Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Лизогения холерных и парагемолитических вибрионов и её практическое значение
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Лизогения холерных и парагемолитических вибрионов и её практическое значение"
с я
2 2 АПР Ш>
На правах рукописи
КУДРЯКОВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА
ЛНЗОГЕШИ ХОЛЕРНЫХ Я ПАРАГЕМ0и11ШРЯШХ ВШРНОНОВ П ЕЁ-ПРАШЧЕСКОЕ ЗНАЧЕШШ
03.00.07 - гучсрсбиолсгия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
- г -
Работа выполнена в Ростовском-на-Дону государственном научно-исследовательском протизочумном институте.
Научные консультанты; Заслуженный деятель науки РФ,
доктор медицинских наук, . профессор Ломов С. М. доктор медицинских наук, профессор Остроумова Н. М.
Официальные оппоненты: член-корреспондент РАЕК,
доктор биологических наук, профессор Габрилович И. М. доктор медицинских наук, профессор Ведьмина Е. к. доктор биологических наук,. Старший научный сотрудник Андрусйнко И. Т.
Ведущая организация - Ставропольский научно-исследовательский
противочумный институт Кавказа'и Закавказья
Защита состоится 1996 г. в ¿<2 часов на заседании
диссертационного совета Д 084.53.01 при Ростовском государственном медицинском университете (344022. Ростов-на-Дону, Нахиче-ванский пер., 29).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского государственного медицинского университета.
Автореферат разослан " ^" (ИърлиЛ- 1ЭС6 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доцент
Н.Я.Корганов
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Большой фактический материал, накопленный в последние три десятилетия, свидетельствует о широком заспространении патогенных для человека вибрионов. Наиболее зна-1ИМЫМИ в патологии человека являются холерные и парагемолитичес-сие вибрионы. На фоне седьмой пандемии холеры ежегодно во всех :транах мира, особенно в Юзном, Юго-Восточном и Юго-Западном резонах с жарким и умеренным климатом регистрируются спорадичес-сие или групповые заболевания, обусловленные холерными вибриона-ш не 01 группы и парагемолитическиии вибрионами. Исходя из это-'о. актуальна разработка дополнительных методов диагностики этих »аболеваний, в том числе основанных на применении фагов (Адамов LK. и соавт.. 1971, 1974; Быстрый Н.Ф. и соавт., 1971,. 1974. [981. 1984; Дрожевкина М.С. и соавт., 1970, 1973, 1974, 1979, 980, 1984; Остроумова Н.М. и соавт., 1971, 1972. 1978, 1980, .983, 1985, 1986, 1988. 1993; Сомова А.Г. и соавт., 1968, 1974; fukerjee S. étal., 1957, 1959, 1960-1962, 1984).
Особого внимания заслуживают умеренные фаги- холерных вибри- . >нов, продуцентами которых являются лизогенные штаммы, выделяете от больных людей и объектов внешней среды. Установлено, что гвление лизогении тесно связано с вирулентностью холерных вибри->нов. Лизогенные свойства сделали бактериальные клетки чрезвы-гайно удобным тест-объектом для решения многих актуальных задач ¡иологии и медицины (Bhaskaran К., 1959; Groman И., Eaton M., 955; Oguma К. et al., 1973; Strockbine N.. et al.. 1986).
Генетические исследования, имеющие фундаментальное значе-[ие, были выполнены благодаря использованию системы фаг-бакте->ия. Например, определение локализации генов и создание генети-[еских карт микроорганизмов, а такге других общих и частных воп-гасов генетики (Гончарова Н.С. и соавт., 1972; Gerdes J., Roraig I.. 1975; Jacob F., Honod J., 1961; Ohashi M. et al., 1981; Ta-liguchl H. et al., 1984; Weston L. et al., 1973).
Однако до настоящего времени не выяснены все механизмы ин-•имного взаимоотношения умеренного холерного фага и клетки-хозя-иа. В дальнейшей разработке нуадаются вопросы, связанные с вы-
делением новых видоспецкфическия фагов. Кало изучен вопрос i использовании фагов как показателей контаминации водоеиав сточных вод патогеннши для человека вибрионами. В литерату имеются сведения о роли фагоз в изменчивости вибрионов (Гшчар ва Н.С. и соавт., 1968; Еременко Г.А. и соаат., 1988; Царе С.А., Остроумова И.И., 1976: Ogg J. et al., 1981; Т1шга Т. i al., 1980). Однако недостаточно изучены иногиа вопросы лизогш нации и транедукцин. Нам не удалось обнарутать работы, посвяца ныз лизогении Л-фэру колернах Бк5р;инов (Лшш D.lt и coairr 1977; Прозоровский C.B. к соавт.. 1976). Сохраняет актуальное проблема использования специфических фатов дли диЗфгрвдциац разнообразной группы холерных вибрионов не 01 (Агапова 3. LL соавт., 1982; Голдовский Г. 11. и соазт., 1984; Зинина 0. С. и о авт.. 1988; Остроумова H.IL и соавт., 1980, 1933» 1985. 193 Хайтозич А.Б., Голг-созский Г. П., 1924). В связи с зтаа взобходк; дальнейшее изучение кх лизогеннах снстеи и свойств продуцируем фагов. Учитывая зпидеинчзскую опасность холершх вкбр.ззюз ном 0139 серогруппы (Rars^utrthy T. et al.. 1993; Шсайа T. et al, 1993), обнаружение отэффгчепей чэтки в ввдз леогенностн i фагу опраделенкого серагагического варианта вагно длл разрабо-п кетодоз их фагоднагностики.
В ряде работ представлена сведзшгя о фатах V. albansi, Biscre с теп необходааз разрабопса индикаторной систем и usîi доз еэдалекзш Caros с последу-срсд шучении бааязгстесгс свойств (Ада^эв А.К. и соавт.,i974; Воронежская Я. Г. tí COCIi?. 1884; ГальцеваГ.В. к соавт., 1Ш, 1995; Ерсзльеза 3.В., 1921 Лкбшган Л.Е., ГальцеваГ.В.. 1S35; Хайтозич А.Б. и соавт. 1982).
Перспективные направление!! в идентификации пграгетлигичэ! ких вибрионов, типичных представителей рода Vibrio (Либага А.Е. и соавт., 1974, 1877. 1994; Еккулов В.А. и соавт., 198! Addiss D. et al.. 1989; Fujino et al., 1951), является разрабзп препарата диагностического фага (ГолкЬзский Г. ti. и соавт.. 3S3-Либинзон А.Е. и соавт.,1984, 1995; rJakanisM H. et al., 1986] До настоящего времени не предложена cxeisa фаготипировгння V. р; ralîaesolyticus и V.alginolyticus, так кгк отсутствуй? типирущ* фаги. СучЭствущая при Центре патогенных вибрионов коллекц! культур нуждается в дополнении соответствущиии фагами. ото дм
.тует необходимость разработки усовершенствованных ыетодов их сохранения - кркоконсервации и лиофилизации.
Изучение перечисленных вопросов позволит разработать новь® и уссверпенствовать существующие метода лабораторной диагностики холеры, острых кигечнах инфекций, обусловленных холерными вибрионами не 01 группы, светящимися и парагемотггическими вибрионами.
Цель и задачи исследования. Основной цельп исследования явилась характеристика лизогении холерных вибрионов 01 н не 0! групп, светящихся, парагаюлитических и алгинолитических вибрионов и усоверпгнствооание методов их фагодиагностики.
Для достижения этой цели предстояло решить следуема задачи:
- изучить распространение лизогении среди холерных вибрионов 01 и не 01 групп, светящихся, парагешлитических и алгиншштнчес-ких вибрионов, выделенных в разные годы в насей стране и за рубеяои;
- выделить вибриофаги и охарактеризовать их биологические свойства;
- исследовать возмояность профаготяпирования холерных, светягди-ся и парагеиолитических вибрионов;
- ссуцествить дифференциации vct+ и vet" штампов холерных вибрионов по типу переносимых умеренных фагов;
- выявить участие фагов в изменении биологических свойств вибрионов;
- предлоаить систему тест-культур для идентификации холерных фагов, выделяемых из объектов внетней среды;
- разработать способ дифференциации вирулентных и авирулентных холерных вибрионов эльтор с использованием фаговых методов;
- усовершенствовать фагодиагностику V. choleras поп 01 и V. alben-sis;
- сконструировать препарат фагов для идентификации и дифферен-' циации парагемолитических вибрионов;
- разработать способ криокдасервирования и усовершенствовать способ лиофилизации фагов холерных вибрионов 01 н не 01 серо-
'групп.
Научная новизна.
1. Установлены особенности ¿шатенки холерных вибрионов 01 и на 01 серогрупп. светящихся и галофиьша вибрионов - V.рагаЬгэ-Eolyticus и V. alginolytiats. .Выявлены уиеренгаге фаги со строгой антигенной специфичности).
2. Показано, что вирулентна апидааческке вгтш холершх вибрионов , выделенное в очагах холеры, продуцирует укереюе® фаги второго серологического типа, третьего инмунотипа. Лнзаге-ния холзршх вкбр;:шоз по Caray XI и XII серотипов является маркером неэпидемических (vcf} нтамиэв.
8. первые установлены VIII и XII иьиунотипы холерных фагов, продуцируешя усГ-пташаш холерных вибрионов зльтор.
í. Показано приобретение признака гшгментообразовання и ауксот-рофности в результате лизагенизации н возможность трансдукци-онной передачи генов his н arg.
5. Впервые обнаружена лизагения V. cholerae 037, 039, 042 серогрупп и показано, что внбржяш кахяого из них обладает специфический профагом. Предложена система тэст-кул>тур для определения серологической принадлежности микроорганизмов вида V.choleras методом профаготипирования.
6. Впервые установлено, что холерные вибрионы новой эпидемически значимой 0139 серогруппы, продуцирует фаги, характерше для эпидемических втгммов холерных вибрионов 01 серогруппы.
7. Создана система тест-культур, лоаволящая идентифицировать обнаруживаемые во внеяней среде фаги как гтасззатши загрязнения хопердаш вибрионами М серагрупга, с определением их эпидемической значимости.
8. Впервые обнаружена лизагения V. al bens is и разработан способ идентификации светящихся вибрионов по типу переносима фагов и чувствительности к ним.
9. Сконструирован диагностический поливалентный фаг галофкльньос вибрионов и составлен набор фагов для ткпирования парагемоли-тических и алгинолнтических вибрионов.
10. Создана коллекция охарактерюоваюшх фагов V. cbolerae 01 и не 01 групп, V.albensis, V.parahaeaolyticus и V.algínolyti-cus, разработан способ кркоконсервнровашя и уооверЕЗнствоваи
' режим лиофилизации.
Теоретическое и практическое значение работы.
1. С попотев лизогенных тест-систеи ггадтверадено, что холерные вибрионы 01, не 01 серогрупп и светящиеся вибрисны шгут быть вкличены в один вид V. choleras, а парагемолитичесиие и алги-нолитические вибрионы в вид V. parahaesolyticus.
2. Псказаш, что зпидешгсескне птахкы холерных вибрионов лизо-генны по фагам второго серологического типа, III инмунотипа. 'Лизогения авирулентных 'втаилов альтер вибрионов, выделенных
из внешней среда, обусловлена разными тотагги прсфзгов. Впервые установлены VIII и XII т:иунотЕПы фагов.
3. Предложены диагностачессие £аги для лденпфзсщии холерных вибрионов 037, 039, 012 серогрупп.
4. Пр5ЛЛ0-ген '"ЗТОД !1Д€!Ш;*!1К£1П!Н Ч. albsnsls по нсаггальстзу Ссгоз и чувстситсгаязетн к icri.
5. Рг-ргботгна технолог: п пр'-тотезтгзг-гп препарата Сага длп в'-У . ^ергнциацил vet* и vet" уя/ярка» вкбргюксэ ольтор.
