Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гемолитическая активность токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов различных серогрупп

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Меньшикова, Елена Аркадьевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Гемолизины бактерий.

1.2. Роль ионов железа в продукции гемолизинов.

1.3. Гемолитическая активность холерных вибрионов.

1.4. Влияние условий культивирования на продукцию гемолизина холерных вибрионов.

1.5. Генетическое детерминирование синтеза гемолизина.

1.6. Гемолизин холерных вибрионов. Получение и свойства.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Бактериальные штаммы.

2.2. Питательные среды.

2.3. Методы изучения гемолитической активности.

2.4. Оценка биологической активности супернатантов холерных вибрионов.

2.4.1. Использование монослойных перевиваемых клеточных культур.

2.4.2. Использование модели кроликов-сосунков.

2.4.3. Использование кожной пробы Крейга.

2.5 Получение и характеристика гемолизина холерных вибрионов.

2.5.1. Получение гемолизина холерных вибрионов.

2.5.2. Электрофорез в полиакриламидном геле.

2.5.3 Количественное определение белка.

2.6. Получение иммунных сывороток к препаратам гемолизина холерных вибрионов.

2.7. Изучение препаратов гемолизина в иммуноблотинге.

2.8. Диффузная иммунно-преципитация по Ouchterlony.

2.9. Статистическая обработка.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ

АКТИВНОСТИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ РАЗЛИЧНЫХ

СЕРОГРУПП И ТОКСИГЕННОСТИ.

3.1. Изучение гемолитической активности токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов eltor и 0139 серогруппы.

3.2. Изучение влияния условий культивирования на интенсивность гемолитической активности токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов eltor и 0139 серогруппы.

ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ТОСИГЕННЫХ И НЕТОКСИГЕННЫХ ШТАММОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ, КУЛЬТИВИРУЕМЫХ НА РАЗЛИЧНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ.

4.1. Тестирование супернатантов токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов, культивируемых на различных питательных средах, на модели перевиваемых клеточных культур.

4.2. Влияние среды культивирования на экспрессию биологически активных факторов холерных вибрионов eltor и 0139 серогруппы на модели кишечника кроликов-сосунков.

ГЛАВА 5. ПОЛУЧЕНИЕ И СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕМОЛИЗИНА ТОКСИГЕННЫХ И НЕТОКСИГЕННЫХ ШТАММОВ

ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ РАЗЛИЧНЫХ СЕРОГРУПП.

5.1. Получение и характеристика препаратов гемолизина холерных вибрионов эльтор и 0139 серогруппы, выращенных в условиях дефицита железа.

5.2. Изучение спектра гемолитической активности препаратов гемолизина токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов различных серогрупп.

5.3. Получение сывороток и изучение серологической специфичности препаратов гемолизина токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гемолитическая активность токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов различных серогрупп"

Актуальность проблемы.

Выделенные впервые от человека в 1905 году вибрионы eltor отличались от возбудителя классической холеры способностью лизировать эритроциты различных видов животных и были отнесены к непатогенным. Разработанный в 1914 Greig метод обнаружения лизиса холерными вибрионами эритроцитов барана в питательном бульоне стал основным тестом дифференциации классических холерных вибрионов от вибрионов eltor, не имеющих эпидемического распространения и вызывающих в Юго-восточной Азии заболевания, отнесенные по мнению Генеральной Ассамблеей ВОЗ 1958 года к «нехолерным» (Коробкова Е.И., 1959).

В 1962 году был описан негемолитичный вариант вибрионов eltor (Vibrio eltor var. Anliaemolyticus) как возбудитель холеры в Ириане на западе Новой Гвинеи (De Moor, 1963, Gallut, 1974). Именно он получил впоследствии пандемическое распространение и был признан новым возбудителем эпидемической холеры. С появлением негемолитичного варианта вибрионов eltor тест гемолитической активности утратил свое значение в дифференциации холерных вибрионов, двух биоваров. Однако, сведения о широком распространении гемолитичных вибрионов eltor в водоемах благополучных по холере территорий обострили обсуждавшийся ранее (Бичуль К.Г., Либинзон А.Е., Сомова А.Г. и др., 1968) вопрос о существовании патогенных и непатогенных вибрионов eltor, и в 1971 году Адамов А.К. и Быстрый И.Ф. предложили тест гемолитической активности в сочетании с отношением вибрионов к холерным диагностическим фагам для оценки вирулентности вибрионов eltor.

Рядом авторов (Мишанькин Б.Н. с соавт.; 1982; Семиотрочев В.Л., 1990г.) было высказано мнение о взаимодействии гемолизина и холерного токсина на уровне их экспрессии. Позднее была предложена формула эпидемического варианта холерных вибрионов - ctx+Hly~ (Подосинникова

Jl.С., 1993г. и др.). В связи с этим определение гемолитической активности в настоящее время используется в качестве ориентировочного теста для оценки эпидемической значимости холерных вибрионов.

Однако, среди нетоксигенных холерных вибрионов, выделямых из водоемов России, нередко (в 3-10%) обнаруживают штаммы, негемолитичные по фенотипу (Кюрегян А.А., Иванова С.М., Мазрухо Б.Л. и др., 2002). В то же время на эндемичной по холере территории Мексиканского залива (США) из клинического материала и водоема выделен гемолитичный токсигенный вариант вибриона эльтор (Barret Т.J., Blake P.А., 1984).

Изучение препаратов гемолизина выделенных из разных штаммов холерных вибрионов (J.A.Watanabe, W.F.Verwey 1966), Honda Т., Finkelstein R.,1979; Романова Л.В., Родионова А.В.,1983; Yamomoto К. et al. (1986) показало, что авторы единодушны лишь в том, что полученные ими гемолизины термолабильны и лизируют эритроциты различных видов животных, а молекулярная масса колеблется от 20 до 80 кДа (Телесманич Н.Р.,1996).

Есть мнение (В.Л. Семиотрочев с соавт., 1988 и др.) о выработке холерными вибрионами гемолизинов двух типов (I и II), различающихся по спектру литической активности эритроцитов разных видов животных, и двух подтипов (а и (3) с различной скоростью синтеза (2 - 24 часа). По данным Осауленко О.В. (1984), токсигенные штаммы способны синтезировать гемолизин II типа, нетоксигенные - гемолизин I типа подтипа р. В.Л. Семиотрочев (1990) предложил рассматривать гемолизин I типа подтипа (3, холерных вибрионов нетоксигенных штаммов, как альтернативный холерогену токсин, обусловливающий энтеропатогенное действие. Однако известно, что далеко не все гемолитичные нетоксигенные штаммы холерных вибрионов, которые, по мнению приведённых выше авторов, должны, как нетоксигенные холерные вибрионы, продуцировать гемолизин I (3, обладают энтеропатогенной активностью.

Известно, что холерные вибрионы, независимо от их серогруппы, биовара и токсигенности, имеют в своем геноме локус, гены которого кодируют синтез гемолизина (Manning Р.А. et al., 1984; Goldberg S.L., 1985; Власов В.П. с соавт., 1992 и др.). Обнаружен он и у нового варианта возбудителя холеры - холерных вибрионов 0139 серогруппы (А.В. Осин с соавт., 2000г.). Клонирование этого участка хромосомы выявило в составе локуса наличие структурного и регуляторного генов.

Рядом авторов описана зависимость экспрессии гемолитической активности от условий культивирования, температуры и состава питательных сред, (Honda Т et al., 1979; Тафелыитейн Э.Е., Блинова JI.C., 1979). Stoebner J.B. et al. (1986) обнаружил, что синтез гемолизина холерными вибрионами стимулирует отсутствие ионов железа в среде культивирования. Однако, проблема различий в экспрессии гемолитической активности холерными вибрионами токсигенных и нетоксигенных штаммов остается невыясненной. Актуальность ее очевидна в связи с использованием теста на обнаружение гемолитической активности при эпидемиологическом надзоре за холерой в качестве наиболее простого и доступного способа ориентировочной оценки эпидемической значимости штаммов.

