Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительное изучение и совершенстование некоторых методов идентификации вирулентных штаммов холерных вибрионов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное изучение и совершенстование некоторых методов идентификации вирулентных штаммов холерных вибрионов"

яг: од

~ ^ '."оп 2а03

На правах рукописи

ОМАРОВА Батина Камильевиа

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ МЕТОДОВ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУЛЕНТНЫХ ШТАММОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов - 2000

Работа выполнена в Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» и Дагестанской противочумной станции.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор,

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник О.П. Плотников доктор медицинских наук, профессор Ю.Ю. Елисеев

Ведущая организация:

Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт

Защита диссертации состоится « » 2000 г. в часов

на заседании Диссертационного Совета Д 074.32.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" Министерства здравоохранения России (410005 Саратов, Университетская, 46).

С диссертацией можно ознокомиться в научной библиотеке института "Микроб".

Автореферат разослан «

¿Я » ¿2/2- 2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

доктор биологических наук, профессор Г. А. Корнеев

член-корреспондент АТН РФ

А.К. Адамов

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Эпидемиологическая обстановка по холере в мире сложная и требует постоянной противоэпидемической готовности медицинской службы (Мединский Г.М., Наркевич М.И., Сергиев В.П., Адамов А.К., 1989; Марамович А.С., Пинигин А.Ф., 1992; Подосинникова JI.C., Воронежская Л.Г., Лобанова Л.И. с соавт., 1992; Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Мединский Г.М., 1994; Ломов Ю.М., Москвигина Э.А., Вариво-да А.Г., 1994; Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Подосинникова Л.С.,1997; Ломов Ю.М., Москвигина Э.А.,1998; Онищенко Г.Г., 1999; Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Подосинникова Л.С. с соавт., 1999; Омариева Э.Я., Чер-ньшов С.Н., Кадиев Ш.З. с соавт., 1999; Савельев В.Н., Грижебовский Г.М., Курбанов Ш.Х., 1999). Опыт профилактики холеры, накопленный в течение седьмой пандемии показал, что успех борьбы с холерой определяется своевременной и достоверной диагностикой вирулентности выделенных холерных вибрионов.

Ведущим тестом оценки вирулентности холерных вибрионов в практических лабораториях является комплексный пробирочный метод А.К. Адамова - Н.Ф. Быстрого (Адамов А.К., Быстрый Н.Ф. с соавт., 1971; Адамов А.К., Наумшина М.С., 1984; Ведьмина Е.А. с соавт., 1984). Применение этого метода в течение многих лет показало его высокую эффективность и надежность. При сопоставлении комплексного метода с экспериментами на лабораторных животных расхождение в оценке вирулентности культур двумя методами не превышало 1,5 % (Кюрегян А.А., Огнева Н.С. с соавт., 1988). С девяностых годов на Украине начали обнаруживаться штаммы холерных вибрионов, частично или полностью резистентные к литическому действию бактериофагов эльтор и ХДФ. А с 1993 года такие же штаммы появились и на территории Дагестана (Кудрякова Г.А., Македонова Л.Д. с соавт., 1991; Казакова Е.С., Лукьянова О.И. с соавт., 1994; Казакова Е.С., Абрамова Е.Г., 1995).

В связи с этим возникла потребность в более глубоком изучении свойств выделенных культур, оценки информативности различных методов дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов, предложенных в последние годы: методов генного зондирования, реакций лизиса специфи-

ческими фагами сЬс+ и сЬс"; биологических методов определения вирулентности на крольчатах-сосунках по Датга и Хаббу и на лапках белых мышей по Дурихину и Поповой, а также необходимости выбора наиболее эффективного из них для использования в практических лабораториях.

Цель работы заключалась в сравнительном исследовании эффективности различных методов дифференциации вирулентных штаммов холерных вибрионов и усовершенствовании некоторых из этих методов.

Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:

1. Изучить биологические свойства штаммов холерных вибрионов, выделенных на территории Дагестана в 1993 - 1998 годах.

2. Оценить эпидемическое значение штаммов, выделенных в Дагестане, с помощью различных методов определения вирулентных свойств холерных вибрионов.

3. Исследовать изменение чувствительности холерных вибрионов к бактериофагам, свежевыделенных из организма больных людей, и хранившихся разные сроки на питательных средах.

4. Изучил, влияние некоторых биологически активных веществ на фа-голизабельность холерных вибрионов.

5. Провести сравнительную оценку разных методов дифференциации вирулентных и авирулентных холерных вибрионов.

