Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выявление эпидемически значимых холерных вибрионов с использованием аффинных магносорбентов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Жилченко, Елена Борисовна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. ПРИМЕНЕНИЕ МАГНОИММУНОСОРБЕНТОВ И ГАНГЛИОЗИДСОДЕРЖАЩИХ ДИАГНОСТИ-КУМОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ХОЛЕРЫ, ЕГО ЭНТЕРОТОКСИНА И АНТИГЕНОВ

1.1. Использование магноиммуносорбентов в экспрессных методах обнаружения холерных вибрионов.

1.2. Тканевые рецепторы холерного энтеротоксина и их применение при конструировании диагностических препаратов.

1.2.1. Ганглиозиды как специфические тканевые рецепторы холерного энтеротоксина .;.

1.2.2. Получение и характеристика диагностических препаратов с использованием ганглиозидов для выявления возбудителя холеры и его энтеротоксина.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Характеристика штаммов, взятых в исследование

2.2. Питательные среды.

2.3. Получение липогликопротеида.

2.4. Получение гипериммунных кроличьих сывороток

2.5. Метод выделения иммуноглобулинов.

2.6. Количественное определение белка.

2.7. Реакция преципитации в агаровом геле.

2.8. Получение иммунопероксидазных конъюгатов и контроль их активности.

2.9. Метод получения композиционных магноиммуно-сорбентов.

2.10.Оценка качества холерных магноиммуносорбентов.

2.11 .Метод получения холерогена.

2.12.Способ получения ганглиозидов.

2.13.Характеристика лабораторных животных, использованных в опытах.

2.14. Получение ганглиозидсо держащих магносорбентов

2.15.Постановка полимеразной цепной реакции.

2.16.Методы статистической обработки материала.

Глава 3. ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ХОЛЕРНЫХ МАГНОИММУНОСОРБЕНТОВ.

3.1. Получение холерных агглютинирующих сывороток

3.2. Способ выделения иммуноглобулинов для иммобилизации на магносорбенте.

3.3. Получение холерных магноиммуносорбентов.

3.4. Оценка чувствительности и специфичности О-холер-ных магноиммуносорбентов.

Глава 4. КОМБИНИРОВАННОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МАГНОИММУНОСОРБЕНТОВ И ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ХОЛЕРЫ.

4.1. Исследование чистых культур холерных вибрионов

4.2. Исследование смешанных культур токсигенных штаммов с гетерологичной микрофлорой.

4.3 Обнаружение холерных вибрионов в пробах большого объема.

4.4 Подготовка проб воды открытых водоисточников для выявления токсигенных штаммов Vibrio cholerae

Глава 5. КОНСТРУИРОВАНИЕ И ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ГАНГЛИОЗИДСОДЕРЖАЩИХ МАГНОСОР-БЕНТОВ.

5.1. Модификация способа получения ганглиозидов

5.2. Получение ганглиозидсодержащих магносорбен-тов. Оценка физико-химических свойств, специфичности и сорбционной емкости.

Глава 6. ПРИМЕНЕНИЕ ГАНГЛИОЗИДСОДЕРЖАЩИХ МАГНОСОРБЕНТОВ ДЛЯ СЕЛЕКТИВНОГО КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ЭПИДЕМИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ ШТАММОВ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА.

6.1. Применение ганглиозидсодержащих магносорбен-тов совместно с полимеразной цепной реакцией для обнаружения эпидемически значимых холерных вибрионов 01 серогруппы.

6.2. Изучение возможности фиксации на ганглиозидсодержащих магносорбентах токсигенных штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выявление эпидемически значимых холерных вибрионов с использованием аффинных магносорбентов"

Актуальность проблемы

Проблема холеры по-прежнему актуальна для многих стран мира, в том числе и для России. Холерные эпидемии, вызываемые токсигенными штаммами Vibrio cholerae, продолжают наносить значительный социально-экономический ущерб многим регионам мира, являются одной из причин заболеваемости и смертности в странах Юго-Восточной Азии, Африки, Центральной и Южной Америки. В настоящее время стойкие эндемичные очаги холеры сформировались в странах Юго-Восточной Азии (Малайзия, Индонезия, Вьетнам, Сингапур, Таиланд), Африки (Гана, Того, Бенин, Нигер, Кения) и Латинской Америки (Мексика, Гватемала, Сальвадор, Перу, Колумбия, Эквадор, Бразилия) (Ломов Ю.М. с соавт., 1995; 1997).

Эпидемиологическую ситуацию по холере в Европе в последнее десятилетие можно охарактеризовать как неустойчивую. За данный период 25 стран Европы информировали ВОЗ о завозах холеры из-за рубежа, произошли крупные вспышки в Румынии (1990, 1991) и Албании (1994). Также отмечались вспышки или спорадические случаи холеры, связанные с завозами инфекции людьми или заносами возбудителя с водой рек, берущих начало за рубежом, в странах СНГ: Украине, Азербайджане, Узбекистане, Кыргызстане, Таджикистане, Туркменистане, Казахстане, Молдове, Армении (Ломов Ю.М. с соавт., 2000). Более 100 вспышек различной интенсивности, связанные с завозом холеры, регистрировались в 1990-2000 годы на территории Российской Федерации. Особенно крупные эпидемические вспышки произошли на административной территории Южного федерального округа: в г. Ставрополе в 1990 г. (завоз из Сирийской Арабской Республики, 49 больных и 21 вибриононоситель) и в Республике Дагестан в 1994 г. (завоз паломниками из Ближнего Востока, 2359 больных и вибриононосителей). В 1998-2000 годах регистрировались как единичные случаи, так и вспышки холеры в Приморье, на Сахалине, в Дагестане, Москве и Челябинске (Онищенко Г.Г. с соавт., 2000).

Основной отличительной особенностью седьмой пандемии холеры, вызванной холерными вибрионами биовара эльтор, является ее продолжительность, которая составляет уже 40 лет, начиная с 1961 г., в то время как длительность предыдущих не превышала 11-23 лет. За столь длительный период времени холерные вибрионы претерпели различные изменения по фенотипическим свойствам, что обусловило в настоящее время преобладание атипичных культур, зарегистрированных на большинстве территорий Российской Федерации (Кюрегян А.А. с соавт., 2000; Под-осинникова JI.C. с соавт., 2000). Значительная изменчивость биологических свойств холерных вибрионов, выделенных от людей и из объектов внешней среды в последние годы, существенно затрудняет выделение и идентификацию культур.

В 90-е годы в связи с регистрацией в странах Южной и Юго-Восточной Азии крупных эпидемий и вспышек, обусловленных холерными вибрионами 0139 серогруппы, или Бенгал, впервые выделенными на прибрежных территориях Бенгальского залива, прогнозировалась возможность начала 8-й пандемии холеры (Swerdlov D. et al., 1993). Но большая вспышка отмечалась затем лишь в Таиланде в 1994 г. (3487 случаев холеры). Отмечены завозные случаи холеры Бенгал в США, Англию, Германию, Эстонию, Данию, Россию, Японию, Кыргызстан, Узбекистан, Казахстан, Китай. В последние годы эпидемические проявления холеры Бенгал отмечались в Индии и Бангладеш.

Оценивая эпидемиологическую обстановку по холере в последнее десятилетие в мире можно дать неблагоприятный прогноз по данной инфекции на ближайшие годы (Ломов Ю.М. с соавт., 2000). Он определяется наличием эндемичных очагов, регистрацией эпидемий и вспышек во многих странах мира, завозами инфекции. Прогноз по России на ближайшие годы также остается неблагоприятным. Активизация продолжающейся международной миграции, расширяющиеся экономические связи, военная и экономическая нестабильность определяют возможность завозов холеры различными видами транспорта на территорию нашей страны.

В связи с вышеизложенным особую значимость приобретают мероприятия по эпидемиологическому надзору за холерой и по его совершенствованию. Важным моментом при определении объема противоэпидемических мероприятий является своевременная и достоверная характеристика свойств штаммов холерных вибрионов, выделяемых от людей и из объектов внешней среды. При этом решающее значение приобретает получение информации о способности конкретных штаммов продуцировать холерный энтеротоксин и, следовательно, вызывать холерогенный синдром у чувствительного хозяина. Также важнейшее значение имеет оперативность получения такой информации.

К ускоренным методам детекции микроорганизмов предъявляются высокие требования: специфичность, чувствительность порядка 1000 м.к./мл, возможность работы с любым нативным материалом, выполнение анализа в течение 2-7 часов. Применяющиеся в настоящее время методические подходы (бактериоскопия, полимеразная цепная реакция, иммунологические методы) не отвечают им в полной мере .

