 6 -МКА ЗВ5, 7 - МКА 0139 с V. cholerae OI (5879)

Для окончательного выбора диагностически ценных гибридом была проведена оценка сохранности О-антигенных детерминант ЛПС холерных вибрионов с помощью МКА при различных способах инактивации (хлороформ, формалин, перекись, трипсин, кипячение, кислота, щелочь).

Установлено, что только действие высоких концентраций перекиси, щелочи и кислоты приводило к снижению ОП, по сравнению с контролем. Если сравнивать активность специфических иммуноглобулинов гибридом ГХ-F8/01 и F11 в отношении инактивированных штаммов, то более высокие показатели ОП отмечены в отношении TX-F8/01. Поэтому для конструирования препаратов решено было использовать в качестве основного источника МКА 01 гибридому TX-F8/01, из МКА 0139 выбраны ЗЕ4 и ЗВ5.

Ставя перед собой задачу получения флуоресцирующих иммуноглобулинов, нами были подобраны оптимальные параметры конъюгации. В таблице 2 представлены часто встречающиеся условия получения флуоресцирующих препаратов, но оптимальными являются следующие: концентрация МКА не ниже 5 мг/мл, ФИТЦ - 0,5 мг на 10 мг белка, 10% КББ, рН реакционной смеси 9,0.

Таблица 2 - Основные параметры технологии получения моноклональных флуоресцирующих препаратов __

№ п/п Параметры конъюгации 1 способ 2 способ 3 способ

1 Концентрация специфических 2-4 мг/мл >5 мг/мл >5 мг/мл

2 Предварительный этап -диализ раствора МКА против 0,05 М КББ рН 9,0 диализ не проводят диализ проводят диализ не проводят

3 Концентрация КББ в реакционной смеси 10% 10% 10%

4 Температура реакции комнатная условия холодильника комнатная

5 Количество ФИТЦ на 10 мг белка 0,3 мг 0,5 мг 0,5 мг

6 Продолжительность реакции 2 часа 18 часов 4 часа

Отмечено, что после добавления красителя происходит снижение рН и значительная часть ФИТЦ не вступает в реакцию с МКА, поэтому необходимо проводить либо предварительный диализ раствора иммуноглобулинов против КББ (2 способ), либо корректировку рН в течение первых 30 минут раствором КББ (3 способ). Наилучшие серии конъюгатов получены 2 и 3 способом, о чем свидетельствует положительная РИФ на «4+» всех взятых в опыт штаммов возбудителя холеры. Предпочтительным, по нашему мнению, является 3 вариант, так как в этом случае время реакции сокращено до четырех часов.

По отработанной схеме мы приготовили экспериментальные образцы флуоресцирующих моноклональных препаратов, которые укомплектовали в набор реагентов «Иммуноглобулины моноклональные диагностические флуоресцирующие сухие для серологической идентификации V. cholerae Ol и 0139 (in vitro) методом РИФ «Иг - V. cholerae 01/0139 - РИФ». Для оценки диагностической значимости препаратов были проведены лабораторные испытания на широком наборе штаммов (таблица 3), которые продемонстрировали высокую специфичность набора и явились основанием для оформления нормативной документации.

Таблица 3 - Оценка специфичности иммуноглобулинов моноклональных диагностических холерных О! и 0139 флуоресцирующих_

№ п/п Штаммы Количество штаммов Реакция иммунофлуоресценции

ФИТЦ-МКА Ol ФИТЦ-МКА 0139

4+ 3+ 2+ 4+ 3+ 2+

1 V. cholerae eltor Inaba 26 15 11 - отрицательная реакция

2 V. cholerae eltor Ogawa 27 14 12 1

3 V. cholerae cholerae Inaba 9 8 1 -

4 V. cholerae cholerae Ogawa 10 4 5 1

5 V. cholerae 0139 (от человека) 17 отрицательная реакция 8 7 2

6 V. cholerae 0139 (из воды) 18 12 6 -

7 V. cholerae не Ol/не 0139, в т. ч. V. cholerae 022 46 отрицательная реакция

8 V.cholerae RO 9

9 V. parahaemolyticus 11

10 E. coli 4

9 Aeromonas 11

10 Brucella spp. 4

11 Salmonella spp. 4

На следующем этапе работы были приготовлены агглютинирующие препараты. Их испытание на широком наборе штаммов показало отсутствие перекрестных реакций с представителями близкородственных и гетерологичных микроорганизмов, что свидетельствует о высокой специфичности агглютинирующих иммуноглобулинов (таблица 4). Полученные МКА Ol и 0139 укомплектовали в набор реагентов «Иммуноглобулины моноклональные диагностические сухие для серологической идентификации V. cholerae 01 и 0139 (in vitro) методом РА

«ИГ -V. скокгае 01/0139 — РА», на который оформили нормативную документацию.