3. Л^раторк0-з$сспер:!1зггальк!э cep;nt /н^юспяйс-зсго <$гга га-ш:бр::окзз я тотгруп:-«? п?лзге1алчт?!Ч5с<!)х <з>гсз ps-келнлоггии к пркгги&ягз в прастачсета ¿гбератсргях, ппего-•• л^™;;: .'гсстадокзягя на ~:брг:оОлору.
7. Пргдлегега nprístru получйая пол слипкизи Сггоз гггзиегэеп rrrc!-.sm янтарных зибргзягсэ, ускоразяЯ л:есг£н-
. птаатзв, а тгчгэ еьглзлгдал Сггоз, " ' ¡гость пссгзлсззсЯ.
8. Рс:а:г.2нлс2г.на exea прс^гопзтгфозгнга ш^булитапя гоягра и .лруги» патогегеап прэдетгпггалзй вида V. citoleras с слрэделз-ьтлвп сершюгичеснвЯг срязддегэяэсти пзрйжеазк Kfwcmpriswsc-KÜS yi:epCH52áX фзгоз.
9. Созлгн кр::сбгягс золэркья и парггеиол?гп!чеаси $згоз для c6sc-печ£!-п!я научко-прс'спгчоаспх иссладсзш-шй по прсблз^э "Холера • и патогенные вибрионы".
Депонирована в коллекции цугеп пшуз культур шетгггута "Гизсрсб" 29 пта^ззв V. citoleras и V. paraftaerslyticus, харгктеркс-тика которых приведена а диссертации. Получета 24 удсстоверешм на рационализаторские предлгЕяия, касагг;*есп получения и прг^э-нения фатов. Результаты исследований, прадстазлегшкэ в диссертации использованы при составлении 10-ти 122тодичгских реншенда-ций, утверзденных Учена! Советса Ростовсксго-ка-Дону протквочум-
ного института. Составлены три инструкции по изготовлению, контролю и применению: холерного фага для идентификации авирулентных штаммов, холерных вибрионов; диагностических парагемолитических фагов для идентификации.и типирования V.parahaemolyticus и V.al-ginolyticus (Утверждены Ученый Советом Ростовского-на-Дону противочумного института Пр. N17 от 30.12.92г. и Пр. N9 от 23.08.ь'5 г.).Фаги внедрены в Одесской , Крымской, Причерноморской ПЧС.
Способ лиофилизации холерных фагоз внедрен в Рос. НИПЧИ "Микроб" (акт о внедрении от 29.05.90 г.) ив Ростовском НИПЧИ (акт о внедрении от 11.03.91 г.).
Разработанные методы применяются при выполнении научно-исследовательских и производственных работ в Ростовском-на-Дону, Иркутском и Казахском противочумных институтах и в Крымской, Одесской, Причерноморской ПЧС.
Результаты исследований нашли отражение в 14 авторских свидетельствах на изобретения: №1578189 от 15.03.1990г.; №1533331 от 8.08.1989г.; №704180 от 21.03.1979г.; №940520 от 23.02.1982г.; №982345 от 16.08.1992г.; ' №1030450 от 22.03.1983.; №1296578 от 5.11.1986г.; №1623205 от 22.09.1990г.; №1387413 от 8.12.1987г.; №1391090 от 22.12.1987г.; №1405298 от 22.02.1988г; №1307848 от 3.01.1987г.; №1636446 от 2. И. 1990г.; №1778188 от 1.08.1992г.
Материалы по фаговш методам лабораторной диагностики заболеваний.' обусловленных V.cholerae 01 и не 01 групп, V. albensis, V. paraHaecolyticus и V. alginolyticus представлены на курсах специализации и усовершенствования врачей бактериологов по особо опасным инфекциям Ростовского НИПЧИ (1993 - 1995 гг.).
Положения, выносимые на защиту.
1. Специфичность лизогенных систем V. choleras 01 и не 01 групп, светящихся и парагемолитических вибрионов по типу переносимого фага.
2. Лизогенность эпидемических вибрионов эльтор по фагазл III именного типа II серологического типа и неэпидемических вибрионов по фагам XI серотипа XII иммунного типа, XII серотипа X иммунного типа. ;
3. Диагностическая система тест-культур, метод и схема ее применения для определения серологической принадлежности иикроор-
ганизшв вида У.сйо1егае по чувствительности систам тест-культур, к умеренных фагам.
4. Тест-система для идентификации V. а1Ьепз1з.
5. Диагностический поливалентный фаг для идентификации парагеш-литкческнх и алгаюдатнческих вибрионов.
в. Ткпирущие фаги парагешлитических вибрионов и схема фаготи-пирования парагенолмтнческнх и алгинолитичеашх вибрионов.
Апробация работа.
Материал* диссертации долояены и представлены на Международной симпозиуме по ЕпЬегоЬаЛег 1 асеае, Чехословакия, г.Коаица, 1975 г.; VI съезде Всесоюзного шжробиологическпго общества, Рига, 1980 г.; VI рабочем совещании гю программе "Плазмида", Пущиго-на-Оке, 1981
г.: Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы ншунолопш, аллергологии и молекулярной биологии", Краснодар, 1983 г. г Всесоюзной симпозиуме, посвяценном 60-летш» Тбилисского НИИВС,Тбилиси, 1984г.; Всесованой научней ионфереярм по актуальным вопросам молекулярной биологии, генетики и иммунологии возбудителей особо опасна инфекций. Ростов-на-Дону. 1984 г.; Всесованой конференции "Вирусы микроорганизмов и растений", г. Ташент, 1986 г.; Областной конференции "Проблемы медицинской и санитарной мм<робиологии города". Рос-гов-на-Дону, 1987 г.; Всесоюзном семинаре "Современные проблем* ан-гибиотикорезжггентности". г. Москва. 1988 г.; Всесованой конференции "Актуальные вопросы микробиологии, лабораторной диагностики и профилактики холеры". Ростов-на-Дону, 1988 г.: Проблемной комиссии по «элекулярному зондировании "Бактериальные плаамида". г.Нальадк. 19%) г.; йевгосударственнои совещании по проблеме "Холера", г.Киме-*ев, 1991 г.; VI Меэдународаой конференции "Успехи современной кри-^тштии", Украина, г. Харшоз, 1992г.; Всерссшйской научной кон-^ергкцзи та проблей» "Холера", г. Ростоз-ка-^ону. 1552т; на ггеедз-жн РпссгЛзг-зй ПробягжоЯ ьзгл^сскттпо прсблггэ "Холера" при голоз-ял по пробяаэ РсстсвазЕма-Лпну кззгчж-шззадаа^ельош проти-ючуикса «кскяуте в 3933 г.; на научных шкференцмях РосМйТЧП "йас-!сбй, Ростозсашго-на-,Лону Протгютгдзюга ¡«статута, Всэсззгкого ?шрсбколоп!чеасого общества, ¡жагосударггтекнсГ! кзучда-праэтичес-ли конференции, пссзяэрнкой ЮО-летга стфнтая чуггз. г. Стаярогнь-а, 594 г.; Всероссийской научно-практической конференции, пссшщэжсй опросам разработки ьжрсбиошгнчаския питательшп сред н тест-снс-
тем. г. Махачкала, 1995 г.; Российской научно-практической конфер цни по проблеме "Холера", г. Ростов-на-Дону, 1995 г.
Представленные в диссертации tsarepaam исследований являя результатов работы по 10-ти планово теваа, выполнявэшкя в pais плана №SP по проблеме "Холера" (1975-1995 гг.): Я гос.регксграци 01.84.0004813; 016839 01.90.0; 017043 01.87.0; 81042108; 01.8 017044 ; 74013892; 75025455 ; 79037000. 031329 01.89.0; 031 01.89.0.
Публикации. По теиз диссертации опубликована 89 работ, в числе одна шнография (в соавторстве). 1.4 авторских свидетельств изобретения.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из вве ния, пяти глав, вклзчагцих данные литературы, описание штериала методов. результаты собственных экспериментов и их обсуждение, такте общего заключения и выводов. Текст работа изложен на страшщах ыашнописного текста, содершт 123 таблица и 23 рисуи Библиографический указатель состоит из 229 источников отечествен и 185 зарубежкой литературы.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Иатериаги и «етоды.
Бактериальные штааа. В работе использовал:! 2311 типичных атаАох® холерных вибрионов 01 группы бновара el tor. 53 - бйоварг choleras, сероваров Огава, Кнаба; Л-фор;к (9 щитюа): атипичны? еташа (74 отзш) со сниженной агглвткнабелькостьв, в Р-, РО-форае, 0"-варианты; мутанты (9 итаьаюз). полученные в Р1ЭД; экспериментально при воздействии нитрозоиетшшчааины (НМЭД, нитрозогуанидина (НГ).
Для выявления фагов применены стрептшицишустойчивые i стрштомицинозависише штамш (3 втамма). Исследовано 5030 клоповых субкультур штаиуэв классических и зльтор вибрионов (4 штамма).
В качестве источников умеренных фагов и для контроля разра-
- и -
батываемых методов были использованы холерные вибрионы не 0J группы (301 штамм), светящиеся вибрионы (37 штаммов), парагемо-литические вибрионы (354 штамма), из которых 124 серотипирован-нкх по 0- и К-антигену, алгинолитические вибрионы (80 штаммов), представители семейства Vibrionaceae, Pseudomonadaceae. и Entero-bacteriaceae (263 штамма).
Штаммы бактерий были получены из музейных и авторских коллекций Ростовского-на-Дону, Саратовского, Ставропольского, Иркутского, Казахского НИПЧИ, Крымской, Одесской, Причерноморской противочумных станций. Часть штаммов микроорганизмов доставлены из зарубежных коллекций культур Франции," Болгарии, Вьетнама, Швеции, Индии, Японии.
Фаги. Объектами исследования явились 263 фага, из которых 230 выделены нами из лизогенных штаммов, в том числе холерных вибрионов 01 группы - 173 фага, вибрионов не 01 группы - 30 фагов, светя!дихся вибрионов - 13 фагов, парагедалитических вибрионов - 13 фагов, алгинолитических вибрионов - 1. Изучены также 33 фага галофильных вибрионов, полученных из Одесской, Крымской. Причерноморской противочумных станций.
Для выделения фагов из объектов внешней среды было исследовано 863 пробы сточной воды и воды открытых водоемов г.Ростова-на-Дону и 44 проба - г.Донецка (Украина).
Тест-система вибрионов зльтор для определения иммунотиг.а-фага была любезно предоставлена нам профессором, д. м. н. Н.М. Остроумовой (НИПЧИ "Микроб") из своей коллекции.
Выполнение экспериментальных исследований осуществляли, используя микробиологические, генетические, электронно-микроскопические и другие методы изучения фагов и патогенных вибрионов. Принадлежность штаммов холерных вибрионов 01 к группе эпидемических подтверждали методом генного зондирования на наличие оперена vet (Гинцбург и соавт., 1389).
При выращивании холерных вибрионов 01 и не 01 групп, светящихся вибрионов применяли 0,1%~ и 1,5%-ныи агар и бульон Мартена (рН 7,6-7,8); для парагемолитических и алгинолитических вибрионов использовали те же среды с 3% NaCl.
Статистическую обработку результатов проводили общепринятым методом (Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962).
Результаты и их обсуждение.
Лизогения У. cholerae 01. В результате изучения 2311 штамма холерных вибрионов биовара эльтор нами выявлено 701 (30,3%) ли зогенных культур (Табл. 1). Наибольшее количество штаммов, проду цирующих фаги, было зарегистрировано в очагах холеры на Украин (1991г.), когда .из 651 исследуемой культуры было выделено 17 фага (36,2%), и Дагестане (1994г.): из 502 штаммов - 37 (75, т.
Таблица 1
Результаты изучения лизогении холерных вибрионов, выделенных на различных территориях (1986 - 3994 гг.)
Место выделения Кол -во Из них лизо- Серотип Иорфотип
штаммов эльтор штаммов генных фага фага
Азербайджан 138 20 II V
Грузия 50 29 И V
Казахстан . 182 10 И V
Киргизия 22 9 II V
Молдова 2 2 II V
Россия 645 396 II,XI,XII I. III.'
