Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дифференциация эпидемических и неэпидемических вибрионов эльтор по типу иммунитета их умеренных фагов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Дифференциация эпидемических и неэпидемических вибрионов эльтор по типу иммунитета их умеренных фагов"

чз-

гссударственный комитет санитарно-эпидемиологического надзора российской федерации российский научно-исследовательский

противочумный институт -микроб"

На правах рукописи

караваева татьяна бсрисовна

Уда 816.932:576.858.9

дифференциация эпидемических и незгвдемических вибрионов эльтор по типу иммунитета их умеренных фагсв

03.00.07 - г-ккрсбиология

- автореферат диссертации ка соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов 1993

Работа ' выполнена в Российском научно-исследовательское противочумном институте "Мцкроб1" Госкомсалэгшдкадзора Роескйс^рй Федерации

Научный руководитель — доктор медицинский наук, профессор Н.15. Остроумова

•

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор М.К. Щеглова доктор биологических наук, старший научный сотрудник Н.И.Смирнова .

Ведущая организация: .

Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт

Защита состоится 1993 г. на заседании

Специализированного ! Совета Д (374.32.01 по' присуждению ученой степени доктора . наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" Госкомсанэпиднадзора Российской Федерации (410071 Саратов, Университетская, 46).

С. диссертацией можно '¿знакомиться в научной библиотеке института "Микроб"

Автореферат разослан ^ГоЛь^К 1993

г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор биологических наук .

Т.А.Корнеев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ А х т у а л ь я о с т ь гт р о' ' л е мы. U;i;;okc i контаминация' объектов внегиней' среди оли6оЕ::рулепт;'1..',.,.:1 и агглрулентш.>л "формами, холердах вибрионе а независимо от элндс • миологической обстановки явилась практической основой дискуссии о судоствовакин двух самостоятельных ¿орм »ибси>:ксп эдкг.;> • эпидемической (vct~) ¡; неэпидемической (vc'"), которая продолжается ка протяжении ьсего периода седьмой .

исследования, ароведокгс.-о з РВМЧЙ "Микроб*, показали. что ъ период эпидемий от бог.ьких и из . -чю'дкей среди ььдодлг.то преимущественно вгрулекткш «¡таммы, в межспидомнческлй n-t itu.i • авирулент!!ые и вирулентные. Для их ¿иф&гртазешж* А.'Х.Ляруънх* л Н.Ф.Быстрым был. предложен хемдлекен!:.-;": метод (1971). Г.'с JI.С.Подосикняковой • с соавт. (1GS2). на территории 'бывшего СОР га период 1987-1901 гг. • било выделено около 7 тыс V. cholerae, в том числе 5930' - из объектов внеез'.еа среди. Подавляющее большинство ■ этих культур (97,9-93,5/0 бгслп авируленткыми;и слабовирулеитними.

Много'глслеккые исследования вьделеншх из' объектов глеишеп среды при эпидемиологическом благополучии вибрионов эльтор с гхгмощью зонда. содержащего клонированные гены холерного токсина,, проведенные в- последние годи, показали, что они лишены vct-генов, в отличие'от штаммов из 'очагов холеры (Гинцбург с. соаь г., 1987; 'Ливанова с соавт., 1069; Грижёбовсхий с соаат., i09l). Большинство исследователей в настоящее время считаю!', что эпидемическая опасность таких "вибрионов минимальна' (Стогова с соазт., Г085"; Уралева с сГсавт., 10Й8; 'Развых с соэвт. , lf/JO; ГрикебоЕский с соазт.. 1390).

А.А.Гинзбург' с соавт. (1-938,1989). А.Ф,Брюханов . (1991), Л.А.Еагняяч с ссавт. (1981) с -помощью метода геномной "дактилоскопии" выяз:1ли генетический лг лимерфйзм неэпидемических ¡втаммов эдьтор, в отл;гкэ от. онадёгаггеских, обладаггих сходными профилями г;;брядчза:;ии. что моу.ет свидетельство зат?* об отсутствии «яокалького.родстза vet* и vet" вкбрнснов зль~ор.

2,Л'ереч:п:гция_ vct+ и vol" вибрионов является'ватккол падаче-л ол-у:;х%слогяческого каЯяора еа холерой, котсрал осложняется их дсстатично бодьи:лм фскотзлпг-т-скяч. и гейстигппесккм сходством .■ 3 настоящее epfeua суцзствует гн.уштелиЕсе число методов

определения вирулентности-холерных вибрионов - иммунологические, окологкчоскис, комплексный'метод А.К. Адамова с соавт. (1971). Большинство используемых методов но 'всегда позволяют установить оипдемичесг.уо значимость' исследуемых штаммов. • Особую трудность для диагностики в отсм плане представляют культуры, по данным лабораторных тостов # определяемые как слабовирулентные. В группу 'елабоьирулзкткых" _ попадают как vet" "'так к vct+ Штаммы (ГинцОург с соавт., 1937," Подосиншкова с соавт., 1932).' Диыь-метод гёнкого зондирования, основанный на детекции сперона vctA3 и геноме V.rholeroe, дает возможность' получить однозначен- ответ .10 опидемпческок или неэпидемическом происхождении стамма. Однако ото* метод' пока еде недоступен болыпиству практических лабораторииведудих плановые обследования на холеру,. В связи с этим разработке достоверного - к достаточно простого. метода дифференциации эпвдемичэЬкнх к .неэпидемических вибрионов 'эльтор является актуальной задачей.

Анализ данных' зарубежных и отечественных"'.исследователей, изучавгаи' феномен .лизегекил .холерных вибрионов, дает основание предполагать, что тип иммунитета, возникающий. у клетки при лпзогскизеднлг , умеренным?, .фагами, может служить маркером внутривидовых вариантов' V. cholerae.'

Показано,- 'что классические ■ к эльтор холерные вибрионы, смолённые в очагах холеры, • несут :умеренные фаги различных иммунотипов. Вибрионы эльтор монолизогенны по ' фагам III иммунотипа. названным К.Такеуа et al. (1933) "каппа" фагами. Для классических V. cholerae' установлено носительстБО фагов I, .II и V иммунотипов в поли- к мополизо.генных системах, 'Феномен лпзогеш:;: у кеапвдэмических . вибрионов зльтор изучен до кастсг.дего времени недостаточно. Греются данные о выявлении у штаммов бисьгра кльтор, Евдеденных из воды поверхностных водоемов при отсутствии заболеваемости холерой, умеренных фагов П . ссротняа I, III, IV иммунотипов (Остроумова с соавт.,' 108?, ¿0S?; Кудрякова с соавт,, .1983), а также фагов- ранее неизвестного XI'серотипа VI иммунотида (Остроумова с соавт., 1933).

