Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Методы дифференциации эпидемических и неэпидемических вибрионов эльтор, основанные на специфичности их систем рестрикции модификации, выявляемой с помощью фага

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Методы дифференциации эпидемических и неэпидемических вибрионов эльтор, основанные на специфичности их систем рестрикции модификации, выявляемой с помощью фага"

йшистегство здрдвоохранеши ссср

Боэоэвашй «йдена Трудоээгэ Красного &шзш неучнв-иооладозатолБскЕй. противочумЕЕй eectetjï

На правах откошоа

ГРАЧЕВА йршга Васжызвна

Уда 616.932:576«858®9

мшды дешшцилции эшдЕштазш и неэшдеюесш; вибрионов эльтор, ошошннш

на спевдфичносш и1 систем йстишщи г "

•шдаадшщ* вшвяящй с швдью ш '

03.00ÍQ7 - шиЕребиадвгия

Автореферат

диссертации на соискание утааой сгапэии кандидата бяодогича ош яаух

Саратов - 1991

; Работа выполнена во Всесоюзном ордена Трудового Кргсного £ншвт научно-нссладоватвдьскоы противочумном института "Микроб" .; .

Научннй руководитель - доктор медицинских наук, профессор Н.М.ОСТРОЗМОВА

. . Официаяьнце оппонент: доктор медицинских наук, профеооор Ы.К.ЩЕГЛОВА, доктор биологических. наук, старший наутшй сотру,тщик Н.И.СШШОВАг . . , ,

Дадущая организация- ваучно-иооявдовгтедьский дроти-вочуыный институт Кавказа а Закавказья

Автореферат разослан п3{ " 1991 г. .

Защита диссертации состоится 1991 V,

в 1300 часор на заседания специализированного Совета Д 074.32,01 по гадите диссертаций на ооиоканив учёной отепйии доктора наук при Всесоюзн- ч ордена Трудового Красного ашмени

научно-исследовательской противочумной институте "Микроб*

(410071, г.Саратов, Университетская, 46).

С диссартавдей можно ознакомиться ь научной библиотека института.

Учений секретарь специализированного совета, . .

доктор биологических-наук " Корнеев Г.А.

■ ОРДАЯ ХШК^ШСТЙКА РАБОТЫ

Актуеяьаооть проблема. Вопрос о сущаст- 4 вовапин двух фор?г холерного вибриона ахьтор - тшдгшой» патогенной, вызнвавцзй эивдв1?'Т1 хшгзра, ш ажетноа, яопатогенной, нс-впвдзничасяой, првдшхюдап-вльно свсбсдагоаквудай, широко обсуждается на прототаши воаго периода садьаоЗ пашсзкаа хояарн» Ип-тврео к данкону вопросу в каетояцаа врашх поддзркиваатся необходимостью знания противсзпякзшгчасага: аадач а сзязи о широкой коптешиапай обметов внзеезй с рада сяабошруланпдаи я asispj-лентнши вибрионами эльтор, набдюдазвда газ в очагах толари э костэпэдваический период, -таг и на тарргторшк, свободах от згой инфекции ( Кареr et al., 1981; bevin ot ai., I982S Жукова, 1985; КршшаЕа с соавт., 1988; Раэткх о оозвт.„ IS90). Например, в IS87 году вибрионы aasop баяз гндалзнз в 23 различных рагионах СССР прн отсутствии таи эпадзыачэскзг оояекнанпй по холарэ О'онагова о соавт., 1988).

Методом гйбридазацяя показано отоутствка в хроиооона большинства вибрионов эльтор, изолированных яз внаашгай срэда при отсутствия заболеваний хода poii, структурных ганаз vct, дата рай-нируюдас синтез холерного энтаротокоааа Kaper et al.» 1981; Монахова о соавт., 1988? Ливанова с иоавт., 1989), У вибрионов эльтор, выделанных в очагах холарн от большое к из внешней срады, обнаружено от одной до нескольких копий опарена тожакгаи-ности в хромосома ( Mekalaooa, 1983; Гинцбург с соавт.,1987).

Бопроо о том, являются дш отог.едгашшз ( vet" ) вибриона эльгор мутантами токсягзшщх штегдюз ш tox» -гену, формой сохранения возбудителя холера в ивв8авдошр»<чай период ила самостоятельными биологическими вариантами холарных вибрионов 01 саровара остается открнпш. Мнзнеэ исследователей относиталь-по значения vot" вибрионов эльтор а развитии эпздаиичзсксго процесса при холера более однозначно. Большинство из них считают, что вибриона эльтор, лияаннда гадатнчаских даварыинан« токсиганности, на способны реверсировать в токсигенныа формы и, следовательно; ьнзывать эпидемии п вошки холера, поскольку именно способность х синтезу юшооичасяого холерного энтар о токсина придает штаммам холерного вибриона эпидемическую опасность ( Kaper et ai., 1982; Мараыович о соавт., 1986; Гршибов-ский о соавт., 1987; Сергеев, Марамович, 1988).

В этой сиязк дифференциация готашдадьно опасных s пана возникновения эладаи71 и вспшак ходарн vet* {еоддвштаеских} и эпидемически на опааша vet" Хнеохв:.виачвexsx) ходаршх внбрпо-1.0в элыор яелнзтся важвайвай кадачзй лабораторной диагностики.