Таджикистан 58 16 II V
Туркменистан 26 7 II V
Узбекистан 488 19 II V
Украина 651 174 • II V
Франция 9 9 II V
Индия 3 3 II V
Болгария И 5 II V
Вьетнам 10 2 II V
Швеция 3 0 - -
Итого: 2311 701 (30,3%)
Необходимость получения холерных фагов из штаммов-продуцентов тесно связана с использованием их для решения практически; задач. Однако экспериментатору не всегда удается выявить лизо-генное состояние. Основной причиной этого затруднения является отсутствие чувствительных к фагу культур. В раде случаев культура спонтанно освобождает незначительное количество зрелых фаговых частиц и требуются специфические условия для их выделения.
Практически важный результатом проведенного исследованhj
явилась разработка оригинальных 1гатоднческих приемов для прямого обнаружения г^огенни у холерных вибрионов. В первуи очередь, быт решена католическая проблем уашренной иленпфосацин лизо-генных птггслзз. Основные пркнцтс!ц разработанного иетодичесного npneîia явилось использование в качестве индикатора зависимого от антибиотика птш.пла холерных эльтор вибрионов, что ггозволило подтверадать фагсксснтельство у 80% холерных вкбрггоноз на средах. содерзг^их стрептомицин, без получения надосадочных аидкос-тей инактивировакных культур и фагс&ильтратов (А. с. N1337413).
Иной подход полосен в основу способа обнаружения холерных фагов после воздействия на лмзогендае культуры концентрированных растЕороз иочевины. При этю £агн выделяли как из типичных, так и аткпмчкых» устойчивых к дз:ап-йхгпгчеаат Сзгги хслернах птгпззз цзух бжвароз (А. с. Ш578189К
Было установлено. что фагапродукцня наблздалась у тех птаи-ззз. Сгги которых на сжзляли псслэ кштгкта клетке с хлсрс^ср-аоа. Укерегаке фага бага обнаругенау 48 птггаазз V. choieras el-tor га 220 изучегашх. у 0 - V. choieras cbolerae - :а 10.
Слздуг^зе нгпразлзсш нз=за ^етодзуесшх рззргботок связано ; пспальзсзгкгеи ^агсинд щирув^вго и злк^гнирус^его действия хи-¡ичесюи, б::огогичеааи и Сизичесюи ^астороз. Применение нитро-зс^эпигязчевкны (Ю). 1=ггс£з:цнна С (КС). ультрг^азлетогого об-зучзжя ' (У0) на »¡одели чатарех лизогекных птэгдоэ вибр.иокоз эль-гор повысшю фагопродукцшь При концентрации готокзщнна ! шг/ил ( птг^азоз Р-10105 и P-1Q345 величина отассежа количества корту ас/л в 1 ил к коя5честву бактерий в тоа се объенэ возросла в 10е и 104 раза соответственно. Увеличение титра Юговых частиц этеечалссь у пташга Р-10105 в 17.8 раза и Р-10345 - в 27,3 раза, кюле контакта с Ю £агспродукцкя возрастала в 10 - 100 раз. 1рккенеш:е K1-J позволит осуществить алзймнацзэ прсфага у 5 из жсыш исследованных птакаов.
При изучении явления лизогении у Л-фори холерных вибрионов >бнаругены фаги у двух из девяти взятых в шит nrasasoa. Результаты показали. что переход холерных вибрионов в Л-ссстояние ио-Еет сспро воздаться элинннацкгй проката, однако отдельные лизо-■енные птазаа способны сохранять профаг при переходе в Л-форму. 'азработана схема исследования Л-форм, позволящая уасорить расту то отбору лнзсгеннах и свободных от профага Л-вариантов.
- И -
что имеет вазное практическое значение.
Исследование стабильности * лизогении после длительного прэ бывания холерных вибрионов в пробах речной и сточной воды, в ка мунноа организме, при воздействии Л-траксфораирущих агентов i . мутагена (НГ) показало, что лизогенность не была утрачена ни од кой из 1647 субкультур каждого из исследованных птг^ов. Tai си признаки вида и биовара колерных внбрионоз как аитигегаез сеойс тва, отношение к колзрша фагам. особенно ХДЭ-З и тгшлрущщ были наиболее лабильна!.
Полученные данные открыли перспективу гарокото прканени - лизогенности в качества иар:серного признака циркулирущ»« станков в очаге холеры и продуцируемой иыи Сагоз для лобораторна; диагностики Еозбудитаги.
.. Во взаимодействии шгкроба и фага шгут вознг^сать снтугщид в результате которых бактерии приобретает резистентность к С^Г] " (Сомова А.Г., 1988; Агепоза 3. II и согвт., 1972, 1077; Бухари О.В. исоавт., 1839; Дззбак Е.Г.. 1974; Корокшна Г.Ц.. 1S33; . Остроуизва Н. К., 1978, 1993; Сульдала Е. Г. и соазт.. 1973). Iteiz показано, что пз&аненне поверхностной сяпгигвнноа структура холерных вибрионоз сопровсщдаетея утратой способности лизирозатьса диагностические фагаьм. Птг^а, атглоткнирукзкзси только РО-сы-воротеай (от 1/8 до титра), составили праагуг^стванко группу фа-гоустойчивах холерных вибрионов (1 группа). Установлено, что np¡ снижении способшстк агглэтинироваться аэораткггя я0° (до i/i титра). Ite6a (1/2 титра), Отава. (1/8 титра) такш набладаета фзгорезистентшсть (II и III группы).
. Умеренные фаги, изолированные да эпидемических (vet*) и кэ-гпидеаичеаои (vet") лизогенных craisaa галерных вибрионов, об' наругшвали в различных титрах от nxlC^-lO6 KE/uo. Ота^ы-носи-тели профагов были устойчивы к супаринфакции годалагичншги фагами. . Холерные фаги образовывали разнообразные по размерам, форгя края, наличию вторичного роста негативные колонии. Наибош распространенными были мутные мелкие негативные колонии-с ровными краями (0,4Ю,01 мм - 0,7±0,1 мм) и больших размеров (3-5 ш в -диаметре), плотный центр которых может быть округе» полупрозрачными окружностями. 8,9% исследованных фагов формировали вирулентные мутанты, негативные колонии которых имели четко очерченные прозрачные пятна с плотной точкой в центре или без нее.
Злектрайно-шжроснппнческоа исследования строения корту скул 54 уверенных холерных фагов показало их принадлбхносгь к I, III, V иорфсгруппам по А. С. Тихоненко. Антигенная характеристика определялась II. XI, XII серологическныи типами. Два последних сера-типа представлены в коллекции холерных фагов Ростовского НИПЧИ впервые.
Изучение фазы взаимодействия фагов с холерными штаммами выявило время, необходимое для их адсорбции, которое составляло 10
- 20 минут. Процент максимальной адсорбции укладывался в пределах 89,7-99,9S. Константы скорости адсорбции фагов колебались от 5-6" 10"8 до 0,12* 10"9. Длительность латентного периода составляла 35-55 минут, у некоторых - 110-120 минут; урожайность - 16,2
- 61,0 корпускул на клетку. Умеренные фаги обладали узким спектром литической активности, лизируя от 12,1-15, IS жтаммов V. dîo-lerae .H б, 0-30,3% V. el tor. Вирулентные фаги тели более широкий диапазон, охватывая до 64, ЗХ пашов.
Холерные фаги были устойчивыми в диапазона таюератур от 45* до 60°С. Практически они инактивировались лив» при 65° -70°С. Особую группу составили фаги I морфогруппы, сохранившие активность при Э0°-90°С. Отличив было обнаружено и в чувствительности к хлороформу. Изученные фаги V и III морфологических групп сохраняли устойчивость теле контакта с ним и погибали -фага I морфогруппы. Фаги по чувствительности к действии УФ-лучей различались незначительно. От сохраняли жизнеспособность до 180 секунд, постепежо снижая количество активных частиц от 0.83 до 0,262. Константа скорости инактивации находились 8 пределах 1,74
- 1,98 МИН.-1
Увеличение концентрации цитрата натрия в бульоне от 0,25% до 3* не выявило различий между фагами. Действие концентрированна, растворов мочевины (1556 и 30*) сопровождалось снижением процента активных корпускул (от 17,0 до 1,47%).
Результаты изучения биологических свойств фагов, продуцируемых vet4- и vet"- вташами холерных вибрионов подтвердили ведущее значение для их таксономии таких признаков, как строение корпускул при электронной микроскопии и антигенная структура (Сомова А.Г., 1968; Остроумова Н.М. и еоавт.,1970, 1971: Быстрый Н.Ф. и соавт., 1966, 1968, 1974; Дрожевкина U.C. и соавт.,1973; Быстрый Н. Ф., Дрожевкина М. С. 1979).
- le -
Полученные сведения каазг пркйршналькое значение, поскольку рфсшряит существуйте представления о семействе холерных фагов II, XI и XII серотипоз, носителши которых галяются злидши-ологическн неравнозначные теша.
Даняие ретроспективного анализа вташэв холерных вибрионов, выделенных в 1975 - 1995 гг. в разных впвдемиологическкх ситуациях, свидетельствовали о различии лизогвнных систем холерных вибрисшов, циркулировавши на контролируемой территории в период VII пандемии, и возшаности оценки их гпидешэлогичвской знзчи-шстн с псвщью ишунотипов ПрОфйГОЗ.
Исследование характера ю&унных ответов лизагениз»фоватах культур тест-систеш в отнодасш 85 умеренных Фагоз показало принадлежность их к следущиы вдыуннш типам: 1-1, IS; III -51,7%; IV - 11,51; VIII - 0,9%; X - 1,8S; XII - 0.4Х. Различие «алунотипов назло применение в практике типирования вггжов aras-тор вибрионе».
Для создания системы транедукции у холерных вибрионов был осуществлен поиск транедуцирущих фагов среда тевфхся рас. В результате исследования 25 холерных фагов обнаружено 28Х из них, обладавшие транедуцирущей активностьо. Фагами II, VII, VIII, IX серотипов осуществлен перенос генов ibis и arg с частотой 10~6 -10"7 БОЕ.
После воздействия на бактериальные клетки холерныы фагоы VITT серотипа с титром 4x10* корпускул в 1 ил были получены пигментные меланннсютезнрущие «таыыы холерных вибрионов. С частотой 10"7 они возникали у зльтор вибрионов после контакта с HSS9 в дозах 0,1 - 0,5 жг/мл. Разработан способ получения пигментных цутантов (A.c. N704180).
При лизогенизации двух прЬтогрофных ггашов тремя холернши фагами отмечали появление вариантов, зависимых от глстаыиновой кислоты, лизина, аспарагина» кзолейцина. Процент субкультур с повывенными потребностями колебало! в пределах 17-67. У боль-винства субкультур выявлена? шсисественная зависимость в факторах роста. Способ получения ауксотрофных мутантов заадзн A.c. »982345.
Выделенные наш аукоотрофные и пигментные еталаи холерных вибрионов пригодны в генетических исследованиях и для создания "более совервенной методической базы генетического анализа холер-
ных вибрионов.
Принимая во внимание, что сохранение уникальных коллекций умеренных фагов в современных условиях представляет серьезную проблему, нами был отработан реним лиофилизации холерных фагов II, III, IV, V морфологических групп. Сокращено время высушивания фагов с 27 до 9,5 часов при соотношении фага и защитной среды 2:1. Титры умеренных фагов снихаятся в 10 - 100 раз, вирулентных - либо сохраняются, либо уменьшаются в 10 раз. Препараты фагов, высушенных в'пептонно-желатиновой среде, активны в течение 27 месяцев (срок набладения) при температуре хранения 4±2 С0 и 26±2 С0. На базе Казахского противочумного института в условиях производства получена наилучшие показатели активности типиру-вщих холерных ганофагов, при использовании среды высушивания: пептона 10%, пелатины - 1,4%. Лнтическне свойства сухих типирую-цих 1,:онофагов сохранялись в течение двух лет (срок наблюдения). •
Составлена "Ведомость дополнений на холерные типирующие фаги. сухие" к НТД II ступени на "Конофаги диагностические холерные типирующие. нидкие 1-7".