Наиболее объективным, чувствительным, специфичным и быстрым методом выявления вирулентности V.cholerae является обнаружение ctx гена методом ПЦР, позволяющее использовать этот маркер для оценки степени потенциальной эпидемической опасности штамма. Но применение ПЦР для детекции холерных вибрионов в объектах внешней среды, канализационных стоках часто затруднено в связи с большими объемами исследуемого материала, сильным загрязнением проб посторонней микрофлорой и другими агентами, низкой концентрацией возбудителя холеры. В этом случае необходимо использовать особые методические приемы, позволяющие максимально сконцентрировать искомые микробные клетки, а также исключить или уменьшить отрицательное влияние на компоненты реакции всевозможных примесей различного происхождения. Кроме того, ряд авторов (Онищенко Г.Г. с соавт., 2000) указывает на необходимость использования генного анализа обязательно в комплексе с другими методами ускоренной диагностики в качестве теста, позволяющего дать предварительный ответ о присутствии в материале патогенного микроорганизма, а также охарактеризовать его по признакам патогенности.

Введение в систему индикации различных микроорганизмов магнитных сорбентов позволило значительно упростить проведение имму-нофлуоресцентного, иммуноферментного, радиоиммунного и других экспресс-методов анализа, обеспечивая их высокую чувствительность и специфичность (Ефременко В.И., 1996). Применение магноиммуносор-бентов значительно расширяет возможность мониторинга внешней среды за счет увеличения объема исследуемых проб (до нескольких кубическим метров), селективного концентрирования искомого микроорганизма, очистки от загрязняющих компонентов.

Вышеизложенное диктует необходимость проведения исследований, направленных на разработку новых доступных методов выделения возбудителя холеры с одновременным определением эпидемической значимости штамма. Совершенствование существующих и по- иск новых методов детекции эпидемически значимых штаммов холерных вибрионов как 01, так и 0139 серогрупп вне зависимости от изменчивости феноти-пических свойств позволит с большей достоверностью осуществлять мониторинг внешней среды с целью выявления возбудителя холеры, планировать и осуществлять необходимый объем противоэпидемических мероприятий.

Цель и задачи исследования

Целью работы является совершенствование экспрессных методов оценки эпидзначимости штаммов холерных вибрионов.

В соответствии с поставленной целью предполагалось решить следующие задачи:

- получить иммунобиологические препараты для экспресс-диагностики возбудителя холеры на основе магноиммуносорбентов к О-антигену холерных вибрионов;

- получить магносорбенты с иммобилизованными ганглиозидами, оценить способность сорбентов фиксировать токсигенные штаммы холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп вне зависимости от фенотипиче-ских свойств;

- разработать условия комбинированного использования аффинных магносорбентов и полимеразной цепной реакции для выделения и характеристики эпидемически значимых штаммов возбудителя холеры;

- провести испытания полученных магносорбентных диагностику-мов в лабораторных условиях с чистыми культурами и в модельных опытах в объектах внешней среды, искусственно контаминированных холерными вибрионами.

Научная новизна работы

- Показана практическая ценность и целесообразность применения магноиммуносорбентных диагностикумов в экспрессном методе индикации холерного вибриона.

- Показана эффективность применения ганглиозидсодержащих магносорбентов для селективного концентрирования эпидемически значимых штаммов холерных вибрионов как 01, так и 0139 серогруппы.

- Установлено, что использование аффинных магнитных сорбентов на этапе подготовки проб повышает чувствительность полимеразной цепной реакции за счет избирательного концентрирования возбудителя холеры на магносорбенте и очистки пробы от посторонних агентов. Разработаны условия сочетанного применения магнитных сорбентов и ПЦР.

Приоритетность вышеизложенного подтверждена: патентом РФ "Способ индикации микроорганизмов" № 2165081 от 10.04.2001 г.

Научно-практическая значимость результатов исследования

Полученные в результате исследований данные представляют интерес с точки зрения поиска путей разработки новых доступных методов выделения и идентификации возбудителя холеры. Проведенные эксперименты показали, что фиксации токсигенных штаммов холерных вибрионов на ганглиозидсодержащих магносорбентах за счет связи "токсин-рецептор" не препятствуют ни принадлежность к различным серологическим группам (01 и 0139), ни изменчивость фенотипических свойств.

Применение аффинных магносорбентов в экспресс-методе индикации возбудителя холеры совместно с ПЦР повышает достоверность и чувствительность исследования, значительно сокращает время анализа, что имеет практическую ценность в условиях эпидемиологического надзора за холерой и при обследовании объектов внешней среды во время вспышек данного заболевания.

Материалы исследований легли в основу одного из разделов "Методических рекомендаций по экспресс-анализу атипичных штаммов возбудителей особо опасных инфекций бактериальной природы", которые одобрены Ученым Советом СтавНИПЧИ (протокол № 11 от 26 декабря 2000 г.) и утверждены директором Ставропольского научно-исследовательского противочумного института.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Получение полиакриламидных магносорбентов с иммобилизованными ганглиозидами и композиционных О-холерных магноиммуно-сорбентов для экспресс-диагностики возбудителя холеры.

2. Разработанные условия комбинированного использования полученных аффинных магносорбентов и полимеразной цепной реакции для детекции эпидемически значимых штаммов возбудителя холеры.

3. Результаты изучения фиксации токсигенных штаммов холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп на ганглиозидсодержащих магносорбен-тах.

4. Результаты изучения диагностической ценности полученных магносорбционных препаратов для детекции возбудителя холеры в объектах внешней среды в модельных опытах.

Апробация работы и публикации результатов исследования

Основные результаты диссертационной работы были доложены на юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ "Диагностика, лечение, профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария", Киров, 1998 г.; на международной научной конференции "Проблемы биологической безопасности", Оболенск, 2000 г.; на научно-практической конференции "Противоэпидемическое обеспечение населения в условиях возникновения чрезвычайных ситуаций в Северо-Кавказском регионе", Ставрополь, 2001 г.

13

Основные материалы диссертационной работы изложены в 7 научных публикациях.

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 120 работ отечественных и 95 зарубежных авторов. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста , иллюстрирована 3 рисунками и 7 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Жилченко, Елена Борисовна

ВЫВОДЫ

1. Получены холерные композиционные магноиммуносорбенты на основе кремнезема - алюмосиликата, магнитных материалов и специфических антител к холерному О-антигену, обладающие высокой чувствительностью и специфичностью, позволяющие выявлять холерные вибрионы 01 серогруппы.

2. Получены полиакриламидные магносорбенты, в структуру которых включены тканевые рецепторы холерного токсина - ганглиозиды. Сорбенты имеют высокую сорбционную емкость, чувствительность и специфичность в отношении токсигенных (ctx+) штаммов холерных вибрионов.

3. Впервые показана возможность применения ганглиозидсодержащих магносорбентов для селективного концентрирования ctx+ штаммов холерных вибрионов, включая вибрионы 0139 серогруппы.

4. Разработаны условия комбинированного применения аффинной магнитной сорбции и полимеразной цепной реакции. Применение магносорбентов на этапе подготовки проб к проведению ПЦР позволило значительно сконцентрировать холерные вибрионы, очистить пробу от кон-таминирующей микрофлоры и загрязняющих включений, сократить время анализа и повысить его чувствительность.

5. Впервые установлено,что при исследовании проб большого объема применение сочетанного метода аффинной сорбции на магносор-бенте и ПЦР дает возможность обнаруживать возбудитель холеры в пробах с концентрацией 1 м.к. в 10 мл. Время анализа не превышает 5-6 часов.

6. Исследование проб воды открытых водоемов, искусственно кон-таминированных V.cholerae, в модельных опытах с применением компо

103 зиционных О-холерных магноиммуносорбентов и ганглиозидсодержа-щих магносорбентов показали, что полученные тест-системы на основе магносорбентов и ПЦР и условия их постановки отвечают требованиям, предъявляемым к ускоренным методам детекции микроорганизмов, и могут быть использованы в системе эпиднадзора за холерой и при проведении углубленного эпидемиологического расследования в очагах холерной инфекции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Усовершенствование лабораторной диагностики и методов выявления в объектах внешней среды возбудителей инфекционных заболеваний, в том числе особо опасных, представляющих серьезную угрозу здоровью населения, является актуальной задачей.

Проблема холеры все так же актуальна для многих стран мира, в том числе и для России. Прогноз на ближайшие годы по мнению ряда исследователей остается неблагоприятным (Москвитина Э.А. с соавт., 1997; Ломов Ю.М. с соавт., 2000; Онищенко Г.Г. с соавт., 2000). В последние десять лет появился новый вариант этого заболевания - холера Бенгал, вызываемая холерными вибрионами 0139 сёрогруппы (Ramamurthy Т. et al., 1993; Albert M.J. et al., 1993; Shimada T. et al., 1993). Кроме того, большинство штаммов, выделяемых от людей и из объектов внешней среды в последние годы, характеризуется как атипичные по ряду биологических свойств, что существенно затрудняет идентификацию возбудителя холеры и определение его эпидемической значимости традиционными методами (Кюрегян А.А. с соавт., 2000; Подосинникова JI.C. с соавт., 2000).

