Молекулярно-генетические свойства штаммов холерного вибриона эльтор с различной эпидемической значимостью

Костромитина, Елена Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетические свойства штаммов холерного вибриона эльтор с различной эпидемической значимостью
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические свойства штаммов холерного вибриона эльтор с различной эпидемической значимостью"

КОСТРОМИТИНА Елена Александровна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ШТАММОВ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА ЭЛЬТОР С РАЗЛИЧНОЙ ЭПИДЕМИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТЬЮ

03.00.07 - микробиология 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов2004

Работа выполнена в Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Н. И. Смирнова доктор медицинских наук, профессор В.В. Кутырев

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук А.А. Филиппов доктор биологических наук Е. И. Кацы

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Российской академии медицинских наук

Защита состоится « _2_» марта 2004 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по присуждению ученой степени доктора (кандидата) наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" Министерства здравоохранения Российской Федерации (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

Автореферат разослан «29» января 2004 г.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РосНИПЧИ "Микроб".

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Г.А. Корнеев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Заболеваемость холерой, входящей в группу карантинных инфекций с диарейным синдромом, регистрируется на всех континентах мира. В 1961г. началась седьмая пандемия холеры Эль-Тор, которая по продолжительности во времени и числу охваченных стран превышает каждую из шести предшествующих [Москвитина Э.А. с соавт., 2003]. Сведения о регистрации на территории России в 1999-2002 гг. крупных эпидемических вспышек (Дальний Восток, 1999; Казань, 2001) и спорадических случаев холеры (Челябинск, 2000; Волгоград, 2001; Калмыкия, 2002) [Онищенко ГГ., 2000-2002; Москвитина Э.А. с соавт., 2003] обусловливают большой интерес исследователей к этой инфекции.

(1970-1975 гг.). Весьма недостаточно данных об изменении структуры генома штаммов при попадании их в водную экосистему. Кроме того, появление атипичных по патогенным свойствам изолятов, которые часто выделяются из воды поверхностных водоемов и при определенных условиях могут вызывать спорадические заболевания холерой у людей, требует более тщательного изучения не только их фенотипических свойств, но и генетической организации, которое до начала нашей работы практически не было проведено.

До сих пор в литературе имеются разноречивые сведения об эволюционных связях и генетическом родстве эпидемически опасных, безопасных и атипичных штаммов холерного вибриона эльтор. Это указывает на необходимость гено-типирования штаммов, выделенных на территории бывшего СССР. Полученные данные будут полезны не только для фундаментальных исследований, но и для проведения более эффективного эпидемиологического мониторинга.

Несмотря на то, что ПЦР и ДНК-гибридизация позволяют быстро и эффективно оценить диагностическую значимость холерных вибрионов, эти методы требуют наличия в диагностических лабораториях дорогостоящего оборудования. В то же время в 1996 г. Н.М. Остроумовой были подобраны фаги ctx+ и ctx-, чувствительность к которым и гемолитическая активность позволяли выявлять эпидемически опасные и неопасные штаммы V.cholerae биовара эльтор [Кокушкин A.M. с соавт., 1998]. Те не менее, к началу нашей работы данные о сравнительной оценке диагностической значимости простого и дешевого метода, основанного на применении указанных фагов, и ПЦР-анализа отсутствовали, что послужило основанием для проведения соответствующей работы и определения состава генов вирулентности в каждой из трех групп штаммов, отнесенных по чувствительности к фагам к эпидемически опасным, безопасным и требующим дополнительных исследований.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - сравнительный анализ структуры генома штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор, выделенных от больных, вибрионосителей и из объектов окружающей среды на разных территориях.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. С помощью комплексного ПЦР-тестирования 13 различных генов и генных «блоков» выявить различия в структуре генома штаммов V.cholerae биовара эльтор, изолированных от больных, носителей и из объектов окружающей среды на территории Поволжья и Туркменистана.

2. Выявить закономерность изменения генома штаммов холерного вибриона эльтор, обитающих в воде открытых водоемов и организме носителей в межэпидемический период.

3. Провести ПЦР- и риботипирование штаммов V.cholerae биовара эльтор, выделенных из различных источников на территории Поволжья и Туркменистана, с целью выявления их генетического родства.

4. Изучить молекулярно-генетические особенности атипичного штамма V.cholerae биовара эльтор, выделенного от больного холерой.

5. Провести сравнительный анализ эффективности фагового метода (фаги ctx+ и ctx-) и ПЦР при дифференциации штаммов V.cholerae биовара эльтор по

эпидемической значимости.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Для выяснения структуры генома холерных вибрионов с различной эпидемической значимостью впервые проведен комплексный ПЦР-анализ 186 штаммов V.cholerae биовара эльтор, выделенных из различных источников на территории Поволжья и Туркменистана в эпидемически благополучные и неблагополучные по холере годы. Выявлено присутствие (или отсутствие) 13 генов, расположенных как на эволюционно древней части хромосомы (гены жизнеобеспечения), так и на пяти МГЭ, выполняющих различные функции. Установлено, что клинические штаммы и ряд изолятов, выделенных от носителей во время вспышек холеры, представлены генетически однородной популяцией и содержат набор всех тестируемых генов, относящихся как к стабильным генам жизнеобеспечения (hapA, toxR, гХA), так и генам патогенности и пер-систенции, расположенным на МГЭ: СТХф (с1хА, 10^ асе), RS1ф) (^С), УР1 ОсрА, аМА, toxT), ЕР1 (mshQ), (папН), а также последовательности attRS. Вибрио-

ны, изолированные в межэпидемический период из воды поверхностных водоемов и от вибрионосителей, характеризуются выраженной вариабельностью генома за счет утраты различных по размерам и функциям фрагментов ДНК. Показано, что процесс потери генов имеет определенную последовательность. Наиболее нестабильными являются гены вирулентности, входящие в состав профагов СТХф и Я81ф. Обнаружен ген ^арА), наследуемый клеткой в 100 % случаях независимо от среды обитания вибрионов.

Приоритетное значение имеют данные рибо- и ПЦР-типирования 29 штаммов V.cholerae биовара эльтор с различной эпидемической, значимостью, выделенных на территории Поволжья и Туркменистана, с целью изучения генетического родства между ними. Показано, что использованные методы молекулярного типирования позволяют дифференцировать холерные вибрионы эльтор на три группы: эпидемически опасные, авирулентные и нетоксигенные штаммы, сохранившие часть генов вирулентности. Установлено, что вибрионы последней группы имеют генетическое родство как между собой, так и с вирулентными штаммами.

подтверждающий

его эпидемическую безопасность. В результате ПЦР-типирования с двумя «случайными» праймерами установлено, что по структуре генома данный штамм отличается как от вирулентных, так и от нетоксигенных эльтор вибрионов.

Впервые получены сведения о присутствии генов hapA, сЫА, ^рА и toxR, генетических маркеров эпидемически опасных штаммов, в хромосоме 142 штаммов V.cholerae биовара эльтор, выделенных на территории Поволжья, Дагестана, Туркменистана, Узбекистана, Сибири и Приморья в период с 1965 по 2002 гг.,

эпидемическая значимость которых была определена фаговым методом. Установлено, что результаты фагового теста и ПЦР-анализа при оценке эпидемической значимости 460 штаммов холерных вибрионов биовара эльтор совпадают в 97 % случаев, что указывает на высокую диагностическую ценность холерных бактериофагов ctx+H ctx". Лизис фагом сЛх+в 93,8 % случаев штаммов, содержащих ген tcpA, позволяет полагать, что пили TCP могут служить рецептором для данного фага.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. По результатам работы составлены методические рекомендации: «Мультиплексный ПЦР-анализ для идентификации штаммов Vibrio cholerae eltor и определения их эпидемической значимости» и «Риботипирование штаммов Vibrio cholerae», которые одобрены Ученым Советом (протоколы № 7 от 3 июля 2002 г. и № 9 от 18 декабря 2003 г.) и утверждены зам. директора Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб».

Депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" три штамма V. cholerae биовара эльтор с различным набором основных генов патогенности ctxA, tcpA, toxR и неодинаковой чувствительностью к новым холерным диагностическим бактериофагам а также шесть штаммов

V.cholerae биовара эльтор, имеющих различные генотипы по данным ПЦР-тестирования 13 генов патогенности. Указанные штаммы могут быть использованы в прикладных и фундаментальных исследованиях.

Данные о структуре генома 186 штаммов V.cholerae биовара эльтор с различной эпидзначимостью предназначены для использования Государственной коллекцией патогенных бактерий «Микроб» при молекулярно-генетической паспортизации штаммов, циркулирующих на разных территориях России.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Геном клинических штаммов V.cholerae биовара эльтор, выделенных на. разных территориях и в различные годы, стабилен и содержит три ПЦР-тестированных гена жизнеобеспечения (hapA, toxR, rtxA), девять генов вирулентности (ctxA, zot, асе, rstC, tcpA, aldA, toxT, nanH, mshQ), входящих в состав мобильных генетических элементов, а также нуклеотидную последовательность attRS.

2. В водной экосистеме геном значительной части популяции вирулентных клонов претерпевает изменения за счет утраты различных фрагментов ДНК, кодирующих продукцию ключевых факторов патогенности. Делеции генных блоков происходят в определенной последовательности: СТХф (ctxA, zot, асе) и RS1a сrstC) VPI (tcpA, aldA, toxT) -> VPI-2 (nanH).

3. Геном «водных» вибрионов содержит гены жизнеобеспечения {hapА, toxR, rtxA) и, в ряде случаев, гены «острова персистенции» (mshQ) и нуклеотид-ную последовательность attRS. Значительные различия между геномамиувирулент-ных и «водных» вибрионов исключают возможность приобретения последними генов патогенности.

4. По данным рибо- и ПЦР-типирования эпидемические штаммы холерных вибрионов, выделенные от больных во время разных вспышек холеры на терри-

тории Туркменистана и Поволжья, имеют клональное происхождение. Обнаруженные нетоксигенные вибрионы эльтор, сохранившие ряд генов вирулентности, имеют генетическое родство с эпидемически опасными штаммами, тогда как «водные» вибрионы представляют самостоятельную гетерогенную популяцию.

5. Атипичный штамм V.cholerae биовара эльтор, выделенный от больного холерой в Челябинске (2000 г.), имеет генотип: ctxÄ~ zof асе' sf tcpÄ~ toxT aldA' nanH~rstC attRS* toxR* hapA* rtxA* mshQподтверждающий его эпидемическую безопасность. По данным генотипирования указанный штамм не имеет сходства ни с клиническими, ни с нетоксигенными вибрионами, выделенными из воды открытых водоемов. Тем не менее, при условии резко сниженного иммунитета у макроорганизма, штаммы холерного вибриона, лишенные ключевых факторов патогенности, могут вызывать холерогенный синдром за счет активной продукции дополнительных токсинов (гемолизин, RTX-токсин).

6. Сравнительная оценка диагностической ценности ПНР и холерных бактериофагов ctx+ И Ctx", проведенная при анализе 460 различных штаммов V.cholerae биовара эльтор, указывает на высокую эффективность простого и дешевого метода, основанного на использовании холерных диагностических фагов

при определении эпидемической значимости эльтор вибрионов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены и представлены на научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2001, 2002, 2003); Проблемной комиссии межведомственного научного совета по санитарно-эпидемической охране территории-РФ (Ростов-на-Дону, 2002); научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» (Москва, 2002); 4-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003).

ПУБЛИ КАЦ И И. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 304 цитируемых работ, из них 190 зарубежных. Общий объем диссертации составляет 163 страницы. Текст иллюстрирован 17 таблицами и 22 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы. В работе использовали 465 штаммов V. cholerae 01 и 0139 серогрупп. Применяли общепринятые методы культивирования бактерий и анализа их фенотипов. Изучение продукции фосфолипазы проводили по N.H. Tan, C.S. Tan (1988), растворимой гемагглютинин/протеазы (НАР) - по R.A. Finkelstein et al. (1992), гемолизина - по A.M. Svennerholm et al. (1983), MSHA - по методу L.P. Hanne, R.A. Finkelstein (1982). Чувствительность культур

к холерным фагам определяли методом агаровых слоев по Грация [Лабораторная диагностика холеры, МУ 4.2, 2002]. Вирулентность штаммов определена по N.K. Dutta и M.K.Habbu (1955). Выделение ДНК и ДНК-ДНК гибридизацию по Саузерну проводили по Т. Маниатис с соавт. (1984). Для генотипирования использовали блот-гибридизацию Bgll-рестриктов исследуемой ДНК с зондом на гены 16S рРНК и ПЦР-типирование с «универсальными» праймерами. Детерминанты вирулентности выявляли с помощью ПЦР с праймерами на фрагменты соответствующих генов.

Результаты исследований.