Установлено, что крио- и ксерочувствительность холерных фагов зависит от особенностей их структуры. Одноэтапное охлаждение от +20С° до -196С0, со скоростью 400С°/мин, хранение при --196С0, последующее оттаивание при 24Са и при 37С° являются оптимальными' условия!'!! при консервировании холерных фагов I, II, 1Ц, IV, VII, IX, X, XI серологических типов. Оформлены "Методические рекомендации по способу криоконсервирования холерных фагов". Способ криоконсервирования внедрен в РосНИПЧИ "Микроб" (Акт от 29.05.1990 г.). Создан криобанк холерных фагов. Установлено. что более высокая чувствительность умеренных 'фагов к длительному воздействию физических факторов определяет специальный реаим сублимации (3-й, из пяти исследованных), включающий скоростной градиент подогрева 3,03°С/мин, подогрев -50°С - 40мнн.; -20°С - 0,75 часа: - Ю°С -0,45 часа; -5°С - 7.5 часов: +20°С -1,5 час. Продолжительность 11 часов. Этот реаим является оптимальным для умеренных фагов второго и одиннадцатого серотипов.
Способ лиофильного высушивания использован для сохранения ¡»«неспособности коллекционных образцов умеренных фагов, что значительно сократило расходы на поддержание музея фагов.
Лнаогения v. cho-erae поп 01. Углубленный анализ лизогеннш wH-Töt: г^теропьтогенных вибрионов и фагов, активных по отношение к морионам отделения серологических вариантов 32, 05, 03, 022, 045, 044, 056, 057, 055 (Остроумова Н. М. и соазт., 59-77, 5S78, i960, 5982; Голкозскнй Г.М. и соавг., 5935; Агапова 3. М. и со-авт., 5981, 3982) позволил нам продолжить исследования и получить ряд новых данных.
Впервые выделены и изучены фаги холерных вибрионов не 01 группы: 06, 037, 039, 042, 05 3S серогрупп. Проведена таксономическая характеристика фагов энтерапатагенных вибрионов 05, 06, 024, 037, 039, 042, 0139 серогрупп.
Отобранный в качестве типового фаг вибрионов 06 серогруппь имел крупную головку в виде многогранника: 72,3±54 ни и длинный отросток с сокращающимся чехлом длиной 3 37±6 нм. По морфологической классификации А.С.Тихоненко вирионы относились к V морфологической группе. Строгая антигенная специфичность фагов была доказана в реакции нейтрализации с антифаговыми сыворотками к холерным фагам 10 серологических типов и фагам вибрионов различных 0-серогрупп. Фаги нейтрализовались только гомологичной сывороткой. Из штаммов 06 серогруппы фаги лизировапи культуры одноименной группы. По антигенному строению фаги отнесены к одному серотипу, обозначенному 06/2. Минимальный латентный период находился в пределах 30-35 минут,- урогаи на 1 инфицированную клетку равнялся 45 корпускулам. Одновременно из культур одноименных серогрупп Остроумовой Н. М. с соавторами был выделен-фаг 4139/4174, принадлежащий к серотипу 06/1, что свидетельствует о наличии у вибрионов 06 серогруппы фагов двух серотипов.
При серологической идентификации фага, выделенного из вири-онов 037 серогруппы, нами была доказана уникальность принятого за эталон фага Р-Э752. обозначенного 037/1. При эл&ктронно-мик-роскопкческом исследовании вирионы фага состояли кь головки гексагональной формы (37, 0-2,5 нм) с рудиментарном отростком и принадлежали ко-II морфологической группе по классификации А.С.Тихоненко. Продолжительность латентного периода составляла 30 мин., урожай частиц на 3 клетку - 30 БОЕ. Фаг не бьт активен в отношении вибрионов 02-036, 038-057 серогрупп и лизировал 50*
культур 037 серогруппы. При множественности инфекции, равной 0,3-1, и концентрации 1,5*1О7 мк/кл, он активно размножается в бульоне Мартена при 37°С.
Главной отличительной особенностью обнаруженного нами штамма 781 V.cholerae 042 серогруппы является способность спонтанно продуцировать умеренный фаг ранее неизвестного серотипа, обозначенный 042/1. Полученный штамм депонирован в музее живых'культур противочумного института "Микроб" под номером КМ-14 (781). Умеренный фаг 042/1 имеет головку гексагональной формы , диаметром 30,042,2 нм, отростка не имеет и относится к мелким фагам II морфологической группы по систематике A.C. Тихоненко. Минимальный латентный период составляет 31 мин и средний урожай 20-23 частицы на инфицированную клетку. Умеренный фаг обладал способности отщеплять вирулентные мутанты, которые отличались морфологией негативных колоний и спектром литической активности. Уме-. ренный.фаг лизирует только индикаторный штамм, вирулентные мутанты - 88-90% штаммов гомологичной серогруппы и обладают высокой специфичностью. Фаг относится к самостоятельному серологическому типу. Антифаговая сыворотка активна в отношении гомологичного фага и не нейтрализует фаги вибрионов других 0-серог-рупп.
Штамм 781 V. choleras 042 серогруппы, продуцирующий' фаг 042/1 серотипа и штамм С-170, индикаторный в отношении фага 042/V серотипа и его мутантов, зарегистрированы в качестве изобретений (A.c. N1405298 и-A.c. N13S10S05.
Разработан новый диагностический фаг, пригодный для идентификации холерных вибрионов 039 серогруппы, депонированный в Тбилисском НИИВС. Носнтельстно фага серотипа 39/1 является специфической генетической меткой вибрионов 039 серогруппы и мояет использоваться для их идентификации (A.c. N1307348).
Обнаружено носнтельстно холерного Фага второго серологического типа III иммунной категории токсигеннымн штаммами холерных вибрионов 0339 серогруппы. По структуре фаговых частиц отнесены к У морфологической группе по классификации А.С. Тихоненко (1063). В качестве методического подхода обнаружение фагов этого серооаряанта перспективно для дополнительной дифференциации хо-лэрных ои5рис:«зв 0139 серогругиш от вибрионов других сэрогрупп.
Для облегчения идентификации вновь выделенных фагов и накопления материала для совершенствования временной классификации фагов холерных вибрионов не 01 группы целесообразно кроме электронно-микроскопического строения корпускул и антигенной структуры определять принадлежность штамма-хозяина фага к определенно; 0-серогруппе и спектр действия фага.
Система фаг-бактерия у V.albensls. Впервые обнаружены фал V. albensis. продуцентами которых являются лизогенные штамш светящихся вибрионов (А. с. N1636446). Предложена индикаторная культура V. albensis КИ-41, способная выявлять фаги. Носительст-во фагов обнаружено как у серотипированных штаммов V. al bens ii 9504 (серовар 5), и 9510 (серовар 6), так и штаммов неизвестны] сероваров.
Электронно-микроскопическое исследование показало, что фал по строению вириона относились к I морфологической группе пс классификации А. С. Тихоненко и имели размеры 2120-2170 ни ; 11,0-12,0 нм. Нитчатые фаги принадлежали к семейству Inoviridae. Штамм V. albensis 9651 - продуцент умеренного фага депонирован i музее института "Микроб". Изученные фаги были сходны в антигенном отношении. Выявлено серологическое родство фагов светящих» вибрионов и холерных фагов XII серотила.
Фаговые корпускулы сохраняли устойчивость к прогреванию i течение часа при 70° С. Полная инактивация наблюдалась в интервале температур 80-90°С. Свойство терморезистентности было использовано нами при выделении фагов из лизогенных штаммов светящихся вибрионов.
Изучение специфичности фагов V. albensis представляло практический интерес для разработки критериев отбора диагностически; фагов. Диапазон литической активности умеренных фагов V. albensis был узким и распространялся на единичные (1-5) штаммы. В ti же время 343 втамма микроорганизмов, различных представителе] близкородственных видов, родов и семейств (Vibrionaceae, Pseudo monadaceae, Enterobacteriaceae) не проявляли чувствительности i испытанным фагам. На газонах втаммов V. cholerae 01 группы выяв лены мутанты фагов 9504-В и 951 О-В, способные при высокой кон центрации частиц (Ю10 Б0£/мл) лизировать холерные вибрионы.
Поскольку между репродукцией фага и условиями клеточнол метаболизма существует тесная зависимость, эти данные свидетель ствуют о большой близости V. albensis к холерным вибрионам. Да
тальное изучение вновь полученных фагов позволило установить, что литическое действие их не распространялось на V. cholerae не 01. Эффективность посева вирулентных фагов 9510 В/Т2 и 9504 В/Т2 на штампе V. cholerae 12 была в 100 раз ниже, чем на V. albensis КМ-41. Фаг 9510 В/6532 лизировал V. eltor 6532 с эффективностью в 1000 раз меньшей, чем индикаторный штамм светящихся вибрионов. Полученные результаты свидетельствовали об ограничивающем действии систем хозяйской специфичности холерных вибрионов. Фактический материал подтвердил правомерность отнесения этого микроорганизма к виду V. cholerae.
■ Лизогения галофильных вибрионов(V. parahaeisolyticus и V.algi-nolyticus). Впервые обнаруаена лизогения у штаммов V. рагаЪаешо-lyticus 04:Kl2. 05:К15, 06:К18 серогрупп. Осуществлено сравнительное изучение таксономических признаков фагов, продуцируемых лизогенными штаммами, и выделенных из проб морской воды.
Установлено, что фаги парагемолитических вибрионов представлены I. III, IV и V морфогруппами (по классификации к. С.Тихонен-ко). Фаги IV морфогруппы имели изометрический капсид и признаки морфотипов В1 и В2. Две разновидности морфотипов AI и А2 отмечены у фагов, относившихся к V морфогруппе. Фаги парагемолитических вибрионов не имели антигенных связей с фагами холерных вибрионов 01 и не 01 серогрупп. Доказано отсутствие литических реакций фагов в отношении различных представителей семейства Vib-rionaceae, Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae. Литическая активность фагов составляла от 0,8 до 58% штаммов парагемолитических вибрионов и 11,1-52,5% алгинолитических вибрионов.
Не выявлено коррелятивной связи между чувствительностью к умеренным фагам парагемолитических вибрионов и специфичностью "0й или "К" серотипов.
Фаги алгинолитических вибрионов, изолированные из различных объектов были представлены тремя (III, IV, V) морфологическими группами. Обнаруяены фаги новых серологических типов. Лизогенный штамм V. alginolyticus, выделенный от больной острым гастроэнтеритом, продуцировал фаг IV морфогруппы, идентичный по антигенным, морфологическим свойствам фагу, продуцируемому штаммом V parahaemoivtiCUü 04:К12 серогруппы.
Выделение Ьагов из внешней среды и лигогенных штаммев лизи-
рущих как V.parahassDlyticus так и V.alginolyticus, a tskes серологическое рэдстю обнарусенных алпшолитичесгшх фагов с фагами парагешлитаческих вибршнов позволяет поддергшвать шенке тех исследователей, которые рассматривают V.alginolyticus как биовар вида V. parahasEOlyticus (Либинзон Д.Б. и соавт., 1935).
