Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы гемолитической активности холерных вибрионов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы гемолитической активности холерных вибрионов"

На правах рукописи

ТЕЛЕСМАНИЧ НАТАЛЬЯ РОБЕРТОВНА

л/

МЕХАНИЗМЫ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Ростов-на-Дону 2006 г.

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения Ростовском — на - Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском противочумном институте Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный консультант: докгор медицинских нау к, заслуженный деятель науки РФ,

Ведущая организация:

ФГУЗ Иркутский орденаТрудового Красного Знамени научно-иосгседоватепьский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока Федеральной спунбыпо надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится «25 »апреля 2006 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01. при ФГУЗ Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб»

Автореферат разослан «22 » марта. 2006 г.

профессор Ломов Юрий Михайлович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор,

Адамов Алексей Константинович доктор медицинских н^к, профессор Швиденко Инна Григорьевна доктор медицинских нау к, Савельев Вилорий Николаевич

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Данные многолетних наблюдений позволяют высказать предположение, что индикатором эволюционной смены возбудителя холеры и одним из критериев оценки появления вирулентных форм явилась гемолитическая активность холерных вибрионов. Гемолитическая активность вибрионов эльтор до возникновения 7-й пандемии отличала их от классических холерных вибрионов. Начало 7-й пандемии охарактеризовалось появлением фенотнпически негемолитичного варианта этого биовара, и в результате гемолитическая активность как тест, дифференцирующий биовары, утратил своё значение (R. Kraus, 1903; F. Gotshlich, 1905; С. Roy, 1962; Е. Greig, 1914; W. Doorenbos, 1932; A.A. Вейде, 1975; В.И. Святой, 1978; A.K. Адамов, 1979 и др.).

Существует два экологических варианта холерных вибрионов, которые различаются по способности лизировать эритроциты барана в пробе Грейга. Это вариант, не разрушающий эритроциты барана, который, с учетом его других свойств, является эпидзначимым, продуцирующим холероген, и гемолитический вариант, который принято считать авируленткым или слабовирулентным. В настоящее время описаны два типа гемолитической активности: I тип, лизирующий эритроциты барана и других видов животных в пробе Грейга, II тип, не лизирующий эритроциты барана, но активный по отношению к эритроцитам кролика, морской свинки и других видов животных (B.JI. Семиотрочев, 1987). В свою очередь каждый из них подразделяют на два варианта: а (лизис через 24 часа) и ß (лизис через 2 часа) (B.JI. Семиотрочев, 1990). Однако продолжает оставаться открытым вопрос: чем отличаются типы гемолитической активности холерных вибрионов — интенсивностью экспрессии гена hly (количественно) или разным механизмом действия?

Гемолитичность холерных вибрионов, обусловленную экспрессией комплекса hly генов (Е. Fiore, 1997), расположенного на малой хромосоме, принято рассматривать как альтернативу холерогенности и, соответственно, эпидемической опасности. Все биовары холерных вибрионов обладают консервативным ле-цитиназа - гемолизин - липазным (lee - hlyA - hlyB - hlyC) локусом (E. Fiore, 1997). Отдельные штаммы холерных вибрионов эльтор могут продуцировать гемолизин, лизирующей эритроциты барана, в отдельных случаях сочетая в себе свойства гемолитичности и холерогенности (О.В. Осауленко 1994), что может затруднять дифференциацию холерогенных и нехолерогенных штаммов по гемолитической активности в общепринятом тесте Грейга.

Сравнительно недавно был показан механизм действия гемолизина как порообразующего токсина (А.О. Цитцер, 1992; 2001; К. Chattopadhyay, 2003). В настоящее время интенсивно изучаются конформационные изменения молекулы HlyA при взаимодействии с эритроцитами кролика и липидными везикулами (N.Saha, 1997; J. Harris, 2002; R. Olson, 2003; К. Chattopadhyay, 2003). Однако в этих исследованиях в большей степени отражена больше структурная сторона процесса, чем функциональная. При этом не раскрывается реализация гемолитической активности живыми клетками холерных вибрионов, а также различие ме-

ханизмов лизиса эритроцитов кролика и эритроцитов барана. Проведено пато-морфологическое исследование тонкого кишечника мышей-сосунков при воздействии гемолизина (цитолизина) (В.А. McCardell, 1985; A. Ray, 2003). Сделан вывод, что гемолитическая активность может служить причиной диареи.

Отечественными специалистами установлено, что в пределах биовара способность к гемолизу эритроцитов барана может быть использована как один из критериев дифференциации эпидемических и неэпидемических штаммов, наряду с определением гена холерного токсина в ПЦР и биологической моделью, определяющей холерогенность (Г.П. Никишина, 1974; В.И. Святой, 1978; A.A. Вейде, 1979; A.A. Кюрегян, 1988; B.C. Уралева, 1988; Л.С. Подосинникова, 1989).

Зарубежные исследователи, уделяя много внимания изучению гемолизина холерных вибрионов, рассматривают его лишь как возможный фактор вирулентности, но не как фактор дифференциации эпидемически значимых штаммов. Поэтому зарубежные методы нацелены, в основном, на определение токсина реакциями латексной агглютинации и Elisa, а тест лизиса эритроцитов барана за рубежом продолжает оставаться тестом, дифференцирующим классический биовар и биовар эльтор.

В системе эпиднадзора за холерой в России гемолитическая активность в пробе по Грейгу является дополнительным критерием оценки эпидемической значимости штаммов, обеспечивая большое подспорье практическим лабораториям, которым недоступны биологические in vivo и молекулярно-биологические методы. С другой стороны, ограниченность подхода к дифференциации токси-рррных и атоксигенных холерных вибрионов по гемолитической активности, который на протяжении 100 лет не претерпел существенньк-изменений, заставляет нас задуматься о том, что представляет собой феномен гемолиза холерных вибрионов и каким образом можно расширить спектр методических подходов, основанных на способности холерных вибрионов лизировать эритроциты барана.

Следует признать, что термин «гемолизин» (цитолизин, гемоцитолизин) (В.А. JyícCardelI, 1985) отражает лишь результат воздействия биологически активного вещества на эритроциты и это условное название не говорит ни о его структуре и функциях, ни о конкретном механизме действия. Несмотря на то, что проблеме выделения и очистки гемолизина посвящено значительное количество зарубежных и отечественных работ, механизмы гемолитической активности холерных вибрионов и роль ферментов в реализации этого процесса живыми бактериальными клетками до настоящего времени оставались неизученными.

Цель и задачи исследования

Целью работы явилось выяснение биологической характеристики, функциональной организации и механизмов гемолитической активности холерных вибрионов.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей полипептидов, продуктов генов, составляющих hly область, с помощью методов компьютерной геномики, что необходимо для прогнозирования ос-

новных биологических характеристик гемолитической активности.

2. Выяснить биологичеаую функцию h f/A как гена, детерминирующего продукцию лектина, участвующего в гемолитической активности штаммов холфных вибрионов различных биовфови серологических групп...

3. Изучить роль лектина в гемагглютинирующей и адгезивной активности холерных вибрионов in vitro на штаммах различных биоваров и серологических групп.

4. Осуществить детекцию ферментов в препаратах гемолизинов, выделенных изразных штаммов холерных вибрионов.

5. Разработать методы изучения липазной активности холерных вибрионов и апробировать их на большом количестве штаммов холерных вибрионов.

6. На штаммах холерных вибрионов установить взаимосвязь лецити-назной,липазной и гемолитической активности холерных вибрионов.

7. Изучить эффекты влияния гемолизинов холфных вибрионов на клетки прокариот.

Научная новизна

Впервые лектиновая природа проду кга гена hlyA выявлена путем ингиби-рования гемолиза эритроцитов барана галактозой у штаммов холерных вибрионов (приоритет № 2004121534). Впервые сформулирована концепция о гемолитической активности как сложном, полифункциональном процессе, включающем взаимодействие лектина с галактозой на поверхности мембран эритроците в барана, участие нейраминидазы в детализации мембран и ферментов, гидролизую-щих липидыи фосфолипиды.

Впервые выполнен компьютерный анализ нуклеотадных (НК) последовательностей геновЫу области и соответствующих аминокислотных (АК) последовательностей холерных вибрионов, на основании которого, составлено представление о функциональной организации и возможных механизмах гемолитической активности.

Впервые обнаружено и на штаммах холерных вибрионов различных биоваров и серологических групп показано фенотипическое проявление гена hlyA, детерминирующего продукцию лектина, определена его углеводная специфичность к галактозе и установлена роль в гемолитической активности холерных вибрионов. На наборе такси генных и атокси генных штаммов установлено, что галактозоспецифичный рецептор не принимает участия в лизисе эритроцитов ролика.

Впервые на штаммах холерных вибрионов различных серологических групп и биоваров показано участие галактозоспецифического лектина в гемагг-л юти наци и и адгезии in vitro.

Впервые определены углеводные рецепторы на мембране эритроцитов бфана и кролика, участвующие в гемолизе, гемагглютинации, адгезии холерных вибрионов. Предложена модельная система in vitro дляизучения влияния у гпево-довнапроцесс адгезии (приоритет№ 2005109733/13).

Впервые описана триацилглицероллипазная активность холерных виб-

рионов; установлена взаимосвязь липазной и гемолитической активности холерных вибрионов.

Впервые предложены методы изучения липазной активное™ холерных вибрионов. Разработана питательная среда (приоритет № 2003135696/13) и диаг-ностикум антилипазный иммуноглобулиновый полимерный сухой для ее детекции (приоритет № 2004108603/15). . .

Впервые для получения диагностику ма, выявляющего липазу холерных вибрионов, предложено использовать иммуноглобулин к гомолргично!^ по струетуре, но чужеродно^ для холерного вибриона антигену коммерческой липазы Pseudomonas «р., что апробировано набольшом количестве штаммов холерных вибрионов зльтор.

Впервые выявлен различный 'диапазон вибриоцино генной активностн препаратов гемолизиновпо отношению к индикаторным 1ультурам.

Теоретическая значимость , , ,

. Данные, полученные с По мощью^ методов компьютерной ген о ми ки, несут высокую степень информативности и перспективны для выяснения неизвестных свойств и функций гемолизина холерных вибрионов. Установлена лектиновая природа продукта гена htyA, которая объясняет способность последнего к ком-лексообразованию с различными' гидролитическими ферментами. С помощью компьютерного анализа предсказаны продукты каждого из генов hly области и установлена степень гомологии с другими бедками, что может быть использовано длядальнейших нгучных исследований, а в результате привести к совершенствованию подходов в дифференциальной диагностике холерных вибрионов.

Полученные сведения о лектине (HfyA) могут быть использованы для дальнейшего углубленного изучения роли лекгинов в патогенезе холерй и острых диарей. Лектиновые свойства препаратов гемолизина и их специфичность к . галактозидам могут быть использованы в разработке новых методов биотехнологии.

Взаимодействие лекгинов с мембранными рецепторами метаболически полноценных клеток эукариот и прокариот, последующая их реакция являются удобной моделью для исследования регулягорных механизмов и углеводных рецепторов клеточной мембраны. Знание углеводной специфичности лектинаН1уА позволяет применить его даже в виде «грубого» препарата, в качестве детектора определенных углеводных групп на поверхности цитомембран и для выяснения участия последних в различных физиологических и патофизиологических процессах. Изучение ингибирующей способности Сахаров на адгезию холерных вибрионов in vitro дает возможность определить наличие или отсутствие углевод связывающих лектиновых рецепторов, участвующих в адгезии, что перспективно для изучения патогенеза холеры. Выявление у холерных вибрионов триацилгли-цероллипазной активности расширило наши представления о биологии' возбудителя холеры. Полученная информация об использовании иммуноглобулинов к липазе Pseudomonas sp. (Sigma) для выявления липазы холерных вибрионов перспективна в плане использования чужеродных, но гомологичных по структуре коммерческих антигенов с целью конструирования препаратевдля изучения фе-

нотипа других микроорганизмов. Практическая значимость

Разработана питательная среда для выявления липазной активности холерных вибрионов. Данные по липазной активности холерных вибрионов позволили предложить новый способ дифференциации токсигенных (негемолитичньгх) и атоксигенных (гемолитичных) штаммов в дополнение к тесту Грейга на основе определения триацилглицероллипазной активности. Принцип реакции (способность гемолитичных вибрионов к гидролизу жиров) может быть использован для разработки других методов биохимической идентификации и дифференциации V. cholerae. Сконструирован антилипазный полимерный иммуноглобулиновый ди-агностикум на основе липазы Pseudomonas sp. (Sigma), который в реакции объемной агломерации выявляет гемолитичные атоксигенные штаммы по продукции липазы. Препарат перспективен в плане изучения закономерностей проявления липазной активности у холерных вибрионов в РАО. Получены сведения о возможности использования чужеродных, но гомологичных антигенов для серологических реакций.

Получены патенты на изобретения: № 2261444 «Способ выявления атоксигенных гемолитичных штаммов холерных вибрионов»; № 2257415 «Способ дифференциации атоксигенных штаммов холерных вибрионов от токсигенных». Положительное решение на выдачу патента «Способ выявления лектиновых рецепторов микроорганизмов и их токсинов» (№ 2004121534/(023081) от 16.01.2006 и приоритет «Способ определения ингибирующей способности Сахаров на адгезию холерных вибрионов» (Ks 2005109733/13) от 04.04.2005.

Одобрены Ученым советом и утверждены директором РостНИПЧИ методические рекомендации «Новый дифференциальный тест для выявления гемолитичных холерных вибрионов» (протокол №3 от 23.05.02); «Инструкция по изготовлению и контролю антилипазного полимерного иммуноглобулинового диаг-ностикума» (протокол №1 от 13.01.05).

Положения, выносимые на защиту:

1. Гемолитическая активность холерных вибрионов является сложным полифункциональным процессом, включающим взаимодействие лектина с галактозой на поверхности мембран эритроцитов барана, участие нейрамини-дазы в десиализации мембран и ферментов, действующих на липиды и фосфолипиды.

2. Лектиновый рецептор, детерминируемый геном hlyA, принимает участие в лизисе эритроцитов барана, ко не кролика, взаимодействует с углеводами II группы - 3,4 - ОН транс D форма (D-галактоза), избирателен к аномерам ß (ß-гапактоза) (по классификации О. Мёкела).

3. Галактозоспецифичный лектиновый рецептор принимает участие в процессах взаимодействия токсигенных и атоксигенных холерных вибрионов с клеточными мембранами: гемагглютинации эритроцитов кролика и барана, адгезии к эритроцитам барана и человека.

4. Холерные вибрионы эльтор обладают триацилглицероллипазной активностью, коррелирующей с гемолитической активностью этих микроорганиз-

мов, что перспективно для разработки методов дифференциальной диагностики V. cholerae.

5. Иммуноглобулины к чужеродному, но гомологичному антигену липазы Pseudomonas sp. могут быть использованы для разработки методов выявления липазной активности холерных вибрионов. Апробация работы

Результаты исследований были представлены на научных конференциях:

«Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». Международная конференция, посвященная 75-летию института им. Пастера. С.-Петербург, 1998 г.

Юбилейная научная конференция, посвященная 70-летию НИИ микробиологии МО РФ. Киров, 1998 г.

Российская научно-практическая конференция по проблеме «Холера». Ростов-на-Дону, 1995 г.

Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 1999 г.

Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2000 г.

Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2001 г.

Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2002 г.. -

VIII съезд Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва, 2002 г.

VIII Российская научно-практическая конференция по проблеме "Холера». Ростов-на-Дону, 2003 г.

Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2004 г.

Всероссийская научно-практичсская конференция «Медицинская микробиология — XXI век». Саратов, 2004 г.

Проблемная комиссия «Разработка и стандартизация медицинских иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики инфекционных болезней». Москва, 2004 г.

Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». . Ростов-на-Дону, 2005 г.

Публикации результатов исследований

По теме диссертации опубликовано 22 научные работы, 9 — в центральной печати, из них четыре обзорных. Представлено пятнадцать докладов на конференциях и проблемных комиссиях. Получены патенты на изобретения: № 2261444 «Способ выявления атоксигенных гемолитичных штаммов холерных вибрионов»; № 2257415 «Способ дифференциации атоксигенных штаммов холерных вибрионов оттоксигенных».

План диссертационной работы утвержден на заседании Ученого совета ФГУЗ РостНИПЧИ Роспотребнадзора (протокол № 3 от 14 мая 2003 г.)

Структура работы '

Диссертация изложена на 256 страницах, состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, каждая из которых включает описание материалов и методов, результаты собственных исследований,, их обсуждение, за которым следуют заключение и выводы. Диссертация иллюстрирована 32 таблицами и 41 рисунком. Библиографический указатель содержит 291 информационный источник, в том числе 128 работ отечественных и 163 - зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Глава 1. Гемолитическая активность холерных вибрионов.

Обзор литературы.

1.1. Гемолитическая активность в эволюции возбудителя холеры.

1.2. Проблемы очистки и характеристики препаратов гемолизина.

1.2.1. Методы очистки гемолизинов холерных вибрионов. -

1.2.2. Механизм действия гемолизина холерных вибрионов как токсина каналоформера.

1.2.3. Организация и экспрессия генов, детерминирующих син-- тез гемолизинов холерных вибрионов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. Ферменты в гемолитической активности холерных вибрионов

При выполнении задач, направленных на прогнозирование биологической характеристики феномена гемолиза и его функциональной организации, были использованы методы компьютерной геномики. Компьютерный анализ нуклео-тидных и соответствующих аминокислотных последовательностей генов hly области Vibrio cholerae проводили при помощи системы интегрированного запроса «Entrez» на сайте National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm/nih.govl. с помощью программного продукта Inter Pro Scan, позволяющего осуществлять одновременный поиск в различных базах данных (PROSITE; PRINTS; PFAMA), и математических алгоритмов - PPsearch, PF;Scan, Finger PRYNTScan, HMMDecypher, Scan Prosite. He останавливаясь конкретно на характеристике аминокислотных и нуклеотидных последовательностей, сообщим об основных предсказанных мотивах (табл. 1). Ген lee - кодирует синтез лецити-назы-фосфолипазы С. Выявлена открытая рамка считывания, состоящая из 12254 п.н. (lee), кодирующая белок из 418 аминокислот. Предсказанная последовательность имеет гомологию с ДНК других фосфолипаз Vibrionaceae, кодирующих белок, вызывающий гемолиз эритроцитов. Практически в середине цепи полипептида Lee имеет место аминокислотный мотив, составляющий 10 аминокислот, гомологичный на 90 % липидсвязывающим белкам - панкреатической липазе крыс, лецитин-холестерол-ацетилтрансферазе человека. Аналогичные данные были представлены ранее A. Fiore (1997).

Таблица 1

Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей (АК) полипелтидов, продуктов генов, Iec-hlyA-h!yB-hlyC (lip), составляющих область hly холерных вибрионов

интегрированный запрос «Entrez» на сайте National Center for Biotechnology Information (www.cnbi.nim/nih.gou). программный продукт Inter Pro Scan (www.expasy.ch/tools). базы данных PROSITE, PRINTS, PFAM-A, математические алгоритмы PPsearch PFScan, FingerPRYNTScan, HMMDecypher, Scan Prosite) _

ген Кол-во (АК) остатков Основные домены Положение в полипептидной цепи функции Локализация образуемого белка Короткие аминокислотные мотивы полипептидов (потенциальные сайты)

I 2 3 4 5 6 7

Lec 418 Фосфолипаза С (лецитиназа) Кодирует белок вызывающий лизис эритроцитов Экзопродукт Мотив панкреатической липазы, мотив, гомологичный ли-пидсвязывющим белкам панкреатической липазы крыс, лицетин-холестерол-ацетилтрасферазе человека

HlyA 2 домена 749 I. Лейкоцидин кодовая характеристика «роге Иаето1узт» II. Лектиновый домен р цепи рицина 288-481 N-конец 488-600 С конец Принимает участие в реализации цитотоксического эффекта Обусловливает адгезию м/о, агглютинацию, преципитацию Экзопродукт Экзопродукт 5 сайтов К-гликолизирования 2 сайта фосфорилирования у АМФ и у ГМФ зависимых протеинкиназ 4 сайта для протеинкиназы С 13 сайтов для казеинкиназы 2 сайта фосфорилирования тирозинкиназы 12 сайтов Ы-миристилирования

Продолжение таблицы 1

1 2 3 1 4 5 6 7

hlyB 548 AK Полипептид отвечает за формирование пор и транспорт гемолизина

3 домена lдомен передатчик бактериальной хемотаксической чувствительности 23-52 N конец Белки, отвечающие за изменения ат-трактантов и репеллентов в окружающей среде, реализует передачу сигнала внутрь клетки Внутриклеточная локализация, связь с внешней мембраной Сайты D-амидирования метилирования

II домен суперспирализованный, рецепторный 198-220 середина цепи Процесс везикулярного слияния с мембраной цели, отвечает за образование канала

III домен сигнальный 366-382 С конец Передача сигнала внутрь клетки Сайты метил акцепции

ЫуС hlyA 312 AK Тригпииеридлипаза (сходство с панкреатической липазой) Катализ синтеза макроциклических лактонов в безводных органических растворах а, р гидролазный эстеразный липазный тиоэстеразный пероксидазный пептидазный

i Ген hlyA кодирует синтез полипептида-предшесгвенника гемолизина V. cholerae (Á. Coelho, 2000). В белке-предшественнике HlyA были обнаружены следующие аминокислотные мотивы (№ д 194418). Первые 40 аминокислот составляют сигнальный пептид. В положении 288-481 обнаружен комбинированный лейкоцидин /ASH 4 (№ JPR 00134), имеющий краткую характеристику «hemolysin роге». В положении 484-600 - лектиновый домен ß-цепи рицина (№ JPR 00772). Очевидно, что эта область участвует в процессе связывания конечного продукта экспрессии hlyA с мембранным рецептором клетки-мишени.

Анализ первичной аминокислотной последовательности HlyA свидетельствует, что HlyA-полипептид способен участвовать в процессах обратимого фосфорилирования в качестве субстрата для различных протеинкиназ-фосфатаз. Два потенциальных сайта фосфорилирования цАМФ у ГМФ-зависимых протеинкиназ; 13-для казеинкиназы. Наличие 12 потенциальных сайтов миристилирования и 5 сайтов N-гликозилирования свидетельствуют о наличии еще одного участка связывания с углеводами, что не было показано ранее.