В связи с вышесказанным актуальной остается задача усовершенствования существующих и создания новых диагностических систем, позволяющих осуществлять в сжатые сроки детекцию холерных вибрионов в различных объектах окружающей среды, одновременно определяя эпидзначимость штамма.

В настоящей работе представлены результаты научно-методических разработок по получению аффинных холерных магносорбентов, где в качестве носителя использовали полиакриламидный гель и композиционные магносорбенты на основе модифицированных высокодисперсных кремнеземов с добавлением магнитного порошка, а в качестве лиганда иммуноглобулины к холерному О-антигену и ганглиозиды - тканевые рецепторы холерного токсина. Было оценено качество полученных магно-сорбентов, их физико-химические свойства, специфичность, чувствительность, а также возможность применения данных сорбентов для детекции возбудителя холеры в лабораторных опытах с чистыми культурами и в модельных опытах в пробах воды открытых водоемов, искусственно контаминированных холерными вибрионами.

Успех получения высокоактивных диагностических иммунных препаратов зависит в большей мере от качества применяемых иммуноглобулинов. Иммуноглобулины к О-холерному антигену фракционировали по методу Poison A. et al. (1964) с помощью ПЭГ-6000 из высокоактивных (титры в РА 1:3200-1:7000 и в РИД 1:16-1:64) гипериммунных кроличьих сывороток, полученных в результате иммунизации кроликов холерным липогликопротеидом по методике Тюменцевой И.С. (1996). Титры полученных иммуноглобулинов в РИД составляли 1:64-1:128, что позволило использовать данный препарат для конструирования магноиммуносор-бентов. Основой МИС служил модифицированный высоко дисперсный кремнезем - алюмосиликат с добавлением магнитного порошка Рез04, который обладал способностью прочно фиксировать на своей поверхности иммуноглобулины. Полученные сорбенты обладали ярко выраженными магнитыми свойствами, не были склонны к конгломерации, эффективно оседали в растворе.

Было приготовлено 4 серии препарата для диагностики возбудителя холеры. В результате опытов по определению чувствительности данных препаратов, было установлено, что композиционные О-холерные магносорбентные диагностикумы обеспечивали выявление типичных штаммов холерных вибрионов 01 серогруппы в ИФА и КИФА в концентрации 1х103 м.к./мл.

Специфичность препаратов, оцененная на 63 типичных гетероло-гичных штаммах Shigella, Salmonella разных видов, E.coli и V.cholerae поп 01 методами ИФА и КИФА, позволила проводить анализ без перекрестных реакций.

Таким образом, был получен магноиммуносорбентный диагности-кум для выявления холерных вибрионов 01 серогруппы, удовлетворяющий требованиям, предъявляемым к препаратам для экспресс-методов детекции микроорганизмов.

Анализируя теоретические предпосылки и данные литературы о перспективности работ по объединению иммуномагнитной сорбции и полимеразной цепной реакции (Islam D., Lindberg А.А., 1992; Olsvik О. et al., 1994; Chandad F. et al., 1997 и др.), мы пришли к заключению о необходимости проведения подобных работ в ходе разработки нового метода детекции холерных вибрионов. Данные работы тем более важны в свете того, что в настоящее время выявление гена ctx АВ, кодирующего синтез холерного токсина, в ПЦР является одним из самых надежных методов определения токсигенности штамма V.cholerae. Неоспоримы преимущества ПЦР при оперативном решении вопроса об эпидемической значимости выделенных штаммов холерных вибрионов. Но при исследовании проб из объектов внешней среды, поверхностных водоемов, канализационных стоков применение ПЦР часто затруднено из-за большого загрязнения проб, низкой концентрации возбудителя и т.п., в этом случае практически всегда требуется выделение чистой культуры холерных вибрионов, что занимает продолжительное время (более 2 суток) и препятствует оперативности проведения анализа и, следовательно, принятию решения о необходимом объеме противохолерных мероприятий.

Проведенные нами эксперименты показали, что использование холерных МИС целесообразно при исследовании проб большого объема с низкой концентрацией возбудителя холеры. При пропускании пробы объемом 10 л происходило селективное концентрирование искомых микробных клеток на МИС, фиксированных постоянным магнитом в стеклянной трубке. Далее МИС кипятили в течение 30 минут в 100 мкл биди-стиллированной воды, чем одновременно достигался лизис клеток и обеззараживание пробы. Надосадочную жидкость использовали для проведения ПЦР. В проведенных нами опытах холерные вибрионы были обнаружены в пробах с исходной концентрацией 1 м.к./мл только сочетан-ным методом МИС-ПЦР, тогда как проведение ПЦР без МИС и бактериологический метод дали отрицательные результаты.

Также в экспериментах с пробами холерных вибрионов, контами-нированных большим количеством гетерологичной микрофлоры, показана эффективность применения МИС. В этом случае чувствительность метода МИС-ПЦР превышала чувствительность ПЦР в десять раз и составляла 100-500 м.к./мл. Повышение чувствительности при использовании сочетания МИС-ПЦР происходило за счет избирательной сорбции холерных вибрионов на МИС, удаления посторонней микрофлоры, мешающей проведению ПЦР, путем многократного отмывания сорбента от посторонней микрофлоры .

Была показана возможность применения сочетанного метода МИС-ПЦР в системе эпиднадзора за холерой в модельных опытах с пробами воды из Комсомольского пруда г. Ставрополя, искусственно кон-таминированными токсигенным (ctx+) штаммом V.cholerae. Холерные вибрионы были обнаружены в течение 5 часов в пробах с концентрацией искомых клеток 100 м.к./мл и выше. Применение данного метода позволило одновременно с детекцией возбудителя холеры определять его эпид-значимость.

Эффективность ПЦР в большой мере зависит от качества очистки ДНК-мишени. Этап подготовки проб, необходимый для удаления или снижения концентрации нежелательных примесей, может включать в себя подращивание материала на селективных или элективных средах, его центрифугирование, фильтрацию, многократное разведение, сепарацию ДНК методом нуклеосорбции, основанным на лизисе материала гуани-динтиоционатом с сорбцией ДНК на силикагеле, фенольную экстракцию, преципитацию ДНК этанолом и т.д. Практически все вышеперечисленные методы трудоемки, занимают продолжительное время. Разработанные нами методичесие подходы использования МИС на этапе пробопод-готовки ПЦР для селективного концентрирования искомых клеток возбудителя холеры и очистки пробы от посторонней микрофлоры и различных примесей природного и техногенного характера позволяют значительно сократить время проведения анализа и повысить его чувствительность. По результатам наших исследований был получен патент РФ "Способ индикации микроорганизмов" , № 2165081 от 10.04.2001 г.

В последнее десятилетие в связи с нарастанием количества выделяемых штаммов холерных вибрионов, которые характеризуются как атипичные по ряду биологических свойств, в том числе и по агглютина-бельности, фагочувствительности и т.д., и в связи с появлением нового эпидзначимого варианта возбудителя холеры - холерных вибрионов 0139 серогруппы применение О-холерных магноиммуносорбентов в ряде случаев не может быть осуществлено. Нами были получены методом блочной полимеризации полиакриламидные ганглиозидсодержащие магносорбенты, способные фиксировать токсигенные штаммы холерных вибрионов за счет связи холерного токсина с его тканевым рецептором -ганглиозидом.

В качестве аффинного лиганда при получении ГМС использовали ганглиозидсодержащий комплекс, выделенный из мозговой ткани свиньи, обладающий высокой токсиннейтрализующей активностью. Были получены 3 серии препарата ганглиозидов, две последние с более высокой степенью очистки с использованием модифицированной с нашим участием методики, обеспечивающей удаление из препарата примеси фосфолипидов.

Полученные ганглиозидсодержащие сорбенты обладали хорошими магнитными свойствами, механической прочностью, устойчивостью к кипячению и автоклавированию. Сорбент прочно фиксировал ганглио-зиды, которые невозможно было удалить ни поверхностноактивными веществами, ни растворами с различными значениями рН и ионной силы. Опыты по изучению специфичности ГМС проводились с использованием бактериологического метода путем высева сорбента на щелочной агар. ГМС обладал довольно высокой специфичностью, т.к. фиксировал только токсигенные (ctx+) штаммы холерных вибрионов и не фиксировал ctx- штаммы V. cholerae, а также бактерии родов Shigella, Salmonella и большинство штаммов E.coli, за исключением энтеропатогенного штамма E.coli O-lll. Фиксация на сорбенте энтеропатогенных кишечных палочек объясняется наличием у данных микроорганизмов термолабильного ганглиозидотропного энтеротоксина, схожего с холерогеном. Также специфичность ГМС была подтверждена тем, что сорбент терял свою биологическую активность и способность фиксировать ctx+ штаммы V.cholerae после инкубации с раствором холерогена. При использовании потерявшего активность холерогена (подвергшегося кипячению), сорбент продолжал работать в обычном режиме.

