Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Антигенная изменчивость холерных вибрионов, выделенных в период седьмой пандемии холеры
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Антигенная изменчивость холерных вибрионов, выделенных в период седьмой пандемии холеры"
**
На правах рукописи
ЧЕРЕПАХИНА ИРИНА ЯКОВЛЕВНА
РГ6 од
АНТИГЕННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ В ПЕРИОД СЕДЬМОЙ ПАНДЕМИИ ХОЛЕРЫ
03. 00. 07 - микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
Ростов-на-Дону 2000 г.
' »
Работа выполнена в Ростовском-на-Дону государственном научно-исследовательском противочумном институте
Научный консультант:
заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Мишанькин Б.Н.
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук,
профессор Васильева Г.И.
доктор медицинских наук,
старший научный сотрудник Яговкин Э.А.
доктор медицинских наук,
старший научный сотрудник Гальцева Г.В.
Ведущая организация:
Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока
Защита состоится "_9_" ноября 2000 г. в 1000 часов на заседании диссертационного совета Д 084. 53. 01 при Ростовском государственном медицинском университете (344022, г. Ростов-на-Дону, Нахичеванский пер., 29).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского государственного медицинского университета.
Автореферат разослан
.2000 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доцент
Н.Я. КОРГАНОВ
/>¿¿4^.9 -¿г, О
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. На фоне продолжающейся пандемии холеры, которая сопровождается диссеминацией возбудителя в окружающей среде, наблюдается выраженная изменчивость основных биологических свойств холерных вибрионов, в том числе связанная с модификацией структуры поверхностных антигенов.
Изменчивость является самым стабильным свойством любой биологической системы, поскольку она служит гарантией сохранения видов, обеспечивая динамическую вариабельность целого ряда признаков, в первую очередь вирулентности и антигенной структуры (Беляков В.Д. с соавт., 1987; Смирнов Г.Б., 1988). Именно эти алгоритмы были отобраны эволюцией в качестве универсального орудия адаптации и персистенции прокариот (Беляков В.Д. с соавт., 1987; Бухарин О.В., 1997, 1999; Литвин В.Ю. с соавт., 1998).
Антигенная изменчивость - это "первый эшелон" адаптации микроорганизмов при смене экологической среды обитания (Беляков В.Д. с соавт., 1987), поэтому ей наряду с вирулентностью придается важная роль в формировании новых патогенных вариантов, обусловливающих запуск эпидемического процесса.
Широкие адаптационные возможности патогенных микроорганизмов, в том числе холерных вибрионов, обусловлены прежде всего гетерогенностью популяции возбудителя, находящегося в определенных экологических условиях (Беляков В.Д. с соавт., 1987), так как создание антигенного разнообразия дает значительные преимущества для ее существования в условиях естественного отбора (Стейниер Р. с соавт., 1979; Литвин В.Ю., 1988).
Главной причиной гетерогенности является непостоянство геномов, поэтому свойства любой популяции никогда не бывают стабильными (Домарад-ский И.В., 1997; БЬагша С. е1 а1., 1997; А1оп и. а1„ 1999).
Эволюция холерных вибрионов продолжается. В эндемичных очагах идет процесс формирования новых антигенных вариантов, имеющих эпидемический потенциал. Вместе с тем, в неблагоприятных экологических условиях образуются глубоко измененные варианты, которые или не выживают, или пополняют аутохтонную микрофлору водоемов. Н.С. Гончарова с соавт. (1987) пришли к выводу, что патогенный вид любого возбудителя в природе эволю-ционно поддерживается громадным многообразием антигенных, авирулентных
% ■
и других вариантов, экологически ему сопутствующих.
Поэтому изучение природы антигенной изменчивости холерных вибрионов приобретает в настоящее время особую актуальность в связи с необходимостью расшифровки общебиологического механизма персистенции бактерий в водных и организменных сообществах.
Несмотря на появление в течение последних десяти лет многочисленных публикаций о выделении на территории Российской Федерации и некоторых государств СНГ большого количества измененных по антигенному составу штаммов холерных вибрионов, эколого-геог рафический анализ их распространения на различных административных территориях, длительности выделения и возможности укоренения в определенных экосистемах производился фрагментарно.
Хотя существующие методы диагностики и идентификации позволяют установить принадлежность выделенных из внешней среды атипичных штаммов к виду V. сЬо1егае и определить их эпидемическую значимость, тем не менее вопросы, связанные с их происхождением и возможной генетической связью с вибрионами, выделяемыми от человека, остаются пока в стороне.
До настоящего времени не было проведено сравнительного исследования геномов типичных и измененных по антигенной структуре холерных вибрионов, выделенных в различных регионах Российской Федерации от людей и из объектов окружающей среды, с целью получения объективной информации об их эволюционном родстве и процессах популяционной изменчивости, происходящих в различных экологических условиях, а также возможности формирования на фоне происходящих адаптационных перемен вирулентных клонов, приводящих к запуску эпидемического процесса.
Следовательно циркуляция гетерогенных популяций вибрионов на благополучных по холере территориях становится не только медицинской, но и актуальной экологической проблемой, которая не может быть решена только традиционными бактериологическими и эпидемиологическими методами и нуждается в дополнительном молекулярно-биологическом мониторинге.
Очевидно, что только с помощью генетических и экологических подходов могут быть решены назревшие проблемы эпидемичности и эндемичности холеры, выяснены механизмы адаптации вибрионов в окружающей среде и определена роль изменчивости в этом процессе.
Актуальным остается также вопрос совершенствования диагностики измененных по агглютинабельности вибрионов, поскольку существующие критс-
рии определения принадлежности к виду V. сЬо!егае с использованием традиционных диагностических препаратов и методов создают значительные трудности при идентификации таких штаммов.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: проведение сравнительного анализа распространения атипичных по антигенному составу холерных вибрионов, выделенных в период седьмой пандемии холеры на территории СССР, изучение диапазона антигенной вариабельности с характеристикой патогенных свойств измененных клонов, обсуждение возможных путей их формирования и оценка роли антигенной изменчивости в механизме адаптации и эволюции холерных вибрионов в окружающей среде. Поиск новых методических подходов к совершенствованию диагностики и идентификации атипичных вариантов холерных вибрионов.
ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:
1.Провести анализ динамики выделения на территории Российской Федерации и других республик СССР атипичных по антигенной структуре штаммов холерных вибрионов в период седьмой пандемии холеры. Охарактеризовать диапазон наблюдаемой при этом изменчивости, изучить состав популяции и стабильность атипичных штаммов.
2. Оценить эпидемическую значимость различных по антигенному фенотипу вариантов холерных вибрионов.
3. Изучить особенности метаболизма у холерных вибрионов в процессе адаптации в окружающей среде, которая сопровождается изменениями антигенного состава.
4. Сравнить генотипы типичных и измененных штаммов, выделенных от людей и из объектов окружающей среды в эпидемический и межэпидемический периоды, с целью определения сходства и различий в составе их нукгтео-тидных последовательностей.
5. Изучить в эксперименте адаптационные способности холерных вибрионов под влиянием различных видов стресса (теплового, холодового, анаэробиоза, биоантагонистов).
6. На основании изучения динамики изменений генотипа и фенотипа при экспериментальном стрессе, как модели климатических условий в Российской Федерации, сделать заключение о возможности формирования на территории нашей страны новых эпидемических клонов.
7. Подобрать методические подходы к совершенствованию диагностики ати-
личных по антигенному составу штаммов холерных вибрионов.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА:
1. Установлены закономерности адаптации и персистенции холерных вибрионов в объектах окружающей среды, которые сопровождаются изменениями антигенного фенотипа, фагочувствителыюсти и вирулентности. Показано, что характер антигенной изменчивости определяется экосистемой, в которой циркулируют холерные вибрионы.
2. Доказано, что две группы антигенных вариантов (Б Я и Я), объединенных в ЯО-серовар, имеют различную природу и эпидемическую значимость.
3. Обнаружена выраженная нестабильность поверхностных структур у штаммов с БЯ-фенотипом, имеющая тенденцию перехода в холерные вибрионы не 01 серогруппы. Стабильность и апатогенность Я-вариантов свидетельствуют о глубоких и необратимых изменениях в геноме таких вибрионов.
4. Впервые показано, что в процессе адаптации к условиям окружающей среды, сопровождающейся модификациями поверхностных структур клетки, у холерных вибрионов происходят значительные изменения в метаболизме, связанные с переходом на новый энергетический уровень с замедленным синтезом органических веществ.
5. Доказано, что типичные и измененные штаммы холерных вибрионов, выделенные из воды, в отличие от культур от людей, проявляют выраженную цитотоксическую активность, что не позволяет однозначно относить их к группе авирулентных.
6. Показана возможность использования полимеразной цепной реакции с универсальными праймерами для сравнительного анализа геномного полиморфизма типичных и измененных штаммов, их генетического родства и оценки происходящих модификаций в поверхностных структурах холерных вибрионов.
7. Установлена неоднородность популяций, циркулирующих в водоемах бывшего СССР и выделенных от людей, по наличию генов, кодирующих синтез токсин-корегулируемых пилей адгезии. Обнаружены редко встречающиеся штаммы с гср+ с1х" генотипом, наличие которых предполагает ступенчатый характер утраты детерминант вирулентности у холерных вибрионов.
8. Доказано, что длительной персистенции холерных вибрионов в водоемах способствует генетическая неоднородность циркулирующих популяций, в которых происходят постоянные эпитопные модификации поверхностных
структур микробных клеток.
9. Показана неоднородность клеточного состава по агглютинабельности у штамма холерных вибрионов О 139 серогруппы, выделенного от человека.
10. Впервые доказано влияние гелиомагнитной активности на характер и динамику антигенной изменчивости холерных вибрионов, выделенных на территории СССР.
11. Впервые показано, что длительная персистенция холерных вибрионов в среде с низкими концентрациями нефтепродуктов сопровождается изменениями в фенотипе и генотипе, приводящими к снижению и утрате агглютинабельности, фаголизабельности и токсигенности.
12. Впервые изучено влияние различных видов стресса на основные биологические свойства холерных вибрионов. Показано, что вибрионы имеют значительный "запас" экологической пластичности, позволяющей им адаптироваться к стрессовым воздействиям путем выраженной модификации поверхностных структур, а также снижением и утратой вирулентности.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ:
Получены новые данные о механизме адаптации холерных вибрионов в объектах окружающей среды. Показано наличие у них "запаса" биологической пластичности, обеспечивающей возможность длительного существования в различных экосистемах.
Представлены доказательства ключевой роли поверхностных структур в явлении микробной адаптации, установлены причины и условия формирования измененных по антигенной структуре холерных вибрионов.
Доказана роль климато-географической среды обитания холерных вибрионов в формировании популяций с определенным антигенным фенотипом.