В настояна е время определенна эдвдаиичаской аналзшостЕ хедазр-ннх вибрионов эдьтоэ проводится на основании изучайая их -друл»es-ности и токсиганности. ЕУаста о тау хорошо нзваотЕо, tío вдаоко-вирулантныа рдидваичасхош иташа аибрионов шатер ври дхнтвльвом . пребывании в объектах внзшаа срада и ююущш оргшшзаа owozm вирулентность а и.-laivasiKocr Пра шиахта о шдштентакм орга-шшом воауокна рзвароня'ЕХ исходах признаков,, Одаахо с шкода .методов опрадзланая ейрудантноотн и згокишзеносте, соноваашх на фонотшшчаскоы прояадашш этих признаков,, мала да&зди будуг оца-ниваться как шшбовирулантнкэ к авидедвдгнца,, подобна нззшдаш-чгсша vot" вибрионеа аш-ор ¿Брвяанеа о соадт«« 1987j Гекц-бург о соазт.,8 IS87; Ыоаахова с соавт.^ 1988; Брюханов, I99X).

Безусловно напгтаа ганов токовуенноста шздзхальстзув'Е только о потенциальной иадпшаеаоЗ опаечоств нгагаа s es огнггеазт8 ■rao дашвй штшм способен Евзваз»' сявод®г.Ч9спиа. Ен|айодошшЗ процесс» Дяй »того необходимо накачка цадого Еошшвса натог-знннх свойств ©masa} которао спрэдоляэг его Евджашшокгь Ддаы&в« Наушшаа, 1984; Сомова с соавт«.„ IS85; Смиряова» 198?}. Однако^ независимо от шшрэссаа 'гаьов '.тожоигвпаоевд а ганов, дзтарща-чищвдюс синтез других фаетороэ.штогенносхя. vct+ .шбр<ЮЕа эльтор является «щдрчвчвокшв по проЕслвдзшв. Паавданвз sasae ппаымив в обьакгах внашнай срада заащштаз! внешний.

Особую вагнооть в егои шш njso6psiasr_ катода, дасвсшизпа ваявягггь ганахичзсага дзтарцжшнтндатогаикоотн, яащлгмр, из ход ггязого Еондяровазия голаршх вдбрсоноа на налет&э опарона .vet. Однако даннай кагод но доступзв дгя.бодшгаствл пракгачасгах ©збо-разгорий, осувдстаюшцих ¡таканга оболадогакая еод&гмоа на ходзру, И!>-Еа сложности и трудоашюота. . '

В s той езяза разработка новах вшжоспацйфячш« и срост их в исполпощш'цатодоз да^фаравдиада двух груш хаваршх вибрионов ажьтор, тазвдах- разшй эхвделшчаашй лохавдзал, яшшатся актуальной задачей. •

ШрспактЕвши вайравдганиаы исследований дет её рзшания представляется совартанстаованка фаговых йвтодов. Об этом ови-датажьствуат опыт применения фагов двя Едантифшсацаи возбуди-

-

им холарн, онрауп^ешм аг бновара, саровара, вирулентности энтаропагоганноск: при лабораторной даагаостшсв холернш: йрионов 01 в нз 01 сзроваров (Адамов о coebt.» 1971; Остроу-?а о соявт.„ 1336, I9S5a; Лзбэдев, 1988).

Изучашш .¡ызогоша а осойота уиаранинх fsros различных юлогичзокнх групп вида V.ohoieree открыло ещё один аспэк? »варшанотзованаа иэтодов их внутривидовой даф£зрзнцаацгя гтйы профаготшшрования, т.е. деффзрашдода по свойствам с умеренных фагов.

Иссладовангчш Н.Ы.Остроумовой о ооавт. <1985, 1986а) »ановлана коррелятивная связь шдяу шмуноташои переносимого шранного фага и биоваром холзргшх вибрионов 01 груши» а ®аа-i сзротипом фага .ж сароварсу жоазрша шбрлсков нз 01 грушш.

Зга дашй» дала код оенозакш предполагать, что тип аата, дятзркшшруамцй укорзшши фзгси в ллзогзнной кдзтаа f 12П™ явиться Критарааы диффарзкциацаи вдцдемзтаских и наэш-¡шгсаских холарннх вибрионов злиор. Незш парзна' исоладова-и, выполненные совмаотно о Н.Ы.Остроумовой» В.щмороэ а дру-пт сотрудниками, нодаардои это прадполоданаэ. У наэдида-ггаских вибраонов эльтор обнаружена унэранныа фага У1 гетаро-шунной категории, а то .враая как »юдаодчаскиз шгаши того з биова'ра, ke зависаю от из ста ввдздвния, являются носиталя-i однотипных умеренных фатоз, назван-чах к.Такэуа et а1.(19бЗ). шла фагаии» во сшцафэтносга гшунитзта относящихся к Ш гз-зрстшунной категории (Остроумова с ооавт.., 1986).

Однако в дальнейшем срзда неэпздамичаск^х холарных вибрио-зв эльтор нами обнаружены штамма - носата ли фагов Ш иыыуноти-з, гомодамушшх фагш эпидваачаских штеамов того на биовара.

В этой оаязи возникла задача разработки методов дайарен- ' мдш! эпидемических и цааявдяьичзскщ: холерных вибрионов эль- . эр, насущкх гомоиццунннэ умвранваа фага' Ы шыунотша. Парспак-азнвм дня дифференциации тоиспвщтш. фагов к, соответственно, t вибрионов- носителей представлялось приыананаа высокосцаштатного метода рестрикцаошюго анализа in vivo.

Цель исследования. Издание особанкоода рестрикции и кодификации (Ш) у каранных фагов Ш Еииунотила, выделанных из эпидемических и ваепгчзыичэокгх хоязрных ВЕбрш-нов эльтор, клзткаыи гокс- и гатаролоютных шташов хозяага / и разработка на этой основа катодов дифференцшда даззс груВД хрларных вибрионов sjaiop разной швдеынчзской шшчшгоо?'!.

Ооновнна «задачи:

1. Разработать ОЕОтему Еадикаторшгх шуаадаов для внжаязвдя спонтанных уыарзшнх фагов назпидащгсздак холарных : абрьэнов эльтор. ....