Таблица 4 - Оценка специфичности набора «ИГ- V. сЬо1егае 01/0139 - РА»

№ Штаммы Количеств о штаммов Количество штаммов, агглютинирующихся МКА

Серия 1 Серия 2 Серия 3

МКА 01 МКА 0139 МКА 01 МКА 0139 МКА. 01 МКА 0139

1 V. cholerae 01 86 86 - 86 - 86 -

2 V. cholerae OI39 29 - 29 - 29 - 29

3 V.cholerae не OI /не 0139, в т.ч. V. cholerae 022 100 - - - - - -

4 V. cholerae RO 7 - - - - - -

5 V. parahaemolyticus 12 - - - - - -

6 E. coli 4 - - - - - -

7 Aeromonas 108 - - - - - -

8 Plesiomonas 7 - - - - - -

9 Comamonas 30 - - - - - -

В течение 2012 г. проведены технические и медицинские испытания наборов реагентов на базе Федерального государственного бюджетного учреждения здравоохранения «Головной центр гигиены и эпидемиологии Федерального медико-биологического агентства» и ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, в ходе которых отмечено полное соответствие свойств, заявленным в нормативно-технической документации. Результаты изучения специфичности флуоресцирующих и агглютинирующих моноклональных препаратов, фотоизображение которых представлено на рис. 6, явились основанием для подачи разработанных наборов реагентов на государственную регистрацию в качестве изделий медицинского назначения.

Рисунок 6 - Фотоизображение наборов реагентов: I - «Иг - V. сЬо1егае 01/0139 - РИФ»; 2 - «ИГ - У.сЬо1егае 01/0139 - РА»

Выводы

1. Получен и охарактеризован набор стабильных гибридом-продуцентов МКА, которые взаимодействуют с видоспецифическими эпитопами О-антигена V. с1го1егае 01 и 0139, представленными на клеточной поверхности с высокой частотой и в доступной для связывания форме. На гибридомы получены два патента №2425874 от 13.04.2010 и №2425875 от 07.06.2010.

2. С помощью набора МКА и иммунологических методов установлено, что эпитопы, узнаваемые гибридомами ГХ-Р8Ю1, ЗЕ4, ЗВ5, являются устойчивыми к различного рода воздействиям (щелочь, кислота, перекись водорода, хлороформ, формалин, трипсин, кипячение) и сохраняют свою структурную организацию.

3. Источником МКА могут быть как асцитические, так и культуральные жидкости, причем количество моноклональных иммуноглобулинов, выделенных из определенных объемов культуральной жидкости, является достаточным для приготовления диагностических препаратов, что исключает привлечение лабораторных животных.

4. Разработана биотехнологическая схема изготовления флуоресцирующих иммуноглобулинов, включающая в себя следующие этапы: получение и очистка МКА; конъюгация МКА с флуорохромом; удаление избытка ФИТЦ; лиофилизация. Результаты лабораторных испытаний ФИТЦ-МКА на широком наборе штаммов позволили укомплектовать их в диагностический набор реагентов «Иг - V. сИокгае 01/0139 - РИФ».

5. На основе МКА сконструирован диагностический набор «ИГ -V. сИо1егае 01/0139 - РА», который позволяет выявлять холерные вибрионы 01 и 0139 серогрупп в реакции слайд-агглютинации, обеспечивая отсутствие перекрестных реакций с близкородственными и гетерологичными микроорганизмами без дополнительной постановки ее развернутого варианта, что существенно сокращает время постановки реакции и экономические затраты.

6. Положительные реакции иммунофлуоресценции и агглютинации с холерными вибрионами 01 и 0139, выращенными в анаэробных условиях, в присутствии глицерина (10% и 15%) и жёлчи (1% и 5%), свидетельствуют о сохранности антигенных детерминант ЛПС и диагностических возможностях разработанных препаратов, пригодных для детекции V. сИо1егае 01 и 0139 не только после выделения чистой культуры, но и для обнаружения возбудителя холеры в материале от больных и из объектов окружающей среды.