При исследовании HlyB в системе Blast установлена высокая степень гомологии с метилакцептирующими хемотаксическими белками рода Vibrio, Pseudomonas и К coli. Кодируемый HlyB полипептид-белок формирует поры, необходимые для секреции гемолизина, содержит три потенциальных трансмембранных домена (Inter Pro Entry № д 15492), что соответствует данным литературы (R.A. Alm, 1990).

С помощью программного продукта Inter Pro Scan в полипептиде HlyC выявлен основной мотив липазы (№ JPR 00734), которая имеет высокую степень гомологии с панкреатической триацилглицероллипазой, а также с липазой Pseudomonas sp. Степень гомологии, составляющая 93,4%, была показана ранее Т. Casanova (1995). Нами обнаружены 4 основных домена: a/ß-гидролазы (№ JPR 00734); эстеразы (тиоэстеразы) [36-125] AK (№ JPR 00379); липазы [104113] АК; гемпероксидазы [281-291] AK (№ JPR 002016). Первые три домена перекрывают друг друга.

Использование приемов компьютерной геномики позволило сделать следующие предположения:

1. ген hlyA кодирует полипептид, который относится к классу лекти-нов;

2. реализация гемолитической активности холерных вибрионов не является функцией одного гена (hlyA);

3. определенная роль в гемолитической активности холерных вибрионов должна принадлежать фосфолипазе С (лецитиназе) и триацилгли-цероллипазе.

Объектом нашего исследования явились препараты гемолизинов, полученные в Ростовском-на-Дону противочумном институте. Задачей работы было обнаружение ферментативных компонентов в препаратах, лизирующих эритроциты барана, полученных с помощью различных схем очистки.

Чч ■

-Препараты гемолизинов изучали с помощью гель-электрофореза, а также качественными реакциями на наличие протеазной, нейраминидазной, леци-тиназной, фосфолипазной активностей. Электрофорез проводили в аппарате «Midget» (Hofer Scientific Instrument, USA), в денатурирующих (с SDS) и не-денатурирующих условиях, .без SDS. Использовали 7,5% и 10% полиакрила-мидный гель, толщина пластины 1,5 мм. Нагрузка на отдельную лунку составляла 40 мкг изучаемых препаратов. При постановке электрофореза без SDS белок смешивали с равным, объемом буфера для образца (0,0625М трис НСГ, рН 6,8, 50% глицерин и бромфеноловый голубой) и вносили в лунку геля. Электрофорез вели при силе тока 25 мА. При окраске электрофореграмм на белки гелевую пластину окрашивали 0,15% Кумасси Р-250 в растворе этанол-уксусная кислота-вода 3:1:10. Отмывали 7,5% уксусной кислотой. Белок определяли методом О.Н. Lowry (1951). Молекулярную массу гемолизинов определяли в ПААГ с SDS, используя коммерческий набор маркеров молекулярных весов.

Препарат гемолизина из V. cholerae eltor 9949 любезно предоставлен B.C. Уралевой и U.C. Оленичевой, содержал 300 мкг/мл белка. В ПААГ выявляли мажорный компонент на уровне м.м. 80 кДа; фракция проявляла активность в отношении эритроцитов барана, кролика, морской свинки через 24 часа (I тип а). Минимальная гемолитическая активность составляла 10 мкг.

Препарат гемолизина из мутанта V. cholerae cholerae 461/67-34 (О") любезно предоставлен B.C. Уралевой и О.П. Фецайловой (депонирован в коллекции НИИ «Микроб» под № КМ 61 как продуцент гемолизина), содержал 400 мкг/мл белка. В ПААГ наблюдали картину, аналогичную предыдущему препарату. Выявляли мажорную фракцию м.м. 80 кДа. Препарат лизировал эритроциты барана через два часа (I тип (3). Минимальная гемолитическая активность составляла 5 мкг.

Препарат гемолизина V. cholerae cholerae 569В любезно предоставлен Л.С. Оленичевой, содержал 300 мкг/мл белка. В ПААГ фиксировали две мажорные белковые зоны с м.м. 20 и 40 кДа. Препарат не лизировал эритроциты барана, но лизировал эритроциты кролика. Активность проявлялась до дозы 15 ' мкг. Препараты, используемые нами для изучения, так же, как и описанные зарубежными исследователями, отличались разной величиной, молекулярной массы (S. Pal, 1997; Т. Honda, 1997; R. Olson, 2003; К. Chattopadhyay, 2003), что, по всей видимости, связано с условиями очистки при выявлении разных молекулярных форм гемолизина.

Препарат гемолизина из штамма V. cholerae не OI Р-11702 любезно предоставлен Б.Н. Мишанькиным и Л.В. Романовой, содержал 340 мкг/мл белка. В ПААГ выявляли две мажорные белковые зоны, располагающиеся близко друг к другу в пределах м.м. 14,4 кДа, вызывающие цитолиз эритроцитов барана, кролика, морской свинки (Г тип а). Минимальная гемолитическая активность проявлялась в дозе 2,5 мкг. Препарат содержал углеводы, липиды. Несмотря на малую молекулярную массу, препарат обладал гемолитической активностью. R. Olson (2003) описал, что один из доменов препарата гемолизина характеризовался величиной в 15 кДа и обеспечивал специфичность токсина. Это позволяет

объяснить малую молекулярную массу одного из используемых нами препаратов, которая выявилась в результате жесткой очистки.

При изучении закономерностей проявления ферментативных активностей отдельных фракций препаратов гемолитичного штамма V. cholerae eltor 14965 нами была применена двухэтапная система очистки: вибрионы культивировали в среде, состоящей из 5% пептона с 0,5% NaCl (рН 7,6), в течение 48 часов при 37°С без шуттелирования, обеззараженный центрифугат хроматографировали на ДЕ-32 целлюлозе, уравновешенной 0,01 М ацетатным буфером (рН 5,6). Полученные отдельные фракции тестировали на наличие гемолитической активности, изучали с помощью электрофореза, а также качественными реакциями на наличие нейраминидазной, лецитиназной и триацилглицероллипазной активностей

Гемолитические фракции изучали с помощью электрофореза. Электрофорез проводили в аппарате «Midget» (Hofer Scientific Instrument, USA), в денатурирующих и недетанурируюших условиях использовали 7,5 и 10% полиакри-ламидный гель, толщина пластинки 1,5 мм. Нагрузка на отдельную лунку составляла 40 мкг препарата по белку.

Качественные реакции, направленные на определение ферментативных активностей препаратов и их фракций, определяли с помощью общепринятых клинико-диагностических микро-экспресс методов (Г.Н. Чистович, 1950; О.Д. Кушманова, 1983; О.Ю. Рябухина, 1990).

Фосфолипазную С (лецитиназную) активность изучали на среде ЭДС титрованием препаратов до установленной минимальной гемолитической дозы и по методике Г.Н. Чистович (1950) на среде с яичным желтком и лецитином. Реакция положительна, если на следующие сутки после инкубации в термостате вокруг лунок с препаратом образовалась специфическая зона просветления.

Липазную активность препаратов определяли по методу О.Д. Кушмано-вой (1983), используя в качестве субстрата необезжиренное молоко, в качестве индикатора - фенолфталеин.

Для определения локализации фрагмента, связанного с гемолитической активностью, электрофорез проводили в неденатурирующих условиях, без SDS, затем гелевую пластину помещали на щелочной агар, содержащий 3% эритроцитов барана. Реакцию учитывали через 2 и 24 часа.

Для определения локализации нейраминидазы, а также для демонстрации расщепления синтетического субстрата 2-(4-метилумбеллиферил) N-anerwi-a-D нейраминовой кислоты, препараты гемолизинов подвергали электрофорезу в 7,5% ПААГ, затем гелевую пластину помещали в раствор флюорогенного субстрата (1 мг/10 мл, 0,1 М ацетатного буфера рН 5,6) и инкубировали при 37 °С в течение 10-20 минут. В случае положительной реакции 4-метилумбеллиферил интенсивно флюоресцировал, при облучении ультрафиолетом с длиной волны 340-440 нм светящиеся полосы в пластинах указывали на локализацию фермента.

Изучаемые препараты отгитровывали до дозы, которая уже не обладала гемолитической активностью. Наличие ферментативных активностей учитывали в каждой гемолитической дозе.

12 3 4

А Б В

Рис. 1. Локализация нейраминидазной и гемолитической активности при «нативном» электрофорезе в ПААГ препаратов гемолизинов из клеток штаммов V. cholerae elíor 9949 и V. cholerae cholerae мутант 461/67-34. А - локализация нейраминшдаы. 1,2 - локализация нейраминидазной активности гемолизина из клеток штамма V. cholerae cholerae мутант 461/67-34; 3 - локализация нейраминидазной активности гемолизина из клеток штамма V. cholerae eítor 9949; 4 - активность препарата коммерческой нейраминидазы из клеток штамма V. cholerae не 01 («Горький») 40 мкг.

Б - локализация гемолитической активности препарата гемолизина клеток штамма V. cholerae eltor 9949. В - локализация гемолитической активности препарата гемолизина клеток штамма V. cholerae cholerae мутант 461/67-34. ;

1 2 3 4 5

А * ■ ? Б

Рис. 2. Локализация нейраминидазной и гемолитической активности при «нативном» электрофорезе в ПААГ-препарата гемолизина из клеток штамма К сЛо/егае не О/Р-11702. : < у А - локализация нейраминидазной активности препарата гемолизина. ■/.'[■ I - 2,5 мкг препарата; 2-5 мкг препарата; 3-10 мкг препарата; 4-20 мкг препарата; 5 - 40 мкг препарата. Б - локализация гемолитической активности препарата гемолизина (40 мкг).

Рассмотрев проявление гемолитического фенотипа препаратов из штаммов V. choleras не OI Р-11702 (I тип а); V. cholerae el tor 9949 ([ тип а); мутанта V. cholerae cholerae 461/67-34 (О") (I тип р); К choleras cholerae 569 В (П тип а); V. cholerae eltor 14965, мы установили, что «активные» препараты гемолизина холерных вибрионов эльтор, .визирующие эритроциты барана, содержат как минимум три фермента - лецитиназу, липазу, нейрамннидазу. Препарат гемолизина из штамма V. cholerae cholerae 569 В, лизирующий только эритроциты кролика, проявлял лецитиназную и нейраминидазную активности, не обладая липазной.

Полученные данные свидетельствовали об отсутствии гомогенности изучаемых препаратов. Тем не менее, обнаруженные компоненты могут играть определенную функциональную роль в реализации гемолитической активности атоксигенных холерных вибрионов.

Нейраминидазная активность проявлялась у всех исследуемых препаратов до дозы минимальной гемолитической активности. Инкубация фракций препаратов после разгонки в натнвном варианте гель-электрофореза с 2,4 мети-лумбеллифероном выявляла нейраминидазную активность на уровне фрагментов, обладающих гемолитической активностью в соответствии с их молекулярной массой г у препаратов мутанта V. cholerae cholerae 461/67-34 и V. cholerae eltor 9949 в пределах м.м 80 кДа (рис. 1). У гемолизина V. cholerae не OI Р 11702 нейраминидазной активностью обладали фракции с м.м 14-14,4 кДа (рис. 2). ,, ,

Для подтверждения специфичности действия нейраминидазы в препаратах гемолизинов использовали антинейраминидазные сыворотки; против нейраминидазы V. cholerae eltor и V.'. cholerae OI39 в разведении 1:10. Антинейра-минидазная сыворотка V. cholerae eltor уменьшала гемолитическую активность препаратов гемолизинов, в то время как антинейраминидазная сыворотка «Бен-гал» вообще не обладала по отношению к препаратам гемолизинов ингиби-рующей активностью. - '

В данном случае уместно процитировать работу D. Zhang (1999). Чтобы определить рецептор гемолизина на мембране эритроцита, авторами были получены МКА к мембранам эритроцитов человека, которые блокировали связывание гемолизина с эритроцитами человека и пншбировапн активность холерного гемолизина. Установлено, что МКА узнают эпитоп р-сиалоглнкопротсина на внеклеточном домене гликофорина. Результаты наших исследований перекликаются с процитированными, несмотря на то, что исследования велись в разных плоскостях.

Убедившись в том, что препараты гемолизинов, полученные разными авторами, содержат ферменты, которые, исключая нейрамннидазу, детерминируются генами, составляющими композицию области hly, мы предприняли попытку изучения закономерности проявления ферментативных активностей препарата гемолизина I типа (5, лидирующего эритроциты барана через 2 часа, непосредственно в процессе очистки, из штамма холерного вибриона эльтор 14965, применив двухэтапную схему, опираясь на публикацию В.A. McCardell (1999). Полученные фракции тестировали на наличие гемолитической активности; определяли ее титр в лунках щелочного агара, содержащего 3% эритроцитов барана и кролика; отобранные гсмолитичные фракции изучали в диск-

электрофорезе, а также качественными реакциями на наличие нейраминидаз-ной, лецитиназной и триацилглицероллипазной активностей. В процессе очистки было получено 15 фракций, из них 5 - гемолитичные. Из пяти - две (1 и 2) имели наибольшую гемолитическую активность (зона гемолиза 6-8 мм), титр гемолитической активности 1/8-1/16. в диск-электрофорезе выявляли три мажорные белковые зоны в пределах м.м. ~ 60 кДа (табл. 2), У этих фракций вьь явили нейраминидазную, лецитиназную, триацилглицероллипазную активности. При титровании они совпадали с титром гемолитической активности. В электрофорезе нейраминидазная активность проявлялась на уровне гемолитического фрагмента. При разведении гемолитичных фракций 1/8 при электрофорезе в ПААГ слабо выявлялась однабелковая полоса, диаметр зоны гемолиза в этом случае составлял 1 мм, лецитиназная и нейраминидазная активности не проявлялись, а триацилглицероллипазная активность выявлялась слабо. Остальные три фракции были менее активны, зона гемолиза вофуглунки составляла 1-2 мм. При раститровке гемолиз наблюдали только в первой лунке. Электрофорез выявлял одну белковую зону в пределах м.м. 60 кДа. Электрофорез нативных фракций при наложении электрофор этических фрагментов на агар с эритроцитами барана гемолиз не выявлял (табл.2). Эти фракции имели такую же характеристик, как и описанные выше «активные», при разведении 1 /8, то есть не обладали лецитиназной и нейраминидазной активностями, липазная проявлялась слабо. Данные факты можно было объяснить низкой гемолитической активностью, малым количеством белка, низюй концентрацией ферментов в этом разведении, недостаточной чувствительностью методов (табл. 2).

Соединив все пять гемолитичных элюагов, получили активный препарат гемолизина, дающий в электрофорезе без БОБ 3 мажорных бепювых фрагмента, в присутствии БОБ - до шести фрагментов. Зона гемолиза в агаре увеличивалась до 12 мм, титр гемолитической активности составлял 1/128, нейраминидазной- 1/128,лецитиназной-1/128,липазной- 1/128 (табл.2) (рис.3).

В результате изучения гемолитического фенотипа штамма У1Ьгю сИокгае е!/ог с1х" Р-14965, продуцирующего гемолизин I типа р, лизирующий эрит-роцитабараначерез 2 часа, стало очевидно,что «активные» препараты гемолизинов содержат как минимум три фермента — нейраминидазу, лецитиназу, триацилплицероллипазу. Связь обнаруженных ферментов с гемолитической активностью холерных вибрионов нам предстояло выяснить.

Проявления нейраминидазной и лецитиназной активностей штаммами холерных вибрионов довольно хорошо изучены (Т.Н. Донская, 1978; Т.В. Бу-гормэва, 1983; ЛИ. Колесникова, 1984; СЛ. Евлахова, БН. Мишанькин, 1998). Установлено, что ни одна из этих активностей не является сугубо специфичной для гемолитичных атоксигенных холерных вибрионов. На основании полученных данных нами было выдвинуто предположение о том, что липазная активность может являться маркером гемолитичности эритроцитов барана атоксигенных штаммов.

Глава 3. Роль триацилглицероллипазы и лецитиназы в гемолитической активности холерных вибрионов

Одной из причин неизученности триацилглицероллипазной (липазной)

Таблица 2. Биохимическая характеристика гемолитических фракций супернатанта V. сЫегае еНог 14965, полученных в процессе очистки

№ фракции Гемолиз эритроцитов барана Размеры зоны гемолиза Гемолитический титр Нейра-мини-дазная активность Леци-ти-назна я активность Ли-пазная активность Нативный электрофорез

Окраска на белок (кол-во полос) Гемолитический фрагмент Окраска на ней-рамини-дазу Молекулярная масса

1 ++++ 6 мм 1/8 1/8 1/8 1/8 3 фрагмента ++++ ++++ В пределах бОкДа

2 ++++ 8 мм 1/16 1/16 1/16 1/16 3 фрагмента ++++ ++++ В пределах 60 к Да

3 ++ 1 мм Ц - - - 1 фрагмент - - бОкДа

4 ++ 2 мм Ц - - - 1 фрагмент - - 60 кДа

5 ++ 2 мм Ц - - - 1 фрагмент - - бОкДа

Совокупность фракций ++++ 12 мм 1/128 1/128 1/128 1/128 3 мажорных фрагмента В пределах бОкДа

Рис.3. Электрофорешческий анализпятй гемолитачных фракций вПААГс SDS: 1 — 1-я фракция (нейраминидаза+); 2 — 2-я фракция(нейраминидаза+); 3,4,5 — 3,4,5-е фракции, соответственно,(иейраминидаза-). Фракции изолированы из клеток штамма V. cholerae eltor Р-14965.

Таблица 3. Результаты изучения липазной активности штаммов холерных вибрионов на питательной среде с 1уриным жиром

Количество Объект Наличие Гемолиз Количество Количество

штаммов выделе- гена ctx по Грейгу штаммов штаммов

ния липаза + липаза -

20 человек — + 16 4

20 окр. среда — + 20 0

20 человек + — 3 17

20 окр.среда + : — 1 19

активности у холерных вибрионов являлось отсутствие методов ее анализа. Нами была сконструирована питательная средадля выявления липазной активности холерных вибрионов, на основе которой предложен способ дифференциации токсигенных (негемолитичных) и атоксигенных (гемолитичных) штаммов (патент на изобретение № 2257415), содержащая агар Мартена, в качестве субстрата 1% куриный жир, в качестве эмульгатора 0,1 % «Прогресс» и индикатор - 0,1% основной водный раствор нильского голубого сульфата или 0,5 % основной спиртовый раствор фенолрот.

На способность проявлять липазную активность исследовали 80 штаммов холерных вибрионов альтор - 20 штаммов с фенотипом HIy+ctx" , вьщеленных отчеловека, 20 Hty^ctx" - из объектов окружающей среды и 40 штаммов с фенотипом Hly" ctx+, выделенных отчеловека и из объекта в окружающей среды. Результаты изучения липазной активности штаммов холерных вибрионов на питательной среде с куриным жиром показали, что гемолитичные штаммы, выделенные отчеловека и из объектов окружающей среды, в90%спучаев проявляли липазную активность, негемолитачные штаммы в 90% случаев не проявляли этой активности (табл.3).

Используя информацию о высокой степени гомологии продукта гена htyA и липазы Pseudomonas sp. (№ AF 194478 ;№ 08828) (Casanova T.B., 1995), мы решили изучить возможность использования чужеродного, но аналогичного по стру кгуре антигена коммерческого препарата липазы Pseudomonas sp. фирмы «Sigma» для разработки полимерного иммуноглобулинового диагностику ма с целью определения продукции липазы у токсигенных и атоксигенных штам-мовхолерных вибрионов.

Для получения антилипазного полимерного диагноста кума использовали препарат коммерческой липазы Pseudomonas sp. («Sigma»), Иммуноглобулины к липазе Pseudomonas получали с помощью отработанной нами поэтапной схемы иммунизации кроликов. Обескровливание животных проводили на60 день от начала иммунизации. Титр антител полученных сывороток проверяли вим-муноблоте с препаратом липазы в качестве антигена, он составлял 1:1600 -13200. Антилипазные антитела из иммунной сыворотки выделяли методом Dubert Иммобилизацию антилипазных антител осуществляли на полимерных микросферах. Антилипазные антитела ковалентно связывали с окрашенными полимерными ми кр о сферами методом, приведенным вРП №978-00 (регламент производства).

Специфичность полученной суспензии препарата проверяли в реакции объемной агломерации (РАО) с препаратами липазы Pseudomonas sp. («Sgma») и препаратами гемолизинов.

Для выявления липазы холерных вибрионов в РАО нами был а отработана методика подготовки культур. Из 24-часовой агаровой культуры холерных вибрионов готовили взвесь 108 микробных клеток по стандарту оптической плотности в объеме 1 мл 0,9 %растворахлориданатрия, отбирали 100 мкл и сеяли в бульон Мартена. Через 3-4 часа после подращивания культур холерных вибрионов при 37 °С ставили реакцию. В лунки планшета для иммунологических

реакций разливали 50 мкл 1% раствора нормальной кроличьей сыворотки (НКС) пипеткой-капельницей от Такачи. В первую лунку ряда вносили по 50 мкл исследуемой 4 часовой бульонной культуры и титровали в 4 лунках. В каждую лунку добавляли по 25 мкл суспензии иммобилизованных на полимерных микросферах антилипазных антител. Содержимое лунок перемешивали покачиванием планшета в течение 1 минуты и оставляли при температуре 20 °С на 2-2,5 часа. За положительный результат принимали цветной ярко-розовый агломерат «зонтик», равномерно выстилающий все дно лунки. Положительный результат указывал на наличие в бульонной культуре липазы. В случае отрицательного результата диагностикум выпадал в осадок на дно лунки, что свидетельствовало об отсутствии продукции липазы. Реакция сопровождается отрицательным контролем мясопептонного бульона и контролем на отсутствие спонтанной агломерации.