Ь!ы высказал!; предположение о нал;г-ии озолшионло о;юсрсдоваш-:ой связи методу принадлежностью "холерных вибрионов к различным в1гутр1:в;:доБым вариантам и нооительством щеренных фагов определенных нмкукотипов. . Б связи с этим была поставлена

задала разрабс?кй метода - дифференциации вибрионов эльтор различной эпидемической значимости ' по типу . иммунитета их умеренных фагов. •

Цель и с с л - е д о в а. ц и я. Изучить сходство и различия умеренных фагов эпидемических Холерных, вибрионов и неэпидемических вибрионов эльтор по иммунотипу и другим биологическим свойствам и' разработать на. этой, основе способ дифференциации V. ciiol'erae eltor различной эпидемической значимости.

Основные задачи:

1. Изучить феномен спонтанной . продукции умеренных фагов в культурах неэпидемических вибрисноз.эльтор,

2. Разработать тест-систему индикаторных штаммов для имму-нот1(пйрования умеренных фагов- неэпидемических холерных вибрионов . ' •

, • 3. Провести анализ сходства я различий по- иммунотипу и другим биологическим -свойствам • умеренных фагов эпидемических холерных вибрионов и неэпидемических вибрионов эльтор.

. 4. Разработать-- метод дифференциации' эпидемических и неэпидемических вибрионов эльтор до типу дшзогешгого иммунитета их умеренных фагов. •

. Н-а. у чц а я к о э й з н а. Разработана тест-система для иммунот клир о в ания : умерённых - фагов неэпидемических вибрионов эльтср.' Впервые установлено', что неэпидемические вибриона эльтор являются носителями умеренных фагов -И. серотйпа.VIII кмиунотипа и XI серотипа VII,-IX. XI, иммуко.типов-. • . • .. . •

Обнаружено, что среди незгпщии 1*ч—г .вибринов эльтор' широко распространено носительстас умеренных-'фагоа - XII:. серотипа X ккаунотипа. ■ ..•••...

Показано," что между тилем -тамунитеха умеренных фагоз холерных: • вибрионов эльтор '■ и наличием • у ' них оперопа vctAB существует определенная_ Корреляция.. Коситёльство фагов I; II, IV, VI. VII, VIIi; IX. X и XI иммунотлпоэ характерно. только для неэпидемических (vct~). вибриокоз эльтор'^ среди -эпидемических (vet4*) вибрионов эльтор не встречается.. . •• .....

Разработан метед . дифференциации .'указанных .вариантов ак5-рискоа эльтор по типу иммунитета • та .умерейдьве фагов'. с . хокощыэ спесиализированной системы тест-культур. ;' :. 1

Обнаоужеяы и списаны лолилизогённыа системы незтгдемических

вибринов эльтор, -дана классификация умеренных фагов холерных вибрионов. ... ■ •

Практическая це. нност'ь. Новизна к практическая ценность умеренных фагов VII, VIII. IX, X и XI иммунотилов. подтверждены Госкомизобретений (А.С. N 1,454848, 1533331, 155735, 1631076;; 159&765). Фаги используют дта получения тест -культур, которые применяются для иммунотипирования умеренных фагов ■ неэпидемических вибрионов пльтор (Акт о Енедрешш в Ростовском противочумном институте от 31.05.8В). Метод-дифференциации эпидемических и неэпидемических вибрионов' зльтср по'типу.иммунитета их умеренных фагов с помошыэ' систе:.:ы тест-культу:) также признан изобретением (АС К 1767879). Тест-система депонирована в музее живых культур РНИПЧИ "Микроб", составлены -к утверждены Д11ректором 'института методические рекомендации -по ее ■ применению.'• .Метод успешно, апробирован и внедрен в практику в'.Ростовской противочумном институте (Акт о внедрении, от 31.05.69). 'Он найде.т ';применение в :научных, и практических, исследованиях, "при оценке- эпидемической значимости холерных вибрионов .эльтор.. Порченные- результаты имеют теоретическое значение для. изученияэволюции'- У.сЬо1егае- как патогенного ввда. и могут' быть использованы в, таксономических исследованиях. .

А.про бац и я работы. Основные материалы диссерта-шш обсуждались' на итоговых, научных конференциях к .заседаниях Ученого Совета института "*1ккроб", Всесоюзной научной конференции "Актуальные' вопросы микробиологии, лабораторной диагностики и 'профилактики холеры", Ростов-на-Дону, 1938 г. , конференции молодых ученых "Эпидемиология,, микробиология и иммунология бактериальных и . вирусных .инфекций", ' Ростов-на-Дону, 1983 и Российской научной конференции "Холера" , Ростов-на-Дону, 1.9Э2.

•П у б л и к а ц 'и .и. Основное содержание работы отражено в 14 опубликованных статьях.

Структ-ура диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследования, заключения и выводов'. Библиографический указатель включает 222' источника, из них 134 работы отечественных и 88 -иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 15 таблицами и 4

рисунками.

На .защиту выносятся следующие положения:

1. Серстип и иммунотлп умеренного фага являются генетической меткой внутривидовых зариантсз холерных ви'брионоз.

2. Неэпидемические (vet") вибрйоиы эльтор являются' носителями фагов не чен^з трех различных серотнпов и десяти иммунотилов а отличие, от vctT вибрионов того же бисвара, который несут фаги только III иммукотипа'II серстипа.

3. Метод дифференциации .эпидемических (vct+) и неэпидемичес,-. ких (vet") вибрионов по типу иммунитета их умеренных фагов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОЛЫ . Для'решения поставленных'задач были использованы современные микробиологические, электронно-микроскопические -и другие методы изучения. холерных вибрионов и их'фагов.

Главным объектом .исследования' явились 170-'рас умеренных фагов, выделенных' нами. из неэпидемических вибрионов' Зльтор различного •происхождения, а также полученные- из коллекции Н.М.Остроумовой'-с соавт. эталонные фаги пести иммунотйпоз. В ка гестзе ' источника'.' умеренных ■ фагоо' к для контроля разрабатываемых методов были использованы' ПС8.:\ штаммов холерных вибрионов серо'типоз-- Инаба и Огааа дв.ух биоваров различного происхождений и эгидемиче скол значимости, .полученный из коллек- ' ций• института "Микроб" "и--других-'противочумных учреждений. Генетически зондированные штаммы были любезно предоставлены нам Н.И.Смирновой и Л.Ф.Ливановой, Г.М.Грижебовским и.А.Ф.Брюханезим из свсих'коллекций. • -

- СОДЕРЖАНИЕ' РАБОТЫ' .