Цель работы

Сравнительная характеристика гемолитической активности ctx+ и ctx" штаммов холерных вибрионов eltor и 0139 серогруппы в различных условиях культивирования и выявление особенностей ее экспрессии.

Основные задачи исследования:

1. Изучение литической активности супернатантов бульонных культур токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов eltor и 0139 серогруппы по отношению к эритроцитам различных видов животных.

2. Изучение проявления гемолитических свойств холерных вибрионов в различных условиях культивирования, в том числе в условиях дефицита железа.

3. Тестирование супернатантов токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов, полученных в различных условиях культивирования, на модели перевиваемых клеточных культур.

4. Получение и сравнительная характеристика гемолизина токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов, выращенных в условиях дефицита железа.

Научная новизна и теоретическая значимость.

Показано, что экспрессия гемолитических свойств ctx" штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы менее выражена и реже выявляется, чем у аналогичных штаммов вибрионов эльтор. Обнаружены сезонные колебания в проявлении гемолитической активности этих штаммов и более выраженное проявление ее в весенний и осенний периоды года.

Установлено, что ctx+ штаммы холерных вибрионов eltor и 0139 серогруппы в триптоновой питательной среде без FeCb продуцируют гемолизин, обладающий одинаковым спектром литической активности по отношению к эритроцитам различных видов животных, биологическим и серологическим сходством с гемолизином ctx" штаммов.

Выявлена зависимость синтеза гемолизина ctx+ штаммами холерных вибрионов от концентрации FeCb в среде культивирования, что свидетельствует о индуцибельности экспрессии гемолитической активности у токсигенных штаммов и коррелирует с представлениями об индуцибельности клеточных систем поглощения железа.

В супернатантах ctx+ штаммов холерных вибрионов, выращенных в триптоновой питательной среде без FeCb, способствующей активной продукции ими гемолизина, наряду с последним, обнаружено присутствие в незначительном количестве холерного токсина. Показано, что культивирование ctx+ штаммов холерных вибрионов в условиях, альтернативных для оптимальной продукции холерного токсина или гемолизина, определяет при заражении кроликов-сосунков характер патологического процесса, обеспечивая соответственно проявление холерогенного или энтеропатогенного синдромов.

Данные о повышении ctx+ штаммами холерных вибрионов синтеза гемолизина и понижении концентрации холерного токсина в условиях дефицита железа (FeCb) являются основанием для обсуждения механизма координированной регуляции синтеза токигенными штаммами холерогена и гемолизина в зависимости от условий среды обитания.

Научно-практическая ценность работы.

Впервые получены и охарактеризованы препараты гемолизинов, продуцируемых ctx+ штаммами холерных вибрионов eltor и 0139 t серогруппы. Показана идентичность серологических свойств и спектра литической активности гемолизинов ctx + и ctx" штаммов холерных вибрионов, культивируемых в триптоновой питательной среде без FeCl3.

Выявлено ингибирующее действие FeCb на экспрессию, в отличие от ctx" штаммов, гемолитической активности ctx+ штаммов холерных вибрионов. Показано различие в концентрациях FeCb в питательной среде, ингибирующих экспрессию гемолитической активности токсигенных штаммов холерных вибрионов eltor и 0139 серогруппы.

Полученные результаты могут быть использованы в дальнейшем совершенствовании теста определения гемолитической активности для оценки эпидемической значимости штаммов с лимитированием питательной среды для пробы Грейга по содержанию FeCb, что будет способствовать ее стандартизации и повышению воспроизводимости результатов.

Утверждены Ученым Советом РПЧИ (протокол № 6 от 5 июня 2000г.) методические рекомендации, «Дифференциация токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы по чувствительности к нормальной человеческой сыворотке», где для оценки изменения состава популяции холерных вибрионов под влиянием нормальной человеческой сыворотки использовали определение гемолитической активности холерных вибрионов на плотных питательных средах. Результаты оценки спектра литической активности гемолизина холерных вибрионов отражены в методических рекомендациях «Paramecium caudatum - как модель in vitro для изучения биологической активности токсических веществ различной природы», утвержденных Ученым Советом РПЧИ (протокол № 9 от 18 октября 2001 г).

Материалы исследований доложены на институтских научных конференциях и конкурсе научных работ молодых ученых Ростовского-на-Дону государственного научно-исследовательского противочумного института в 1998, 2000, 2001, 2002 годах. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, в том числе и в центральной печати.

Положения, выносимые на защиту.

1. Способность холерных вибрионов eltor и 0139 серогруппы лизировать эритроциты барана и других видов животных обусловлена уровнем синтеза секретируемого в окружающую среду гемолизина, в связи с чем низкий уровень синтеза гемолизина холерными вибрионами ctx+ штаммов, в отличие от ctx", в общепринятых условиях культивирования обеспечивают лизис только эритроцитов морской свинки, чувствительных к малым количествам гемолизина.

2. Экспрессия гемолитической активности токсигенными штаммами холерных вибрионов eltor и 0139 серогруппы зависит от условий их культивирования. Дефицит FeCb в питательной среде индуцирует продукцию ctx+ холерными вибрионами eltor и 0139 серогруппы гемолизина, лизирующего эритроциты барана, как и гемолизин ctx" штаммов обеих серогрупп.

3. Препараты гемолизина ctx+ и ctx" штаммов холерных вибрионов эльтор и вибрионов 0139 серогруппы, полученные в условиях культивирования в питательной среде без FeCb, обладают биологическим и серологическим сходством и одинаковым спектром литической активности по отношению к эритроцитам различных видов животных.

4. При культивировании в условиях дефицита FeCb в супернатантах ctx+ штаммов холерных вибрионов эльтор и 0139 серогруппы одновременно с гемолизином обнаружено присутствие холерного токсина в незначительном количестве.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 15 научных работ.

Структура работы: диссертация состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающих 185 цитируемых работ, в том числе 112 - зарубежных. Общий объем диссертации составляет 133 страницы. Текст иллюстрирован 20 таблицами и 8 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Меньшикова, Елена Аркадьевна

ВЫВОДЫ:

1. Гемолизотрицательные по отношению к эритроцитам барана в тесте Грейга ctx+ штаммы холерных вибрионов эльтор и 0139 серогруппы способны лизировать эти эритроциты в других условиях культивирования: снижении рН сред, использовании сердечно-мозгового настоя с 3% глицерина, культивировании на плотных питательных средах.

2. Гемолитические свойства ctx" штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы выявляются непостоянно и менее выражены, чем у аналогичных штаммов вибрионов эльтор. Обнаружены сезонные колебания их гемолитической активности и более интенсивное проявление в весенний и осенний периоды года.

3. Экспрессия ctx+ штаммами вибрионов эльтор и 0139 серогруппы гемолитической активности в пробе Грейга при культивировании в условиях дефицита FeCb свидетельствует о способности токсигенных штаммов холерных вибрионов продуцировать гемолизин, лизирующий эритроциты барана в пробе Грейга. Показаны различия в концентрациях FeCl3, инги-бирующих в питательной среде синтез гемолизина токсигенными штаммами холерных вибрионов eltor и 0139 серогруппы.

4. Препараты гемолизина, полученные из ctx+ и ctx" холерных вибрионов eltor и 0139 серогруппы в условиях культивирования на триптоновой питательной среде, не содержащей FeCl3 , обладают биологическим и серологическим сходством и имеют одинаковый спектр литической активности эритроцитов различных видов животных.

5. Иммунные сыворотки, полученные к гемолизинам ctx+ и ctx" штаммов холерных вибрионов eltor и 0139 серогруппы, образуют одну общую линию преципитации с гомологичными и гетерологичными препаратами полученных гемолизинов, что подтверждает их специфичность и иммунологическое сходство.

6. В супернатантах ctx+ штаммов холерных вибрионов eltor и 0139 серогруппы в условиях культивирования на триптоновой среде без FeCl3, способствующей активной выработке гемолизина, наряду с ним методом биологического тестирования и иммуноферментного анализа выявлено наличие незначительных количеств холерного токсина.