7. Диагностическая ценность разработанных препаратов подтверждена техническими и медицинскими испытаниями, в ходе которых на разных сериях была показана высокая специфичность и отмечено полное соответствие физико-химических свойств заявленным в ТУ критериям

качества, на основании чего наборы реагентов «Иг - V. ско1егае 01/0139 — РИФ» и «ИГ - У.сИокгае 01/0139 - РА» направлены на государственную регистрацию в качестве изделий медицинского назначения. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

а) статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК

1. Алексеева, Л.П. Идентификация холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп с помощью моноклональных антител и реакции слайд-агглютинации / Л.П.Алексеева, В.Д. Кругликов, Н.Р. Телесманич, Ю.М. Ломов, В.В.Евдокимова, Е.П. Авдеева, О.Ф. Фатеева*, М.Э. Яговкин // Клиническая лабораторная диагностика.-2010.-№ 11.-С. 53 - 56.

2. Алексеева, Л.П. Сравнительная оценка методов дот-иммуноанализа и иммунохроматографии при выявлении холерных вибрионов 01 серогруппы / Л.П. Алексеева, Н.Р. Телесманич, Ю.М. Ломов, М.В. Храмов, В.Д.Кругликов, В.В. Агафонова, О.Ф. Фатеева*. Д.А. Чеботарёв, А.В. Керманов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. — 2010. — № 6. — С. 88—93.

3. Алексеева, Л.П. Получение и свойства холерных Инаба-специфических моноклональных антител / Л.П. Алексеева, В.Д. Кругликов, Ю.М. Ломов, В.В. Евдокимова, О.Ф. Фатеева*, М.Э. Яговкин // Эпидемиология и инфекционные болезни. — 2011. — № 1. — С. 28 —31.

4. Кретенчук, О.Ф. Оптимизация условий получения диагностических флуоресцирующих моноклональных иммуноглобулинов для идентификации холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп / О.Ф. Кретенчук, Л.П.Алексеева, О.В. Маркина, Г.А. Козлова, М.Э. Яговкин, В.Д. Кругликов, И.В.Архангельская // Клиническая лабораторная диагностика. - 2012. - № 12. - С. 32-34.

5. Алексеева, Л.П. Использование моноклональных пероксидазных конъюгатов для идентификации холерных вибрионов 01, 0139 в реакции дот-иммуноанализа / Л.П. Алексеева, Г.А. Козлова, О.В. Маркина, О.Ф.Кретенчук. М.Э. Яговкин, О.С. Бурша // Клиническая лабораторная диагностика. — 2013. —№3. — С.26 — 29.

б) тезисы научных конференций

6. Алексеева, Л.П. Идентификация холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп в реакции слайд-агглютинации с использованием моноклональных антител / Л.П. Алексеева, В.Д. Кругликов, В.В. Евдокимова, Е.П. Авдеева, О.Ф.Фатеева*. М.Э. Яговкин, Э.Г. Цедова // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». - Ростов-на-Дону, 2009. - вып. 22.-С.66-68.

7. Алексеева, Л.П. Моноклональные антитела к антигену холерных вибрионов эльтор серовара Инаба / Л.П. Алексеева, В.В. Евдокимова, О.Ф.Фатеева*. Д.А. Чеботарев, М.Э. Яговкин, О.А. Татаренко // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». — Ростов-на-Дону, 2009.-вып. 22.-С. 68-70.

8. Евдокимова, B.B. Оценка агглютинирующей способности холерных моноклональных иммуноглобулинов / В.В. Евдокимова, Л.П. Алексеева, Е.П.Авдеева, В.Д. Кругликов, O.A. Татаренко, О.Ф. Фатеева* // Матер, научно-практической конф. «Современные аспекты эпид. надзора и профилактики особо опасных природноочаговых болезней», посвящ. 75-летнему юбилею ФГУЗ Иркутского НИПЧИ Сибири и Д. Востока. - Иркутск,

2009.-С.105 - 106.

9. Алексеева, Л.П. Условия образования «ругозного» фенотипа вибрионов эльтор и его свойства / Л.П. Алексеева, В.Д. Кругликов, O.A. Татаренко, И.С.Шестиалтынова, H.H. Ускова, М.Э. Яговкин, О.Ф. Фатеева* // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». - Ростов-на-Дону,

2010. - вып. 23. - С. 68 - 70.

10. Фатеева, О.Ф.* Оценка специфичности флуоресцирующих моноклональных иммуноглобулинов для детекции холерных вибрионов Ol и 0139 серогрупп / О.Ф. Фатеева*. Л.П. Алексеева, Г.А. Кузьмина, М.ЭЛговкин, В.Д. Кругликов, И.В. Архангельская, Л.В. Григоренко // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». - Ростов-на-Дону,

2011.- вып. 24.-С. 180- 183.