Применение дгшгкостнческих препаратов колерных fcaros при бзк-тевиологическом обследовании очагов холера. За пергад с 19S2 по 1994 года нани была изучена чувствительность к даагностическгш фатаи. 1296 впаалв холерных вибрионов 01 группа, поступивших в Центр патогенных вибршнов, из которых 697 взделена от лздей в различит: очагах холеры и 599 - из объектов округащей среда. Исследование лнзабельдасти вта^ов фагами С и Зльтор позволяю отнести к бгавару зльтор в 1992 г. - 83,3%, в 1993 г. - 93.5%, в 1994 г. - 49,43 еггггаш, изолированных от ладей на территории России; в странах блианего зарубежья эта цифра составляла в 1992 г. - 93, 456. в 1993 г. - 88,92. Что касается холеркшс вибрионов, выделенных из объектов внешней среды, то чувствительных иташэв было 97,5% (1992 г.). 82.51 (1993 г.). 37.5% (1994 г.) - ПО РФ И из СНГ - 88,3% (1992 г.). 84.6% (1993 г.). Количество втаммов. лизироваввихся классическим холерный фагои составляло 1.IS (19S2 г. ) - из внеаней среда; 2,19% - от ладей и 25% - из вне^ей среда (1994 г. ) - по России. В этот период была отиачена тенденция к увеличении числа культур холерных вибрионов, устойчивых к фагам ХДФ-3, I, 5. у которых был выявлен ген холерного токсина. В связи с этиа кошлаксныу методом птамш с измененной чувствительностью оценивались как авкрулентккэ (74,5 - 100%) или слабо-•зирулачтные (1.6 - 25,5%). §аги ХДФ-3, 4, 5 на данном этапа оказались недостаточно эффективным» для оценки вирулентности свеае-заделанных вташов холерных вибрионов альтор кз-®а фггаусгойчи-еости микробных клеток.
Дифференциация vet* и vet" втаммов холерных вибрионов. Показало. что лизогенныг систеш эпидемических и неэпидемических итамдав холерных вибрганов различается по типу ишуннтета продуцируемых фагов.
Установлено, что угареннае фаги толысо III ¡^унотгла продуцируют эпидемические Bradai зльтор (табл.2). Носктелъстро фзгзв I, II-IV, VI-XII таунотипоз характерно для неапидегачеошх зташэв палергал вибрионов. Получены данкаэ о тол, что уьареккьа фаги III икмунотнпа из vct+ и vet" втаааов различается мегду
Таблица 2.
ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ ЭЛЬТОР, ВЫДЕЛЕННЫХ В РАЗЛИЧНЫХ ОЧАГАХ НА УКРАИНЕ (1991г.)
Место выделения Всего идентифицировано штамгдов Объект выделения Кол-во штаммов ЛИЗОГЕНИЯ Лизис фагом эльтор Вирулентность по фагам ХДФ 3,4,5 Всего фагами типиро-валнсь Наличие гена vet Сера-вар Гемолиз отриц
авирул. слабовир.
Кол-во 7. ймму-нотип фага Кол-во % Кол-во 7. Кол-во 7, Кол-во /о
г.Билкоео люди 234 71 30,3 III 36 15,3 223 95 10 4,2 21 , 9 + Огава 234
264 внеш.
г. Кялия среда 30 14 46,6 III 17 56 29 96,6 1 3,4 3 10 + Огава 30
Николаев- люди 209 28 13,4 III 184 88 157 75 52 25 130 62.5 + Огава 209 •
ская 244 внеш.
область среда 35 б 14,3 III 34 100 28 82,8 6 17,2 13 36 + Огава 34
• - - 1 . - - ■ - - + Инаба 1
люди 49 25 51 III 46 94 49 100 - - 34 69 + Огава 49
г.Каховка 50 внеш. 4- ИнаОа
среда 1 1 100 III 1 100 1 - - - 1 - + Огава 1
Херсон- люди ' 33 10 30,3 III 22 66,6 33 100 - - 25 75,7 + Огава Я*5
ская 40 внеш.
область среда 57 1,7 III 2 28,6 7 100 - - 5 71 + Огава
Всего: 593 598 158 26,4 340 56,8 528 88,3 69 11,5 232 38,7 598
собой по показателю рестрикции. Сопоставление зтих данных с результатами определения vet гена с помогаю ЛЯК-зонда выявило их совпадение.
Результаты показали, что продуценты фагов второго серологического типа VIII гетероишунного типа встречаются только среди неэпидемических (vet') Еташэв вибрионов эльтор (A.c. N1533331). 8 ходе исследований обнаруаены фаги XII серологического типа у лизогенных авирулентнш штаммов холерных вибрионов.
Нами дополнена система тест-культур для прямого фаготипирова-ния, предлогенная ранее сотрудниками противочумного института "Микроб" (Остроумова Н. U. исоавт., 1986, 1388). Путем искусственной лизогенизацни фагом 9966, одиннадцатого серотипа. реци-пиентной культуры 570 получен тест-штамм 570/9968. лизогенный по фагу XII иммунного типа (табл.3). Тест-итамм обладал резистент-
Таблнца 3.
Характеристика типа иммунитета уиэренного фага штамма Vibrio choleras ellor 9968. .
Субкультура
Лизоген-на по фагу иммунного типа
Чувствительна к фагу ишунного типа
I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII
41 70 222Н 132 sax en 893 583 6901 80 1564 9966
570 485/41 570/70 570/222Н 570/132 570/98.X 570/61i . 570/893 570/583 570/6901 570/80 570/1564 570/9966 XII
I -
II -
III 4
IV 4
V 4
VI 4
VII 4
VIII 4
IX 4
X 4
XI 4
XII 4
+ +
4 4 4 4 4 4 4
4 +
4
4 4 4
4 4
4 +
+ +
4
4
4 +
4
4 4 4 4 4 4 4
4
4 +
4 4 4 4
4
4 +
4 4
+ + +
4 4 4 4 4
4 4
4 +
4 4 4 4
4 +
+
4 +
4
4 4
4
4 +
4 4 4
4 4 4 4 4
Примечание: (+)-культура чувствительна к фагу, (-)-резистентна к фагу
ностыо к гоюишунным фагам XII и VI иммунных типов и чувствительностью к гетероншуннш фагам I-V, VII-XI типов, в связи с чем его используют в методе прямого фаготипирования, а включение в систему тест-культур увеличило процент типируекых штаммов (A.c. N1623205)
Углубленное изучение структуры и функции фагов, продуцируемых штаммами из различных объектов (очагов холеры и вне очагов из внешней среды), способствует совершенствованию методов дифференциации vot* и vet" штаммов и определяет перспективу дальнейших исследований лизогенных систем.
Изолированные из неэпидемических (vet") штаммов 9 холерных фагов лизировали от 16 до 44% авирулентных культур вибрионов эльтор и не были активны к вирулентным (vet*) штаммам. Составлен препарат фага, лизирующий 64% испытанных vet"- штаммов. Разработана технология производства фага в лабораторных условиях и утверждена первичная техническая документация на препарат, предназначенный для идентификации авирулентных штаммов холерных вибрионов.
Современная идентификация измененных форм холерных вибрионов имеет важное значение при проведении противоэпидемических мероприятий. Анализ полученных нами материалов показал, что 41,1 % атипичных штаммов являются носителями холерного фага V морфологической группы II серотипа, 4,4% лизогенны по фагам I морфологической группы XII серотипа. Среди исследованных фагов выделено два, активных в отношении штаммов V. cholerae 01. со сниженной агглютинабельностью диагностическими холерными сыворотками и показана перспективность для диагностики измененных штаммов.
Специфические фаги-индикаторы загрязнения внешней среды холерными вибрионами. Анализ бактериологических находок холерных вибрионов позволил отметить корреляцию во времени выделения возбудителя холеры и холерных фагов. Установлено присутствие в культурах вибрионов эльтор фагов, идентичных по биологическим свойствам фагам открытых водоемов и сточных вод г.Ростова-на-Дону. Выявлена циркуляция лизогенной разновидности возбудителя холеры в обследованной местности. Фаги холерных вибрионов обнаруживали в поверхностных водоемах и сточных водах с июля по сентябрь (1986-1987, 1989. 1991, 1994-1995 гг.)(табл. 4). В связи с быстротой и простотой постановки тестов на бактериофаги по сравнению с тестами на обнаружение холерных вибрионов, показана возможность использования фагов холерных вибрионов в качестве индикатора присутствия холерных вибрионов в объектах" внешней среды. С помогцыэ разработанной тест-системы предложено определять к какой группе относятся обнаруженные фаги.
Выделено два фага вибрионов 024 серогруппы в исследуемых пробах из реки Дон.' Благодаря специфичности фагов их обнаружение можно считать- свидетельством циркуляции данных серогрупп вибрионов среди людей изучаемых территорий.-
Таблица i.
Результаты исследований проб сточной воды и открытых шдоемш на наличие холерных фагов (1986 - 1995 гг.)
Территория Годы Количество Вид Морфотип Серотип
фагов фагов *
Россия I Холерный
Ростовская 1986 10 01 и не 01 V II, 024/1
область 1987 9 и V II
1983 - и - -
1989 1 и V II
1950-1993 - * . - -
1994 3 и I XII
1995 8 »1 1.У II. XII
Украина
Донецкая 1991 2 Холерный 01 III VI
область
В результате исследования 44 проб вода контролируемых водоемов г. Донецка было показано присутствие колерных фагов в сточной воде коллектора ХБК. Саги выделены из одной и той ае точки забора воды в августе и октябре 1991 г. Обнаружена два штамма холерных вибрионов среди культур, поступивших из Донецкой СЗС, которые являлись потенциальными хозяевами для выделенных холерных фагов.
Метод профаготипирования микроорганизмов вида У.с1'.о1егае для определения их серологической принадлежности с помощью системы тест-культур. По нашим данным процент лизогенных штаммов холерных вибрионов не 01 группы колебался в широких пределах, достигая ,в ряде случаев 82, Для идентификации переносимого фага-паразита штаммами каждого 0-сероЕара холерных вибрионов составлена система тест-культур, вкличашря 16 итанмад У.с1ю1егае не 01 группы и двух шташэз V. сЬоЮгае 01 группы. По чувствительности соответствующей тест-культур« к умеренному фагу иссле-Ауе*г»го шхакаа определяют серологическую принадлежность последнего. Предлагаемый метод используют дпя идентификации 01, 02, 05, 06, 08. 022, 024, 037, 033, 041, 042, 044. 05-3 и других се-
рогрупп вида V.с!ю1егае по спектру литического действия переносимых им умеренных фагов.
По сравнению с серологическим методом он*технически прост и экономичен. В практике противоэпидемических исследований метод нашел применение при плановом обследовании внешней среды на наличие холерных вибрионов.
Разработка способа идентификации светящихся вибрионов. Предложен новый способ идентификации светящихся вибрионов для лабораторной диагностики возбудителя диарейных заболеваний. Способ позволяет повысить эффективность бактериологического подтверждения штаммов светящихся вибрионов на основании выделения фага, продуцируемого штаммами-носителями профага и использовании фага для обнаружения нелизогенных культур (табл. 5). Преимуществом
Таблица 5.
Идентификация У.а1ЬешнБ по продукции-умеренного фага и фагочувствительности нелизогенных штаммов
Количество штаммов V. а1Ьепз1з Фагопродук-ция лизоген-ными штаммами Лизис нелизогенных штаммов фагами Количество штаммов с биолюминесценцией клеток
9504 9510
37 .. 15 10 . 6 12
его является идентификация штаммов, обладающих биолюминесценцией и утративших свечение при длительном хранении, неагглютинирую-щихся сыворотками к V.с!ю1егае 01 и не 01 групп. Способ сокращает использование дорогостоящих и дефицитных сывороток. Разработанный способ может найти применение в практике микробиологических исследований, а также в тех случаях, ксгдз необходимо дифференцировать лизогенную разновидность возбудителя, циркулирующего на обследуемой территории от нелизогенной.
Специфический фаг ДГФ для идентификации галофильных вибрионов. Разработан поливалентный диагностический фаг (ЛГФ), пригодный для идентификации патогенных вибрионов вида V. рага11аето1уИ-сиз и V. а1с1по1уИсц5, возбудителей острых гастроэнтеритов и пищевых токсикоинфекций. Анализ полученных результатов после испы-
тамия препарата на 124 серотипированных штаммах парагемолитичес-ких вибрионов, выделенных от больных ОКЗ людей, показал, что чувствительными к ДГФ были 82% штаммов известных 17 "К" сероти-пов, и 52,57. V. а^1по1уИсиа.
Комплексное использование фагов различного спектра действия обеспечило препарату ДГФ более широкую активность при сохранении специфичности. Фаг ДГФ не лизировал различных представителей близкородственных микроорганизмов (табл. 6). Специфическая активность фага ДГФ в сочетании с технической простотой его приготовления и применения позволяют рекомендовать разработанный препарат для лабораторной диагностики.