Научная новизна. В результате проведенных исследований получены данные о биологических свойствах и особенностях 1259 штаммов холерных вибрионов, выделенных на территории Дагестана за период с 1993 по 1998 годы, и дана оценка вирулентности этих штаммов разными методами определения вирулентных свойств холерных вибрионов.

Изучена динамика фагочувствительности штаммов холерных вибрионов, свежевыделенных из организма больных холерой людей, и хранившихся на питательных средах. Впервые изучено влияние биологически активных веществ на фаголизабельность атипичных по этому признаку штаммов холерных вибрионов.

Впервые проведены сравнительные испытания эффективности разных методов определения вирулентности: комплексного метода, с помощью фа-

гов ctx+ и ctx", ПЦР, а также биопроб на крольчатах-сосунках и беспородных белых мышах.

Научно-практическая ценность. Для надежного определения вирулентности холерных вибрионов предложено сочетайте применение комплексного метода и фагов ctx+ и ctx". Разработаны «Методические рекомендации по оценке вирулентности холерных вибрионов комплексным методом» с учетом специфики выделяемых на территории республики Дагестан холерных вибрионов, одобренные научно - практическим советом Дагестанской ПЧС и утвержденные начальником Дагестанской ПЧС и Главным Санитарным врачом по Республике Дагестан. Разработаны «Методические рекомендации по усовершенствованию питательных сред для постановки пробы с холерными диагностическими фагами», утвержденные начальником Дагестанской ПЧС.

Предложенные методы внедрены в работу баклабораторий Дагестанской противочумной станции, Кизлярского и Буденовского противочумных отделений.

Впервые в практических условиях проведено испытание активности и специфичности новых диагностических препаратов холерных фагов ctx+ и ctx". Метод идентификации и дифференциации эпидемически опасных и эпидемически неопасных холерных вибрионов биовара эльтор при помощи диагностических холерных бактериофагов ctx+, ctx" и теста на гемолиз, внедрен в практическую работу лаборатории Дагестанской ПЧС.

Внедрен в практическую работу лабораторий Дагестанской ПЧС и Центра Госсанэпиднадзора в Республике Дагестан метод полимеразной цепной реакции для выявления Vibrio cholerae (ctxA4).

Положения, выносимые на защиту.

1. Модифицированная система идентификации вирулентных штаммов холерных вибрионов по комплексному методу.

2. Использование в комплексном методе идентификации вирулентных штаммов холерных вибрионов теста отека лапок белых мышей вместо теста на крольчатах - сосунках при определении токсигенности штаммов.

3. Рекомендации, составленные по результатам, полученным при сравнительном изучении существующих методов дифференцирования вирулентных и авирулентных штаммов холерных вибрионов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены:

- на научно - производственной конференции Кизлярского противочумного отделения, посвященной 50-летию Кизлярского ПЧО, Кизляр, август 1997 г.

- на межлабораторной научной конференции Рос НИПЧИ «Микроб», Саратов, ноябрь, 1997 г.

- на научно - производственной конференции Дагестанской противочумной станции, посвященной 45-летию Дагестанской ПЧС, Махачкала, ноябрь, 1997 г.

- на научно - практической конференции Дагестанской противочумной станции, март, 1999 г.

- на расширенном научно-производственном совещании Дагестанской противочумной станции, Махачкала, март, 2000 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы.

Штаммы бактерий. В работе использованы 1259 свежевыделенных штаммов холерных вибрионов эльтор 01 серогруппы, изолированных на территории Дагестана в период с 1993 по 1998 годы.

Методы. При выполнении работы применяли микробиологические, биохимические, серологические, биологические и статистические методы исследований.

Для характеристики вирулентных свойств возбудителей холеры применяли комплексный метод Адамова - Быстрого, определение холероген-ности на крольчатах-сосунках, определение токсинопродукции с использованием теста отека лапок на белых мышах по К.В. Дурихину и А.Е. Поповой, определение вирулентности с использованием диагностических хо-

лерных фагов йх+ и Ох" по Н.М. Остроумовой с соавт., а также при помощи полимеразной цепной реакции (ПНР) выявляющей йхА ген в холерных вибрионах.

Результаты и обсуждение.

В проведенных нами исследованиях получены данные о свойствах и особенностях 1259 штаммов холерных вибрионов, выделенных на территории Дагестана с 1993 по 1998 гг.

Подавляющее большинство (95,5 %) составили культуры изолированные от больных и вибрионосителей во время зарегистрированных вспышек холеры в Дагестане за указанный период. Из объектов окружающей среды изолированно 4,5 % штаммов холерных вибрионов, преимущественно из воды открытых водоемов.