На способность продуцировать липазу в реакции РАО с помощью сконструированного диагностикума было исследовано 129 штаммов холерных вибрионов эльтор, выделенных из окружающей среды. Из них 68 штаммов с фенотипом ctx" Н1у+; 46 ctx+ Hly"; 15 штаммов с фенотипом ctx" Hly". Сконструированный нами диагностикум выявлял липазу у гемоли-тичных атоксигенных штаммов в 80% случаев. Не выявлял продукцию фермента у токсигенных негемолитичных вибрионов в 90% случаев. Штаммы с фенотипом ctx" Hly" не работали с диагностикум ом. Препараты гемолизинов при концентрации белка 40 мкг в первой лунке вступали в реакцию с диагностикумом до 4-й лунки. Препарат липазы Pseudomonas sp. вступал в реакцию с диагностикумом при концентрации белка 200 мкг в первой лунке и проявлял активность до 2-й лунки. Положительная реакция гемолитичных штаммов с антилипазным диагностикумом проявлялась в 2-3 лунках

Разработанный нами антилипазный диагностикум перспективен для дифференциации штаммов холерных вибрионов, выделенных из окружающей среды, на гемолитичные (атоксигенные) по продукции липазы и негемолитичные (токсигенные) по отсутствию продукции липазы (патент на изобретение № 2261444).

С помощью предложенных нами методов возможно изучение закономерностей проявления липазной активности у других биоваров и серо-варов холерных вибрионов, выделенных из разных объектов, и установления взаимосвязи липазной активности с другими факторами патогенности при других условиях культивирования.

Участие лецитиназы в гемолитической активности холерных вибрионов было изучено на 21 штамме холерных вибрионов с фенотипом ctx+ Hly", ctx' Н1у+ с помощью метода ретроингибирования фермента субстратом, для чего использовали 0,5% раствор лецитина. Для постановки реакции 24-часовые бульонные культуры холерных вибрионов инкубировали 1 час при 37 °С с 0,5% раствором лецитина, затем 1 мл бульонной культуры

с лецитином соединяли с 1 мл 1% взвеси эритроцитов барана и кролика. Смесь микробов с лецитином и эритроцитами помещали на 2 часа в термостат (37 °С), а затем в холодильник до следующего дня. В качестве контроля гемолиза со всеми культурами ставили реакцию Грейга.

С атоксигенными (гемолитичными) штаммами ставили гемолиз эритроцитов барана и изучали возможность ингибирования реакции лецитином. Гемолиз эритроцитов кролика и возможность торможения гемолиза лецитином определяли у токсигенпых и атоксигенных штаммов. Установлено, что лецитин полностью ингибировал гемолиз эритроцитов кролика у токсигенных штаммов холерных вибрионов эльтор и V. cholerae cholerae 569В. У гемолитачных (атоксигенных) V. cholerae eltar лецитин так же полностью ингибировал гемолиз эритроцитов кролика. Ингибиро-вание гемолиза эритроцитов барана у атоксигенных штаммов холерных вибрионов имела место, но была неполной (табл. 4). Наши данные подтверждаются результатами S. Pal (1998). Им показано, что V. cholerae 0139 способны продуцировать бифункциональную моле^лу Hly PC (фосфолипаза Q, обладающую лецитиназной и гемолитической активностями в отношении эритроцитов кролика.

Таким образом, из полученных результатов следует, что лецитаназа может принимать участие в лизисе эритроцитов барана и являться маркерной для гемолизина II типа, лизирующего эритроциты кролика (рис. 4). Это согласуется с данными литературы о том, что лецитиназная активность, как и способность к лизису эритроцитов кролика, характерна для всех штаммов холерных вибрионов, независимо от их токсигенности. (Т.Н. Донская, 1978;B.C. Уралева, 1988; С.П. Евлахова, 1998).

Липазная активность является маркером гемолиза эритроцитов барана. Наши данные согласуются с результатами J.R. Harris (2002) и К. Chattopadhyay (2003) о том, что при взаимодействии HlyA с липидными везикулами гемолизину необходима активность на поверхности раздела фаз липид-вода, где нарушается третичная стру ктура мономера HlyA и в результате совершается переход в негемолитичный олигомер. Активность гемолизина на поверхности раздела двух фаз липид-вода не может бьггь реализована без липазы, особенно если субстратом являются эритроциты барана, в составе мембран которых преобладают глицеролипиды. Кроме того, MA. Ogierman (1997) было выдвинуто предположение, что липаза холерных вибрионов является составляющей комплекса ферментов, принимающих участие в повреждении мембран.

Глава 4. Биологическая функция гена hlyA, детерминирующего продукцию лектина

Проведенный компьютерный анализ позволил обратить внимание на то, что доменная организация полипептида HlyA очень сходка с доменной организацией лектинов (фитогемагглютининов) (табл. 5). Ключевым признаком принадлежности белка клектинам является наличиеуглеводсвязывающего домена, который

Таб лица 4. Результаты изучения эффекта ингибирования лизиса эритроцитов кролика и барана

лецитином у холерных вибрионов

Биовар и серогруппы Гемолиз эритроцитов кролика Ингибирование гемолиза эритроцитов кролика лецитином Гемолиз эритроцитов „барана Ингибирование гемолиза : эритроцитов барана лецитином

V. скокгае еИог сХх "Н1у + гемолиз ингибирование гемолиз слабое ингибирование

V. скокгае еИог с1х + Н1у' - гемолиз ингибирование нет

V. скокгае 0139 с(х "Н1у + гемолиз слабое ингибирование - гемолиз слабое ингибирование

V. скокгае 0139 с1х +Н1у" нет — нет

V, скокгае скокгае 569В <±\+Н1у" слабый гемолиз ингибирование нет

Таблица 5. Сравнительный анализ доменной структуры лектинов с доменной организацией полипептида Н1у А ______________(по данным компьютерного анализа) _ __________

Домены лектинов Функции Мотивы доменов полипептида HlyA Фенотипическое проявление доменов HlyA

Домен сигнального пептида(Ы-конец 15-40 ак) Активизация незрелого лектина(пролектина) путем протеолиза HlyA-гемолизин-предшественник (прогемолизин) мотив сигнального пептида на N-концс 40 ак HlyA-гсмолизин - предшественник с Мм- 83.200 подвергается протео-лизу с образованием еще 2 белков с мм-71.600 и 60.300 (R.H. Hall, 1990)

Домен трансмембранный Транспорт лектина из клетки полипептид Н!уВ 1 домен - передатчик бактериальной, хемотоксической чувствительности 2 домен - суперспирализованный ре-цепторный 3 домен - сигнальный Синтез белка, формирующего поры, необходим для секреции гемолизина (R.A.Alm, 1990)

Домен, образующий ионные каналы Реализация цитотоксиче-ского действия N-конец 288-481 ак (193 ак) мотив под кодовой характеристикой «hemolysin роге» Формирование пор и каналов, ци-тотоксическая активность (А.О. Zitzer, 1992; Н. Jkigai, 1997)

Домен липидсвя- зываюший (ЛСД) Гидрофобные свойства, обусловливающие способность белка к слиянию с природными мембранами 12 сайтов для присоединения мери-стиловых кислот, ближе к N-концу гюлипептида (Предположительно участие ЛСД полипептидов Lec и HlyC) (собственные исследования) Слияние с фосфатидными везикулами и природными мембранами

Домен углевод-связывающий (УСД) Агглютинация, преципитация, адгезия м/о, способность образовывать фимбрии, пили, комплексы с ферментами, полифункционал ьность С-конец 488-600(116 ак) Лектиновый домен В-цепи рицина (УСД); 5 сайтов гликолизирования (собственные исследования) Способность «узнавать» и связывать галактозу в форме D- и р- в реакциях гемолиза эритроцитов барана, гемагглютинации и адгезии штаммами холерных вибрионов (собственные исследования)

мы обнаружили ближе к С-концу HlyA (116 АК). Именно этот домен лектинов обусловливает агглютинацию, преципитацию, адгезию микроорганизмов, способность к образованию фимбрий, пилей, а также к образованию комплексов с ферментами. Очередным этапом исследования явилась идентификация свойств гемолизина как лектина, определение углеводной специфичности лектина (HlyA) и его участия в гемолитической, гемагглютинирующей и адгезивной активностях, что было осуществлено при изучении препаратов гемолизинов и на штаммах разных биоваров и серологических групп. По данным литературы, В-цепь рицина семян клещевины специфична р-галактозе и N-ацетилгалактозамину (В.М. Лахтин, 1994). На основании этих данных был подобран следующий набор Сахаров: D-галактоза, р-галактоза, N-ацетилгапактозамин и глюкоза производства зарубежных фирм. В опыте исследовали препараты гемолизинов из штаммов V. cholerae не О! Р-11702 (I тип а), V. cholerae eltor 14965 (1 тип р). Методика определения углеводной специфичности (М.Д. Луцик, 1983) была адаптирована нами для изучения торможения реакции гемолиза по Грейгу специфичным HlyA сахаром. Результат положительной реакции торможения гемолиза углеводами - ингибирование гемолизина по отношению к контролю (частичное или полное оседание эритроцитов). Реакцию гемолиза и торможения гемолиза ставили параллельно с эритроцитами барана и кролика. Результат положительной реакции торможения гемолиза углеводами - пуговица на дне пробирки (отсутствие гемолиза). Результат свидетельствовал, что гемолиз по Грейгу эритроцитов барана с двумя препаратами гемолизинов ингибировался D и р-галактозой, гемолиз эритроцитов кролика не ингибировался ни одним из Сахаров. Для подтверждения полученных результатов необходимо было подтвердить эффект торможения гемолиза D и (5-галактозой на штаммах холерных вибрионов. Для этого были взяты атоксиген-ные штаммы V. cholerae eltor и V. cholerae 0139, лизирующие эритроциты барана ctx"Hly+, выделенные от человека и из объектов окружающей среды. С исследуемыми штаммами ставили классический тест Грейга с эритроцитами барана и кролика, а также реакцию торможения гемолиза углеводами. Для изучения торможения гемолиза эритроцитов кролика углеводами исследовали токси-генные штаммы (ctx т Hly"): V. cholerae ellor, V. cholerae О!39 и V. cholerae cholerae. Для постановки реакции торможения гемолиза сухую навеску углевода растворяли в 1 мл 1 млрд. взвеси односуточной культуры холерных вибрионов так, чтобы получился 1% раствор углевода, инкубировали 30-40 минут при 37 °С, затем добавляли 1 мл 1% суспензии эритроцитов, реакцию учитывали через 2 часа инкубации при 37 °С. Гемолиз эритроцитов барана у штаммов с фенотипом (ctxHly) ингибировался

D и р-галактозой. Гемолиз эритроцитов кролика у штаммов ctx + и ctx" не ингибировался ни одним из углеводов (табл. 6), что подтверждало результаты, полученные на препаратах гемолизинов.

Далее мы изучали участие галактозоспецифического лектина в гемагг-лютинации токсигенных и атоксигенных штаммов холерных вибрионов. С каждым штаммом ставили классическую реакцию гемагглютинации на стекле с эритроцитами кролика и барана. Положительная реакция - образование хлопьев. Для по давления гемагглютинации использовали тот же набор Сахаров.

Таблица 6. Результаты изучения ингибирования углеводами гемолиза эритроцитов кролика и барана у холерных вибрионов

Серовар, биовар Гемолиз эритроцитов кролика Гемолиз эритроцитов кролика ингибирование Гемолиз эритроцитов барана Гемолиз эритроцитов барана ингибирование

Б- галактоза В-галактоза Ы-ацетил-галактоз-амин глюкоза галактоза Р- галактоза Л- ацетил-галактоз-амин глюкоза

V. сИо!егае еког йх'Шу + гемолиз гемолиз гемолиз гемолиз гемолиз гемолиз ингиб. ингиб. гемолиз гемолиз

V. скокгае еНог с!х +Н1у" гемолиз гемолиз гемолиз гемолиз гемолиз нет нет нет нет нет

V. сИокгае 0139 с!хН1у+ гемолиз гемолиз гемолиз гемолиз гемолиз гемолиз ингиб. ингиб. гемолиз гемолиз

V. сИокгае 0139 йх +Н!у" нет нет нет нет нет ■ нет нет нет нет нет

V. сИокгае сЬокгае 569В ах+Н1у" слабый гемолиз слабый гемолиз слабый гемолиз слабый гемолиз нет нет нет нет

Положительный результат реакции подавления гемагглютинации — образование «пуговицы». В опыте использовали 28 штаммов холерных вибрионов разных биоваров и серологических групп.

С каждым штаммом ставили классическую реакцию агглютинации в 96 луночной панели, используя 1млрд. взвесь агаровой культуры по стандарту мутности 50 мкл и 50 мкл 2,5% взвеси эритроцитов барана и кролика, трижды отмытых физиологическим раствором, так как в опытах по изучению торможения гемолиза углеводами использовали именно эти эритроциты.

При положительной реакции в течение 5 минут наступала агглютинация эритроцитов в виде зонтика. Отрицательная реакция - выпадение эритроцитов в виде «пуговицы» в центре лунки.

Контроли: 1) 50 мкл физиологического раствора + 50 мкл 2,5% взвеси эритроцитов = отрицательная реакция (красная пуговица в центре капли); 2) 50 мкл физиологического раствора с испытуемой культурой.

Для метода подавления гемагглютинирующей активности лсктина углеводами использовали тот же набор Сахаров: D-галактоза (Serva), ß-галактоза (Chemahol, Praha), N-ацетилгалактозамин (Cal-Biochem, USA), глюкоза («Ла-верна»), В 1 мл 1 млрд. взвеси холерных вибрионов растворяли навеску 0,01 мг каждого сахара и инкубировали в термостате при 37 °С 20-40 минут. Затем 50 мкл приготовленной суспензии соединяли с 50 мкл 2,5% взвеси эритроцитов. Результат положительной реакции - ингибирование гемагглютинации: выпадение осадка эритроцитов в виде пуговки.

Классическую реакцию гемагглютинации и реакцию торможения гемагглютинации углеводами с каждой культурой ставили параллельно. _

Результаты ингибирования гемагглютинации эритроцитов кролика и барана представлены в таблице 7. Из таблицы видно, что гемагглютинация эритроцитов барана и кролика у токсигенных и атоксигенных штаммов, в частности штамма V. cholerae cholerae 569В, подавлялась галактозой, что свидетельствовало о том, что галактозоспецифичный лектин экспрессируется во всех штаммах холерных вибрионов независимо от серогруппы и токсигенности. Таким образом, на препаратах гемолизинов и штаммах холерных вибрионов с помощью реакций торможения гемолиза и гемагглютинации углеводами, основываясь на данных компьютерного анализа, нам удалось установить, что продук- • том гена ЫуА является рициноподобный лектин, который принимает участие в лизисе эритроцитов барана, но не эритроцитов кролика. Нами установлено также участие галактозоспецифичного лектина в гемагглютинирующей способности токсигенных и атоксигенных штаммов, что позволяет высказать предположение о бифункциональное™ продукта гена HlyA. B процессах, как гемолиза, так и гемагглютинации лектин взаимодействует с углеводами мембраны эритроцитов, которые относятся к II группе - 3,4-ОН транс Д-форма (D-галактоза), аномерам ß (^галактоза) по классификации Мёкела. В лизисе эритроцитов кролика принимает участие только домен переформирования, располагающийся на N-конце полипептида HlyÁ, работающий в комплексе с лецитиназой (рис.4), а механизм рецепторного взаимодей-

Таблица 7. Результаты изучения ингибирования гемагглютинации эритроцитов кролика и барана углеводами у холерных вибрионов

Холерные вибрионы Агглютин. эритроцитов кролика Ингибирование агглютинации эритроцитов с сахарами Агглютин. эритроцитов барана Ингибирование агглютинации эритроцитов сахарами

Б-галак-тоза Р- галактоза Ы-ацетил-галактоз-амин глюкоза Ц- галактоза Р- галактоза Ы-ацетил-галактоз-амин глюкоза

V. сИо!егае е/(ог с1х"Н1у+ есть ингиб. - - - есть ингиб. ингиб. ингиб.

V. сЬокгае еИог йх + Н1у" есть ингиб. ингиб. активн ингиб. ингиб. есть ингиб. ингиб. - -

V. сИокгае 0139 сгх'Н1у+ есть ингиб. активн ингиб. есть ингиб. ингиб.

V. сИокгаг 0139 С1х +Н1у" частично ингиб. ингиб. -

V. сИокгае сИокгае 569 В съ +Н1у есть ингиб. ингиб. активн ингиб. есть слабая ингиб.

Рис. 4. Модель реализации гемолитической активности холерных вибрионов

+ нейраминидаза Лизис эритроцитов барана

PC фосфолипаза С лецитиназа . лектин галактозоспецифичный метилакцепти-рующий фактор липаза

♦Lec(PC) (ЛСД) ЛСД HlyA N-конец С-конец (УСД) Н1уВ Н1уС (ЛСД)

липидсвязывающий домен hemolysin «роге» домен лектиновый домен Белки для транспорта гемолизина липидсвязывающий домен

Бифункциональная молекула РС Н1у = лецитиназа + N - конец Н1уА э нтеротоксическая активность

Лизис эритроцитов кролика

ЛСД - липидсвязывающий домен

УСД - углеводсвязывающий (лектиновый) домен ф

рецепторы гемолизина *1ес - лецитиназа; РС - фосфолипаза С

ствия этого комплекса с мембраной эукариотической клетки несколько иной, чем у гемолизина, лизирующего эритроциты барана.

Подводя итог исследованиям, касающимся функциональной организации гемолитической активности холерных вибрионов, можно сказать, что основными ее компонентами являются: галактозоспецифичный лектин, лецитина-за, нейраминидаза и липаза, которые принимают участие в лизисе эритроцитов барана, причем в этом случае липаза является маркерным ферментом. В гемолизе эритроцитов кролика принимает участие N-конец HlyA под кодовой характеристикой hemolysin «роге», лецитиназа, но не липаза. В этом случае маркерным ферментом лизиса эритроцитов кролика является лецитиназа (рис. 4).

Участие галактозоспецифичного лектина и лсктиновых рецепторов иной углеводной специфичности в адгезии холерных вибрионов изучали при помощи методики В.И. Брилис (1986). Метод основан на том, что эритроциты имеют на своей поверхности гликофорин — вещество, идентичное гликокаликсу эпителиальных клеток кишечника, на котором расположены рецепторы для ад-гезинов микроорганизмов. Одной из задач работы было отработать нашу модификацию этого метода для изучения углеводной специфичности лектиновых рецепторов холерных вибрионов, участвующих в адгезии. Клеточным субстратом служили эритроциты человека О (1) гр Rh (+) и эритроциты барана. В работу были взяты токсигенные штаммы холерных вибрионов эльтор и Бенгал. Предложенный нами метод ингибирования адгезии специфичными углеводами отличался от метода Брилиса тем, что перед смешиванием культуры холерных вибрионов с эритроцитами на стекле, вибрионы предварительно инкубировали с 1% раствором Сахаров. Если лекгиновые рецепторы холерных вибрионов связываются с сахарами, то адгезия ингибируется. В эксперименте сравнивали два показателя - средний показатель адгезии (СПА) - контроль адгезии (среднее количество вибрионов, прикрепившихся к одному эритроциту) В.И. Брилис (1986) и показатель ингибированиия адгезии углеводами (ПИА), предложенный нами (среднее количество вибрионов, прикрепившихся к одному эритроциту при влиянии углеводов). При изучении влияния спектра углеводов на процесс адгезии холерных вибрионов нами установлено, что все углеводы, используемые в опыте, в большей или меньшей степени оказывали ингибирующий эффект на этот процесс. Выявлено, что галактозоспецифичный лектин участвует в адгезии холерных вибрионов эльтор, но наиболее активен при адгезии токси-генных штаммов Бенгал. В адгезии токсигенных штаммов V. cholerae eltor одну из ведущих ролей выполняют лектиновые рецепторы, узнающие глюкозу и аминосахара. Действие, ингибирующее адгезию холерных вибрионов, установлено у глюкосолана - препарата для регидратационной терапии.

Глава 5. Действие гемолизина на клетки микроорганизмов

Результатами проведенной нами работы явилось установление у препаратов гемолизинов антагонистических свойств по отношению к клеткам холерных вибрионов, некоторых шигелл и сальмонелл. О специфичности антагонистического действия гемолизинов свидетельствовал разный спектр их ингиби-

рующей активности по отношению к индикаторным культурам для выявления вибриоцинов, соответствующей типу гемолизина. Специфичность действия гемолизинов на клетки холерных вибрионов подтверждали с помощью нейтрализации бактерицидного эффекта антигемолитической сывороткой к гемолизину из штамма V. cholerae не Ol Р-11702.

' Влияние препаратов гемолизинов на рост клеток грам + и грам " бактерий было изучено на 42 штаммах холерных вибрионов, на наборе индикаторных культур энтеробактерий для выявления вибриоцинов холерных вибрионов и на шести штаммах лактобактерий.

Динамику и характер изменений ультраструктуры холерных вибрионов при действии гемолизина из штамма V. cholerae не Ol Р-11702 проводили с помощью электронной микроскопии методом ультратонких срезов. Установлено, что при действии препарата гемолизина на клетки холерных вибрионов наблюдается значительное увеличение числа клеток с деградацией нуклеоида и рибо-сомального комплекса, что позволяет назвать их лизированными. У некоторых клеток холерных вибрионов поврежден пептидогликан клеточной стенки. Установленный феномен не противоречит данным литературы о том, что у некоторых бактерий гемолитическая и бактерицидная активность тесно связаны: бактериоцИн и гемолизин Streptococcus pyogenes (В.Г. Петровская, 1967); Bacillus megaierium (М. Ozaki, 1966); Enterococcus faecalis (M. Gepson, 1999); Yersiniapestis (Е.Г. Булгакова, B.B. Кутырев, 2002).

Глава 6. Функциональная организация и механизмы гемолитической активности холерных вибрионов

Эпидзначимые холерные вибрионы, содержащие ctx ген, не лизируют эритроциты барана, но лизируют эритроциты кролика и морской свинки. Их называют негемолитичными вариантами. Неэпидемические холерные вибрионы не содержат ctx гена и лизируют эритроциты барана, кролика и морской свинки. Это гемолитичный вариант холерных вибрионов. В связи с этим гемолитическая активность в пробе Грейга (по отношению к эритроцитам барана) в системе эпидемиологического надзора за холерой в Российской Федерации используется в качестве дополнительного критерия оценки эпидемической значимости выделенных штаммов, обеспечивая большое подспорье практическим лабораториям, которым недоступны биологические in vivo и молекулярно-биологические методы. Несмотря на большое количество работ, посвященных гемолизину, остаются невыясненными механизмы гемолитической активности штаммов холерных вибрионов по отношению к эритроцитам кролика (атокси-генные, токсигенные штаммы) и барана (атоксигенные штаммы).