1.. Изучение феномена лизогении ■ у эпидемических холерных • • ■

вибрионов и неэпидемических вибрионов эльтор.

Первым этаком напкх исследований -явилось изучение распространенности феномена спонтанной ■ продукции .умеренных ¿агев у неэпидемических вибрионов эльтор для сравнительного' анализа сзсистз лх умеренных фагов я фагов эпидемических культур 7. choleras. - •

Материалом для изученил сослужили 743 вибоисков ольтср из внешней среды. Их принадлежность к ¡¡е'эпидэмичеоким была

. а

подтверждена . данными генного зондирования (335 шт. ) и лабораторных исследований вирулентности (363 шт.).

Для установления .лизогенкого состояния исследуема культур мы использовали 'рекомендованные В.П,Мороз с соавт, (1987) индикаторные итаммы. - V.; спо1егае' еНог 485 и 570, обладающие чувствительностью к.умеренным фагам неэпиде!31ческих вибрионов:

Для упрощения приемов'. обнаружения . и _ идентификации типа ' иммунитета умеренных фагов .. 0да_ разработан ■ способ прямого исследования на лизогенность -агаровой культуры холерных вибрионов.

На этом этапе исследования перед нами стояла также задача доказать,'. что эпидемические 'вибриоцы эльтор несут фаги только III. иммунотапа, классические- - I, 41,,, V .иммунотипов и никаких других фагов, отличках от укааанвдт до • 'иммунотипу.и отношению к . индикаторным системам,' не ¿одер*ат. . Поэтому для идентификациЕи типа иммунитета, умеренных фагов ' эпидемических с.тдммов (90 вибрионов- бисв'ара эльтор и 75 -классического) нами -была-использована ■специализированная; неэпидемическая ' индикаторная тест-система, состоящая клонов вт: -'V. ' сЬо1егзе еИог 485 к 570, лиэргенных'по" 4йг*ам. П1 -и Л", IV нммукотшоз, и щтамш V. с!ю1егае-с1ю1егае 145 и .V.'сЬо1егаё е1\ог МЕ-7, выявляющие фаги - эпидемических/ голершх вибрионов двух, биоваров. Характер иммунитета культур тест-системы позволял дифференцировать фагк III и V иммунот1шов и* выявлять фагь' других- иммунотипов. Фаги I и II иммунотипов -отличали- дт фагов V иммунотипа по мор'фологии колоний,' а друг от- друга -.-по .способности" формировать негативные ' колонии на'штаммах '145 „и:1Й-7. - .. "

Результаты нашего исследования' подтвердили полученные ранее ■ данные о .том, что эпидемические. холерные ■ вибрионы классического биовара содержат только .фаги I,' II и V иммунотипов, а бковара эльтор т только.фаги-III иммунотипа. При изучении неэпидемических культур- обнаружено 152. лизогенных штамма, из которых получено 170 умеренных фагов. Изуче.ние свойств этих фагов в сравнении, со .' свойствами фагов -эпидемических - культур составило предмет дальнейших исследований.'

2. Разработка тест-системы для иммунотипирования умеренных фагов неэпидемических вибрионов эльтор.

Известно, что тип иммунитета, создаваемого у-клетки-хозяина

при лизогенизации, является важнейшей характеристикой умеренных фагов холерных вибрионов. Поэтому, изучение .специфичности имму-но'типа умеренных фагов неэпидемических вибрионов эльтор явилось осноекым методическим подходом_ в достижении главной цели наших исследований..

Для определения типа иммунитета умеренных фагов неэпидемических вибрионов эльтор необходимо разработать специализированную тест-систему, поскольку существующие индикаторные системы оказались мало пригодными для Этой цели.. ■

• 3 качестве реципиент ных штаммов были выбраны V. сЬо1егае е Ног и 570 в соответствии со спектром логической активности фагов этой группы (Мороз с соавт.,1387). Лизсгенизацив проводили чистыми линия® умерешъгх фагов шести (I-VI) известных до настоящего времени гетероимиунных категорий: 41, 70. 222Н, 132. 98х и 811 (Остроумова- с соавт.. 1986,1983). Фаги 41, 70, 222Н, 98х были предварительно' модифицированы ' с использованием модифицирующей системы V. сЬ.о1егае еНог 485'.

В результате получен набор мснолиз'о генных тест-культур, об-ладаххцих специфическим 'типом 5э®гулитвта и соответственно -специфическим типом чувствительности й' фагам ' шести гетероиммун-нки категорий". . Полученная система была успешно' апробирована, при изучении 78 лизсгенных пггакмов неэпидемических Ейбрионов эльтор,-■ умеренный фаг в культурах которых' бый обнаружен - помощь» индикаторного штамма V. йю1агаа 485, '...•'•'

Таким образом, были созданы предпосылки изучения свойств умеренных • фа'гоз' неэпидемических вибрионов ел.ьтор: . собрана коллекция лизогечных культур, разработка тест-система для дифференциация фагов, по' вгмунотипу^ а метод' идентификации и иммуиотИлировакия их а апарово^ культур». .

3. Изучение умеренных Загав II серотнпа' неэпидемических вибрионов эльтор, •'"-'.'

Учитывая важное значен» аатягвшк?! специфичности в таксоночкчеоксй характеристике фьгоз, и с цельв упорядочения проводимых исследований. з качестве первого критерия группировки изучаемы:? фагов мы исбради их серологические .свойства..

Поиск фагов II серотипа з культурах' "неэпидемических Еибрконов эльтор г изучение их свойств явились'■предметом следующего этапа наших исследований.

Были изучены 152 лизогенных. птамма вибрионов этой группы,' обнаруженные нами ранее. Установлено, что 81 птамм из шк является носителем, фагов II серстипа. Остальные фаги (7; ) серологического родства с фагами II серотнпа не имели.' Нзученне •шла ¡ммунитеть выделенных фагов II сероткпа позволило выявить среди них фаги I, II. III, IV иммунотипов, а также VIII ранее не известного 1р.;мунотипа. Наиболее часто имело место нссктельствс фагов IV иммунотипа (36-75 % б зависимости от территории). Было отмечено, что состав фагов II сероткпа по иммукотипак не зависит от региона выделения лизогенных культур.

Выделенные фаги II серотипа не- отличались существенно по морфологии полоний и вириэнэв от фагов, эпвдеетческнх культур. Они формировали негативные колонки двух типов: михенеБидкые (полупрозрачный центр, окруженный чередующимися зонами. плотного и разреженного роста) и мутные,- окруженные узким прозрачным ободком по периферии. 'Диаметр колоний колебался е пределах 0.6± 0.05 - 1,2+С,03 ым. По злектрокно-м^жроскошгческой структуре изучаемые фаги относились к V морфологичекой группе по классификации А.С.Тихоненко.