Все штаммы были отнесены к биовару эльтор. Вибрионы эльтор серо-вара Огава составили 98,8%, Инаба 1%, Гикошима 0,2%. Однако в последние годы увеличилось выделение культур серовара Инаба.

Среди культур, выделенных в Республике Дагестан, регистрировались типичные штаммы и часть атипичных по некоторым признакам. Доминирующей формой проявления изменчивости являлась резистентность к диагностическим монофагам эльтор (29,5%). У всех штаммов, изолированных из воды поверхностных водоемов в 1996 и 1998 гг., и отнесенных к атипичным по биологическим свойствам культур, наблюдалась изменчивость морфологии колоний, серологических признаков, образования ацетилме-тилкарбинола, диастатического фермента.

Все штаммы проявляли типичные для холерных вибрионов свойства по отношению к сахарам и аминокислотам.

При определении чувствительности к антибиотикам, обнаружена возрастающая резистентность холерных вибрионов к традиционным антибактериальным препаратам, таким как тетрациклин, доксициклин, левоми-цетин(рис. 1).

Наряду с определением отношения к ввдо- и типоспецифическим сывороткам, диагностическим фагам, антибиотикам и химиопрепаратам, важнейшей остается информация о способности конкретного штамма вибрионов продуцировать энтеротоксин и в связи с этим вызывать холерогенный

синдром у чувствительного хозяина (Адамов А.К., Быстрый Н.Ф., 1971; Покровский В.И. с соавт., 1989; Мишанькин Б.Н., Ломов Ю.М. с соавт., 1999; Монахова Е.В. с соавт., 1999).

1993 1994 1996 1998

—♦—Тетрациклин -«— Доксициклин -•А- Левомицитин -х-Эритромицин

Рис. 1. Изменение резистентности холерных вибрионов к некоторым антибиотикам.

За многие годы изучения патогенеза холеры среди большинства исследователей сложилось устойчивое мнение о том, что в комплексе факторов вирулентности холерных вибрионов центральное место принадлежит холерному токсину, с которым связана и эпидемическая опасность штаммов. Патогенность холерных вибрионов носит ярко выраженный полиде-терминангный характер, однако, далеко не все ее факторы и их сочетания, необходимые для возникновения клинического заболевания, достаточно хорошо изучены, а критерии оценки эпидемиологической опасности нехо-лерогенных штаммов до настоящего времени не разработаны.

Приемы оценки эпидзначимости холерных вибрионов прошли несколько этапов своего развития - от экспериментов на животных до моле-кулярно - генетического.

Ведущим тестом оценки вирулентности в практических лабораториях является комплексный пробирочный метод А.К. Адамова - Н.Ф. Быстрого. С помощью этого метода нами были проведены исследования вирулентности холерных вибрионов биовара эльтор, выделенных в Дагестане.

По чувствительности к фагам ХДФ-3, 4, 5 культуры оказались неоднородными. Так фагом ХДФ-3 лизировались лишь 0,8 % от всех исследованных культур, Фагом ХДФ-4 не лизировалась ни одна культура, фагом

ХДФ-5 лгоировались 35 % изученных культур. Гемолитической активностью к бараньим эритроцитам не обладали 98,3 % культур вибрионов.

По нашим наблюдениям среди культур холерных вибрионов, выделенных в Дагестане во время вспышек холеры за период с 1993 по 1998 гг., вирулентные штаммы, изолированные от больных, вибрионосителей, объектов из окружения больного и других объектов внешней среды, не обладали гемолитической активностью, в то время как авирулентные штаммы, выделенные за указанный период, обладали гемолитической активностью.

При наблюдении за хранящимися в лабораторных условиях на питательных средах штаммами холерных вибрионов, выделенных на Украине в 1990 - 1994 гг., было установлено, что чувствительность некоторых из них к лизису бактериофагами эльтор и ХДФ-5 восстанавливается (Казакова Е.С., Лукьянова О.И., 1994). На основании этих данных нами были проведены исследования влияния некоторых условий на чувствительность к бактериофагам С, эльтор и ХДФ-3, 4, 5 холерных вибрионов, выделенных в Дагестане.

Нам представилась редкая возможность изучить изменение фаголиза-бельности холерных вибрионов, выделенных от пяти больных в разные сроки болезни. Проведенные исследования показали, что чувствительность к бактериофагу эльтор холерных вибрионов, выделяемых в разные сроки болезни, имела тенденцию к возрастанию по мере лечения больных.