1. Вариабельность структуры генома штаммов V.cholerae биовара эльтор, выделенных от больных, вибрпоносителей и из внешней среды на разных территориях. На первом этапе с помощью ПЦР проведены эксперименты по анализу структуры генома клинических штаммов, выделенных во время вспышек холеры, зарегистрированных в разное время (1969 г., 1970-1975 гг.) на географически удаленных территориях - Поволжье и Туркменистане. Установлено, что изученные клинические штаммы являются генетически однородными, геном которых содержит все тестируемые гены, относящиеся к двум функционально разным группам (рис.1, табл.1). Поскольку эти вибрионы могут существовать не только в организме хозяина, но и вне его, то их геном, как и других «свободножи-вущих» бактерий, содержит набор генов, продукты которых обеспечивают метаболическую возможность адаптироваться к условиям обитания в водной среде. К

М * • 12

¿т т

Рис.1. ПЦР-тсстирование клинического штамма V.cholerae M1023 биовара эльтор на наличие в его геноме генов вирулентности. 1 - rstC; 2 - attRS; 3 - toxR; 4 - hap A; 5 - rtxA\ 6 - z,ot, 7 - ace; 8 - aldA; 9 - mshQ; 10 - ctxA; 11 - tcpA clas; 12 - tcpA El Tor; 13 - toxT; 14 - nanH; M - маркер молекулярных масс GeneRulerTM50bp DNA Ladder.

такому типу относят гены жизнеобеспечения hapA, toxR, rtxA, а также «остров персистенции». Вторая черта клинических штаммов связана с наличием в их геноме специфических МГЭ, контролирующих синтез факторов вирулентности. К их числу относят два профага - СТХф, К52ф и два «острова патогенности»- УР1,

УР1-2, без которых реализация типичного инфекционного процесса при холере невозможна.

Таблица 1. Распространение генов жизнеобеспечения и генов вирулентности среди штаммов У.екакгае биовара эльтор, выделенных в эпидемически неблагополучный период в Поволжье и Туркменистане._

Региои Источник Кол-во штаммов Присутствие ПЦР-тестированных генов в геноме штаммов

1 и к» асе О С tcpA aldA íoxT ¡5 1 s: aííRS i toxR ItapA

Поволжье (22 штамма) Больные 6 + + + + + + + + + + + + +

Носители 2 + - + + +

Внешняя среда 7 + + + + + + + + + + + + +

3 + + + +

2 + + + +

2 + + +

Туркменистан (27 штаммов) Больные 11 + + + + + + + + + + + + +

1 - + + - +* + + + - + + + +

Носители 4 + + + + + + + + + + + + +

1 + - + + +

1 + +

Внешняя среда 5 + + + + + + + + + + + + +

2 + + + + +

2 + + + +

Примечание. * - ген tcpA классического биовара

Уникальность клинических штаммов состоит также в стабильном наследовании ими обеих групп генов в условиях in vivo. По всей вероятности функция этих генов абсолютно необходима холерным вибрионам как для адаптации в организме хозяина, так и для проявления ими патогенности. Однородность клинических штаммов по составу изучаемых генов, возможно, также обусловлена и относительно одинаковыми условиями их существования в данной экологической нише.

Лишь один клинический штамм (2223), выделенный в 1972 г. в Туркменистане (табл.1), отличался от других по следующим свойствам: а) имел неполную «кассету вирулентности» профага СТХф, утратив ген ctxA, но сохранив гены двух других токсинов Zot и Асе, б) структура гена tcpA была иной, чем у вибрионов эльтор, но имела гомологию с таковой гена tcpA классических вибрионов, в) утратил ген mshQ и, следовательно, видимо, «остров персистенции». Эти данные

говорят о том, что штамм претерпел значительные генетические изменения в процессе эпидемии. Наибольший интерес, с нашей точки зрения, представляло появление у него признаков холерного классического вибриона (структура гена tcpA), поскольку природные штаммы вибрионов эльтор с комбинированными свойствами возбудителей двух биоваров недавно описаны [Nair G.B. et al, 2002].

Смена эпидемического периода на межэпидемический не сопровождается полным исчезновением холерных вибрионов, поскольку этот вид способен существовать и в водных экосистемах. Известно, что длительное пребывание вибрионов во внешней среде обусловливает их гетерогенность. При анализе структуры генома 111 штаммов, выделенных в межэпидемический период в Туркменистане и Поволжье (табл.2), впервые получены генетические доказательства существования трех групп штаммов: 1) вирулентные вибрионы, которые сохраняются в межэпидемический период, хотя доля таких штаммов в общей популяции вибрионов, циркулирующих в водной экосистеме невелика (3,6 %); 2) нетоксигенные вибрионы, производные вирулентных, поскольку в их геноме сохранился ряд генов вирулентности, относящихся к генетическим маркерам эпидемически опасных штаммов. Так, 78,2 % из них имели VPI, в геноме ряда штаммов присутствовал неполноценный СТХф, утративший гены ctxAB, но сохранивший z,ot и асе. Более того, в геноме всех указанных штаммов присутствовал VPI-2 (папН), который в настоящее время стал считаться еще одним генетическим маркером эпидемически опасных штаммов [Jermin W.S., Boyd E.F., 2002]; 3) непатогенные «водные» вибрионы эльтор, составившие значительную часть популяции (75,7 %), в хромосоме которых были лишь гены жизнеобеспечения, attRS-сдмт (у 71,4 % штаммов), а из МГЭ - «остров персистенции» (в 58,3 % случаев). Выявлены заметные различия в структуре генома штаммов, обусловленные различными экологическими условиями существования холерных вибрионов на двух исследуемых территориях. Оказалось, что штаммов, производных от эпидемически опасных вибрионов, в Туркменистане обнаружено значительно больше (32 %), чем в Поволжье (7,5 %), при этом геном 80,6 % из них содержал VPI с генами основного фактора колонизации, что полностью согласуется с полученными ранее результатами ПЦР-анализа [Челдышова Н.Б., 2002] и данными эпидемиологов о развитии в 70-80 гг. на территории Туркменистана своеобразного эпидемического процесса, характеризующегося выделением из объектов внешней среды слабовирулентных холерных вибрионов и высоким уровнем вибрионосительства [Анисимов П.И. ссоавт., 1981].

Редукционный характер изменчивости генома вибрионов, обитающих в водной среде, свидетельствует о том, что микроорганизмы используют все возможные молекулярные механизмы, чтобы их геном освобождался от последовательностей ДНК, не нужных для жизни клетки в водных экосистемах. Маловероятно, что такие преобразования генома холерных вибрионов вредны для них. Скорее всего вибрионы в водной среде подвергаются действию какого-то отбора, направленного на освобождение их генома от генов и генных блоков, не нужных им для существования в этой экологической нише. Таким образом, анализ полученных данных о составе тестируемых генов в хромосоме изучаемых штаммов

указывает на четкие отличия в наборе генов и генных блоков между клиническими и непатогенными штаммами, обитающими в водной среде.

Таблица 2. Распространение генов жизнеобеспечения и генов вирулентности среди штаммов У.сШегае биовара эльтор, выделенных в межэпидемический период от носителей и из объектов внешней среды на территории Туркменистана.

а- Кол-во штаммов Генотип штаммов по данным ПЦР-тестирования

В" е и ОхА zot асе м/С /срА 1 в ЮхТ ¡5 с в О! "1 аПШ ГЬсА ЮхИ И ар А

1 - + + - - + + + + + + + +

3 - - - + + + + + + + + + +

7 - - - - + + + + + + + + +

5 4 - + + + + +

н я 1 + + _ + +

о К 2 - - - - - - - - + - - + +

3 + + +

1 - + + +

1 - + +

2 + + + + + + + + + + + + +

1 + + + + + + + + - + + + +

2 - + + + + + + + + ■ + + +

2 - + + - - + + + + + + + +

12 - - - - + + + + + + + + +

1 _ _ + + + + + _ + +

§ <и 2 - - - - - + + + + + + + +

п. о 1 + + + -+ + +

(Я 5 21 _ + + + + +

3 8 - + - + + +

ш X т 1 + + - + +

3 + + +

11 + + + +

1 + + +

3 _ + - + +

2 + +

1 +

Новыми являются данные об обнаруженной закономерности в изменении структуры генома штаммов, циркулирующих в водной экосистеме. Установлено, что вирулентные вибрионы, попав в водную среду, в первую очередь утрачивают генетическую основу их вирулентности - весь СТХ-генетический элемент (в 66,7% случаев) или только гены с1хЛВ (у 18,5 % штаммов), что не противоречит

данным других исследователей о возможной делеции отдельных генов «кассеты вирулентности» [Kurazano H. et al, 1995; Монахова Е.В. с соавт., 1999; Pourshafie M.D., et al, 2000; Челдышова Н.Б., 2002; Li M. et al, 2003]. Генетические перестройки в геноме профага СТХф, который у клинических штаммов включен в хромосому стабильно, с общебиологических позиций представляют самостоятельный интерес. Ранее было принято считать, что указанная «кассета вирулентности» неделима и входящие в ее состав гены ctxAB, zot и асе могут быть делети-рованы (или амплифицированы) как одна генетическая единица [Sears S.L. et al, 1996; Colombo M.M. et al, 1997]. Однако оказалось, что у ряда штаммов могут отсутствовать гены ctxAB. Избирательность утраты генов ctxAB из профага СТХф вряд ли является случайным событием. Возможно, эти факты служат подтверждением высказанного предположения E.F. Boyd et al. (2001), что предшественником фага СТХф (или рге СТХф) мог быть бактериофаг с генами zot и асе, но без оперона ctxAB. И только впоследствии на каком-то этапе эволюции этот фаг приобрел гены ctxAB от неизвестного донора, которые при определенных условиях существования вибрионов становятся нестабильными.

Важно отметить, что утрата «кассеты вирулентности» сопровождается потерей другого «блока вирулентности» - профага ЯБЦ, который ограничивает СТХф с обеих сторон и присутствует у всех эпидемически опасных вибрионов эльтор. Следующий этап изменения генома вибрионов в природных водоемах связан с утратой или делецией второго абсолютно необходимого для реализации вирулентных свойств генного блока - «острова патогенности» (VPI), который оказался более стабильным, чем профаги, сохраняясь в геноме 85,2 % вирулентных вибрионов и их производных. Вместе с тем обнаружены штаммы, содержащие дефектный VPI, лишенный гена tcpA, который кодирует биосинтез основной субъединицы пилей TCP, но сохранившие гены aldA, toxT. Вибрионы с генотипом ctxA~tcpA~ являются эпидемически безопасными, поскольку невозможна колонизация ими тонкого кишечника и развитие диареи. Тем не менее, определенная часть таких вибрионов ранее были вирулентными, так как в их геноме присутствует VPI-2, являющийся генетическим маркером эпидемических штаммов. Ген «острова персистенции» mshQ наследовался стабильно и присутствовал в хромосоме 96,3 % штаммов. Что касается генов жизнеобеспечения (hapA, toxR, rtxA) и последовательности attRSl, то они наследовались в 100 % случаев. Дальнейшее изучение структуры генома штаммов, полностью утративших все блоки вирулентности и поэтому отнесенных нами к 3-й группе, генетически не связанной с вирулентными вибрионами, позволило выяснить, что наиболее стабильными оказались видоспецифический ген hapA и регуляторный ген toxR, которые имелись соответственно у 100 % и 97,0 % штаммов.

2. Молекулярное типирование штаммов холерных вибрионов эльтор, выделенных из различных источников и на разных территориях. Выраженные отличия в структуре генома вибрионов различной эпидемичности ставит вопрос об их генетическом родстве. Для его решения мы использовали молекуляр-но-генетическое типирование, в основе которого лежало два методических подхода: риботипирование, основанное на ДНК-ДНК гибридизации со специфиче-

ским зондом для выявления в большой хромосоме холерных вибрионов генов ггп [Stull Т. L. et al., 1988; Lan R., Reeves P. R., 1999; Ерошенко ГА. с соавт., 2002], кодирующих биосинтез рибосомальной РНК (рис.2), и ПЦР-типирование - амплификации ДНК с использованием олигонуклеотидных праймеров, созданных на основе различных нуклеотидных последовательностей [Шагинян И.А., Першина М.Ю., 1997; Olive D.M., Bean P., 1999] (рис.3). В качестве модельных использовано 29 штаммов из указанных выше групп, выделенных на территории Поволжья (15 штаммов) и Туркменистана (14 штаммов)

Распределение генов ггп (риботип) в хромосоме изолятов V.cholerae анализировали с помощью гибридизации Bgll - рестриктов хромосомной ДНК со специфическим зондом на высококонсервативные гены 16S рРНК, которые у разных клонов одного и того же вида могут располагаться в разных участках хромосомы. Данные риботипирования 3-х клинических штаммов, изолированных в Туркменистане, указывают на идентичный профиль гибридизации 2-х из них. Выявлено 6 фрагментов ДНК размером 6,2; 5,1; 4,9; 4,4; 3,7; 1,4 т.п.н. (рис.2А, дорожки 1,2). Что касается клинического штамма 2223, то появление у него двух дополнительных фрагментов размером 4,2 и 0,8 т.п.н., гибридизирующихся со специфическим зондом (рис.2А, дорожка 3), по-видимому, связано со структурными изменениями профага СТХф (утрата гена ctxA при сохранении zot и асе) и возможной потерей острова персистенции (EPI). Нетоксигенные штаммы, выделенные от носителей и из природных водоемов в межэпидемический период и сохранившие в геноме полноценный (643, 126, М693, Ml 194, М1244, М1215), либо дефектный (М1071) VPI, кодирующий продукцию основного фактора колонизации, а также VPI-2 по данным риботипирования были гомологичны и имели семь фрагментов, из которых шесть (размером 6,2, 5,05, 4,9, 4,4, 3,7 и 1,4 т.п.н.) не отличались от таковых клинических штаммов (рис.2А, дорожки 6-10, 12). Незначительное различие между двумя указанными группами штаммов, обусловленное появлением дополнительного фрагмента размером 0,8 т.п.н. (рис.2А, дорожки 6-10, 12), либо 10,4т.п.н. (рис.2А, дорожка 5) подтверждает наше предположение, что эти штаммы являются производными клинических, утратившими при обитании в новой экологической нише ряд генов или генных блоков вирулентности. Авирулентные штаммы 461, М691, Ml309, выделенные нами по данным ПЦР-тестирования в третью группу (из-за потери двух профагов и двух островов патогенности, в состав которых входят ключевые гены вирулентности), по профилю гибридизации заметно отличаются как друг от друга, так и от клинических (первая группа) штаммов (рис.2А, до-рожки 11,13,14). Различия по 4 - 7 фрагментам размером от 0,8 до 6.2 т.п.н. нельзя не признать существенными, что, возможно, отражает отсутствие эволюционной связи между вибрионами первой и третьей группы.