2. вздвлеть уиоргшшэ фата ш ншуео-пша тешшдэщгаскаг вибрионов аш?ор в изують их беологачаскЕа свойства.

3. Изучить сшхщ&гшооть озстаы И! опадамиаскшс к няэпй» дакЕчосгак хояарцах щбрцоаота 'эльтор» внявлЕзаув с Еэиодьа . гов Ш гэтвроиьщунзоЗ катагориг,

4. Ргзрабогеть' на »то2 ошка' шхода ; гЗ^вреяцаацаа нщзд-ыгчаских а коэшздиачскшх ходе раит. ивбразков злыор.

К п у ч н а я soíubs. Раэрсбатшк систола щдгн. sasojHux .итаадов яда штшпгх укэрадцих $агоз не- •

шидеиичвшдах ховзрнш: Е^бриокоь aestop.

Показано,, что Езгийдаи-чзсглз »шрш'э вгбраоры эльтор, кгк а шадмшяаш» шасш того m tícoaapa, когут tíaw» носагеяша ударзшшх фагоз Ц ос ропща Ш иаауБогщш.

Получена дгшнш>» сэздвтальотвующар о различил* а дарвичкой структура SBC уыерашшх faros Щ иаишмша» вндолвнрчх из ciarnos холэрких вибрионов еяътор рзрличшй впздзюлаской заачн-кости»

Вяарвыа уотаношшно, что сЕВДвклчзсква к Ейзшцшккчаскк хояарнна вибрионы гас^т дза рааючш» система В,!, шашка групповую ошщЩрхчвооть,. Одаа ез них характерна дая вшкааичиг сши, вторая - для наэшдацичашзх вибрионов эльтор.

Разработаны два метода диффзрашдаад ишдаиичасзди vott) ü наэдздашгчесгшх ( vob" ) влбриокоз эльтор. Один из нех основан на приыанаюш вирулентного цутанта фага 123, обладающего, различной чувствительностью к системам Ш гнидашчаских и на-

- ? -

»вдеамических ходчршпс siícípt~ohob эльтор. Во втором - использует-зя различная чувствительность умарэшгах фагов Ш шшунотипа эпи-|амжчзсявх а незаидагстдсаих вибрионов эльтор к системам Ш го-го- и готаролоотзис: тост-культур,; Помздний ызтод признан ь шчзстш Изобр-танЕЯ '.А„С, .'5 1558987). lía mzmi Vibrio choleras eltor 123 - продувает умарзыюго <£ara 123 получано шторское свидетельство j& 1373729.

Практичвсяая ценность. Разработая-хнз шзтодн могут бить использованы в научной и прахтичасаой работа при оценка апидамичасхой значимости штемыов холерных зибраонов эльтор; Состашгани изтодические рзкомендацаи го их тршанаш®, которые обсуяданы а одобранн Учзат Советом ШИШИ »Микроб" (протокол Л 10 от 04„С5.90 г.), утпарздвнм дзраятороы шотитута "Микроб" I4.05.D0 г.

Апробация работ н. Основпш материала диезе ртации обсуддадиоь на научных контракциях я заседаниях Учёного Совета института "ftatpotí" и 1987-1990 гг; Бса союзной Заучной конференции "Актуальные вопроса микробиология, лабоparo рной диагностики и профила-.тики холарн", Ростов-на-Дону„ [988; конфаречции ыолодаг учета "Эпидемиология, микробиология i иммунология бактеркалышх и валетах инфекций", Ростоа-на-¡Йну, 1969..

. Публивацаи. Основное содержание работа отражено з девяти опубликованных статьях

Структура диссертация. Диссертация Изложена на f¥é~ страницах машинописного тавота и состоит из зЕэдания, обзора литература, методической часта, результатов йсслодозашй, заключения я ьнводов. Еаблиографачэсгшй указатель включает 245 источников, из них 166 отечественных и 83 иностранных авторов. Работа итаютрярована 14 таблицами и 5 рисунками.

На защиту выносятся следующие а о л о к а н и я: .

I. Гомоишунные уме ранние фаги Ш ишунотипа зпвдемичаских i на эпидемических холерных вибрионов эльтор икают различия а структурной организации ДНК, выявляэмнэ методом рестршсцпонно-.,) анализа.

2. Эцэдо^ичаокио а ноэхшдамаче ские холзрныа шбраонн гльтор нэсут различала сибтчыа рзстришхии-ыодафикащше шещга групповую специфичность.

3. Фаги Ш шшунотшт эпвдаыичаских и навпадагдагрских холерных вибрионов алыор облачаются по чувскатвлхностй к системам растрикшш^оди$шп1^^'гомсйогЕщах и гетарологачшх шташов холарннх вибрионов.

4. Фаг 123/203/570 специфически активен в оташанш нзапи-дамичаскйх холарннх нвбриоиоа элътор.

5„ Разработав катод вшцакачаопих в неэпи-

демических холарянх вибрионов эльтор^' naoyEjs: шнодаиуншгэ 'умеренные фага Ш Евдукотпла, о поаощэ тост-оастеаа рэотршдаш-

.{ДАТЕИШН И МЕТОД!

Для рзЕоякя поотаэдйнннх адач бэш прЕмзнеаш еоарэмошшэ микробаодоютасаш, адкчтронно'^шкросштасго),' колакудярно-йиололгааскиа и'другие kg года изучали? faroa ъ холоршк взбцио-

ЕОВ. - : . ,

Главнда объектом -иос яадовааия аякась 26 рас рарзяшл: фа™ юз Ш ищу котила, вцделаншя usaz з »да ксалздованкЗ иг наэхш-ддыичаских вибрионов вльто]-, в 72 pacs гомоЕицушщх т фаго« эшдаошчаских штаммов eg коллекции H;f.L Остроумовой.