7. Культивирование ctx+ штаммов холерных вибрионов в условиях альтернативно обеспечивающих оптимальную продукцию холерного токсина или гемолизина, определяет характер патологического процесса на экспериментальной модели кроликов-сосунков с экспрессией соответственно холерогенного или энтеропатогенного синдромов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Оценка литичеекой активности токсигенных и нетоксигенных штаммов вибрионов эльтор и холерных вибрионов 0139 серогруппы по отношению к эритроцитам различных видов животных на жидких и плотных питательных средах показала, что ctx" штаммы вибрионов эльтор, лизирующие эритроциты барана в пробе Грейга, способны лизировать в этом тесте эритроциты и других видов животных. Популяция данных штаммов на уровне 300 и более клеток на плотных питательных средах однородна по этому признаку.

Однако, среди 35 изученных ctx" штаммов холерных 01 (eltor) вибрионов обнаружены три (№17479, 17480 и 2399), которые были гемолизотрицательны-ми не только в пробе Грейга, но и при изучении на агаровых пластинах с 2% эритроцитов барана на уровне 300-500 клеток их популяции.

Гемолитическая активность ctx" штаммов 0139 серогруппы и в количественном и в качественном отношении оказалась менее выраженной.

В отличие от аналогичных штаммов холерных вибрионов эльтор в пробе Грейга эритроциты барана лизировали не все ctx" штаммы V.cholerae 0139, а только шесть из 20 изученных. На плотных питательных средах Н1у+ клоны в популяции этих штаммов можно было обнаружить лишь на 2-3 сутки и при малом процентном содержании эритроцитов в среде. При этом выявлены, в отличие от ctx" штаммов eltor, и сезонные различия в экспрессии их гемолитической активности. Наибольшее количество штаммов среди изученных были гемоли-тичными в пробе Грейга в весенний и осенний периоды.

В отличии от ctx" холерных вибрионов ctx+ штаммы обеих серогрупп в общепринятых условиях культивирования не лизировали эритроциты барана в пробе Грейга, но лизировали в этом тесте эритроциты морской свинки и кролика. Известно (Kraus R., Pribram Е , 1906), что последние чувствительны к малым количествам гемолизина и этим, вероятно, обусловлен, при отсутствии способности у ctx+ холерных вибрионов лизировать эритроциты барана в пробе Грейга, различный спектр литической активности токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов разных серогрупп.

На плотных питательных средах ctx+ штаммы вибрионов эльтор и холерных вибрионов 0139 серогруппы лизировали в большинстве случаев эритроциты барана и имели неоднородную по этому признаку популяцию, в которой процент гемолизпозитивных клонов колебался в довольно широких пределах (от 13 до 31 у V.eltor и от 2 до 17 у V.cholerae 0139), что совпадает с наблюдениями других авторов (Мазрухо А.Б., Челядинова А.В., 1997, и др.).

Таким образом, сравнительное изучение показало, что ctx" штаммы вибрионов эльтор и холерные вибрионы 0139 серогруппы, культивируемые в общепринятых питательных средах, обладают более широким, чем ctx+ штаммы, спектром литической активности и лизируют эритроциты барана, наиболее устойчивые к действию токсина.

Наличие гемолизпозитивных по отношению к эритроцитам барана клонов в популяции ctx+ штаммов, гемолизнегативных в пробе Грейга, и присутствие hly-генов в их геноме свидетельствует о значении условий культивирования для проявления гемолитической активности холерных вибрионов и индуцибельно-сти синтеза гемолизина у этих штаммов. В результате поиска многочисленными авторами (Honda Т. et.al.; 1979; De Moor, 1963; Sen, 1970 и др.) оптимальных питательных сред и условий культивирования для выявления гемолитической активности холерных вибрионов было предложено использование сердечно-мозговых питательных сред, содержащих и не содержащих глицерин. Использование сердечного бульона с 3% глицерина в нашем эксперименте в два раза увеличивало количество выявленных гемолизпозитивных в пробе Грейга ctx" штаммов 0139 серогруппы, в отличие от вибрионов eltor с менее выраженной гемолитической активностью в бульоне Мартена. Культивирование в этих же средах ctx+ штаммов вибрионов эльтор и холерных вибрионов 0139 серогруппы также способствовало выявлению среди них гемолизположительных в пробе Грейга по отношению к эритроцитам барана штаммов, гемолизотрицатель-ных в бульоне Мартена.

Нами обнаружено, что снижение рН питательной среды до 7,0 не менее, чем в 50% способствует проявлению гемолитических свойств по отношению к эритроцитам барана у ctx+ штаммов не только вибрионов эльтор, но и холерных вибрионов 0139 серогруппы.

Выявлено также влияние температуры культивирования на продукцию гемолизина. Культивирование при 37°С не только стимулировало продукцию гемолизина у ctx" штаммов вибрионов eltor, но, что еще более важно, способствовало выявлению большего количества литических по отношению к эритроцитам барана штаммов среди ctx" холерных вибрионов 0139 серогруппы.

Усиление гемолитической активности гемолитичных V.eltor в средах с пониженным содержанием железа обнаружили Stoebner Y.A. и Payne S. (1988), однако влияние железа на проявление гемолитической активности ctx+ штаммов холерных вибрионов этими исследователями не описано.

Нашими исследованиями показано, что в результате культивирования в среде без FeCb все изученные штаммы вибрионов эльтор и холерных вибрионов 0139 серогруппы, независимо от наличия ctx-гена, оказываются способными лизировать эритроциты барана в пробе Грейга. Таким образом, нами обнаружено, что культивирование ctx+ штаммов холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп в этих условиях способствует продукции одинакового по спектру литической активности с ctx" штаммами гемолизина ctx+ штаммами вибрионов эльтор и холерных вибрионов 0139 серогруппы. Дозированное добавление в указанную среду FeCb показало, что гемолитическая активность ctx+ штаммов V. eltor перестает выявляться при концентрации этой соли в среде в количестве 10-14 мг/л, a ctx+ V.cholerae 0139 - 2-4 мг/л. По мнению ряда исследователей (Bergeron R.S., Weimar W.R., 1990; Sigel S„ Payne S., 1982; Stoebner Y.A., Payne S, 1988 и др.) системы поглощения железа индуцибельны. Их компоненты не синтезируются бактериями в условиях высокого содержания железа. Культивирование при низкой концентрации железа приводит к индукции синтеза сидерофоров и их рецепторов и активации синтеза гемолизина, что, вероятно, и имеет место при культивировании ctx+ холерных вибрионов в среде без FeCb.

Тестирование биологической активности ctx+ штаммов вибрионов эльтор и вибрионов 0139 серогруппы, выращенных в среде без FeCb, на модели перевиваемых клеточных культур по деструктивному действию в отношении эритроцитов барана, нейтрализуемому антигемолитической сывороткой, также подтвердило факт возможности синтеза этими штаммами гемолизина.

При этом было установлено, что в этих условиях культивирования ctx+ штаммы сохраняли одновременно с продукцией гемолизина способность к синтезу холерного токсина, что было подтверждено дополнительным тестированием супернатантов на наличие холерного токсина методом ИФА.

Заражение кроликов-сосунков культурами холерных вибрионов, выращенными в условиях дефицита FeCb, подтвердило значение условий культивирования для экспрессии биологических свойств и индуцибельность гемолитической и токсигенной активности холерных вибрионов ctx+ штаммов.

Заражение кроликов - сосунков ctx"Hly+ штаммами холерных вибрионов, выращенными в триптоновой среде без FeCb, способствовало усилению их энтеропатогенного действия в кишечнике кроликов-сосунков.

Токсигенные (ctx+) штаммы вибрионов эльтор и вибрионов 0139 серогруппы, культивируемые в той же среде, стимулирующей продукцию гемолизина, так же, как ctx" штаммы, вызывали у зараженных ими кроликов-сосунков развитие энтеропатогенного, а не холерогенного синдрома, в то время как предварительное выращивание их в среде AKI способствовало развитию у кроликов-сосунков холерогенного синдрома.