11. Кузьмина, Г.А. Использование моноклональных пероксидазных конъюгатов для идентификации холерных вибрионов Ol, 0139 серогрупп в реакции дот-иммуноанализа / Г.А. Кузьмина, Л.П. Алексеева, О.Ф.Фатеева*. В.Д. Кругликов, М.Э. Яговкин, И.В. Архангельская, Л.В. Григоренко // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». — Ростов-на-Дону, 2011.-вып. 24.-С. 172- 174.

12. Кретенчук, О.Ф. Моноклональные диагностические препараты для идентификации холерных вибрионов Ol и 0139 серогрупп в реакциях слайд-агглютинации и прямой иммунофлуоресценции / О.Ф. Кретенчук. Л.П.Алексеева, О.В. Маркина, М.Э. Яговкин, О.С. Бурша // Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения: Матер. Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора. - Пермь, 2012. - Т.1. - С.334 - 338.

13. Григоренко, Л.В. Дифференциация водных штаммов V. cholerae поп Ol/ поп 0139 от холерных вибрионов Ol серогруппы / Л.В. Григоренко, В.Д.Кругликов, Н.Р. Телесманич, Л.П. Алексеева, И.В. Архангельская, М.И.Ежова, H.H. Ускова, И.С. Шестиалтынова, Д.А. Зубкова, О.Ф.Кретенчук. О.В. Маркина // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». - Ростов-на-Дону, 2012. - вып. 25. - С. 72 - 74.

14. Кругликов, В.Д. Изучение циркуляции холерных вибрионов в водоемах и стоках г. Ростова-на-Дону в период с 2008 по 2011 г. / В.Д. Кругликов, Н.Р.Телесманич, Ю.М. Ломов, А.Б. Мазрухо, М.И. Ежова, И.С.Шестиалтынова, Т.А. Кудрякова, Ю.Г. Киреев, Л.В. Григоренко,

И.В.Архангельская, O.A. Шалу, С.О. Водопьянов, A.C. Водопьянов, Д.И.Каминский, К.К. Рожков, H.H. Ускова, Н.Б. Непомнящая, Г.В. Качкина, Н.Е. Гаевская, Л.Д. Македонова, О.Ф. Кретенчук // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». - Ростов-на-Дону, 2012.- вып. 25.-С. 50-55.

15. Алексеева, Л.П. Оценка диагностической эффективности наборов реагентов для серологической идентификации V. cholerae Ol и 0139 методами РИФ и РА / Л.П. Алексеева, О.Ф. Кретенчук, О.В. Маркина, М.Э. Яговкин, В.Д. Кругликов, И.В. Архангельская, Н.Р. Телесманич // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». — Ростов-на-Дону, 2013, вып. 26. - С. 211 - 215.

16. Баранова, Е.В. Разработка иммунохроматографических тестов для выявления штаммов серогруппы 01 и токсинобразующих штаммов холерного вибриона / Е.В. Баранова, Г.Н. Федюкина, П.В. Соловьев, Н.В. Колосова, Л.В. Миронова, Е.С. Куликалова, Л.Я. Урбанович, П.Г. Свешников, Т.А. Ягудин, Е.В. Морозкина, М.В. Храмов, С.Ф. Бикетов, Л.П. Алексеева, О.Ф. Кретенчук // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». - Ростов-на-Дону, 2013, вып. 26. - С. 215 - 218.

17. Алексеева, Л.П. Видоспецифические моноклональные пероксидазные конъюгаты в варинтах «сэндвич»-ИФА для детекции противохолерных антител / Л.П. Алексеева, О.С. Бурша, О.Ф. Кретенчук, O.A. Татаренко, М.Э.Яговкин, Н.Р. Телесманич // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». - Ростов-на-Дону, 2013. - вып. 26. - С. 218 - 220.

в) патенты на изобретение:

18. Пат. 2425874 Российская Федерация, МПК C12N 5/18, С12Р 21/08. Штамм культивируемых гибридных клеток животных Mus. musculus L — продуцент моноклональных антител, специфичных к О-антигену холерных вибрионов Ol серогруппы / Алексеева Л.П., Евдокимова В.В., ФатееваО.Ф.*: заявитель и патентообладатель Федеральное государственное учреждение здравоохранения «Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. -№2010114795/10; заявл. 13.04.10; опубл. 10.08.11, Бюл. №22. - 7 с.