• В качества иотсиягэ ввда левая фагов Ш Егеднотипа и двя разработки новнх дагцоотвчаогаа катодов в рабою иснольговано т22 шташа хласстшш холзрхшх вибрионов z S88 холэрпих взб-рионов сльтор разной »явдишчзскоЯ ваатоюстц а трокаховдзния, получений наш из здвоёдшс и авторских коллекций противочукнш свститутоп ЧЛжроб", Кг.з:и2-з и Закавказья, Туркиецсксй противочумной станцаи, Пршдаошхиь 429 штагаоз холерных вибрионов альтор к rpjaae видоаячасйшс и ноопЕДокачаских подтварздаш результата/:! га иного еондаровалкя ка наличка славна vet,. Остальные штамма. относана. к юй или иной группа на основании епедеыиологичзских показателей и дадаыж биологических тестов определения йирулзитности.

/ '

СОДЕЕШ.ДЗ .РАБОТЫ

Хорошо известно, что уопах изучения лизогашш и- свойств укоренных фагов в значительной степени зависит от подбора индикаторных штаммов. Поэтому гарвый этап наших исследований по изу-юнаю особанностай лизогэшшх систем неэпидастчаских холерных зябраонов зльтор составил поиск индикаторных ¡штаммов, выявляющих умеренные фаги вибрионов данной группы, а сравнение их по фвствителъноотн и специфичности с ивдшсаторнши штаммами V.choleras choleras I45(PI) и V.cholerae eltor ЬЕ-?, прадлоган-шми H.,М. Остроумовой о соаат.' для выделения фагов возбудителя шядаыячаской холарн двух бкозароя»

С этой цалыз мы провали изучанга 77 штаммов вибрионов эль-гор, изолированных из гнашнзй срзда лрп отсутствии заболеваний :оларой, на наличие спонтанных фагоа э культура, применяя вса '7 штатов перекрёстно в качаства индикаторных, параллельно с ОТДаыячаскЕка штаммами V.cholerae choleraeI45(PI) и V.cholerae eltor !"Е-7» .

В результата инддглторн а свойства выявлены у 17 штаммов L3 77 изученных. • По спектру фагочувствитальности они разделаны :а два группы: с помола? пятнадцати штаммов параой группы спон-■анныа фага обнаружена в культурах одиннадцати штаммов вибрио-iOB зльтор, два индикаторных штамма 379 и -38S выявляли один фаг :ао а были устойчивы я фагам других ллзогенпых культур.

С помощью эпидемических индикаторных штаммов холерных виб-1ИОНОВ спонташша фага выявлена в культурах только четырёх юта>'-ов из 77 изученных, причём указанные фаги йыяашшсь и на на-пидамичасках индикаторных итшш^х.

Таким образом, эпидемическая индикаторная система оказалась апригодной для выявления большинства (64 %) умеренных фагов аэпиданкчаских вибрионов зльтор. Получаннкэ. данниа свидаталь-твовала о необходимости создания для этойцзлк спацаалиэиро-аяной. индикаторной системы.

Е качества перспективных для создания новой индикаторной истаиы было отобрано пять штаммов v.cholerae eltor (379, 485, 70, 574, 692), на газоне которых нагативши колонии фагов проявились наиболее чётко.

Изучение ¿^сравнительно с эшдамичзсетши индашаторавш'. шташами v.choleraeyHa эффективность выявления известных умеренных фагов эпидемических холерных вибрионов двух биоваров г укоренных фагов, обнаруженных наш у неэпидемических вибрионов вльтор, подтвердило необходимость использования специализированных индикаторных енст«íf для выявления фагов каждой из деjx групп холарных вибрионов. Установлено, что эпидемические и неэпидемические чвдикаторныа штаммы v.cholerse обладают наибольшей чувствительностью к фагам вибрионов гомологичной группы;

Учитывая сходство и различ. л в свойствах индикаторных штаммов V, choleras eltor(iw отобрали из них три, которые иодользо-ер.ли для изучэния штогашш цаэпидакических холарных вибрионов эльтор: 485 и 570, хврактеризудаоея наиболее широкий спектром чувствительности в извзстшзд уаврепши фагам вибрионов вльтор данной группы, а 379,. обладающий саоообяостьа вшшаш> одну группу упаренных фагов типа 180.

Индикаторные штаммы V.oholerae eitor 46. u V.cbolereo eltor 570 были приманены нами в. дшштайдай- рьботе для оаска лизогвн-вых шташов незпвдэмичзских вибрионов эляор - нооиталзй фагов Ш ишунотина. Для идакифиейка яамунотяов уыарэнного фага использовали субкультуры этих итшшов, моаолизогвтий да фага« Щ, 1У и У гатарошмунных категорий, табазио прсдосташюиЕЬ'з паи Т.Б.' Караваев эй. По комплексной рдакко чувствительности ваяхой системы индикаторных шташов позлю было отличить уиараннта фаги Ш иммунотчла от фагов друпи вшунотизов, .

В результата среди 748 шташов шэхшдами'.-кжнх вибрионов эльтор, выделанных из внешней среда ез территории Турк...ашт и рзенублик Кавказа и Закавказья, обнаруаено 26 шташов - носителей фагов Ш иьшунотипа. Принадлежность выделенных ф&гов к Ш юшуио-тзшу была подтверждена их способности) фораировать опадафичвеккй иммунитет при лизогакизацщг радашшнтного шташа;

Таким образом, нами показано, что фагк Ш ©шунотипа, ранеа обнаруживаемые только у згодаинческшс холерных вибрионов эльтор, достаточно широко распространены и среди неэпидемических штаммов того га биовара. Встречаемость их в культурах штаммов кз различных регионов свидетельствует о том, что носительство фагоа Ш идаунотйпа неэпидзмотескиыи вибрионами эльтор - явление закономерное.