В соответствии с последними данными литературы К. Chattopadhyay (2003), HlyA синтезируется как препрогемолизин — 82 кДа и переносится в среду для культивирования как прогемолизин - 79 кДа (proHlyA), протеолитиче-ское расщепление HaN-коице образует зрелый HlyA величиной 65 кДа и 15 кДа с активностью по отношению к эритроцитам кролика и синтетическим липид-ным везикулам. Следует обратить внимание на то, что гемолиз эритроцитов ба-

рана не изучался, а описание взаимодействия HlyA с эритроцитами кролика отражает конформационные изменения молекулы, не затрагивая функциональные характеристики процесса гемолиза. Высказано предположение о лектиновой природе HlyA (R. Olson, 2003; К. Chattopadhyay, 2003).

Исходя из полученных нами данных, основными компонентами, участвующими в гемолизе эритроцитов барана атоксигенными холерными вибрионами, являются галактозоспецифичный лектин (HlyA); лецитиназа (1ес); липаза (hlyC); продукция этих веществ кодируется генами hly области малой хромосомы, а также, нейраминидаза, кодируемая самостоятельным геном (папН). На основании этих результатов можно предположить следующий механизм реализации гемолитической активности.

Основным рецептором на мембране эритроцитов барана для реализации гемолиза является галактоза (цереброза), которую содержат гликолипиды (це-реброзиды, ганглиозиды), а также тансмембранный белок гликофорин. За связывание с галактозой ответственен рициноподобный лектиновый домен HlyA. Ингибирование галактозой гемолиза эритроцитов барана показано нами на цггаммах холерных вибрионов разных биоваров и сероваров и подтверждается данными R. Olson (2003), о том, что гемолизин содержит домен, родственный растительным лектинам. Взаимодействие лектинов с ферментами включает все случаи образования комплексов в результате белок-углеводных взаимодействий (В.М. Лахтин, 1989). Существует гипотеза о том, что биологическое действие многих бактериальных лектинов обусловлено их ^функционированием с липолитическими ферментами (N. Gilboa-Garber, 1988). В случае с лектином HlyA можно предположить именно такой путь биохимической реализации гемолитической активности у холерных вибрионов.

Возможный функциональный комплекс — галактозоспецифичный лектин (HlyA) — нейраминидаза - является очень физиологичным для холерных вибрионов, так как сиаповая кислота является терминальным углеводным остатком в гликолипидах и гликопротеинах (гликофорин), связанным с субтерминальным остатком р-галактозы. Поэтому лектины, строго специфичные Д-галактозе, не могут связываться с последней без отщепления сиаловой кислоты. Нейраминидаза отщепляет сиаловые кислоты, чем демаскирует остатки р-галактозы, делает их более доступными для лектина, что проявляется в увеличении количества рецепторов на поверхности клетки (Ю.В. Езепчук, 1977; Y.Goldstein, 1978; М.Д.Луцик, 1981).

Установленный в нашей работе факт участия нейраминидазы в гемолизе эритроцитов барана холерными вибрионами подтверждается данными литературы (Н. Zang, 1999) о рецепторе гемолизина, которым является Р-сиалогликопротеин гликофорина мембран эритроцитов человека, и сведениями о том, что высокоочищенная молекула HlyA вступает во взаимодействие с гли-копротеинами, не имеющими сиаловых кислот (К. Chattopadhyay, 2003).

По нашим данным, лецитиназа принимает участие как в лизисе эритроцитов барана атоксигенными (гемолитичными) штаммами, так и в лизисе эритроцитов кролика атоксигенными и токсигенными штаммами, что было показано

на препаратах гемолизинов и штаммах холерных вибрионов разных биоваров и серологических групп. У токсигенных штаммов, не способных к лизису эритроцитов барана, реализация лизиса эритроцитов кролика холерными вибрионами осуществляется, по всей видимости, комплексом лецитиназы и N-концом полипептида, который участвует в формировании пор. На 28 штаммах холерных вибрионов - токсигенных и атоксигенных мы убедились, что галактоза в форме D и ß не ингибирует гемолиз эритроцитов кролика в отличие от эритроцитов барана, что свидетельствует о различном механизме гемолитической активности и ставит под сомнение участие галактозоспецифичного домена в реализации гемолиза эритроцитов кролика штаммами холерных вибрионов. Участие лецитиназы в гемолизе подтверждается результатами S. Pal (1996), который выделил гемолизин, представляющий собой бифункциональную молекулу HlyPC (Hly фосфолипаза С), вызывающую лизис эритроцитов кролика, обладающую лецитиназной и энтеротоксической активностью.

Ген hlyC или НрА был клонирован и секвенирован М.А. Ogierman (1997), выделен белок 18 кДа (T.B. Casanova, 1995). Показана высокая степень гомологии с липазой Pseudomonas sp. До настоящего времени фенотипическое проявление гена hlyC не было описано. Нами были подобраны условия, сконструирована питательная среда, содержащая в качестве субстрата куриный жир, с помощью которой была выявлена липазная активность именно у гемолитичных штаммов холерных вибрионов, что объясняло присутствие липазы в препаратах гемолизинов, лизирующих эритроциты барана. Для доказательства того, что мы имеем дело с продуктом гена hlyC, мы использовали липазу Pseudomonas sp. «Sigma» для получения иммуноглобулинового полимерного диагностикума и на 130 штаммах холерных вибрионов эльтор продемонстрировали наличие липазы (hlyC) у гемолитических штаммов холерных вибрионов. Известно, что липазная активность реализуется на поверхности двух фаз - липид-вода, что может играть свою роль при взаимодействии продукта гена hlyA с липидными везикулами или с эритроцитами барана, мембрана которых богата ацилглицеро-лами. По данным К. Chattopadhyay (2003) HlyA может находиться в трех формах. Для pro HlyA, характерны отсутствие лектинового домена и неспособность взаимодействовать с липидами, однако он вызывает гемолиз эритроцитов кролика. В соответствии с нашими данными, именно эта форма неспецифической активности имеет место при гемолизе эритроцитов кролика холерными вибрионами. Она осуществляется доменом каналоформирования, вероятно при вспомогательной роли лецитиназы. В этом случае гемолиз ингибируется осмо-протекторами, которым соответствует размер пор. Вторая форма - это зрелый HlyA, обладающий лектиновым доменом, который по нашим данным участвует в гемолизе эритроцитов барана, выполняя функции рецептора. Поэтому инги-бирование гемолиза галактозой характеризуется специфичностью и не зависит от молекулярной массы ингибитора. При взаимодействии с липидами у зрелого HlyA нарушается нативная третичная структура, и он превращается в негемо-литичный олигомер. Вполне логично, что в условиях раздела фаз липид-вода для сохранения третичной структуры необходим гидролиз липидов, который

может осуществиться при действии липазы. Третья форма — олигомер Н^А, гемолитически неактивный с обусловленной углеводами гемагглютинирующей активностью, что согласуется с нашими данными об участии ranактозоспецифично го лекгина в гемагглютинирующей способности штаммов холерных вибрионов. 4

Таким образом, описанные в последних зарубежньк работах (R. Olson, 2003; К. Chattopadhy^, 2003) явления взаимодействия HlyA с эритроцитами кролика и липидными вези1улами отражают структурный, но не функциональный*. характер гемолиза. Очевидно, что Н)уА, являясь гемолизином-предшественниюм, молекула больше потенциальная. Реализация же гемолитической активности зависит от живых клеток холерных вибрионов, условий культивирования и эритроцитов, с которыми они взаимодействуют. Несмотря на полученные нами новые результаты о природе гемолитической активности холерных вибрионов, проведенные исследования ответили лишь на некоторые вопросы, касающиеся этого феномена. Установление многоюмпонентности процесса гемолиза холерных вибрионов позволило наметить ряд важных направлений, развитие которых позволит внести новый вклад в представления об особенностях биологии возбудителя холеры. г.

ВЫВОДЫ

1. На штаммах холерных вибрионов различных серологических групп показано, что лекгиновый рецептор,детерминируемый геном hlyA, принимает участие в лизисе эритроцитов барана, но не кролика, взаимодействует с углеводами II группы3,4 - ОН транс D форма (D-галактоза), избирателен к аномерам Р (Р-галактоза) (по классификации О. Мёкела). Лектино-вая природа HlyA может обусловливать способность последнего к кЬм-плексообразованию с различными гидролитическими ферментами.

2. Сформулирована концепция о гемолитической активности холерных вибрионов как сложном полифункциональном процессе, включающем взаимодействие лекгина с галактозой на поверхности мембран эритроцитов барана, участие нейраминидазы в десиализации мембран и ферментов,

' действующих налипиды и фосфолипиды.

3. Показано участие галаетозоспецифичного лещинового рецептора в процессах взаимодействия токсигенных и атоксигенных холерных вибрионов

" * с клеточными мембранами: гемагглютинации эритроцитов кролика и баг рана, адгезии к эритроцитам барана и человека.

4. Разработана питательная среда для выявления триацилпжцероллипазной активности холерных вибрионов с использованием в качестве субстрата куриного жира: . • ,. .1

5. Выявлено и на большом иэличестве штаммов показано, что гемолитич-ные холерные вибрионы эльтор обладают триацилглицероллипазной активностью, а негемолитичные - не обладают, что перспективно для раз* работки методовдифференциальнойдиагностики V. cholerae.

6:' Показана возможность использования иммуноглобулинов, полученных к

чужеродному, но гомологичному антигену липазы Pseudomonas sp. (Sigma), с целью конструирования диагности 1^ма для выявления липазы холерных вибрионов.

7. Сконструирован и мму но гл о бул ино вый антпипазный диагноста Бум, позволяющий выявлять в РАО гемолитические штаммы, обладающие ли-пазной активностью.

8. Выявлен различный диапазон вибриоциногенной активности препаратов гемолизинов по отношению к индикаторным культурам холерных вибрионов и некоторых энтеробактерий.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Телесманич HP. К вопросу о гемолизине несолерогенных вибрионов / Ростовский НИ противочумный ин-т. - Ростов н/Д, 1997.-10 с. - Библиогр. 54 назв. - Деп. ВИНИТИ.-13.11Э7.-№3299-В97.

2. Телесманич HP., Bmioiyp Н.И., Непомнящая HJ5. Действие «гемо» цитолизина V. cholerae поп Ol на холерные вибрионы // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: Матер. 2-ой мезвдунар. конф., посвящ. 75-лет ин-та им. Пастера.- С.-П6., 1998,- С. 146.

3. Телесманич HP. Гемо-цитолизин Vibrio cholerae: механизмы действия in vitro и h vivo II Журн. микробиол, эпидемиол., иммунобиол.-1999,- №3.-С. 89-93.

4. Телесманич HP., Меньшикова ЕА., Титова С.В., Винокур Н.И., Непомнящая HJJ. Характеристика токсического действия гемолизина V. cholerae non OI Р-11702 на клетки близкородственных прокариот и простейших эу кари-от // Пробл. юмис. «Холера и патоген, для человека вибрионы». - Ростов н/Д 1999.-Вып. 12,-С. 85-86.

5. Телесманич HP., Вино1ур Н.И., Меньшиюва ЕА., Непомнящая HJB. Бактерицидные свойства гемоцитолизина из штамма Vibrio cholerae поп Ol P-11702 на наборе индикаторных культур для выявления вибриоцинов И Журн. микробиол., эпидемиол.,иммунобиол.-2000,- №6.- С.74-76.

6. Телесманич HP., Винокур НИ., Непомнящая HJJ., Меньшикова ЕА. Бактерицидные свойства гемоцитолизина Vibrio cholerae поп Ol И Журн. микробиол ., эпидемиол., и мму нобиол -2000 .-№ 5.- С. 84-86.

7. Телесманич HP., Непомнящая Н.Б., Шиманюк Н.Я., Винокур НИ. Возможная роль нейраминидазы в активности гемолизина из штамма поп Ol Р-11702 // Пробл. юмис. «Холера и патоген, для человека вибрионь». - Ростов н/Д 2000.-Вып. 13,-С. 82-83.

8. Телесманич HP., Непомнящая НБ., Винокур НИ. Гемолизины холерных вибрионов как липоплиюпротеиновые полиферментные комплексы // Пробл. ко мис. «Холер а и патоген, для чел о века вибрионы».- Роста в н/Д, 2001.

-Вып. 14.-С. 52-55.

9. Мишанькин М.Б., Телесманич Н.Р. Компьютерный анализ нуклео-тидной и аминокислотной последовательностей гена hlyA гемолизина Vibrio cholerae // Пробл. комис. «Холера и патоген, для человека вибрионы». - Ростов н/Д, 2001. - Вып. 14. - С.56-57.

10. Телесманич Н.Р., Мишанькин М.Б. Биологическая роль гемоцитоли-зина холерных вибрионов // Пробл. комис. «Холера и патоген, для человека вибрионы». - Ростов н/Д, 2002. - Вып. 15. - С. 46-49,

11. Телесманич Н.Р., Мазрухо Б.Л., Винокур Н.И. Новый дифференциальный тест для выявления нетоксигенных штаммов холерных вибрионов // Пробл. комис. «Холера и патоген, для человека вибрионы». - Ростов н/Д, 2002. -Вып. 15.-С. 143-144.

12. Телесманич Н.Р. Общебиологическая роль гемолизина холерных вибрионов // Intern. J. Immunorehabilitation. - 2002. - Т. 4, № 2. - С. 222-227.

13. Телесманич Н.Р., Безуглова Е.В., Винокур Н.И., Мишанькин М.Б. Роль лектина (HlyA) в гемолитической и гемагглютинирующей активности холерных вибрионов // Холера: Матер. VIII Росс. науч. - практ. конф. по пробл. «Холера».- Ростов н/Д, 2003. - С. 165-166.

14. Саямов С.Р., Телесманич Н.Р. Ультраструктурные изменения холерных вибрионов при действии гемоцитолизина из штамма V. cholerae не OI Р-11702 // Биотехнология, - 2003. - № 1. - С. 33-38.

15. Телесманич Н.Р., Ломов Ю.М., Бардых И.Д., Винокур Н.И. Лектино-вые рецепторы холерных вибрионов, роль Сахаров в адгезии // Пробл. комис. «Холера и патоген, для человека вибрионы». - Ростов н/Д, 2004. - Вып. 17. - С. 33-36.

16. Телесманич Н.Р., Ломов Ю.М., Агафонова В.В., Терентьев А.Н., Карбышев Г.Л., Безуглова Е.В. Новые подходы к дифференциации токсигенных и атоксигенных штаммов холерных вибрионов эльтор на основе лилазной активности // Пробл. комис. «Холера и патоген, для человека вибрионы». - Ростов н/Д, 2004. - Вып. 17.-С. 32-33.

17. Телесманич Н.Р. Триацилглицероллипазная активность гемолитических холерных вибрионов // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол.-2004,-№2.-С. 11-14.

18. Телесманич Н.Р., Ломов Ю.М., Агафонова В.В., Терентьев А.Н., Карбышев Г.Л. Триацилглицероллипазная активность холерных вибрионов как основа для разработки методов определения эпидемиологической значимости штаммов // Медицинская микробиология - XXI век: Всеросс. науч. - практ. конф. - Саратов, 2004. - С. 219-220.

19. Иванова Н.Г., Сальникова О.И., Телесманич Н.Р. Paramecium caudatum - как модель in vitro для изучения биологической активности бактериальных токсиновУ/Матер. VIII Всерос. съезда эпидемиол., микробиол., пара-зитол.: Сб. ст. - Москва, 2002. - Т. 1 - С. 179-180.

20. Телесманич Н.Р., Ломов Ю.М., Бардых И.Д., Винокур Н.И. Характеристика адгезивных и некоторых других свойств холерных вибрионов tep* ctx",

изолированных из объектов внешней среды на территории Ростовской области в 2002 г. // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол.-2004.- № 6. - С. 3-6.

21. Телесманич Н.Р., Безуглова Е.В., Винокур Н.И., Мишанькин М.Б. Роль лектина (Н1уА) в гемолитической и гемагглютинирующей активности холерных вибрионов // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол.-2004,- № 5. -С. 12-16.

22. Телесманич Н.Р., Ломов Ю.М. К вопросу о природе гемолитической активности холерных вибрионов // Пробл. комис. «Холера и патоген, для человека вибрионы». - Ростов н/Д, 2005. - Вып. 18. - С. 59-64.

23. Телесманич Н.Р., Винокур Н.Р. Способ дифференцировки атоксиген-ных штаммов холерных вибрионов от токсигенных // Патент на изобретение №2257415,27 июля 2005 г.

24. Телесманич Н.Р., Безуглова Е.В., Карбышев ГЛ., Агафонова В.В. Способ выявления атоксигенных гемолитичных штаммов холерных вибрионов // Патент на изобретение .№2261444, 27 сентября 2005 г.

Сдано в печать 6.03.2006 г. Подписано к печати 6.03.2006 г. Формат 84x108 1/16 Печать лазерная. Гарнитура Тайме. Объем 2,0 ус. пл. Тираж 100 экз.

Отпечатано в компьютерном центре Ростовского НИПЧИ

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Телесманич, Наталья Робертовна

f СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ХОЛЕРНЫХ

ВИБРИОНОВ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Гемолитическая активность в эволюции возбудителя холеры.

1.2. Проблемы очистки и характеристики препаратов гемолизинов.

1.2.1. Методы очистки гемолизинов холерных вибрионов.

1.2.2. Механизм действия гемолизинов холерных вибрионов как токсинов i каналоформеров.

1.2.3. Организация и экспрессия генов, детерминирующих синтез гемолизина холерных вибрионов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 2. ФЕРМЕНТЫ В ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ.

2.1. Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей структурных генов, составляющих hly область генома холерных вибрионов и их продуктов.

2.1.1. Компьютерный анализ аминокислотной последовательности полипептида, продукта гена hlyA.

2.1.2. Компьютерный анализ аминокислотной последовательности полипептида, продукта гена 1ес.

2.1.3. Компьютерный анализ аминокислотной последовательности полипептида, продукта гена hlyB.

2.1.4. Компьютерный анализ аминокислотной последовательности полипептида, продукта гена hlyC.'.

2.2. Детекция ферментативных активностей в препаратах гемолизинов,

Л полученных с помощью многоэтапных схем очистки.

2.3. Двухэтапная схема очистки гемолизина холерных вибрионов, детекция ферментативных активностей фракций препарата.

ГЛАВА 3. РОЛЬ ТРИАЦИЛГЛИЦЕРОЛЛИПАЗЫ И ЛЕЦИТИНАЗЫ В ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ.

3.1. Разработка питательной среды для выявления триацилглицероллипазной активности холерных вибрионов.

3.2. Конструирование антилипазного полимерного иммуноглобулинового диагностикума на основе коммерческого препарата липазы Pseudomonas sp. фирмы «Sigma» для изучения липазной активности холерных вибрионов.

3.3. Роль лецитиназы в гемолитической активности холерных вибрионов.

ГЛАВА 4. БИОЛОГИЧЕСКАЯ ФУНКЦИЯ ГЕНА HLY А,

ДЕТЕРМИНИРУЮЩЕГО ПРОДУКЦИЮ ЛЕКТИНА.

4.1. Общие сведения о лектинах.

4.2. Углеводная специфичность лектина (Н1у А), выявленная в реакции торможения гемолиза.

4.3. Участие галактозоспецифичного лектина в агглютинации эритроцитов токсигенными и атоксигенными штаммами холерных вибрионов.

4.4. Метод осмотической протекции в изучении механизма действия гемолизинов.

4.5. Углеводная специфичность некоторых лектиновых рецепторов холерных вибрионов в процессе адгезии (на модели эритроцитов).:.

ГЛАВА 5. ДЕЙСТВИЕ ГЕМОЛИЗИНА НА КЛЕТКИ

МИКРООРГАНИЗМОВ.

5.1. Изучение влияния препаратов гемолизина на рост клеток грам грам" бактерий.

5.2. Ультраструктурные изменения холерных вибрионов при действии гемолизина из штамма V. cholerae не 01 Р 11702.

ГЛАВА 6. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И МЕХАНИЗМЫ ^ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ХОЛЕРНЫХ

ВИБРИОНОВ.

6.1. Гемолитическая активность холерных вибрионов эльтор.

6.2. Гемолитическая активность классических холерных вибрионов.

6.3. Гемолиз и биологические мембраны.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы гемолитической активности холерных вибрионов"

Актуальность проблемы.

Данные многолетник наблюдений позволяют высказать предположение, что индикатором эволюционной смены возбудителя холеры и одним из критериев оценки появления вирулентных форм явилась гемолитическая активность холерных вибрионов. Гемолитическая активность вибрионов эльтор до возникновения 7-й пандемии отличала их от классических холерных вибрионов. Начало 7-й пандемии охарактеризовалось появлением фенотипически негемоли-тичного варианта этого биовара, и в результате гемолитическая активность как тест, дифференцирующий биовары, утратил своё значение (Gotshlich F., 1905, Kraus R., 1903, Doorenbos W., 1932, Roy C., 1962, Greig E., 1914, Вейде A.A., 1975; Святой В.И., 1978; Адамов A.K., 1979 и др.).

Существует два экологических варианта холерных вибрионов, которые различаются по способности лизировать эритроциты барана в пробе Грейга. Вариант, не разрушающий эритроциты барана, с учетом его других свойств, является эпидзначимым, продуцирующим холероген, и гемолитический вариант, который принято считать авирулентным или слабовирулентным. В настоящее, время описаны два типа гемолитической активности: I тип, лизирующий эритроциты барана и других видов животных в пробе Грейга, II тип, не лизирующий эритроциты барана, но активный по отношению к эритроцитам кролика, морской свинки и других видов животных (Семиотрочев В.Л., 1987). В свою очередь каждый из них подразделяют на два варианта: а (лизис через 24 часа) и Р (лизис через 2 часа) (Семиотрочев В.Л., 1990). Однако продолжает оставаться открытым вопрос: чем отличаются типы гемолитической активности холерных вибрионов - интенсивностью экспрессии гена hly (количественно) или разным механизмом действия?