Получены новые данные о физиологических свойствах возбудителя холеры, реализуемых им в неблагоприятных условиях окружающей среды путем перехода на другой энергетический уровень питания и дыхания, обеспечивающий длительную персистенцию в различных экосистемах.
С помощью молекулярно-биологического исследования генотипов холерных вибрионов, выделенных от людей, и популяций, циркулирующих в водных экосистемах, получены новые сведения о рекомбинативных процессах, происходящих в процессе изменчивости.
Показана роль солнечной активности как возможного индуктора в появлении новых антигенных вариантов.
Доказана важная экологическая роль высокомолекулярных углеводородов в механизме выживания холерных вибрионов в окружающей среде и модификации основных биологических свойств, важнейшими из которых являются вирулентность и антигенный состав.
Получены доказательства ведущей роли стресса в механизме адаптации холерных вибрионов в водных экосистемах, приводящей к появлению разнообразных антигенных форм, в том числе и неагглютинабельных, что может объяснять сезонную смену серопейзажа в водоемах.
Полученные данные о происходящих в процессе адаптации холерных вибрионов к условиям окружающей среды негативных изменениях в генотипе и фенотипе вибрионов свидетельствуют о том, что условий для формирования новых патогенных клонов на территории Российской Федерации, по-видимому, не существует.
Показана необходимость при идентификации атипичных штаммов дифференцировать холерные вибрионы ЫО-серовара на ЭЯ- и Я-варианты, отличающиеся характером изменений поверхностных структур и эпидемической значимостью. §Я-вариан гы выделяют от людей, из сточной воды и иногда из воды поверхностных водоемов. У них нередко сохраняются детерминанты па-тогенности. 11-варианты - аутохтонные обитатели водоемов, они полностью авирулентны.
Предложено использование метода переписного окисления липидов и тетразолового теста с субстратами цикла Кребса для изучения особенностей метаболизма у холерных вибрионов в процессе изменений антигенного состава.
Показана возможность использования клеток культуры СНО-К1 для оценки цитотоксической и цитотонической активности типичных и измененных по антигенной структуре холерных вибрионов.
Установлено, что полимеразная цепная реакция с универсальным прай-мером № 15 может быть применена для анализа гетерогенности популяций штаммов, циркулирующих в различных экосистемах.
Показано, что эпидзначимость циркулирующих в воде поверхностных водоемов и выделенных от людей штаммов, помимо существующих методов генного зондирования и в ПЦР со специфическими праймерами, может быть оценена с помощью фагов СТХ+ и СТХ".
Предложено использование [¿калы чисел Вольфа, характеризующих ге-лиоактивность в период солнечного цикла, для проведения коррелятивного
анализа степени ее влияния на характер и динамику антигенной вариабельности холерных вибрионов.
Подобраны экспериментальные условия для моделирования стресса у холерных вибрионов.
Модифицирован метод изучения взаимоотношений вибрионов и инфузорий, который описан в "Методических рекомендациях по изучению характера взаимоотношений холерных вибрионов с представителями зоо- и фитопланктона в эксперименте", утвержденных на Ученом Совете Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института 24.12.1999 года.
Получен набор моноклональных антител к антигенным детерминантам атипичных холерных вибрионов. Гибридомы клонированы и криоконсервиро-ваны. Гибридома СПЛЮ депонирована в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных коллекции клеточных культур под номером ВСКК/11/614Д в институте цитологии АН, г. Санкт-Петербург.
Проведено сравнение существующих иммуно-серологических методов идентификации атипичных по антигенной структуре штаммов холерных вибрионов. Показана целесообразность дифференцированного их использования в зависимости от глубины изменчивости последних.
Рекомендована замена диагностических коммерческих лошадиных сывороток, дающих неспецифические реакции в связи с наличием гетерогенного пула входящих в них антител, на кроличьи, обладающие высокой специфичностью и чувствительностью, что позволит перейти от постановки объемной реакции агглютинации к реакции на стекле, значительно сокращающей время проведения анализа.
Для музея живых культур Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института составлен каталог атипичных по агглютинабельности штаммов, выделенных в период седьмой пандемии холеры.
Разработанные предложения и дополнения к диагностике атипичных штаммов холерных вибрионов включены в "Инструкцию по организации и проведению противохолерных мероприятий" (М., 1995 г.), новую ее редакцию (2000 г.) и в руководство "Диагностика возбудителей опасных инфекционных заболеваний" (Саратов, 1998 г.).
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
1. Выраженная клнмато-географическая и временная зависимость динамики и характера антигенной изменчивости холерных вибрионов, выделенных в период седьмой пандемии холеры. Влияние экосистемы, создающей условия для формирования определенных антигенных вариантов, на фенотип холерных вибрионов.
2. Характеристика патогенных свойств измененных клонов. Обоснование необходимости дифференцированного подхода при выделении БЯ- и Я-вариантов, имеющих разную природу и эпидзначимость.
3. Новые закономерности в биологии холерных вибрионов, выявленные при изучении метаболизма у этих микроорганизмов в процессе адаптации к условиям окружающей среды. Переход в процессе изменчивости на новый энергетический уровень с замедленным синтезом органических веществ, способствующий персистенции в окружающей среде. Проявление в этих условиях альтернативной цитотоксической активности.
4. Возможность использования полимеразной цепной реакции со специфическими и универсальными праймерами для изучения геномного полиморфизма типичных и измененных по вирулентности и антигенной структуре штаммов, оценки их происхождения и установления генетического родства с холерными вибрионами других серогрупп.
5. Способность холерных вибрионов, выделенных в период эпидослож-нений от людей и из объектов окружающей среды, формировать токсин-корегулируемые пили адгезии, отсутствие гена гсрА у вибрионов, изолированных в межэпидемический период. Оценка эпидзначимости штаммов с к:р+ сГх" генотипом.
6. Роль стресса в механизме адаптации холерных вибрионов к неблагоприятным условиям окружающей среды. Динамика антигенной изменчивости при стрессе, вызванном дефицитом кислорода, низкотемпературным воздействием, контактом с инфузориями. Возможность изменения серопейзажа. Псих-рофильные и гидрофобные свойства Я-форм вибрионов, обеспечивающие устойчивость к стрессу и длительную персистенцию в условиях низкотемпературных широт.
7. Динамика негативных изменений генотипа и фенотипа при экспериментальном стрессе у холерных вибрионов, моделирующем климато-экологические условия на территории России, по-видимому, не способствует формированию эпидемических клонов в воде открытых водоемов.
• '
8. Совершенствование диагностики атипичных холерных вибрионов с помощью высокоспецифичных и чувствительных моноклональных антител и кроличьих иммуноглобулинов. Дифференцированный подход к использованию определенных иммуно-серологических методов исследования при анализе штаммов с разной глубиной изменчивости. Внесение дополнений в существующие инструктивно-методические документы по диагностике холеры.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ: результаты исследований были представлены на научных конференциях: IV краевая научно-практическая конференция по природной очаговости, эпидемиологии и профилактике особо опасных инфекционных болезней "Особо опасные инфекции на Кавказе", Ставрополь, 1978; Актуальные вопросы лабораторной диагностики и биохимии возбудителей чумы и холеры, Саратов, 1984; Актуальные вопросы проблемы "Холера", Ростов-на-Дону, 1984; Проблемы медицинской и санитарной микробиологии города, Ростов-на-Дону, 1987; Актуальные вопросы микробиологии, лабораторной диагностики и профилактики холеры, Ростов-на-Дону, 1988; I съезд иммунологов России, Новосибирск, 1992; Российская научная конференция "Вопросы эпидемиологии, микробиологии и лабораторной диагностики", Ростов-на-Дону, 1992; Российская научная конференция "Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций", Саратов, 1993; Межгосударственная научно-практическая конференция, посвященная 100-летию открытия возбудителя чумы "Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний", Ставрополь, 1994; Всероссийская научно-практическая конференция "Принципы и практика борьбы с холерой в республике Дагестан. Актуальные вопросы разработки микробиологических питательных сред и тестси-стем", Махачкала, 1994; Российская научно-практическая конференция по проблеме "Холера", Ростов-на-Дону, 1995; Эпидемиологические и клинико-иммунологические аспекты профилактики важнейших инфекционных заболеваний, Астрахань, 1996; VII съезд Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 1997; Научно-практическая конференция, посвященная 100-летию образования противочумной службы России, Саратов, 1997; Юбилейная научная конференция, посвященная 70-летию НИИ микробиологии МО РФ "Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария", Киров, 1998; Юбилейная научная конференция "Проблемы медицинской и экологической биотехнологии", Оболенск, 1999; Проблемная комиссия (46.04) межведомственно-
го научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации, Ростов-на-Дону, 1999; Юбилейная научная конференция, посвященная 50-летию Центра военно-технических проблем биологической защиты НИИ микробиологии МО РФ "Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария", Екатеринбург, 1999; Проблемная комиссия (46.04) межведомственного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации, Ростов-на-Дону, 2000; Ninth International Congress for Culture Collections, Brisbane, Australia, 2000.
Представленные в диссертации материалы являются результатом работы по 9 плановым темам, выполнявшимся в рамках НИР РПЧИ (№№ гос. регистрации: 75025455; 79 036999; 01.83.0 026803; 016827 01.90.0; 00. 3536 01.950; 01. 9. 50. 003722; 01.9.70 009308; 01.9.50. 003720; 01.9.70 009327).
Материалы диссертации обсуждены на общеинститутской научной конференции в РПЧИ ь августе 2000 г.
ПУБЛИКАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ: по теме диссертации опубликовано 57 работ, в том числе одна монография (в соавторстве) и руководство по лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний (в соавторстве). Соавтор двух инструкций по организации и проведению противохолерных мероприятий.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ: диссертация состоит из введения, шести глав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов, результаты собственных экспериментов и их обсуждение, а также общего заключения и выводов. Текст работы изложен на 352 страницах машинописного текста, иллюстрирован 46 таблицами и 29 рисунками. Библиографический указатель состоит из 310 источников отечественной и 262 - зарубежной литературы.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объекты и методы исследования
В экспериментальной работе использовано 50 атипичных по антигенному составу штаммов холерных вибрионов 01 серогруппы биовара eltor (R-, SR-
¡арианты, культуры со сниженной и утраченной агглютинабелыюстью холер-шми сыворотками), полученных из музея живых культур Ростовского проти-ючумного института. В ряде опытов дополнительно изучено 200 типичных и типичных штаммов холерных вибрионов OI, 0139, 02-039 серогрупп, других 1редставителей рода Vibrio и семейства Vibrionaceae (Aeromonas и Plesiomo-ias).
В процессе выполнения работы проанализированы данные 5089 паспортов на штаммы холерных вибрионов, выделенных в период с 1965 по 1999 гг., (ранящиеся в музее живых культур РПЧИ, и материалы компьютерной базы ханных "ХОЛЕРА ЭЛЪТОР. СНГ. РОССИЯ". Для анализа динамики выделения типичных по агглютинабельности штаммов холерных вибрионов использова-1и ежегодную информацию Противочумного Центра МЗ РФ и Ростовского тротивочумного института.