Риботипирование 15 штаммов, выделенных из разных источников в другом регионе - Поволжье - показало, что картина гибридизации является идентичной практически у всех клинических штаммов, изолированных в разные неблагополучные по холере годы - 1970, 1971, 1974 (рис.2Б, дорожки 2, 3, 5-7). Лишь у вирулентного штамма М915 был выявлен дополнительный фрагмент размером 7,2 т.п.н. (рис.2Б, дорожка 4). В то же время картина гибридизации авирулентных

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 М(п.)

__ __ ■•—21226

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15 16 М(п.н.)

-—21226

Рис. 2. Результаты риботипирования штаммов V. еко1вгав биовара эльтор, выделенных на территории Туркменистана (А) и Поволжья (Б), с зондом на гены 168 рРНК. А. 1 -М1023; 2 - М698; 3 - 2223; 4 - 2353; 5 - 643; 6 - 126; 7 - М693; 8 - М1 194; 9 - М1244; 10-М1215; 11-461; 12-М1071; 13-М691; 14-М1309; 15, 16-контрольные штаммы Р-16064 {V.еко1вгав 0139) и 569В {у.еко1вгав классического биовара); Б 1 - контрольный штамм V. екокгав КУ79 биовара эльтор, выделенный до 7-й пандемии холеры; 2 -М890; 3 -М899; 4-М915; 5-М574; 6-М1067; 7- М592; 8-В91; 9-В100; 10 -М995;11-5978/1;12-Р-6668/1;13-Р-8184;14-Р-8182;15-М1399;16-М1395.М - маркер молекулярных масс (ЕсоМ+НМЕЛ-фрагметы ДНК фага X).

штаммов (третья группа), изолированных из открытых водоемов на той же территории в период эпидемии (1972 - 1974 гг.), имела четкие отличия (по 4-7-и фрагментам размером от 0,8 до 6.2 т.п.н.) от таковой с клиническими штаммами. Кроме того, эти «водные» вибрионы по структуре генома представляли собой неоднородную группу, поскольку почти для каждого штамма был характерен свой профиль гибридизации (рис. 2Б, дорожки 8-14). В связи с выявленной закономерностью, важное значение имеет тот факт, что два нетоксигенных штамма (М1399 и М1395), изолированных из внешней среды через 6-7лет после последней вспышки холеры в Поволжье, имели очень сходный профиль гибридизации с клиническими штаммами 1970-1971гг., отличаясь от них лишь одним дополнительным фрагментом размером 0,8 т.п.н. (рис. 2Б, дорожки 15, 16). Эти результа-

ты в совокупности с данными о присутствии в их геноме двух островов патоген-ности (VPI и VPI-2) указывают на то, что названные штаммы являются производными вирулентных.

Для подтверждения данных о генетических связях названных штаммов на следующем этапе работы мы провели их ПЦР-типирование с использованием праймеров на вариабельный тандем фага М13, обозначенных как pS [Beech I. et al, 1998; Савостина Е.П. с соавт., 2004]. Оказалось, что у всех вирулентных штаммов, выявлялось четыре ампликона размером 0,46; 0,59; 0,65 и 1,22 т.п.н. Кроме того, такое же распределение фрагментов имелось у нетоксигенного штамма 126, изолированного от носителя в Туркменистане в 1966 г. до начала вспышки холеры в 1969 г., хотя из-за утраты профага СТХф он имел явно иную генетическую организацию. Большинство штаммов из второй группы (75,0 %), выделенных из обоих регионов, отличались от вирулентных отсутствием одного мажорного ампликона размером 1,22 т.п.н. Вместе с тем, штаммы из этой группы были неоднородны, поскольку два (25,0 %) из них (643 и Ml 194) отличались от вирулентных наличием дополнительного ампликона размером 1,85 т.п.н.. Что касается авирулентных штаммов из третьей группы, то они представляли собой гетерогенную популяцию, 60,0 % клонов которой сохранили лишь два ампликона размером 0,65 и 0,59 т.п.н. являющихся, видимо, видоспецифическими, так как они имелись у всех изученных вибрионов независимо от вирулентности, серо-группы или биовара. Часть клонов (20,0 %) характеризовались присутствием дополнительного ампликона размером 1,73 т.п.н. Таким образом, ПЦР-анализ с помощью праймеров pS показал возможность его использования для дифференциации всех трех групп выделенных штаммов: вирулентных, нетоксигенных, сохранивших отдельные гены и (или) генные блоки вирулентности и авирулентных. При этом структура генома клинических штаммов была одинакова, несмотря на то, что они были выделены во время разных эпидемических вспышек.

При дальнейшем поиске праймеров, позволяющих эффективно проводить типирование штаммов холерного вибриона различной эпидемической значимости, мы остановились на прайм ере 1281, сконструированном на основе произвольных нуклеотидных последовательностей [Makino S.I. et al, 1995; Chakraborty S. et al, 2001; Mukhopadhyay A. K. et al, 2001; Sinha S. et al, 2002]. Результаты проведенных экспериментов полностью согласуются с данными, полученными при риботипировании и ПЦР-типировании с праймерами pS относительно кло-нальности всех изученных клинических штаммов. Эти изоляты, выделенные на территории как Туркменистана, так и Поволжья, имели шесть ампликонов размером от 0,32 до 0,94 т.п.н., два из которых были мажорными (фрагменты размером 0,39 и 0,76 т.п.н.) (рис.3А, дорожки 1-6, рис.ЗБ, дорожки 1, 2). Идентичная картина распределения ампликонов была также обнаружена у трех нетоксигенных штаммов из Туркменистана (2223, 643 и Ml071), выделенных, соответственно, от больного, носителя и из внешней среды в разные годы (рис.3А, дорожки 3, 5, 12). Мы пока не имеем данных, объясняющих эти результаты. Можно лишь предположить, что определенная доля вибрионов, утративших полностью (ctxA-zot-асв) или частично (ctxA'z,ot+ace+) профаг СТХф, в действительности принадле-

жит к генетически однородной популяции вирулентных вибрионов, а имеющиеся особенности в структуре их генома используемый нами методический прием не позволяет обнаружить. Что касается остальных изучаемых нетоксигенных вибрионов, изолированных из воды природных водоемов в Туркменистане, то эти штаммы в 83,3 % случаев генетически однородны и отличаются от вирулентных присутствием двух дополнительных ампликонов длиной 0,48 и 1,24 т.п.н. (рис.ЗА, дорожки 6-10). В то же время с помощью этого метода удалось выявить различия в структуре генома между нетоксигенными штаммами с одинаковым набором тестируемых генов, выделенных из разных регионов.

*■> rt -i

; * >/,tri*с?-**'*** »r -f

4 л 4 Ш 1031

м» 900

Ян* SD0

mm 7D0

1ЫШ 600

ч м 500

3 Т. 400

шт ** 300

• » 250

Рис. 3. Результаты RAPD-ПЦР с праймером 1281 штаммов V. cholerae биовара эльтор, вьщеленных на территории Туркменистана (А) и Поволжья (Б). А. 1 - Ml 023; 2 - М698; 3 - 2223; 4 - 2353; 5 - 643; 6 - 126; 7 - М693; 8 - Ml 194; 9 - М1244; 10 - М1215; 11 -461; 12 - М1071; 13 - М691; 14 - М1309; 15, 16 - контрольные штаммы RV79 и 569В. Б. 1 - М890; 2 - М899; 3 - М915; 4 - М574; 5 - М1067; 6 - М592; 7 - В91; 8 - В100; 9 -М995; 10-5978/1; 11-Р-6668/1; 12-Р-8184; 13-Р-8182; 14-М1399; 15-М1395; 16, 17 - контрольные штаммы RV79 и 569В. М - маркеры молекулярных масс (GeneRul-erTM50bp DNA Ladder и ЕсоШ+НЫШ-фрагменты ДНК фагаХ).

3. Молекулярно-генетические свойства атипичного штамма У.ско1егае биовара эльтор. Согласно общепринятой точке зрения, реализация патогенных свойств холерного вибриона в организме восприимчивого хозяина требует присутствия у этого микроба целого ряда факторов вирулентности, среди

которых ключевыми являются основной фактор колонизации (пили TCP) и холерный токсин. Вместе с тем известны случаи инфицирования людей холерными вибрионами, лишенными известных факторов вирулентности [Rodrigue D. С, et al, 1994; Saha P. et al, 1996; Савельев В.Н., 1998; Pal A. et al, 1999; Кюрегян А.А. с соавт., 2001, Москвитина Э.А. с соавт., 2003; Pichel M. et al, 2003]. Среди них наибольший научный и практический интерес представляет атипичный по детерминантам вирулентности штамм V.cholerae биовара эльтор серовара Инаба, выделенный в 2000 г. в Челябинске от больного холерой, который в течение многих лет страдал гормонозависимой бронхиальной астмой и хроническим гастритом со сниженной секреторной функцией [Ратникова Л.И., Кузьмина Н.Я., 2002; Крив-дина Т.М. с соавт., 2003]. По морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам этот штамм не отличался от типичных вибрионов эльтор, но был не-токсигенным, поскольку в его геноме по данным ПЦР не было структурного гена ctxA. Вместе с тем, несмотря на отсутствие продукции холерного токсина, этот штамм вызвал у больного развитие типичного при холере инфекционного процесса: наблюдалась выраженная слабость, частый жидкий водянистый стул, имеющий вид рисового отвара, многократная рвота, судороги в мышцах конечностей [Ратникова Л.И., Кузьмина Н.Я., 2002]. Поскольку в основе любого инфекционного процесса лежат сложные взаимоотношения между макро- и микроорганизмом, при которых факторы вирулентности патогена, действуя на защитный механизм хозяина, нарушают его, вызывая заболевание [Туйгунов М.М. с соавт., 2003], то, безусловно, возникает необходимость детального анализа структуры и функции генома этого вибриона.

Результаты проведенного нами комплексного ПЦР-тестирования показали отсутствие у данного штамма не только генов ctxA, zot и асе, локализованных на профаге СТХф, но и гена st, отвечающего за продукцию термостабильного токсина, иногда встречающегося у штаммов V.cholerae биовара эльтор [Pal. A. et al, 1992; Dalsgaard A. et al, 1995; Sears C.L., Kaper J.B., 1996; Vicente A.C.P. et al, 1997; Singh D.V. et al, 2001]. Более того, его хромосома была лишена всех тестируемых МГЭ, связанных с вирулентностью (VPI, VPI-2, RS1<}>) и содержала лишь гены жизнеобеспечения (rtxA, toxR, hap A), ген «острова персистенции» mshQ и последовательность attRS. Таким образом, анализ генотипических свойств штамма (ctxA~, zof, асе', sf, tcpA~, toxT, aldA', rstC, nanK, altRS*, toxRhap A*, rtxA

указывает не только на его эпидемическую безопасность, но и неспособность вызывать единичные случаи холеры. Для получения ответа на вопрос, каким образом этот штамм, геном которого лишен всех известных «блоков вирулентности», смог вызвать острое инфекционное заболевание у человека, мы изучили его популяционный состав после заражения им крольчонка-сосунка и шести белых мышей, поскольку организм чувствительного животного или человека является селективной средой для накопления вирулентных клонов. Оказалось, что все 1140 колоний, изолированные после трехкратного пассажа через кишечник животных, продуцировали гемолизин, фософолипазу и растворимую гемагглюти-нин/протеазу, которые обладают цитотоксической активностью и способностью разрушать цитокины хозяина, участвующие в мобилизации защитных сил макро-

организма, но не смогли вызвать развитие инфекционного процесса. Кроме того, по данным ПЦР-типирования с использованием двух «универсальных» праймеров он не имел генетического родства ни с эпидемически опасными, ни с нетоксиген-ными вибрионами эльтор, изолированными в период с 1970 по 2002 гг. на различных территориях.