19. Пат. 2425875 Российская Федерация, МПК C12N 5/18, С12Р 21/08, G01N 33/569. Штамм культивируемых гибридных клеток животных Mus. musculus L - продуцент моноклональных антител, специфичных к ЛПС холерных вибрионов Ol39 серогруппы / Алексеева Л.П., Маркина О.В., Фатеева О.Ф.*, Яговкин М.Э.; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное учреждение здравоохранения «Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав

потребителей и благополучия человека. - № 2010123205/10; заявл. 07.06.10; опубл. 10.08.11, Бюл. № 22. - 7 с.

«*» - фамилия Фатеева О.Ф. изменена на Кретенчук О.Ф. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ АЖ — асцитическая жидкость БСА — бычий сывороточный альбумин

ГАТ - селективная среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин

ДАБ — диаминобензидин

ДИА — дот-иммуноферментный анализ

ДМСО — диметилсульфоксид

ИФА — иммуноферментный анализ

КББ — карбонат-бикарбонатный буфер

КЖ — культуральная жидкость

ЛПС - липополисахарид

МКА — моноклональные антитела

МФА - метод флуоресцирующих антител

НАФ — неполный адъювант Фрейнда

ОП — оптическая плотность

ПАФ - полный адъювант Фрейнда

ПЭГ — полиэтиленгликоль

РА — реакция агглютинации

РИФ — реакция иммунофлуоресценции

РПИФ — реакция прямой иммунофлуоресценции

РНИФ — реакция непрямой иммунофлуоресценции

РП — реакция преципитации

ТУ — технические условия

ФИТЦ — флуоресцеинизотиоцианат

ФСБ — фосфатно-солевой буфер

^ - штаммы со сниженной агглютинабельностью видовой 01 сывороткой

Благодарности

Приношу искреннюю благодарность научному руководителю кандидатской диссертации д.б.н., проф. Людмиле Павловне Алексеевой, оказавшей помощь на всех этапах работы, моим соавторам, принимавшим участие в проведении экспериментов.

КРЕТЕНЧУК ОКСАНА ФЕДОРОВНА

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 20.02.2014 Формат 60x84 1/16. Гарнитура Times New Roman. Бумага офсетная. Объем 1,0 уч. изд. л. Тираж ЮОэкз. Заказ №6795

Отпечатано в типографии ООО «ЛПИ» 344018, Ростовская область, г. Ростов-на-дону, ул. Островского 124

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кретенчук, Оксана Федоровна, Ставрополь

ФЕДЕРАЛЬНОЕ КАЗЁННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ «РОСТОВСКИЙ-НА-ДОНУ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОТИВОЧУМНЫЙ ИНСТИТУТ» ФЕДЕРАЛЬНОЙ СЛУЖБЫ ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА

РАЗРАБОТКА НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ 01, 0139 СЕРОГРУПП УСКОРЕННЫМИ МЕТОДАМИ

На правах рукописи

04201456529

КРЕТЕНЧУК ОКСАНА ФЕДОРОВНА

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация

на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Л.П. Алексеева

Ростов-на-Дону

2014 г.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЖ - асцитическая жидкость

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГАТ - селективная среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин

ДАБ - диаминобензидин

ДИА - дот-иммунофементный анализ

ДМСО - диметилсульфоксид

ИФА - иммуноферментный анализ

КББ - карбонат-бикарбонатный буфер

КЖ - культуральная жидкость

ЛПС - липополисахарид

МКА - моноклональные антитела

МФА - метод флуоресцирующих антител

НАФ - неполный адъювант Фрейнда

ОП - оптическая плотность

ПАФ - полный адъювант Фрейнда

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РА - реакция агглютинации

РИФ - реакция иммунофлуоресценции

РПИФ - реакция прямой иммунофлуоресценции

РНИФ - реакция непрямой иммунофлуоресценции

РП - реакция преципитации

ТУ - технические условия

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

I - штаммы со сниженной агглютинабельностью видовой 01 сывороткой

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................14

1.1. Гибридомная технология получения МКА........................................................14

1.2. Серологические методы исследования в лабораторной диагностике холеры..................................................................................................................29

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..............................................................................40

2.1. Лабораторные животные......................................................................................................40

2.2. Бактериальные штаммы........................................................................................................40

2.3. Клеточные линии позвоночных....................................................................................40

2.4. Питательные среды и реактивы....................................................................................41

2.5. Гибридизация клеток..................................................................................................................42

2.6. Клонирование гибридом......................................................................................................44

2.7. Культивирование гибридом in vitro и in vivo......................................................45