С целью сравнительной характеристики гемолизинов, продуцируемых холерными вибрионами обеих серогрупп в условиях дефицита FeCb, нами из супернатантов ctx+ и ctx" штаммов вибрионов эльтор и холерных вибрионов 0139 серогруппы, культивируемых в триптоновой среде без FeCb, были выделены препараты гемолизина с молекулярной массой белка 63-65 кДа, обладающие литической активностью по отношению к эритроцитам барана, и к ним получены антигемолитические сыворотки. Препараты гемолизинов, независимо от наличия ctx-гена и серогруппы штамма-продуцента, образовывали одну общую линию преципитации с антигемолигическими сыворотками к гемолизинам V.cholerae поп 01, 01 (эльтор) и 0139.

Гомология их в иммуноблотинге с сывороткой к гемолизину V.cholerae поп 01 и нейтрализация полученными к гемолизинам ctx+ и ctx" штаммов сыворотками их литической активности по отношению к эритроцитам барана являются показателями иммунологического родства этих гемолизинов. Синтез ctx+ и ctx" холерными вибрионами в условиях дефицита железа (FeCb) гемолизинов одного спектра литической активности по отношению к эритроцитам различных видов животных и общих иммунологических свойств свидетельствует о том, что экспрессия гемолитической активности ctx+ холерных вибрионов эльтор и 0139 серогруппы зависит от условий индукции синтеза гемолизина, что коррелирует с представлениями ряда исследователей о влиянии ионов железа на синтез некоторых бактериальных белков на уровне их транскрипции ( Wyckoff S.E., Stoebner J.A., Reed К.Е., Payne S.M., 1997) и позволяет отнести гемолизин холерных вибрионов к железо-регулируемым белкам. Сведения о том, что повышение концентрации железа в среде стимулирует синтез холерного токсина (Patel М., Jsaacson М.,1999) и полученные нами данные о повышении ctx+ штаммами холерных вибрионов синтеза гемолизина и понижении концентрации холерного токсина в условиях дефицита железа (FeCb) являются основанием для обсуждения механизма координированой регуляции синтеза ток-сигенными штаммами холерогена и гемолизина в зависимости от условий среды культивирования (обитания).

Полученные данные о влиянии условий культивирования на экспрессию гемолитической активности не только ctx+, но и ctx" штаммов холерных вибрионов необходимо учитывать при трактовке результатов использования теста на гемолитическую активность для оценки эпидемической опасности штаммов холерных вибрионов. Возможно, лимитирование питательной среды для пробы Грейга по содержанию FeCb будет способствовать ее стандартизации и воспроизводимости результатов.

В связи с отличием фенотипа ctx+ и ctx" штаммов холерных вибрионов по гемолитической активности в общепринятых условиях тестирования выявление нами синтеза гемолизина в условиях дефицита FeCb может быть использовано для изучения возможной роли гемолизина в обеспечении холерных вибрионов ионами железа в различных условиях существования.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Меньшикова, Елена Аркадьевна, Ростов-на-Дону

1. Адамов А.К. Иммунология холеры. - Саратов, 1981,- 320с.

2. Адамов А.К., Быстрый Н.Ф, Шмеркевич Д.Л., Середин В.Г. Методика дифференцирования патогенных и апатогенных вибринов Эль Тор. //Пробл. особо опасн. инф. Саратов, 1971. -Вып.1. -С.116-123.

3. Адамов А.К., Наумшина М.С. Холерные вибрионы. Саратов, 1984. -328с.

4. Андрусенко И.Т., Пастернак Н.А., Гивенталь Н.И. и др. Сезонные колебания чувствительности к антибиотикам у холерных вибрионов. //Антибиотики и мед. биотехнол. -1987. -№4. -С.275-279.

5. Бичуль К.Г., Либинзон А.Е., Сомова А.Г. и др. Характеристика вибрионов, выделенных из открытых водоемов. //Диагност, особ, опасн. инф. Ростов-на-Дону, 1968. -С.92-95.

6. Бондаренко В.М., Голубев А.В., Корягина И.П. Влияние гемолитических плазмид на развитие «бьющего» эффекта у энтеробактерий разных видов.//Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1983. -№9. - С.50-52.

7. Броун И.И., Сиренко Л.А. Роль натриевого цикла энергетического сопряжения в возникновении, и сохранении природных очагов современной холеры. //Биохимия. -1997. -Т.62, №2. -С.263-269.

8. Ванин А.Ф. Нитрозольные комплексы негемового железа в тканях животных и микроорганизмов. //Автореф. канд. биол. наук -Москва , 1980- 22 с.

9. Ванин А.Ф., Кубрина Л.Н., Киладзе С.В., Бурбаев Д.Ш. О факторах, влияющих на образование динитрозольных комплексов железа в препаратах печени мышей и дрожжей.//Биофизика.-1977.-т.22.-С.646.

10. Ю.Ведьмина Е.А., Пастернак Н.А., Андрусенко И.Т. и др. Сезонные колебания энтеропатогенных свойств у вибрионов. //Журн. микро-биол., эпидемиол. и иммунобиол. -1980. -№9.-С.34-39.

11. П.Власов В.П., Бардахчьян Э.А, Харланова Н.Г. и др. Сравнительное изучение вирулентности vct+ и vtc" холерных вибрионов //Холера: Матер. Рос. науч.-практ. конф. по пробл. «Холера». Ростов-н/Д, 1995.-С.92-98.

12. Власов В.П., Михась Н.К., Монахова Е.В. и др. Штамм бактерий Escherichia coli продуцент гемолизина Vibrio cholerae eltor. А.С. №1649809,1991.

13. Воронежская Л.Г. Холерные вибрионы не 01 группы (биологическая характеристика): Дис. в форме науч. докл. . д-ра мед. наук. Саратов, 1994. -65 с.

14. Грижебовский Г.М. Холера на Кавказе (теоретические и прикладные вопросы эпидемиологии): Автореф. дисс. в виде науч. доклада д-ра. мед. наук. Саратов, 1997. -78 с.

15. Далин М.В., Фиш Н.Г. Белковые токсины микробов.//М: Медицина, 1980-224с.

16. Доломанова А.А. Вибрионный режим реки Дон: Автореф. дис. канд. мед. наук Ростов н/Д.,1952.-12с.

17. Дрожевкина М.С., Либинзон А.Е., Харитонова Т.Н. и др. Применение комплексного метода для определения вирулентности вибрионов эльтор. //Пробл. особо опасн. инф. Саратов, 1978. -Вып. 4. -С.39-42.

18. Коробкова Е.И. //Микробиология и эпидемиология холеры. М: Медицина. -1959. -303с.

19. Крю Ж. Биохимия. Медицинские и биологические аспекты. М: Медицина, 1979.-510с.

20. Кулов Г.И. Вибрионы открытых водоемов Сурхандарьинской области //Пробл. особо опасн. инф. Саратов, 1970.-Вып. 3.-С.44-48.

21. Лабораторная диагностика холеры. Методические указания. М: Федеральный центр ГСЭН МЗ России,2002. - 95с.

22. Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Беспалов И.А. и др. Холера в 19901999 гг.: состояние и тенденция заболеваемости в мире, странах СНГ, России. Прогноз. //Пробл. комиссия "Холера и патоген, для человека вибрионы". Ростов н/Д, 2000. -Вып. 13. -С. 11-16.

23. Мазрухо А.Б., Челядинова А.В. Сравнительное изучение токсинпро-дуцирующей активности Гем+ и Гем" субкультур V.cholerae 0139. /Ростов н/Д, 1997. -11с.- Деп. ВИНИТИ 12.03.97. -№770-В97.

24. Мазрухо А.Б., Михась Н.К., Монахова Е.В., Рожков К.К. определение оптимальных условий продукции ряда факторов патогенности холерных вибрионов // Журн.микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -2000.-№1. С. 21-24.

25. Методические рекомендации по определению вирулентности холерных вибрионов на модели кроликов-сосунков.//Ростов-н/Д, 1979.-6с.

26. Мецлер Д. Биохимия: Химические реакции в живой клетке. М: Мир, 1980-Т.З. -487с.

27. Микробиология и лабораторная диагностика холеры. Ростов н/Д, 1975. -136с.