Хотя указанный штамм, выделенный от больного в Челябинске, эпидемически безопасен, тем не менее нетоксигенные штаммы, вызывающие легкую или тяжелую форму холероподобных кишечных заболевания, все больше привлекают внимание исследователей, поскольку их важная роль, как этиологического агента диареи в последние годы стала очевидной. Так, в ряде стран (Индия, Бразилия, Аргентина) от больных с диареей были выделены генетически родственные группы нетоксигенных штаммов, которые получили название V. cholerae 01 «варианты» [Rodrigue D. С, et al, 1994; Coehlo A.J. et al, 1995; Saha P. et al, 1996; Pal A. et al, 1999; Pichel M. et al, 2003]. Молекулярное типирование показало, что структура генома нетоксигенных штаммов из Бразилии (амазонский вариант) была идентична. Одинаковую генетическую организацию имел ряд нетоксигенных штаммов из Аргентины. Но эти группы штаммов генетически отличались как между собой, так и от токсигенного клона, вызвавшего в Латинской Америке эпидемию холеры. Учитывая наличие сниженной антиферментной резистентности организма 61-летнего больного на фоне хронического гипосекреторного гастрита и длительного приема глюкокортикоидных гормонов, возникновение профузной диареи могло быть обусловлено действием дополнительных токсинов - гемолизина и RTX-токсина, механизм действия которых связан с формированием пор в цитоплазматической мембране клеток макроорганизма, а также нового токсина Саньяла, широко распространенного среди различных штаммов V. cholerae биовара эльтор [Singh D.V. et al, 1996,2001; Saha S., Sanyal S.C., 1988; Монахова Е.В. с соавт., 2001; Глянько Е.В., Власов В.П., 2003]. Мы не исключаем также, что развитие типичной для холеры клинической картины было вызвано еще не известными факторами патогенности, для выявления которых требуется проведение дополнительных исследований.

4. Сравнительный анализ определения эпидемической значимости штаммов V.cholerae биовара эльтор с помощью ПЦР и новых диагностических фагов ctx+ и ctx_. На завершающем этапе работы для определения эпидемической значимости различных штаммов холерного вибриона эльтор был проведен сравнительный анализ двух методов (более простого и дешевого метода с использованием фагов и ПЦР, для проведения которой необходимо дорогостоящее оборудование). Использовано 460 штаммов V.cholerae биовара эльтор, выделенных от больных (135 штаммов), вибрионосителей (61 штамм) и из воды открытых водоемов (264 штамма) в эпидемически опасный и безопасный периоды. С помощью фагового метода и данных о гемолитической активности у 84,0 % штаммов была определена эпидемическая значимость. В то же время у 74 штаммов (или 16,1 % от 460 изученных) эпидзначимость установить не удалось.

ПЦР-анализ этих же штаммов показал, что эпидемически опасные штаммы по данным фагового метода содержали в 80,0 % - 99,2 % случаев весь набор

тестируемых генов - видоспецифического гена НарА и трех ключевых генов вирулентности: МхА, 1срА и 1ахЕ. (табл.3).

Таблица 3. Распространенность генов ctxA, tcpA, toxR и hap А среди штаммов V.cholerae биовара эльтор, выделенных от больных, носителей и из объектов внешней среды, эпидемическая значимость которых была определена с помощью диагностических холерных бактериофагов эльтор ctx+ и ctx~_

Источник

Эпидемическая значимость по данным фагового теста

Присутствие генов вирулентности по данным ПЦР-анализа_

ctxA+ tcpA* toxR* hapA*

ctxA" tcpA* toxR* hapA*

ctxA~ tcpA~ toxR* hapA*

Эпидемически неблагополучный период

ctxA~ tcpA~ toxRT hapA*

Больные Опасные 123 (99,2%) 1 (0,8%) 0 0

Неопасные 2 (100,0%) 0 0 0

Не установлена* 7 (77,8%) 2 (22,2%) 0 0

Носители Опасные 17 (100,0%) 0 0 0

Неопасные 0 1 (10,0%) 9 (90,0%) 0

Не установлена* 3 (75,0%) 0 1 (25,0%) 0

Внешняя среда Опасные 30 (93,8%) 2 (6,2%) 0 0

Неопасные 0 0 27 (100,0%) 0

Не установлена* 2 (22,2%) 1 (11,1%) 6 (66,7%) 0

Межэпидемический период

Носители Неопасные 0 0 18 (94,7%) 1 (5,3%)

Не установлена* 0 10 (90,9%) 1 (9,1%) 0

Внешняя среда Опасные 4 (80,0%) 1 (20,0%) 0 0

Неопасные 0 2 (1,3%) 142 (94,7%) 6 (4,0%)

Не установлена* 3 (7,3%) 20 (48,8%) 18 (43,9%) 0

Всего штаммов 191 40 222 7

Примечание. * - штаммы, для оценки эпидемической значимости которых необходимы дополнительные исследования на наличие генов с(хАВ и крА.

Эпидемически безопасные вибрионы лишены генов ctxA и tcpA в 90,0 - 100 % случаев. Штаммы с неустановленной эпидзначимостью представлены гетерогенной популяцией (табл.3). Из анализа представленных данных следует, что результаты двух методов совпадают в 97,8 % случаев. Следовательно, дешевый и простой в постановке фаговый тест имеет высокую диагностическую ценность. Установлено также, что фаг ctx+ в 93,8 % случаев лизирует штаммы, содержащие гены tcpA, что позволяет говорить о рецепторной функции пилей TCP.

Обобщая изложенный материал, мы можем заключить, что использование комплексного ПЦР-анализа и трех различных методов молекулярного типирова-ния позволило провести более глубокое исследование генома значительного количества штаммов V.cholerae биовара эльтор, выделенных на различных территориях, и получить приоритетные данные, имеющие как фундаментальное, так и прикладное значение. Важным результатом исследований является также подтверждение высокой диагностической ценности холерных бактериофагов эльтор ctx+ и ctx~ при оценке эпидемической значимости штаммов холерного вибриона эльтор, что указывает на необходимость его использования в работе практических учреждений здравоохранения.

ВЫВОДЫ

1. Клинические штаммы V.cholerae биовара эльтор, выделенные в разные годы на территории Поволжья и Туркменистана, являются генетически однородной группой. Их геном содержит следующие 13 ПЦР-тестированных генов: стабильно наследуемые гены жизнеобеспечения (hapA, toxR, rtxA), нуклеотидную последовательность attRS, а так же расположенные на мобильных генетических элементах гены патогенности и персистенции - СТХф (ctxA, zot, асе), КБЦ (rstC), VPI (tcpA, aldA, toxT), VPI-2 (nanH), EPI (mshQ).

2. В межэпидемический период в природных экосистемах циркулируют штаммы, отличающиеся друг от друга по структуре генома: 1) единичные вирулентные (3,6 %), 2) производные вирулентных штаммов, утратившие лишь отдельные гены и (или) генные блоки патогенности (20,7 %), и 3) «водные» вибрионы, содержащие в хромосоме гены жизнеобеспечения, а также в ряде случаев гены персистенции и нуклеотидную последовательность attRS (75,7 %).

3. Существует определенная закономерность в изменении генома неэпидемических штаммов, являющихся производными вирулентных за счет делеции различных фрагментов ДНК. Утраты «блоков» вирулентности происходит в следующей последовательности: СТХф (ctxA, zot, асе) и RSI<j> (rstC) —> VPI (tcpA, aldA, toxi) -> VPI-2 (nanH).

4. Результаты риботипирования с зондом на 16S рРНК и ПЦР-типирования с праймерами на вариабельный тандем ДНК бактериофага М13 и «универсальным» праймером 1281 позволяют дифференцировать вирулентные штаммы, их производные и «водные» вибрионы эльтор. Клинические штаммы V.cholerae биовара эльтор, вызвавшие эпидемические вспышки холеры в Поволжье и Туркменистане в 1969-1975 гг., имеют клональное происхождение и генетически родственны с нетоксигенными вибрионами, сохранившими часть генов вирулентности.

Авирулентные «водные» вибрионы по данным генотипирования отличаются от штаммов двух указанных групп и представлены гетерогенной популяцией.

5. Установленный генотип атипичного штамма V.cholerae биовара эльтор, выделенного от больного холерой в Челябинске в 2000 г. (ctxA' zof асе' sf tcpA' toxT aldA' rstC nanFT attRS* toxR* hapA* rtxA* mshQ*) подтверждает его эпидемическую безопасность. По данным ПЦР-типирования с двумя «универсальными» праймерами указанный штамм не имеет генетического родства с вирулентными и нетоксигенными эльтор вибрионами.

6. Результаты определения эпидемической значимости 460 штаммов V.cholerae биовара эльтор, изолированных на территориях Поволжья, Дагестана, Туркменистана, Узбекистана, Сибири и Приморья (с 1965 по 2002 гг.), с помощью ПЦР-тестирования видоспецифического гена hapA и ключевых генов вирулентности ctxA, tcpA, toxR в 97,0 % случаев совпадают с данными метода, основанного на использовании бактериофагов диагностических холерных эльтор ctx+ и ctx~, что подтверждает высокую диагностическую ценность последних.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Смирнова Н.И., Челдышова Н.Б., Костромитина Е.А., Куличенко А.Н., Кутырев В.В. Дифференциация штаммов Vibrio cholerae eltor по их эпидемической значимости с помощью новых диагностических холерных бактериофагов эльтор ctx+ И Ctx" и полимеразной цепной реакции // Журн. микробиол. - 2001. -№6.-С. 11-16.

2. Костромитина Е.А., Челдышова Н.Б., Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Оценка эпидемической значимости штаммов V.cholerae eltor, выделенных на территории Туркменистана по данным полимеразной цепной реакции и чувствительности к холерным диагностическим фагам Ctx+, Ctx"// Холера и патогенные для человека вибрионы Материалы проблемной комиссии межведомственного научного совета по санитарно-эпидемической охране территории РФ. - Ростов-на-Дону, 2001. - Вып. 14. - С. 22-24.

3. Смирнова Н.И., Костромитина Е.А., Челдышова Н.Б., Кутырев В.В. Отличия в составе генов вирулентности в штаммах Vibrio cholerae eltor, выделенных из разных источников на территории Туркменистана // Молекул, генетика. -2002.-№4-С. 12-18.

4. Костромитина Е.А., Челдышова Н.Б., Лозовский Ю.В., Смирнова Н.И. Изучение распространенности генов zot, асе, rtx и attRSl среди штаммов Vibrio cholerae eltor с помощью полимеразной цепной реакции // Холера и патогенные для человека вибрионы Материалы проблемной комиссии межведомственного научного совета по санитарно-эпидемической охране территории РФ. - Ростов-на-Дону, 2002. - Вып. 15. - С. 67-69.

5. Челдышова Н.Б., Костромитина Е.А., Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Сравнительный ПЦР-анализ штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор, выделенных на территориях с различным типом эпидемических проявлений // Генодиагностика инфекционных заболеваний. Материалы 4-й Всероссийской научно-практической конференции - Москва, 2002. - С. 310-312.

6. Костромитина Е.А., Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И. Рибо- и ПЦР-типирование штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор с различной эпидемической значимостью // Холера. Материалы VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера» - Ростов-на-Дону, 2003. - С. 120-124.

7. Смирнова Н.И., Челдышова Н.Б., Костромитина Е.А. Эволюция патоген-ности возбудителя холеры // Холера. Материалы VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера» - Ростов-на-Дону, 2003. -С.101-104.

8. Костромитина Е.А., Ерошенко Г.А., Савостина Е.П., Осин А.В., Лозовский Ю.В., Яшечкин Ю.И., Смирнова Н.И. Сравнительный анализ информативности различных методов генотипирования Vibrio cholerae биовара эльтор с различной эпидемической значимостью // Проблемы особо опасных инфекций. - Саратов, 2003. - № 85 - С.75-84.

9. Челдышова Н.Б., Костромитина Е.А., Смирнова Н.И. Мультиплексный ПЦР-анализ для изучения структуры генома штаммов Vibrio cholerae различных биоваров // Проблемы особо опасных инфекций. - Саратов, 2003. - № 85 - С. 180186.

10. Костромитина Е.А., Челдышова Н.Б., Смирнова Н.И. Вариабельность структуры генома штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор, выделенных от больных и из внешней среды на разных территориях // Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней. Материалы 4-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (30 сентября - 2 октября 2003 г., Саратов). - Саратов, 2003. - С. 103-107.

И. Kostromitina E.A., Cheldyshova N.B., Smirnova N.I., Kutyrev V.V. Retrospective PCR analysis of Vibrio cholerae El Tor strains isolated during different epidemic situations in Turcmenistan // The Abstract Book of lstFEMS Congress of European Microbiologists, Lubljana, Slovenia, June 29- July 3,2003, P.285-286.

12. Kostromitina E.A., Smirnova N.I. A study of the population structure of non-toxigenic Vibrio cholerae 01 isolated from the immunocompromised patient // The Abstract Book of 1st FEMS Congress of European Microbiologists, Lubljana, Slovenia, June 29- July 3,2003, P.286.

Сдано в набор 26.01.04 г. Подписано к печати 28.01.04. Формат 84x108 1/6. печать лазерная. Бумага финская Гарнитура Тайме. Объем 1,1 усл.пл. Тираж 100 экз.

îm29 56

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Костромитина, Елена Александровна

СПИСОК ПРИНЯТЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТРЫ.

1.1. Особенности структуры генома эпидемически опасных и безопасных штаммов холерных вибрионов эльтор. Вариабельность генома возбудителя холеры.