Основываясь на результатах экспериментов по определению специфичности полученных ганглиозидсодержащих магносорбентов, нами был проведен ряд опытов по применению ГМС для селективного концентрирования эпидемически значимых штаммов холерных вибрионов 01 серогруппы с последующей детекцией методом ПЦР.

В случае, когда анализу подверглись пробы чистых культур V.cholerae (ctx+) незначительного объема, чувствительность тест-системы

ГМС-ПЦР составила 10-100 м.к./мл, что сопоставимо с чувствительностью ПЦР.

В экспериментах по селективному концентрированию ctx+ штаммов возбудителя холеры в пробах объемом 10 л была проведена детекция холерных вибрионов в пробах с концентрацией 1 м.к. в 10 мл, что подтверждает целесообразность использования ГМС при исследовании на холеру водоисточников - водопроводов, воды проточных водоемов, где концентрация возбудителя холеры может быть очень мала, а объем пробы очень велик.

Также применение ГМС позволяет очистить пробу от посторонней микрофлоры, природных и техногенных загрязнений, что было подтверждено в опытах с пробами суспензий холерного вибриона, контами-нированных гетерологичной микрофлорой и при исследовании сильно загрязненной бытовыми стоками воды реки с внесенными в нее холерными вибрионами. В первом случае чувствительность метода составила 100 - 200 клеток возбудителя холеры в 1 мл пробы, во втором - 200-500 м.к./мл.

Предлагаемый нами метод сочетанного использования ГМС-ПЦР позволяет с большей достоверностью обнаружить наличие токсинообра-зования у исследуемого штамма холерных вибрионов и, следовательно, определить его эпидемическую значимость, так как ГМС фиксируют только штаммы V.cholerae, продуцирующие холероген. С другой стороны, использование в ПЦР праймеров к ctx-гену холерных вибрионов также позволяет сделать заключение об эпидемическом потенциале искомого штамма возбудителя холеры. Соединение 2-х методов - сорбции на ГМС и ПЦР позволяет определить не только наличие гена токсинооб-разования у холерных вибрионов, но и его экспрессию.

Время анализа проб с использованием ГМС-ПЦР тест-системы не превышало 5-6 часов, что имеет важное значение для практики эпиднадзора, так как дает возможность своевременного и рационального проведения противохолерных мероприятий.

В последние годы отмечено преобладание количества свежевыде-ленных штаммов холерных вибрионов, которые характеризуются как атипичные по ряду биологических свойств. Особенно часто наблюдается фагорезистентность, что затрудняет идентификацию штаммов и определение вирулентности штамма общепринятым комплексным методом. В связи с этим нами были проведены эксперименты с рядом атипичных культур холерных вибрионов. Было установлено, что чувствительность ГМС-ПЦР тест-системы не зависит от проявления фенотипических свойств штамма. Наши исследования в качестве одного из разделов вошли в "Методические рекомендации по экспресс-анализу атипичных штаммов возбудителей особо опасных инфекций бактериальной природы", одобренные решением Ученого Совета СтавНИПЧИ от 26 декабря 2000 г., протокол № 11 и утвержденные директором СтавНИПЧИ.

В настоящее время единственным методом диагностики холерных вибрионов 0139 серогруппы является серологическая идентификация выделенных культур в слайд-агглютинации с использованием холерной диагностической агглютинирующей сыворотки к V.cholerae 0139. Необходимым условием повышения эффективности лабораторной диагностики является создание новых препаратов для экспресс-диагностики холерных вибрионов Бенгал.

В связи с этим нами была изучена возможность фиксации токсигенных штаммов V.cholerae 0139 на ганглиозидсодержащих магносорбен-тах. Опыты проводили с ctx+ штаммами холерных вибрионов 0139 серогруппы, выделенными от больных в Индии, и с ctx- штаммами, выделенными из воды рек Московской области и Республики Калмыкия. Проведенные эксперименты показали, что на ГМС фиксировались только ток-сигенные штаммы V.cholerae 0139, что подтверждалось бактериологическим методом. Но доза холерных вибрионов для высева на щелочной агар должна быть достаточно высокой, поэтому чувствительность метода составила всего лишь 103-104 м.к./мл. Время контакта сорбента с микробными клетками составляло 30 минут, увеличение времени инкубации до 1-2 часов не давало ощутимых результатов.

Проведенные исследования показали возможность использования ГМС для детекции холерных вибрионов 0139 серогруппы (ctx+). Но применение бактериологического метода для детекции фиксированных на ГМС клеток V.cholerae 0139 имеет ряд недостатков, а именно: длительность анализа (18 часов), высокая посевная доза вибрионов. В связи с этим в качестве метода обнаружения фиксированных клеток была избрана полимеразная цепная реакция. Чувствительность метода составила 10100 клеток V.cholerae 0139 (ctx+) в 1 мл пробы, время анализа сократилось до 4-5 часов.

Таким образом, нами получены высокоспецифичные магносор-бентные диагностикумы на основе иммуноглобулинов к холерному О-антигену и на основе ганглиозидов - тканевых рецепторов холерного энтеротоксина. Показана целесообразность их применения для селективного концентрирования холерных вибрионов. Лабораторные испытания свидетельствуют о надежности и перспективности использования этих препаратов совместно с ПЦР в эпиднадзоре за холерой при целенаправленной детекции эпидемически значимых штаммов холерных вибрионов.

Использование ГМС для выявления токсигенных штаммов холерных вибрионов независимо от серогруппы приобретает особое значение в связи с обнаружением нового антигенного варианта возбудителя холеры V.cholerae 0139. Рядом авторов был исследован механизм процесса появления холерных вибрионов 0139 серогруппы в результате горизонтального переноса генов (Comstok L. et al., 1995, 1996; Karaolis P. et al., 1995;

101

Colwell R., 1996; Stroeher U.H. et al., 1997, 1998; Смирнова Н.И. с соавт., 1999). Было высказано предположение о возможности появления в будущем новых антигенных вариантов V.cholerae, поскольку они "более подходят" для возникновения эпидемической вспышки, чем старые (Mukhopadhyay et al., 1996; Mekalanos J.J. et al., 1997). Считается, что именно из холерных вибрионов Ol серогруппы, несущих в своем геноме "островки патогенности" и зараженных СТХ- филаментозным фагом, могут происходить новые эпидемические клоны (Faruque S.M. et al., 1998). В связи с тем, что фиксация эпидемически опасного штамма V.cholerae происходит на ГМС за счет связи "токсин-рецептор" независимо от поверхностного О-антигена, открывается перспектива использования данных сорбентов в эпиднадзоре за холерой.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жилченко, Елена Борисовна, Ставрополь

1. Аврова Н.Ф. Значение эволюционного подхода к изучению структуры и функции ганглиозидов // Укр. биохим. журнал. 1984. -Т.56, вып. 3. - С. 245-253.

2. Адамов А.К. Иммунология холеры. Саратов, 1981. - 319 с.

3. Адамов А.К., Быстрый Н.Ф., Шмеркевич Д.Л., Середин В.Г. Методика дифференцирования патогенных и апатогенных вибрионов Эль Top II Пробл. особо опасн. инф. Саратов, 1971. - Вып. 1. - С. 116-123.

4. Адамов А.К., Наумшина М.С. Холерные вибрионы. Саратов, 1984.-328 с.

5. Аксёнов М.Ю., Гинцбург А.Л. Диагностика инфекционных заболеваний с помощью метода полимеразной цепной реакции// Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1993. - -№ 4. - С. 3-8.

6. Андреевская Н.М. Получение и оценка пригодности липоглико-протеида холерного вибриона для производства агглютинирующей О-сыворотки: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Алма-Ата, 1987. - 16 с.

7. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз, 1962. - 180 с.

8. Балахонов С.В., Ганин B.C., Урбанович Л .Я. и др. Сравнительное изучение различных методов определения токсигенности Vibrio cholerae // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1999. - -№ 1. - С. 912.

9. Брюханов А.Ф., Ерёменко Е.И., Грижебовский Г.М, и др. Полимеразная цепная реакция в диагностике инфекции // Материалы науч.-практ. конф., посвящ. 100-летию образования противочум. службы России. -Саратов, 1997. Т.2. - С. 163-164.

10. Владимцева И.В., Ефременко В.И., Пушкарь В.Г. и др. Имму-нофлуоресцентный метод определения холерного энтеротоксина // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1986. - № 12. - С. 62-65.

11. Владимцева И.В., Плеханова Н.Г., Смирнова В.И., Закревский В.И. Конструирование диагностической тест-системы на основе магно-сорбентов и липосом // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1990. № 10. - С. 64-66.

12. Власов В.П., Бардахчьян Э.А., Харланова Н.Г. и др. Сравнительное изучение вирулентности vct+ и vet- холерных вибрионов // Холера: Материалы Рос. науч.-практ. конф. по пробл. "Холера". Ростов н/Д, 1995.- С. 92-98.