Изучение видовых, родовых признаков исследуемых штаммов, определе-ше холерогенности на кроликах-сосунках проводили в соответствии с 'Инструкцией по организации и проведению противохолерных мероприятий" ;М., 1995 г.).
Оценку кожной пробы на модели взрослых кроликов для выявления дер-чонекротического, геморрагического факторов и фактора кожной сосудистой троницаемости у холерных вибрионов осуществляли по методике О.И. Пому-<иной с соавт. (1989). Определение токсигенности штаммов холерных вибрионов на модели овариальных клеток китайского хомячка (СНО) проводили по методике О.И. Сальниковой с соавт. (1993).
Реакцию иммунодиффузии в агаре ставили по методам А.А. Канчух ¡1965) и В.В. Сухаря (1966). Встречный иммуноэлектрофорез и электрофорез в 12% полиакриламидном геле осуществляли по методу Л.А. Остермана (1981).
Иммуноферментный анализ (ИФА) проводили на твердой фазе с сорбированными в лунках полистироловых панелей фирм "Costar" и "Linbro" убитыми кипячением или другими способами клетками холерных вибрионов. В заботе использовали антилошадиный или антимышиный пероксидазный конъюгат производства института им. Н.Ф. Гамалеи. Субстратом служил орто-}>енилендиамин (ОФД) "Serva". Учет реакции осуществляли с помощью фотометров "Titertek Multiskan" или "Uniscan"npn длине волны 492 нм.
Иммуноблоттинг ставили по методу Н. Towbin et al. (1979). В качестве :убстрата в иммунопероксидазном методе использовали О-дианизидин "Serva". В работе также применяли модификацию иммуноблоттинга - метод точечной
иммунодетекшш (ТИД), в которой взвеси холерных вибрионов наносили на нитронеллюлозную бумагу.
При изучении особенностей метаболизма у атипичных штаммов холерных вибрионов использовали метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты в соответствии с рекомендациями Ю.В. Владимирова (1987), тест с тетразоловым голубым и субстратами цикла Кребса по методу Ю.М. Ломова с соавт. (1985).
Анализ ДНК изучаемых штаммов проводили с использованием полиме-разной цепной реакции (ПЦР) с универсальным и со специфическими прайме-рами для тестирования генов токсинопродукции и токсин-корегулируемых пи-лей адгезии и колонизации (Сучков И.Ю. с соавт., 1997, 2000; Мишанькин Б.Н. с соавт., 1999).
, ,Для получения гибридом к R-формам холерных вибрионов использовали две линии миеломных клеток P3-X63/Ag8 653 и NSO. Культивирование миелом и гибридом осуществляли в среде RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. В опытах по получению гибридом, перитонеальных макрофагов. ..пдукции асцитных опухолей использовали инородных мышеи линии Balb/C. Клонирование гибридом проводили методом предельных разведений (Новохатский A.C. с соавт., 1985).
Коагглютинирующие диагностикумы на основе моноклональных антител готовили в соответствии с руководством по иммунологическим методам под редакцией Г. Фримсля (1987), а люминесцирующие препараты - по методу А. Coons и М. Kaplan, в модификации J. Riggs и J. Marshall (1967).
Статистическую обработку полученных данных проводили по И.Н. Аш-марину и A.A. Воробьеву (1962) и с помощью компьютерной программы Microsoft Excel 7.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Представленные в нашей работе результаты исследований свидетельствуют о том, что в характере антигенной изменчивости холерных вибрионов Ol серогруппы, выделенных в период седьмой пандемии холеры, прослеживается выраженная территориальная и временная зависимость. За изученный 14-летний период на территории Российской Федерации было выделено из по-.верхностных водоемов 1873 штамма холерных вибрионов, среди которых культуры со сниженной агглютинабельностыо, неопределяемым сероваром и
ЯО-варианты составляли 15,9%. При этом 71% измененных штаммов был отнесен к ЯО-серовару, что свидетельствует о превалировании этого типа изменчивости над остальными (табл. 1).
Таблица 1
Количественная характеристика измененных по антигенному составу штаммов холерных вибрионов, выделенных на территории СССР из объектов окружающей среды
Штаммы, атипичные по
Всего агглютинабельности
Республики Годы выделено всего из них 1Ю-вариантов
штаммов абс. кол-во уд. вес от общ. кол-ва (%) абс. кол-во уд. вес от общ. кол-ва (%) УД-вес от атипич. (%)
Российская 1986-
Федерация 1999 1873 297 15,9 211 11,3 71,0
Казахстан 19861991 864 314 36,4 169 19,6 53,8
Узбекистан и 2486 187 7,5 103 4,1 55,1
в т. ч.
Каракалпакия и 413 137 33,2 103 24,9 75.2
Украина <( 381 26 6,8 - - -
Молдавия и 42 4 9,5 1 2,4 25,0
Киргизия и 210 31 14,8 1 0,5 3,2
Таджикистан 309 98 31,7 52 16,8 53,1
Туркмения и 11412 62 4,4 - - -
Азербайджан и 371 31 8,4 1 0,3 3,2
Армения и 47 12 25,5 - - -
С 1986 по 1999 г. атипичные штаммы были изолированы на территории 19 административных районов России. Основными регионами, в которых зарегистрировано многолетнее обнаружение холерных вибрионов в воде и высокий удельный вес атипичных штаммов, являлись Ростовская, Астраханская, Ленинградская, Новосибирская, Читинская области и Приморский край. Максимальное количество атипичных вибрионов было выделено в Приморском крае, на территории которого с 1987 года циркулируют ЯО-варианты. Доля дальневосточных в общем количестве измененных штаммов равнялась 63%, а ЫО-вариантов - 87% (табл. 2). При этом их удельный вес по отношению ко всем выделенным на Дальнем Востоке холерным вибрионам составил 44%, а среди ати-
• «
Удельный вес атипичных штаммов, выделенных на различных территориях _Российской Федерации за период с 1986 по 1999 гг._
№ п/п Территория Всего выделено атипичных штаммов с 1986 по 1999 гг. В том числе
атипичные штаммы без ЯО-вариантов яо -варианты
абс. число X абс. число X абс. число X XX
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 Астраханская обл. 12 4,0 12 4,0 - - -
2 Ленинградская обл. 10 3,4 5 1,7 5 1,7 2,4
3 Ростовская обл. 20 6,7 19 6,4 1 0,3 0,5
4 Московская обл. 5 1,7 5 1,7 - - -
5 Читинская обл. 10 3,4 8 2,7 2 0,7 0,9
6 Дагестан 6 2,0 6 2,0 - - -
7 Мурманская обл. 1 0,3 - - 1 0,3 0,5
8 Владимирская обл. 1 0,3 - - 1 0,3 0,5
9 Приморский край 188 63,3 4 1,3 184 62,0 87,2
10 Калмыкия 9 3,0 8 2,7 1 0,3 0,5
11 Иркутская обл. 1 0,3 1 0,3 - - -
12 Новгородская обл. 1 0,3 1 0,3 - - -
13 Новосибирская обл. 13 4,4 - - 13 4,4 6,2
14 Красноярский край 9 3,0 9 3,0 - - -
15 Омская обл. 1 0,3 - - 1 0,3 0,5
16 Томская обл. 1 0,3 1 0,3 - - -
17 Рязанская обл. 3 1,0 1 0,3 2 0,7 0,9
18 Волгоградская обл. 5 1,7 5 1,7 - - -
19 Саратовская обл. 1 0,3 1 0,3 - -
Примечание: х - уд. вес (%) от общего кол-ва атипичных штаммов, выделенных в РФ с 1986 по 1999 гг. (297); хх - уд. вес (%) от общего количества ЯО-вариантов, выделенных в РФ с 1986 по 1999 гг. (211)
пичных штаммы ЛО-серовара достигали 98%. Полученные данные свидетельствуют о наличии специфических экологических условий для появления и длительной персистенции в водоемах Приморья таких "экологических вариантов". Аналогичный тип изменчивости регистрировался на протяжении 5 лет в Новосибирской области, где выделялись атипичные штаммы только КО-серовара.
Другой характер антигенной модификации имел место в Ростовской и Астраханской областях: за указанный период ЯО-варианты в этих регионах
практически не выделялись. Атипичные штаммы, которые на протяжении 5-6 лет обнаруживали в реках Волга, Дон и Темерник, были представлены в основном холерными вибрионами со сниженной агглютинабельностью или с неопределяемым сероваром. В Читинской и Ленинградской областях на протяжении нескольких лет выделяли атипичные штаммы с разным антигенным фенотипом.
Полученные результаты свидетельствуют о выраженном влиянии экологических условий обитания вибрионов на количество персистирующих вибрионов и состояние поверхностных структур, определяя фенотип циркулирующей в воде популяции.
Было установлено, что в 1988-1991 гг. резко увеличилось общее число и соответственно удельный вес атипичных холерных вибрионов (рис. 1, 2, табл. 3). Пик максимального количества и удельного веса атипичных штаммов в Российской Федерации пришелся на 1989 год. Количественный рост измененных вибрионов в эти сроки отмечен в основном в Приморском крае, Астраханской, Ростовской, Читинской и Новосибирской областях.
В Казахстане основным регионом, где на протяжении всего срока исследования выделялись измененные штаммы, является район г. Шевченко в Ман-гистаусской области, где наряду с типичными холерными вибрионами периодически диагностируют ЯО-варианты. При этом ЯО-штаммы изолировали не только из воды Каспийского моря, но и из сточной воды, что свидетельствует об их "человеческом" происхождении.
В Каракалпакии (Узбекистан) с 1988 года на протяжении нескольких лет из поверхностных водоемов также выделялись измененные по антигенной структуре ЯО-штаммы. В Таджикистане и Киргизии выделялись культуры с разным, в том числе ЯО-антигенным фенотипом. В Туркмении ЯО-серовар не был выделен ни разу. При этом отмечено, что в Туркмении почти ежегодно выделялись штаммы от людей.
Таким образом, показано, что длительная циркуляция холерных вибрионов в воде открытых водоемов на ряде территорий бывшего СССР сопровождается последующим появлением атипичных по агглютинабельности штаммов, фенотип которых зависит от условий данной экосистемы, способствующей формированию определенных антигенных вариантов (ЯО - в Приморском крае, Новосибирской области, Каракалпакии, Таджикистане, со сниженной агглютинабельностью и неопределяемым сероваром - в Ростовской и Астраханской областях).
Рис. 1. Динамика выделения анитичных шга.ммов на территории РФ с 1986 по 1999 гг.
Рис. 2. Удельный все атипичных штаммов, выделенных на территории РФ с 1986 по 1999 гг.
Динамика выделения атипичных по агглютинабельности штаммов холерных вибрионов из объектов окружающей среды в РФ в периоде 1986 по 1999 гг.