Гемолитичность холерных вибрионов, обусловленную экспрессией комплекса hly генов (Fiore Е., 1997), расположенного на малой хромосоме, принято рассматривать как альтернативу холерогенности и, соответственно, эпидемической опасности. Все биовары холерных вибрионов, обладают консервативным ф лецитиназа - гемолизин - липазным (lec - hly А - hly В - hly С) локусом (Fiore

Е., 1997). Отдельные штаммы холерных вибрионов эльтор могут продуцировать гемолизин, лизирующей эритроциты барана, в отдельных случаях сочетая в себе свойства гемолитичности и холерогенности (Осауленко О.В., 1994), что может затруднять дифференциацию холерогенных штаммов от нехолерогенных по гемолитической активности в общепринятом тесте Грейга.

Сравнительно недавно был показан механизм действия гемолизина как порообразующего токсина (Цитцер А.О., 1992; 2001; Chattopadhyay К., 2003). В настоящее время интенсивно изучаются конформационные изменения молекулы HlyA при взаимодействии с эритроцитами кролика и липидными везикулами (Saha N., 1997; Harris J., 2002; Olson R., 2003; Chattopadhyay K., 2003). Однако в этих исследованиях отражена больше структурная сторона процесса, чем функциональная. При этом не раскрывается реализация гемолитической активности живыми клетками холерных вибрионов, а также различие механизмов лизиса эритроцитов кролика и эритроцитов барана. Проведено патоморфологи-ческое исследование тонкого кишечника мышей - сосунков при воздействии гемолизина (цитолизина) (McCardell., 1985;Ray А., 2003). Сделан вывод, что гемолитическая активность может служить причиной диареи. ^ Отечественными специалистами установлено, что в пределах биовара способность к гемолизу эритроцитов барана может быть использована как один из критериев дифференциации эпидемических штаммов от неэпидемических, наряду с определением гена холерного токсина в ПЦР и биологической моделью, определяющей холерогенность (Никишина Г.П., 1974; Вейде А.А., 1979; Святой В.И., 1978; Кюрегян А.А., 1988; Уралева B.C., 1988; Подосинникова JT.C., 1989).

Зарубежные исследователи, уделяя много внимания изучению гемоли-4 зина холерных вибрионов, рассматривают его лишь как возможный фактор вирулентности, но не как фактор дифференциации эпидемически значимых штаммов. Поэтому зарубежные методы нацелены, в основном, на определение токсина реакциями латексной агглютинации и Elisa, а тест лизиса эритроцитов барана за рубежом продолжает оставаться тестом, дифференцирующим классический биовар от биовара эльтор.

В системе эпиднадзора за холерой в России гемолитическая активность в пробе по Грейгу является дополнительным критерием оценки эпидемической значимости штаммов, обеспечивая большое подспорье практическим лабораториям, которым недоступны биологические in vivo и молекулярно-биологические методы. С другой стороны, ограниченность подхода к дифференциации токсигенных и атоксигенных холерных вибрионов по гемолитической активности, который на протяжении 100 лет не претерпел существенных изменений, заставляет нас задуматься о том, что представляет собой гемолитическая активность холерных вибрионов и каким образом можно расширить спектр методических подходов, основанных на гемолитической активности.

Следует признать, что термин «гемолизин» (цитолизин, гемоцитолизин) (McCardell., 1985) отражает лишь результат воздействия биологически активного вещества на эритроциты и это условное название не говорит ни о его структуре и функциях, ни о конкретном механизме действия. Несмотря на то, что проблеме выделения и очистки гемолизина посвящено значительное количество зарубежных и отечественных работ, механизмы гемолитической активности холерных вибрионов и роль ферментов в реализации этого процесса живыми бактериальными клетками до настоящего времени оставались неизученными.

Цель и задачи исследования.

Целью работы явилось выяснение биологической характеристики, функциональной организации и механизмов гемолитической активности холерных вибрионов.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей полипептидов, продуктов генов, составляющих hly область, с помощью методов компьютерной геномики, что необходимо для прогнозирования основных биологических характеристик гемолитической активности.

2. Выяснить биологическую функцию гена hlyA, как гена, детерминирующего продукцию лектина, участвующего в гемолитической активности штаммов холерных вибрионов различных биоваров и серологических групп.

3.Изучить роль лектина в гемагглютинирующей и адгезивной активности холерных вибрионов in vitro на штаммах различных биоваров и серологических групп.

4. Осуществить детекцию ферментов в препаратах гемолизинов, выделенных из разных штаммов холерных вибрионов.

5. Разработать методы изучения липазной активности холерных вибрионов и апробировать их на большом количестве штаммов холерных вибрионов.

6. На штаммах холерных вибрионов установить взаимосвязь лецитиназной, липазной и гемолитической активности холерных вибрионов.

7. Изучить эффекты влияния гемолизинов холерных вибрионов на клетки прокариот.

Научная новизна.

Впервые лектиновая природа продукта гена hlyA выявлена путем инги-бирования гемолиза эритроцитов барана галактозой у штаммов холерных вибрионов (приоритет № 2004121534). Впервые сформулирована концепция о гемолитической активности как сложном, полифункциональном процессе, включающем взаимодействие лектина с галактозой на поверхности мембран эритроцитов барана, участие нейраминидазы в десиализации мембран и ферментов, действующих на липиды и фосфолипиды.

Впервые выполнен компьютерный анализ нуклеотидных (НК) последовательностей генов hly области и соответствующих аминокислотных (АК) последовательностей холерных вибрионов, на основании, которого составлено представление о функциональной организации и возможных механизмах гемолитической активности.

Впервые обнаружено и на штаммах холерных вибрионов различных биоваров и серологических групп показано фенотипическое проявление гена hlyA, детерминирующего продукцию лектина, определена его углеводная специфичность к галактозе и установлена роль в гемолитической активности холерных вибрионов (приоритет № 2004121534). На наборе токсигенных и аток-сигенных штаммов установлено, что галактозоспецифичный рецептор не принимает участие в лизисе эритроцитов кролика.

Впервые на штаммах холерных вибрионов различных серологических групп и биоваров показано участие галактозоспецифического лектина в гемагг-лютинации и адгезии in vitro.

Впервые определены углеводные рецепторы на мембране эритроцитов барана и кролика, участвующие в гемолизе, гемагглютинации, адгезии холерных вибрионов. Предложена модельная система in vitro для изучения влияния углеводов на процесс адгезии (приоритет №2005109733/13).

Впервые описана триацилглицероллипазная активность холерных вибрионов; установлена взаимосвязь липазной и гемолитической активности холерных вибрионов.

Впервые предложены методы изучения липазной активности холерных вибрионов. Разработана питательная среда (№ приоритет 2003135696/13) и ди-агностикум антилипазный иммуноглобулиновый полимерный сухой для ее детекции (приоритет №2004108603/15).

Впервые для получения диагностикума, выявляющего липазу холерных вибрионов, предложено использовать иммуноглобулин к гомологичному по структуре, но чужеродному для холерного вибриона антигену коммерческой липазы Pseudomonas sp., что апробировано на большом количестве штаммов холерных вибрионов эльтор.

Впервые выявлен различный диапазон вибриоциногенной активности препаратов гемолизинов по отношению к индикаторным культурам.

Теоретическая значимость.

Данные, полученные с помощью методов компьютерной геномики, несут высокую степень информативности и перспективны для выяснения новых неизвестных свойств и функций гемолизина холерных вибрионов. Установлена лектиновая природа продукта гена hlyA, которая объясняет способность последнего к комлексообразованию с различными гидролитическими ферментами. С помощью компьютерного анализа предсказаны продукты каждого из генов hly области и установлена степень гомологии с другими белками, что может быть использовано для дальнейших научных исследований, а в результате привести к совершенствованию подходов в дифференциальной диагностике холерных вибрионов.

Полученные сведения о лектине (Hly А) могут быть использованы для дальнейшего углубленного изучения роли лектинов в патогенезе холеры и острых диарей. Лектиновые свойства препаратов гемолизина и их специфичность к галактозидам могут быть использованы в разработке новых методов биотехнологии.

Взаимодействие лектинов с мембранными рецепторами метаболически полноценных клеток эукариот и прокариот, последующая их реакция являются удобной моделью для исследования регуляторных механизмов и углеводных рецепторов клеточной мембраны. Знание углеводной специфичности лектина Hly А позволяет применить его даже в виде «грубого» препарата, в качестве детектора определенных углеводных групп на поверхности цитомембран и выяснения участия последних в различных физиологических и патофизиологических процессах. Изучение ингибирующей способности Сахаров на адгезию холерных вибрионов in vitro дает возможность определить наличие или отсутствие углеводсвязывающих лектиновых рецепторов, участвующих в адгезии, что перспективно для изучения патогенеза холеры. Выявление у холерных вибрионов триацилглицероллипазной активности расширило наши представления о биологии возбудителя холеры. Полученная информация об использовании иммуноглобулинов к липазе Pseudomonas sp. (Sigma) для выявления липазы холерных вибрионов перспективна в плане использования чужеродных, но гомологичных по структуре коммерческих антигенов, с целью конструирования препаратов для изучения фенотипа других микроорганизмов.

Практическая значимость.

Разработана питательная среда для выявления липазной активности холерных вибрионов. Данные по липазной активности холерных вибрионов позволили предложить новый способ дифференциации токсигенных (негемоли-тичных) от атоксигенных (гемолитичных) штаммов в дополнение к тесту Грей-га на основе определения триацилглицероллипазной активности. Принцип реакции (способность гемолитичных вибрионов к гидролизу жиров) может быть использован для разработки других методов биохимической идентификации и дифференциации V. cholerae. Сконструирован антилипазный полимерный им-муноглобулиновый диагностикум на основе липазы Pseudomonas sp. (Sigma), который в реакции объемной агломерации выявляет гемолитичные атоксиген-ные штаммы по продукции липазы. Препарат перспективен в плане изучения закономерностей проявления липазной активности у холерных вибрионов в РАО. Получены сведения о возможности использования чужеродных, но гомологичных антигенов для серологических реакций.

Получены положительные решения на выдачу патентов по заявкам: «Способ выявления атоксигенных гемолитичных штаммов холерных вибрионов» (№ 2004108603/15 (009067); «Способ дифференциации атоксигенных штаммов холерных вибрионов от токсигенных» (№ 2003135696/13 (038310); «Способ выявления лектиновых рецепторов микроорганизмов и их токсинов» (№ 2004121534/(023081); «Способ определения ингибирующей способности Сахаров на адгезию холерных вибрионов» (№ 2005109733/13).

Одобрены Ученым советом и утверждены директором РостНИПЧИ методические рекомендации «Новый дифференциальный тест для выявления гемолитичных холерных вибрионов» (протокол №3 от 23.05.02); «Инструкция по изготовлению и контролю антилипазного полимерного иммуноглобулинового диагностикума» (протокол №1 от 13.01.05). Положения, выносимые на защиту:

1. Гемолитическая активность холерных вибрионов является сложным полифункциональным процессом, включающим взаимодействие лектина с галактозой на поверхности мембран эритроцитов барана, участие нейраминидазы в десиализации мембран и ферментов, действующих на липиды и фосфолипиды.

2. Лектиновый рецептор, детерминируемый геном hlyA, принимает участие в лизисе эритроцитов барана, но не кролика, взаимодействует с углеводами II группы - 3,4 - ОН транс Д форма (Д - галактоза), избирателен к аномерам р ф галактоза) (по классификации О. Мёкела).

3. Галактозоспецифичный лектиновый рецептор принимает участие в процессах взаимодействия токсигенных и атоксигенных холерных вибрионов с клеточными мембранами: гемагглютинации эритроцитов кролика и барана, адгезии к эритроцитам барана и человека.

4. Холерные вибрионы эльтор обладают триацилглицероллипазной активностью, коррелирующей с гемолитической активностью этих микроорганизмов, что перспективно для разработки методов дифференциальной диагностики V. cholerae.

5. Иммуноглобулины к чужеродному, но гомологичному антигену липазы Pseudomonas sp., могут быть использованы для разработки методов выявления липазной активности холерных вибрионов.

Апробация работы.

Результаты исследований были представлены на научных конференциях: «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». Международная конференция, посвященная 75-летию института им. Пастера. С.-Петербург, 1998 г.

Юбилейная научная конференция, посвященная 70-летию НИИ микробиологии МО РФ. Киров, 1998 г.

Российская научно-практическая конференция по проблеме «Холера». Ростов-на-Дону, 1995 г.

Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 1999 г.

Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2000 г.

Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2001 г.

Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2002 г.

VIII съезд Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва, 2002 г.

VIII Российская научно-практическая конференция по проблеме "Холера». Ростов-на-Дону, 2003 г.

Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2004 г.

Всероссийская научно-практическая конференция «Медицинская микробиология - XXI век». Саратов, 2004 г.

Проблемная комиссия «Разработка и стандартизация медицинских иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики инфекционных болезней». Москва, 2004 г.

Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2005 г.

Публикации результатов исследований.

По теме диссертации опубликовано 22 научные работы, 9 - в центральной печати, из них четыре обзорных. Представлено пятнадцать докладов на конференциях и проблемных комиссиях. Получены положительные решения на выдачу патентов по заявкам: «Способ выявления атоксигенных гемолитичных штаммов холерных вибрионов» (№ 2004108603/15 (009067); «Способ дифференциации атоксигенных штаммов холерных вибрионов от токсигенных» (№ 2003135696/13 (038310); «Способ выявления лектиновых рецепторов микроорганизмов и их токсинов» (№ 2004121534/(023081); «Способ определения ингибирующей способности Сахаров на адгезию холерных вибрионов» (№2005109733/13).

План диссертационной работы утвержден на заседании Ученого совета ФГУЗ РостНИПЧИ Роспотребнадзора (протокол № 3 от 14 мая 2003 г.)

Структура работы.

Диссертация написана в виде монографии, изложена на 256 страницах, состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, каждая из которых включает описание материалов и методов, результаты собственных исследований, их обсуждение, за которым следуют заключение и выводы. Диссертация иллюстрирована 32 таблицами и 41 рисунком. Библиографический указатель содержит 291 информационный источник, в том числе 128 работ отечественных и 163 - зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Телесманич, Наталья Робертовна

ВЫВОДЫ

1. На штаммах холерных вибрионов различных серологических групп показано, что лектиновый рецептор, детерминируемый геном hlyA, принимает участие в лизисе эритроцитов барана, но не кролика, взаимодействует с углеводами II группы - 3,4 - ОН транс Д форма (Д - галактоза), избирателен к аномерам р (р галактоза) (по классификации О. Мёкела). Лектиновая природа HlyA может обусловливать способность последнего к комплексообразованию с различными гидролитическими ферментами.

2. Сформулирована концепция о гемолитической активности холерных вибрионов как сложном полифункциональном процессе, включающем взаимодействие лектина с галактозой на поверхности мембран эритроцитов барана, участие нейраминидазы в десиализации мембран и ферментов, действующих на липиды и фосфолипиды.

3. Показано участие галактозоспецифичного лектинового рецептора в процессах взаимодействия токсигенных и атоксигенных холерных вибрионов с клеточными мембранами: гемагглютинации эритроцитов кролика и барана, адгезии к эритроцитам барана и человека.

4. Разработана питательная среда для выявления триацилглицероллипаз-ной активности холерных вибрионов с использованием в качестве субстрата куриного жира.

5. Выявлено и на большом количестве штаммов показано, что гемоли-тичные холерные вибрионы эльтор обладают триацилглицероллипаз-ной активностью, а негемолитичные - не обладают, что перспективно для разработки методов дифференциальной диагностики V. cholerae.

6. Показана возможность использования иммуноглобулинов, полученных к чужеродному, но гомологичному антигену липазы Pseudomonas sp. (Sigma), с целью конструирования диагностикума для выявления липазы холерных вибрионов.

7. Сконструирован иммуноглобулиновый антилипазный диагностикум, позволяющий выявлять в РАО гемолитические штаммы, обладающие липазной активностью.

8. Выявлен различный диапазон вибриоциногенной активности препаратов гемолизинов по отношению к индикаторным культурам холерных вибрионов и некоторых энтеробактерий.

227

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Гемолитическая активность холерных вибрионов в пробе Грейга на протяжении многих лет является одним из эффективных способов оценки эпидемической значимости штаммов, наряду с выявлением гена токсинооб-разования с помощью ПЦР, ДНК-зондирования и определением чувствительности к фагам эльтор ctx+ и ctx". С одной стороны, гемолитическая активность, тестируемая в пробе по Грейгу, является дополнительным критерием оценки эпидемической значимости штаммов, обеспечивая большое подспорье практическим лабораториям, которым недоступны биологические in vivo и молекулярно-биологические методы. С другой стороны, ограниченность подхода к дифференциации токсигенных и атоксигенных холерных вибрионов по гемолитической активности, который на протяжении 100 лет не претерпел существенных изменений и дополнений, заставляет нас задуматься о том, что представляет собой гемолитическая активность холерных вибрионов. Исходя из сделанных обобщений, мы акцентировали внимание на выяснении особенностей феномена гемолиза. Конкретной задачей .явилась детекция ферментов, что, по нашему мнению, и согласно проведенному компьютерному прогнозированию, имеет немаловажное значение в осуществлении биологической роли гемолитической активности.

Для прогнозирования и объяснения свойств гемолизина холерных вибрионов нами был проведен компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей генов hly-области V. cholerae, который позволил сделать следующие обобщения:

1. ген hlyA кодирует полипептид, который относится к классу лектинов -поверхностно-активных веществ;

2. гемолитическая активность холерных вибрионов не опосредована активностью одного гена (hlyA); по всей видимости, феномен гемолиза -это сложный полифункциональный процесс, являющийся результатом взаимодействия продуктов нескольких генов;

3. определенная роль в гемолитической активности должна принадлежать фосфолипазе С и триацилглицероллипазе, так как гены, которые принято считать основными генами гемолитической активности hlyA и hlyB, окружают гены lec (лецитиназы) и hlyC (липазы). Проведенный нами анализ литературы и компьютерный анализ всех генов hly области холерных вибрионов позволил обосновать и объяснить свойства препаратов гемолизина, которые были описаны ранее другими авторами, такие как лизис эритроцитов различных животных (Семиотрочев В.Л., 1987; Адамов А.К., 1979; Подосинникова Л.С., 1989); цитотоксическая активность по отношению к клеточным культурам разного происхождения (Цитцер А.О., 1992, 2002); энтеротоксичность (McCardell, 1985), способность к пороформированию и каналоформированию (Цитцер А.О., 1992, 1997, 2002, 2003; Chattopadhyay К., 2002, 2003).

Одной из задач нашего исследования явилась детекция ферментов и других составляющих гемолитической активности холерных вибрионов в препаратах гемолизинов, полученных из разных штаммов холерных вибрионов с помощью многоэтапных схем очистки, предложенных другими авторами (Мишанькин М.Б., 1981; Романова Л.В., 1983; Уралева B.C., 1985; Оленичева Л.С., 1989), и отдельных фракций препарата, полученного нами с помощью двухэтапной схемы очистки. Ферментативные активности в препаратах гемолизинов определяли с помощью общепринятых клинико-диагностических экспресс-методов.

Изучив проявление гемолитичного фенотипа препаратов из штаммов V. cholerae не 01 Р-11702 (I тип а), любезно предоставленного Б.Н. Мишань-киным; V. cholerae eltor 9949 (I тип а), любезно предоставленного B.C. Ура-левой; мутанта V. cholera cholerae 461/67-34 (О") (I тип |3), любезно предоставленного О.П. Фецайловой (авт. свидетельство №4109359/2813); V. cholerae cholerae 569 В, любезно предоставленного Л.С. Оленичевой; (II тип а); V. cholerae eltor 14965 (I тип Р), очищенного нами. Установлено, что «активные» препараты гемолизинов холерных вибрионов эльтор, лизирующие эритроциты барана, содержат как минимум трех фермента - лецитиназу, липазу, нейраминидазу. Препарат гемолизина из штамма V. cholerae cholerae 569 В, лизирующий только эритроциты кролика, проявлял лецитиназную и нейраминидазную активности, не обладая липазной. В связи с этим возник вопрос насколько закономерно существование обнаруженных ферментов в препаратах, и как они связаны с гемолитической активностью. На основании полученных данных нами было выдвинуто предположение, что липазная активность при определенных условиях может являться маркером гемолитич-ности эритроцитов барана атоксигенных штаммов, это согласуется с мнением зарубежных исследователей о возможном участии липидов и липазы в ориентации гемолизина на поверхности раздела фаз липид-вода (Chattopadhyay К, 2002,2003; Olson R., 2003).

Несмотря на то, что ген нейраминидазы не является структурным геном hly области, нейраминидаза, по всей видимости, играет важную роль в биологическом действии гемолизина, подготавливая клетки-мишени к контакту и поражению. Данный факт подтверждается рядом работ (Козырева JT.A., 1978; Езепчук Н.В., 1983; Zhang D., 1999), в которых освещается роль нейраминидазы в реализации функции бактериальных токсинов. Нами установлено, что все препараты гемолизинов, очищенные разными авторами и способами содержали нейраминидазу. Этот факт согласуется с работами зарубежных исследователей последних лет (Zhang D., 1999; Chattopadhyay К., 2002, 2003) о взаимодействии гемолизина с сиалоглкопротеином гликофори-на. Известно также, что сиаловые кислоты экранируют Р-галактозу гликоли-пидов и гликопротеинов, поэтому для взаимодействия лектинов с галактозой необходима десиализация мембран (Луцик М.Д., 1980)

Проявления как нейраминидазной, так и лецитиназной активности штаммами холерных вибрионов довольно хорошо изучены. Установлено, что ни одна из этих активностей не является сугубо специфичной для гемоли-тичных атоксигенных холерных вибрионов (Донская Т.Н., 1978; Бугоркова Т.В., 1983; Колесникова Л.И., 1984; Евлахова С.П., Мишанькин Б.Н., 1998).

Одной из причин неизученности триацилглицероллипазной (липазной) активности у холерных вибрионов являлось отсутствие методов ее анализа, потому что последняя реализуется на поверхности раздела фаз липид-вода. Поэтому очередной задачей нашего исследования стала отработка методик изучения липазной активности холерных вибрионов. Нами была сконструирована питательная среда для выявления липазной активности холерных вибрионов, и показана корреляция липазной и гемолитической активности на большом количестве штаммов холерных вибрионов эльтор (приоритет №2003135696).