Таблица 6.
Спектр специфического действия фага ДГФ в отношении вибрионов и других близкородственных организмов
Семейство Род Вид Кол-во Из них
штаммов чувст-
витель
ных
Kf?
Vibrionaceae Vibrio
Pseudomona-doceae
Enterobacte-riaceae
Áermonas Plesiomonas
Pseudocsonas
Escherchia
Shigella
Salmonella
V. parahaemo-liticus
V. alginolyticus V. cholerae V.proteus V.cholerae non 01 (02-057) V. fluvialis V. nimicus
124
80 102 1 57
3 3 13 2
19
5 5 12
82,2
52,5 0 0 0
0 0 0 0
0 0 0
Утверадена Ученым Советом Ростовского-на-Дону противочумного института "Инструкция по изготовлению, контролю и применению фага ДГФ". Фаги внедрены в Одесской ПЧС.
Фаготипирование парагемолитических и алгинолитических вибрионов. Специфика эпидемиологического надзора за инфекциями включает постоянное слежение за циркуляцией возбудителя. Анализ литературы свидетельствует о том. что методы внутривидового типиро-вания дают более развернутую характеристику однородных по биологическим свойствам птаммов холерных вибрионов 01 и не 01 групп (Дрокевкина Ы.С.. Арутюнов 0.И.. 1979. 1983; Быстрьй Н.Ф. и со-авт.. 1984).
Так как в мировой практике отсутствуют схеш фаготипирования галофильных вибрионов, следущим этапом нагих исследований явилось создание набора типирую^их фагов. Нами предлозена четыре типирущих фага, дащие возыогность с их помощью распределить фагочувствительные птаааа* парагеаолитических вибрионов на четыре фаготипа, а алгнколитические - на три. Разработанная схема фаготипирования была апробирована на 148 втаммах парагеногатических вибрионов, выделенных при всгьеке острых зелудочно-кшеедых заболеваний в г.Бердянске с 1984 по 1987 г.. из которых 92 (82.IX) лизировались типирущими фагами. Полученные результаты свидетельствовали о том, что причиной вспыжи явилось инфицирование людей, рыб, воды штаммами I фаготипа (табл. 7).
Таблица 7.
Результаты фаготипирования парагешлитических вибрионов, полученных из г.Бердянска (1984-1987 гг).
Территория Годы выделения вташов Объект выделения Количество вггашов Фаго-тип Фаготипи-ровано
- абс. ( %
Украина, г.Бердянск 1984 человек рыба вода 56 16 16 1 1 1 I 31 55,3 И 68.7 7 43.7
1985 1986 1987 человек « • 42 16 2 1 1 1 29 69,0 13 81.2 1. 50.0
Всего: . " 148' 1 92 62.1
Реализация внесенных усовершенствований в фаговые методы лабораторной диагностики различных представителей рода Vibrio -V. cholerae 01 и не 01 группы, V.albensis. V. parahaernolyticus и V. alginolyticus повышает эффективность эпидемиологического надзора за заболеваниями, вызываемыми этими микроорганизмами. Созданная коллекция фагов и штаммов с каталогом расширяет возможность использования их в научно-практических исследованиях по проблеме "Холера и патогенные вибрионы",.
По' мере накопления новых данных о фагах патогенных вибрионов выяснение особенностей и специфичности лизогенных тест-систем может быть полезным в решении вопросов об эволюционных взаимоотношениях в пределах вида и между видами.
выводы
1. Штаммы возбудителя холеры из очагов и объектов внешней среды вне очагов, не связанных эпидемиологически, четко дифференцируются по типу лизогенных систем. Выделенные в очагах холеры штаммы, содержащие в геноме оперон vet АВ, характеризуются продукцией фага второго серологического типа, третьего иммунотипа. Холерные вибрионы новой, эпидемиологически значимой 0139 серогруппы, продуцируют фаги, идентичные фагам эпидемических штаммов холерных вибрионов 01 группы.
2. Лизогения авирулентных (vet") вибрионов эльтор обусловливается разными типами профагов. Установлены три (II, XI, XII) серологических типа фагов, продуцируемых vet"- вибрионами, ишунотипы которых распределены на I-IV, VI-XII. Выделены холерные фаги, специфически активные в отношении неэпидемических холерных вибрионов. Разработана технология приготовления препарата фага для идентификации авирулентных штаммов холерных вибрионов эльтор.
3. Установлено., что среди холерных вибрионов не 01 серогруппы, имеющих преимущественное значение в патологии человека, представители 06, 024, 037. 039, 042 серогрупп являются носителями серологически специфических- умеренных фагов, не-обнаруживающих серологического родства с фагами других 0-се-рогрупп. Разработана и внедрена диагностическая система тест-культур, методы и схемы ее применения для определения серологической принадлеаности микроорганизмов вида V. chole-гае по чувствительности системы тест-культур к их умеренным фагам. ■
4. В результате лизогенизации холерных вибрионов эльтор отмечено проявление хромосомных мутаций по нескольким признакам: пигментообразования и факторам роста. Обнаружены фаги, различающиеся структурой корпускул п антигенными свойствами, перспективные в изучении транедукции у холерных вибрионов.
5. Стабильность признака лизогении не зависит от изменчивости маркерных признаков холерных вибрионов и воздействия неблагоприятных факторов (пребывание в воде, иммунном организме, воздействие мутагена, Л-трансформация). Измененные по чувствительности к диагностическим фагам и агглютинабельности штаммы холерных вибрионов 01 серогруппы идентифицируются по носительству холерных фагов второго и двенадцатого серологических типов.
6. Выявлена синхронность выделения возбудителя холеры и холерных фагов из открытых водоемов и сточных вод. Обнаружение фагов VI. XII серологических типов сочетается, как правило, с циркуляцией неэпидемических штаммов холерных вибрионов. Выделение лизогенной разновидности эпидемических вибрионов эльтор (vctM коррелирует с циркуляцией продуцируемых ими фагов второго серологического типа III ишунотипа. Создана система тест-культур, позволяющая идентифицировать обнаруживаемые во внешней среде фаги, как показатели загрязнения холерными вибрионами 01 серогруппы, с определением их эпидемической значимости.
7. Внесено усовершенствование в реаиые лиофилизации фагов холерных вибрионов 01 и не 01 групп, в результате которого сокращена продолжительность цикла сублимации в.2 раза. Особенности структурной организации фагов влиявт на их крио-чувствительность. Определены оптимальные параметры криокон-сервации фагов холерных вибрионов 01 и не 01 серогрупп, вклзчащие одноэтапное охлаждение от 20°С до -196°С со скоростью 400°С/ыин. и хранение при -196°С.
8. Лизогенные втахаи V.albensis освобоздают умеренный фаг. серологически родственный холерным фагам XII серологического типа Подтверадена правомерность отнесения этого микроорганизма к виду V. cholerae. Предлонен дополнительный метод идентификации V.albensis по носительству фагов и чувствительности к ним.'
9. Впервые показано, что лизогения вггаммов V. parahemolyticus 04:К12, 05:К15, 06: К18 серогрупп обусловлена серологически идентичным типом фага. Не выявлено корреляции между.чувствительностью к Фагам и принадлежностью к 0-серогруппам и К-ан-тигенам. Установлено, что фаги парагемолитических вибрионов не имеют антигенных связей с фагами холерных вибрионов 01 и не 01 серогрупп. Сходство лизогенных систем и выделенных фагов позволили рассматривать V.alginolyticus как биовар вида V.parahaemolyticus. Впервые разработаны и внедрены в практику поливалентный фаг галофильных вибрионов и препарат диагностических фагов для типирования V. parahaemolyticus и V.alginolyticus.
10. Создана коллекция холерных и парагемолитических фагов с каталогом для обеспечения научно-практических исследований по проблеме "Холера и патогенные вибрионы".
СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕКЕ ДИССЕРТАЦИИ.
1. Совершенствование техники применения реплик /Орлова Г.И. /.-//Лаб. дело,- 1978.-N12.- С.738 - 739.
2. Изучение выживаемости холерных вибрионов и стабильности их фаготипов под влиянием некоторых детергентов /Соколова И. Т.. Рыако И. В., Арутюнов D. И. /. - // Научн. -техн. прогресс в медицине и мед. технике: Сб. науч. тр.. Ростов н/Д, 1979.-С. 44-45.
3.0 синтезе меланинов вибрионами /Гальцева Г.В., Либинзон
A. Е., Саямов Р. М. /. -//Вопр. теорет. и клин. медицины :Тез.докл.- Нальчик, 1979.- Вып.8 - С.165.
4. Конвертирующие свойства холерных фагов VIII типа /Дрогевкина М.С., Уилптин В.Н./.- //Ыикробисикжурн.- 1980, t.42.N4.-С. 508 - 512.
5. Способы отбора и делизогенизации лизогенных субкультур холерных вибрионов /Дрохевкина Ы. С./.- // Рукопись дел. во ВНИИМИ ИЗ СССР. N3408-80, Реф. 6: MPS. 1980, III, Н113315 ДЕЛ'.
6. Умеренные фаги холерных вибрионов /Дроаевкина Ü. С., Нилвтш
B.Н., Черкасова Л.P./.- //VI Всесовз. съезд кикробиол. общ-ва: Тез. докл. - Рига, 1980. -Т. 2. - С. 12.
7.Лизогенная конверсия у холерных вибрионов /Шшотин В.Н., Дрогевкина Ы. С., Киселева В. И. /. - II 2урн. микробиол., эпиде-миол-И имыунобиол. -1980. - N7. -,С. 18 - 21.
8.Способ получения мутантов холерных вибрионов /Дрогевкина М.С./.- Авторское свидетельство N704180 ИКИ С12К 1/00.- За-явл. 7.06.78; опубл. 7.07.81, Бюл. N27,- С. 279.
9.Индукция фатообразования у лизогенных штаюлэв вибрионов зль-тор./йакедонова Л. Д. /. - //Изв.Сев.Кавк. Науч.центра, выси, шк. Естеств. науки. - 1981. -N4.- С.78-79.
10. Популяционный состав лизогенных и нелизогенных аташов вибрионов эльтор /Дрогевкина М. С., Черкасова Л. Р., Киселева В. И. /. - // Изв. Сев. Кавк. Науч. центра, высш. пк. Естеств. науки.- 1982.-N1.- С. 78 - ВО.
11.Конверсия холерных вибрионов в Р - форму /Милптин В.Н., Дро-аевкина И. С., Черкасова Л. Р. /. - //Микробиол. аурн. - 1982.-Т. 44, N2.- С. 46- 49.
12.Пигсзнтные вггашы холерных вибрионов биотипа эльтор /Дрогев- ■ кина И. С. /. - //Эпидемиология, клиника, диагностика и профилактика антропонозных инфекций: Тез. докл. - Астрахань, 1982.- С.192 - 194.
13. Способ внутривидовой дифференциации штаммов холерных вибрионов биотипа эльтор /.—Авторское свидетельство на изобретение N1030410 МКИ C12Q 1/04 - Заявл. 18.12.81; опубл. 15.07.83,
• Бюл. N27. - С. 114.
14. Питательные потребности лизогенных иташюв вибрионов эльтор и их делизогенизированных вариантов /Дрожевкина ML С.. Богданова М. И. /. - //Изв. Сев. Кавк. Науч. центра, высш. ее Ес-теств. науки.- 1983.-Ml.- С. 101 - 103.
15. К усовершенствованно Фагодиагностики холергах вибрионов /Мороз В.П.. Остроумова H.H.. Шеркевич Д.Л. и др./.- //Рукопись дел. во ВННШ Ю СССР N3 6751-83. Реф. в : ИР* 1983. р. III. N12. 3721 ЛЕИ
16. Способ отбора лизогенных »таймов холерных вибрионов/. - Авторское свидетельство на изобретение N940520 МКИ С12 15/00. -Заявл. 10.12.81: опубл. 30.06.84. Бил. N24. - С. 198.