Задачей сладу и® го этап работы являлось изучение умеренных загов И имаувотша, обкпруяашшх лака у нззиидзыичасиих иоков эльтор» ш основаны таксоноыичаоки значимым признакам -¡орфологаа нагатявных колоний, строению вириона, сарологичлсквч ¡воЗстваа с ц ,щ> вы тления аозмоякнх отличий их от гоыошыун-гах фатов эпидемических шташоз того яв биовара и разработки а этой основа метода даффарзнциацая их вибрионов-иосителай.

При этой ын исходили из' следующего теоретического прадпо-гожания, сформировавши гася при анализе литературы- Если эпида-тчасюга ( vct+ ) и наэпидаиичасквз ( vet" ) холерные вибриона эльтор является саыостоятальЕШП бтлошчаокшги вариантами «угарных вибрионов 01 саровара, то их гсцоишушше умеренные iara долкны иметь опрадалешша отличая, как рэзультат диварган-сш, согласно общебиологичаской зависимости эволюционной из-1внчивости хозяина и, а го паразита (Догзль, 1947; Цилщский, !988).

Однако о поаощао ыизробиологичасках, эязктронно-микроскс-шчесних и серологических методов нам на удалось выявить досто-ирннх различий шжду сравютаашыи грушами фагов.' Устаковла-[о, что фаги Ш иыаунотнпа неэпидемических вибрионов • эльтор, как 1 тсхотщштв mi фа™* зпвдзничаеггах штам&ов того sa баовара, ю антигенной спвгдафачкастн относятся ко П серологическому тагу (Остроумова о соазт;, 1971), по отроокив вириона - к У мор-юлогичаской груше (Тихонанхо, 1968\

В этой связи цц бняи вшуждеяы веста поиск шшх подходов (ля решения поставленной задачи. В настоадза враия для диффа-юшршщш близкородствакннх гзшшоа фагов и» вирусов широко «¡пользуется катод растрикадонното анализа! превосходящий по ¡увствительностн и специфичности иммунологические 'методы, гкб-шдизацию геномов и гетародушгакешхй анализ (Сенкавич о соавт.', :981, 1982; Goldberg,Murphy, 1983). Он основан на том, что .. [рофиль расщепления изучаемой ЯЯК кошератной рестриетазой яа-[яатся её постоянной характеристикой, Поэтому да решили орав-гательно изучать растрикционный профиль фагов Ш шшунотипа »швдашчаских vet* я неэпидемических vet-" холерных вибрио-[ов эльтор на прима ру их типичных представителей - фагов 222Н I 123, соответственно.

При гидролиза ДНК иосладуамнх фагов эндонуклаазами рветрик-

щи Pstl ■ :: Hindin образуется индивидуальное дая каячого фага количество реотрикциодаых фраптнтов разной элактрофсре-тической подвиянос'лЛ. Полученные дачные свидетельствуют о различиях в первичной структуре ДНК этих фагов, которые являются предположительно, следствием их эвояюциоиной дива pre нции.

Следовательно дифференциации фагов Ш иммунотипа и; соотвзтственно, их носителэй - vct+ и vat" штаммов холер-

■ ных вибрионов зльтор может быть использован растрпнциошый анализ in vitro с пршшашйн эндонуюааз рестрикции Petl и Hindin. Однако снохнос: этого катода делает его малопригодным дая практических. од лай. •

Поэтому мы поставили задачу разработать боле а простой метод дифференциации гоьняашушых фагов разного ироасхойдашш» основанный т шшядещшх различиях а наличной структуре их

дак. .

Работой Н.~Н;Новосалыива и Н»И.Шрченкова (1Э84) покава-' на возможность применения для даффаранцигда сэрологдчаски родственных фагов рестрзкдаоннога а;ад_2а in vi о, Прянпитт метода заключается в дифференциации,фагов по степени их раотршсциЕ системами хоэяйокой специфичности спацаально шдобргдшш: штаммов»

Б этой связи ш шстзршш задачу изучить специфичность Н,! систем эпидвмичасгшх vct+ и мэпвде,шчошк vct" шб-

■ раонов альтор, используя в качзства- краторяя их даффэрэнциадии чувстштельность фагов 222Н и 123, которые, как было показано аыаае отличаютоя по структурной организации ДШС» С Этой цели» была проведена серая експаркаентов по возвратному пясскровашш фагов на двух группах иадаааторннх штаммов холерных вибрионов: сами эпидеиячдсхнх ч пяти незшадзикчаеких в соответствии с методикой Arber et Duseoix (1962).

В результате установлено, что кагдай штамм обладает способностью ограничивать размноаениа гатерологичного фага и вызывать его модификацию (табл. Di- При каадоы пассаже на гетерологич-ном хозяина спектр латнчаского действие исшауемого фага изменялся в сторону снижения эффективности посева на первичном, гомологичном хозяине. Одновременно происходило увеличение эффективности посева на вторичном гатерологичном хозяине. Это- свойство утрачивалось фагом за ода пассаж на исходном хозяине* При

Эффективность посева фадов 222Н и 123 на эпздвыяадскях и яаэаддеиачвсшос плешах холарного вибриона до и поелэ аодификшда

Обозначение фага и aro ■ шдификантов

Эпвдамачаскиа вдашы V.choleras

гНоэпиданотзскиа вташн J_-y^ctoJ.grsff .......

classica

eltor

altor

:I45 : 41 : 113: ME-? 75M ; сгз-б 469 : 757 : 485 : 570 : 574 : 684 : 692

222H/I45 I I I I . IO"1 иг*. io-i IO"1 IO"2 IO"2 IO"4 Ï0"4 IO"3

222H/I45/570 IO"2 ТО"2 IO"2 IO"2 IO"2, IO"2 I0~2 J0~2 I I I „ I I

222H/I45/570/I45 I I I I T I I I IO"1 IO"2 IO"2 IO"2 IQ'°'