Выделенные у трех больных, слаболизировавпшеся бактериофагом ХДФ-3 культуры холерных вибрионов, при повторных выделениях приобрели свойство лизироваться этим фагом в ДРТ; у двух больных чувствительность к фагу ХДФ-3 повторно выделявшихся культур не изменялась.

Чувствительность вибрионов к фагу ХДФ-5 в повторных культурах имела тенденцию к увеличению у всех штаммов, выделенных от пяти больных.

Проведенные наблюдения свидетельствуют о наличии сложных процессов в организме больного, влияющих на чувствительность холерных вибрионов к лизису холерными бактериофагами.

Принимая во внимание наблюдения Е.С. Казаковой и О.И. Лукьяновой (1994), мы провели исследование изменения чувствительности холерных вибрионов при хранении культур 80 штаммов в полужидком агаре. Лиза-

бельность холерными фагами определялась после хранения в столбике 0,4 % полужидкого агара в течение 6 и 12 месяцев при температуре 22° - 24°С.

При сравнении данных, полученных в экспериментах в момент выделения штаммов холерных вибрионов и после 6 и 12 месяцев хранения, отмечается снижение количества штаммов чувствительных к фагу эльтор в ДРТ с 74 % до 65 % (через 6 месяцев) и до 54 % (через 12 месяцев). Фагом ХДФ-5 в момент выделения лизировались в ДРТ 35 % штаммов, через 6 и 12 месяцев не лизировался ни один штамм.

С целью изучения возможной зависимости результатов исследований фаголизабильности штаммов от качества питательной среды, нам представилось актуальным провести сравнительные исследования чувствительности к диагностическим холерным бактериофагам штаммов холерных вибрионов, хранившихся в течение 12 месяцев в 0,4 % полужидком агаре Мартена, приготовленном в Рос. НИПЧИ «Микроб» и полужидком щелочном агаре НПО «Питательные среды». Хранились штаммы в одинаковых условиях при комнатной температуре. Мы наблюдали некоторое повышение фаголизабельных свойств вибрионов после хранения их в 0,4% агаре Мартена Следовательно, на сохранение фагочувствительности холерных вибрионов некоторое влияние оказывает качество полужидкой питательной среды.

Эти наблюдения послужили основанием для поиска веществ, влияющих на чувствительность холерных вибрионов к бактериофагам. Были проведены опыты с некоторыми веществами, активно участвующими в биохимических процессах.

В экспериментах испытывались: аденозин - 5'- трифосфат, аденозин -2У (3') - монофосфат, аденозин - 5' - монофосфат, аденозин - 3,5; - цикло-фосфат, гуанозин - 51 - трифосфат, гуанозин -51 - дифосфат, гуанозин - 5' -монофосфат, диоксигуанозин - 5 - трифосфат, таврохолат натрия, гликоген, глютатион и гистон; ферменты рибонуклеаза, фосфорилаза, ацилаза, пепсин, лизоцим, ацетил коэнзим А и коэнзим 02.

В результате проведенных опытов получены следующие результаты: аденозин - 5; - трифосфат вызывал увеличение на один порядок чувствительности к литическому действию бактериофагов эльтор и ХДФ-5. К дру-

гим бактериофагам чувствительность исследованных штаммов не изменялась.

Аденозин - 3,5' - циклофосфат и гуанозин - 51 - трифосфат способствовали увеличению чувствительности некоторых штаммов к литическому действию бактериофага ХДФ-5.

Аденозин - 21 (3') - монофосфат, аденозин -51 - монофосфат, гуанозин -5' • дифосфат, диоксигуанозин - 5 - трифосфат не изменяли чувствительность исследованных штаммов холерных вибрионов к бактериофагам С, эльтор, ХДФ-3, 4,5.

При исследовании влияния ферментов: пепсина, ацилазы, фосфорила-зы, рибонуклеазы, лизоцима и коферментов: коэнзима Q2, ацетил коэнзима А, глютатиона на чувствительность вибрионов к холерным бактериофагам, было установлено, что из перечисленных веществ только лизоцим несколько увеличивал чувствительность трех штаммов к лизису бактериофагом эльтор.

В экспериментах с гистоном, гликогеном и таврохолатом натрия не наблюдалось существенных изменений лизабильности вибрионов холерными бактериофагами.

Данные полученные в опытах с аденозином - 5; - трифосфатом послужили основой для разработки методических рекомендаций «по приготовлению питательных сред для постановки пробы с холерными диагностическими фагами».