2.8. Криоконсервирование гибридом............................................................................................46

2.9. Подъем из жидкого азота гибридом..........................................................................46

2.10. Очистка специфических иммуноглобулинов....................................................46

2.11. Маркировка иммуноглобулинов ФИТЦ................................................................47

2.12. Метод иммунофлуоресценции......................................................................................47

2.13. Иммуноферментные методы............................................................................................49

2.14. Иммуноблоттинг........................................................................................................................50

2.15. Иммунодиффузия в геле по Оухтерлони.......................,..............50

2.16. Реакция агглютинации..........................................................................................................51

2.17 Методы статистической обработки результатов..........................................52

ГЛАВА 3. ГИБРИДОМЫ-ПРОДУЦЕНТЫ МКА К АНТИГЕНАМ

V. CHOLERAE OI И 0139................................................................................................................53

3.1. Подъем из азота и оптимизация условий культивирования гибридом-продуцентов МКА, направленных к поверхностным эпитопам V. cholerae 0139................................................................................................53

3.2. Получение и выведение в массовую культуру гибридом, продуцирующих видоспецифические МКА OI..............................................56

3.3. Оценка продукции специфических иммуноглобулинов гибридомами в условиях in vitro............................................................................................59

3.4. Получение и накопление в препаративных количествах МКА в виде АЖ..............................................................................................................................................62

3.5. Выделение и очистка специфических иммуноглобулинов различными методами............................................................................................................65

ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА МКА, НАПРАВЛЕННЫХ К ВИДОСПЕЦИФИЧЕСКИМ ЭПИТОПАМ V. CHOLERAE OI И

0139........................................................................................................................................................................67

4.1. Определение специфичности и активности МКА из АЖ и КЖ в различных серологических реакциях........................................................................67

4.2. Определение класса специфических иммуноглобулинов......................72

4.3. Оценка сохранности О-антигенных детерминант холерных вибрионов при различных способах инактивации................... 73

4.4. Эпитопная направленность МКА OI и 0139.......................... 77

ГЛАВА 5. ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ДИАГНОСТИКУМЫ НА ОСНОВЕ МКА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ OI И 0139 СЕРОГРУПП........................................................................ 79

5.1. Оптимизация условий получения видоспецифических флуоресцирующих моноклональных препаратов для идентификации V. cholerae OI и 0139....................................... 79

5.2. Наработка экспериментальных серий флуоресцирующих препаратов для испытания на широком наборе штаммов гомологичных и гетерологичных микроорганизмов и подготовка нормативно-технических документов.................. 82

5.3. Лиофилизация флуоресцирующих МКА............................... 87

5.4. Оценка серологической активности флуоресцирующих препаратов после лиофилизации и в процессе хранения............ 88

ГЛАВА 6. ПРИМЕНЕНИЕ АГГЛЮТИНИРУЮЩИХ МКА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ OI И 0139 СЕРОГРУПП В РЕАКЦИИ СЛАЙД-АГГЛЮТИНАЦИИ.............. 91

6.1. Исследование агглютинабельности MICA, выделенных из АЖ и ЮК, в реакции слайд-агглютинации.................................... 91

6.2. Получение экспериментальных серий диагностических агглютинирующих МКА и их испытание на широком наборе штаммов....................................................................... 94

6.3 Стабильность лиофилизированных диагностических

агглютинирующих MICA при хранении................................. 98

6.4. Оценка возможности применения диагностических наборов для выявления холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп,

подвергнутых воздействию различных факторов.................... 99

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................... 103

ВЫВОДЫ.............................................................................. 113

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................... 115

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Первое десятилетие XXI века отмечено крупными эпидемиями и вспышками холеры в странах Африки и Азии, а также Северной Америки с заносами инфекции из эндемичных очагов практически ежегодно на все континенты, с тенденцией к росту мировой заболеваемости, что определяет неблагоприятный прогноз и для России [77]. Поэтому в нашей стране постоянно проводятся мероприятия, направленные на предупреждение заноса и распространения этого особо опасного заболевания. Одной из важнейших составных частей эпидемиологического надзора за холерой является своевременная диагностика, эффективность которой зависит от наличия высокочувствительных и специфичных препаратов для серологического анализа. Как отмечалось на 64-ой сессии Всемирной ассамблеи здравоохранения, трудность в борьбе с холерой вызвана недостаточным количеством диагностических экспресс-тестов для выявления холерных вибрионов и своевременного принятия мер, что определяет необходимость дальнейших научных исследований по разработке таких тестов.