13. Воробьева О.В., Брыкалов А.В., Тюменцева И.С. Разработка композиционных магноиммуносорбентов нового поколения и их применение для иммуноферментного анализа сибирской язвы// Там же. 1995а. - С. 92.

14. Гинцбург A.JI. Генодиагностика инфекционных заболеваний // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1998. - № 3 - С. 86-95.

15. Голубинский Е.П., Марчук JI.M., Тафелынтейн Э.Е. и др. Определение токсичности холерных вибрионов с помощью ганглиозидов // Проблемы природной очаговости чумы: Тез. докл. IV Советско-монгол. конф. специалистов противочум. учр. Иркутск, 1980. - С. 7-8.

16. Громова О.В. Сравнительное изучение О-антигена холерного вибриона, детоксицированного различными методами // Пробл. особо опасн. инф. Саратов, 1994. - С. 113-120.

17. Громова О.В. Изучение О-антигена холерного вибриона и биохимические аспекты снижения его токсичности: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1995. - 23 е.

18. Давыдова Н.А., Куличенко А.Н., Федоров Н.А. и др. Тест-система для выявления возбудителя холеры методом полимеразной цепной реакции // Пробл. особо опасн. инф. Саратов, 1999. - Вып.79. - С. 72-76.

19. Дзантиев Б.В., Егоров A.M. Современное состояние и перспективы развития иммуноферментного анализа // Журнал Всесоюз. химич. об-ва им. Д.И.Менделеева. 1982. - Т.27, № 4. - С. 442-447.

20. Долматова JI.A., Голосеев Ю.А., Нарбутович Н.И. и др. Использование нейраминидазы для улучшения свойств эритроцитарного ганглиозидного диагностикума // Журн. микробиол., эпидемиол. и им-мунобиол. 1985. - № 9. - С. 35-37.

21. Долматова JI.A., Ефременко В.И. Конструирование холерного эритроцитарного энтеротоксического ганглиозидного диагностикума для выявления специфических иммуноглобулинов // Лабораторное дело. -1982. № 10. - С. 40-42.

22. Домарадский И.В. Некоторые проблемы адаптации патогенных бактерий к окружающей среде II Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1997. - № 4. - С. 31-35.

23. Дубинина И.Г. Использование метода полимеразной цепной реакции в клинико-диагностических лабораториях // Лаборатория. 1996. -№ 4. - С. 3-6.

24. Езепчук Ю.В. Биомолекулярные основы патогенности бактерий -М.: Наука, 1977. -215 с.

25. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул. -М. .Медицина, 1985. 240 с.

26. Ефременко В.И. Ганглиозиды клеточные рецепторы для бактериальных энтеротоксинов // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1985. - № 4. - С. 96-100.

27. Ефременко В.И. Новые методы исследования холерного вибриона // Актуальные вопросы микробиологии, лаборатоной диагностики и профилактики холеры: Тез.Всесоюзн. конф. Ростов н/Д, 1988. - С. 145151.

28. Ефременко В.И. Магносорбенты в микробиологических исследованиях. Ставрополь, 1996. - 131 с.

29. Ефременко В.И., Владимцева И.В. Применение ганглиозидного сорбента для получения субъединиц холерогена // Патолог, физиол. особо опасных инф. Саратов, 1981. - С. 49-53.

30. Ефременко В.И., Владимцева И.В., Дурихин К.В. и др. Способ извлечения холерного токсина из плотных сред при выращивании на нихвибрионов // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1980. - № 11.-С. 68-71.

31. Ефременко В.И., Масленникова В.Н. Способ получения гангли-озидов. А.с.(19) SU (11) 1113743 A// G 01 N 33/48.- N 3404144/28-13; За-явл. 05.02.82.; Опубл. 15.09.84, Бюл. 34.

32. Ефременко В.И., Пушкарь В.Г., Трофимов Е.Н., Перов В.Ю. Получение и применение магнитных сорбентов в методах иммуноанали-за микроорганизмов // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1989. -№12. -С.100-106.

33. Жарникова И.В. Разработка технологии композиционных магноиммуносорбентов и конструирование на их основе диагностических тест-систем для иммуноанализа возбудителя чумы и туляремии: Дис. канд. биол. наук. Ставрополь, 1995.- 157 с.

34. Жарникова И.В., Брыкалов А.В. Тюменцева И.С. Использование композиционных иммуносорбентов в иммуноферментном анализе (ИФА) для экспресс-диагностики возбудителей ООИ// Там же. 1994. - С. 41.

35. Жарникова И.В., Брыкалов А.В., Тюменцева И.С. Опыт конструирования композиционных магносорбентов для диагностических тест-систем // Там же. 1994.- С. 224-225.

36. Закревский В.И. Иммуносорбенты и их применение в иммунологии микроорганизмов // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1980. --№4. -С. 9-15.

37. Закревский В.И., Ефременко В.И., Фарбер С.М. и др. Приготовление и применение иммуносорбентов для изучения антигенного состава микроорганизмов I и II группы: Методические рекомендации. -Волгоград, 1982. 23 с.

38. Инструкция по организации и проведению противохолерных мероприятий. Москва, 1995. - 190 с.

39. Казакова Е.С., Абрамова Е.Г., Маккаева A.M. и др. Фаголиза-бельные свойства штаммов Vibrio cholerae, выделенных в отдельных районах Дагестана в 1994 г. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1995. - № 2 (Прилож.) - С. 78-80.

40. Климова И.-М., Пушкарь В.Г., Тихонов Н.Г. Иммунофермент-ный анализ токсина чумного микроба на магнитных микрогранулах// Генетика и биохимия вирулентности возбудителей ООИ. Волгоград, 1992.-С. 155.

41. Кудрякова Т.А. Лизогения холерных и парагемолитических вибрионов и ее практическое значение: Автореф. дис. . д-ра мед. наук. -Ростов н/Д, 1996. 42 с.

42. Кудрякова Т.А., Македонова Л.Д., Качкина Г.В. Применение диагностических препаратов холерных фагов при бактериологическом обследовании очагов холеры // Холера: Материалы Рос. науч.-практ. конф. по проблеме "Холера". Ростов н/Д, 1995. - С. 112-116.

43. Кутырев В.В., Куличенко А.Н., Булгакова Е.Г., Смирнова Н.И. Молекулярно-генетические аспекты ПЦР-диагностики особо опасных инфекций // Генная диагностика особо опасных инфекций: Материалы 1-й Всерос. науч.-практ. конф. Саратов, 2000. - С. 14-17.

44. Ломов Ю.-М., Мазрухо Б.Л., Воронежская Л.Г. и др. Эпидемически опасные холерные вибрионы нового серовара 0139 "Бенгал" // Сб. науч. тр. Новороссийск, 1994. - Вып. 1. - С. 92-97.

45. Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Подосинникова Л.С. Анализ эпидемической ситуации по холере в мире, СНГ и России. Прогноз // Холера: Материалы Рос. науч.-практ. конф. по пробл. "Холера". Ростов н/Д, 1995. - С. 3-10.

46. Ломов Ю.-М., Онищенко Г.Г., МосвитинаЭ.А., Подосинникова Л.С. Характеристика современного этапа в развитии 7 пандемии холеры //Журн. микробиол., эпидемиол. ииммунобиол. 1997. --№ 6. - С. 39-42.

47. Маурер Г. Диск-электрофорез. М: Мир, 1971. - 247 с.

48. Маянский A.M., Кравцова О .Я., Молчанова И.В. К методике приготовления иммуносорбента с фиксированными антителами на основе полиакриламидного геля// Лабораторное дело. 1976. -№ 3. - С. 165167.

49. Методические указания по детекции патогенной микрофлоры в клиническом маатериале, пищевых продуктах, объектах внешней среды и выполнение генетической идентификации клеток с помощью полимеразной цепной реакции. М., 1996. - 7 с.

50. Москвитина Э.А., Ломов Ю.М. Подосинникова Л.С. и др. Системный подход при анализе холеры: использование банка данных

51. ХОЛЕРА ЭП ИД "//Материалы VII съезда Всерос. о-ва эпидемиол., микробиол. и паразитол. -М., 1997. - Т.П. - С. 16-17.

52. Омарова Б.К., Асваров Б.-М., Адамов А.К. Сравнительная оценка разных методов определения вирулентности холерных вибрионов // Пробл. особо опасн. инф. Саратов, 2000. - Вып. 80. - С. 101-109.

53. Онищенко Г.Г., Глухов А.И., Грачев С.В. и др. Анализ ДНК штаммов Vibrio cholerae методом полимеразной цепной реакции // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1996. - № 4. - С. 38-41.

54. Онищенко Г.Г., Федоров Ю.М., Кутырев В.В. и др. Пути совершенствования генной диагностики особо опасных инфеций в Российской Федерации // Генная диагностика особо опасных инфекций: Материалы 1-й Всерос. науч.-практ. конф. Саратов, 2000. - С. 5-8.