2г£/т~? I I I I I I I I IO"1 IO"2 IO"2 IO"2 IO"2

222H/ME-7/570 IO"2 IO"2 IO"2 IO"2 IO"2 IO"2 IO"2 IO"2 I I. I I I

222Н/Ш-7/570ДЕ-7 I I - I I I I I I . IO"1 IO"2 IO-2 IO"2 IO"2

123/570 IO-9 IO-9 IO-9 IO"9 IO-9 IO-9 IO"9. IO"9 I I I I I

123/5^0/145 I I, . I icr1 IO-1 F"1 IO"3 IO"1 IO"1 I072 IO"3 IO"2 •IO"2

123/570/145/570 . IO"4 IO"4 10^- IO"4 IO"4 Jff* 10-6 IO"3 I I I I I

I23/570/MS-7 'I I T X ■I ■ I • IO"1 IO"1' I IO"1 IO"2 IO"3 IO"2 X0~2

123/570Д5В-7/57С IO"4 IO"4 IO"3 IO4 IO"3 IO"4' IO"4 IO"3 I I I I I

i

w

атом било обнаружат, что каждый фаг, будучи модифицирован на одном штамма, оказывается модифицированным в отношения всех других штаммов этой группы.

Получэнныа результаты позволили нам предположить, что системы лестрикции-ыодификациа, обнаруженные нами у эпидемических и неэпидемических холерных вибрионов, иызют групповую специфичность, которая коррелирует с наличием или отсутствием у них опа-рона ус-ь. Одна из них характерна длч эпидемкчзских юь* холерных вибрионов классического и эльтор биоваров, вторая - ддя неэпидемических вибрионов эльтор.

Дачное предположение было подтверждено результатами изучения опектра литичасной активности фага 123 исходного и модифицированного на штаммах холзршх виорионов разной эпидемической значимости.

Фаг 123 в концентрации Ю^ БОЕ/шг на лизирзвая эпадамичо-скиа холерна® вибриона двух биопроз; После модификации на одно* из эпидемических индикаторных штаммов 145, МЕГ-7, 7Ш он приобретал такую способность.

Наличке у эпидемических и незпидзмичаских холерных нйбрио-нов группоспецифачаских систем Щ позволило нам в дальнейшем разработать два метода их дифференциации, Первый ыатод основан 1 использовании диагностического фага, обладающего разной чувствительностью к В! системам эпидемических и неэпидемических холерных вибрионов эльтор. Второй разработанный метод основан на различной чувствительности фатов Ш тшуаотшш холерных вибрионов эльтор разной эпидемической значимости к Щ системам гомо-и гетеролегичных штаммов.

За основу первого метода бил взят фаг 123, полученный из одноимённого штагзш У.оЬсйегаа еИ-ог( высланного В.М.Развнх в 1982 году из открытого водоёма на территории'Туркмении при отсутствии эпидемических осложнений по холере.

Вирулентный мутант фага 123 - 123/203/570 обладал ценным свойством - низкой частотой модификации <10"9) на эгшдемичаских штаммах холерных вибрионов. Фаг 123/203/570 в концентрации 1.0?БСЕ/ш1 при нанесении каплей на газон эпидемических штампов: 122 классического биовера и 139 биовара ольтор - на формировал литичоски-»- пятен. В то жа время 33 % неэпидемических вибрионов

эльтор (из 542 изученных) различного происхождения были чувствительны г его лзтпческому действия.

•Тазам образом, наш вадален фаг с практически ценным свойством» Применяя его широко известным методом агаровых сяоёв, можно идентлфицровать 03 % vet"* вабрьонов эльтор. Новизна к практическая данность получаштых дашшх бйда додаверадана Государственник Кс.дггатом по делам изобретений я открытий, заре' гисгрироаэашх штамм V.choleras eltor- продуцент фага 123 в качества язобратения 'А.С. № 1373729). '

С цвлыв.внедрения фага 123 в практику разработана технология его размножения а жидгой срода и лиофализадая.

Доводи» у экий спектр литачзевой активности фага 123 в отношении на спидамяча ехш: холзрннх'вгбтшонов эльтор, на наш взгляд, слязан с 'неоднородности» больаоЗ груши таданх вибрионов эльтор,' в отлична от эеядвшивсюос шташов холерного тй-(риона того sa биовара. 0 гетерогенности это:! группа вибрионов свидетельствуют даннда а»Д.Гшщбурга о соавт, (1987, 1988), якяэивишх методом, га домной'дактиаископии'. ганошгвЗ ползшоп-физм кеэпвдмгачэсяих вибрионов альтор.

К гналотачнш втзодам пгззлн В.Иоаеа et S.A.Sallea (1S66), показавшие гетерогенность йеашадваачакшх взбелоноа эльтор ю зшовару, которая рзс:и контрастировала с гскоганностгз эпидемических згтамков двух биовароа в этом аспекта.

Поэт ему к ало вероятно вндалекда фага, активного а озноше-нки всай болыпой и неоднородной группы иззвидвмячаскях вибрионов эльтор, как мн шаем в олучэе гшадемичасках штаммов того sa биовара и кяаоснчасках халврннх 'вибрионов.' Болае раадьннм подходом к рэшэны дешшЗ задача является поиск фагов с другим спектры действия и ■ создаете поливалентного фагового препарата.'

Получзннда нами результата можно рассааэряпть как перспективное направление разработки метода дифференциация vct+ a vet" вибрионов альтор с помощь© специфических фагов. Воз-мозпость усовершенствования метода показана Г.И.Коровкина с соавт. (1989), выделившая фаг 6901 IX иммунотшш, который отличается по спектру литической активности от предложенного аают фага и можат служить его' дополнением, при создании поли-

о . . . '''

валентного фагового препарата широкого спектра действия в отношении vet™ вибрионов эльтор.