28. Миронова А.В., Меньшикова Е.А., Подосинникова JI.C. Влияние сред культивирования на экспрессию биологических свойств холерных вибрионов. //Пробл. комиссия: «Холера и патогенные для человека вибрионы» Ростов н/Д, 2002. -Вып. 15. -65 с.

29. Мишанькин Б.Н., Либинзон А.Е., Родионова А.В. и др. Взаимоотношение активностей гемолизина и гемолизиндеструктивного фактора у Vibrio cholerae биовара eltorV/Журн. микробиол.-1983.-№2.-С.59-62.

30. Мишанькин М.Б., Телесманич Н.Р. Компьютерный анализ нуклеа-тидной и аминокислотной последовательностей гена Hly А и гемолизина Vibrio с1ю1егае.//Сборник : « Холера и патогенные для человека вибрионы.»Ростов- на- Дону,2001.-Вып. 14. С.56-57.

31. Зб.Осауленко О.В., Пинигин А.Ф., Вейде А.А., Марамович А.С. Определение количественного содержания 01-антигена при идентификации и ориентировочной оценке вирулентности холерных вибрионов.

32. Совр. аспекты профилакт. зооноз. инф.: Тез. докл. к всесоюз. конф. специалистов противочум. учрежд. Иркутск, 1984. -Ч.З. -С.118-119.

33. Осин А.В., Ерошенко Г.А., Коннов Н.П. Фенотипический и генетический анализ штаммов Vibrio cholerae 0139 серогруппы, выделенных из внешней среды Пробл. особо опасн. инф. Саратов, 2000,-Вып.80. - С.93-100.

34. Павлович Н.В., Сорокин В.М., Благородова Н.С. Устойчивость Fran-cisella tularensis к бактерицидному действию нормальной сыворотки как критерий оценки вирулентности бактерии.//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол., 1996.-№1.-С.7-10.

35. Подосинникова JI.C. Холерные вибрионы, выделенные на территории СССР в период седьмой пандемии: Автореф. дис. д-ра. мед. наук. Ростов н/Д, 1993,- 44с.

36. Подосинникова J1.C., Ломов Ю.М., Власов В.п. и др. Вирулентность холерных вибрионов различного происхождения. //Холера. Вопр. эпидемиол.,микробиол. и лаб. диагн.: Матер. Рос. науч. конф. Ростов н/Д, 1992.-С.75-78.

37. Романова Jl.В., Родионова А.В. Очистка и некоторые свойства гемолизина из клеток Vibrio Nag Р-11702// Профилактика природно-очаговых инфекций. Тез. док. Всесоюз. науч.-практ. конф. Ставрополь, 1983-С.40-41.

38. Сальникова О.И. Культура клеток в изучении и тестировании токсинов холерного вибриона: Автореф. дис. канд. биол. наук,- Саратов, 1994.-20с.

39. Сальникова О.И., Лобанов В.В., Шиманюк Н.Я. Использование культур клеток СНО при изучении холерных вибрионов, выращенных в различных условиях. //Микробиол. журнал. -1991. -Т.53,№6. -С.94-99.

40. Сальникова О.И., Подосинникова Л.С., Воронежская Л.Г. и др. Определение токсигенности штаммов Vibrio cholerae с помощью культуры овариальных клеток китайского хомячка. //Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1993. -№6. -С. 18-19.

41. Семиотрочев В.Л. Гемолизин холерных вибрионов как один из факторов, обуславливающих диарею и гибель кроликов-сосунков./Юсобо опасн. инф. на Кавказе: Тез. докл. к 6 краевой науч. конф. Ставрополь, 1987.-С. 185-187.

42. Семиотрочев В.Л. Группы вида Vibrio cholerae, имеющие различную эпидемическую значимость.//Журн. микробиол., эпидемиол. и имму-нол., 1990.-№4.-С.54-58.

43. Семиотрочев В.Л. Энтеропатогенные свойства штаммов холерных вибрионов, продуцирующих гемолизин I типа подтипа р. //Актуал. вопр. микробиол., лаб. диагност, и профилакт. холеры: Тез. Всесоюз. науч. конф. Ростов н/Д, 1988.-С.119-120.

44. Семиотрочев В.Л., Бабицин С.Н., Цитцер А.О. Селекция клеток холерного вибриона 01, лишенных гемолитических свойств. Материал.обл. науч.-практ. конф. Гурьевской противочум. станции по профи-лакт. ООИ. Гурьев, 1989.-С.192-194.

45. Семиотрочев В.Л., Дмитровский A.M. Диареи, вызванные гемолити-чески активными холерными вибрионами.//Холера. Вопр. эпидеми-ол., микробиол. и лаб. диагн.: Матер. Рос. науч. практич конф. -Ростов н/Д, 1992.-е.202-203.

46. Сомова А.Г., Лобанова Л.Н., Бадалова И.М. Изучение состава популяции вибрионов Эль Тор по агглютинабельности типоспецифиче-скими сыворотками. //Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1978. -№10. -С.82-85.

47. Сомова А.Г., Эмдина И.А., Смоликова Л.М., Гриценко А.И. Основные факторы патогенности Vibrio с1ю1егае.//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.-1985.-№5.-С.104-109.

48. Сомов Г.П. Значение феномена психрофильности патогенных бактерий для обоснования возможности их размножения в окружающей среде.// Экол. возбудит, сапронозов.- М.,1988. С.35-47.

49. Тафельштейн Э.Е., Блинова Л.С. Гемолитические свойства холерных вибрионов Эль-тор.//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. -1979, №10. -С.91-93.

50. Телесманич Н.Р. Анализ гемолизинов холерных вибрионов с помощью монослойных перевиваемых клеточных культур и монокло-нальных антител. // Автореф. дис. канд. биол. Наук Ростов -на -Дону, 1996. - 20 с.

51. Телесманич Н.Р., Непомнящая Н.Б. Анализ гемолизинов холерных вибрионов с помощью монослойных перевиваемых клеточных культур. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол ,-1998.№ 6,- С. 3032.

52. Телесманич Н.Р. Гемоцитолизин Vibrio с1ю1егае:механизмы действия in vitro и in vivo. //Жури, микробиол., эпидемиол. и иммунол., 1999,-№3 С.89-93.

53. Телесмаиич Н.Р. Сравнительная характеристика гемолизинов холерных вибрионов //Микробиол. журн. 1992.-Т.54,№5.-С. 105-112.

54. Телесманич Н.Р., Мишанькин М.Б. Биологическая роль гемоцитоли-зина холерных вибрионов.//Пробл. комиссия: Холера и патогенные для человека вибрионы».-Ростов н/Д, 2002,- Вып. 15 С.46-49.

55. Ткаченко В.В.Гемолитические свойства отмытых культур чумного микроба.// Микробиол. и иммунол. ООН. Сборник научных работ противочумных учреждений страны,- Саратов,-1964,- С.61-67.

56. Ушакова И.Е., Власов В.П. Генетическое детерминирование и спектр гемолитической активности холерных вибрионов. //Холера. Вопр. эпидемиол., микробиол. и лаб. диагн.: Матер. Рос. науч. конф. Ростов н/Д, 1992.-С.96-98.

57. Ушакова И.Е. Гемолитическая активность холерных вибрионов: клонирование и экспрессия гена гемолизина. Автореф. дис. канд. мед. наук. Саратов, 1993. - 22с.

58. Ушакова И.Е., Власов В.П., Монахова Е.В., Михась Н.К. Генетическое детерминирование и спектр гемолитической активности Vibrio cholerae: значение в комплексе биоварспецифических признаков. //Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол., 1994. №2. -С.31-36.

59. Ушакова И.Е., Власов В.П., Михась Н.К., Монахова Е.В. Клонирование и экспрессия гена гемолизина Vibrio cholerae eltor. //Генетика,биохимия вирулентности возб. ООИ: Матер. Рос. науч. конф. -Волгоград, 1992. -С.66-67.

60. Цитцер А.О., Езепчук Ю.В., Накисбеков И.О. и др. Очистка и некоторые свойства цитолизина Vibrio cholerae поп 01. //Мол. генетика, микробиол. и вирусол.-1990.-№9.-С.14-18.