1.2. Современные методы дифференциации эпидемически опасных и безопасных штаммов У.ско1егае биовара эльтор.

1.2.1. Дифференциация эпидемических и неэпидемических вибрионов эльтор с помощью холерных фагов.

1.2.2. Генодиагностика холеры.

1.3. Молекулярное типирование холерных вибрионов.

1.3.1. Методы, основанные на рестрикционном анализе хромосомной ДНК.

1.3.2. ПЦР-типирование.

1.3.3. Секвенирование.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.2. Бактериальные штаммы.

2.2. Питательные среды и реактивы.

2.3. Методы.

2.3.1 Микробиологические методы.

2.3.2 Молекулярно-генетические методы.

ГЛАВА 3. ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ СТРУКТУРЫ ГЕНОМА ШТАММОВ V. СНОЬЕКАЕ БИОВАРА ЭЛЬТОР, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БОЛЬНЫХ, ВИБРИОНОСИТЕЛЕЙ И ИЗ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ НА РАЗНЫХ ТЕРРИТОРИЯХ.

3.1. Распространенность различных генов жизнеобеспечения и генов вирулентности, локализованных на МГЭ, среди штаммов холерного вибриона эльтор, выделенных в Поволжье и Туркменистане.

3.2. Адаптивные мутации генома холерных вибрионов эльтор, обитающих в организме вибрионосителей или в водных экосистемах.

3.3. Молекулярное типирование штаммов холерных вибрионов эльтор, выделенных из различных источников и на разных территориях.

ГЛАВА 4. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА АТИПИЧНОГО ШТАММА V. СНОЬЕКАЕ БИОВАРА ЭЛЬТОР

ГЛАВА 5. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭПИДЕМИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ ШТАММОВ V. СНОЬЕЛАЕ БИОВАРА ЭЛЬТОР С ПОМОЩЬЮ ПЦР И НОВЫХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ФАГОВ СТХ+ И СТХ~.

5.1. Дифференциация штаммов V. ско1егае биовара эльтор, выделенных в различных регионах, по их эпидемической значимости с помощью поливалентных холерных диагностических фагов с1х+ и ctx-.

5.2. Распространение генов, связанных с вирулентностью, среди штаммов V. cholerae биовара эльтор, имеющих различное эпидемическое значение по данным нового фагового теста. Сравнительный анализ эффективности ПЦР и фагового метода.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетические свойства штаммов холерного вибриона эльтор с различной эпидемической значимостью"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Заболеваемость холерой, входящей в группу карантинных инфекций с диа-рейным синдромом, регистрируется на всех континентах мира. В 1961 г. началась седьмая пандемия холеры Эль-Тор, которая по продолжительности во времени и числу охваченных стран превышает каждую из шести предшествующих [Москви-тина Э.А. с соавт., 2003]. Сведения о регистрации на территории России в 19992002 гг. крупных эпидемических вспышек (Дальний Восток, 1999; Казань, 2001) и спорадических случаев холеры (Челябинск, 2000; Волгоград, 2001; Калмыкия, 2002) [Онищенко Г.Г., 2000, 2002; Москвитина Э.А. с соавт., 2003] обусловливают большой интерес микробиологов и эпидемиологов к этой инфекции. Кроме того, благодаря уникальной вариабельности своего генома, холерный вибрион является идеальной моделью для изучения механизмов эволюции патогенных свойств возбудителей особо опасных инфекций [Кутырев В.В., Смирнова Н.И., 2003].

Холерные вибрионы могут обитать как в природных экосистемах, так и в организме человека. Для существования в двух таких разных экологических нишах возбудитель холеры должен обладать набором генов, которые обеспечивают ему выживаемость как во внешней среде, так и в организме хозяина, обуславливая его патогенность [Бароян О.В., 1971; Faruque S.M. et al., 1998; Литвин В.Ю. с соавт., 2001; Ali М. et al., 2002; Faruque S.M., Nair G.B., 2002]. Полученные в последние 57 лет данные указывают на то, что гены, обеспечивающие жизнеспособность этого микроорганизма, локализованы на эволюционно древних участках большой хромосомы и называются генами жизнеобеспечения (housekeeping genes) [Trucksis М. et al., 1998; Heidelberg J.F. et al., 2000]. Кроме того, в геноме V.cholerae присутствуют мобильные генетические элементы или МГЭ (профаги, «острова патогенности»), которые холерный вибрион приобрел в процессе эволюции. К настоящему времени известно, что хромосома эпидемически опасных штаммов V.cholerae содержит как минимум 4 «блока вирулентности»: профаг СТХф с генами холерного токсина (CT), вызывающего развитие основного симптома при холере - профузную диарею [Waldor М. К., Mekalanos J. J., 1996; Chiang S.L., Mekalanos J.J., 1998; Iida T. et al., 2002; Davis B.M., Waldor M.K., 2003]; «остров патогенности» (ОП) VPI, несущий кластер генов, кодирующих биосинтез основного фактора колонизации - токсин-корегулируемые пили адгезии (TCP) [Karaolis D.K.R. et al., 1998, 1999; Смирнова Н.И., 1999]; недавно открытый второй ОП VPI-2 с генами, отвечающими за синтез нейраминидазы, усиливающей действие холерного токсина [Jermyn W.S., Boyd E.F., 2002] и профаг RS 1 ф, присутствующий у всех вирулентных вибрионов эльтор [Faruque S.M., Asadulghani et al., 2002; Davis B.M., Waldor M.K., 2003]. Кроме того, геном эпидемически опасных и непатогенных холерных вибрионов содержит ОП с генами Ol-антигена [Stroeher U.H. et al., 1998] и «остров персистенции» с генами маннозо-чувствительных пилей адгезии, участвующих у эльтор вибрионов в образовании биопленки, защищающей их от неблагоприятных воздействий окружающей среды [Marsh J.W., Taylor R.K., 1999; Смирнова Н.И., Лозовский Ю.В., 2003]. Таким образом, для генома возбудителя холеры характерна модульная организация, обуславливающая генетическую гетерогенность этого микроорганизма. Благодаря использованию современных молекулярно-биологических методов исследования стало возможным изучение молекулярно-генетических свойств штаммов V.cholerae биовара эльтор, вызвавших различные вспышки холеры, а также выяснение механизма эволюции этого патогена. Тем не менее, до сих пор имеются лишь отдельные сведения о структуре генома вирулентных штаммов, выделенных во время массовых заболеваний холерой на территории бывшего СССР (19701975гг.). Недостаточно также данных о том, как изменился состав генов вирулентности у штаммов, изолированных впоследствии в межэпидемический период от вибрионосителей и из объектов внешней среды на географически удаленных друг от друга территориях с разными климатическими и экологическими условиями. Кроме того, среди штаммов V.cholerae имеется значительная доля атипичных по патогенным свойствам изолятов, которые часто выделяются из воды поверхностных водоемов, и при определенных условиях могут вызывать спорадические заболевания холерой у людей [Rodrigue D. С., et al., 1994; Coehlo A.J. et al., 1995; Saha P. et al., 1996; Pal A. et al, 1999; Ратникова Л.И., Кузьмина Н.Я., 2002; Марамович A.C. с соавт., 2003; Москвитина Э.А. с соавт., 2003; Pichel M., et al., 2003]. Определение эпидемической значимости таких штаммов нередко затруднено. Более того, возникает вопрос, существует ли эволюционная связь между типичными и атипичными штаммами V. cholerae и какова степень их генетического родства между собой. Для получения ответа на указанные вопросы существует целый ряд методов молекулярного типирования: рестрикционный анализ хромосомной ДНК вибрионов, основанный на феномене полиморфизма длин фрагментов рестрикции (ДНК-дактилоскопия, риботипирование, пульс-электрофорез) и полимофизма длин ам-плифицированных фрагментов; генотипирование штаммов по характеру распределения в геноме вариабельных тандемных повторов - VNTR; ПЦР с использованием произвольных (универсальных) праймеров; секвенирование геномов или фрагментов генов [Гинцбург А.Л. с соавт., 1988; Stull T.I. et al, 1988; Olive D. M., Bean P.,

1999; Момыналиев К.Т., Говорун В.М., 2000; Шагинян И.А., 2000; Водопьянов С.О. с соавт., 2001]. Вместе с тем информативность разных методов генотипирова-ния неодинакова, в связи с чем возникает необходимость выбора наиболее оптимального метода (или методов), которые смогут обеспечить проведение более эффективных мониторинговых исследований. Таким образом, «генные портреты» штаммов V.cholerae и их молекулярное типирование позволят решить вопросы о клональности различных штаммов, вызвавших вспышки холеры на различных территориях и в разное время, а также о степени их генетического родства с вибрионами, обитающими в объектах внешней среды.

Несмотря на несомненные достоинства молекулярно-биологических методов исследования, они достаточно сложны и дорогостоящи и пока не нашли широкого применения в практической работе Центров Госсанэпиднадзора. В этой связи работа многих исследователей была направлена на создание других более простых и доступных, но также информативных методов для определения эпидемической значимости вибрионов. В настоящее время в практике эпидемиологического надзора за холерой широкое применение нашел метод, позволяющий дифференцировать холерные вибрионы биовара эльтор на 3 группы (эпидемически опасные, эпидемически безопасные и штаммы с неустановленной эпидемической значимостью) на основании избирательного литического действия диагностических холерных бактериофагов эльтор ctx+ и ctx~~, полученных в РосНИПЧИ «Микроб» Н.М. Остроумовой с соавт. в 1996 г., и данных о гемолитической активности штаммов. [Ко-кушкин A.M. с соавт., 1998; Смирнова Н.И. с соавт., 2001]. В результате государственных испытаний новых холерных фагов на 570 штаммах V.cholerae биовара эльтор установлено, что фаг ctx+ более чем в 80 % случаев лизирует штаммы, содержащие гены ctxAB и не продуцирующие гемолизин. В то же время, почти в 12% случаев к этому фагу чувствительны и штаммы, лишенные генов СТ [Анисимова Т.И. с соавт., 2000]. Вместе с тем в последние годы появились сообщения о выявлении фагорезистентных культур холерных вибрионов эльтор, что ставит под сомнение диагностическую ценность фагового теста [Казакова Е.С. с соавт., 1995; Подосинникова JI.C. с соавт., 1995; Онищенко Г.Г. с соавт., 2000, 2002; Зиатдинов В.Б., 2002]. В связи с этим, встает вопрос о том, какой набор генов вирулентности имеют в хромосоме штаммы, имеющие различную эпидемическую значимость по данным фагового теста. Получение ответа на этот вопрос позволит получить новые фундаментальные знания о структуре генома природных штаммов вибрионов эльтор и ее влиянии на взаимоотношения между бактериальной клеткой и фагом, а также оценить эффективность фагового метода при определении эпидемической значимости штаммов V.cholerae биовара эльтор.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - сравнительный анализ структуры генома штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор, выделенных, от больных, вибрионосителей и из объектов окружающей среды на разных территориях.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

3. Провести ПЦР- и риботипирование штаммов У.скокгае биовара эльтор, выделенных из различных источников на территории Поволжья и Туркменистана, с целью выявления их генетического родства.

4. Изучить молекулярно-генетические особенности атипичного штамма У.ско1егае биовара эльтор, выделенного от больного холерой.

5. Провести сравнительный анализ эффективности фагового метода (фаги йх+ и с1х~) и ПЦР при дифференциации штаммов У.ско1егае биовара эльтор по эпидемической значимости.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

Для выяснения структуры генома холерных вибрионов с различной эпидемической значимостью впервые проведен комплексный ПЦР-анализ 186 штаммов У.ско1егае биовара эльтор, выделенных из различных источников на территории Поволжья и Туркменистана в эпидемически благополучные и неблагополучные по холере годы. Выявлено присутствие (или отсутствие) 13 генов, расположенных как на эволюционно древней части хромосомы (гены жизнеобеспечения), так и на пяти МГЭ, выполняющих различные функции. Установлено, что клинические штаммы и ряд изолятов, выделенных от носителей во время вспышек холеры, представлены генетически однородной популяцией и содержат набор всех тестируемых генов, относящихся как к стабильным генам жизнеобеспечения (карА, ШхЯ, ггхА), так и генам патогенности и персистенции, расположенным на МГЭ: СТХф (сША, ю^ асе), RS 1 ф (rstC), VPI (tcpA, aldA, toxi), EPI (mshQ), VPI-2 (nanH), а также последовательности attRS. Вибрионы, изолированные в межэпидемический период из воды поверхностных водоемов и от вибрионосителей, характеризуются выраженной вариабельностью генома за счет утраты различных по размерам и функциям фрагментов ДНК. Показано, что процесс потери генов имеет определенную последовательность. Наиболее нестабильными являются гены вирулентности, входящие в состав профагов СТХф и RSl<j). Обнаружен ген (hapA), наследуемый клеткой в 100,0 % случаев независимо от среды обитания вибрионов.

Приоритетное значение имеют данные рибо- и ПЦР-типирования 29 штаммов V.cholerae биовара эльтор с различной эпидемической значимостью, выделенных на территории Поволжья и Туркменистана, с целью изучения генетического родства между ними. Показано, что использованные методы молекулярного типи-рования позволяют дифференцировать холерные вибрионы эльтор на три группы: эпидемически опасные, авирулентные и нетоксигенные штаммы, сохранившие часть генов вирулентности. Установлено, что вибрионы последней группы имеют генетическое родство как между собой, так и с вирулентными штаммами.