17. Способ получения ауксотрофных мутантов холерных вибриоюв /Дрожевкина М.С., Богданова U.U./.- Авторское свидетельство на изобретение N982345 ЖИ С12К 5/00. -Заявл. 08.12.80:
. опубл.-07.06.84. Бюл. N24..-С. 198.
18. Таксономические основы разработки методов фагодиагностики НАГ-вибрионов /Остроумова H.H., Коровкина Г.И., 1ароз В.П./.- //Рукопись деп. во ВНИИМИ Ш СССР НД 744984. Реф. в: MPS, 1984. р. III. N7. 2655 ДЕП.
19. Изучение лизогении у Л-форм холерных вибрионов /Ломов D.M./. - //Матер. Всесооз. симпоз.. посвящ. 60 летаю Тбмл. НИИ вакцин и сывороток.-Тбилиси, 1984.- С. 62 - 65.
20. Усовершенствование методики выявления спонтанной фагопрадук-цин у НАГ-вибрионов /Воронежская Л.Г.. Черкасова Л.Р./.-//Натер. Всесооз. симпоз., поевзд. 60 летию Тбил. НЖ вакцин и сьшороток.-Тбилиси, 1984.- С. 56 - 59.
21. Сохранение умеренных фагов холерных вибрионов методой лиофи-лизации /Македонова Л.Д., Король В.В., Кадетов В.В.А- //Матер. Всесооз. - симпоз., посвяц. 60 летип Тбил. НИИ вакцин и сывороток. -Тбилиси, 1984. - С.140 - 142.
22. Факторы, влияющие на трансдуцирущую активность холерных фагов /Богданова М. И./. - // Обл. науч. практ. кокф. по проблеме "Холера": Тез.докл.-Ростов н/Д. 1984.-С. 161 - 163.
23. К таксономии фагов микроорганизмов V. cholerae не 01 группы /Остроумова Н.М., Агапова З.И., йороз В. П. Л - //Генетика и мккробкол.природноочагов. инф. -Саратов, 1984.- С.52 - 55.
24. Изучение стабильности фаготипов у холерного вибриона /Арутэ-нов D. И., Бичуль К. Р. /. - //Генетика и ыикробиол.природноочагов. ннф. -Саратов, 1984.- С. 64 - 65.
25. Трансдуцирущие фагн холерных вибрионов//УН съезд кикро-бкологов: Тез.докл.- Алиа-Ата, 1985.- С. 19.
26 Phagua 53(Ф424) для идентификации вибрионов 039 серовара /Воронежская Л.Г./. Авторское свидетельство на изобретение ÍÍ1307848 1ÜW C12ÍÍ 7/00.- Заявл.17.06.85.
27. Современные дгнк^е по таксономии фагов гяясроорганизшв V. choleras не 01 группы /Остроушва H.ÍI., Гяроз В. П. /. -//Рукопись деп. во ВИНИТИ N3378-13-86, 1988. Реф. в: Р2 Бко-логия, 1988.- N9510 ДЕП.
28. Utzlh бактерий V. choleras el tor, используем в качестве индикатора для ускоренной идентификации лкгогенных стрептони-цинчувствительных птамиов холерного вибриона эльтор/. -Авторское свидетельство на изобретение N1387413 ПШ С12Г1 15/00.-Заявл. 23.08.88.
29. Причины фагоустойчдаостн холерных вибрионов /Черкасова Л.Р./.- //Рукопись деп. ВО ВИНИТИ Н7243-1340, 1SS3.
30. Умеренный фаг как генетическая иетка пта^яэ НАГ-внбрконов 056 серсзара /Остроумова Н.И., Трусева О.С., &зроз В. П. и др. /. - /ЛЬл. биол. и иккробиол. . прнродксочагоЕых инфекций.- Саратов, 1986.-С. 121- 127.
31.1'орфология вирисна и антигенная спец!ф{чность фагоз шгкрсор-ганизтв V. choleras не 01 группы /Остроумова Н. L!., Конноз Н.П., Зкнина О.С./.- //Рукопись деп. во ВИНИТИ 29.08.86. Й6259-В. Реф. в: Р2 Биология. - 1986.- М12Б405 ДЕЛ.
32. Система тест-культур для определения серологической принад-
. легкости микроорганизмов вида V. choleras методой профаготи-пирования /Остроумова H.H., Зинина О.С., Мороз В. П. /. - //Рукопись деп. во ВИНИТИ N6258- В. 16. Реф. в: PS Биология. -1986.- 1112Ц168 ДЕП.
33.Способ внутривидовой дифференциации холерных вибрионов зль-тор /. - //Изобретательство и .рационализация в медицине. И., . 1987.- С.103 - 105.
34. Способ хранения холерных фагов /йакедонова Л.Д., Кадетов
B.В./. Авторское свидетельство на изобретение N1296578 МКИ С12 N 7/00. - Заявл. 25.03.85; опубл. 07.02.87, Вол. п10.<-
C. 114.
35. Изучение роли водного фактора в распространении заболеваний, вызванных холерными вибрионами не 01 группы с использованием серо- и фаготипирования /Зайденов А.И., Новиков Д.Н., Воро- . неаская JI. Г. /. - //1урн.микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.-1987.-N7.-С. 28 - 31.
36. Трансдуцирупцие < фаги кщш вибрионов эльтор /Черкасова Л.Р./.- //Изв.Сев.-Кавк. Науч.центра, выси. тс. Естеств. науки. - 1987.- Ц1. - С.97 -100.
37. Фаги внеяней среды, активные в оттенки вибрионе» не 01 группы /Македонова Л. Д.. Черкасова Л. Р. А -// Лаб. дело. -1988. -т. - С.63 - 65.
38. Поиск умеренных fare» V. choleras 06, 024, 037. 042. 043 и некоторых других 0-сероваров /Зинмма О.С., Мороз В.П., Остроумова Н.М. и др. /.- //Микробиология и биохимия ООН - Сара-.ТОВ.1988.- С.83.- 87.
39. Использование мутантов холерных вибрионов в системе фаг -бактерия /.-//Актуальн.вопр. микробиол.,лаб. диагностики и профилактики холеры :Тез.докл. -Ростов н/Д, 1968.- С.189-191«
40. Тестирование люагенных штаммов вибрионов эльтор по свойствам переносишх умеренных фагов /Черкасова Л,Р.. Иакедонова Л. Д. /. -//Актуальн. вшр. микробиол.. лаб. диагност»« и профилактики холеры : Тез. докл. -Ростов н/Д, 19®.- С. 185-189.
41. Взаимодействие стрептошцинрезистентных еташов вибришов эльтор с холерными фагами /Новосельцев Н.Н., Черкасова Л. ?./.- //Современные пробл. антибиотш>резистентности: Тез. докл. -М., 1888. ~ С. 22 - 23.
42. Штамм бактерий V. choleras el tor - источник угзарашзго фзга II серотнпа VIII гетероишунной категории /Остроумова И. й., ?,!ороз В. П.,,. Коровкина Г. И. и др. /. - Авторсзаэа свидетельство на изобретение И1533331 Ш С12 N 7/00,- Запал. 18.01.88.
43.Умеренные холерные фаги II серотипа и их значение для внут-
ривидовой дифференциации холерных вибрионов 01 серовара /Остроумова Н. , Караваева Т. Б., Корошшна Г. И. и др. /. -//Рукопись деп. во ВИНИТИ N5188- В. 89. ДЕЛ.
44.Выживаемость фагов холерных вибрионов не 01 группы при воздействии инактивирукцих веществ /Ушакова НЕ., Иакедонова Л. Д. /. - //Эпидешгал.. микробиол. и иммунол.бактер. и вирусных инфекций: Тез. докл. -Ростов н/Д. 1989,- С. 134 - 136.
45.Лизогенкя холерных вибрионов.полученных из коллекции института Пастера (Франция), и свойства продуцируемых фагов Л,!аке-донова Л. Д.. Черкасова Л. Р., Дудкина 0. В. /. - //Вестн. Всесо-оз. микробиол. общества. - Ростов н/Д. 1989. - Внп.1.- С.81 -65.
4.6. Значение умеренных фагов II серотипа для внутривидовой дифференциации холерных вибрионов 01 серовара /Караваева Т. Б., Остроумова Н. Н., Коровкина Г. И. /. - //Зпиде:с:ол., микробиол. и кммунобнол. бактер. и вирусных инфекций: Тез. докл. - Ростов н/Д, 1989.- С.177 - 180.
47. Микробиологическая характеристика и гнтерспатогенные свойства пта-.с.'ов неагглотинирущихся вибрионов, изолированных от людей на территория Каракалпакской АССР /Седина С. Г., Кенае-баев А. Я.. Сабиров Р. С. и др. /. - //Вестн. Каракалпак, филиала
" АН Уз. ССР. -1989.- N3.- С. 53 - 58.
48. Способ дифференциации лкзогенных птаиаов холерных вибркокоа Л!зкедонова Л. Д., Черкасова Л. Р. /. - Авторское свидетельстве
. на изобретение N1578189 ША С12 N 1/20.- Заявл. 18.05.88; опубл. 15.07.90, Бил. N28. - С. 100.
49.Етаг.сд бактерий У. сЬо!егае 042 серовара, используемый для получения вирулентного фага 781 (781В) С-170 /Остроумова Н. I!.. Мороз В. П., 3!Ш!!на 0. С. и др. /. - Авторское свидетельство нз изобретение М1405298 !ЖИ С12 N 1/20.- Заявл. 7.04.88: опубл. 15.07.90. Бол. N22. -С. 279.
50.Штамм бактерий V. сйо!егае 042 серовара, используемый в качестве индикаторной культура для выявления умеренного фагг 042/1 серовара и его вирулентных мутантов /Остроумова Н.М., Мороз В. П., Зкнина 0. С. и др./ - Авторское свидетельство кг изобретение N1391090 15КИ С12 1/20, 7/00.- Заявл. 16.04.88; опубл. 30.04.90, Бол. N16. - С. 81.
51. Умеренные фаги холерных вибрионов 039 серовара и их таксона-
мическая характеристика /Остроумова H. М., Македонова Л.Д. /. - //Лаб. диагн.и генетика вирулентности возб. 00И.- Саратов, 1990. - С. 47 - 52.
52. Сравнительное изучение холерных фагов, изолированных из открытых водоемов и ли'зогенных штаммов вибрионов ЗльТор /Маке-донова Л. Д., Черкасова Л.Р. ; Дегтярев Б. Ы. /. - //Гигиена и санитария.-1990. - N5.- С. 7 - 9.
53. Получение прототрофных штаьйшв Vibrio cliolerae путем трансакции /Черкасова Л.Р., Макэдонова Л.Д./.-//Журн.микроби-ол., эпидемиол. и иымунобиол.- 1990.-N2. - С. 110 - 111.
54.'Холерные фаги /Ломов С.У., Соаова А.Г./.- //Ростов н/Д, 1930." 159С.
55.Изучение фагорезкстентнах стачав холерных вибрионов на ли-зогеншо и наличие vct-гена /Власов В. П., Черкасова Л. Р., !!а-келонова Л.Д. и др./. - // Бактериальные плззг.нди:Тез. докл. - Нальчик, 1980.- С.40 -41.
56. Ста;и V. albensis - продуцент gara /Сагсэз С. Р./-Авторское . свидетельство на изобретение N1633448 LCií CÍ2 î! 7/СО. - Запел. 22.02.89; опубл. 22.11.90, Б-ол. ГШ. - С.ЕО.
57. Морфология ковах фагов светящихся вибрионов /Casas С. Р. / -//05л. науч.-техн. конф., посзязц. Дна радио: Тез. дсйсл. -Ростоз н/Д, 1991. - С.40.
58. Электронно кйфоскопичасксе исследование гало&шьнж фагов /Дегтяраз Б. Î1 /. - //05л.науч. -техн. коиф., посегд. Дна радио: Тез. докл.-Ростов н/Д, 1991. - С.-13.
59. Способ обнаружения фагов в лигогениах игг^лах холзрних вибрионов /Ыакедонова Л.Д., Черкасова Л.Р., Дудкша 0.В./'.-//Лаб. дело. -1991. - N2. - С. 58 - 57.