61. Цитцер А.О., Киселев Ю.Л., Седина С.Г., Бабицин С.Н. Продукция цитолизина штаммами холерных вибрионов 01 и не 01, выделенными от людей.//Холера: Вопр. эпидемиол., микробиол. и лаб. диагн. Матер. Рос. науч. практ. конф. - Ростов н/Д, 1992.-С.80-81.

62. Черепахина И.Я., Уралева B.C. Методические рекомендации по изучению состава популяции штаммов холерных вибрионов по основным признакам рода, вида и биотипа М., 1978. - 17с.

63. Чижевский А.Л. Земное эхо солнечных бурь. М.: «Мысль», 1976. -367с.

64. Яковлев A.M., Туркин В.В.,. Толмазова Т.В. Роль железо- и медь-связывающих белков в резистентности к инфекции.//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол., 1988.-№10.-С.75-79.

65. Ahuja M.L., Krishnan K.V., Pandit S.R., Venkatraman K.V. Laboratory diagnosis of cholera. A note on bacteriological procedures //Ind. J. Med. Res. -1951. -Vol.39. -P.135-138.

66. Aisen H., Leibman A. Lactoferrin and transterrin: a comparative study. //Biochim. Biophis. Asta. -1972. -Vol.257. -P.314-323.

67. Bagg A., Neilands J.B. Ferric uptake regulation protein acts as a repressor, employing iron (11) as a cofactor to bind the operator of an iron transporter operon in Escherichia coli //Biochemistry. 1987. -Vol.26, №17. -P.5471-5477.

68. Barrett T.J., Blake P.A. Epidemiological usefulness of changes in hemolytic activity of Vibrio cholerae biotype ElTor during the seventh pandemic //J. Clin. Microbiol. -1984. -Vol.13, №1. -P.126-129.

69. Ваша D., Mukherjee A.C. Observations on the El Tor vibrios isolated from cases of cholera in Calcutta //Bull. Calcutta Sch. Trap. Med. -1964. -Vol.12. -P.147-149.

70. Bergeron R.J., Weimar W.R. Kinetics of iron acquisition from ferric siderophores by Paracoccus denitrificans //J. Bacteriol. -1990. -Vol.172, №5. -P.2650-2657.

71. Bindereif A., Neilands J.B. Promoter mapping and transcriptional regulation of the iron assimilation system of plasmid ColV-КЗО in Escherichia coli K-12 //J. Bacteriol. -1985. -Vol.162, №3. -P.1039-1046.

72. Boyd J., Oza M.N., Murphy J.R.Molecular cloning and DNA sequence analysis of a diphtheria tox iron-dependent regulatory element (dtx R) from Corinebacterium diphtheriae //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1990. -Vol.87, №15.-P.5968-5972.

73. Busk G.A., Cross R.E., Wong T.P. et al. DNA relationships among some tox bearing corynebacteriophages //Infect. Immun. -1985. -Vol.49, №3. -P.679-684.

74. Butterton J.R., Stoebner J.A., Payne S., Calderwood S.B. Cloning, sequencing and transcriptional regulation of vi A, the gene encoding the ferric vibriobactin receptor of V.cholerae //J. Bacteriol. -1992. -Vol.174, №11. -P.3729-3738.

75. Cavalieri S.J., Snyder I.S. Effect of Escherichia coli Alpha-hemolysin on human peripheral leukocyte viability in vitro. //Infect. Immun. -1982. -Vol.36, №2.-P.459-461.

76. Coffey J.A., Harris R.L., Rutlend M.L. et al. Vibrio damsela: another potentially virulent marine vibrio //J. Infect. Dis. -1986. -Vol.153, №4. -P.800-802.

77. Crosa J.H. Genetic and molecular biology of siderophore mediated iron, trasport in bacteria//Microbiol. Rev., 1989. -Vol.53, №4. -P.517-530.

78. De Moor C.E. A non-hemolytic ElTor vibrio as the cause of fn outbreak of paracholera in West New Guinea //Trop. Geogr. Med. -1963. -Vol.15. -P.97-105.

79. De Moor C.E. Paracholera (ElTor): enteritis choleriformis ElTor van Loghem //Bull. WHO. -1949. -Vol.2. -P.5.

80. De S.N., Bhattacharyya K., Roychoudhury P. The haemolytic activities of Vibrio cholerae and related vibrios // J. Pathol. Bact. -1954. Vol.67. -№1. -P.117-127.

81. De S.N., Chattajee D. An experimental stady of the mechanism of action of Vibrio cholerae on the intestinal mucous membrane //J. Pathol. Bacte-riol. -1953. -Vol.66. -№2. -P.559.

82. Dubos R.J., Geiger J.W. Preparation and properties of Shiga toxin and toxoid //J. Exp. Med. 1946. -Vol.84. -P.143-156.

83. Dutta N.K., Habbu M.R. Experimental cholera in infant rabbits: amethod for chemotherapeutic investigation //Brit. J. Pharmacol. 1955. -Vol.10. -P.153-159.

84. Feeley J.C., Pittman M. Studies on the haemolytic activity of eltor vibrios //Bull. Wold. Health. Org. -1963. -Vol.28, №3. -P.347-356.

85. Fiore A.E., Michalski J.M., Russell R.G. et al. Cloning, characterization, and chromosomal mapping of a phospholipase (lecithinase) produced by Vibrio cholerae //Infect. Immun. -1997. -Vol.65, №8. -P.3112-3117.

86. Gallut J. The cholera vibrios //Cholera. Ed: D. Ваша, W.Burrows. Philadelphia, London, Toronto, 1974. -Ch.2. -P. 17-40.

87. Ganguly R., Ghosh A.K., De S.P., Shrilastava D.L. Haemolysis in vibrios //Ind. J. Med. Res. -1966. -Vol.54 -P.15-23.

88. Goldberg M.B., Boyko S.A., Batterton J.R. et al. Characterization of a Vibrio cholerae virulence factor homologous to the family of Ton В dependent proteins //Mol. Microbiol. -1992. -Vol.6, №16. -P.2407-2418.

89. Goldberg M.B., Boyko S.A., Calderwood S.B. Transcriptional regulation by iron of a Vibrio cholerae virulence gene and homology of the gene to the Escherichia coli fur system //J. Bacteriol. -1990. -Vol.172, №12. -P.6863-6870.

90. Goldberg S.L., Murphy J.R. Molecular cloning of the hemolysin determinant from Vibrio cholerae ElTor //J. Bacteriol. -1984. -Vol.160, №1. -P.239-244.

91. Goldberg S.L., Murphy Y.R. Cloning and characterization of the hemolysin determinants from Vibrio cholerae RV 79 (Hly+), RV 79 (Hly") and 569В //J. Bacteriol. -1985. -Vol.162, №1. -P.35-41.

92. Goto S., Ota K., Kuwahara S. Studies on purine requirements of Vibrio eltor //Jap. J. Microbial. -1959. -Vol.3 -P.223-230.

93. Green B.A., Newland J.W., Holmes R.K. Mapping of chromosomal genes that determine the ElTor biotype in Vibrio cholerae //Inf. Immun. -1983. -Vol.42, №3. -P.924-929

94. Greig E.D.W. The haemolytic action of Indian strains of cholerae and cholera like vibrios //Indian. J. Med. Res. -1914. -Vol.2 -P.623-629.

95. Griffiths S.E., Chart H., Stevenson P.H. High- affinity iron uptake systems and bacterial virulence //Virulence Mech. Bact. Pathog. Washington, 1988. —P. 121-137.

96. Griffiths G.L., Sigel S.P., Payne S.M., Neilands J.B. Vibriobactin, a siderophore from Vibrio cholerae //J. Biol. Chem. -1984. -Vol.259, №1. -P.383-385.

97. Hantke K. Cloning of the repressor protein gene of iron-regulated systems in Escherichia coli K-12 // Mol. Gen. Genet. 1984. -Vol.197, №2. -P.337-341.