Получены новые сведения относительно фенотипических и молекулярно-генетических свойств атипичного штамма V.cholerae биовара эльтор, вызвавшего единичный случай заболевания холерой в 2000 г. В экспериментах на модельных животных показано, что штамм нехолерогенен, но продуцирует ряд ферментов па-тогенности (гемолизин, фосфолипазу, растворимую гемагглютинин/протеазу). На основании данных ПЦР-анализа определен генотип этого штамма (ctxA~ zof асе~ sf tcpA~ toxT aldA' rstC nanFT attRS? toxR+hapA+rtxA+mshQ+), подтверждающий его эпидемическую безопасность. В результате ПЦР-типирования с двумя «случайными» праймерами установлено, что по структуре генома данный штамм отличается как от вирулентных, так и от нетоксигенных эльтор вибрионов.

Впервые получены сведения о присутствии генов hap A, ctxA, tcpA и toxR, генетических маркеров эпидемически опасных штаммов, в хромосоме 142 штаммов V.cholerae биовара эльтор, выделенных на территории Поволжья, Дагестана, Туркменистана, Узбекистана, Сибири и Приморья в период с 1965 по 2002 гг., эпидемическая значимость которых была определена фаговым методом. Установлено, что результаты фагового теста и ПЦР-анализа при оценке эпидемической значимости 460 штаммов холерных вибрионов биовара эльтор совпадают в 97 % случаев, что указывает на высокую диагностическую ценность холерных бактериофагов ctx+ и ctx~. Лизис фагом ctx+ в 93,8 % случаев штаммов, содержащих ген tcpA, позволяет полагать, что пили TCP могут служить рецептором для данного фага.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

По результатам работы составлены методические рекомендации: «Мультиплексный ПЦР-анализ для идентификации штаммов Vibrio cholerae eltor и определения их эпидемической значимости» и «Риботипирование штаммов Vibrio cholerae», которые одобрены Ученым Советом (протоколы № 7 от 3 июля 2002 г. и № 9 от 18 декабря 2003 г.) и утверждены зам. директора Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб».

Депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" три штамма V cholerae биовара эльтор с различным набором основных генов патогенности ctxA, tcpA, toxR и неодинаковой чувствительностью к новым холерным диагностическим бактериофагам ctx+ и ctx~, а также шесть штаммов V.cholerae биовара эльтор, имеющих различные генотипы по данным ПЦР-тестирования 13 генов патогенности. Указанные штаммы могут быть использованы в прикладных и фундаментальных исследованиях.

Данные о структуре генома 186 штаммов Кско1егае биовара эльтор с различной эпидзначимостью предназначены для использования Государственной коллекцией патогенных бактерий «Микроб» при молекулярно-генетической паспортизации штаммов, циркулирующих на разных территориях России.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Геном клинических штаммов ¥.ско1егае биовара эльтор, выделенных на разных территориях и в различные годы, стабилен и содержит три ПЦР-тестированных гена жизнеобеспечения (карА, 1охЯ, гЬсА), девять генов вирулентности (с1хА, асе, г$1С, рА, аЫА, 1охТ, папН, тякО), входящих в состав мобильных генетических элементов, а также нуклеотидную последовательность аиЛБ.

2. В водной экосистеме геном значительной части популяции вирулентных клонов претерпевает изменения за счет утраты различных фрагментов ДНК, кодирующих продукцию ключевых факторов патогенности. Делеции генных блоков происходят в определенной последовательности: СТХф (с(хА, zot, асе) и ЫБЦ (гя [С) -> УР1 (1срА, аША, ШТ) -> УР1-2 (папН).

3. Геном «водных» вибрионов содержит гены жизнеобеспечения (НарА, ШЯ, ША) и, в ряде случаев, гены «острова персистенции» (тзкО) и нуклеотидную последовательность айЯБ. Значительные различия между геномами у вирулентных и «водных» вибрионов исключают возможность приобретения последними генов патогенности.

4. По данным рибо- и ПЦР-типирования эпидемические штаммы холерных вибрионов, выделенные от больных во время разных вспышек холеры на территории Туркменистана и Поволжья, имеют клональное происхождение. Обнаруженные нетоксигенные вибрионы эльтор, сохранившие ряд генов вирулентности, имеют генетическое родство с эпидемически опасными штаммами, тогда как «водные» вибрионы представляют самостоятельную гетерогенную популяцию.

5. Атипичный штамм У.ско1егае биовара эльтор, выделенный от больного холерой в Челябинске (2000 г.), имеет генотип: сйсА~ гоГ асе~ яГ 1срА~ гохТ аША папН~ ШС аиЯБ+ гохЯ+ карА+ НхА+ тяИО*, подтверждающий его эпидемическую безопасность. По данным генотипирования указанный штамм не имеет сходства ни с клиническими, ни с нетоксигенными вибрионами, выделенными из воды открытых водоемов. Тем не менее, при условии резко сниженного иммунитета у макроорганизма, штаммы холерного вибриона, лишенные ключевых факторов патоген-ности, могут вызывать холерогенный синдром за счет активной продукции дополнительных токсинов (гемолизин, ЯТХ-токсин).

6. Сравнительная оценка диагностической ценности ПЦР и холерных бактериофагов с!х+ и с!х~, проведенная при анализе 460 различных штаммов У.ско1егае биовара эльтор, указывает на высокую эффективность простого и дешевого метода, основанного на использовании холерных диагностических фагов йх+ и с1х , при определении эпидемической значимости эльтор вибрионов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Материалы диссертации доложены и представлены на научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2001, 2002, 2003); Проблемной комиссии межведомственного научного совета по санитарно-эпидемической охране территории РФ (Ростов-на-Дону, 2002); научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» (Москва, 2002); 4-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003).

ПУБЛИКАЦИИ.

По теме диссертации опубликовано 12 научных работ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Костромитина, Елена Александровна

ВЫВОДЫ

1. Клинические штаммы V.cholerae биовара эльтор, выделенные в разные годы на территории Поволжья и Туркменистана, являются генетически однородной группой. Их геном содержит следующие 13 ПЦР-тестированных генов: стабильно наследуемые гены жизнеобеспечения (hapA, toxR, rtxA), нуклеотидную последовательность attRS, а так же расположенные на мобильных генетических элементах гены патогенности и персистенции - СТХф (ctxA, zot, асе), КБ1ф (rstC), VPI ( tcpA, aldA, toxT), VPI-2 (nanH), EPI (mshQ).

3. Существует определенная закономерность в изменении генома неэпидемических штаммов, являющихся производными вирулентных за счет делеции различных фрагментов ДНК. Утрата «блоков» вирулентности происходит в следующей последовательности: СТХф (ctxA, zot, асе) и RS^ (rstC) —>• VPI (tcpA, aldA, toxT) —» VPI-2 (nanH).

1969-1975 гг., имеют клоиальиое происхождение и генетически родственны с не-токсигенными вибрионами, сохранившими часть генов вирулентности. Авирулент-ные «водные» вибрионы по данным генотипирования отличаются от штаммов двух указанных групп и представлены гетерогенной популяцией.

5. Установленный генотип атипичного штамма У.ско1егае биовара эльтор, выделенного от больного холерой в Челябинске в 2000 г. (ЫхА~ гоГ асе~ яГ (срА~ ШТ аМА гя^ папН~ аМЯЗ+ Г<хсЯ+ кар А+ г1хА+ тякО^) подтверждает его эпидемическую безопасность. По данным ПЦР-типирования с двумя «универсальными» праймерами указанный штамм не имеет генетического родства с вирулентными и нетоксигенными эльтор вибрионами.

6. Результаты определения эпидемической значимости 460 штаммов У.ско1егае биовара эльтор, изолированных на территориях Поволжья, Дагестана, Туркменистана, Узбекистана, Сибири и Приморья (с 1965 по 2002 гг.), с помощью ПЦР-тестирования видоспецифического гена карА и ключевых генов вирулентности ОхА, ЩзА, ШЯ в 97,0 % случаев совпадают с данными метода, основанного на использовании бактериофагов диагностических холерных эльтор с1х+ и что подтверждает высокую диагностическую ценность последних.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Возбудитель холеры характеризуется уникальной вариабельностью генома, которая обусловила появление в процессе его эволюции различных патогенных клонов, отличающихся между собой по ряду важнейших фенотипических и генетических свойств [Кутырев В.В., Смирнова Н.И., 2003]. В процессе изучения структуры генома было обнаружено, что значительная часть генов патогенности у V.cholerae расположена на МГЭ различного филогенетического происхождения. Такая модульная организация генома возбудителя холеры, как и других патогенных бактерий, указывает на то, что основной механизм его эволюции - как приобретение через горизонтальный перенос генов различных «блоков вирулентности» и эпидемичности (ОП и профагов), так и потеря их. Эволюционный успех возбудителя седьмой пандемии холеры, по видимому, определен более удачной комбинацией в его геноме различных МГЭ, продукты которых обеспечили ему как выживаемость во внешней среде, так и более быстрое распространение за пределы эндемичного очага и укоренение на других территориях. С помощью современных мо-лекулярно-биологических методов исследования показано, что эволюционные преобразования возбудителя холеры продолжаются и в настоящее время. Так, отмечено широкое распространение среди клинических штаммов интегронов с кассетами генов резистентности к антибиотикам, что свидетельствует об эволюционной адаптации возбудителя холеры к лекарственным препаратам [Dalsgaard A. et al, 1999; Chakraborty S. et al., 2001; Folgosa E. et al., 2001; Chhotray G.P. et al., 2002; Марамо-вич А.С. с соавт., 2003]. В 2002 г. впервые описан новый вариант вибрионов эльтор, выделенных в 1991-1994 гг. от больных холерой, которые имели ряд фенотипических (чувствительность к полимиксину, резистентность к диагностическим фагам и т.д.) и генотипических (структура генов tcpA и rstC) признаков V.cholerae классического биовара [Nair G.B. et al, 2002]. Использование относительно новых методов молекулярного типирования (AFLP, MLST, PFGE), характеризующихся высокой разрешающей способностью, позволило выявить генетическую неоднородность как патогенных клонов V.cholerae биовара эльтор, выделенных в период седьмой пандемии на географически разобщенных континентах [Jiang S. С. et al, 2000; Lan R., Reeves P., 2002], так и штаммов различных серогрупп, циркулирующих в природных водоемах [Singh D.V. et al, 2001; Kotetishvili M. et al, 2003; Li M. et al, 2003; Thompson F.L. et al, 2003]. Что касается молекулярно-генетических свойств вирулентных вибрионов эльтор, вызвавших массовые заболевания холерой на территории бывшего СССР в начале 70-х гг. прошлого столетия, а также штаммов, изолированных в межэпидемический период, то к настоящему времени получены лишь сведения о распространении в их геноме четырех генов: видоспецифи-ческого гена hapA и трех генов вирулентности - ctxA, tcpA и toxR. [Смирнова Н.И. с соавт., 2001; Челдышова Н.Б., 2002]. До начала нашей работы более глубокие исследования структуры генома различных штаммов холерного вибриона не проводились. В этой связи одной из основных задач нашего исследования явилось изучение молекулярно-генетических свойств холерных вибрионов эльтор, выделенных от больных холерой, вибрионосителей, а также из объектов внешней среды на двух географически удаленных друг от друга территориях - в Поволжье (1970-2002 гг.) и в Туркменистане (1965-1987 гг.). С помощью разработанных нами мультилокус-ных ПЦР в геноме 186 исследуемых штаммов было определено присутствие двух групп генов. В первую группу входило три стабильно наследуемых гена жизнеобеспечения, расположенных на эволюционно древней части хромосомы [Мохоп

E.R. et al, 1994]: видоспецифический ген hapA [Finkelstein R.A. et al, 1992; Kimsey H.H. et al, 1998; Челдышова Н.Б. с соавт., 2000; Смирнова Н.И. с соавт., 2001; Benitez J.A. et al, 2001; Zhu J. et al, 2002], rtxA [Lin W. et al, 1999; Chow K.H. et al, 2001] и глобальный регуляторный ген toxR [Смирнова Н.И. 1999; Merrell D.S. et al, 2001, Wang S.Y. et al., 2002]. Вторая группа включала ключевые гены патогенности и персистенции, локализованные на МГЭ, которые холерный вибрион приобрел в процессе эволюции: гены коровой области профага СТХф- ctxA, zot, асе, кодирующие биосинтез различных токсинов [Waldor M.K. et al, 1996; Kimsey H.H. et al, 1998; Heilpern A.J. et al, 2000], ген rstC профага RS1(|) [Davis B.M. et al, 2002; Faru-que S.M. et al, 2002], генетические маркеры двух ОП: VPI (структурные гены tcpA, aldA и регуляторный toxT) [Karaolis D.K.R. et al., 1998; O'Shea Y.A. et al., 2002; Fa-ruque S.M., Zhu J. et al., 2003] и VPI-2 (nanH) [Jermyn W.S., Boyd E.F. et al., 2002], a также ген mshQ «острова персистенции» [Marsh J.W., Taylor R.K. et al., 1999; Torna С. et al., 2002]. Кроме того, мы выяснили присутствие в геноме изучаемых штаммов последовательности attRS, которая служит сайтом для внедрения в хромосому профагов СТХф и RS^ [Iida T. et al, 2002; Davis B.M., Waldor M.K., 2003].