Таким образом, было показано, что фаги II . серотипа неэпидемических культур вибрионов эльтор по специфичности иммунитета представляют не. менее пяти гетерыамункых групп. Среди них были обнаружены фаги, гомоиммунные фагам I и II iwMyHonrnoE. классических холерных вибрионов, к. фаги , гомоиммунные фагам -III иммунотипа эпидемических вибрионов эльтор.' Фагк II. сероткпа IV иммунотипа и впервые обнаруженные Фаги VIII иммунотипа встречаются только в культурах неэпидемических вибрионов.

Полученные данные показывают, что умеренные фаги II серо- ' типа неэпидемических (vct") вибрионов имеют существенные различия по генет1гчески детерминированному признаку - типу и.е.гуни-тета от умеренных фагов эпидемических (vet+ ) культур.

А. Изучение умеренных фагов XI сероткпа неэпидемических вибрионов эльторЛ

H.M.Остроумовой с соавт. (193S) из культур вибрионов эльтор, обнаруженных при плановых обследованиях водгемоЕ негндемичшх по холере территорий, были получены восемь фатов VI гетероикнунной категории, не имеющие серологического родства с фагами II серотипа. Они образовали самостоятельную серологически группу. к:-

торой был присвоен очередной номер XI серологического типа, (типовой представитель фаг 511). Как было отмечено Еьапе. подобные фаги в культурах эпидемических холерных зибрлснсп не встречаются я следовательно могут выступать 3 качестве генетической метки неэггэдемического варианта вибрионов зльтср.

3 этой связи нами было 'продолжено изучение распространенности и свойств умеренных холерных -tares XI серотипа. Предметом исследован:'-? явились 3 фагез XI серотипа, описанные л.М. Сстроучозой с соавт. (1963). к 71 ■ лизогенкый иггамм зибрисноэ зльтср. чьи фаги, как было показало зыпе, * не имели се-' рслогичесхого родства с фагами II серотипа.

Спонтанные фаги XI серотипа были обнаружены э культурах ¡4 дтаммоа из числа изученных. С ни не обладал:! чувствительксстьв :< антифаговей сыворотке II серотипа и нейтрализовались антисыэо-рстязй прогиз фага 511 XI серст:пта. Фаги остальных 57 лизогенных атаммоз были устойчивы к обеим сызороткач.

Зое выделенные фаги формировали на газоне штамма 4Б5 сходггые по морфологии кслсьпм диаметром 2,4^0.5 см с полутгрозрзчззя* центром. аоследухздей зоной уплотненного роста и зоной неполного лизиса по периферии. Злектронио-иикрс с ко гагшсксе строение вирионоз этих фагов было также сходным и соответствовало. III морфологической группе по классификации А.С.Тихсненхо. .

Изучение типа иммунпггета фагез XI серотипа позволите разделить ид на четыре гетерсиммунных подгруппы, две из которых.' представленные фагами 1554, 1G85, 1417 и 955, 356, 393, с сстзетстзенно, характеризовались гасско специфичным иммунитетом. Уе.чду фагами дзух других подгрупп (32, 27, 73, 1С8. 114. ■337. 15J5. 511, 469. -553, 647, 550, 590, 530. 1201 и cSOl соответственно) существовал сдносторсняий тид гетэроиммункссти. Фаг создавал им:г;нптет не только к самому с^бе, но и х фагу 31!. тогда как фаг 61! и др:угиз представители этой подгруппы создавали иммунитет только фагам своей подгруппы. На ссяоЕа-'пи ст-.п данчкх подгруппы фагез XI сгрзтага отнесены к различным :пс.г.';-:сг;п:ам. Фаг 393 принят за эталонный ппгамм VII :сз._;,п~стипа, Фаг iv-l - за этадогп-дл! ira.*« IX иммукотипз л фаг IS34 - за с-талсчныЛ лтамм XI !-з'„му:-:отиг.а. Фаги II я XI серотипоз по тиду ;гммуннт г га дредстадлл.сг собой независимые- группы.

Тагом образом показано, что не; гптдемичес кие вибрионы эль тор лзл.~отс.ч -тоонтеллгп: фагоз , стднч£пш£хся от фагез с-гпшеулг-эснпх

культур того же биовара по серологической специфичности' и .типу иммунитета. Носктальство фагов - XI сероткпа . коррелирует с отсутствием у штамма оперона vctAB, в связи с чем этот признак может бить использован для дифференциации двух вариантов вибрионов зльтор..'

5.. Изучение умеренна фагов."XII серотипа цеэ^щещчесщх вибрионов зльтср. . . • .

Очевидно, что фаги II' и XI серотипов'У. cholerae не исчерпывают всего 'разнообразия этих объектов, поскольку была обнаружена большая группа неэпидемических вибрионов эльтрр, умеренные фаги которых ' устойчивы к .' антифаговым сызороткам указанных 'серотипсв. Эти 57- штаммов к 'их умеренные фаги ' и составили предает • ваших.. дальнейглр: ' исследований. Следует отметить, что для 53' штаммов • этой группы отсутствие ■'оперена vctAB бьатб подтверждено, даннЬми генного зондирования.

В нашу 'задачу входило разделить изучаемые фаги на однородные группы, определив их таксономические характеристики. Поскольку изучить • каядай фат4 кв'представлялось зоз»южныа, мы поели по пути рационализации, реЕкь:разделить их по типу иммунитета, без выделения кг' культур, используя метод идентификации в агаровой культуре. • ' '

Из указанной группы штаммов произвольно были взяты даа штамма 80 и 64, имещке 'различное происхождение; Штамм ВО был выделен из внешней среды в Астраханской области, штамм 64 - из внешней среды.в Туркменской ССР. Полученные из них фаги, обозначен.-, ные соответственно 80 и 64,- формировали на газоне индикаторных .штаммов 485 и 570 негатив.ные. колонии сходной морфологии. При титровании методом агаровых слоев б 0,7 % полужидком агаре они образовывали очень мелкие, подобие уколу иглой пятка, в которых было невозможно различить какие-либо элементы строения.. Заменив 2 % агаровый слой на 1 % к 0,7 .% полужидкий-агар.на 0,5 %, мы получили возможность убедиться, что колонии этих фагов имеют круглую форму с неровным краем и равномерно мутной поверхностью; чем отличаются • от всех изученных ранее умеренных фагов II и XI серотипов. " _ .