98. Hantke K. Regulation of terric iron transport in Escherichia coli K-12: isolation of a constitutive mutant //Mol. Gen. Genet. -1981. -Vol.182 -P.288-292.

99. Honda Т., Arita M., Takeda T. et al. Non 01 Vibrio cholerae two -newly identified toxins related to Vibrio parahaemolyticus haemolysin and Escherichia coli heat-stable enteroxin. //Lancet. -1985. -Vol.2 -P. 163-164.

100. Honda Т., Finkelstein R.A. Purification and characterization of a hemolysin produced by Vibrio cholerae biotype eltor another toxis substance produced by cholera vibrios //Inf. Immune. -1979. -Vol.26, №3 -P. 1020-1027.

101. Honda Т., Ni Y., Honda S. et al. A new TDH-related hemolysin produced by a clinical isolate of Kanagawa phenomenon -negative Vibrio parahaemolyticus //Jap. J. Med. Sci. Biol. -1988. Vol.41, №5-6. -P.218.

102. Honda Т., Ni Y., Miwatani T. Purification of a TDH-related hemolysin produced by a Kanagawa phenomenon-negative clinical isolate of Vibrio parahaemolyticus Об: K46 //FEMS Microbiol. Lett. -1989. -Vol.57, №2.-P.241-246.

103. Honda Т., Nishibuchi M., Miwatani Т., Kaper J. Demonstration of a plasmid borne gene encoding a termostable direct hemolysin in Vibrio cholerae non Ol strains //Appl. Environ. Microbiol. -1986. -Vol.52, №5. -P.1218-1220.

104. Honda Т., Taga S., Takeda T. et al. Identification of letal toxin with the thermostable direct hemolysin produced by Vibrio parahaemolyticus, and some physicochemical properties of the purified toxin //Inf. Immun. -1976. -Vol.13, №1. -P.133-139.

105. Hood M.A., Ness G.E., Rodrick G.E., Blake N.J. Study of hemolytic properties of V.cholerae strains. //Microbiol. Ecology. -1983. -Vol.9. -P.65-67.

106. Ichinose Y., Yamamoto K., Ehara M. et. al. Quantitation of hemolysin produced by Vibrio cholerae using reversed passive latex agglutination //Trop. Med. -1987. -Vol.29, №3. -31. -P. 19-26.

107. Ikida H., Ono Т., Nakae T.,et al.Two forms of Vibrio cholerae 01 ElTor hemolysin derived from identical precursor protein //Biochim. Bio-phys. Acta. 1999. - Vol.1415, №2. - P.297-305.

108. Islam M.S.,Drasar B.S.,Bradley D.J.Long-term persistence of toxigenic Vibrio cholerae Ol in the mucilaginous sheath of a blue-green alga, Anabaena variabilis//J.Trop. Med. Hyg.-1990.- Vol.93,№ 2.-P.133-139.

109. Ivanaga M., Yamamoto K., Higa N. et al. Culture conditions for stimulating cholerae toxin production by Vibrio cholerae 01 ElTor //Microbiol. Immund. -1988. -Vol.30, №11. -P. 1075-1083.

110. Kraus R., Pribram E. Uber Choleravibrionen und andere pathogenen Vibrionen. l.Uber die Beziehungen der Vibrionen ElTor zu dem Choleravibrio //Zbl. Bakt. Abt. Orig. -1906. -Bd.41, №15. -S.155.

111. Kreger A.X., Lockwood D. Detection of extracellular toxin (s) produced by Vibrio vulnificus //Inf. Immun. -1981. -Vol.33, №2. -P. 583590.

112. Kreger A.S. Cytolytic activity and virulence of Vibrio damsel. //Inf. Immun. -1984. -Vol.33. -P.583-590.

113. Laemmli U. Most commonly used discontinuous buffer system for SDS electrophresis.// Nature.-1970,- Vol. 227. P.680.

114. Litwin C.M., Calderwood S.B. Analysis of the complexity of gene regulation by fur in Vibrio cholerae //J. Bacteriology. 1994. -Vol.176, №1. -P.240-248.

115. Litwin C.M., Calderwood S.B. Role of iron in regulation virulence genes //Clin. Microbiol.Rev. 1993. -Vol.6, №2. -P.137-149.

116. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.Z., Randall R.D. Protein measurement with the Folin reagent. //J. of Biol. Chem. -1951. -Vol.193. -P.265-275.

117. Macrina F.L. Molecular cloning of bacterial antigens and virulence determinants. //Annu. Rev. Microbiol. -1984. -Vol.38. -P. 193-219.

118. Massad G., Simpson L.M., Oliver J.P. Isolation and characterization of hemolysin mutants of Vibrio vulnificus //FEMS Microbiol. Lett. -1988. -Vol. 56, №3. -P.295-299.

119. Mc Cardell B.A., Kothary M.H., Madden J.M. Two-step purification and partial characterization of a variant of the Vibrio cholerae non 01 hemolysin //FEMS Microbiol. Lett. -1999. -Vol.180, №2. -P. 177-182.

120. Mc Cardell B.A., Madden J.M., Shah D.B. Isolation and characterization of a cytolysin produced by Vibrio cholerae serogroup non 01 //Can. J. Microbiol. -1985. -Vol.31, №8. -P.711-720.

121. Miller C.J., Foxall P.A., Harrison T.J., Drasar B.S. Vibrio cholerae haemolysin: genetic constitution and biotyre //Trans. Biochem. Soc. -1988. -Vol.16, №4. -P.638-639.

122. Miyake M., Honda Т., Miwatani T. Detection of a precursor form of Vibrio metschnikovii cytolysin. //Jap. J. Med. Sci. Biol. -1988. -Vol.41, №5-6.-P.215-216.

123. Mechow S., Vaidya A.B., Bramucci M.J. Maping of gene that regulates haemolysin production in Vidrio cholerae // Bacteriol. 1985. vol. 136. №2,-P. 799- 802.

124. Miyake M., Honda Т., Miwatani T. Purification and characterization of Vibrio metschnikovii cytolysin //Inf. Immun. -1989. -Vol.56, №4. -P.954-960.

125. Miyake M., Honda Т., Miwatani T.Immunological cross-reactivity between hemolysins produced by Vibrio species //Immunodiagnostic procedure in laboratory Medicune: Proc. Int. Seminar held at Madras. Sout India. -Madras, 1987. -P.93-95.

126. Mtiller D., Hughes C., Goebel W. Relation ship between plasmid and chromosomal hemolysin determinants of Escherichia coli. //J. Bac-terol. -1983. -Vol.153, №2. -P.846-851.

127. Neilands J.B. Microbiol iron compounds. //Annu Rev. Biochem. -1981. -Vol.50."-P.715-731.

128. Nishibuchi M., Kaper J.B. Thermostable direct hemolysin gene of Vibrio parahaemolyticus: a virulence gene acquired by a marine bacterium //Infect. Immun. -1995. -Vol.63, №6. -P.2093-2099.

129. Nishibuchi N., Honda Т., Miwatani Т., Kaper J.B. Diversity and mobility of the thermostable direct hemolysin gene of Vibrio parahaemo-lyticus //Jap. J. Med. Sci. Biol. -1987. -Vol.40. -P.219-220.

130. Occhino D.A., Wyckoff E.E., Henderson D., et. al. Vibrio cholerae iron transport: haem transport genes are linked to one of two sets of ton B, exb B, exb D genes //Mol. Microbiol. -1998. -Vol.29, №6. -P. 14931507.

131. Ogierman M.A., Fallarino A., Riess T. et al. Characterization of the Vibrio cholerae eltor lipase operon lip А В and a Protease gene downstream of the hly region. //J. Bacteriol. -1997. -Vol.179, №22. -P.7072-7080.

132. Oo K.N., Myint Т., New Y.Y., Aye T. Vibrio spp. Isolated from natural waters of the city Yandon, Myanmar. //J. Diarrhoeal. Dis. Res. -1993. -Vol.11, №2. -P.105-107.

133. Patel M., Isaacson M. The effect of iron of the toxigenicity of Vibrio cholerae//Am. J. Trop. Med. Hyg. 1999. - Vol.60, №3. - P.392-396.