В результате проведенных экспериментов показано, что геном штаммов, изолированных от больных и ряда носителей во время эпидемий холеры как в Поволжье, так и в Туркменистане был стабилен и содержал набор всех 13 тестируемых генов и генных «блоков»: hapA, toxR, rtxA, СТХф (ctxA, zot, ace), RSl^ (rstC), VPI (tcpA, aldA, toxT), VPI-2 (nanH), EPI (mshQ), attRS. Выявленная закономерность может служить указанием на то, что холерному вибриону для развития инфекционного процесса в организме хозяина (человека) необходимы продукты всех указанных генов. Только в присутствии в хромосоме ключевых и второстепенных генов вирулентности этот патоген приобретает способность противостоять защитным системам макроорганизма, заселять тонкий кишечник и размножаться там, вызывать развитие клинических симптомов при холере. Мы пока не знаем, является ли такое сочетание генов и генных блоков в хромосоме холерных вибрионов вполне достаточным для развития эпидемии или вспышек холеры. Для ответа на этот вопрос необходимы дополнительные исследования. Тем не менее, выявленная стабильность генома клинических штаммов, выделенных на разных территориях, позволяет говорить о ее адаптивном характере, обеспечивающим вибрионам возможность существовать в организме хозяина.

Особый интерес для нас представляло обнаружение клинического штамма с фенотипическими (не агглютинировал куриные эритроциты) и генотипическими (структура гена tcpA,) свойствами вибрионов классического биовара, тем более, что штаммы с признаками возбудителя обоих биоваров описаны ранее другими исследователями [Nair G.B. et al., 2002]. Выявленные особенности в структуре генома указанного штамма, а также наличие в его хромосоме неполноценного профага СТХф, сохранившего лишь гены токсинов Zot и Асе, подтверждают большую роль горизонтального переноса генов и рекомбинационных событий в эволюции этого патогенна. Что касается штаммов эльтор вибрионов, выделенных из объектов внешней среды в эпидемически неблагополучный период, примерно 50 % популяции как в Поволжье, так и в Туркменистане было представлено вирулентными вибрионами, имеющими в геноме все тестируемые гены. Остальная часть изученных штаммов состояла из авирулентных клонов, в хромосоме которых присутствовали лишь гены жизнеобеспечения, attRS-сайт (в 86 % случаев) и «остров персистенции» (у 47 % изолятов). Таким образом, по данным ПЦР-анализа существенных различий между штаммами, выделенными во время вспышек холеры на территории Поволжья и Туркменистана, не обнаружено.

Смена эпидемического периода на межэпидемический, по мнению многих исследователей, не сопровождается полным исчезновением холерных вибрионов, поскольку этот вид способен в определенных условиях существовать вне организма хозяина, т.е. в водных экосистемах. Длительное пребывание вибрионов во внешней среде порождает много вопросов; изменяется ли структура генома вирулентных вибрионов при смене экологической ниши и каким образом, какова граница вариабельности генома вибрионов эльтор, каково соотношение вирулентных и типичных «водных» вибрионов в популяции? Безусловно, мы не можем дать исчерпывающего ответа на эти важные для эпидемиологов вопросы. Тем не менее в пределах нашего экспериментального материала мы попытались проанализировать события, происходящие с вибрионами в этот период. При анализе 111 изолятов, выделенных из воды поверхностных водоемов в Туркменистане и Поволжье выявлено три группы штаммов: 1) вирулентные вибрионы, которые сохраняются в межэпидемический период, хотя доля таких штаммов в общей популяции вибрионов, циркулирующих в водной экосистеме невелика (3,6 %); 2) нетоксигенные вибрионы, производные вирулентных, поскольку в их геноме сохранился ряд генов вирулентности, относящихся к генетическим маркерам эпидемически опасных штаммов. Так, 78,2 % из них имели VPI, в геноме ряда штаммов присутствовал неполноценный СТХф, утративший гены ctxAB, но сохранивший zot и асе. Более того, в геноме всех указанных штаммов присутствовал VPI-2 (папН), который в настоящее время стал считаться еще одним генетическим маркером эпидемически опасных штаммов [Jermin W.S., Boyd E.F., 2002]; 3) непатогенные «водные» вибрионы эльтор, составившие значительную часть популяции (75,7 %), в хромосоме которых присутствовали лишь гены жизнеобеспечения, attRS-сшт (у 71,4 % штаммов), а из МГЭ - «остров персистенции» (в 58,3 % случаев). Из-за неоднородности условий существования холерных вибрионов на двух исследуемых территориях, были выявлены заметные различия в структуре их генома. Оказалось, что штаммов, производных от эпидемически опасных вибрионов, в Туркменистане обнаружено значительно больше (32 %), чем в Поволжье (7,5 %), при этом геном 80,6 % из них содержал VPI с генами основного фактора колонизации, что полностью согласуется с полученными ранее результатами ПЦР-анализа [Челдышова Н.Б., 2002] и данными эпидемиологов о развитии в 70-80 гг. на территории Туркменистана своеобразного эпидемического процесса, характеризующегося выделением из объектов внешней среды слабовирулентных холерных вибрионов и высоким уровнем вибрионоси-тельства [Анисимов П.И. с соавт., 1981].

Редукционный характер изменчивости генома вибрионов, обитающих в водной среде, свидетельствует о том, что микроорганизмы используют все возможные молекулярные механизмы, чтобы их геном освобождался от последовательностей ДНК, ненужных для жизни клетки в водных экосистемах. Маловероятно, что такие преобразования генома холерных вибрионов вредны для них. Скорее всего вибрионы в водной среде подвергаются действию какого-то отбора, направленного на освобождение их генома от генов и генных блоков, не нужных им для существования в этой экологической нише.

В рамках проведенной работы встает также вопрос о предельно допустимом уменьшении размера генома холерных вибрионов эльтор. Обнаружены вибрионы, которые, по-видимому, утратили достаточно протяженные фрагменты ДНК - профаги СТХф (7,0 т.п.н.) и RS1<|> (2,7 т.п.н.), VPI (39,5 т.п.н.), VPI- 2 (57,3 т.п.н.), EPI (16.7 т.п.н.), attRS (18,0 п.н.), rtx (около 4,0 т.п.н.), toxR (около 1,0 т.п.н.). В этой связи чрезвычайно интересно проследить, может ли у этих вибрионов происходить увеличение генома в процессе приобретения ими указанных или новых генов и каковы биологические последствия этих событий на каждом этапе формирования клона с определенными свойствами.

Таким образом, анализ полученных данных о составе тестируемых генов в хромосоме изучаемых штаммов указывает на четкие отличия в наборе генов и генных блоков между клиническими и непатогенными штаммами, обитающими в водной среде. Клиническим штаммам свойственны две общие черты, определяющие их принадлежность к патогенным бактериям:

1 .Поскольку эти вибрионы могут существовать не только в организме хозяина, но и вне его, то их геном, как и других «свободноживущих» бактерий, содержит набор генов, продукты которых обеспечивают метаболическую возможность адаптироваться к условиям обитания в водной среде. К такому типу относят гены жизнеобеспечения hapA, toxR, rtxA, а также «остров персистенции».

2. Вторая черта клинических штаммов связана с наличием в их геноме специфических МГЭ, контролирующих синтез факторов вирулентности. К их числу относят два профага - СТХф, RS^ и два «острова патогенности»- VPI, VPI-2, без которых реализация типичного инфекционного процесса при холере невозможна.

Уникальность клинических штаммов состоит еще и в стабильном наследовании ими обеих групп генов. Очень велика вероятность того, что функция этих генов абсолютно необходима холерным вибрионам как для адаптации в организме хозяина, так и для проявления ими типичной патогенности. Однородность клинических штаммов по составу изучаемых генов, возможно, также обусловлена и относительно одинаковыми условиями их существования в данной экологической нише.

Что касается природных популяций холерных вибрионов, обитающих в воде открытых водоемов, то давно известно, что их главный и общий признак - огромная гетерогенность, обеспечивающая возможность адаптаций в этой разнородной среде обитания [Беляков В.Д., с соавт. 1996; Литвин В.Ю. с соавт., 1998, 2001; Ма-рамович А.С. с соавт., 2003].

Выявленная генетическая гетерогенность холерных вибрионов, циркулирующих в воде открытых водоемов в межэпидемический период, позволила выяснить общие закономерности в изменении структуры их генома, которые, видимо, носят адаптивный характер. На основании полученных данных установлено, что вирулентные вибрионы, попав в водную среду, в первую очередь утрачивают генетическую основу их вирулентности - весь СТХ-генетический элемент (в 66,7 % случаев) или только гены ctxAB (у 18,5 % штаммов), что не противоречит данным других исследователей о возможной делеции отдельных генов «кассеты вирулентности» [Kurazano Н. et al., 1995; Власов В.П. с соавт., 1999; Монахова Е.В. с соавт., 1999; Pourshafie M.D., et al, 2000; Челдышова Н.Б., 2002; Li М. et al., 2003]. Генетические перестройки в геноме профага СТХф, который у клинических штаммов включен в хромосому стабильно, с общебиологических позиций представляют самостоятельный интерес. Ранее было принято считать, что указанная «кассета вирулентности» неделима и входящие в ее состав гены ctxAB, zot и асе могут быть деле-тированы (или амплифицированы) как одна генетическая единица [Sears S.L. et al., 1996; Colombo M.M. et al., 1997]. Однако оказалось, что у ряда штаммов могут отсутствовать гены ctxAB. Избирательность утраты генов ctx А В из профага СТХф вряд ли является случайным событием. Возможно, эти факты служат подтверждением высказанного предположения E.F. Boyd et al. (2000), что предшественником фага СТХф (или pre СТХф) мог быть бактериофаг с генами zot и асе, но без оперона ctxAB. И только впоследствии на каком-то этапе эволюции этот фаг приобрел гены ctxAB от неизвестного донора, которые при определенных условиях существования вибрионов становятся нестабильными.

Важно отметить, что утрата «кассеты вирулентности» сопровождается потерей другого «блока вирулентности» - профага Я81ф, который ограничивает СТХф с обеих сторон и присутствует у всех эпидемически опасных вибрионов эльтор. Следующий этап изменения генома вибрионов в природных водоемах связан с утратой или делецией второго абсолютно необходимого для реализации вирулентных свойств генного блока - «острова патогенности» (VPI), который оказался более стабильным, чем профаги, сохраняясь в геноме 85,2 % вирулентных вибрионов и их производных. Вместе с тем обнаружены штаммы, содержащие дефектный VPI, лишенный гена tcpA, который кодирует биосинтез основной субъединицы пилей TCP, но сохранивший гены aldA, toxT. Вибрионы с генотипом ctxA~tcpA~ являются эпидемически безопасными, поскольку невозможна колонизация ими тонкого кишечника и развитие диареи. Тем не менее, определенная часть таких вибрионов ранее были вирулентными, так как в их геноме присутствует VPI-2, являющийся генетическим маркером эпидемических штаммов. Ген «острова персистенции» mshQ наследовался стабильно и присутствовал в хромосоме 96,3 % штаммов. Что касается генов жизнеобеспечения {hapA, toxR, rtxA) и последовательности attRSl, то они наследовались в 100 % случаев. Дальнейшее изучение структуры генома штаммов, полностью утративших все блоки вирулентности и поэтому отнесенных нами к третьей группе, генетически не связанной с вирулентными вибрионами, позволило выяснить, наиболее стабильными оказались видоспецифический ген карА и регу-ляторный ген ШЯ, которые имелись соответственно у 100 % и 97,0 % штаммов.

Выявленные отличия в структуре генома между изученными нами холерными вибрионами эльтор ставят вопрос об их генетическом родстве. Рибо- и ПЦР-типирование с использованием праймеров разной длины и с разным содержанием О+С (р8 и 1281) 29 модельных штаммов позволили нам провести анализ генетических взаимоотношений между эпидемическими и неэпидемическими штаммами холерного вибриона. Полученные данные указывают на то, что штаммы, выделенные от больных во время разных вспышек холеры, зарегистрированных на территории Туркменистана и Поволжья, представлены генетически однородной группой. Эти данные полностью совпадают с эпидемиологическими выводами о том, что эпидемия холеры, начавшаяся в 1970 г. на территории бывшего СССР, была вызвана одним вирулентным клоном холерного вибриона эльтор.