Различная чувствительность фагов 222Н и 123 к системам реи ршарш-щедафика:. .и эпидемических и неэпидемических холерных ви< рконсгэ позволила нам предположить возможность дифференциации вибрионов эльтор разной эпвдемичаской значимости, пасущих зхао-и&шушша умарашжз фаги, по чувствительности последних к системам Ш спациально-подобрашдах теемгааммов.

Для разработки мэтода мы провела эксперименты по определению эффективности посева 2S фагов Ш шшуцоташа» обнаруженных нами у на эпидемических вибрионов эльтор, и 72 гомоикмунннх фагов элвдакичбских шгаимов того жа бювара на эпидемических и наепидамичаских индикаторных шхамках холарных вибрионе"1, несущих спацифичаакяз системы RJ, Опродалаииа зффактивности посава фагов проводила титращшй фаяьтратоа бульонных культур лигэген-шк штатов катодом агаровых слоёв на индикаторных шташах.

В результата установлено, что вса исследованные фаги зпиде-ыичашщх вибрионов эльтор с наибольшей эффективности) формируи яагативииа колонии на гоиодогачных индикаторных штаммах..

Зффактивность посава различных фагов указанной группы на неэпидемических вибрионах еяьтор варьировала, ifo всегда была на манае чам в 10 раз швш сравнительно с показателем эффективности посава на эпидемических штаммах.- Яря этом наибольший показатель рестрикции фагов бил ^характерен дгш штамма V.choleras eltor 574 ( vet" ) сравнительно с эпидемическим v.cholerae choleras 145,(Р1), обладаадш наиболее высокой чувез витальное«® к умараннзн фагам эпидамичаских штаммов холерных вибрионов эльтор,

Уыарошша фаги Ш иммунотипа неэпядамических вибрионов эльтор с нанбодшай эффективностью выявлялись на штамма V.cholera eltor 465. Показатель рестрикция фагов данной группы системами PLJ эпидемических штаммов, в том числе и V.cholerae cholerae 145, составляя IO^-IO"6.

Получзшша данные показывает, что фаги Ш иммунотипа эпидемических холарных вибрионов эльтор отличаются от гоыоиммунлых . фагов ноэпздэмячаских вибрионов того яе биовара различной чувм вительно^ыо к системам рестрикции-модификации гомологичных и

гетарологачют штаммов холерных вибрионов^ Указанные фаги и, соответственно, их вибрионы-носители могут чиффаранцироватьсд по различия в эффективности их посева на индикаторных аташах, несущих системы Ш, специфичные для эпидемических я наэпидзмичэ-ских холарных вибрионов.

Наиболее достоверные результата, яоррз лиру шив в 100 % случаев о данными .энного зондирования на наличяэ оперона vcfc, получена при комплексном применения таст-системя, вклззчазкцей зтамыя V.ohoierao cho1jrae 145 (vet*), V;cboleree eltor 485 (vofc~) u V.oholerae eltcr 574 ( vet" ).

Для оценки получаемых результатов (эффективности посава Jaros) шз разработали дав диагностичаокиз формулы, учитывайте вогнозниа взряацаз в показателях эффективности носэва фа- -гоз, котоуз, гаосго с списание« «айда, дави я «гтодачэезпх реиокэндацшк та ого прсаонзшзэ, уттгзргдаашх дпрзктором инегк-х/га "Микроб" 14.05.90 г»

Штод прнззен изобраташма (А;С. Л I55898I)„

Таким образе:.!,' в результата премдзншх зссяадевггпй решена sea поставленный задачи и достигнута основала цз.та работы: разработаны два метода дпЦарэш&акг! эпидемачоскш: ( vot'*' ) а тападошкаекпх ( vot"' ) холзрпж тябраонов авьтор, Один яз анх позволяет дЕ^орзЕЩфоиа^ь лизогвнюэ яташа лгадаипчз-c:ciEc а нвападащтсаях Езбрасноз эльтор, nbcyrias какишуынв . умврашия фаги Ш иммукотила.

Оба погода ярости в ислолноют, кз трэбуат слояного обору-дованпя п дефицитных реактивов, позволяют бистро проанализировать бользоа количество штампом. Результата днфЗзрзнцаацва вибрионов эльтор на епадакапзскис а незшадегапаскиа прздаозэн-ныаи методами в 100 % елгчаав корродирует с результатами гзк-ного зондирования штатов на наличка ода рока vot „ Всё это далает возмогшим рекомендовать оба метода для использования в " пражгичаеких лабораториях и,яра проведении научн. -исследовательских работ для оценка потенциальной эпидемической значимости вибрионов эльтор. '

Составлены и утвервдвнн мзтодическиа ракокацдации по применению разработанных методов в практика.

Полученные нами данные подтварздают перспективность дальней-шпго совзщанствования фаготух методов лабораторной диагностики

ходары» Актуальным в этом плане представляется поиск новых высокоспецифичных фагоз для дифференциации зпидемичаскдх и неэпидемических вибрионов эльтор и продолжение исследований по разработке "етода прнчэго фаготипирования, основанного на пазличиях в овойствах умеренных фагов вибрионов эльтор, шавдих различный эпидемический потенциал.

ВЫВОДЫ

I« Разработана система индашторных штаммов для обнару-аения и выделения ^арошшх фагов неэпидемических холерных вибрионов эльтор.

ü. Установлено,, что укоренные фаги И иммунотипа неэпидемических холерных вибрионов ьльтор по морфологии виг '»на . и формируемых колоний, иммунотипу и серологическим свойствам на отличима or тоаошхутщ фатов эпидемических шгашов "ото se биовара.