В последние годы активно развиваются инновационные технологии по созданию рекомбинантных белков, в частности антител, получаемых с помощью молекулярно-генетических манипуляций. Благодаря разработке гибридомной технологии широкое распространение в лабораторной диагностике получили и моноклональные антитела (МКА). Уже первые МКА продемонстрировали уникальные преимущества перед поликлональными сыворотками: высокая специфичность и активность, стандартность, стабильность, возможность получения в неограниченном количестве. Очевидно, что МКА в силу своей уникальной направленности к индивидуальным антигенным детерминантам позволяют разработать на их основе препараты для серологической идентификации и дифференциации холерных вибрионов, отвечающие современным требованиям. Процесс замены поликлональных антител в диагностических наборах на моноклональные начался еще в начале 80-х годов и активно продолжается в настоящее время в направлении создания новых

препаратов на основе MICA [37]. Зарубежные публикации, касающиеся использования МКА в серодиагностике холеры, появились еще в 1982 году, то есть намного раньше, чем отечественные. В. Gustafsson et al. получили МКА к коровой области ЛПС V. cholerae OI, которые выявляли в реакции слайд-агглютинации антигенную детерминанту, общую для всех представителей вида V. cholerae [132]. Также этой группе авторов удалось получить МКА к А-, В- и С-антигенам V. cholerae 01, на основе которых были приготовлены флуоресцирующие препараты для экспресс-диагностики холерных вибрионов OI. Позже другие зарубежные авторы сконструировали на основе МКА высокоэффективные тест-системы: для слайд-агглютинации [120], набор CholeraeScreen для реакции коагглютинации [125], дот-блот-ИФА [152], флуоресцирующие иммуноглобулины [123, 134]. J.A. Hasan с соавторами в 1994 г. создали набор для выявления V. cholerae 0139, включающий реагенты для реакции коагглютинации и прямой иммунофлуоресценции [134]. Несомненно, такие препараты эффективны и полезны как в случае ранней диагностики холеры, так и на различных этапах исследования. В России работы по получению и созданию набора стабильных гибридом-продуцентов МКА к антигенным детерминантам возбудителей особо опасных инфекций целенаправленно были начаты в 90-е годы прошлого столетия. В отечественной практике сведения о холерных моноклональных препаратах, имеющих диагностическую значимость, появились в 1988 году в публикациях Л.П. Алексеевой с соавторами [5, 8, 28, 30]. В диссертации О.С. Бурлаковой (1993 г.) показана возможность использования МКА к О-антигену V. cholerae 01 для конструирования коагглютинационных и иммунофлуоресцентных диагностикумов [29]. Для экспресс-диагностики токсигенных штаммов V. cholerae З.Л. Девдариани с соавторами в 1999 г. предложили использовать МКА в дот-иммуноанализе [38]. В работе Н.Е. Терешкиной (2004 г.) описано создание на основе разноэпитопных МКА и поликлональных антител к ЛПС V. cholerae 0139 экспериментальных диагностических иммуноферментных тест-систем, предназначенных для детекции возбудителя холеры независимо от наличия у него капсулы [102]. С 2000 г. в

Государственном Научном Центре ФГУП «ГосНИИ биологического приборостроения» (г. Москва) ведутся работы в области создания отечественных иммунохроматографических тест-систем, чувствительность и специфичность которых повышается, если используются МКА. В ФГУН ГНЦ ПМБ была оценена возможность использования в иммунохроматографических (ИХ) тест-системах МКА, продуцируемых гибридомами, полученными в Ростовском противочумном институте. Проведенные экспериментальные исследования показали, что антитела сохраняют свою иммунохимическую активность после конъюгирования с коллоидным золотом, поэтому на их основе были разработаны ИХ-полоски [11]. Результаты испытания полученных ИХ тест-систем для выявления V. cholerae 01 показали, что их применение позволяет выявить холерные вибрионы 01 серогруппы, если их концентрация в исследуемых пробах будет не ниже

о

10 м.к./мл. В случае низкоагглютинабельных штаммов содержание вибрионов в пробах должно быть не менее 109 м.к./мл. Е.В. Баранова с соавторами (2010 г.) сконструировали на основе МКА, высокоспецифических к холерному токсину, предназначенный для обнаружения токсигенных штаммов V. cholerae диагностикум «Тест-полоска V. cholerae tox+» [22]. Однако следует отметить, что ИХ тест-полоски не лишены недостатков: сравнительно низкая чувствительность