55. Парамонов И.В., Вахгов Е.Ю., Воробьев А.А. Обнаружение и идентификация холерных вибрионов с использованием полимеразной цепной реакции // Пробл. особо опасн. инф. Саратов, 1999. - Вып. 79. -С. 89-95.

56. Подзолкова Г.Г., Климова И.-М., Ефременко В.И и др. Применение количественной иммунофлуоресценции для определения адсорбционной способности магнитных иммуносорбентов // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1988. - № 5. - С. 56-58.

57. Подосинникова Л.С. Холерные вибрионы, выделенные на территории СССР в период седьмой пандемии: Автореф. дис. . д-ра мед. наук. Саратов, 1993. - 44 с.

58. Попова А.Е. Методические рекомендации по определеннию отекогенного эффекта на белых мышах. М., 1979. - 11 с.

59. Попова А.Е., Дурихин К.В. Количественная оценка биологической активности фильтратов культуры холерного вибриона (холерогена) на белых мышах // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1974. - № 9. - С. 52-56.

60. Практическая химия белка/ Под ред. А.Дарбре. М.: Мир, 1989.-С.300-301.

61. Пушкарь В.Г., Ефременко В.И., Климова И.М. и др. Приготовление и применение магнитных сорбентов для изучения антигенов микроорганизмов // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1985. -№ 12. - С. 30-34.

62. Пушкарь В.Г., Климова И.-М., Ефременко В.И. и др. Приготовление и применение магнитных сорбентов для изучения антигенов микроорганизмов // Методические рекомендации. Волгоград, 1984. - 15 с.

63. Савельев В.Н. Холера эльтор (эпидемиологические и микробиологические аспекты): Автореф. дис. . д-ра мед. наук. Ставрополь, 1998.- 48 с.

64. Свеннерхольм Л. Ганглиозиды: выделение // Методы исследования углеводов. М., 1975. - С. 348-357.

65. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985. - 360 с.

66. Смирнов О.Н., Сурин A.M., Асташкин Е.И. и др. Исследования взаимодействия холерного токсина и его В-субъединицы с липосомами, содержащими ганглиозид Gml и флуоресцентномеченые ганглиозиды// Биол. мембраны. 1995. - Т. 12, № 2. - С. 174-184.

67. Смирнова Н.И., Давыдова Н.И., Ливанова Л.Ф. Картирование генетического детерминанта, определяющего повышенный синтез холерного токсина штаммом Vibrio cholerae Дакка 35 // Мол. генет., микробиол. и вирусол. 1994. - № 2. - С. 25-28.

68. Смирнова Н.И. Ерошенко Г.А., Щелканова Е.Ю. и др. Умеренный фаг Vibrio cholerae 0139: характеристика и роль в изменении экспрессии хромосоных генов вирулентности // Мол. генет., микробиол. и вирусол. 1999. - № 1. - С. 3-9.

69. Смирнова Н.И., Кириллина О.А., Бирюкова Н.Б., Кутырев В.В. Генетические маркеры эпидемически значимых штаммов холерного вибриона // Пробл. особо опасн. инф. Саратов, 1999. - Вып. 79. - С. 2535.

70. Соколова И.А., Лямкин Г.И., Брюханова А.Ф. и др. Сравнительное изучение методов подготовки проб материала, содержащего бруцеллы, к проведению ПЦР-анализа // Пробл. особо опас. инф. Саратов, 2000. -Вып. 80. - С. 148-151.

71. Соколова И.А., Лямкин Г.И., Касторная М.Н., Ляпустина Л.В. Способ индикации бруцелл, основанный на применении ПЦР // Генная диагностика особо опасных инфекций: Материалы 1-й Всерос. науч.-практ. конф. Саратов, 2000. - С. 40-41.

72. Санитарные правила 1.2.011-94: Безопасность работы с микроорганизмами I-П групп патогенности. М., 1994. - 152 с.

73. Стоев К.Г., Чибисова В.А., Шаханина И.А., Походзей И.В. Новый количественный иммунофлуоресцентый метод определения Ig Е с помощью специфического сефарозного иммуносорбента и люминесцентного микроскопа // Журн. иммунология. 1981. - № 1. - С. 85-88.

74. Тихонов Н.Г., Сто лбин С. В., Климова И.М. и др. Состояние и перспектива развития биосенсорных устройств // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций: Материалы Рос. науч. конф. Волгоград, 1992. - С. 170.

75. Трофимов Е.Н. Получение и характеристика ганглиозидсодержащих сорбентов для разработки методов определения холерного энтеротоксина: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Ростов н/Д, 1987. - 28 с.

76. Тюменцев С.Н., Андреевская Н.М., Казаренко Т.Д., Безносов М.В. Способ получения растворимого холерного О-антигена для иммунизации продуцентов холерных агглютинирующих сывороток. А.С. 1085040, СССР. - А 61К23/33. - Опубл. 8.12.83 г.

77. Тюменцев С.Н., Молева В.А., Андреевская Н.М. и др. Афферентная блокада иммунного ответа у кроликов при иммунизации липо-полисахаридом холерного О-антигена. Сообщ.1 // Тез. докл. науч.-практ. конф по проблеме "Холера". Ростов н/Д, 1984. - С. 120-123.

78. Тюменцева И.С. Научно-методические основы конструирования и усовершенствования производства диагностических тест-систем для выявления возбудителей особо опасных и других инфекций: Дисс. . д-ра мед. наук. Ставрополь, 1996. - 327 с.

79. Урбах В.Ю. Статистические методы в биологических и медицинских исследованиях. М.: Медицина, 1975. - 296 с.

80. Хайтович А.Б., Подосинникова Л.С., Ильчев Ю.А. и др. Оценка вирулентности свойств Vibrio cholerae 01 с помощью методов in vitro // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1997. - № 3. - С. 7-10.

81. Четина Е.В., Гинцбург А.Л., Грижебовский Г.М. и др. Исследование эпидемической значимости некультивируемых форм холерных вибрионов методом полимеразной цепной реакции// Журн. микробиол., эпидемиол и иммунобиол. 1992. - № 3. - С. 21-24.

82. Чеховская Г.В. Генетический анализ хромосомной области Vibrio cholerae 0139, содержащей гены О-антигена: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1997. - 20 с.

83. Шаханина К. Л., Голь дин Р. Б., Прусакова З.М., Манько Н.М. Избирательное концентрирование бактерий и риккетсий при помощи поликонденсационных иммуносорбентов// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1969. - № 9. - С. 140-144.

84. Шахламов В.А. Новые данные о механизмах действия холерного токсина // Архив.патол. 1980. - Т.42, № 5. - С. 75-83.

85. Яковлев А.Т., Зыкин Л.Ф., Рыбкин B.C. Иммуноферментный анализ в микробиологии. Саратов, 1990. - 112 с.

86. Albert M.J., Rahman М., Ansaruzzaman М. et al. Phenotypic and genotypic changes in Vibrio cholerae 0139 Bengal // J.Chn.Microbiol. 1997. -V.35, № 10. - P.2588 - 2592.

87. Albert M.J., Siddique A.K., Islam M.S. et al. Large outbreak of clinical cholerae due to Vibrio Cholerae non-01 in Bangladesh // Lancet. 1993. - V.341, № 8846. - P.704.

88. Benkirane R.M., Guillot E., Mouton C. Immunomagnetic PCR and DNA probe for detection and identification of Porphyromonas gingivalis // J.Clin. Microbiol. 1995,- V.33, № 11. - P.2908-2912.

89. Bhattacharua M.K., . Bhattacharua S.K., Garg S. et al. Outbreak of Vibrio cholerae non 01 in India and Bangladesh // Lancet. 1993. - V.341, № 8856. - P.1346-1347.

90. Bik E.M., Bunchten A.E., Gouw R.D., Mooi F.R. Genesis of the novel epidemic Vibrio cholerae 0139 strain: evidence for horizontal transfer of genesis involved in polysaccharide sythesis// EMBO Journal. 1995. - V.14., № 2. - P.209-216.

91. Blake P.A., Allegra D.T., Snyder J.D. et al. Cholera a possible endemic focus in the Unated States // New Engl.J.Med. - 1980. - V.302, № 6. - P. 305-309.

92. Borroto R.J. Ecology of Vibrio cholerae serogroup 01 in aquatic enviroments// Rev.Panam.Salud.Publ. 1997. - V.l, № 1. - P.3-8.

93. Brossmer R., Burk J., Eschenfelder V. et al. Recent aspects of the chemistry of N-acetyl-D-neuraminic acid.// Behring Inst.Mitt. 1974. - V.55. -P.119-123.

94. Chandad F., Guillot E., Mouton C. Detection of Bacteroides forsythus by immunomagnetic capture and a polymerase chain reaction DNA probe assay // Oral.Microbiol.Immunol. - 1997. - V.12,№5. - P.311-317.