Попытки размножить фаги 80 и 64 в кадкой среде не увенчались успехом: "в 'течение 4 часов наблюдения концентрация фага в присутствии индикаторного штамма оставалась на уровне посевной до-

зы, после.чего начинала снижаться. Удалось размножить эти фаги только в полужидком агаре■ методом агйровых слоев. На третьем пассаже, были получены препараты с 'концентрацией фагочастщ Ю1^ в 1 мл; которые были использованы в дальнейшей работе.

Путем лизогенизации фагами 80 и. Б4 реципиентньгх стазов У. сЬо1егае еНсг '485' и 570 были получены . лизогенные клоны 485/80, 485/64, 570/80 и 570/64, которые дополнил:! ранее разработанную .тест-систему • и . были использованы для дифференциации исследуе!-!ых лкзогенных штаммов. на' группы по типу иммунитета их умеренных фагов.

Было установлено, что фаги 60 и 64 являются: гомоим:-гукным.;1 о фагами Нового, ранее.неизвестного X кмнуноткпа. Среди остальных -55 штаммов' носителями . фага' X кммунотипа оказались еще 37. Фаги остальных 18 штаммов преодолевали 'иммунитет фагов X иммуко~я;а к 1-1Х и XI' иммунотипов.' Как показали дальнейшие исследования, эти штаммы являются полилизогенными. . . ■

Путем внутривенной зшмунизации'кроликов , фагом 80 была получена- антифаговая сыворотка, используя' которую в' методе агаровых слоев, .мы смогли показать, что обнаруженные Фаги X иммунстила относятся.к новому, ранее неизвестному серотипу холерных фагов, обозначенному XII номером..

При электронно-микроскопическом .исследовании было обнаружено, что'фаги оО и.64 лишены голозки, .их. вкрисны 'представляют собой длинные извитые шти. диаметром 8 А '(80 нм) с полым центральным каналом. Следовательно, их можно отнести к I морфологической- группе по классификации А.С.Тихонеыко.

Территориальный ■■ анализ• • встречаемости культур вибрионов эльтор, лизогенньгх по фагу XII . серотипа, 'показал их -греков распространение в природе. ■ Они были обнаружены сред»: и-таммсв, выделенных во многих областях Туркмении, на территории Армснии, Азербайджана, Узбекистана , Астраханской области.

Таким образом, при исследовании лизогенкых культур неэпидемических- (ус1~) вибрионов эльтор были выделены умеренные фаги ранее неизвестного серотипа,. обозначенного XII .номером в продолжение отечественной классификации холерных фагов. Эти фаги относятся к новому X иммунотипу. Носктельство фагов X кммукотпг.а XII серотипа коррелирует с'отсутствием'оперона ус1АВ' в хромосоме, вибрионов эльтор, следовательно* они могут служить меткой неэпидемического варианта ы^-риснов' эльтср.

5. 'Изучение полилизогенкых систем неэпидемических впсрнсноз зльтор.

На следующем этапе кашей работа были изучены 1= штаммОБ vct* вибрионов эльтор, умеренные фаги которых преодолевал:! ;асг/>:;:тет фагов всех известных в настоящее зремя иммунотипоз.

Для ' выделения и идентификации фагов - был исслъзозак метод получения их чистых линий клонированием по различию з структуре .негативных колоний, серологической специфичности и иммунитета. Строение негативных колоний изучали с пемеды стереоскопического микроскопа' марки МБС-1.. Серологическую идентификацию проводили в • полужидком агаре с применением специфических антифаговых сызороток Цу XI и XII серотипоз, Ти:т иммунитета определяли с помоцьа индикаторной. системы. зключапцей 10 субкультур штаммез ольтор 435 и 570, мснолизогенных по фага:-! 10 иммунотшов'.

3 результате было установлено, что зее 13 атаммев являются полилизогенныма. Ха:вдый из них несет не мзнее двух гетгрспм-муиных ярофагов. Всего был^ обнаружено восемь поднлизогелкых кс.чплексов, зклвнянцих в различных комбинациях фаги восьми раз-.игшых иммунотипов, отнсс,гциася к трем серотипам по антигенной специфичности. Из них 10 итаммои (55 А) яиаогенны по фагу III пммунотлаа в соча-.ании с фагами I и X тчукотапоз. Присутствие .второго фага з культуре неэпидемического вибриона эльтср, н&судэго фаг III иммунотипа, является важным отличием егс от зг„щ;;миче--:к::л, всегда монолизогенкых штаммов.

Таким образом, показано, что в 12 % случаев лизсгенные nrru.\Mj незс/цомнческих вибрионов элъте? несут не менее двух умеренных ijuroB. отлпчаод1хся ла гоамун. ni.ту. а з солъшпнгтзе слу-■W03 и по сйротилу. Нал;гыз фага III «¡мыунотипа з поли-лизогс-чнеу. uüMiyic.ícs всагда указывает на принадлежности его к

ак5рнонам эльтор".

7. Таксономическая характигл-т:::;а z гянесафакаамг' ФЙГСЬ кигзддодичесхнх оиесишиз мы?? .

f~"-s по наги «сг.^дога.'Ы.ч. звопц::с-&г-;£с.с:а 4

i..'.¡ff?o.i умеренных фагс-з • II,

.'I.. • XII ? efr/, гка je. лето спо типу нмыукптета, г у

'"-■vv^.'a-хг^лг-.ма ¡:pu д'-могекиспц-ли, четко --

иммунотипов (i-rv, VI-XI). При этом 9 из ша (I, II, IV, VI-XI}' специфичны только для vet" и среди vct+; птаммов этого биовара не встречаются. Около 14 % лизегеккых ытакмов неэпкдемическиз внб-ркснов несут, фаги' III кммунотгспа, гоиоиммунные фагам эга'демм-чеоких вибрионов, которые в 100 % случаев являгтея ноептелягл фагов II серотипа III иммунотипа (Каппа). -

Результаты изучения биологических свойств умеренных фагов холерных Еибрионов явились материалом для их таксономггческой характеристики. .

В основу временной классификации фагов микроорганизмов Егдг^ V. cnolerae положено четыре признака: серологическая специфичность холерных Еибрионов, серологическая специфичность, электронно-микроскопическая структура к спектр действия фагов, которые охранены в предложенной Н.й.Остроумовой с соавт. (1SS6, 1986а) схеме их распределения и номенклатуре. Эта схема была использована нами для определения■ таксономического положения ранее неизвестных умеренных фагов, выделенных из неэпидемических вибрионов биовара эльтор.