О Q

порядка 10 - 10 м.к./мл зависит от качества используемых антител и концентрации антигена в биоматериале. Экономически затратным является и производство ИХ полосок, так как их себестоимость в итоге получается достаточно высокой. Из современных технологий обращает на себя внимание технология биомикрочипов. Так, в работе Е.С. Петровой с соавторами [80] описано создание тест-системы на основе специфичных к холерному токсину МКА в формате микрочипа и в планшетном варианте иммуноферментного анализа. Предел обнаружения токсина достигает 0,2 нг/мл в планшетном формате ИФА и 0,44 нг/мл в формате микрочипа. Присутствие в пробах с холерным токсином молока, мясного бульона и воды из открытого водоема не снижает чувствительность методов. Применение современной технологии биомикрочипов дает точные результаты в сжатые сроки. Однако сложная технология

приготовления наряду с высокой себестоимостью анализа ограничивает возможность их использования практическими лабораториями, которым требуются высокочувствительные, специфичные и простые экспресс-методы. На сегодняшний день в лабораторной диагностике холеры согласно МУК 4.2.2870-11 используются лошадиные агглютинирующие 01-сыворотки, иммуноглобулины 01 флуоресцирующие и кроличья агглютинирующая 0139-сыворотка производства института «Микроб». Однако существующие препараты не отвечают в полной мере современным требованиям, так как обладают рядом недостатков: разнородность и гетерогенность популяций антител, низкие титры специфических иммуноглобулинов, наличие перекрестных реакций. Применение агглютинирующих МКА позволит исключить перекрестные реакции с представителями холерных вибрионов не 01/не 0139, среди которых увеличивается число штаммов, агглютинирующихся холерной сывороткой 01 в низком титре [70]. Проблема повышения качества диагностических препаратов и, как следствие, повышение достоверности лабораторной диагностики холеры была и остаётся в центре внимания специалистов. В институте «Микроб» в последние годы разработан новый диагностический препарат для выявления холерных вибрионов 0139 с помощью прямого метода иммунофлуоресценции [13, 14]. В технологии предусмотрено получение кроличьей сыворотки путем иммунизации убитыми клетками вибрионов и для удаления неспецифических антител необходима неоднократная адсорбция близкородственными микроорганизмами, что сопровождается значительными потерями специфических иммуноглобулинов и соответственно отражается на качестве препарата. Несмотря на неоднократную адсорбцию, не удается избавиться от антител, обеспечивающих перекрестную активность с V. ско1егае 022. Одним из перспективных направлений является создание на основе МКА флуоресцирующих и агглютинирующих препаратов для выявления V. ско1егае 01 и 0139, так как в ряду других иммунодиагностических тестов, предназначенных для ранней диагностики холеры, эти методы обладают рядом преимуществ: экспрессность анализа и простота исполнения.

В связи с вышеизложенным, исследования, направленные на совершенствование и разработку новых холерных иммунодиагностикумов, не утратили своей актуальности и практической значимости.

Цель исследования - совершенствование лабораторной диагностики холеры путем конструирования диагностических препаратов на основе МКА для идентификации холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп в реакциях прямой иммунофлуоресценции и слайд-агглютинации.

Задачи исследования:

1. Расширить спектр имеющихся гибридом за счет получения новых, продуцирующих МКА к видоспецифическим эпитопам холерных вибрионов 01 серогруппы, охарактеризовать их изотип, направленность, аффинность, наличие перекрестной активности внутри вида, рода.

2. Получить в препаративных количествах видоспецифические МКА, провести их очистку с помощью различных методов, оценить их специфическую активность в реакциях непрямой иммунофлуоресценции, слайд-агглютинации, преципитации и иммуноферментном анализе.

3. Разработать на основе охарактеризованных МКА биотехнологическую схему получения флуоресцирующих моноклональных иммуноглобулинов для выявления V. ско1егае 01 и 0139 в реакции прямой иммунофлуоресценции, наработать экспериментальные серии препаратов в лиофилизированном виде.

4. Изучить агглютинирующие свойства видоспецифических МКА 01, МКА 0139, выделенных из культуральных и асцитических жидкостей, в реакции слайд-агглютинации на наборе штаммов гомологичных и гетерологичных микроорганизмов, отобрать диагностически значимые агглютинирующие МКА.

5. Провести лабораторные испытания экспериментальных серий видоспецифических флуоресцирующих и агглютинирующих МКА 01, МКА 0139, оформить нормативную документацию для их государственной регистрации.

Научная новизна. Набор видоспецифических гибридом, которыми располага