95. Clark M.F., Adams A.N. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant virus // J.Gen. Virol. -1977. V.36, № 3. - P.475-483.

96. Colwell R.R. Global climate and infections disease: The cholera paradigm // Science. 1996. - V.274, № 5295. - P.2025-2031.

97. Colwell R.R., Epstein P.R., Gubber D. et al. Climate change and human health // Science. 1998. - V.279, № 5353. - P.968.

98. Comstock L.E., Maneval D., Panigrahi P. et al. The capsule and О antigen in Vibrio cholerae 0139 bengal are associated with a genetic reaction not present in Vibrio cholerae 01 // Infect.Immun. 1995. - V.63,№ l. - p. 317-323.

99. Craig J.P. The effect of cholera stool and culture filtrates on the skin of guinea pigs and rabbits. In: Proc. Cholera Res. Symp. - Honolulu, Hawaii, 1965. Washington. D.C. 1965. - P. 153-158.

100. Cuartrecasas P. Ganglioside and membrane receptors for cholera toxin // Biochemistry. 1973. - V.12,№ 18. - P. 3558-3566.

101. Cuartrecasas P., Parikh J. Affinity chromatography of Vibrio cholerae enterotoxin-ganglioside polysaccharide and the biological effects of ganglioside-containing soluble polymers: Patent 4125492 (USA) Publ. 14.09.78.

102. Dafhi Z., Robbins J.B. Purification of heat-labile enterotoxin from four Escherichia coli 078:H11 by affinity chromatography with antiserum to Vibrio cholerae toxin // J.Infect.Diseases. 1976. - V.133. - P.138-141.

103. Dalsgaard A., Skov M.N., Serichantalergs O. et al. Molecular evolution of Vibrio cholerae 01 strains isolated in Lima, peru from 1991 to 1995//J.Clin.Microbiol.- 1997. V.35, № 5. - P. 1151-1156.

104. Dodin A., Goud B. Diagnostic da vibrion Cholerique au laboratoire // Bull.Soc.Pathol.Exot. 1983. - V.76. - P. 644-651.

105. Donta S.T. Interactions of choleragenoid and Gml ganglioside with enterotoxins of Vibrio cholerae and Escherichia coli in cultured adrenal cells // J.Infect. Diseases. 1976. - V.133. - P.115-119.

106. Donta S.T., Vines J.P. Inhibition of the steroidogenic effects of cholera and heat-labile Escherichia coli enterotoxins for a similar receptor site for the two toxins // Infect. Immun. 1975. - V.ll,№ 5. - P. 982-985.

107. Duffy L.K., Lai Chu-Yen. Involvement of arginine residues in the binding site of cholera toxin subunit В // Biochem.Diophys. Res. Commun. 1979. -V.91, № 3. - P. 1005-1010.

108. Dutta N.K., Habbu M.K. Experimental cholera in infant rabbits: a method for chemotherapentic investigation // Britt. J.Pharmacol.Chemother. 1995. - V.10, № 2. - P. 153-159.

109. Eidels L., Proia R.L., Hart D A. Membrane receptors for bacterial toxins // MicrobioLRev. 1983. - V.47, № 4. - P.596-620.

110. Faruque S.M., Alim A.R.M.A., Roy S.K. et al. Molecular analysis of rRNA and cholera toxin genes carried by the new ehidemic strain of toxigenic Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal // J.Clin. Microdiol. 1994. - V.32, № 4. -P. 1050-1053.

111. Finkelstein R.A. Properties of cholera exoenterotoxin (choleragen) and its natural toxoid (choleragenoid) // Toxicon. 1972. - V.10,№ 5. - P. 441-450.

112. Ficher-Hoch S.P., Khan A., Inam-al-Hay et al. Vibrio cholerae 0139 in Karachi, Pakistan // Lancet. 1993. - V.342, № 8884. - P. 1422-1433.

113. Fishman P.H., Atikkan E.E. Mechanism of action of cholera toxin: effect of receptor density and multivalent binding on activation of adenylate cyclase // J.Membr.Biol. 1980. - V.54, № 1. - P. 51-60.

114. Fishman P.H., MossJ., Richards R.L. et al. Lihosomes as model membranes for ligand-receptor intor-actions: studies with choleragen and glycolipids // J.Biochemistry. 1979. - V.18, № 12. - P. 2562-2567.

115. Guesdon J.L., Avrames S. Magnetic solid phase enzyme-immunoassay // Immunochemistry. 1977. - V.14. -P.207-232.

116. Haywood A.M. Characteristics of Senval virus receptors a model membrane// J.Mol.Biol. 1974. - V.83, № 4. - P. 427-436.

117. Hedrum A., Lundberg J., Pahlson C., Uhlen M. Immunomagnetic recovery of Chlamidia Erachomatic from urine with subsequent colometric DNA detection // PCR Methods Appl. 1992. - V.2„ №2. - P. 167-171.

118. Hollenberg M.D., Fishman P.H., Benett V. Cholera toxin and cell growth: roll of membrane gangliosides // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1974. - V.71, № 10. - P. 4224-4228.

119. Holmgren J. Comparison of the tissue receptors for Vibrio cholerae and Escherichia coli enterotoxins by gangliosides and natural cholera toxin // Infect. Immun. 1973. - V.8, № 3. - P. 851-859.

120. Holmgren J. Experimental studies on cholera immunization the protective immunogenicity in rabbits of monomeric ahd polymeric crude exotoxin // J. Med. Microbiol. 1973. - V. 6, № 3. - P. 363-370.

121. Holmgren J., Lonnroth J., Svennerholm L. Tissue receptor for cholera exotoxin: postulated structure from studies with Gmi ganglioside and related glicolipids // Infect. Immun. 1973. - V. 8, № 2. - P. 208-214.

122. Holmgren J., Mansson J. E., Svennerholm L. Tissue receptor for cholera exotoxin: structural requirements of Gmi ganglioside in tixin binding and inuctivation // Med. Biol. 1974. - V. 52, № 4. - P. 229-233.

123. Houslay M.D., Elliott K.R.F. Cholera toxin mediated activation of adenylate cyclase in intact rat hepatocytes // FEBS Lett. 1979. - V. 104, № 2 -P. 359-363.

124. Islam D., Lindberg A.A. Detection of Shigella dysenteriae type 1 and Shigella flexneri in feces by immunomagnetic isolation and polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol. 1992. - V. 30, № 11. - P. 2801-2806.

125. Jonson G., Svennerholm A.-M., Holmgren J. Expression of virulence factors by classical and El-Tor Vibrio cholerae in vivo and in vitro // FEMS Microbiology Ecology. 1990. - V. 74, № 2-3. - P. 221-228.

126. Johnson J.M., McFarland L.M., Braudlord H.B., Caraway C. Isolation of nontoxigenic Vibrio cholerae 01 from a human wound infection // J. Clin. Microbiol. 1983. - V. 17, № 5. - P. 918-920.

127. Johson J.A., Salles C.A., Pfnigtahi P. et al. Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal is closely related to Vibrio cholerae El Tor but has important differences // Infect. Immunol. 1994. - V. 62, № 5. - P. 2108-2110.

128. Kaper J. В., Bradford H.B., Roberts H.C. et al. Molecular epidemiology of Vibrio cholerae in the United States Gulf Coast // J. Clin. Microbiol. 1982. - V. 16, № 1. - P. 129-134.

129. Kaper J.B., Moorris J.G., Levine M.M. Cholera // Clin. Microbiol. Rev. 1995. - V. 8, № 1. - P. 48-86.

130. Karaolis D.K., Lan R., Reeves P.R. The sixth and seventh cholera pandemics are due to independent chones separately derived from environmental, non-toxigenic, non-Ol Vibrio cholerae // J. Dfcteriol. 1995.-V. 177, №11.-P. 3191-3198.

131. Kurowsky A., Markel D.E., Touchstone B. Chemical characterization of the structure of cholera toxin and its natural toxoid // J. Infect. Diseases.- 1976- V. 133.- P. 14-32.

132. Lai Chi-Yen. The chemistry and biology of cholera toxin // CRC Crit. Rev. Biochem.- 1980.- V. 9, № 3 P. 171-206.

133. Lea Т., Vartdal F., Davies C., Ugelstad J. Magnetic monosized polimer pasticles for fast and specific fractionation of humtn mononuclear celles // Scand. J. Immunol. 1985. - V. 22, № 2. - P. 207-216.

134. Ledeen R.W. Gangliosides // Handb. Heurochem. 1983. - V. 3. - P.41.90.

135. Mekalanos J.J. Duplication and amplification of toxin genes in Vibrio cholerae // Cell. 1983. - V. 35, № 1. - P. 253-263.