Всего Штаммы, атипичные по агглютинабельности
Годы выделено всего уд. вес RO- уд. вес УД- осталь- УД- УД-
штаммов в (%) вариан- ко вес к ные вес ко вес к
РФ ты всем (%) атип. (%) атип всем (%) атип. (%)
1986 214 8 3,7 - - - 9 3,7 100,0
1987 174 20 11,5 10 5,7 50,0 10 5,7 50,0
1988 184 11 5,9 7 3,8 63,6 4 2,2 36,4
1989 195 61 31,3 47 24,1 77,1 14 7,2 22,9
1990 192 59 30,7 46 24,0 77,9 13 6,8 22,1
1991 218 25 11,5 15 6,9 60,0 10 4,6 40,0
1992 90 28 31,1 25 27,8 89,3 3 з,з 10,7
1993 40 6 15,0 6 15,0 100,0 - - -
1994 101 13 12,9 9,0 9,0 69,2 4 4,0 30,8
1995 119 21 17,6 12 10,1 57,1 9 7,6 42,9
1996 70 16 22,9 13 18,6 81,2 3 4,3 18,8
1997 96 17 17,7 10 10,4 58,8 7 7,3 41,2
1998 97 8 8,2 7 7,2 87,5 1 1,0 12,5
1999 83 4 4,8 4 4,8 100,0 - - -
Практически все регионы, где длительно выделялись типичные и измененные штаммы, расположены в зоне 40°-50° северной широты.
Установлено наличие среди ЯО-вариантов двух групп (II и БИ), принципиально отличающихся по свойствам. Хотя большинство из них было гемоли-тичными, фагоустойчивыми и авирулентными по фаговому тесту и на модели кроликов-сосунков, тем не менее доказано, что холерные вибрионы в Я- и 811-формах имеют разную природу и разную эпидемическую значимость.
Я-фенотип (способность агглютинироваться только РО-холерной сывороткой) характерен, в основном, для штаммов, выделенных в Приморье, Новосибирской области, Каракалпакии и Таджикистане. Штампы с таким фенотипом никогда не выделялись от людей, они полностью авирулентны, у них ни в одном случае не были обнаружены гены с1х и 1ср. Такие холерные вибрионы циркулируют в регионах, в которых на протяжении многих лет не регистрировались заболевания у людей, поэтому они с полным основание могут быть от-
несены к аутохтонной микрофлоре.
БЯ-варианты представлены штаммами, выделенными как из объектов окружающей среды, так и от людей. Они характеризуются способностью вступать в реакцию агглютинации с иммуноглобулинами всех холерных сывороток, включая РО. Часть из них сохранила вирулентность (штаммы, выделенные от больных и вибриононосителей в Дагестане) или была потенциально патогенна (с1х+ культуры, изолированные из сточной и морской воды в Мангистаусской области). Токсигенные БЯ-штаммы выделялись из воды в Кзыл-Ордынской области и из сточной воды в Крыму.
Анализ свойств холерных вибрионов, выделенных из воды и имеющих другие признаки антигенной изменчивости (снижение агглютинабельности, неопределяемый серовар), показал, что у большинства из них отсутствовали детерминанты патогенности, они были фагоустойчивы, хотя у единичных штаммов был обнаружен ген йх, что свидетельствует об их потенциальной патогенности.
Выявлены особенности метаболизма у холерных вибрионов, находящихся в процессе адаптации к условиям окружающей среды, которая сопровождается модификациями антигенного состава, снижением и утратой фаголизабельности и вирулентности. При исследовании перекисного окисления липидов с определением малонового диальдегида и постановке тетразолового теста с субстратами цикла Кребса было установлено, что у холерных вибрионов с нарушенной антигенной структурой показатели экстинкции были значительно выше (0,04-0,06), чем у типичных по составу ЛПС холерных вибрионов серовара Огава (0-0,003). Характерно, что у штамма 0139 серогруппы, который некоторые авторы рассматривают как полушероховатый вариант вибрионов эльтор, показания МДА составляли, как и у БЯ-форм, 0,02.
Штаммы в Я- и БЯ-формах практически не восстанавливали тетразолий, а типичные штаммы вызывали активную реакцию. 0139-ссровар занимал промежуточное положение между типичными и атипичными холерными вибрионами (табл. 4). Полученные результаты доказывают, что в процессе изменчивости холерные вибрионы переходят на новый энергетический уровень с замедленным синтезом органических веществ, позволяющим им определенное время перси-стировать в окружающей среде.
Атипичные штаммы, выделенные из объектов окружающей среды, в отличие от с1х+ штаммов, изолированных от людей, обладали выраженной цитоток-сической (гемолитической и дермонекротической) активностью, которая, вероятно, способствует сохранению холерных вибрионов во внешней среде.
Биохимическая характеристика типичных и измененных по антигенному составу штаммов холерных вибрионов
Восстановление тетразолия с субстратами
цикла Кребса
Варианты Штаммы янтарной щавелево-уксусной
кислотой кислотои
реакция время реакция время
II 14311 ++ 3 мин -
14312 ++ 3 мин -
БЯ 13892 ++ 2 мин -
13921 ++ 3 мин -
О" 13907 ++ 3 мин -н- 3 мин
14926 ++ 3 мин ++ 3 мин
0139 Р-16064 ++ 3 мин ++ 2 мин
Инаба ¡3893 +++ 1 мин 1-++ 1 мин
13933 +++ 1 мин 1 !- г- 1 мин
13952 ++ 2 мин -Н + 30 сек
14172 ++ 2 мин +++ 30 сек
Огава Р-3119 +++ 2 мин +++ 2 мин
13779 +++ 1 мин +++ 1 мин
14176 н-+ 1 мин +++ 1 мин
Примечание: ++ - +++ - степень выраженности реакции
Анализ динамики выделения атипичных холерных вибрионов от людей показал, что такие штаммы обнаруживались с 1975 по 1991 г. в Ростове-на-Дону, Керчи, Лзове, Николаевской и Одесской областях. Большинство таких вариантов имело БЯ-фенотип, они были гемолизнегативны, содержали гены ах и Юр. Вирулентные штаммы в БЯ-форме выделяли в 1994 и 1998 гг. в Дагестане. Эпидемия холеры в 1994 году в Дагестане проходила на фоне выраженной устойчивости холерных вибрионов к антибиотикам, при этом не везде проводилась адекватная терапия, что, вероятно, и способствовало появлению атипичных форм.
Сравнение в ПЦР геномов культур, выделенных в 1994 и 1998 гг. в Дербентском районе Дагестана, с целыо выявления их "родственных связей" показал их сходство между собой, они все содержали гены токсинообразования и
\ \
токсин-корегулирусмых пилей адгезии и колонизации, т.е. несмотря на изменение поверхностных структур, эти холерные вибрионы сохранили эпидемическую опасность. Характеристика геномного полиморфизма, полученная с помощью универсального праймера № 15, позволяет судить о различиях в составе генов, детерминирующих синтез поверхностных антигенов у типичных и SR-форм холерных вибрионов, выделенных в Дагестане, поскольку они имели отличия в области 280-300 п.н., которая, как мы предполагаем, характеризует состояние генов, кодирующих липополисахарид. У R-вариантов эти фрагменты отсутствуют, что свидетельствует о глубоких изменениях в структуре соответствующих генов.
С целью характеристики холерных вибрионов, выделенных во время седьмой пандемии на территории бывшего СССР от людей и из объектов окружающей среды по признаку образования токсин-корегулиуемых пилей, которые, как и липополисахарид, являются поверхностными антигенами и рассматриваются в настоящее время как один из ведущих факторов патогенности было изучено в ПЦР 150 штаммов с помощью специфических праймеров, выявляющих в гены tcpA и ctx (табл. 5).
Большинство штаммов, выделенных от людей в период эпидосложнений, содержало нуклеотидные последовательности генов пиле- и токсинообразова-ния. Особый интерес для оценки эпидзначимости изучаемых штаммов представляли гсмолизпозитивные нехолерогенные V. cholcrae, выделенные от людей в 1988 г. в Хорезмской области Узбекистана. Мы показали, что эти штаммы были лишены гена ctx, но ген tcp у них сохранился, что свидетельствует об их потенциальной патогенности, поскольку при определенных условиях они могли бы воспринять фаги СТХф.
В период эпидосложнений из воды поверхностных водоемов и из сточной воды выделяли как tcp+, так и tcp' - варианты, но превалировали штаммы tcp", что указывает на сравнительно быструю утрату этого признака в окружающей среде. Штаммы с генотипом tcp+ ctx' были обнаружены только у культур, выделенных из сточной воды в Грузии и Азербайджане, из воды - в Узбекистане, Азербайджане и Дагестане.
В межэпидемический период и в регионах, в которых не регистрировались заболевания холерой, выделялись только tcp' ctx'-штаммы холерных вибрионов, что свидетельствует об их полной апатогенности и отсутствии потенциальной способности формировать вирулентные токсигенные клоны, ввиду отсутствия у них пилей адгезии - рецепторов фага СТХф.
Характеристика коллекции штаммов холерных вибрионов, выделенных в разных регионах на наличие генов К:рА и с1х
Годы Количе- Наличие Наличие
Республики Объект ство гена 1срА гена с(х
выде- выделе- изучен-
ления ния ных + - +
штаммов
1 2 3 4 5 6 7 8
Российская Федерация
г. Ростов-на-Дону 1976 человек 5 5 - 5 -
1987 человек 1 1 - 1 -
сточная
вода 1 1 - - 1
вода 1 - 1 - 1
1990 человек 1 1 - 1 -
вода 1 - 1 - 1
Астраханская область 1995 человек 1 - 1 - 1
вода 3 - 3 - 3
Приморский край 1988- вода 41 - 41 - 41
1999
Дагестан 1994 человек 7 7 - 7 -
вода 4 2 2 2 2
1998 человек 25 25 - 25 -
Украина
г. Керчь 1872 человек 1 - 1 - 1
г. Мариуполь 1991 человек 1 1 - 1 -
вода 1 - 1 - 1
г. Вилково 1991 человек 1 1 - 1 -
Николаевская область 1991 человек 5 5 - . 5 -
Узбекистан 1988- человек 14 6 8 3 11
1989 вода 10 1 9 1 9
Каракалпакия 1989 человек 2 - 2 - 2
вода 3 - 3 - 3
Азербайджан 1985- человек 8 6 2 6 2
1989 сточная
вода 1 1 -' 1 -
вода 6 3 3 3 3
Грузия 1972 человек 2 2 - 2 -
сточная -
вода 1 1 - 1 -
вода 1 - 1 - 1
Туркмения 1972 человек 2 1 1 1 1
Особый интерес представляют штаммы с 1ср+ с1х" генотипом. Хотя такие находки редки, тем не менее, их обнаружение может свидетельствовать о ступенчатом характере изменения вирулентности у холерных вибрионов (1ср+ с!х+ —> 1ср+ с1х' -> гср" с1х").