Изучение серологических свойств . этих фагоз позволило разделить кх на три группы, ' одна из которых соответствовала фагам II серотипа холерных вибрионоз 01 серовара, а две другие имели - оригинальную антигенную специфичность. Им были присвоены номера XI и XII. Анализ электронно-морфологического строения уу.еоекик фагов II, XI к XII серотипов подтвердил родство ¿агов Енутри серотипа к четкие отличия мезэду фагага различных серотипов. Фаги II серотипа эпидемических и незпидек;г-:?ск:::: вибрионов относятся к V, фаги XI серотипа - к III, фаги XII серотипЕ - к I морфологическим группам по' зс:асс::ф::ка:дп: А.С.Тихоненко (1958).

Б ходе изучения спеафгчности иммунитета, фср:Д:г:уемого умеренными фагами. II, XI к XII серотипов у лиэогенкых клонов хозяина, была выявлена корреляция . этого признака с вкутр:;гв;ц:овыми ■ группировками холерных вибрионов 01 сыровара по свойствам, определяющим биовар, а внутри 'биовара эльтор - nft ка-гчию оперона vet A3. Косительствс фагов IV, VIII ;э>.мунот1'.;!Оь •' 11 серотип) и всех иммуногрупп фагев XI (VI, - VII ¡ IX и XI ¡у.ег-т-.оттспы) к XII (X иммукотип) серотипов обнаружено только у vet" Еибрионов эльтор, фаггз V (II- с ере тип) - только

у гибг~енсь г.-.;".:г-;-:-гкг~: Спегарг.' ч-лгк I и II иккузстклэв

встречались е.культурах классических.(vct+) холерных вибрионов и vet" вибрионов эльтор. На примере фагов I, II, III йммунотипов ■ было показано, что. в 'зависимости от источника (vct+ и vet" вибрионы) они. ота-чаются чувствительностью к. системам рестрикции-модификации гомологичных и гетерологичных (по оперону vetA3) штаммов.

Следовательно, тип . .иммунитета умеренного фага может использоваться в качестве дополнительного критерия классификации этих организмов. На основании.вышеизложенного и в соответствии с поставленной целью определения- места, умеренных фагов холерных вибрионов в общей- системе фагов вибрионов вида V. choierae мы сочли возможным внести дополнения в предложенную ранее Схему их временной классификации. . ,

.Уморенные фаги, отнесены к трем с§ротипам II, XI и XII. вида фагов вибрионов 01 серсвара. Каждый из этих - трех серотипов делится на иммунотипы, каждый и-£мунотип - на расы.

В соответствии, с изменением классификации холерных фагов следует • соответстве1шо дополнить и их . •номенклатуру. Для сероваров, включающих умеренныэ фйги, в обозначение фага кроме серовара вибриона, серотипа фага и его, расы, предлагается внести' обозначение иммунотипа фага-, ■ выражаемое римской цифрой: 01/2/VIII/1 (первая, раса восьмого йк-гунотила второго -серотипа фагов холерных -вибрионов Oi • серовара): Это обозначение" дает представление об основных "практически важных свойствах фага, '' отражает индивидуальную характеристику объект^ и' группы, к которой рн принадлежит; ' ..• '.'

8. Разработка метода .дифференциации V.; choierae '■ .eltor различно^ ■ эпидемической значимости ' по типу иммунитета их унесенных фагов. _ • ■" '

Полученные наш; данные позеоляют сделать вывод о.возможности дифференцировать вибрионы эльтор различной' эггздемической значимости по типу иммунитета их" щеренных фагов.' С этой целью ьами была разработана система из 11 тест-культур, 10 из которых полу- . чены путем экспериментальной лизогьнизации реципяектного vet" штамма V.eltor 570 одним, из /меренных фагов1 перечисленных пмму-потппов. Какпая субкультура тест-системы обладает специфической усто/готзсс^ыо к г7К0Л!*<унным умеренным фагам и сохраняет .чувствительность иг-ходного рецитшкггного штамма к. большинству г^-зроп^чунных фагов (см. таблицу). •

Таблица

Определение типа иммунитета умеренного фага вибрионов зльтор по-характеру его. логического 'действия в отношении тест-системы, вкдючахвдей 11- тест-культур штамма V. с!ю1егае 570

субкультура лизоген-на по -фагу им-мунотипа ■ иммунотип .исследуемого фага

I II III IY YI YII YIII IX X . Ai

570 + + + + о. + + + + +

570/41 I + + + + + + + + +

570/70 II - - + + + + + + -t- -f.

570/222Н III + + - ■ + + о. + + + +

570/132 IY + - + + + + +

570/611 YI + + + + - + + t + +

570/893 YII + + + + + - + ■ + + +

570/583 YIII + + + + + + - + + +

570/6901 . IX . -г + + . + - + + * +

57.0/80' X + + + + > + + + - +

570/1554 XI + + + + + + + + + -

Примечание:' "■+" - фаг лизирует культуру тест-систем, - фаг.не лизирует культуру тест-системы

Применяя' разработанный ранее способ определения лизогености штаммов по. фагу в агаровой культуре, можно определять тип иммунитета умеренного'фага у вдентифицируемого штамма зльтор по характеру его литической реакции в отношении субкультур тест-системы. При Этом штаммы, несущие фаги I, II, IV и VI-XI иммукоти-пов, относят к неэпидемическим, а' штаммы, лизогенные по фага# III иммунотипа - к подозрительным на принадлежность i: эндемическим. Последняя группа дифференцируется на vet" и vct~ втамм; по отношению к системе ре-п-лгкцнн-кодификации (Остроумова с со-авт., 19Э0). ■'

Метод дифференциации vet" и vet"1' птаммов вибрионов зльтор по

типу иммунитета их умеренных фагов высоко специфичен, его данные в 100 % случаев коррелируют с результатами генного зондирования культур- на наличие оперона - vetAB. Однако он имеет ряд недостатков, ограничивающих его возможности. Он может бьпь использован для идентификации умеренных фагов одиннадцати известных иммунотипов, которыми разнообразие этих объектов может не исчерпываться. Метод не пригоден для идентификации фагов з поли-лизогенных■системах: Кроме того необходимость использования 11 и более тест-культур делает метод.достаточно громоздким. .