Таким образом, у выделенных в очаге холеры штаммов вибрионов эльтор, при хранении их в лабораторных условиях в полужидком агаре, регистрировались некоторые изменения свойств по отношению к диагностическим фагам. Фагоустойчивость и снижение чувствительности к холерным бактериофагам, по-видимому, может быть следствием лизогенности или изменением внутриклеточного метаболизма, вызванного различными факторами.

При использовании методических рекомендаций А.К. Адамова с со-авт. (1995), в которых в таблицу оценки вирулентности холерных вибрионов были внесены изменения («Методические рекомендации по оценке вирулентности холерных вибрионов комплексным методом», утвержденные Ученым советом Рос. НИПЧИ «Микроб», 1995), нами были повторно ис-

следованы штаммы холерных вибрионов, выделенные в 1994 году (табл. 1). Результаты определялись по двум вариантам комплексного метода (I вариант - по таблице рекомендованной в 1971 году, II вариант - по новой таблице от 1995 года). При оценке результатов по новой таблице (вариант П) все пггаммы выделенные в 1994 году от больных холерой людей отнесены к вирулентным, что подтверждалось биопробой на крольчатах-сосунках.

Таблица 1.

Сравнительная эффективность I и II вариантов комплексного метода дифференцирования вирулентных и авирулентных штаммов, выделенных в 1994 г.

Серо-вар Объект выделения Кол-во штаммов Чувствительность к монофагам ХДФ вДРТ Гемолиз Оценка вирулентности

Вариант! Вариант II

ХДФ-3 ХДФ-4 Вдф- 5 - + Вир. Слабо вир. Авир. Вир. Слабо вир. Авир

Огава Боль- Фаг+ 389 389 389 389

ные и 389

вибрио- Фаг- - - - 745 - - - 745 745 - -

носите- 745

ли Всего 1134 - - 389 745 1134 - -

1134

Внеш- Фаг+18 _ 18 18 _ 18 - 18 -

няя Фаг-

среда 12 - - . - 12 - - - 12 12 - -

Всего

30 30 - - 18 12 30 - -

Примечание: фаг+ штаммы, лизирующиеся хотя бы одним из фагов ХДФ; фаг- штаммы не лизирующиеся фагами ХДФ.

При исследовании 6 штаммов, выделенных от больных холерой людей, в 1998 году было установлено, что они лизируются фагом ХДФ-3 и не гемолизируют эритроциты барана, согласно таблице оценки вирулентности их следовало отнести к авирулентным. Однако указанные штаммы вызывали заболевания холерой людей, в тесте на крольчатах - сосунках генерировали типичный холерогенный синдром. С помощью ПЦР в них обнаружен йхА-ген. Наличие этих свойств свидетельствует об их вирулентности. На основании приведенных данных, нами было предложено внести в таблицу оценки вирулентности вибрионов следующие изменения: штаммы холерных вибрионов серовара Огава, лизирующиеся только фагом ХДФ-3 и не гемолизирующие эритроциты барана считать вирулентными. Нами составлены методические рекомендации «по оценке вирулентности холерных вибрионов комплексным методом» с новым вариантом таблицы оценки вирулентности холерных вибрионов.

При получении нечетких результатов в пробирочных тестах по комплексному методу рекомендуется ставить биопробы на крольчатах-сосунках. В большинстве практических лабораторий своевременно иметь крольчат-сосунков невозможно. В связи с этим нами была изучена возможность применения теста на белых мышах вместо крольчат-сосунков. Тест отека лапок белых мышей ставили по методике К.В. Дурихина и А.Е. Поповой (1974).

При сопоставлении опытов на крольчатах-сосунках и белых мышах с оценкой вирулентности штаммов по фагам ХДФ и гемолизу (по методическим рекомендациям 1995 и 1999 гг.) расхождений в эпидемиологической значимости холерных вибрионов не наблюдалось. Полученные данные послужили основой для рекомендации применения теста на белых мышах вместо крольчат-сосунков.

Все 1259 штаммов были исследованы с помощью комплексного метода с применением усовершенствованной схемы оценки вирулентных свойств штаммов холерных вибрионов (табл. 2).

Среди выделенных во время вспышки холеры в 1993 году штаммов холерных вибрионов 23 определялись как вирулентные. Они были изоли-

Таблица 2.

Дифференциация вирулентных и авирулентных вибрионов эльтор посредством усовершенствованного комплексного метода.

Год выделения Серовар Объект выделения Кол-во штаммов Чувствительность к монофагам ХДФ Гемолиз эритроцитов барана Оценка вирулентности

ХДФ-3 ХДФ-4 ХДФ-5 + Вир Авир

1993 Огава Больные и 23 23 23 23

вибрионос.