Обнаружение в период седьмой пандемии холеры большого количества атипичных по агглютинабельности штаммов поставило вопрос об их природе, глубине и стабильности. Результаты наших исследований показали, что наиболее стабильными по этому признаку оказались холерные вибрионы с К-фенотипом. Штаммы, выделенные в Приморском крае и Каракалпакии на протяжении всего срока исследования ни в одном случае не реверсировали в типичные формы. Это, скорее всего, свидетельствует о глубоких изменениях в кластере генов г1Ъ, приведших к утрате способности синтезировать боковые полисахаридные цепи в липополисахариде. Возможно, только компенсаторные изменения в метаболизме таких форм позволяют им длительно сохраняться в воде поверхностных водоемов.
При сравнении генотипов штаммов, выделенных в водоемах гг. Находки и Уссурийска в период с 1988 по 1998 гг., в ПЦР с универсальным праймером № 15 было показано, что спектры амплификатов двух групп холерных вибрионов отличаются друг от друга, что свидетельствует о наличии двух популяций, обитающих в указанных экосистемах. При этом были отмечены различия в геномах не только между этими двумя группами штаммов, но и внутри каждой из них. Это указывает на спонтанные перестройки в геномах даже фенотипически сходных штаммов, возникающие, вероятно, при воздействии местных экологических условий окружающей среды, под влиянием которых и формируются измененные формы. Выраженная гетерогенность профилей ДНК иллюстрирует неоднородность группы не только типичных, но и К-вариантов, выделяемых в разные годы даже на одной территории, что свидетельствует о сложности и многогранности процесса адаптации холерных вибрионов к изменяющимся условиям существования.
Дополнительное подтверждение результатов ПЦР-типирования было получено в опытах с кроличьими сыворотками и МКА к типичным и измененным штаммам холерных вибрионов. И МКА, и иммуноглобулины кроличьих сывороток реагировали только со штаммами, выделенными на определенной территории в течение 1-2 лет, что свидетельствует о неоднородности циркулирующей популяции и постоянных эпитопных модификациях поверхностных структур в ЛПС холерных вибрионов.
Учитывая эпидзначимость некоторых БЯ-вариантов, особый интерес представляют полученные нами данные о нестабильности их антигенного фенотипа. Большинство БЯ-штаммов в процессе хранения полностью утратили агглютинабельность холерными сыворотками. Часть других штаммов "перешла" в Я-формы, у единичных - появились признаки реверсии в Б-варианты. Отмечено, что наиболее резко антигенный состав БЯ-вариантов менялся весной и осенью.
При изучении динамики изменений антигенного фенотипа БЯ-штаммов, выделенных от людей, было показано, что ее характер зависел от места и времени их выделения. Все атипичные штаммы, идентифицированные как ЯО-варианты в гт. Азове, Вилково и Николаевской области, полностью реверсировали в типичные Б-формы. Что же касается БЯ-вариантов, выделенных во время вспышки холеры в Дагестане в 1994 г., то полной реверсии в типичные вибрионы Огава мы не получили ни у одного штамма, хотя у части штаммов наблюдалось "улучшение", свидетельствующее о частичном восстановлении исходного фенотипа. Настораживает, что нестабильность такого фенотипа может приводить к полной утрате агглютинабельности всеми холерными сыворотками, что и наблюдалось у части дагестанских штаммов. Важно отметить, что у таких "ие 01 вариантов" полностью сохранились на протяжении всего срока исследования гены с1х и К;р, они не лнзировапи эритроциты, что подтверждает их эпидзначимость.
Популяция БЯ-штаммов оказалась крайне неоднородной, в ней встречались клоны с разной степенью агглютинабельности (табл. 6). Неоднороден был и состав штамма со сниженной агглютинабельностью. Большинство субкультур реагировало с сыворотками в низком разведении, хотя были обнаружены клоны, агглютинирующиеся в более высоком титре. Анализ удельного веса клонов с разным антигенным фенотипом, составляющих популяцию изученных штаммов, дал нам возможность оценить динамику изменений в липополисахариде холерных вибрионов, которая характеризуется, в первую очередь, попрелсденпем или снижением количества концевых антигенных детерминант боковых цепей ЛПС, обеспечивающих агглютинабельность О-холерной сывороткой и близко к ним расположенных антигенных детерминант Огава, затем "страдают" эпитопы, определяющие серовар Инаба. По-видимому, этим и объ-ясняется довольно часто наблюдаемая антигенная изменчивость, при которой снижена или отсутствует агглютинабельность О-холерной сывороткой и сывороткой Огава при сохранении положительной реакции в высоком титре с антителами к серовару Инаба и РО.
Таблица 6
Характеристика состава популяции атипичных штаммов холерных вибрионов по агглготинабельности
Штаммы Агглютинабель-ность на момент исследования Агглютинабельность субкультур холерными сыворотками (от общего числа, %)
О Огава Инаба РО
О Ога-ва Инаба РО т- 1/2 т 1/4 т <1/4 т не аггл. Т- 1/2 Т 1/4 Т <1/4 т не аггл. Т-1/2 Т 1/4 т <1/4 Т не аггл т-1/2 т 1/4 т <1/4 Т НС аггл
13921 1/4 т - 1/4 Т 1/4 т 10 51 30 9 - - - - 22 60 13 5 30 65 5 2
14312 - - - т - - - 100 - - - 100 - - - 100 100 - - -
14994 - - - т - - - 100 - - - 100 - - - 100 100 - - -
14268 - - - - - - - 100 - - - 100 - - - 100 - - - 100
13947 - - - - - - - 100 - - - 100 - - - 100 - - - 100
13813 1/8 Т - 1/4 Т - - 13 41 46 - - - 100 3 96 1 - - - - 100
Коитро ш Р-3119 Т т „ 100 . 100 . 100 100
Р-5879 Т - т - №0 - - - 100 100 - - - - - - 100
Примечание: Т - 1/8 Т - показания от титра до 1/8 титра
*
Состав штаммов в Я-форме и О"-вариантов, полученных из штаммов холерных вибрионов, утративших агглютинабельность в процессе хранения на питательных средах, оказался однородным, что свидетельствует о глубоких необратимых изменениях в структуре О-антигена.
Популяция трех из четырех изученных штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы была однородна, однако в популяции штамма, выделенного от больного Л. в г. Азове, всего 42% субкультур давали четкую реакцию агглютинации, остальные 58% или не агглютинировались, или давали очень слабую замедленную реакцию, что свидетельствует о наличии выраженных изменений в антигенном составе этого штамма.
Анализируя антигенные изменения холерных вибрионов под влиянием определенных абиотических факторов, мы, используя числа Вольфа, характеризующие гелиоактивность в период предпоследнего цикла Солнца (1986-1996 гг.), попытались установить наличие коррелятивной связи между этими показателями. Проведенное нами сравнение показателей выявило наличие тенденции к увеличению количества выделяемых типичных и атипичных холерных вибрионов, особенно ЯО-вариантов, в период максимальной солнечной активности (1988-1991 гг.) (табл. 7). Особенно высокая коррелятивная связь гелиоак-тивности с динамикой выделения ЯО-вариантов имела место в Приморье (г-0,/44) и Каракалпакии (г-0,772). Высокие показатели коэффициента корреляции активности солнца и выделения атипичных штаммов отмечены в. Ростовской (г=0,671) и Читинской областях (г=0,532), а также в Туркмении (г=0.561).
Поскольку нефть и ее дериваты встречаются в значительных количествах в объектах окружающей среды, мы изучили в многолетнем эксперименте их влияние на основные свойства холерных вибрионов. На протяжении 2-6 лет холерные вибрионы не только не погибали в присутствии высокомолекулярных углеводородов, но и в ряде случаев размножались, более того, через 20 лет после начала эксперимента из отдельных проб, содержащих низкие концентрации керосина и солярового масла, продолжают высеваться холерные вибрионы. Это свидетельствует о наличии в популяции этих штаммов клонов, устойчивых к низким концентрациям нефтепродуктов, которые адаптировались к существованию в них и приобрели способность размножаться, используя углеводород как питательный субстрат. Холерные вибрионы длительное время сохраняли свои видовые признаки и детерминанты вирулентности.
Корреляционный анализ влияния солнечной активности на динамику выделения холерных вибрионов из объектов окружающей среды в СССР с 1986 по 1996 гг.
г =(по Пирсону)
Территории, на которых выделялись от общего от числа от числа RO-
атипичные штаммы холерных числа выде- атипичных вариангов
вибрионов из объектов ленных по агглюти-
окружающей среды штаммов набельности
штаммов
(без RO)
Всего по РФ 0,229 0,434 0,754
Астраханская область - 0,254 -0,11
Ленинградская область 0,260 0,106
Ростовская область 0,505 0,671
Территория, курируемая Централь- 0,014 0,281
ной ПЧС
Читинская область 0,009 0,532 -0,351
Дагестан - 0,043 0,172
Приморский край 0,537 -0,107 0,744
Калмыкия -0,143 0,200
Новосибирская область - 0,373 0,406 0,225
КАЗАХСТАН, -0,088 - 0,424 0,169
в т.ч. Мангистаусская обл. -0,106 - 0,653 0,008
УЗБЕКИСТАН 0,924 0,192 0,772
в т.ч. Каракалпакия 0,476 0,036 0,772
УКРАИНА - 0,743 -0,601
МОЛДАВИЯ 0,249 -0,547 0,016
КИРГИЗИЯ - 0,849 - 0,059 0,463
ТАДЖИКИСТАН -0,812 -0,526 - 0,647
ТУРКМЕНИЯ 0,573 0,561
АЗЕРБАЙДЖАН -0,001 0,192 -536
АРМЕНИЯ - 0,798 - 0,684
Однако у части изучаемых вариантов после многолетнего пребывания в воде с примесью нефтепродуктов снизилась агглютинабельность холерными сыворотками, перестал определяться серовар, появились признаки диссоциации и была утрачена лизабельность фагами ХДФЗ и 4. Часть классических холерных вибрионов приобрела свойства вибрионов эльтор, что свидетельствует о наличии или формировании клеток со свойствами, характерными для виб-
рионов другого биовара, и увеличении их удельного веса в процессе контакта с нефтепродуктами. У отдельных субкультур появилась гемолитическая активность, которая сопровождалась утратой гена холерного токсина и холерогенно-сти на кроликах-сосунках. Ген 1ср у всех изученных вариантов сохранился, что еще раз подтверждает тезис о ступенчатости наблюдаемой изменчивости патогенных свойств у холерных вибрионов. Наличие генов tcp коррелировало с ли-забельностью новыми фагами СТХ+, используемыми в настоящее время вместо ХДФ для оценки эпидзначимости выделяемых штаммов. Характерным для сохранившихся живыми вибрионов было наличие выраженных геморрагических свойств, отсутствовавших у исходных штаммов, что указывает на проявление в этих условиях альтернативной цитотоксической активности.