3 этой связи была поставлена цель, упростить-метод, положив в его основу принцип исключения принадлежности умеренного фага исследуемого штамма к III иммунотипу по чувствительности тест-культур V. cholerae eltor 570 и. 570/222Н к его 'логическому действию, вместо ' принципа идентификации иммукотипа фага исследуемого, штамма. » ' ■ - -

Штамм 570 является универсально чувствительным ко всем известным умеренны:»! фагам вибрионов зльтор и служит-контролем .'наличия фага з культуре. Его. субкультура 570/222Н, лизогекная по ?агу III иммунотипа'222Н, обладает устойчивостью к гомокммунньш .тагам III иммунотила и чувствительностью ко всем известным гетерсиммукным фагам вибрионов эльтор как в моно- гак и по:ш-валенткых системах. Ее используют для отличия'фагов . III иммуно-тнпг- б • монолизогенной системе от моно- и полкдизогенных систем фагов дгугих иммунотипов. . Фаги III ¡шмунотипа в .монолизогенной ; системе, взятые в' определенной концентрации,. лизируют субкультуру 570 и не лизируют субкультуру 570/222Н. Фаги других иммунотипов в моно- и полилизогенных системах лизируют обе субкуль-. турк. В основе применения тест-системы лежит. ¡аироко известный метод агаровых слоев.....

3 ходе работы - над методом был разработан способ предварительной концентрации фага и лизегеяных кленов в исследуемом материале и определено-опТимальное разведение фагового материала. позволяющее че."ко определять характер литкческой реакции фага з отноЕекш. тест-культур при идентификации его иммукотипа.

Метод подробно изложен в методических рекомендациях ао его пряуен&низс, утззржденных директором института• "Микроо' 20.12.51.

3 работе ш использовали 58 vet" оиерионоз зльтср :i 12G 7CÍ* пультур того • ;хе биовара.' При этом вся ICO % ver." зтамчез онли пд::ггйфиццроааяы как эпидемические, 63.2 % ята:глсз как :;=-

эпидемические и только 15,7 % vet" культур дали реакцию, характерную для эпидемических вибрионов эльтор. В их число вопли 15,3 % штаммов-, лизегенных по фагу III иммунстшта, и 3,3 -культур, несущих фаг III иммунотипа в комбинации с фагом X иммунотипа. Поскольку фаг X иммунстипа обладает очень слабой литической реакцией, исчезающей при его разведении, то штаммы, несущие этот вариант полилизогекной системы, будут тага;е идентифицированы как .'подозрительные на ' принадлежность к эпидемическим. ■

Таким образом, при выявлении в культуре исследуемого лизогенкого штамма фагев I, II , IV и VI-XI иммунотипоЕ его относят к неэпидемическим, при ■выявлении фагов III иммукгтила штамм откосят - к подозрительным • на принадлежность к. эпидемическим. Окончательное решение' вопроса о происхсхлении таких штаммов может - быть получено при идентификации их на системе рестрикции-модификации (РМ). -Следовательно, совокупное использование этих двух #методов позволяет в 100 % случаев определить эпидемическую значимость исследуемого- лизегенного штамма, при этом -полученные данные в 100 % коррелирует с результатами генного зондирозания культур на наличие сперона vetAB.

- Таким образом, в результате проведенных исследований решены ■все поставленные задачи и достигнута основная цель работы -разработан метод, позволяющий с высокой достоверносткю дифференцировать лизогенные vet" штаммы вибрионов' зльтор ст лиз с генных vct+. культур того ке биозара. В сочеташш. с применением системы рестрикции-модификации .его эффективность равна 100 . Он высокоспецифичен, техничеемг прост, не требует дефицитных реактивов, сложного оборудования, специальной подготовки -персонала.

Результаты- наших исследований позволяют сделать вывод о перспективности использования фаговых методов лабораторной диагностики холеры.

в ы в-о д ы •

1.,Впервые установлено, что неэпидемические вибрионы эльтор являются носителями умеренных фагов II серотипа VIII.иммунотипа, XI серотипа VII, IX и XI иммунстипоа и XII серотипа X иммунотипа. '

2. Разработана тест-система для иммунотипирования умеренных • фагов неэпидемическихвибрионов эльтор, представляющая собой набор монолизогенных субкультур'штамма V. cholerae eltor 570, несущих фаги 10 иммунотипоз. '•' .

3. .Показано,, что серотип и йммунотип:. умеренного фага являются генетической-,меткой внутривидовых вариантов холерных вибри-. онов. Нез.шдемическпа (vet*), вибрионы эльтор являются носителями', умеренных, фагов не менее трех различных серотйпов, которые по типу иммунитета представляют 10 иммуштипов (I-IV/ VI-XI).. Фаги... S кшлунотипс-з (исключая III), специфичны только для, vet "штаммов вибрионов эльтор и.. среди vct+ культур ■этого •ónosapá . не встречаются. Следовательно, тип. иммунитета может быть положен в основу внутривидовой, дифференциации холерных вибриснов.

4. Разработан метод Дифференциации vet" и vet"1" вибрионов эльтор ло типу иммунитета их' умеренных фагов с. помощью -специализированной системы индикаторных' птаммов

5. Обнаружены'и описаны п элили з о г е: лше системы неэпкдемичес-ких вибрионов эльтор." Всего . выявлено ' восемь полилизогеншх комплексов', включающих в различных комбинациях фаги восьми

: различных иммунотипов ,'представляющие три серотипа.

6. Внесены усовершенствования з классификацию фагов холерных вибрионов. Умеренные фаги V. cholerae 01 • отнесены к трем серотипам - II, XI и XII; -внутри серотипа фаги подразделяются на иммунотипы, внутри иммунотипа .-• нр расы.

. . л ■

СПИСОК РАБОТ; ОПУБЛИКОВАННЫХ по ТЕМЕ ДЙСС^-РТАШИ

Í. Остроумоьа' K.M., Караваева Т.Б., Мороз В.П., Грачева И.З. , Коровкина Г.И.. Воробьева Т.В. К разработке системы тест-культур для' определения иммунотипа умеренных фагов неэпидемических вибрионов эльтор // Деп. в ВЙНИТК 12.02.88, М 1211-338. - Реф. з: РЖ Биология. - 1988.. - 9 S55.

2. Коровгеша. Г.И., Мороз В.П., Караваева Т.3.; Адамова Г.З., 1!еньпккова. Л.Г. Способ определения ли.-.огенности штаммов холерных

вибрионов по фагу в агаровой культуре/ Бсесоюз. науч.-исслед. кн-т "Микроб". - Саратов. 1388. - 9 с.-- Бпблиогр.: 12 каэ=. Доп. БКНЙТК 20.04.63, К' 3000-В83. -: Роф. в: РЕ Биолог:?* -1938. - 3 Б315.

3.. Караваева Т.Е., Остроумова Н.М., Мороз В.П., Коровге-ча Г.К., Воробьева Т.З. К разработке скзтеии тест-кул:-.~ур, прггсд-ной для. прсЗсготишроьания 'неэ1»шс««г:есккх виСрисков элпср к дифференциации их по этому признаку ст эпг.декгчлсг-'Л'.х культур т; -гс- уе бйовара // Актуал. вопр. микробкол.-, лаб. даагк. и проФ:-:-лакг. холеры:Тез. Всесс-го. науч. конф. - Ростс-з-н/Д, 19Г.С. - С 187-188.