Установленная нами и другими авторами (Casanova Т.А., 1995; Ogier-man М.А., 1997) гомология липазы холерного вибриона с липазой Pseudomonas sp. позволила открыть новое направление в получении диагностических препаратов - возможность использования чужеродных, но гомологичных по структуре антигенов для серологических реакций. Мы использовали коммерческий препарат липазы Pseudomonas sp. («Sigma») для конструирования ан-тилипазного полимерного иммуноглобулинового диагностикума для изучения закономерностей проявления липазной активности у холерных вибрионов в РАО. Разработанный нами антилипазный диагностикум позволяет выявлять липазную активность у гемолитичных штаммов холерных вибрионов, выделенных из окружающей среды (приоритет № 2004108603). На наш взгляд, предложенные нами методы изучения липазной активности холерных вибрионов позволили затронуть лишь некоторые аспекты характеристики последней у холерных вибрионов. С помощью предложенных нами методов возможно изучение закономерностей проявления липазной активности у других биоваров и сероваров холерных вибрионов, выделенных из разных объектов, и установления взаимосвязи липазной активности с другими факторами патогенности при других условиях культивирования, что на сегодняшний день остается актуальным.

Таким образом, мы установили, что в «гемолитическом» фенотипе холерных вибрионов могут принимать участие ферменты липидного обмена

- лецитиназа и липаза, последняя коррелирует с гемолитической активностью атоксигенных штаммов. Тем не менее, предстояло ответить на один из главных вопросов: «Какое же вещество, принятое называть «гемолизином», детерминирует собственно структурный ген hlyA?». Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей генов и их продуктов, составляющих hly область холерных вибрионов, позволил обратить внимание на то, что доменная организация полипептида HlyA (HlyB) очень сходна с доменной организацией лектинов. Анализ показал наличие 1) домена сигнального пептида, который участвует в активации гемолизина-предшественника путем протеолиза. По данным (Hall R.H., 1990) полипептид гемолизина-предшественника (м.м 83200 кДа), кодируемый геном hly, подвергается протеолизу с образованием 3 белков с м.м. - 79,4; 68,6; 65,3 кДа. Мотив сигнального пептида располагается на N-конце полипептида HlyA, состоит из 40 аминокислотных остатков. Наличие сигнального пептида характерно для лектинов. Обычно он располагается на N-конце и включает до 15-40 аминокислот, его функция - активация незрелого лектина (пролектина) путем протеолиза (Лахтин В.М., 1994);

2) трансмембранный домен обеспечивает транспорт лектина из клетки микроорганизма. Ген hlyB кодирует синтез белка-порина, необходимого для секреции гемолизина, связанного с внешней мембраной холерного вибриона, отвечает за функции бактериальной хемотаксической чувствительности, обеспечивающей процесс передачи сигнала внутрь клеток, везикулярного транспорта и рецепторного слияния мембран;

3) домен, образующий ионные каналы, необходим для реализации токсического действия бактериальных лектинов (Лахтин В.М., 1994). При помощи компьютерного анализа мотив под кодовой характеристикой «haemolysin роге» был обнаружен ближе к N-концу полипептида HlyA в положении 288-481. Фенотипическое проявление этого домена HlyA-хорошо известно, оно заключается в формировании пор, каналов и, в результате, ци-тотоксической активности гемолизина (Zitzer А., 1997; Jkigai Н., 1996);

4) углеводсвязывающий домен (лектиновый) является ключевым признаком принадлежности белка к лектинам. Именно этот домен бактериальных лектинов обусловливает агглютинацию, преципитацию, адгезию микроорганизмов, способность лектинов к образованию фимбрий, пилей, а также к образованию всевозможных комплексов, в частности с ферментами. Наличие углеводсвязывающих доменов обусловливает полифункциональность лектинов (Лахтин В.М., 1989, 1994; Луцик М.Д., 1984). В положении 484-600 (116 ак) полипептида HlyA нами был обнаружен мотив лектинового домена В-цепи рицина. Результаты проведенного нами компьютерного анализа позволили с высокой степенью вероятности предположить, что продуктом гена HlyA является лектин. В последующем аналогичный компьютерный анализ был проведен R. Olson (2003), который также предположил наличие рицино-подобного лектина, отсутствующего у других родственных микроорганизмов. Способность связываться с углеводами у авторов вызывала сомнения по причине низкой гомологии лектиновых доменов растений и холерных вибрионов. Поэтому очередной задачей нашей работы была идентификация свойств гемолизина (hlyA) холерных вибрионов как лектина, изучение участия лектина (HlyA) в гемолитической активности на большом количестве штаммов разных сероваров холерных вибрионов, учитывая наличие двух типов гемолизинов - лизирующего эритроциты барана (атоксигенные штаммы) и лизирующие эритроциты кролика (токсигенные и атоксигенные штаммы).

На препаратах гемолизинов и штаммах холерных вибрионов, лизи-рующих эритроциты барана и кролика, с помощью реакции торможения гемолиза углеводами, основываясь на данных компьютерного анализа установлено, что лектиновый рецептор HlyA взаимодействует с углеводами III группы - 3,4-ОНтрансДформа, избирателен к аномерам р по классификации О. Мёкела, принимает участие в лизисе эритроцитов барана, но не эритроцитов кролика. Некоторые зарубежные авторы (Chattopadhyay К., 2002) сообщают об ингибиции гемолиза эритроцитов кролика гликопротеинами с Р-галактозиловыми молекулами. Однако сами же авторы свидетельствуют, что чувствительность кроличьих эритроцитов к hlyA не коррелирует с поверхностной плотностью галактозы. В связи с чем наши результаты при использовании чистой галактозы (D- р) при ингибиции гемолиза эритроцитов кролика на большом количестве штаммов адекватно отразили отсутствие ингибиции. Углеводным рецептором для гемолизина на поверхности мембраны эритроцитов барана является галактоза. Моделью для изучения галактозоспецифич-ного лектина и других лектиновых рецепторов холерных вибрионов для нас явилась не только модель гемолиза, но и гемагглютинации и адгезии к эритроцитам. В гемолизе эритроцитов кролика принимает участие N-конец pro HlyA - домен каналоформирования, вызывающий неспецифический гемолиз, который способен ингибироваться различными осмопротекторами, масса которых соответствует размерам пор в эритроцитах кролика.

Общепризнано, что адгезия является начальным и необходимым элементом патогенеза, а структуры (лектины), обусловливающие адгезивность возбудителя к клеткам хозяина, признаны определяющими факторами пато-генности (Yangulu N.K., 1996; Alouf J.E., 1982; Франц X., 1983; Луцик М.Д., 1981; Лахтин В.М., 1994). Показано, что лектины взаимодействуют с глико-каликсом щеточной каймы энтероцитов и вызывают его повреждение. Это приводит к нарушению функции всасывания слизистой кишечника, повышает ее проницаемость для бактериальных токсинов. Они же усиливают катаболизм белков в тканях и приводят к нарушению азотистого баланса. Лектины устойчивы к протеолизу в желудочно-кишечном тракте (Brady Р., 1978; Liener I., 1976). Однако микроорганизмы, обладая лектинами (агглютининами, адгезинами), при помощи последних участвуют в различных межклеточных взаимодействиях (Луцик М.Д., 1981; Лахтин В.М., 1994; Chivelli D.A., 2001; Flemming Н.С., 1998; Ипполитов И.Г., 2003; Chattopadhyay К., 2003).

Относительно лектиновых рецепторов (адгезинов) холерных вибрионов и их участия в различных межклеточных взаимодействиях в литературе до настоящего времени имелись отрывочные сведения. В нашей работе мы обобщили имеющиеся в литературе данные, дополнив их полученными нами новыми сведениями. В результате чего сформировали новое направление исследований, которое нуждается в дальнейшем развитии, так как изучение молекулярных основ взаимодействия холерных вибрионов с клетками человека и животных, идентификация лектиновых гаптенов холерных вибрионов и их углеводных рецепторов, несомненно, будет способствовать расшифровке структурно-клеточных механизмов действия токсинов холерного вибриона и углублению наших представлений о начальных этапах патогенеза холеры, а также позволит совершенствовать методические подходы профилактики и лечения холеры. Кроме обнаруженных ранее маннозочувствительного лектина (Chivelli D.A., 2001), лектина, узнающего N-ацетилглюкозамин на поверхности эритроцитов цыплят (Sasmal D., 2002), нами обнаружен галактозоспе-цифичный лектин, принимающий участие в лизисе эритроцитов барана (приоритет № 2004121534), гемагглютинации холерными вибрионами эритроцитов барана и кролика, участвующий в адгезии холерных вибрионов. Нами выявлены также лектиновые рецепторы, узнающие на поверхности эритроцитов N-ацетилД-галактозамин и глюкозу. Оба эти рецептора участвуют в адгезии штаммов холерных вибрионов 01 на модели эритроцитов, предложенной Брилисом В.И. (1986). Нами установлено, что рецептор, узнающий глюкозу, является специфическим при агглютинации эритроцитов кролика холерными вибрионами эльтор ctx+ (глюкоза не ингибирует агглютинацию эритроцитов кролика у других представителей холерных вибрионов). Данный принцип может быть использован при идентификации и дифференциации токсигенных вибрионов эльтор. Действие, ингибирующее адгезию холерных вибрионов, нами выявлено у глюкосолана - препарата, применяемого для ре-гидратационной терапии.

Результатом проведенной нами работы явилось установление у препаратов гемолизина антагонистических свойств по отношению к клеткам холерных вибрионов, некоторых шигелл и сальмонелл. О специфичности действия гемолизинов свидетельствовал разный спектр их ингибирующей активности по отношению к индикаторным культурам для изучения вибриоциногенности, соответствующий типу гемолизина. Препараты гемолизинов I тип а, лизирующие эритроциты барана через 24 часа, обладали узким спектром бактерицидной активности, препарат I тип Р, лизирующий эритроциты барана через 2 часа, ингибировал рост большого количества индикаторных культур. Сыворотка к гемолизину холерного вибриона не 01 группы нейтрализовала как гемолитическую, так и бактерицидную активность препаратов.

При помощи электронной микроскопии методом ультратонких срезов нами установлено, что при действии препарата гемолизина на клетки холерных вибрионов наблюдается значительное увеличение числа клеток с деградацией нуклеоида и рибосомного комплекса, что позволяет назвать их лизи-рованными. У некоторых клеток холерных вибрионов поврежден пептидог-ликан клеточной стенки. Установленный феномен не противоречит данным литературы о том, что у некоторых бактерий гемолитическая и бактерицидная активность тесно связаны: бактериоцин и гемолизин Streptococcus zymo-genes (Петровская В.Г., 1967); Bacillus megaterium (Jzaki M., 1966); Enterococ-cus faecalis (Gepson M., 1999); Yersinia pestis (Булгакова Е.Г., Кутырев B.B., 2002).

По нашим данным препараты гемолизинов холерных вибрионов ин-гибировали рост холерных вибрионов, некоторых шигелл и сальмонелл, в слабой степени штаммов некоторых лактобацилл. В связи с вышесказанным можно выдвинуть предположение, что в явлениях бактериоциногении важную роль могут играть лектиновые и углеводные рецепторы. Таким образом, понимание молекулярной основы адгезии микроорганизмов, которая имеет место в любых межклеточных взаимодействиях и явлениях, требует знаний о поверхностных компонентах патогенов, в частности холерных вибрионов.

Несмотря на полученные нами новые результаты о природе гемолитической активности холерных вибрионов, проведенные исследования, по всей видимости, ответили лишь на некоторые вопросы, касающиеся этого феномена. Установление многокомпонентности процесса гемолиза у холерных вибрионов послужило предпосылками для разработки новых методических приемов, направленных на совершенствование дифференциальной диагностики V. cholerae, и наметить ряд важных направлений, дальнейшее развитие которых позволит внести новый вклад в представления о биологии возбудителя холеры.

225

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Телесманич, Наталья Робертовна, Ростов-на-Дону

1. Адамов А.К., Быстрый Н.Ф., Шмеркевич Д.Л., Середин В.Г. Методика дифференцирования патогенных и апатогенных вибрионов Эль Тор // Пробл. особо опас. инф. Саратов. -1971, Вып. 1. - С. 116-123.

2. Адамов А.К., Наумшина М.С. Холерные вибрионы. Саратов, 1984. - 328 с.

3. Андрусенко И.Т. Исследование факторов, влияющих на вирулентность холерных вибрионов и разработка новых методов ее определения: Автореф. дис. д-ра мед. наук. Саратов, 1991 - 43 с.

4. Андрусенко И.Т., Адамов А.К., Яговкин Э.А., Шепелев А.П. Изучение биологического действия холерного энтеротоксина холерного вибриона // Сб. научных трудов. Вып. 1,- Новороссийск, 1994. - С. 173-175.

5. Андрусенко И.Т., Пастернак Н.А., Ведьмина Е.А. и др. Действие энтеротоксина Vibrio cholerae на микроорганизмы // Журн. микробиол., эпидемиол., и иммунобиол. 1984.- № 10.- С. 52-55.

6. Андрусенко И.Т., Фрунзе О.В., Шепелев А.П., Адамов А.К., Щуркина И.И. Использование реакции гемагглютинации с целью изучения адгезивно-сти вибрионов. Лаб. дело. 1987. № 3.

7. Биохимия человека / Р. Мари, Д. Греннер, П. Мейес, В. Родуэлл. М.:1. Мир, 1993.-Т. 1.-384 с.

8. Брилис В.И., Брилене Т.А., Ленцер Х.П., Ленцер А.А. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов // Лаб. дело. 1986. №4. - С. 210212.

9. Брокерхоф X., Дженсен Р. Липолитические ферменты. М.: Мир, 1978. -396 с.

10. Бугоркова Т.В., Майоров Н.В., Казакова Е.С., Адамов А.К. Некоторые биохимические особенности двух штаммов V. cholerae 0139 серовара // Эко-лого эпидемиол. надзор за природно - очаг. инф. в Северном Прикаспии: Сб. науч. тр. - Астрахань, 1996.- С. 96-97.

11. Бугоркова Т.В., Шмеркевич Д.Л., Наумшина М.С. Характеристика штаммов холерных вибрионов биовара эльтор по протеолитической и лецитиназной активности // Биохимия, патофизиол. и микробиол. особо опас. инф. -Саратов, 1978. С. 76-82.

12. Булгакова Е.Г., Кутырев В.В. Генетическая детерминированность гемолизина чумного микроба // Матер. VIII съезда Всерос. об-ва эпидемиол., микробиол. и паразитол. М., 2002. - Т. 1. - С. 142.

13. Бырдаров С.В. Экспериментальная микробиология. София: Медицина и физкультура, 1965. - 372 с.

14. Вейде А.А., Марамович А.С., Ганин B.C. и др. Характеристика холерных вибрионов, выделенных в Астраханской области в 1970 г. // Пробл. особо -опас. инф.- Саратов, 1975. Вып. 2. С. 81-85.

15. Вертиев Ю.В. Токсин-опосредованная обусловленность инфекционных заболеваний // Мол. структура бактериальных токсинов и генетич. контроль их биосинтеза: Тез. 1-й Всесоюз. конф. М., 1985. - С. 28-30.

16. Вертиев Ю.В., Езепчук Ю.В. Бактериальные нейраминидазы: некоторые физико-химические и биологические свойства и связь их с патогенностью микробов // Веста. АМН СССР. 1973. - № 12. - С. 56-61.

17. Власов В.П., Монахова Е.В., Подосинникова JI.C. и др. Использование Тох-зонда для изучения холерных вибрионов // Пробл. мед. и сан. микро-биол. города: Тез. обл. конф. Ростов-на-Дону, 1987. - С. 14-16.

18. Власов В.П., Монахова Е.В., Ушакова И.Е. и др. Гемолизин Vibrio cholerae el tor: клонирование и экспрессия генов в Escherichia coli // Мол. генетика, микробиол. и вирусология. 1992 - № 7-8. - С. 14-20.

19. Водопьянов С.О., Мишанькин М.Б., Олейников И.П. и др. Разработка способа выявления гена tcpA холерного вибриона биотипа эльтор и серова-рианта 0139 Бенгал с помощью полимеразной цепной реакции // Биотехнология.-1999.-№ 6. С. 19-23.

20. Гинцбург A.JL, Грижебовский Г.М., Токарская О.Н. и др. Изучение полиморфизма штаммов холерного вибриона разного происхождения методом геномной дактилоскопии // Генетика.- 1989.- T.XXV, № 7.- С. 1320-1324.

21. Гинцбург A.JL, Янишевский Н.В., Мотин B.JI. и др. Организация и клонирование структурных генов энтеротоксина Vibrio cholerae eltor RV 79// Мол. генет., микробиол. и вирусол.- 1984,- № 9.- С. 12-18.

22. Громов Б.В. Строение бактерий. Л.: Изд-во ЛГУ, 1985. - 190 с.

23. Далин М.В., Фиш Н.Г. Белковые токсины микробов. М., 1980. - 224 с.

24. Джапаридзе М.Н., Наумов А.В., Никитина Г.П. и др. Оральная химическая вакцина из гипертоксигенных штаммов КМ-76 Инаба и КМ-68 Огава возбудителя холеры // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1991. -№ 4.-С. 31-33.

25. Домарадский И.В. Зачем микробам токсины? (о роли токсинов в экологии бактерий) // Мол. генет., микробиол. и вирусол.- 1990.- № 9.- С. 3-10.

26. Домарадский И.В. Некоторые проблемы адаптации патогенных бактерий к окружающей среде // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1997. -№ 4.-С. 31-35.

27. Домарадский И.В. Роль токсинов в экологии бактерий // Журн, микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1993. - № 1. - С. 103-106.

28. Донская Т.Н. Ферметативная активность холерных вибрионов // Пробл. особо опас. инф. Саратов, 1978. - Вып. 3. - С. 59-63.

29. Дуванова О.В., Шиманюк Н.Я., Мишанькин Б.Н. Способность расщеплять твин 20 как дифференциальный тест для вибрионов 0139 серовара различного происхождения // Клин. лаб. диагн. 2000, № 5. - С. 48-49.

30. Евлахова С.П., Мишанькин Б.Н. Протеолитическая и лецитиназная активность холерных вибрионов 0139 серовара // Пробл. сан. эпид. охраны территории стран Содр. Независ. Гос-в: Тез. докл. Междунар. науч. - практ. конф.- Саратов, 1998.- С. 154-155.

31. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул. М.: Медицина, 1985.-240 с.

32. Езепчук Ю.В., Вертиев Ю.В., Денисов JI.A. Роль нейраминидазы в функции бактериальных токсинов // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 1983. -№ 1.-С. 21-24.

33. Зыкин Л.Ф. Современное состояние вопроса о лабораторной диагностике холеры // Микробиол. и иммунол. особо опас. инфекций. Саратов, 1968. - С. 391-395.

34. Иммунология: в 3-х т. / Под ред. У. Пола. М.: Мир, 1989. Т. 3. - С. 49-50.

35. Ипполитов К.Т., Сироткин А.С., Панкратова С.А., Кюн М. Закономерности развития биопленки и особенности образования внеклеточных полимерных веществ штаммом Sphingomonas sp. // Биотехнология. 2003. - № 3. - С. 3-11.

36. Каральник Б.В. Эритроцитарные диагностикумы. -М., 1976. 164 с.

37. Колесникова Л.И., Гулида М.М., Фецайлова О.П., Кутырева И.В. Значение лецитиназы (фосфолипазы С) в вирулентности возбудителя холеры // Обл. науч. практ. конф. по пробл. «Холера»: Тез. докл.- Ростов-на-Дону, 1984.- С. 90-91.

38. Король В.В. Современное состояние и перспективы развития проблемы адгезии патогенных микроорганизмов // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. 1994. - № 4. - С. 45-48.

39. Король В.В., Алексеева Л.П., Гофман Е.Л. Метод изучения адгезивных свойств холерных вибрионов, меченных радиоактивным углеродом // Профилакт. природноочаговых инф.: Тез. докл. Всесоюз. науч. практ. конф. -Ставрополь, 1983. - С. 300-301.

40. Костромитина Е.А. Молекулярно-генетические свойства штаммов холерного вибриона с различной эпидемической значимостью: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 2004. - 22 с.

41. Крю Ж. Биохимия. Медицинские и биологические аспекты. М.: Медицина, 1979.-С. 195.

42. Кузьмиченко И.А., Грачев И.В., Плотников О.П. Деструктивная активность и рост холерного вибриона в присутствии твинов // Пробл. особо опас. инф. Саратов, 2001.-Вып. 1.-С. 101-105.

43. Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. М.: Медицина, 1983. - 272 е.

44. Лабораторная диагностика холеры. МУ 4.21097-02. Москва, 2002. - 95с.

45. Лахтин В.М. Молекулярная организация лектинов // Мол. биология. -1994.- Т. 28, №2.-С. 245-273.

46. Лахтин В.М., Биотехнология лектинов // Биотехнология. 1989. - Т. 5, № 6.-С. 616-691.

47. Ленцнер А.А., Брилис В.И., Брилене Т.А. // Теоретическая и прикладная инфекционная иммунология. М., 1982, - С. 93.

48. Ломов Ю.М., Онищенко Г.Г., Москвитина Э.А., Подосинникова Л.С. Характеристика современного этапа в развитии 7 пандемии холеры // Журн.микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1997. - № 6. - С. 39-42.

49. Ломов Ю.М. Пандемии холеры и эволюция возбудителя // Холера: Матер. 8 Росс. науч. практ. конф. - Ростов-на-Дону, 2003. - С. 13-23.

50. Луцик М.Д., Панасюк Е.Н., Антонюк В.А. и др. Методы поиска лектинов (фитогемагглютининов) и определение их иммунохимической специфичности: Метод, рекомендации.- Львов, 1980.- 20 с.

51. Луцик М.Д., Панасюк Е.Н., Луцик А.Д. Лектины. Львов, 1981. - 156 с.

52. Манувахова М.Ш., Богданова М.В., Несмеянова М.А. Изучение роли оболочки Е. coli в секреции гемолизина // Биологические мембраны. 1990. - Т. 7, № 4. - С. 390-398.

53. Меньшикова Е.А., Подосинникова Л.С., Миронова А.В., Сальникова О.И. Гемолитическая активность и токсигенность V. cholerae различных серог-рупп // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2002. - № 5. - С. 7-11.

54. Меньшикова Е.А. Гемолитическая активность токсигенных и нетокси-генных штаммов холерных вибрионов различных серогрупп: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Ростов-на-Дону, 2002. -18 с.

55. Меньшикова Е.А., Подосинникова Л.С., Соколенко А.В. и др. Гемолитическая активность токсигенных и атоксигенных штаммов V. cholerae и V. cholerae 0139 серогрупп // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -2004.-№5.-С. 106-108.