134. Perry R.D., Brubaker R.R. Accumulation of iron by Yersiniae. //J. Bacteriol. -1979. -Vol.137, №3. -P.1290-1298.

135. Rahman M.M., Miyoshi S., Tomochika K. et al. Analysis of the structural gene encoding a hemolysin in Vibrio mimics //Microbiol. Immunol. -1997. -Vol.41, №2. -P.169-173.

136. Ranim Z., Arir K.M. Factors affecting production of hemolysin by stains of Vibrio fluvialis. //J. Diarrhea Dis. Res. -1996. -14(2). -P. 113116.

137. Richardson К., Michalski J., Kaper J. Hemolysin production and cloning of two hemolysin determinants from classical Vibrio cholerae. //Inf. Immun. -1986. -Vol.54, №2. -P.415-420.

138. Roy C., Mukerjee S. Variability of haemolytic power of Eltor vibrios. //Ann. Biochem. Exp. Med. -1962. -Vol.22. -P.295-296.

139. Russell L.M., Cryz S.J., Holmes R.K. Genetic and biochemical evidence for a siderophore dependent iron transport system in Corynebac-terium diphtheriae. //Inf. Immun. -1984. -Vol.45, №1. -P. 143-149.

140. Rutz J.M., Abdullah Т., Singh S.P. et al. Evolution of ferric entero-bacterin receptor in gram-negative bacteria. //J. Bacteriol. -1991. -Vol.173, №9.

141. Schottmtiller H. Zur Aetiologil der akuten Gastroenteritis //Munch, med. Wschr. -1904. -Bd.51. -S.294.

142. Sen R. Observations on the haemolytic character of Vibrio cholerae in a medium containing glycerol //Ind. J. Med. Res. -1971. -Vol.59, №7. -P.1019-1024.

143. Sigel S.P., Payne S.M. Effect of iron limitation on gowth, siderophore production, and expression of outer membrane proteins of Vibrio cholerae //J. Bacteriol. -1982. -Vol.150, №1. -P.148-155.

144. Sigel S.P., Stoebner J.A., Payne S.M. Iron-vibriobactin transport system is not required for virulence of Vibrio cholerae // Inf. Immun. -1985. -Vol.47, №2. -P.360-362.

145. Spreng S., Dietrich G., Goebel W., Gentschev I. The Escherichia coli haemolysin secretion apparatus: a potential universal antigen delivery system in gram-negative bacterial vaccine carriers //Mol. Microbiol. -1999. -Vol.31, №5. -P.1596-1598.

146. Stoebner J.A., Butterton J.R., Calderwood S.B., Payne S.M. Identification of the vibriobactin receptor of Vibrio cholerae. //J. Bacteriol. -1992. -Vol.174. -№16. -P.3270-3274.

147. Stoebner J.A., Payne S.M. Iron-regulated hemolysin production and utilization of heme and hemoglobin by Vibrio cholerae. //Inf. Immun. -1988. -Vol.56, №11. -P.2891-2895.

148. Stoebner J.A., Payne S.M. Iron-regulated haemolysin production in Vibrio cholerae. //Abstr. Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol. Washington, 1986. -P.69.

149. Su S.C., Lee C.Y. Characterization of hemolysin of the Vibrio parahaemolyticus. //J. Microbial. Immune. Infect. -1997, Feb. -30 (1). -P.32-42.

150. Tai S.P., Holmes R.K. Iron regulation of the cloned diphtheria toxin promoter in Escherichia coli //Infect. Immun. -1988. -Vol.56, №9. -P.2430-2436.

151. Taniguchi H., Ohta H., Ogawa M., Mizuguchi Y. Cloning and expression in Escherichia coli of Vibrio parahaemolyticus thermostable hemolysin genes and thermolabile hemolysin genes //J. Bacterial. -1985. -Vol.162, №2. -P.510-515.

152. Tashima K.T., Carrol P.A., Marc В., Calderwood S.B. Relative importance of thee Iron regulated outer membrane proteins for vivo growth of Vibrio cholerae //Inf. Immun. - 1996. -Vol.64, №5. -P.1756-1761.

153. Wall V.W., Kreger A.S., Richardson S.H. Production and partial characterization of Vibrio fluvialis cytotoxin //Inf. Immune. -1984. -Vol.46, №3.-P.773-777.

154. Watanabe Y., Verwey W.F. The biological characterization of haemolysin from the ElTor variety of Vibrio cholerae //J. Infect. Dis. -1966.-Vol.166.-P.363-371.

155. West P.A. The human pathogenic vibriosa public health update with environmental perspectives //Epidem. Infect. -1989. -Vol.l03.№l. -P.1-34.

156. Williams P.H. Novel iron uptake system specified by ColV plas-mids: an important component in the virulence of invasive strains of Escherichia coli //Infect. Immun. -1979. -Vol.26, №3. -P.925-932.

157. Williams S.G., Manning P.A. Transcription of the V.cholerae hemolysin gene. //Mol. Microbiol. -1991. Vol.5, №8. -P.2031-2038.

158. Wright A.C., Morris J.C., Maneval R.D. et al. Cloning of the cyto-toxin-hemolysin gene of Vibrio vulnificus //Inf. Immun. -1985. -Vol.50, №3. -P.922-924.

159. Wright A.C., Simpson L.M., Oliver J.D., Morris J.G. Phenotypic evaluation of acapsular transposon mutants of Vibrio vulnificus. //Infect. Immun.-1990. -Vol.58, №6. -P. 1769-1773.

160. Wyckoff E.E., Stoebner J.A., Reed K.E., Payne S.M. Cloning of a Vibrio cholerae vibriobaktin gene cluster: identification of genes required for early steps in siderophore biosynthesis //J. Bacteriol. -1997. -Vol.179, №22. -P.7055-7062.

161. Yamamoto K., Al-Omani M., Honda T. et al. Non-01 Vibrio cholerae hemolysin: purification, partiae characterization, and immunologicalrelated ness to ElTor hemolysin //Inf. Immun. -1984. -Vol.45, №1. -P.192-196.

162. Yamamoto K., Ichinose Y., Nakasone N. et al. Identity of hemolysins produced by Vibrio cholerae non-01 and Vibrio cholerae 01, bio-type ElTor //Inf. Immun. -1986. -Vol.51, №3. -P.927-931.

163. Yamamoto K., Takeda J., Miwatani Т., Craig J.P. Purification and some properties of a non-01 Vibrio cholerae enterotoxin that is identical to cholerae enterotoxin //Inf. Immune. -1983. -Vol.39, №3. -P.1128-1135.

164. Yoh M., Honda Т., Miwatani T. et. al. Comparison of hemolysins of Vibrio cholerae non-01 and Vibrio hollisae with thermostable direct hemolysin of Vibrio parahaemolyticus //Can. J. Microbiol. -1988. -Vol.34, №12. -P.1321-1324.

165. Yoh M., Honda Т., Miwatani T. Purification and partial characterization of a Vibrio hollisae hemolysin that relates to the thermostable direct hemolysin of Vibrio parahaemolyticus //Can. J. Microbiol. -1986. -Vol.32, №8. -P.632-636.

166. Young D.B., Broadbent D.A. Biochemical characterization of extra cellular proteases from Vibrio cholerae //Infect. Immun. -1982. -Vol.37, №3. -P.875-883.

167. Zairani Z.M., Simpson L.M., Oliver S.D. Ability of V.cholerae to obtain iron from hemoglobin haphoglobin complexes. //Abstr. Anny. Meet. Amer. Soc. Microbiol. -1986.

168. Zimmermann E. Weitere Beobachtungen iiber die Hamolysine der Vibrionen//Z. Immun. Forsch. -1934. -Bd.82. -S.495-502.

169. Zitzer A., Wassenaar T.M., Walev I., Bhakdi S. Potent membrane -permeabilizing and cytocidal action of Vibrio cholerae cytolysin on human intestinal cells // Inf. Immun.-1997. -Vol.65, №4. -P 1293-1298.

170. РОССИЙСКАЯ государственна?;: БИБЛИОТЕК// ,- O'vb