3,' Матодом рестртодюнного анализа выявлены различия в структурной организации ДНК гомоишунных фагов Щ та.унотипа эпидемических и пиэпидаыичзскш: холерных вибрионов ,аш?-р. Для их дифференциации этим методом могут быть использованы зндонуклеази рестрикции Pstl и HindllZ,

4. Показано, что эпидемические и неэнидемичвекиа вибрион] эльтор несут две различные системы растршсции-модафикации, имеющие групповую специфичность. Одна цз них характерна для эпидемических холер!шх вибрионов классического и эльтор биов! ров, вторая - для наэпиде^дчаских вибрионов эльтор.

5. Выделен фаг 123/203/570, специфически активный в отношении неэпидемических холарных вибрионов эльтор, прягодачй для их отличия от эпидемических шташов того &а биовара. Разработана технология приготовления жидкого и сухого препарата фага 123/203/570 в лабораторных условиях.

6. Установлено, что фагиШ иммунотипа эпидемических холерных вибрионов эльтор отличаются от гомоишунных фагов неэпидемических холерных вибрионов эльтор различной чувствител: ностью к системам рестрикции-модификации гомологичных и ге-теролопгпшх штаммов холерных вибрионов.

7.- Разработан метод дгффврвнщапса эшдаинчаскш: и незпя-

1МИЧЭСЯНХ Т0Л912ШХ ВИбрЕОЕОВ ЭЛЬТОр, НОСУШЧХ ГОЫО2Ш01ШНЗ

ярзшше фага Ш тшукотппар с псион&э теот-системы ра строка-модификации. i

Список работ, опубликованных по матяриаяак дасса ртацгсп

1. Остроумова Н.М.. Анасимоа П.Й., Гра'.Зза If.-Bv, Мороз П. К дифференциации зпндэмячзскях а на зшдамячз с:яп ¡raas-ib холаргах впбрионоа эльтор ш типу яззогзгашх систем//

п, в ШШТИ C5.0I.67, JS 75-287.-Раф.в: 12 Биология.,- ISS7.-£81 Дзп.

2. Морсз В.П., Корогглпа Г.И., Грачёва И.В., Осхроуыоза U,, Солодовкажов Н.С. К разработка ciíctgi,:h индзмторшас ■Ежов, ваявяпэдга: уыорзшкм фзги-иазпвдакячасгах пкбрионов лтор// Дан. в Н5ЙЙТИ 27.08.87, Я 6323-И7.-Рй§.а:ЕС Ваоясгзя.-«7,- I2E109 Дзп.

S.OcipoytíOBa Н.М.', КэрпЕиэза Т.Б,-, Мороз Б.Д., Грлчзва В», Корогкша Г.К., Воробьева Т.В. К ргьработкз jreretn ст-«ультур для опрадедааая ямупоткпа уаарзшпз йагаз когпг-шчаских вибрионов эльтор// Д-зп.э PUDffií 12.СЛ.СЭ, Й I2II-8.-Реф. згШ Бполэгзд.- 1988.- 6Е36 &ш.

4.' Остроумова Н.М., Развах В.М., Мороа В.П., Грачёва И."В., роЕкина Г.И,, Копноз Н.Л, Штамп СаптзргЙ Vibrio choleras tor, дспользуакый для получошш споягяиного фага 123//

С. № 1373729.

5. Остроумова Н.М., Грг :ёва II.Bí, Мороз В.П., Коровника К., ¡йгаркавлч Д.Л., Кочнов H„ILt Развнх В,М, Фаг 123 для ффоренцяадая эпидемических л нээщдомвчаских вибрионов ьтор// Деп. в ВШ1 I5.02.S8, Л I246-B38.- Раф.вгАннот. блиогр.указ. по холере,- Ростов-н/Д, 1989,- ЗС_.

6; Грачёва И.В.-, Остроумова Н.Ш, Мороз В.п., Жоречкпна И.-, Успенская Я.В. !&тод дифференциации эпидемических я на-идамических вибрионов эльтор по спзцафкчносхи их систем стршщии-иодифйпащш; выявляемой с поуоцьн íara 123/203/570// тул. вопр. микробиол., лаб." диагн. и пройялакт. холары:, Таз. •

Всасоюз. науч. конф.- Ростов-н/Д, 1988;- С.93-94.

• "7. Остроумова Н.М., Караваова Т.Б», Кудрякова T.A.-, Коров' шша Г.Я., Мороз В.П., Грачёва И.В. Удареянво холерина фаги П саротила и i . значение для внутривидовой дифференциации хо-Л31'.шх вибрионов 01 саровара// Дап. в ЕШИШ 02.08.89, & 5I9B В89.;- Раф,в:рН Биология;- 1989.- 12Ц2С4 Да п.

8. Остроумова H.H., Грачёва И.В., Мороз В0П„, Грижэйовски Г.М., Савальава D.H., Брстанов А.Ф.-» Коровкшш Г„И, Дкффаран-цаацая эпидемических и наэпидзмичасках вибрионов олмор; несущих гомошшушша умеренные фаги Ш иккунотида, о помощью тас"-системы растрикции-иодификаадш// Эпидешол., шжробиол. и шиуиоя,' бакториал. и вирусных инф.:Таз. докл. облает, кауч конф. молодых учёных.- Ростов-н/Д, 1989.'- C.I92-I93.

9. Остроумова H.Ai., Грачёва И.'В. , Мороз В.П., Коровкина Г.И., Боровикова Т.'П., Зимарина Л.С. Способ ддффоренщами эпидамичаских и неэпидемические холерных вибрионов эльтор, несущих гомошшупные умаранкыа фаги Ш иммунотила/У A.C.

й 1558987.