Характер и динамика наблюдаемых изменений свидетельствуют о наличии у холерных вибрионов "запаса" экологической пластичности, реализуемой в среде обитания, в том числе и при адаптации к различным стрессовым воздействиям.
Так, была установлена высокая степень устойчивости основной массы популяции типичных и измененных штаммов (кроме БЯ-вариантов) к тепловому стрессу при сохранении исходных антигенных и вирулентных свойств. У части субкультур штамма с утраченной агглютинабельностью наблюдалась частичная реверсия этого признака, что сопровождалось восстановлением ли-забельности диагностическими фагами и ХДФ. БЯ-вариант оказался наименее устойчивым к тепловому воздействию, большая часть его популяции при этом погибла, но выжившие клетки почти не изменили свой фенотип. Этим свойством противостоять тепловому стрессу можно объяснить феномен сохранения холерных вибрионов в горячен сточной воде, где в коллекторах канализационной системы температура достигает 45 °С и выше.
Эксперименты показали, что резкое снижение температуры (вплоть до замораживания) не влияло на антигенный фенотип у типичных штаммов, отмечалось лишь незначительное снижение агглютинабельности холерными сыворотками после восьми суток воздействия, хотя отмеченная тенденция могла прогрессировать при продолжении воздействия Холодовым стрессом. Чрезвычайно нестабильным оказался штамм в БЯ-форме. Его популяция даже после сравнительно короткого воздействия перестала агглютинироваться О-холерной сывороткой, резко снизилась агглютинабельность сывороткой Инаба и, таким образом, наметился явный переход в Я- и О" -варианты. Удельный вес устойчивых к холодовому воздействию клеток был гораздо ниже, чем в популяции
других штаммов, что еще раз свидетельствует о лабильности генотипа и сниженных адаптационных способностях SR-вариантов.
Наиболее устойчивыми к воздействию низких температур, в том числе замораживания, оказались культуры в R-форме. Они сохранили высокий удельный вес жизнеспособных клеток в популяции после стрессового воздействия, что свидетельствует о незначительной роли холодового фактора в жизнедеятельности таких антигенных вариантов. Их с полным основанием можно относить к факультативным психрофилам, поскольку они приспособились к жизнедеятельности в условиях низких температур. Это предполагает наличие особого адаптационного механизма у R-форм, а именно повышения содержания ненасыщенных циклопропановых жирных кислот Cnv и Ci9y , которые отсутствуют у типичных форм холерного вибриона (Brian В., Gardner Е., 1968), с помощью которых они увеличивают свою гидрофобность, тем самым обеспечивая функционирование клеточных мембран в стрессовых условиях.
При анализе влияния анаэробных условий культивирования как модели для оценки возможности изменения поверхностных структур вибрионов в экологической среде с дефицитом кислорода (подо льдом, в простейших, гидро-бионтах, желчной системе человека) было установлено, что анаэробиоз, особенно в комбинации с низкой температурой, вызывал резкое изменение О-антигена у типичных и SR-штаммов (рис. 3,4). Они в течение нескольких суток перешли в неагглютинирующиеся формы. При этом показано, что штамм Ина-ба гораздо быстрее терял агглютинабельность холерными сыворотками, чем Огава, что свидетельствует о более короткой боковой цепи в ЛПС, легче подвергающейся изменениям при неблагоприятных воздействиях. Штамм серова-ра Огава приобрел в итоге фенотип R-форм. Снижение и утрата агглютина-бельности у типичных холерных вибрионов сопровождалась утратой лизабель-ности диагностическими фагами и ХДФ, что указывает на потерю или модификацию зон рецепции фагов за счет изменения клеточной поверхности. Другие биологические свойства в результате эксперимента не изменились, сохранились и гены ctx и tcp. При попытке восстановить исходную агглютинабельность было показано, что легче этот процесс проходил у штаммов Огава, у Инаба полной реверсии в исходный фенотип получить не удалось. Стрессиро-ванные вибрионы с большим трудом восстановили способность реагировать только с О-холерной сывороткой.
Дни
Рис. 3. Динамика изменения агглютинабельности V. еког Р-3119 Огава в условиях анаэробиоза
-4—0 -■Ч- Огав.1 -А— Инаиз
Рис. 4. Динамика изменения агглютинабельности \'.е11ог Р-5879 Инаба в условиях анаэробиоза
Как и в других опытах по изучению R-форм, в исследованиях по влиянию анаэробиоза на варианты с этим типом изменчивости была установлена высокая стабильность этих вариантов, хотя и у них при низких температурах отмечена тенденция к снижению агглютинабелыюсти РО-сывороткой.
В исследованиях по влиянию биотических факторов на основные свойства холерных вибрионов было установлено, что в популяции выживших после контакта с инфузориями Paramecium caudatum обнаруживались типичные субкультуры, но появились и клоны, полностью утратившие агглютинабельность, R, SR и варианты с неопределяемым сероваром. Отмечена также тенденция к снижению токсигенности, выражающаяся в замедлении гибели кроликов-сосунков. Неоднородной была и популяции SR-варианта, в ней встречались слабо и неагглютинирующиеся культуры и R-варианты. Впервые было отмечено изменение в популяции R-штамма: часть субкультур перестала агглютинироваться даже РО-сывороткой и "перешла" в неагглютинирующиеся варианты. У единичных субкультур отмечена слабая реакция с холерными сыворотками О и Огава.
Проведенное исследование показало, что взаимоотношения вибрионов с указанным типом инфузорий носили характер "хищник-жертва", большая часть популяции холерных вибрионов при этом погибала, в у выживших наблюдалось значительное изменение поверхностных структур в сторону неагглютини-рующихся и R-форм.
Таким образом, на основании представленных в нашей работе результатов исследований можно судить о наличии у холерных вибрионов адаптационного механизма, выработанного в процессе эволюции, который способствует сохранению и выживанию определенной части популяции даже в условиях стресса, какими являются резкие колебания температуры, голодание, гелиогео-магнитное воздействие, биоантгонисты и другие факторы.
Динамика негативных изменений генотипа и фенотипа при экспериментальном стрессе, который приблизительно моделирует климатические условия на большей части территории Российской Федерации, иллюстрацией чему служат показания изменяющейся агглютииабельности и вирулентности, свидетельствует об упорной борьбе холерных вибрионов за выживание и сохранение популяции.
Все, чему были посвящены наши исследования, свидетельствует о том, что для реализации механизма формирования новых патогенных клонов в холодном климате умеренных широт нашей страны, где холерные вибрионы
осуществляют свою "стратегию жизни" в меньшем объеме, чем в эндемичных зонах (Ларионов Г.М. с соавт., 1997; Сухов В.В., Лобанов А.Н., 1999), по-видимому, нет условий.
Изменения антигенной структуры холерных вибрионов, вызванные неблагоприятными условиями обитания во внешней среде, а иногда и в организме человека с его иммунным статусом и неадекватным приемом противомик-робных препаратов, привели к тому, что диагностика атипичных по антигенной структуре вариантов стала весомой проблемой, которая уже не решается с помощью традиционных приемов, а требует своего совершенствования. Для этих целей нужны высококачественные специфические сыворотки с высокими титрами иммуноглобулинов. Разработанная в последние годы технология получения моноклональных антител позволяет получить специфические препараты с высокой активностью, гомогенностью, аффинностью.
В результате гибридизации спленоцитов мышей, иммунизированных по специально подобранным схемам штаммами холерных вибрионов в Я-форме, с клетками миеломы Х-653 впервые в отечественной и зарубежной практике получен набор гибридных культур к антигенным детерминантам, экспонированным на поверхности клеток этих штаммов. Для клонирования были отобраны гибридные культуры, отличающиеся высокой пролиферацией и стабильным уровнем продукции антител, которые криоконсервированы и хранятся в крио-банке Ростовского противочумного института. Гибридома СПЛЮ депонирована в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных коллекции клеточных культур под номером ВСКК/11/614 Д в институте цитологии АН, г. Санкт-Петербург.
Для диагностики атипичных холерных вибрионов получены препаративные количества асцитических иммуноглобулинов и проведен их скрининг в системе иммунологических реакций с коллекцией гомологичных и гетероло-гичных штаммов, который позволил установить наличие наиболее консервативных эпитопов на поверхности микробных клеток.
Представляется перспективным применение в диагностике атипичных штаммов смесей моноклональных иммуноглобулинов, существенно расширяющих спектр выявляемых детерминант холерных вибрионов.
Учитывая высокую специфичность МКА гибридомы СцДз в отношении атипичных форм холерных вибрионов, на их основе получены экспериментальные препараты, меченые ФИТЦ для прямого иммунолюминесцентного метода. В отличие от коммерческих люминесцирующих сывороток с низким тит-
ром, полученный препарат на основе МКА обладал очень высокой активностью (рабочее разведение 1:400).
Мы попытались также преодолеть недостатки существующих методов серологической идентификации с использованием кроличьих иммуноглобулинов, полученных нами ¡j.типичным и измененным штаммам холерных вибрионов. Кроличьи сыворотки содержат меньшее количество гетерогенных антител и дают соответственно меньше перекрестных неспецифических реакций. Для их получения была специально отработана схема, титры полученных иммуноглобулинов к типичным и измененным холерным вибрионам были достаточно высокими (1:1600-1:6400). Использование для анализа антигенного состава кроличьих сывороток дало гораздо большую информацию по этому вопросу, чем применение коммерческих сывороток. Специфичность и чувствительность их, обусловленная пулом высокоактивных иммуноглобулинов, делает эти препараты перспективными для дальнейшего использования, поскольку с их помощью может быть значительно упрощена идентификация холерных вибрионов за счет отмены развернутой реакции агглютинации с коммерческими сыворотками и заменой ее постановкой реакции на стекле с кроличьими иммуноглобулинами. Предложение о получении и использовании кроличьих сывороток, наряду с коммерческими лошадиными, и последующем их внедрении в лабораторную практику включено в новую инструкцию по холере (2000 г.).
Поиски новых методических приемов для совершенствования диагностики атипичных штаммов позволили нам доказать перспективность использования для этих целей иммуноферментного анализа, с помощью которого был охарактеризован антигенный состав типичных и измененных штаммов. Наше предложение об использовании ИФА для идентификации измененных холерных, вибрионов было включено в "Инструкцию по организации и проведению противохолерных мероприятий" (М., 1995 г.), в новую ее редакцию (2000 г.) и в руководство "Диагностика возбудителей опасных инфекционных заболеваний (Саратов, 1998).
Для диагностики наиболее глубоко измененных штаммов нами были апробированы высокочувствительные современные методы исследования - электрофорез в полиакриламидном геле и иммуноблоттинг. С их помощью был проведен анализ глубины и диапазона антигенной вариабельности холерных вибрионов, изучение антигенного родства холерных вибрионов OI и не 01 се-рогрупп и отличие их от других представителей рода Vibrio и семейства Vi-brionaceae.