4. Остроумова Н'.М., Караваева Т.Б., Кудрякова Т.А. . Ксре?.-;?-на Г. И. , Мороз'В. П., Грачева И. В. Умеренные холерные фал: II ;;;-роткла и их значение для внутривидовой дпфферйягкзцн-.: ::г.л :;■::.•-::•: вибрионов 01 ' серовара // Деп. в Е1ШКП1 02.08.89, К" S1S7-E.4?. -Реф. в: PS Биология. - 19S9.', - 12 Ц204.

5. 'Караваева Т.5., Остроумова Н.М., Кудрякова Т.А., Корякина Г.И.., Мороз В.П. Значение умереншх фагов II серэтипа д~-> вкутривэдовой . дифференциации • холерных вибрионов 01 серег-ара /.' Зпндемнол., иккребкол. и ккмувол. бактериал. и вирусах кнф.: Тез. докл. облает, науч. конф. мслодих ученых. - Ростгв-н/Д,

1989. - С.177-179.

6. Остроумова Н.М., Грижебовский' Г.М., Мороз Б.П. , Каракас-га Т.Е.; Брюханов А.Ф.. Коровкина Г.К. Зтамм бактерий Vibrio ohe-lerao' cltor - источник умеренного фага XI серотиг.а 7л г*тс -мунной категории: A.c. .153! 731 СССР МКИ 5С12 N 1/Г0. V. Л\ N 4420314/30-13; Залвл.' 04.05.88. Опубл. 23.03.50. Бок. N .. Открытия: Изобретения. - 1990. - 1- 11. - С. 102.

7.Коровкина Г.П., Караваева Т.Б.. Мороз Б.П., СчTjvyxr •; Н.М., Зининз О.С., Воробьева Т.Е. , Саятгаа Л.В. холерные фаги XII серотипа /Всесоюэ. науч.- исслед.

;гн-т "Микроб". - Саратов, 1990. - 7 с. - Бпблгогр. • 5 v.¿:,t -Деп. в EIUniTK 03.07.90. К 37в0-В90. ■ Реф. в: Гл Биолог:--- -

1990. - 11Б373ДЕЛ. - «

Б. Сгтроумова Н.М., Ксровхшга Г.П., Караваева Т.5. . ч-.т Б.П. , Ксннов II.П. Стомм бактерий Vibrio cholcrao el tor 60 - ;т-ггчг.-.к умеренного фага XII серотипа X гетерснмм/:-::':.": г.."';-: г-::;;: A.c. 1031076 "ССР. MICK С 12 N 7'00. - К 405414:-/13. С-г..-:.--.". o^.Oí.t'P; СггуГсч 91. Бпл. 8 // Открытия. ";.о5ретйг.:'л -

igst. - N 8. - G.72.

9. Караваева Т.Б., Остроумова Н.М., Мороз В.П.. 'Коровкина Г.}!., Зоышз О.С. Семейство умереншх холоршх фагез XI' сероти-' па/ Зсессв». науч. -исслед. противочум. ин-т "Микроб*. - Саратов. 1SG0. - 11 с. - Еиблиогр. : 15 казь. - Дсп. в Е51НИТИ 17.07.SC, N .:'J78 -F20. - Fe:?, в.: PS Биология. - 1931. - I Б385.

'1С., Харазаеса Т.Б. ,' Остроумова Н М., Мороз В.П. , Коровки:» Г.'Л., Зпника О.С. Умеренные холерше фаги XI серотипд // Ген.. улкроб-кол. и совервснствовагеб методов лаб. диагностики особо огл.-ных кн$. ■ Саратов, 1S31. - С. 109-115.

П.' Ксрозкииа Г.Л., Караваева Т.Е., Мороз 5.П., Остроумове. K.M., Заюл-д О.С., Есробьева Т.В.; Сакгаша Л.З. Холерные фагк XII геротипа // Ген., микребиол. и совершенствование методез ;::5. диагностики особо опасных инф. - Саратов, 1991. '- С. 126131.

12. Остроумова H.ü., Караваева Т.Е. Короикина Г.И., Мороз

B.П., Д-згткрев З.М. -К такссгдмяческому положению умеренных <*агов холерных з^брлоцоа- // Ген., микробиол. и совершенствование хетодов лвб. диагностики особо опаешх инф.- - Саратов, 1991. - .

C. 119-123.

13. Остроумова Н.М., Караваева Т.5. Коровкина Г.й., Мороз Н.П., Зигсгла О.С. Пол-длизогенкуо с*лсто:.га неэпидемических в;-,брлсчсв зльтор // 1\.а., мнхгоблол. и соверлелстЕОвание методов, лаб. дишостжи. зеебо опаски: кнф. - Саратов, 1991. -• С. '115119. .

14. Остроумова Н.М., Караваева Т.З., Кудрякова Т'.А.', Ксров-И., Мороз В.П., Грачева И.В, «tarn II серотнпа и их значение д.". вгг/трпз^овой ^^времсвада холерных вибрионов Ol espo-

'// Акт/ал. прсбл. п запа'-ш биохимии, диаги. и иимуйолрофи-;u-:-v:. осе':, ertr.ctt'x.rat. - Саратов, 1SÖ1. - С. -95-102.■

15. iTapCEiiesü Т.Е., Сстроумона К.;«'., Мороз Б.П., Коровника Г.'А. Метод д::^;ерекл/:ац:!к олш'.еккчзехих (vct+> и неэпидемических ' '-"ot" > 'aai-p-i:40b по тллу ;№гуп;г;етп пх умереш.дх фагоз //' •'—üut«j?. yz-2. кг.уч. кенф. (Еспр. эпчде:.к:ол., нлкробдел. и г г^.гп.}. Ic-lG чокС. !Q92r. Ростов-н/ Д. 11-02. - С. 165-

'о. '.'ое 2.Г.. , К.;*сз-:и-:д Г.И.'. Kü;üi>«wBa Т.о., Сстрсууоза

'■ ■ ^ч-.-сЧ ".В. К - -•bo.vTitäi/ic-jTn иагктафилтц-.д vet" зибрконсь -•- •" . пг.л обследованиях' гсдоемое с

помощью, фаговых• методов // Холера: Матер. Рос. науч. конф. (Эоцр. эпкдемиол., микробиол. и лаб. диагн.), 18-19 нояб. 1992 г. - Ростов-н/Д, 1992. - С. 170-171,-