Внеш. сред 2 - - - - 2 - 2 _

1994 Огава Больные и 1134 _ 389 1134 1134 _

вибрионос.

Внеш. сред 30 - - 18 30 - 30 -

1995 Огава Больной 1 1 - 1 1 - 1 -

1996 Огава Больные и 3 . _ _ 1 2 1 2

вибрионос.

Внеш. сред 9 3 - 3 4 5 4 5

Инаба Больные и 1 „ . . 1 . 1

вибрионос.

Внеш. сред 5 - - 1 1 4 1 4

1998 Огава Больные и 40 6 _ 40 . 40 _

вибрионос.

Внеш. сред 3 - - - 3 - 3 -

Инаба Больные и 1 _ 1 1

вибрионос.

Внеш. сред 7 - - - - 7 - 7

Итого 1259 10 - 435 1237 22 1237 22

Примечание: ДРТ фагов ХДФ-3 - Ю-2; ХДФ-4 - 10"2; ХДФ-5 - 10"2.

рованы от вибрионосителей и больных с выраженной клинической картиной холеры. Выделенные из внешней среды 2 штамма относились к авиру-лентным. При учете результатов определения вирулентности штаммов выделенных в 1994 году 407 вибрионов (35 %) признаны вирулентными по лизису фагом ХДФ-5 и отсутствию гемолиза и 757 (65 %) - по устойчивости к логическому действию монофагов ХДФ и отрицательному гемолизу.

Во время вспышки холеры в 1998 году, при изучении культур холерных вибрионов от 41 больных и вибрионосителей 6 можно признать как вирулентные по лизису фагом ХДФ-3 и 34 штамма - по устойчивости к логическому действию монофагов ХДФ и отсутствию гемолиза. Предложенная нами новая идентификационная таблица позволила дифференцировать все исследованные вирулентные и авирулентные штаммы холерных вибрионов.

В последнее десятилетие опубликованы данные о возможности определения вирулентности холерных вибрионов по структуре ДНК. Показано, что с помощью генной диагностики может быть получена более надежная информация относительно эпидемической значимости различных штаммов холерных вибрионов.

В качестве основного генетического маркера эпидемически значимых штаммов холерных вибрионов используют структурные гены холерного токсина ctx АВ (или vet АВ). Штаммы, имеющие гены ctx АВ, считаются эпидемически опасными, а штаммы, лишенные указанных генов, -эпидемически безопасными (Смирнова Н.И., Кокушкин A.M., 1999).

С целью определения наличия ctxA-гена методом ПЦР, мы исследовали 155 штаммов холерных вибрионов, выделенных в период с 1993 по 1998 гг. Подобные исследования в лабораториях Дагестана проводились впервые. Этот метод внедрен в практику лаборатории Дагестанской противочумной станции и Центра Госсанэпиднадзора в республике Дагестан.

Нами проведено сравнительное исследование эффективности разных методов дифференцирования вирулентных и авирулентных холерных вибрионов: комплексного метода (по методическим рекомендациям 1995 года с нашими изменениями в таблице оценки вирулентности); биопроб для определения холерогенности на крольчатах-сосунках и по величине отека лапок белых мышей, а также выявление ctxA-гена с помощью полимеразной цепной реакции.

Для работы методом случайной выборки были отобраны 59 штаммов холерных вибрионов, выделенных от больных людей, вибрионосителей и объектов внешней среды в период с 1993 по 1998 годы. Расхождения в оценке вирулентности выявлено не было, вирулентными признаны 37 штаммов, авирулентными 22 штамма (табл. 3).

Таблица 3.

Сравнительная эффективность разных методов идентификации вирулентных штаммов эльтор вибрионов.

Объект выделения Кол-во штам- Вирулентность

мов По комплексному методу На кроликах-сосунках По лапкам белых мышей ПЦР

Вир. Авир. Вир. Авир. Вир. Авир. Вир. Авир.

Больные 11 11 - 11 - И ' - 11 -

Вибрио-носители 16 12 4 12 4 12 4 12 4

Внешняя среда 32 14 18 14 18 14 18 14 18

Всего 59 37 22 37 22 37 22 37 22

Все четыре метода, как показали наши исследования, являются достаточно надежными. Однако, учитывая возможности практических лабораторий, следует отдать предпочтение комплексному методу определения вирулентности холерных вибрионов.