Таким образом, сравнительное исследование рутинных и наиболее современных чувствительных методов с целью совершенствования диагностики измененных по антигенной структуре штаммов холерных вибрионов показало, что традиционные приемы лабораторной диагностики могут использоваться лишь на ранних стадиях диссоциации.
Для характеристики глубоко измененных антигенных вариантов следует использовать высоко специфичные и чувствительные методы (иммунофер-ментный анализ, иммуноблоттинг и в дальнейшем, возможно, ГГЦР).
ВЫВОДЫ
1. Установлена выраженная территориальная и временная связь характера и динамики антигенной изменчивости холерных вибрионов, выделенных в период седьмой пандемии холеры. Длительная циркуляция в воде открытых водоемов сопровождалась последующим появлением атипичных по агглюти-набельности вибрионов, фенотип которых зависит от условий данной экосистемы, способствующей формированию определенных антигенных вариантов. Установлено, что практически все регионы, где длительно выделялись типичные и измененные штаммы, расположены в зоне 40°-50° северной широты.
2. Показано наличие среди ЯО-вариантов двух групп (Я и БЯ), принципиально отличающихся по происхождению и свойствам. Я-фенотип характерен для штаммов, выделяемых в Приморье, Новосибирской области, Каракалпакии и Таджикистане. Штаммы с таким фенотипом не выделялись от людей, они полностью авирулентны и могут быть отнесены к аутохтонной микрофлоре. ЭЯ-варианты обнаруживались у людей и в объектах окружающей среды, часть из них - вирулентна, часть - апатогенна. Такие вибрионы выделялись во время вспышки холеры в Дагестане в 1994 и 1998 гг., в г. Шевченко Мангистаустаус-ской области Казахстана и в ряде других регионов.
3. При изучении особенностей метаболизма у атипичных по антигенному составу холерных вибрионов установлено, что клетки при этом переходят на новый энергетический уровень с замедленным синтезом органических веществ, позволяющим им определенное время персистировать в окружающей среде. Этот процесс сопровождается проявлением выраженной цитотоксической (гемолитической и дермонекротической)активности.
4. Использование полимеразной цепной реакции с набором специфических и универсальных праймеров позволило провести исследование большой
группы штаммов, выделенных от людей и из объектов окружающей среды, с целью изучения геномного полиморфизма. Показано, что универсальный праймер № 15 может быть рекомендован для анализа популяции вибрионов, циркулирующих в определенных экосистемах.
5. Исследование большой коллекции штаммов холерных вибрионов на наличие генов 1срА, кодирующих синтез токсин-корегулируемых пилей адгезии и являющихся поверхностными антигенами, а также генов с1хАВ показало, что комбинация этих последовательностей обнаруживается в период эпидо-сложнений наиболее постоянно у холерных вибрионов, изолированных от людей, из сточной воды и иногда из воды открытых водоемов. В межэпидемический период из воды, а иногда и от людей без выраженных клинических проявлений, как правило, выделяются 1ср" с1х"-штаммы. Обнаружение штаммов с гср* с(х" генотипом может свидетельствовать о ступенчатом характере утраты вирулентности у холерных вибрионов.
6. Анализ состава популяции штаммов холерных вибрионов с различным антигенным фенотипом и стабильности их свойств на протяжении нескольких лет выявил однородность Я- и 0"-вариантов, находящихся в стадии глубокой необратимой изменчивости, не способных даже к частичной реверсии. Установлена выраженная неоднородность клеточного состава БЯ-вариантов и штаммов со сниженной агглютинабельностью. Нестабильность такого фенотипа может приводить к полной утрате агглютинабельности всеми холерными сыворотками или переходу в Я-форму, что свидетельствует о лабильности генотипа. Установлены явления изменчивости антигенного состава в популяции холерных вибрионов 0139 серогруппы.
7. Графический и статистический анализ влияния гелиоактивности на динамику и характер наблюдаемой в различных регионах антигенной изменчивости холерных вибрионов позволил установить прямую связь количества выделенных в этот период атипичных штаммов и уровня солнечной радиации. Прослежена четкая зависимость характера и продолжительности наблюдаемой антигенной модификации от прямого или опосредованного влияния гелиоактивности.
8. Доказана способность холерных вибрионов длительно выживать в присутствии низких концентраций высокомолекулярных углеводородов с постепенным изменением фенотипа и генотипа, что выражалось в снижении агглютинабельности, появлении признаков диссоциации, гемолитической активности, утрате гена с1х.
9. Доказано наличие выраженных адаптационных способностей у холерных вибрионов при различных видах стресса. Наиболее устойчивыми вибрионы оказались к тепловому воздействию, не вызывающему изменений антигенных и вирулентных свойств. Комбинированный анаэробно / холодовой стресс вызывал очень быстрый переход в неагглютинирующиеся формы с потерей ли-забельности диагностическими фагами и ХДФ. Показано отсутствие влияния всех стрессовых воздействий на R-формы вибрионов, что свидетельствует об их психрофильных и гидрофобных свойствах, обеспечивающих длительную персистениию в условиях низкотемпературных широт.
10. Взаимоотношения типичных и атипичных холерных вибрионов с инфузориями Paramecium caudatum носили характер "хищник-жертва". Большая часть популяции холерных вибрионов при контакте с ними погибает, а у выживших - отмечено значительное изменение поверхностных структур со сторону неагглютинирующихся и R-форм. Отмечена также тенденция к снижению токсигенности, выразившаяся в замедлении гибели кроликов-сосунков.
11. Проведенный комплекс исследований позволяет сделать вывод, что динамика негативных изменении генотипа и фенотипа при экспериментальном стрессе, моделирующем климатические условия на большей части территории Российской Федерации, не способствует реализации механизма формирования новых эпидемических клонов на территории нашей страны, для этого необходима экологическая среда эндемичных приэкваториальных зон, где в течение года существуют благоприятные условия для постоянного контакта человека с водной средой.
12. С целью совершенствования диагностики измененных по антигенному составу холерных вибрионов был получен набор высокоспецифичных мо-ноклонапьных антител и кроличьих сывороток, оценена диагностическая ценность иммуноферментного анализа, встречного иммуноэлетрофореза, электрофореза в ПААГ, иммуноблоттинга. Рекомендации по диагностике атипичных штаммов включены в "Инструкцию по организации и проведению противохолерных мероприятий" (М., 1995 г.), в новую ее редакцию 2000 г. и в руководство "Диагностика возбудителей опасных инфекционных заболеваний" (Саратов, 1998).
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Характеристика некоторых методов выявления мутагенного действия различных веществ на холерные вибрионы / Уралева B.C., Гулида М.М., Фе-цайлова О.П. и др. /.- // Мол. биол. и генетика возб. особо опасн. инф.-Саратов, 1982.-Ч.2.-С.69-70.
2. Адгезивные свойства штаммов и мутантов холерных вибрионов с различной биологической характеристикой / Уралева B.C., Кутырева И.В., Трубникова В.А. / .- // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.-1983.-К7.-С.51-55.
3. Влияние нефти и продуктов ее переработки на холерные вибрионы в эксперименте / Уралева B.C., Кутырева И.В. / .- // Актуап. вопр. лаб. диагн. и биохим. возб. чумы и холеры.-Саратов, 1984.-С.56-60.
4. Оценка значения некоторых свойств для вирулентности возбудителя холеры и выявления их коррелятивных связей / Уралева B.C., Фецайлова О.П., Гулида М.М. и др. / .- // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.-1984.-N10.-C.58-63.
5. Возможности и условия реверсии патогенных свойств возбудителя холеры в эксперименте / Уралева B.C., Гулида М.М., Кутырева И.В. и др. / .- // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.-1984.-М12.-С.54-59.
6. Теоретические и методические подходы к определению возможности реверсии невирулентных штаммов холерных вибрионов / Уралева B.C., Гулида М.М., Фецайлова О.П., Помухина О.И. / .- // Обл. науч.-практ. конф. по пробл. "Холера": Тез. докл.-Ростов н/Д, 1984.-С.38-40.
7. Нейраминидазная активность штаммов и мутантов холерных вибрионов с различной биологической характеристикой / Кутырева И.В. /.- // там же,-С.181-183.
8. Длительность выживания и свойства холерных вибрионов в присутствии нефти и продуктов ее переработки / Кутырева И.В. / .- // Обл. конф. "Пробл. мед. и сан. микробиол. города": Тез. докл.-Ростов н/Д, 1987.-С.62-63.
9. Характеристика амилолитической активности штаммов и мутантов холерных вибрионов с различными биологическими свойствами / Кутырева И.В. / .- // Всесоюз. науч. конф. "Актуал. вопр. микробиол., лаб. диагн. и проф. холеры: Тез. докл.-Ростов н/Д, 1988.-С.95-97.
10. Результаты молекулярного зондирования штаммов и мутантов холерных вибрионов с различной биологической характеристикой на наличие vet-
гена / Уралева B.C., Фецайлова О.П., Власов В.П. и др. /.- // там же.- С.54-56.
11. Серологический ответ различных пород кроликов на антигены возбудителей ООИ / Анисимов Б.И., Гамлешко Х.П., Некляев В.Н и др. /.- // Экология животных: Пущино, 1989.-С.78.
12. Результаты молекулярного зондирования на наличие генов токсинооб-разования штаммов Vibrio cholerae с различными биологическими свойствами / Уралева B.C., Фецайлова О.П., Власов В.П. и др. /.- // Журн. микробиол., эпи-демиол. и иммунобиол.-1989.-Ы11.-С.116-117.
13. Выделение дермотоксина холерных вибрионов, его серологические и другие свойства / Атарова Г.Т., Помухина О.И., Козырева Л.А., Сальникова О.И. /.- //1 съезд иммунол. России: Тез. докл.-Новосибирск, 1992.-С.22.
14. Тестирование моноклональных антител, полученных к атипичным штаммам холерных вибрионов в системе серологических реакций / Гладких И.М., Алексеева Л.П., Бурлакова О.С. и др. / .- // там же.-С. 106-107.
15. Динамика антителообразования при иммунизации мышей штаммами холерных вибрионов в R-форме в процессе получения моноклональных антител / Алексеева Л.П., Бурлакова О.С., Кутырева И.В. и др. / .- // там же.-С.530.
16. Подбор оптимальной схемы иммунизации для получения моноклональных антител к антигенным детерминантам атипичных штаммов холерных вибрионов / Алексеева Л.П., Бурлакова О.С., Кутырева И.В. и др. / .- // Холера. Вопр. эпидемиол., микробиол. и лаб. диагностики: Матер. Рос. науч. конф.-Ростов н/Д, 1992.-С.116-119.
17. Совершенствование диагностики атипичных штаммов холерных вибрионов с использованием моноклональных антител / Бурлакова О.С., Алексеева Л.П., Подосинникова Л.С. и др. /.- // там же.-С.165-168.