56. Методические рекомендации по выявлению вибриоцинов холерных вибрионов 01 и не 01 сероваров / Сост.: Л.В. Иванова, Л.Г. Воронежская, А.Г. Сомова., Н.С. Гончарова. Ростов н/Д, 1987. - 11 с.

57. Методические рекомендации по определению вирулентности холерныхвибрионов на модели кроликов-сосунков / Сост.: А.К. Адамов, Л.Ф. Зыкин, И.В. Исупов и др. Ростов н/Д, 1979 - 6с.

58. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов. МУК 4.1/4.2.588-96. МЗ России. М., 1996. - 128 с.

59. Мишанькин Б.Н., Родионова А.В., Рачицкая В.А., Романова Л.В. Способ получения гемолизина / А. с. 982347 (СССР). Заявл. 01.04.81, № 3275956/28. Опубл. в Б.И., 1984, № 46, 15.12.84. МКИ С 12 № 1/00.

60. Мишанькин Б.Н., Шиманюк Н.Я., Рябухина О.Ю. и др. Молекулярное клонирование генов нейраминидазы V. cholerae El Tor: Перспективы использования // Вестн. Всесоюз. микробиол. общества. Ростов, отд. Ростов н/Д, 1989.- Вып. I.-C. 149-156.

61. Мишанькин М.Б., Телесманич Н.Р. Компьютерный анализ нуклеотид-ной и аминокислотной последовательностей гена HLY А гемолизина Vibrio cholerae // Пробл. комис. «Холера и патоген, для человека вибрионы». Ростов н/Д, 2001.-Вып. 14.-С.56-57.

62. Молекулярная биология клетки / Б. Альберте, Д. Брей, Дж. Льюис и др. -М.: Мир, 1986. Т. 2. - С. 197-200.

63. Монахова Е.В., Власов В.П., Подосинникова Л.С. и др. Использование молекулярной гибридизации ДНК для определения потенциальной способности холерных вибрионов к синтезу холерного токсина//Бактериальные токсины: Сб. науч. тр. М., 1987. - С. 92-97.

64. Недзевецкий Э.Ф. К микрографии холеры,- 1872. // Оттиск из Московской медицинской газеты.

65. Нефедов К.С., Осин А.В., Ливанова Л.Ф., Смирнова Н.И. Фенотипическая и генотипическая характеристика штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор // Пробл. комис. «Холера и патоген, для человека вибрионы». Ростов н/Д, 2005.-Вып. 18.-С. 81-82.

66. Никитина Г.П., Урюпина Н.В. Методические особенности применения гемолитического теста для дифференциации биотипов холерных вибрионов //

67. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Мазрухо Б.Л. и др. Характеристика культур холерных вибрионов 01, изолированных из объектов окружающей среды на территории Российской Федерации в 2002 г. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2004. - № 2. - С. 3-8.

68. Определитель бактерий Берджи: В 2-х томах. М.: Мир, 1997. - Т. 1.

69. Осауленко О.В., Марамович А.С., Вейде А.А. Изучение стабильности гемолитического теста у штаммов Vibrio cholerae eltor различной вирулентности // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1983.- № П.- С. 100101.

70. Осауленко О.В., Пинигин А.Ф., Погорелов В.И. Изучение гемолизинов холерных вибрионов // Актуал. пробл. профилак. особо опас. и природно -очаг, инфекций: Тез. докл. науч. конф., посвящ. 60-лет. Иркутского ПЧИ.-Иркутск, 1994.-С. 122-123.

71. Осин А.В. Фенотипический и генетический анализ вирулентных и авиру-лентных штаммов Vibrio cholerae 0139: Автореф. дис. . канд. биол. наук. -Саратов, 2002. 22 с.

72. Пастернак Н.А., Ведьмина Е.А., Андрусенко И.Т. и др. Титрование энте-ротоксина холерных вибрионов на модели УФ-2 мутанта Staph, aureus 209р. // Лаб. дело. 1983. -№9. - С. 52-53.

73. Петровская В.Г. Проблема вирулентности бактерий. М: Медицина, 1967. - 263 с.

74. Подосинникова JI.C. Холерные вибрионы, выделенные на территории СССР в период седьмой пандемии: Автореф. дис. . д-ра мед. наук. Саратов, 1993.-44 с.

75. Подосинникова JI.C., Власов В.П., Монахова Е.В., Глянько Е.В. Оценка эпидемической значимости холерных вибрионов. Формула эпидзначимости штаммов Vibrio cholerae 01 // Пробл.-темат. комисс. по пробл. «Холера»: Информация.- Ростов н/Д, 1989,- С. 9.

76. Покровский В.И., Малеев В.В. Холера. М.: Медицина, 1978,- 232с.

77. Покровский В.И., Малеев В.В., Адамов А.К. Клиника, патогенез и лечение холеры.- Саратов, 1988.- 272 с.

78. Прозоровский С.В., Кац JI.H., Каган Г.Я. L-формы бактерий (механизм образования, структура, роль в патологии). М.: Медицина, 1981. - 240 с.

79. Резников Ю.Б., Стукова Н.Ю., Донская Т.Н.; под ред. Ледванова М.Ю., Неумова А.В. Клиническая микробиология холеры. Академическая серия «Международные стандарты». М., 1997. 26 с.

80. Рис Э., СтернбергМ. От клеток к атомам. М.: Мир, 1988. - 144 с.

81. Романова Л.В., Родионова А.В. Очистка и некоторые свойства гемолизина из клеток Vibrio NAG Р-11702 // Профилактика природно-очаговых инфекций: Тез.докл. Всесоюз. науч.-практ. конф Ставрополь, 1983. - С. 40-41.

82. Рубан Е.Л. Микробные липиды и липазы. -М.: Наука, 1977.-218 с.

83. Савельев В.Н., Грижебовский Г.М., Брюханов А.Ф. и др. Этиология холеры эльтор. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.- 1998.- №1.- С. 21-24.

84. Сальникова О.И., Помухина О.И., Подосинникова JI.C. Определение нейтрализующей активности иммунных сывороток к токсинам холерных вибрионов на модели культуры клеток // Иммунол. и спец. профил. ООИ.: Матер. Рос. науч. конф. Саратов, 1993. - С. 255.

85. Саямов С.Р., Телесманич Н.Р. Ультраструктурные изменения холерных вибрионов при действии гемоцитолизина из штамма V. cholerae Не 01 Р-11702 // Биотехнология, 2003. - № 1. - С. 33-38.

86. Саямов С.Р., Дунаев Г.С., Зыкин Л.Ф., Курилов В.Я. Автолитические процессы как возможный компонент механизма L-трансформации чумного микроба // Дезинфекция и стерилизация. Перспективы развития: Матер. Всес. науч. конф. Волгоград, 1983. - С. 118-119.

87. Саямов С.Р., Заренков М.И., Мишанькин Б.Н. Индукция пестицином изменений ультраструктуры чумного микроба, коррелирующих с продукцией экстрабактериальной каталазы II Биотехнология. 2000. - № 4. - С. 22-27.

88. Святой В.И. Изучение вирулентности гемолитически активных вибрионов Эль Тор в тесте Грейга // Пробл. особо опас. инф.- Саратов, 1978.-Вып. 3. - С. 42-44.

89. Семиотрочев В.Л. Изучение гемолитической активности холерных вибрионов эльтор // XII Межреспубл. науч. практ. конф. противочумн. уч-режд. Средней Азии и Казахстана по проф. чумы: Тез. докл.- Алма-Ата, 1985.-С. 281-283.

90. Семиотрочев В.Л., Бабицин С.Н., Цитцер А.О. Селекция клеток холерного вибриона 01, лишенных гемолитических свойств // Матер. Обл. науч.-практ. конф. Гурьевской ПЧС по профилактике ООИ. Гурьев, 1989. - С. 192-194.

91. Семиотрочев В.Л. Группы V. cholerae, имеющие различную эпидемическую значимость // Журн. микробиол., эпидемиол. и иимунобиол. 1990. -№4.-С. 61-67.

92. Скулачев В. П. Биоэнергетика. Мембранные преобразователи энергии. М.: Высш. шк., 1989.-271 с.

93. Смирнова Н.И., Ильина Т.С., Гончарова Н.С., Смирнов Г.Б. Мутанты Vibrio eltor с измененной продукцией гемолизина: получение и характеристика//Генетика.- 1982.-Т. 18, № 10.- С. 1730-1732.

94. Соловьев В.Д., Кобринский Г.Д., Гальцева Г.В., Саямов P.M. О роли нейраминидазы холерных вибрионов в патогенезе экспериментальной холеры // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 1975,- № 5. - С. 94-99.

95. Справочник биохимика / Р. Досон, У. Элиот, К. Джонс К. М.: Мир, 1991.-С. 240.

96. Суханова Г.А. Патохимия клетки. Томск: изд-во Томского мед. инта, 1990.- 150 с.

97. Тихомирова Е.И., Заднова С.П., Волох О.А. и др. Лектин вакцинного штамма Yersinia pestis EV и изучение его иммунобиологических свойств // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2003. - № 1. - С. 51-55.

98. Уралева B.C., Гулида М.М. Характеристика протеазной активности штаммов и мутантов Vibrio cholerae с различными биологическими свойствами //Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.- 1988.- № 9.- С. 7-10.

99. Уралева B.C., Кутырева И.В., Черепахина И.Я., Трубникова В.А. Адгезивные свойства штаммов и мутантов холерных вибрионов с различной биологической характеристикой // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1983. №7.-С. 51-55.

100. Уралева B.C., Фецфйлова О.П. Штамм вибриона V. cholerae cholera -продуцент гмолизина / Авторское свидетельство № 4109359/2813 (123125) от 11.08.86.

101. Уралева B.C., Гулида М.М. Протеазы возбудителя холеры // Пробл. мед. и сан. микробиологии города: Тез. обл. конф. Ростов-на-Дону, 1987. -С. 16-17.

102. Ушакова И.Е. Гемолитическая активность холерных вибрионов: Авто-реф. дис. канд. мед. наук. Саратов, 1993. - 22 с.

103. Фецайлова О.П., Уралева B.C. Иммуногенность гемолизина холерных вибрионов //1 съезд иммунологов России: Тез. докл. Новосибирск, 1992. -С. 495-496.

104. Фецайлова О.П., Уралева B.C., Цыгулева Н.Н. Особенности получения антигемолитических сывороток и их характеристика //1 съезд иммунологов России: Тез. докл. Новосибирск, 1992. - С. 496.

105. Фецайлова О.П., Уралева B.C., Помухина О.И. Сравнительная характеристика вирулентности холерных вибрионов // Генетика и микробиологияприродноочаговых инфекций. Саратов, 1984. - С. 56-60.

106. Франц X., Пфюллер К. Применение токсических растительных лектинов в изготовлении иммунотоксинов (аффинотоксинов) // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1983. - № 5. - С. 18-25.

107. Чистович Г.Н. Стафилококковая лецитиназа // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1950. - 10. - С. 54-57.

108. Шиманюк Н.Я., Дуванова О.В., Мишанькин Б.Н. Нейраминидаза холерных вибрионов 0139 серовара «Бенгал» // Матер, науч. практ. конф., по-свящ. 100-лет. образов, противочум. службы России. - Саратов, 1997. - Т. 2. -С. 151-152.

109. Цитцер А.О.Красильникова О.В., Муратхаджаев Д.Н., Семиотрочев B.JL Характеристика свойств цитолизина холерного вибриона Холера. Матер. Российской науч. конф. (Вопр. эпидем., микробиол. и лаб. диагностики). Ростов-на-Дону, 18-19 ноября 1992. С. 78.

110. Aim R.A., Manning P. A. Caractreization of the hly В gene and its role in the production of Eltor hemolysin of V. cholerae 01 // Mol. Microbiol. 1990. - №4 (3).-P. 413-425.

111. Aim R.A., Mayrhofer G., Kotlarski I., Manning P.A. Amino-terminal domain of the El Tor haemolysin of Vibrio cholerae 01 is expressed in classical strains and is cytotoxic // Vaccine. 1991. - Vol. 9, № 8. - P. 588-594

112. Alouf J.E. Bacterial toxin: an outlook // Toxicon. 1982, Vol. 20, № 1. - P. 211-216.

113. Barua D., Cvjetanovic В. Холера в период 1961-1970 гг. // Принципы ипрактика борьбы с холерой.-Женева, ВОЗ, 1971.- С. 15-21.

114. Baxter A., Beeley J., Changes in surface carbohydrate of human erythrocytes aged in vivo//Biochem. Soc. Trans. 1975. - Vol. 3, № 1. - P. 134-136.

115. Benz R., Schmid A., Wagner W., Goebel W. Pore formation by E. coli hemolysin: evidence for an association dissociation equilibrium of the pore-forming aggregates // Infect. Immun. - 1989. - Vol. 67, № 2. - P. 887-895.

116. Bernard P., Guillerm J., Gallut J. L hemolyse par le vibrion El Tor et par son hemolysine // Compt Rend. Soc. Biol.- 1939.- Vol. 130,- P. 147-148.

117. Bhattacharya M.K., Bhattacharya S.K., Yarg S. et al. Outbreak of Vibrio chol-erae non 01 in India and Bangladesh // Lancet.- 1993.- Vol. 341, № 8856.- P. 13461347.

118. Bhattacharya S.K., Bhattacharya M.K., Nair G.B. et al. Clinical profile of acute diarrhoea cases infected with the new epidemic strain of Vibrio cholerae 0139: designation of the disease as cholera//J. Infect.- 1993.-Vol. 27, № l.-P. 11-15.

119. Bishagratnas K. An English translation of the Sushruta Samhita Chowk-hamba Sanscrit Series Office. Varanasi, India, 1963.- P. 352-356.

120. Booth I.W., Harries J.T. Oral rehydration therapy: An issue of growing controversy // J. Trop. Pediatr. 1982. - Vol. 28. - P. 116-123.

121. Boyd W. Lectins // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1970. - Vol. 169. - P. 168-190.

122. Boyd W., Everhart D., Mc Master M. The anti- N lectin of Bauhinia purpurea//J. Immunol. 1958. - Vol. 81. - P. 414-418.

123. Brady P., Vannier A., Banwell J. Identification of the dietary lectin, wheat germ agglutinin, in human intestinal contents // Gastroenterology. 1978. - V. 75, № 2. - P. 236-239.

124. Broveli A., Balduini C.L. Membrane glycoprotein structure during erythro-% cyte life-span // Ital. J. Biochem. 1978. - Vol. 27, № 4. - P. 274-275.

125. Casanova T.B., Peterson K.M. The Vibrio cholerae hlyC gene encodes a proteinthat is related to lipases of pseudomonas species // DNA Seq. 1995. Vol. 5, №3. P. 181-184.

126. Chattopadhyay K., Bhattacharyya D., Baneijee K.K. Vibrio cholerae hemolysin. Implication of amphiphilicity and lipid-induced conformational change for its pore-forming activity // Eur J Biochem. 2002. - Vol. 269, № 17. - P. 4351 -4358.

127. Chattopadhyay K., Banerjee K.K. Unfolding of Vibrio cholerae hemolysin induces oligomerization of the toxin monomer // J Biol Chem. 2003. - Vol. 278, № 40. - P. 38470-38475. Epub 2003 Jul 23.

128. Cholera in 1983 // WER. 1984. - Vol. 59, № 33. - P. 353.

129. Cholera in 1988 // WER. 1989. - Vol. 64, № 19. - P. 141-148.

130. Chongsa-nguan M., Chalcumpa W., Moolasart P. et al. Vibrio cholerae 0139 Bengal in Bangkok//Lancet.- 1993.- Vol. 342, № 8868.- P. 430-431.

131. Cieplak W., Eidels L. Membrane-mediated cytotoxicity / Bonavida D., Collier R.J. Eds.-N.Y.: AlanR. Liss, 1987.-P. 19-26.

132. Coelho A., Andrade J.R., Vicente A.C., Dirita V.J. Cytotoxic cell vacuolating activity from Vibrio cholerae hemolysin // Infect Immun. 2000. - Vol. 68, № 3. - P. 1700-1705.

133. Col well R.R. Vibrios in the aquatic environment: an ecological paradigm. // Perspect. Microbiol. Ecol.: Proc. 4 л Intern. Symp. Ljubljana, 1987,- P. 426-434.

134. De Moor C.E. A non haemolytic El Tor Vibrio as the cause of an outbreak of paracholera in West New Guinea. The El Tor problem and pandemic paracholera in the West Pacific. // Trap. Geograph. Med.- 1963.- V. 15, № 2.- P. 97-107.

135. De Moor C.E. Paracholera (El Tor). Enteritis choleriformis El Tor Van Loghem.

136. Bull. Wld. Helth. Org. Geneva, 1949.- Vol. 2, № 1.- P. 5-17.

137. De Moor C.E. Un vibrion du type El Tor responsable, dans la partie sud de 1' ile ^ de Celebes (Indes Neerlandaises), d'une epidemie presentant les apparances completesdu cholera//Bull. Off. Int. Hyg. Publ.- 1938.- Vol. 30, № 7.- P. 1510-1519.

138. De S.N., Bhattacharyya K., Roychaudhury P.K. The haemolytic activities of Vibrio cholerae and related vibrios // J. Pathol. Bacteriol. 1954. - Vol. 67.- P. 117.

139. Doorenbos W. Etude sur la symbiose du vibrion cholerique avec le bacteriophage. Reproduction experimentale de caracteres biologiques des vibrions choleriques // Ann. Inst. Pasteur. 1932. - T. 48. - P. 457-469.

140. Dubert J.M., Stiewiez P., Rebeyrotte P. nouvelle methode de separations des proteins seriques par methanol application aux serum de lapin et de cheval // Ann. Inst. Pasteur. 1953. - Vol. 84. - P. 370-381.

141. Eshdat Y., Ofek I., Yashow-Gan Y. et al. Isolation of a mannose-specific lectin from E. coli and its role in the adherence of the bacteria to epithelial cells. // Biochem. Biophis. Res. Comm. 1978. - Vol. 85, № 4. - P. 1151-1559.

142. Farkas-Himsley H. Bacteriocins as growth inhibitors of neoplasma and tu-morigenic cells //IRCS Med. Sci.- 1976.- Vol. 4,- P. 291.

143. Faruque S.M., Comstock L., Kaper J.B., Albert J. Distribution of zonula occludens toxin (zot) gene among clinical isolates of Vibrio cholerae 01 from Bangladesh and Africa //J. Diar. Dis. Res. 1994. - Vol. 12, № 3. - P.222-224.

144. Feeley J.C., Pittman M. Studies on the haemolytic activity of El Tor vibrios // Bull. WHO. 1963. - Vol. 28. - P 347-356.

145. Felsenfeld O., Jatanasen S., Buspavanich B. et al. El Tor vibrios of the Ogava serotype occurring in an epidemic of diarrhoea with vomiting in Ubol, Thailand // J.

146. Trap. Med. Hyg. -1961. Vol. 64. - P. 207-210.

147. Figueroa-Arredondo P., Hueser J.E., Akopyants N.S. et al. Cell vacuolation caused by Vibrio cholerae haemolysin // Infect. Immun. 2001. - Vol. 69, № 3.-P. 1613-1624.

148. Finkelstein R., Hanne L. Purification and characterization of the soluble hemagglutinin (cholera lectin) produced by Vibrio cholerae // Infect. Immun. -1982. Vol. 36, № 3. - P. 1199-1208.

149. Fiore E., Michalski J., Russel R. et al. Cloning, characterization, and chromosomal mapping of a phospholipase (lecithinase) produced by Vibrio cholerae // Infect. Immun. 1997. - Vol. - 65, № 8. - P. 3112-3117.

150. Flemming H.C. Bakterien auf Oberflaechen. Skript zur Vorlezung: Universi-taet Stuttgart. Stuttgart, 1998. - S. 81.

151. Franz H., Ziska P. Lectins: Biology, biochemistry and clinical biochemistry / Eds. T.C Bog-Hansen.- Berlin; New York: Walter de Gruyter, 1981.- Vol. 1.- P. 179-184.

152. Fredericq P. Action antibiotique chez les Enterobacteriaceae // Rev. Beige Path. Med. Experimental. 1948. - Suppl. № 4. - P. 1.

153. Gallut J., Qniniou J. Взаимодействие вибрионов классической холеры биотипа Эль Тор и вибрионов НАГ // Бюлл. ВОЗ 1971. - Т. 42. № 3. - С. 480-482.

154. Gancik J., Schaner R. Sialic acid a determinant of the life-time of rabbit erythrocytes // Hoppe - Seylers's Zschr. Physiol. Chem. - 1974. - Vol. 355, № 4. -P. 395-400.

155. Ganguly N.K., Kaur T. Mechanism of action of cholera toxins and other toxins // Indian J. Med. Res.- 1996.- Vol. 104.- P. 28-37.

156. Gilboa-Garber N. Pseudomonas aeruginosa lectins as a model for lectin production, properties, applications and functions // Zbl. Bakt. Hyg. 1988. - Vol. 270,№ 1-2.-P. 3-15.

157. Goldberg S.L., Murphy J.R. Cloning and characterization of the hemolysin determinants from Vibrio cholerae RV 79 (Hly +), RV 79 (Hly "), and 5'69B //1.

158. Ф Bacteriol. 1985. - Vol. 162, № 1.-P. 35-41.

159. Goldberg S.L., Murphy J.R. Molecular cloning of the hemolysin determinant from Vibrio cholerae El Tor // J. Bacteriol.- 1984,- Vol. 160, № 1. P. 239-244.

160. Gotschlich F. Uber cholera und choleraahnliche Vibrionen unter den aus Mekka zuriickkehrenden Pilgern // Zschr. Hyg. Infektkr.- 1906. - Bd. 53, H 2.-S. 281-304.

161. Gotschlich F. Vibrions chol6riques isoles au campement de Tor. Retour du pelerinage de l'annee 1905. Rapport adresse au president du

162. Conseil quarantenaire d'Egypte, Alexandrie // Bull. Inst. Pasteur. -1905.- Vol. 3.- P. 726.

163. Green B.A., Newland J.W., Holmes R.K. Mapping of chromosomal genes that determine the El Tor biotype in Vibrio cholerae // Infect. Immun. 1983.- Vol. 42, № 3. - P. 924-929.