60. Лиофилизация фагов холерных вибрионов 01 и не 01 групп /tía-кедснова Л.Д.. Кадетов В.В., Наталич Л. Д. /. - //Пробл. криобиологии.-1991.- N2. - С. 34 - 40.
61.Фаги II серотипа и их значение для внутривидовой дифференциации холерных вибрионов 01 серовара /Остроумова Н. I!., Караваева Т. Б.. Корозкина Г.И. и др. /. - //Актуальные пробл. и задачи биохимии, диагностики и иммунопрофилактики ОСИ.-Саратов, 1991. - С. 95 - 101.
62. Способ идентификации V.albensis /.- Авторское' свидетельство на изобретение N1778188 МКИ С 12 Q 1/04. - Заявл. 21.09.90;
опубл. 1.08.92, Бвл. N44. С. 71.
63. Штамм бактерий V. cholerae eUor - источник умеренного фага, XI серотипа, XII гетероиммунной категории /Македонова Л. Д., Мороз В. П., Коровкина Г. И. и др. /. - Авторское свидетельство на изобретение N1623205 ИКИ С12 N 7/00.- Заявл. 11.07.89; опубл. 15.03.92, Бвл. N10.-С. 90.
64.Криоконсервация холерных фагов /Кадетов В.В., Дудкина О.В., Терентьев А. Н., Дегтярев Б. Н. /. - //Успехи современной криобиологии; Тез. докл. II меадународ. конф.-Харьков. 1992. - С. 75
- 76.
65. Фагочувствительность пташгав холерных вибрионов, изолированных из иммунного организма /Хануньян Т.А., йакедонова Л.Д./. - //Холера:Натер.Рос. науч.конф.-Ростов н/Д. 1992. -С: 138 -139.
66. Профагоносительство и фаголизабельность холерных вибрионов, выделенных в очаге холеры на Украине /Македонова Л. Д., ®е-цайлова 0.П.. Дудкина 0.В.. Евтеева Е.И/. -//Холера:Матер. Рос. науч. конф.-Ростов н/Д. 1992. - С.133- 136.
67.Фаги галофильных вибрионов и их применение /Накедонова Л.Д.. Дудкина 0. В.. Дегтярев Б. И. и др./. - //Вурн.микробиол.. эпи-демиол. и иимунобиол. - 1992.-R9-10. - С. 5 - 8.
68. Лизогения парагешлитических вибрионов 04: К12 серовара /Накедонова Л.Д., Дудкина О.В.. Хайтович A.B. и др./. - //Никро-биол. аурн. -1992. - Т. 54. N8.- С. 45 - 49.
69. Изучение фагов, продуцируемых vct'-лизогенными птамыаш вибрионов зльтор. для дифференциации vet* и vet" пташов /Остроумова Н.Н.. Накедонова Л.Д.. Евтеева Е.И. и др./.- //Генетика и биохимия- вирулентности особо опасных инф.: Тез.докл.-Волгоград, 1992. - С. 157.
70. Оптимизация процесса повышения литической активности монофагов холерных типируицих 1-7 /Тюлеибаев U.A., Тлеугабылова A.M., Апсатаров P.A. и др./.-//Холера:Матер. Рос.науч.конф. -Ростов Н/Д. 1992. - С. 176 - 178.
71. Биологические свойства фагов галофильных вибрионов, выделенных из прибрежной зоны Азовского и Черного шрей /Македонова Л.Д., Хайтович А.Б.. Савченко Б.И. и др./.-// там ае.- С. 151
- 155.
72. К вопросу усовершенствования технологии изготовления монофа-
гов диагностических холерных типирущих 1-7 /Тюлембаев М. А., Тлеугабьшова А.М.. Разумкова В.Ф. и др./. - // там же. -С.178 - 181.
73. Вспышка холеры в г. Вилково Одесской области в 1991 г /Моск-витина Э. А., Ломов Ю. М., Голубев Б. П. и др. /. - // там se. -С. 44 - 47.
74. Характеристика штаммов холерных вибрионов, выделенных на Украине в 1991г/Ломов D.M., Шестиалтынова И. С., Фецайлова О.П. и др./. - // там se. - С.71 -73.
75.0 циркуляции холерных вибрионов на территории СССР в 1987-1991 годы /Подосинникова Л.С.. Воронеаская Л.Г., Лобанова Л.Н. и др./.-// там се .- с.67 - 71.
76. Шрфология вириона и антигенная специфичность как таксономические критерии фагов V.ctiolerae не 01 группы /Остроумова Н. Ы.. Коннов Н. П.. Зинина 0. С. и др. /. - //Лробл. 00И. - Саратов. 1993.- N1-2. - С. 96 - 103.
77. Характеристика и распространение холерных вибрионов на территории СССР в 1987 - 1991г /Подосинникова Л. С.. Воронежская Л.Г., Лобанова Л.Н. и др./.- //Пробл.00И.- Саратов, 1993.-N1-2. - С. 50 - 56.
78. Элементы таксономии фагов микроорганизмов у V.cholerae не 01 группы /Остроумова Н.М., Мороз В.П., Зинина О.С./. //Пробл.00И.- Саратов. 1993.- N3. - С. 127 - 134.
79. Фаги Vibrio albensis /Саянов С.Р./..- //Микробиол. зурн.-1993. - Т.55, Н1.- С.53 -.57.
80. Холера на Украине и в Молдове в период седьмой пандеши /Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Москвитина Э.А. и др./.-//Зурн.микробиол.,эпидемиол. и иммунобисш.- 1993.- N1. -С. 52 - 56.
81. Поиск типирущих фагов галофильных вибрионов /Дудкина' О.В.. Накедонова Л.Д., Саямов С.Р. и др./.- //Современные аспекты природной очаговости, эпидемиол. и профилакт.00И:Тез. докл.науч.конф. - Ставрополь, 1993. - С.219 - 220.
82.0 генетической связи представителей Vibrio cftolerae /Гальце-ва Г. В., Леванова Г. Ф., Либинзон А. Е.. Ус 3. И. /. - //там же. - С.187 - 189.
83. Серологические свойства фагов галофильных вибрионов /Дудкина О.В., Македонова Л.Д., Евтеева Е.И. и др./.- //Иммунология и
спец. профилактика 00И: Натер. Рос. науч.конф.- Саратов. 1993.- С. 257.
84. Изучение биологических свойств холерных фагов и штампов вибрионов эль тор. выделенных из внесней среды Донецка /Евтеева Е.И., Македонова Л. Д., Саямов С. Р. и др./. - //Гигиена и санитария.-1993. - N12.- С. 14 -17.
85.К совериенствованип препарата фага специфического действия в отношении vet* отаммов эльтор /Цороз В. П., Коровкнна Г. И., Остроумова H.H. и др./.- //Рукопись деп. во ВИНИТИ 14.10.94 N2369- В. 94.
88.Оптимизация лиофнльного высупивания холерных фагов /Кадетов В. В.. Македонова Л. Д.. Дудкина 0. В.. Терентьев А. Н. /. -//Изв. Сев.-Кавк. Науч. центра. Выса.пк. Ест. науки.-1994. -N1,- С. 12 - 17.'
87. Характеристика птаммоз холерных вибрионов, выделенных в 1993 году от лздей, по чувствительности к холернш диагностическим фагам /Македонова Л.Д.. Евтеева Е.И., Качкдаа Г.В./. - // Сб. науч.тр.- Новороссийск, 1994.-Вып.1.- С.150 - 152.
88. Основные критерии для отбора фагов патогенных бактерий, Еклэчаемых в коллекцию депозитарий /Накедонова Л. Д., Гурлева V.T./.-// там se.- С. 153- 155.
89. Лизогенга холерных вибрконоз 0139 серозара /Накедоноза Л.Д., Евтеева E.H., Сая:,'х>в С.Р./. - //там se. - С. 152 - 153.
90. Соворпенстговакие фагоднагкосткки атшичных птехг'-ов холерных вибрконоз /Македонова Л.Д., Черепахина И.Я., Огнева Н.С., Качкша Г. В. /. - //Актуальные вопр. разработки шкребкол. питательных сред и тест - систем: 1'атер. дсхл. Всерос. науч.-практ. конф.-Махачкала, 1994.- С.57.
91.Тест-система для ветвления фагоз холерных вибрионов, серологически родственных Фггги светящихся в:;бркоков /Накедоиоза Л.Д.. Саямов С.Р. /.- // там па. - С. 155.
92. Фаготипировгнпе галофильных вибрионов, выделенных в г.Бердянске /Нгкедоноса Л. Д., Евтеева Е. И., Качкжа Г. В. /. - //Актуальные вопр. профилактики чуня и других инфекционных заболеваний: Матер, ыелгосудар. научно-пргктичеекзй кокф., пос-вкг». 100-летиз открытия чумы. - Ставрополь, 1894.- С/135 -136.
93. Характеристика фагорезистентных Етазжов холерных вибрионов
по носительству специфического фага /Македонова Л. Д./.- // там se. - С. 136 - 137.
94.Селекция пигментных вариантов из штаммов холерных вибрионов 0139 серовара и лизогенизация их холерным фагом /Мишанькин Б. Н.. Шиманш Н. Я., Македонова Л. Д. и др. /. - //там se. -С. 137 - 138.
95.Значение бактериофагов в идентификации парагемолитических вибрионов /Македонова Л. Д., Евтеева Е. И., Качкина Г.В. и др./.- //там ае. - С.143 - 144.
96.Случай завоза на территории России холеры, вызванной новым сероваром /Ломов JD.М., Мазрухо Б. Л., Мишанькин Б. Н.. Авроров
B.П. и др./. - //Журн.микробиол.,эпидемиол. и иммунобиол. -1995.- N2. - С. 97 -101.
97.Причины устойчивости холерных вибрионов к диагностическим фагам/Черепахина И.Я., Алексеева JI.П., Македонова Л.Д., Евтеева Е. И. и др./.-//Микробиол. журн.-1995.- Т.57, ЫЗ. -
C. 57 -64.
98. Некоторые особенности Vibrio cholerae, выделенных в Дагестане в 1994 г. /Подосинникова Л. С., Мазрухо Б.Л., Ломов Ю.М. и др./.- // 2урн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.- 1995.-N2. - С. 74 -78.
99. Характеристика холерных вибрионов ' выделенных в "некоторых ■ странах СНГ в 90-е годы /Подосинникова Л.С., Ломов Ю. М.,
Власов В. П. и др. /. -// Холера: Матер. Рос. науч. - практ. конф. по пробл."Холера" 25 - 26 апреля 1995 года. Ростов н/Д, 1995. - С. 76 - 77.
100. Характеристика культур холерных вибрионов, выделенных на территории России в 1994 году /Огнева Н.С., Пономарева Т.Н., Кюрегян А. А. и др. /. - //там se. - С. 80 - 86.
101. Применение диагностических препаратов холерных фагов при бактериологическом обследовании очагов холеры /Македонова Л.Д., Качкина Г.В./.- //там ае.-С. 112 - 115.
102.Лизогенные системы и свойства умеренных фагов V. cholerae 0139 серогруппы /Остроумова Н. М., Мороз В. П., Синичкина Н.А. и др./. - //там se. - С. 130 - 131.
103.Отбор новых холерных фагов, активных в отношении неэпидемических штаммов холерных вибрионов /Македонова Л.Д., Качкина Г. В. /. - //там же. - С. 132 - 133.
-
Кудрякова, Татьяна Александровна
-
доктора медицинских наук
-
Ростов-на-Дону, 1996
-
ВАК 03.00.07
- Характеристика биологических свойств бактериофагов холерных и парагемолитических вибрионов
- Сравнительное изучение и совершенстование некоторых методов идентификации вирулентных штаммов холерных вибрионов
- Антигенные свойства и серотипирование новых штаммов неагглютинирующихся вибрионов
- Лектиновые рецепторы холерных вибрионов
- Гемолитическая активность токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов различных серогрупп