Мы в своей работе, помимо указанных четырех методов определения вирулентности (комплексный метод; определение холерогенноста на крольчатах-сосунках; определение токсинопродукции с использованием теста отека лапок на белых мышах), проводили испытание активности и специфичности экспериментально - производственной серии новых диагностических препаратов холерных фагов ctx+ и ctx', предназначенных для ускоренной идентификации и дифференциации эпидемически опасных ctx+ и эпидемически неопасных ctx" холерных вибрионов биовара эльтор.

Испытания проводили на 155 штаммах холерных вибрионов, выделенных на территории республики Дагестан с 1993 по 1998 годы (табл. 4).

Таблица 4.

Сравнительная оценка дифференцирования вирулентных и авирулентных холерных вибрионов фагамн <Лх+ и с1х* и гемолиза, комплексным методом и ПЦР.

Объект Кол-во Вирулентность

выделения штаммов Комплексный метод Фаги йх и гемолиз ПЦР

Вир. Авир. Вир. Авир. Вир. Авир.

Больные 46 46 - 44 2 46 -

Вибрио-носители 53 49 4 49 4 49 4

Внешняя среда 56 38 18 38 18 38 18

Всего 155 133 22 131 24 133 22

Из 155 исследованных штаммов 131 были отнесены к эпидемически опасным, 24 к эпидемически неопасным, из них 2 штамма при проверке на моделях кроликов-сосунков были признаны вирулентными. Следовательно, с помощью фагов йх+ и с1х" и теста на гемолиз возможно идентифицировать вирулентные и авирулентные штаммы холерных вибрионов. Этот метод допускает возможность неправильной оценки вирулентности в 1,5 % случаев.

Метод дифференцирования эпидемически опасных и эпидемически неопасных холерных вибрионов эльтор с помощью холерных фагов йх+ и йх" внедрен в работу лаборатории Дагестанской ПЧС.

Нами проведена также сравнительная оценка надежности определения вирулентности с помощью фагов ctx+ и ctx", комплексного метода и полимеразной цепной реакции. Оценка проводилась по данным, полученным при исследовании перечисленными методами 155 штаммов холерных вибрионов.

Результаты сравнительной оценки свидетельствуют о возможности достоверного определения вирулентности холерных вибрионов с помощью комплексного метода, а также о целесообразности использования бактериофагов ctx+ и ctx". Оба метода допускают вероятность ошибок при исследовании вирулентности штаммов вибрионов в пределах 1,5 % случаев. Совместное их применение повышает достоверность оценки вирулентности вибрионов.

Таким образом, впервые проведены сравнительные испытания эффективности методов определения вирулентности: комплексного метода А.К. Адамова - Н.Ф. Быстрого, с помрщью фагов ctx+ и ctx" (Остроумова Н.М. с соавт., 1997; 1998), полимеразной цепной реакции (Давыдова H.A., Куличенко А.Н. с соавт., 1999), а так же биопроб на крольчатах-сосунках и беспородных белых мышах.

Представленные нами экспериментальные и практические материалы служат основанием рекомендовать сочеганное применение комплексного метода, фагов ctx+, ctx" и теста на гемолиз при определении вирулентности холерных вибрионов. Биопробы на крольчатах сосунках могут быть заменены тестом отека лапок белых мышей. При наличии в практической лаборатории необходимого оборудования, реактивов и праймеров целесообразно применять полимеразную цепную реакцию.

Выводы.

1. Установлено, что на территории Дагестана за период с 1993 по 1998 год резко возросла частота выделения штаммов холерных вибрионов эльтор резистентных к диагностическим холерным бактериофагам и к традиционным антибактериальным препаратам, таким как тетрациклин, доксициклин, левомицетин. Выделенные в 1998 году штаммы эльтор вибрионов не лизи-ровались в ДРТ диагностическими фагами эльтор, ХДФ-4 и ХДФ-5; фаг ХДФ-3 лизпровал в ДРТ 11,8 % исследованных штаммов.

2. Выявлено увеличение в 10 раз чувствительности к холерным бактериофагам: эльтор, ХДФ-3 и ХДФ-5 культур холерных вибрионов, выделенных от некоторых больных холерой людей в разные сроки болезни. В условиях in vitro отмечено снижение чувствительности к диагностическим бактериофагам: эльтор, ХДФ-3 и ХДФ-5 при хранении штаммов холерных вибрионов в полужидком агаре 6 и 12 месяцев.