164. Greig E. The haemolytic action of indian strains of cholera and cholera-like vibrios // Indian. J. Med. Res.-1914.- Vol. 2.- P. 623-629.

165. Gruber M., Durham H.E. Eine neue Methode zur raschen Erkennung des Choleravibrio und des Typhusbacillus // Munch, med. Wschr.- 1896.- Bd. 43.- S. 285.

166. Gyobu Т., Kodama H., Sato S. Studies on the enteropathogenic mechanism of non 01 Vibrio cholerae. III. Production of enteroreactive toxins // Kansen-shogaku Zasshi. -1991. V. 65. -№ 7. - P. 781-787.

167. Hall R.H., Drasar B.S. Vibrio cholerae HlyA hemolysin is processed by proteolysis // Infect. Immun. 1990.- Vol. 58, № 10.- P. 3375-3379.

168. Hanson P.I., Heuser J.E., Jahn R. Neurotransmitter release-four years of SNARE complexes // Curr. Opin. Neurobiol. 1997 - Vol. 7, № 3. - P. 310-315.

169. Harris J.R., Bhakdi S., Meisner U. et al. Interactin of the Vibrio cholerae cytolysin (VCC) with cholesterol, some cholesterol esters, and cholesterol derivatives: а ТЕМ study // J. Struct. Biol. 2002. Vol 139, №2. - P. 122-135.

170. Hazelbauer G.L. The bacterial chemosensory system. // Can. J. Microbiol. -1988. Vol. 34, № 4. - P. 466-474.

171. Heidelberg J.F., Eisen J.A., Nelson W.C. et al. DHA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae // Nature. 2000. - Vol. 406, № 6795.-P. 477-483.

172. Hellin H. Der giftige Eiweisskorper Abrin und sein Wirkung auf Blut. -Dorpat, 1891.

173. Holmgren J.A., Svennerholm A.M. Enzyme-linked immunosorbent assays for cholera serology // Infect. Immun. 1973. - Vol. 7, № 5. - P. 759-763.

174. Honda Т., Finkelstein R.A. Purification and characterization of a haemo-lysin produced by Vibrio cholerae biotype El Tor: another toxic substance produced by cholera vibrios // Infect. Immun. 1979. - Vol. 26, № 3. - P. 1020-1027.

175. Hutchison M.L., Poxton I.R., Govan J.R.W. Burkholderia cepacia produces a hemolysin that is capable of inducing apoptosis and degranulation of mammalian phagocytes // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66, № 5. - P. 2033-2039.

176. Ichinose Y., Yamamoto K., Nakasone N. et al. Enteroxicity of El Tor -like hemolysin of non-Ol Vibrio cholerae // Infect. Immun. 1987. - Vol. 55, № 5.-P. 1090-1093.

177. Ikigai H., Nakae T. The rate assay of alpha toxin assembly in membrane // FEMS Microbiol. Lett. 1987. - Vol. 24, N 2-3. - P. 319-322.

178. Ikigai H., Ono T, Nakae T. et al. Two forms of Vibrio cholerae 01 El Tor hemolysin derived from identical precursor protein // Bioch. Bioph. Acta. 1999. - Vol. 1415, № 5. - P. 297-305.

179. Izumi N., Kondo H. Studies on Clostridium oedematiens toxins with special reference to differentiation of the lethal oedematous hemolytic and lecitinase activities // Jap. J. Med. Sci. Biol. 1978. - Vol. 31, №2. - P. 219-220.

180. Jesudason M.V., Cherian A.M., John T.J. Blood stream invasion by Vibrio cholerae 0139 //Lancet.- 1993,- Vol. 342, № 8868.- P. 431.

181. Kamata Y., Kozaki S., Sakaguchi G. et al. Evidence for direct binding of Clostridium botulinum type E derivative toxin and its fragments to gangliosides and free fatty acids // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1986. - Vol. 140, № 3. -P. 1015-1019.

182. Kammerer H. Bakterien und Blutabstoss // Arch. Exper. Path. Pharmac.-1920.- Bd. 88.- S. 247.

183. Kaper J.B, Bradford H.B., Roberts N.C., Falkow S. et al. Molecular epidemiology of Vibrio cholerae in the United States Gulf Coast // J. Clin. Microbiol.- 1982.-Vol. 16, №1.- P. 129-134.

184. Kaper J.B. Molecular approaches to the study of infectious diseases // Mar. Technol. Soc. J.-1981.- Vol. 15, № 2.- P. 41-44.

185. Karaolis D.K.R., Johnson J.A., Bailey C.C. et al. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1998.- Vol. 95, № 6,- P. 3134-3139.

186. Karaolis D.K.R., Lan R., Reeves P.R. The sixth and seventh cholera pandemics are due to independent clones separately derived from environmental, nontoxigenic, non-Ol Vibrio cholerae//J. Bacteriol.- 1995.-Vol. 177, № 11,- P. 3191-3198.

187. Karaolis D.K.R., Somara S., Maneval D.R. et al. A bacteriophage encoding a pathogenicity island, a type IV pilus and a phage receptor in cholera bacteria // Nature." 1999.- Vol. 399, № 6734.- P. 375-379.

188. Kemper M., Doyle R.J. Abstr. Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol. 87th Annu. Meet., At lanta, Ga, 1-6 March, 1987. - Washington, D.C., 1987. - P. 220.

189. Kemper M., Weissman С., Askanazi J. et al. Metabolic and respiratory changes during weaning from mechanical ventilation //Chest. 1987. - Vol. 92, N1. V* 6.-P. 979-983.

190. Kessel M., Klink F. Archaebacterial elongation factor is ADP-ribosylated by diphteria toxin // Nature. 1980. - Vol. 287, № 5779. - P. 250-251.

191. Keusch G.T. Donohue-Rolfe A., Jacewicz M. Microbial lectins and agglutinins / Ed. D. Mirelman N.Y.: J. Wiley, 1986. P. 271-296.

192. Kimura M., Sumizawa Т., Funatsu G. // Biosci. Biotechnol. Biochem. -1993. Vol. 57. № l.P. 166-169.

193. Kimura M., Sumizawa Т., Funatsu G. The complete amino acid sequences of the B-chains of abrin-a and abrin-b, toxic proteins from the seeds of Abrus preca-torius // Biosci Biotechnol Biochem. 1993. - Vol. 57, N1. - P. - 166-169.

194. Koch R. In: Conferenz zur Erorterung der Cholerafrage // Dtsch. med. Wschr.- 1884.- Bd. 10,- S. 499, 519.

195. Krasilnikov O.V., Muratkhodjaev J.N., Zitzer A.O. The mode of action of Vibrio cholerae cytolysin. The influences on both erythrocytes and planar lipid bilayers // Biochim. Biophys. Acta - 1992. - Vol. 1111, № 1. - P. 7-16.

196. Kraus R. Zur Differenzierung des Choleravibrio von artverwandten if Vibrionen // Wien. klin. Wschr. 1903. - Bd. 16. - S. 1382.

197. Kraus R., Pribram E. Uber Choleravibrionen und andere pathogenen Vibrionen. 1. Uber die Beziehungen der Vibrionen El Tor zu dem Choleravibrio // Zbl. Bakt., Abt. 1. Orig. - 1906. - Bd. 41, № 15. - S. 155.

198. Kriipe M. Blutgruppespezifische pflanzliche Eiweiskorper (Phytoagglutini-ne).- V. Enke, Stuttgart, 1956. 131 S.

199. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T 4 // Nature (London). 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.

200. Lakhtin V.M. Lectins: Biology, Biochemistry, and Clinical Biochemistry V.7 / Eds. J. Kocourek, D. Freed. St. Luis: Sigma Cem. Co. (USA). - 1990. - P. 417-426.

201. Lee J.H., Ahn S.H., Kim S.H. et al. Characterization of Vibrio mimicus phospholipase A (PhlA) and cytotoxicity on fish cell // Biochem Biophys Res Commun. 2002. - Vol. 298, №2. - P. 269-276.

202. Levine M.M., Kaper J.B., Herrington D. et al. Volunteer studies of deletion mutants of Vibrio cholerae 01 prepared by recombinant techniques // Infect. Immun. -1988. -Vol. 56, №1.- P. 161-167.

203. Loghem J.J. Van Un vibrion ElTor pathogene isole aux Indes Neerlandaises. // Bull. Off. Int. Hyg. Publ.- 1938.- T. 30, № 8.- P. 1520-1523.ft

204. Loghem J.J. van Unterschied zwischen Hamolyse und Hamodigestion auf der Blutagarplatte. Ill Mitteilung zur El Tor Frage // Zbl. Bak. I Abt. Orig.-1913.-Bd. 70.-S. 70-74.

205. Loghem J.J. van. Der El Tor Vibrio // Z. Hyg. Infekt. Kr.- 1932.- Bd. 114.-S. 20.

206. Loghem J.J. van. Uber den Unterschied zwischen El Tor und Cholera -Vibrionen // Zbl. Bak. I Abt. Orig.-1911,- Bd. 57- S. 289.

207. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement Ц with the folin phenol reagent//J. Biol. Chem.-1951.-Vol. 193,№ 1.-P265-275.

208. Makela O. Studies in hemagglutinins of leguminose seeds // Ann. Med. Exp. Biol. Fenniae. 1957. - Vol. 35, Suppl. 11. - 53 p.

209. Manning P.A., Brown M.H., Heusenroeder M.W. Cloning of the structural gene (hly) for the hemolysin of Vibrio cholerae El Tor strain 07 // Gene.- 1984.-Vol. 31, № 1-3.-P. 225-231.

210. Marxen M., Maienschein V., Volknandt W. et al. Immunocytochemical lo-^ calization of synaptic proteins at vesicular organelles in PC 12 cells // Neurochem.

211. Res. 1997. Vol. - 22, № 8. - P. 941-950.

212. McCardell B.A., Kothary M.H., Madden J.M. Two-step purification and partial characterization of a variant of the Vibrio cholerae non 01 hemolysin // FEMS Microbiol. Lett. 1999. - Vol. 180. № 2. - P. 177-182.

213. McCardell B.A., Madden I.M., Shah D.B. Isolation and characterization of a cytolysin produced by Vibrio cholerae serogroup non 01 // Canad. J. Microbiol. -1985.-Vol. 31, № 8. P. 711-720.

214. Mechow S., Vaidya A.B., Bramucci M.G. Mapping of a gene that regulates hemolysin production in Vibrio cholerae // J. Bacterid.- 1985.- Vol. 163, № 2.- P. 799-802.

215. Mekalanos J.J., Swartz D.J., Pearson Y.D. et al. Cholera toxin genes: nucleotide sequence, deletion analysis and vaccine development // Nature.-1983,- Vol. 306, № 5943. P. 551-557.

216. Mekalanos J.J., Waldor M.K., Rubin E.Y. Cholera: Molecular basis for emergence and pathogenesis // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1997. -Vol. 18, №4.-P. 241-248.

217. Mercurio A., Manning P.A. Cellular localization and export of soluble hemolysin of Vibrio cholerae eltor // Mol. Gen. Genet. 1985. - V. 200, № 3. - P. 472-475.

218. Montal M.S., Blewit R., Tomich J.M., Montal M. Identification of an ion channtl-forming motif in the primary structure of tetanus and botulinum neurotoxin //FEBS Lett. 1992.-Vol. 313, № l.-P. 12-18.

219. Moschioni M., Tombola F., de Bernard M., Coelho A., Zitzer A., Zoratti M., Montecucco C. The Vibrio cholerae haemolysin anion channel is required for cell vacuolation and death // Cell Microbiol. 2002. Vol. 4№ 7. - P. 397-409.

220. Mukerjee S. Characterization of the cholera typing phages. II. Thermal death points // Ann. Biochem. Exp. Med. 1961. - Vol. 21, № 9. - P. 265-266.

221. Ogierman M.A., Fallarino A., Riess T. et al. Characterization of the Vibrio cholerae eltor lipase operon lip AB and a protease gene down-stream of the hly region // J. Bacterid. 1997. - Vol. 179, № 22. - P. 7072-7080.

222. Olsnes S., Sandvig K. Receptor Mediated binding and internalization of toxins and hormones. - New York, 1981. - P. 81-94.

223. Olson R., Gouaux E. Vibrio cholerae cytolysin is composed of an alpha-hemolysin-like core // Protein Sci. 2003. - Vol. 12, № 2. - P. 379-383.

224. Ozaki M., Higashi Y., Saito H. et al. Identity of megacine A with phospoli-pase A. // Biken Journal. 1966. - Vol. 9, № 3. - P. 201-213.

225. Pal S., Datta A., Mallick R. et al. Electrophoretic mobility and immune response of outer membrane proteins of Vibrio cholerae 0139 // FEMS Immunol. Med. Microbiol.- 1996.-Vol. 15, №2-3.-P. 143-148.

226. Politzer R. Cholerae. Monograph Series, N43. - WHO, Geneva, 1959.

227. Ponniah S., Endres R.O., Hasty D.L., Abraham S.N. Fragmentation of Escherichia coli type 1 fimbriae exposes cryptic D-mannose-binding sites // J. Bacterid. -1991. Vol. 173, № 13. - P. 4195-4202.

228. Prabhakar H., Lai M., Kaur H. Outbreak of gastroenteritis due to a new strain of поп О group-1 Vibrio cholerae, in Ludhiana in May August 1993. // Indian. J. Med. Res.- 1994.- Vol. 99, № 3.- P. 107-108.

229. Ramamurthy Т., Garg S., Sharma R. et al. Emergence of novel strains of Vibrio cholerae with epidemic potential in Southern and Eastern India // Lancet.- 1993.- Vol. 341, № 8846.- P. 703-704.

230. Rice M.S. Dahlquist F.W. Sites of deamidation and methylation in Tsr, a bacterial chemotaxis sensory transducer // J. Biol. Chem. 1991. - Vol. 226, N15. -P. 9746-9753.

231. Ray A., Chattopadhyay K., Banerjee K.K., Biswas T. Macrophage distinguishes Vibrio cholerae hemolysin from its protease insensitive oligomer by time dependent and selective expression of CD80-CD86 // Immunol Lett. 2003. - Vol. 89, №2-3.-P. 143-147.

232. Richardson К., Michalski J., Kaper J. Hemolysin production and cloning of two hemolysin determinants from classical Vibrio cholerae // Infect. Immun.-1986.- Vol. 54, № 2. P. 415-420.

233. Roy C., Mukerjee S., Tanamal S. Haemolytic and nonhaemolytic El Tor vibrios // Ann. Biochem. Exp. Med. 1963. - Vol. 23, № 12. - P. 553-558.

234. Samadi A.R., Hyq M.I., Shahid N. et al. Classical Vibrio cholerae biotype displaces El tor in Bangladesh // Lancet. 1983. - Vol. 341, № 8328. - P. 805-807.

235. Sasmal D., Guhathakurta В., Bhattacharya S.K. et al. N-acetyl-D-glucosamine specific hemagglutinin receptor of Vibrio cholerae 01 in chicken erythrocyte membranes // FEMS Immunol. Med. Microbiol.-2002-Vol. 32,№3.-P. 187-189.

236. Sen R., Shrivastava D.L. A note on designating strains as Vibrio cholerae biotype El Tor // Indian. J. Med Rec.-1970.- Vol. 58, № 2. P. 174-178.

237. Saha N., Baneijee K.K. Carbohydrate-mediated regulation of interaction of Vibrio colerae hemolysin with erithrocyte and phospholipid vesicle // J. Biol. Chem. -1997.-Vol. 272, №1.-P. 162-167.

238. Shahid N.S., Samadi A.R., Khan M.U. et al. Classical Vibrio eltor : a prospective family study of a concurrent cholera outbreak // J. Diarrh. Dis. Res.- 1984,- Vol. 2.- P. 73-78.

239. Sharon N., Ofek I. // Microbiol Lectins and Agglutinins / Ed. D. Mirelman -N.Y.: J. Wiley, 1986. P. 55-81.

240. Shimada Т., Nair G.B., Deb B.C. et al. Outbreak of Vibrio cholerae non 01 in India and Bangladesh //Lancet. 1993. - Vol. 341, № 8856.- P. 1346-1347.

241. Shottmiiller H. Zur Aetiologie der akuten Gastroenteritis // Munch, med. Wochr.- 1904.- Bd. 51.- S. 294.

242. Simpson D., Thorne D., Loh H. Lectins: endogenous carbohydrate-binding proteins from vertebrates tissues. Functional role in recongnition processes // Life Sci. 1978. - Vol. 22, № 9. p. 727-748.

243. Singh D.V., Matte M.H., Matte G.R., et al. Molecular analysis of Vibrio cholerae 01, 0139, non 01 and non 0139 strains: clonal relationships between clinical and environmental isolates // Appl. Environ. Microbiol.- 2001.1. Vol. 67, №2.-P. 910-921.

244. Smith H.W., Halls S. The transmissible nature of the genetic factor in Escherichia coli that controls enterotoxin production // J. Gen. Microbiol. -1968.-Vol. 52, №3.-P. 319-334.

245. Smith S., Martin F. The El Tor and Celebes vibrios. Vibrio comma and asiatic cholera // Zinsser's Textbook of Bacteriol. 1948. - P. 504-505.

246. Snapper I. De ontleding van bloed en bloedkleurstof door cholera El Tor -* vibrionen // Ned. T. Geneesk. -1918.- Bd 62.- S. 848.

247. Stevenson G., Leavesley D.I., Lagnado C.A. et al. Purification of the 25 kDa Vibrio cholerae major outer membrane protein and the molecular cloning of its gene: omp V // Eur. J. Biochem.- 1985.- Vol. 148.- P. 385-390.

248. Stewart R.C., Dahlquist F.W. Molecular components of bacterial chemotaxis // Chem. Rev. 1987. - Vol. 87. - P. 997-1025.

249. Stilmark H. Ricin, ein qiftiges Ferment aus dem Samen von Ricinus communis und einiqen anderen Euphceaen. Inaug. Dissertation. Dorpat, 1888.

250. Tacket C.O., Losonsky G., Natar J.P. et al. Initial clinical studies of CVD 112 Vibrio cholerae 0139 live oral vaccine: safety and efficacy against experimental challenge // J. Infect. Dis. 1995. Vol. 172, №3-P. 883-886.

251. Towbin H., Stachelin Т., Gordon J. electroforetic transfer of proteins frompoliacrilamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications // Proc. Nath. Acad. Sci. USA. 1979. Vol. 76, № 9. - P. 4350-4354.

252. Townsend R.R. The Pharmacology and Toxicology of Proteins / Eds. J.S. Holcenberg, J.L. Winkelhake. N. Y.: Alan R. Liss, 1987. - P. 41-57.

253. Valeva A., Walev J., Weis S. et al. Cellular metlloprotein activates Vibrio cholerae procytolysin // J. Biochem. 2004. - Vol. 279, №24. - P. 251143-25148.

254. Wake A., Yamamoto M. Hemolysin destructive factor of Vibrio cholerae (Vibrio comma) // J. Bacteriol. - 1966. - Vol. 91, № 1. - P. 461-462.

255. Waldor M.K., Mekalanos J.J. Lysogenic conversion by a filamentous phage en coding cholera toxin// Science.- 1996.- Vol. 272, № 5270.- P. 1910-1914.

256. Waldor M.K., Mekalanos J.J., Kimsey H. Regulation, replication and integration functions of the Vibrio cholerae CTX phi are encoded by region RS 2 // Mol. Microbiol.- 1997.- Vol. 24, № 5,- P. 917-926.

257. Ward H.M., Manning P.A. Mapping of chromosomal loci associated with lipopolysaccharide synthesis and serotype specificity in Vibrio cholerae 01 by transposon mutagenesis using Tn 5 and Tn 2680 // Mol. Gen. Genet. 1989.- Vol. 218,№2.-P. 367-370.

258. Watanabe Y., Seaman G.R Purification and properties of the hemolysin from El Tor Vibrio // Arch. Bioch. Bioh. -1962. Vol. 97, № 2 - P. 393-398.

259. Watanabe Y., Verwey W.F. The biological characterization of the ha'emolysin from the El Tor variety of Vibrio cholerae // J. Inf. Dis.-1966. Vol. 116, № 3. -P. 363371.

260. Williams S.G., Attridge S.R., Manning P.A. The transcriptional activator HlyU of Vibrio cholerae: nucleotide sequence and role in virulence gene expression // Mol. Microbiol. 1993. - Vol. 9, № 4. - P. 751-760.

261. Williams S.G., Manning P.A. Transcription of the Vibrio cholerae haemoly-sin gene, hlyA, and cloning of a positive regulatory locus, hlyU // Mol. Microbial-1991.- Vol. 5, № 8.- P. 2031 -2038.

262. Yamamoto K., Honda T. Activation and processing of Vibrio cholerae cytolysin //Jap. J. Bacteriol. 1989. - Vol. 44, № 1. -P 199.

263. Yamamoto К., Ichinose Y., Nakasone N. et al. Identity of hemolysins produced by Vibrio cholerae non 01 and V. cholerae 01 biotype El Tor // Infect. Immun. -1986. -Vol. 51, №3.- P. 927-931.

264. Zhang D., Takahashi J., Seno T. et al. Analysis of receptor for Vibrio chol-erae Eltor hemolysin with a monoclonal antibody that recognizes glycophorin В of human erythrocyte membrane // Infect. Immun. 1999. - Vol. 67, № 10.-P. 5332-5337.

265. Zimmerman E. Weitere Beobachtungen uber die Haemolysine der Vibrionen // Z. Immunnitatsforsch. 1934. - Bd. 82. - S. 495-505.

266. Zitzer A., Palmer M., Weller U. et al. Mode of primary binding to target membranes and pore formation induced by Vibrio cholerae cytolysin (hemolysin) // Eur.J. Biochem. 1997. - Vol. 247, № 1. - P. 209-216.

267. Zitzer A., Wassenaar T.M., Walev I., Bhakdi S. Potent membrane per-meabilizing and cytocidal action of Vibrio cholerae cytolysin on human intestinal cells. // Infect. Immun. - 1997. - Vol. 65, № 4. - P. 1293-1298.

268. Zitzer A., Zitzer O., Bhakdi S., Palmer M. Oligomerization of Vibrio Ь cholerae cytolysin yields a pentameric pore and has a dual specificity for cholesterol and sphingolipids in the target membrane //J. Biol. Chem. 1999. - Vol.274, №3,-P. 1375-1380.