18. Выделение и некоторые свойства дермонекротического фактора холерных вибрионов / Атарова Г.Т., Помухина О.И., Уралева B.C. /.- // там же,-С.82-83.
19. Тест-системы на основе моноклональных антител для обнаружения холерных вибрионов OI группы / Бурлакова О.С., Алексеева Л.П., Балахнова В.В. и др. / .- // там же.-С. 163-165.
20. Моноклональные антитела в диагностике атипичных штаммов холерных вибрионов / Гладких И.М. /.- // Иммунол. и спец. проф. особо опасн. инф.: Матер. Рос. науч. конф.-Саратов, 1993.-С.240.
21. Использование иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга для диагностики атипичных штаммов холерных вибрионов / Балахнова В.В., Copo-
кин В.М., Прозорова Л.А. /.- // Принц, и практ. борьбы с холерой в Респ. Дагестан. Актуал. вопр. разработки микробиол. питат. сред и тестсистем: Матер, докл. Всерос. науч.-практ. конф.-Махачкала, 1994.-С.58.
22. Клиническое испытание микросистем для идентификации холерных вибрионов / Меджиев М.М., Гриднева Н.И., Пономарева Л.С. и др. / .- // там же.-С.53.
23. Использование реакции коагглютинации в качестве ускоренного метода в очаге холеры / Смоликова Л.М., Некляев В.Н., Карагозова A.B. и др. /.- // там же.-С.59.
24. Совершенствование фагодиагностики атипичных штаммов холерных вибрионов / Кудрякова Т.А., Македонова Л.Д., Огнева Н.С., Качкина Г.В. /.- // там же.-С.57.
25. Характеристика штаммов холерных вибрионов, выделенных в Хасавюртовском и Бабаюртовском районах Дагестана / Карагозова A.A., Смоликова Л.М., Македонова Л.Д. и др. /.- // там же.-С.54.
26. Использование иммуноферментного анализа и реакции коагглютинации с поликлональными и моноклональными иммуноглобулинами для диагностики атипичных по агглютинабельности штаммов холерных вибрионов / Ба-лахнова В.В., Бурлакова О.С., Алексеева Л.П. /.- // Матер, межгос. науч.-практ. конф. "Актуал. вопр. проф. чумы и др. инф. забол., посвящ. 100-лет. откр. возб. чумы" .-Ставрополь, 1994.-С.148-149.
27. Селекция пигментных вариантов из штаммов холерных вибрионов 0139 серовара и лизогенизация их холерным фагом / Кудрякова Т.А., Мишань-кин Б.Н., Шиманюк Н.Я. и др. /.- // там же.-С.137-138.
28. К вопросу о механизме антигенной вариабельности холерных вибрионов // Холера: Матер. Рос. науч.-практ. конф. по пробл. "Холера".-Ростов н/Д, 1995.-С.116-119.
29. Использование метода точечной иммунодетекции (ТИД) для диагностики типичных и атипичных штаммов холерных вибрионов / Балахнова В.В. / .-//там же.-С.134-135.
30. Дермонекротический фактор холерных вибрионов 0139 серогруппы / Помухина О.И., Атарова Г.Т./ .-//там же.-С. 135-136.
31. Причины устойчивости холерных вибрионов к диагностическим фагам / Кудрякова Т.А., Алексеева Л.П., Македонова Л.Д. и др. / .- // Микробиол. журн.-1995.-Т.57, N3.-C.56-64,
32. Свойства штаммов Vibrio cholerae, выделенных в крупных районах на
западе Дагестана в 1994 г. / Ломов Ю.М., Карагозова A.B., Помухина О.И. и др. / .- // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.-1995, приложение 2 (март-апрель).-С.84-86.
33. Применение холерного коагглютинирующего диагностикума в условиях эпидемии холеры в Дагестане / Орлова Г.М., Адимов Л.Б., Гончарова О.В. и др. /.- // там же.-С.30-32.
34. Холера на равнинной части Дагестана / Кучин В.В., Онищенко Г.Г., Сучков И.Ю. и др. / .- // там же.-С.34-36.
35. Холера в отдаленном районе Дагестана / Арутюнов Ю.И., Амирханов A.A., Базарганов М.М. и др. /.- // там же.-С.40-43.
36. Выделение дермотоксина Vibrio cholerae и характеристика его биологических свойств / Атарова Г.Т., Помухина О.И., Мишанькин Б.Н. и др. / .- II там же.-С.90-91.
37. Влияние высокой температуры на антигенную структуру атипичных штаммов холерных вибрионов / Помухина О.И. / .- // Эпидемиол. и клинико-иммунол. аспекты проф. важн. инф. забол.: Матер, конф.-Астрахань. 1996.-С.125-126.
38. Современные подходы к изучению антигенной вариабельности холерных вибрионов / Балахнова В.В., Подосинникова Л.С., Огнева Н.С. и др. / .- // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.-1996.-Ы4.-С.85-86.
39. Изучение антигенной вариабельности холерных вибрионов на модели перитонеальных макрофагов белых мышей / Балахнова В.В., Ермоленко Т.Д. Помухина О.И. и др. /.- // Матер науч.-практ. конф., посвящ. 100-лет. образов, противочум. службы России.-Саратов, 1997.-Т2.-С.146.
40. Характеристика биологической активности антигенных вариантов холерных вибрионов на модели клеточной культуры СНО-К1 / Сальникова О.И., Балахнова В.В. /.- // Матер. VII съезда Всерос. об-ва эпидемиол., микробиол. и паразитол.-М„ 1997.-Т. 1 .-С.236-237.
41. Изучение антигенных взаимосвязей типичных и R-форм холерных вибрионов на основе моноклональных антител / Алексеева Л.П., Сальникова О.И., Бурлакова О.С. /.-// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.-1998.-N4.-C.9-12.
42. Влияние экологических условий на диапазон антигенной вариабельности холерных вибрионов // Диагн., лечение и проф. опасн. инф. забол. Биотехнология. Ветеринария: Матер, юбил. науч. конф., посвящ. 70-лет. НИИ микробиол. МО РФ.-Киров, 1998.-С.402-403.
43. Антигенная вариабельность холерных вибрионов в условиях дефицита кислорода / Помухина О.И., Бурлакова О.С., Балахнова В.В., Фецайлова О.И. / .-//там же.-С.195-196.
44. Изучение вариабельности некоторых биологических свойств холерных вибрионов на модели инфузорий Paramecium caudatum / Бурлакова О.С., Помухина О.И., Фецайлова О.П., Шевченко C.B. /.- // там же.-С.61-62.
45. Некоторые особенности метаболизма атипичных форм холерных вибрионов / Каграманов B.C., Бурша О.С., Асеева JI.E., Помухина О.И. / .- // там же.-С.106-107.
46. Холера / Подосинникова Л.С., Воронежская Л.Г., Ломов Ю.М. и др./ .-// Лаб. диагн. возб. опасн. инф. бол-ней.-Саратов, 1998.-T.2.-C.3-43.
47. Изменчивость холерных вибрионов / Подосинникова Л.С. / .- // Пробл. особо опасн. инф.-Саратов, 1998.-С.22-31.
48. Некоторые экологические аспекты распространения атипичных по антигенной структуре вибрионов эльтор в период седьмой пандемии холеры / Подосинникова Л.С., Помухина О.И., Бурлакова О.С. и др. /.- // Пробл. мед. и экол. биотехнол.: Сб. тез. докл. юбил. науч. конф., посвящ. 25-лет. ГНЦ прикл. микробиол.-Оболенск, 1999.-С.149.
49. Влияние низких концентраций нефти и продуктов ее переработки на свойства холерных вибрионов / Фецайлова О.П., Водопьянов С.О., Монахова Е.В. / .- // Диагн., лечение и проф. инф. забол. Биотехнология. Ветеринария: Матер, юбил. науч. конф., посвящ. 50-лет. Центра военно-технич. пробл. биол. защиты НИИ микробиол. МО РФ.-Екатеринбург, 1999.-С.251.
50. Влияние некоторых биотических факторов на антигенную структуру и вирулентность холерных вибрионов / Подосинникова Л.С., Балахнова В.В., Бурлакова О.С., Титова C.B. / .- // Пробл. комиссия "Холера и патоген, для человека вибрионьГ.-Ростов н/Д, 1999.-Вып.12.-С.63-64.
51. Сравнительный анализ штаммов холерных вибрионов, выделенных в Дагестане от людей в 1994 и 1998 гг. / Мишанькин Б.Н., Романова Л.В., Водопьянов С.О. и др. /.- // там же.-С.36-39.
52. Этапы в развитии приемов оценки эпидзначимости штаммов холерных вибрионов / Мишанькин Б.Н., Ломов Ю.М., Бардых И.Д. и др. / .- // там же.-С.47-50.
53. Ген tcpA и эпидемиологическая значимость холерных вибрионов, выделенных из объектов окружающей среды / Водопьянов С.О., Мишанькин Б.Н. Олейников И.П. и др. /.- // там же.-С.50-55.
54. Influence of solar activity on forming of changed by antigen structure V. cholerae / Burlakova O.S., Prometnoy V.I. / .- // Ninth International congress for culture collections, Australia, Brisbane, July 23-28,2000.
55. Результаты изучения длительного воздействия высокомолекулярных углеводородов на фенотип и генотип холерных вибрионов в эксперименте / Помухина О.И., Водопьянов С.О., Мишанькин Б.Н. / .- // Пробл. комиссия "Холера и патоген, для человека вибрионы".-Ростов н/Д, 2000.-Вып.13.-С.84-85.
56. Vibrio cholerae 0139, выделенные от людей и из воды открытых водоемов: сравнительное генотипирование / Мишанькин Б.Н., Романова Л.В., Ломов Ю.М. и др. / .- // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.-2000.-Ш.-С.3-7.
57. Актуальные проблемы холеры / Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Покровский В.И. и др. / .- // М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 2000.-204 с.
***
Сдано в набор 27.09.2000 г. Подписано к печати 27.09.2000 г. Формат 84x108 1/16 Печать лазерная. Гарнитура Тайме. Объем 2,0 усл. п.л. Тираж 100 экз.
Отпечатано в компьютерном центре Ростовского НИПЧИ.
-
Черепахина, Ирина Яковлевна
-
доктора медицинских наук
-
Ростов-на-Дону, 2000
-
ВАК 03.00.07
- Антигенные свойства и серотипирование новых штаммов неагглютинирующихся вибрионов
- Лизогения холерных и парагемолитических вибрионов и её практическое значение
- Выявление эпидемически значимых холерных вибрионов с использованием аффинных магносорбентов
- Сравнительное изучение и совершенстование некоторых методов идентификации вирулентных штаммов холерных вибрионов
- Получение множественно маркированных штаммов холерного вибриона и их использование для картирования хромосомы