136. Mekalanos J.J., Collier R.J., Romig W.R. Purification of cholera toxin and its subunits: ntw methods of preparation and the use of hypertoxinogenic mutants // Infect. Immun. 1978. - V.20, № 2. - P. 552-558.

137. Mekalanos J.J., Collier R.J., Romiy W.R. Affinity filters, a new approach to the isolation of tox mutants of Vibrio cholerae // Proc. Nat. Acad. Sci: USA. 1978. - V. 75, № 2. - P. 941-945.

138. Mekalanos J.J., Moseley S.L., Murphy J.R., Falkow S. Isolation of enterotoxin structural gene deletion mutations in Vibrio cholerae induced by two mutagenic vibriophages // Proc. Nat. Acad. Sci: USA. 1982. - V. 79, № 1. - P. 151-155.

139. Mekalanos J.J., Rubin E.U., Waldor M.K. Cholera: Molecular basis for emegence and pathogenesis // FEMS Immunol. Med. Microbiol. -1997.-V. 18. P. 241-248.

140. Mekalanos J.J., Swartz D.J., Person G.D. et al. Cholera toxin genes: nucleotide sequence, deletion analysis and vaccine development // Nature. 1983. - V. 306. - P. 551-557.

141. Molday R.S., Mackenzie D. Application of magnetic microsphe- res in labelind and separation of cell // J. Immunol. Meth. 1982 . - V. 52. - P. 437438.

142. Moling N.C., Peterson J.W. Cholera toxin like toxin released by Salmonella species in the presence of mytomycin С // Infect. Immun. - 1980. -V. 30, № 1. - P. 224-230.

143. Morris N.P., Consiglio E., Kohn L.D. et al. Interactions of fragments D and С of tetanus toxin with neutral and thyroid membranes and with gangliosides // J. Biol. Chem. 1980 - V. 225, № 13. - P. 6071-6078.

144. Moss J., Fishman P.H., Richards R.L. et al. Choleragen- mediated release of trapped glucose from liposomes containing ganglioside Gmi // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1976. - V.73, № 6 - P. 3480-3483.

145. Moss J., Garrison S., Fishman P.H., Richardson S.H. Gangliosides sensitize unresponsive fibroblasts to Escherichia coli heat-labile enterotoxin // J. Clin. Invest.- 1979,- V. 64. № 2.- P. 381-384.

146. Moss J., Richards R.L., Alving C.R., Fishman P.H. Effect of the A and В protomers of choleragen on release of trapped glucjse from liposomes containing or lacking ganglioside Gmi // J. Biol. Chem. 1977. - Y. 252, № 2. -P. 797-798.

147. Moss J., Stanley S.J., Lin M.C. NAD glycohydrolase and ADP-rubosyltransferase activities are intrinsic to the Al peptide of choleragen // J. Biol. Chem. 1979. - V. 254, № 23. - P. 1993-1996.

148. Mukhopadhyay A.K., Basu A., Yarg P. et al. Molecular epidemiology of reemerging Vibrio cholerae 0139 Bengal in India // J. Clin. Microbiol. 1998. - V. 36, № 7. - P. 2149-2152.

149. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labelled antibody a new method of conjugation // J. Histochem. Cytocchem. 1974. - V. 22, № 4. - P. 1084-1092.

150. Olsvik O., Popovic Т., Skjerve E. et al. Magnetic separation teshniques in diagnostic microbiology // Clin. Microbiol. Rev. 1994. - V. 7, № 1. - P. 43-54.

151. Ouchterlony O. Antrigen-antibody reactions in gel // Arkiv for Kemi. Mineral. О Ced. 1949. - V. 261, № 14. - P. 1-9.

152. Poison A., Potgieter G.M., Langier J.E. The fractionation of protein mixtures by linear Polymers of higth molecular Wrigh // Biochem. Biophys. Acta. 1964. - V. 82. - P. 463-475.

153. Ramamurthy Т., Garg S., Sharma R. et al. Emergence of novel strain of Vibrio cholerae with epidemic potential in southern and lastern India //Lancet. 1993. - V. 341., № 8846. - R 703-704.

154. Ricci L.C., De-Siqueira P.S., Castro A.F.P. Gangliosides inhibit serological reactions for the detection of cholera and heat-labite enterotoxins of E. coli // Braz. J. Med. an Biol. Rec. 1992. - V. 25, № 8 - P. 805-807.

155. Richards R.L., Moss J., Alving C.R. et al. Choleragen (cholera toxin): a bacterial lectin // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1979. - V. 76, № 4 - P. 1673-1676.

156. Sack D., Huda S., Neogi P.R.B. et al. Microtiter ganglioside enzyme-linked immunosorbent assay for Vibrio and Escherichia coli heat-labile enterotoxins and antitoxin // J. Clin. Microbiol. 1980. - V. 11, № 1. - P. 35-40.

157. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F. et al. Enzymatic amplification of p-golobin genomic sequences and restriction site analysisfor diagnosis of sickle cell anemia // Science. 1985. - V. 230. - P. 1350-1354.

158. Sarkar B.L., De S:P., Sircar B.K. et al. Polymyxin В sensitive strains of Vibrio cholerae non Ol from recept epidemic in India // Lancet. -1993. V. 341, № 8852. - P. 1090.

159. Sharma C., Thungapathra M., Ghosh A. et al. Molecular analysis of non Ol, non-0139 Vibrio cholerae associated with an unusual upsurge in the incidence of cholera like disease in Calcutta, India // J. Clin. Microbiol. -1998. V. 36, № 3. - P. 756-763.

160. Shimada Т., Balakrich G., Deb B. et al. Outbreak of Vibrio cholerae non-Ol in India and Bangladesh // Lancet. 1993. - V. 341. - P. 13461347.

161. Shirai H., Nishibuchi M., Ramamurthy T. et al. Polymerase chain reaction for detection of the cholera enterotoxin operon of Vibrio cholerae // J. Clin. Microbiol. 1991. - V. 29, № 11. - P. 2517-2521.

162. Simpson L.L., Rapport M.M. The binding of botulinum toxin to membrane lipids: phospholipids and proteolipid // J. Neurochem. 1971. - V. 18, №9.-P. 1761-1767.

163. Smith K.O., Gehl W.D. Magnetic transfer devices for use in solid-phase radioimmunoassays and enzymelinked immunosorbent assays // J. Infect. Diss. 1977. - V. 136. - P. 5329-5336.

164. Stroeher U.H., Dredge B.K., Manning P.A. Novel Vibrio cholerae 0139 genes involved in lipopolysaccharide biosynthesis // J. Bacteriol. 1997. -V. 179, № 8. - P. 2740-2747.

165. Svennerholm A.-M., Holmgren J. Identification of Escherichia coli heat-labile enterotoxin by means of a ganglioside immunosorbent assay (Cmi-ELISA) procedure // Curr. Microbiol. 1998. - V.l, № 1. - P. 19-23.

166. Swerdlow D.L., Mintz E.D., Rodriguez M. et al. Waterborne transmission of epidemic cholera in Trujillo, Peru: lessons for a continent at risk // Lancet. 1992. - V. 340, № 8810. - P. 28-32.

167. Taylor R.K. Genetic studies of enterotoxin and other potential virulence factors of Vibrio cholerae // Genetic of latteriael difersity. Ch.15.-Acad. Press. 1989. - P. 309-329.

168. Tayot J.L., Holmgren J., Svennerholm A.-M. et al. Receptor-specific large-scale purificaton of cholera toxin on silica beads derivitized with lyso Gmi ganglioside // Eur. J. Biochem. 1981. - V. 113, № 2. - P. 249-258.

169. Tosteson M.T., Tosteson D.C., Rubnitz J. Cholera toxin interactions with lipid bilayers // Acta physiol. scand. 1980. - V. 109, № 481. -P. 21-25.130

170. Waldor M.K., Colwell R., Mekalanos J.J. The Vibrio cholerae 0139 serogroup antigen includes an О-antigen capluse and lipopolisaccharide virulence denerminants//J. Microbiol. 1994. - V. 91. - P. 11388-11392.

171. Waldor M.K., Mekalanos J.J. Emergence of a new cholera pandemic: molecular analysis of virulence determinants in Vibrio cholerae 0139 and development of a live prototype // J. Infect. Dis. 1994. - V. 170, № 2. - P. 278-283.

172. Waldor M.K., Mekalanos J.J. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin // Science. 1996. - V. 272, № 5270. -P. 1910-1914.

173. Warburg O., Christian W. Isolierung und Kristallisat on des Garugsterments Enolase // Biochem. Z. -1941. V. 310. - P. 384-421.

174. West P.A. The human pathogenic vibrios. A. public health update with environmental perspectives // Epidemiol. Infect. - 1989. - V. 103. - P. 1-34.

175. Yuen Kwok-yung, Yam Wing-cheong, Wong S. Sai-yin et al. Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal in Hong Kong // Clin. Infect. Dis. -1994.-V. 19, №3. -P. 312-321.