3. Исследование влияния биологически активных веществ на фаголи-забельность холерных вибрионов эльтор показало, что аденозин - 5; - три-фосфат, вызывает увеличение чувствительности к литическому действию бактериофагов эльтор и ХДФ-5. Фермент лизоцим несколько усиливал лизис холерных вибрионов бактериофагом эльтор. Нуклеозидфосфаты: аденозин - 2,3' - монофосфат, гуанозин - 57 - дифосфат и деоксигуанозин - 5; -трифосфат; ферменты: пепсин, ацилаза, фосфорилаза и рибонуклеаза; ко-ферменгы: коэнзим Q2, ацетил коэнзим А и глютатион, а также гистон, гликоген и таврохолат натрия не изменяли чувствительность исследованных штаммов холерных вибрионов к бактериофагам С, эльтор, ХДФ-3,4, 5.

4. На основании исследований особенностей лизиса бактериофагами ХДФ и гемолитической активности штаммов холерных вибрионов, выделенных от больных холерой людей и из объектов внешней среды, в комплексном методе усовершенствована таблица идентификации вирулентных штаммов холерных вибрионов эльтор.

5. Показано в сравнительных опытах на крольчатах-сосунках и белых мышах (тест отека лапок), что мыши могут быть использованы вместо крольчат при определении токсигенности штаммов холерных вибрионов.

6. Впервые в практическую работу Дагестанской ПЧС внедрен новый комплект диагностических холерных бактериофагов с1х+ и си' для дифференциации эпидемически опасных и эпидемически неопасных холерных вибрионов эльтор.

7. Результаты сравнительной оценки определения вирулентности с помощью комплексного метода и посредством совместного применения фагов с1х+, и теста на гемолиз свидетельствуют о целесообразности сочетанного использования этих методов.

8. Сравнительная оценка эффективности разных способов определения вирулентности холерных вибрионов: комплексного метода, с помощью фагов си+, йх" и теста на гемолиз, а также ПЦР служит основанием рекомендовать их для применения в практических лабораториях.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Микробиологическая характеристика штаммов холерных вибрионов, изолированных в 1994 г., на территории Дагестана // Материалы докладов Всероссийской научно-практической конференции. - Махачкала -1994. - С. 55-56. (Соавт.: Батырова Б.А., Асваров Б.М., Джафаров Н.И., Фа-раджева А.З., Асельдерова З.М.)

2. Чувствительность к антибиотикам холерных штаммов выделенных на территории Дагестана в 1994 г. Н Материалы докладов Всероссийской научно-практической конференции. - Махачкала - 1994. - С. 65-66. (Соавт.: Батырова Б.А., Асваров Б.М., Фараджева А.З., Джафаров Н.И., Асельдерова З.М.)

3. Дифференциация биоваров и определение вирулентности с помощью монофагов ХДФ-3, 4, 5 штаммов холерных вибрионов выделенных в Дагестане в 1994 г. // Сборник научных трудов ДГМА. - Махачкала. - 1996. - С. 155-158. (Соавт.: Асваров Б.М., Батырова Б.А., Маккаева A.M.)

4. Оценка эффективности антибактериальной терапии холеры в Дагестане // Сборник научных трудов ДГМА. - Махачкала. - 1996. - С. 155-158. (Соавт.: Маккаева А.М., Шамов Ю.А., Ахмедов Д.Р.)

5. Ретроспективная оценка вирулентности холерных вибрионов, выделенных в Дагестане // Материалы научно-практической конференции. -Махачкала - 1998. - С. 146-151. (Соавт.: Асваров Б.М., Адамов А.К., Ома-рова А.Г.)

6. Характеристика биологических свойств холерных вибрионов, выделенных на территории Дагестана // Материалы научно-практической конференции. - Махачкала. - 1998. - С. 170-173. (Соавт.: Асваров Б.М., Батырова Б. А., Маккаева А.М.)

7. Ретроспективная оценка вирулентности холерных вибрионов, выделенных в Дагестане в 1994 году // Материалы юбилейной конференции, посвященной 100-летию противочумной службы России, Ставрополь, 19-20 ноября 1997 г. Рук. Деп. в ВИНИТИ. 14.05.99., №1522-В. (Соавт.: Асваров Б.М., Омаров А.Г.)

8. Мультиплексная полимеразная цепная реакция для обнаружения и биотипирования токсигенных штаммов Vibrio cholerae // Тез. докл. 3-й

Всероссийской научно-практической конф. Москва, 2000 г. - С. 304 - 307. (Соавт.: Давыдова Н.Н., Куличенко А.Н., Грачева И.В., Бугоркова Т.В., Казакова Е.С., Кутырев В.В.)