Наиболее интересными с общебиологических позиций оказались, на наш взгляд, данные генотипирования нетоксигенных вариантов, существующих в другой экологической нише - воде природных водоемов. Полученные сведения лишь частично подтверждают точку зрения ряда исследователей о том, что нетоксиген-ные варианты являются самостоятельной гетерогенной популяцией, представители которой не имеют генетического сходства как друг с другом, так и с эпидемически опасными штаммами [Гинцбург А.Л. с соавт. 1989; Грижебовский Г.М., 1997] и не могут приобрести профага СТХф. Показано, что такая группа авирулентных вибрионов действительно присутствует в водной популяции этих бактерий, характеризуясь заметно укороченным геномом за счет отсутствия в нем практически всех генов и генных блоков вирулентности (третья группа). Вполне вероятно, что такие вибрионы не способны к реконструкции к вирулентному варианту. Их происхождение остается пока неясным. В то же время параллельно с вибрионами этой группы обнаружены нетоксигенные вибрионы эльтор, сохранившие в геноме часть генов вирулентности, которые имели несущественные отличия в генетической организации от вирулентных вибрионов, выделенных от больных. Их сходство между собой по данным генотипирования, а также явное генотипическое родство с эпидемически опасными штаммами указывает на то, что эти штаммы являются производными вирулентных, утрата которыми профагов, либо острова патогенности является необходимым генетическим событием для их адаптации к существованию в водной экосистеме. Из части штаммов, сохранивших остров патогенности с генами основного фактора колонизации (ctxA~tcpA+aldA+tox7*) теоретически могут быть сформированы эпидемически опасные штаммы. Но мы пока не знаем конкретных условий и факторов, которые сделали бы это событие реальным и эпидемически значимым в природе, хотя в условиях эксперимента показана возможность превращения нетоксигенных штаммов в токсигенные в результате фаговой конверсии.

О том, что в качестве этиологического агента диарейных инфекций все чаще выступают авирулентные холерные вибрионы, свидетельствуют многочисленные публикации отечественных и зарубежных исследователей [Кюрегян А.А. с соавт., 2001, Хайтович А.Б. с соавт., 2001; Москвитина Э.А. с соавт., 2003: Rodrigue D. С., et al., 1994; Coehlo A.J. et al., 1995; Saha P. et al., 1996; Савельев B.H., 1998; Pal A. et al., 1999; Pichel M. et al., 2003]. В этой связи особый интерес для нас представляло получение данных о фенотипических и молекулярно-генетических свойствах нетоксигенного штамма V.cholerae биовара эльтор, выделенного в 2000 г. в Челябинске от больного, длительное время страдающего гормонозависимой бронхиальной астмой и гастритом со сниженной секреторной функцией. Результаты проведенного нами комплексного ПЦР-тестирования показали отсутствие у данного штамма не только генов ctxA, zot и асе, локализованных на профаге СТХф, но и гена st, отвечающего за продукцию термостабильного токсина, иногда встречающегося у штаммов V.cholerae биовара эльтор [Pal. A. et al., 1992; Ogawa A., Takeda Т., 1993; Dalsgaard A., Serichantalergs О., et al., 1995; Mallard K.E., Desmarchelier P.M., 1995; Sears C.L., Kaper J.B., 1996; Vicente A.C.P. et al., 1997; Singh D.V. et al., 2001]. Более того, его хромосома была лишена всех тестируемых МГЭ, связанных с вирулентностью ( VPI, VPI-2, RS1([)) и содержала лишь гены жизнеобеспечения (rtxA, toxR, hapA), ген «острова персистенции» mshQ и последовательность attRS. Таким образом, анализ генотипических свойств штамма (ctxA~, zof, асе, st~, tcpA", toxT, aldAT, rstCT, nanlT, attRS+, toxR+, hapA+, rtxA+, mshQ+) указывает не только на его эпидемическую безопасность, но и неспособность вызывать единичные случаи холеры. Для получения ответа на вопрос, каким образом этот штамм, геном которого лишен всех известных «блоков вирулентности», смог вызвать острое инфекционное заболевание у человека, мы изучили его популяционный состав после заражения им крольчонка-сосунка и шести белых мышей, поскольку организм чувствительного животного или человека является селективной средой для накопления вирулентных клонов. Оказалось, что все 1140 колоний, изолированные после трехкратного пассажа через кишечник животных, продуцировали гемолизин, фософолипазу и растворимую гемагглютинин/протеазу, которые обладают цитотоксической активностью и способностью разрушать цитокины хозяина, участвующие в мобилизации защитных сил макроорганизма, но не смогли вызвать развитие инфекционного процесса. Кроме того, по данным ПЦР-типирования с использованием двух «универсальных» праймеров он не имел генетического родства ни с эпидемически опасными, ни с нетоксигенными вибрионами эльтор, изолированными в период с 1970 по 2002 гг. на различных территориях.

Хотя указанный штамм, выделенный от больного в Челябинске, эпидемически безопасен, тем не менее, нетоксигенные штаммы, вызывающие легкую или тяжелую форму холероподобных кишечных заболевания, все больше привлекают внимание исследователей, поскольку их важная роль, как этиологического агента диареи в последние годы стала очевидной. Так, в ряде стран (Индия, Бразилия, Аргентина) от больных с диареей были выделены генетически родственные группы нетоксигенных штаммов, которые получили название V. cholerae 01 «варианты» [Rodrigue D. С., et al., 1994; Coehlo A.J. et al, 1995; Saha P. et al., 1996; Савельев B.H., 1998; Pal A. et al., 1999; Pichel M. et al., 2003]. Молекулярное типирование показало, что структура генома нетоксигенных штаммов из Бразилии (амазонский вариант) была идентична. Одинаковую генетическую организацию имел ряд нетоксигенных штаммов из Аргентины. Но эти группы штаммов генетически отличались как между собой, так и от токсигенного клона, вызвавшего в Латинской Америке эпидемию холеры. Учитывая наличие сниженной антиферментной резистентности организма 61-летнего больного на фоне хронического гипосекреторного гастрита и длительного приема глюкокортикоидных гормонов, возникновение профузной диареи могло быть обусловлено действием дополнительных токсинов - гемолизина и RTX-токсина, механизм действия которых связан с формированием пор в цито-плазматической мембране клеток макроорганизма, а также нового токсина Саньяла, широко распространенного среди различных штаммов V.cholerae биовара эльтор [Saha S., Sanyal S.C., 1988; Singh D.V. et al., 1996, 2001; Монахова E.B. с соавт., 2001; Глянько Е.В., Власов В.П., 2003]. Мы не исключаем также, что развитие типичной для холеры клинической картины было вызвано еще не известными факторами патогенности, для выявления которых требуется проведение дополнительных исследований.

Несмотря на явные преимущества современных технологий при определении эпидемической значимости холерных вибрионов, что имеет первостепенное значение при решении вопроса о проведении противохолерных мероприятий, генодиагностические методы являются весьма дорогостоящими и в ряде случаев недоступными для практического здравоохранения. В связи с этим в работе практического здравоохранения широкое применение нашел более дешевый и простой в исполнении тест, основанный на использовании диагностических холерных бактериофагов эльтор ctx+, ctx" и определении гемолитической активности. Высокая информативность данного метода при дифференциации эпидемически опасных и безопасных штаммов V.cholerae биовара эльтор была подтверждена работами многих исследователей [Анисимова Т.И. с соавт., 2000г.; Омарова Б.К. с соавт., 2000; Кудря-кова Т.А. с соавт., 2001; Смирнова Н.И. с соавт., 2001; Манрикян М.Г. с соавт., 2003; Неъматов A.C. с соавт., 2003]. Между тем, до сих пор отсутствовала информация о том, какой набор генов вирулентности содержат в хромосоме штаммы, имеющие согласно фаговому тесту неодинаковую эпидемическую значимость и какова информативность этого метода по отношению к ПЦР. Для получения ответа на эти вопросы мы определили эпидемическую значимость 460 штаммов V.cholerae биовара эльтор, выделенных от больных, носителей и из объектов внешней среды на разных территориях (Поволжье, Дагестан, Туркменистан, Узбекистан, Сибирь и Приморский край) в период с 1965 по 2002 гг., с использованием фагового теста и ПЦР, и провели сравнительный анализ эффективности двух этих методов. На основании проведенных исследований установлено, что 97,8 % штаммов, идентифицированных согласно фаговому тесту как эпидемически опасные, содержат все тестируемые гены (видоспецифический карА и гены вирулентности: ЫхА, /срА, ¡охК). Что касается эпидемически безопасных штаммов, то 99,0 % из них лишены генов с(хА, либо с(хА и Юр А, либо с1хА, ЮрА и /охК, из чего следует, что эти штаммы и по данным ПЦР-анализа не способны вызывать эпидемии или вспышки холеры. Полученные данные свидетельствуют о высокой диагностической ценности холерных бактериофагов и Этот вывод о целесообразности дальнейшего использования бактериофагов диагностических холерных эльтор и для ускоренной идентификации и дифференциации эпидемически опасных и безопасных вибрионов имеет особо важное значение, поскольку у ряда исследователей [Онищенко Г.Г. с соавт., 2000, 2002; Зиатдинов В.Б., 2002] появились сведения о резистентности, в частности, клинических штаммов, выделенных во время вспышки холеры в Казани (2001 г.), к указанным фагам. В то же время, при комиссионной проверке в РосНИПЧИ «Микроб» в 2003 г. чувствительности 134 штаммов У.ско1егае биовара эльтор, изолированных в Казани (2001 г.), к фагам с1х+ и с1х~ было установлено, что 70,9 % из них оказались чувствительными к фагу йх+ и, следовательно, эпидемически опасными. Сделанное ранее заключение об их устойчивости к названным фагам, возможно, было связано с неполным соблюдением требований по подготовке штаммов к экспериментам.

Обобщая изложенный материал, мы можем заключить, что использование комплексного ПЦР-анализа и трех различных методов молекулярного типирования позволило провести более глубокое исследование генома значительного количества штаммов ¥.сИо1егае биовара эльтор, выделенных на различных территориях, и получить приоритетные данные, имеющие как фундаментальное, так и прикладное значение. Важным результатом наших исследований является также подтверждение высокой диагностической ценности холерных бактериофагов эльтор с1х+ и с!х— при оценке эпидемической значимости штаммов холерного вибриона эльтор, что указывает на необходимость его использования в работе практических учреждений здравоохранения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Костромитина, Елена Александровна, Саратов

1. Адамов А. К., Наумшина М. С. Холерные вибрионы. Саратов, 1984. - 328 с.

2. Балахонов C.B., Миронова Л.В., Марамович A.C. с соавт. ПЦР-детекция маркеров эпидемической значимости штаммов Vibrio cholerae 0139, изолированных в Сибири // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол 2001. - № 2. - С. 24-26.

3. Балахонов C.B., Миронова Л.В., Погорелов В.И. с соавт. Ускоренная диагностика холеры с помощью мультиплексной ПЦР // Матер. 1 Междунар. Симпозиума «Стресс и экстремал сост.». Кара-Даг. - 2002. - С. 27-28.

4. Бароян О .В.//Холера Эль-Тор. М., «Медицина», 1971. - С.254.

5. Безденежных И.С. Эпидемиология. М.: Медицина, 1977. - 264 с.

6. Белохвостов A.C. Полимеразная цепная реакция и лигазные реакции, принципы, традиционные методики и нововведения // Молекул, генетика,микробиол. и вирусол.- 1995. №2. - С.21-25

7. Беляков В.Д, Марамович A.C., Каминский Г.Д. Гетерогенность и изменчивость популяций Vibrio cholerae eltor и их роль в развитии эпидемического процесса // Журн. микробиол. 1996. - № 2. - С. 91-97.

8. Бондаренко В. М, Мавзютов А. Р, Golkocheva Е. Секретируемые факторы патогенности энтеробактерий // Журн. микробиол. 2002. - № 1. - С. 84-90.

9. Бошнаков Р.Х, Романова Ю.М, Зигангирова H.A., Гинцбург A.JI. Дифференциальная экспрессия генов в культивируемых и некультивируемых формах Salmonella Thyphimurium II Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 2002. - №3. - С. 8-12.

10. Вартапетян А.Б. Полимеразная цепная реакция // Молекул, биол. 1991. - № 4. - С. 926-936

11. Власов В.П, Монахова Е.В, Подосинникова JI.C. с соавт. Использование ДНК-зонда для изучения природных штаммов холерных вибрионов. //Пробл. мед. и сан. микробиологии города: Тез. Обл. конф. Ростов-на-Дону, 1987. -С. 14-18.

12. Власов В.П, Воронежская Л.Г, Монахова Е.В. с соавт. Молекулярное зондирование холерных вибрионов не Ol группы на наличие vct-гена // Акт. вопр. микробиол, лаб. диагн. и проф. холеры: Тез. Всесоюзн. науч. конф. -Ростов-на-Дону, 1988. С. 315-418.

13. Власов В.П., Монахова Е.В., Ушакова И.Е. с соавторами. Гемолицин Vibrio cholerae eltor\ клонирование и экспрессия генов в E.coli // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1992. - № 7-8. - С. 14-20.

14. Власов В. П., Монахова Е. В., Михась Н. К., Мазрухо Б. JI. Сравнительное изучение патогенных свойств различных по происхождению холерных вибрионов не 01 группы // Холера и патогенные для человека вибрионы. -Ростов-на-Дону, 1999. Вып. 12. - С. 65 - 66.

15. Водопьянов С.О., Парамонов И.В., Сучков И.Ю. с соавт. Конструирование специфических праймеров для выявления гена toxR холерного вибриона // Биотехнология. 2001. - № 5. - С. 70-74.

16. Водопьянов С.О., Олейников И.П., Гончаров Е.К. с соавт. Вариабельный тандемный повтор Vea Vibrio cholerae II Мол. биология. 2002. - Т. 36. - № 6. -С. 1074-1079.

17. Вуцан В.Н., Монахова Е.В., Власов В.П. с соавт. обнаружение холерныхвибрионов с помощью молекулярного зондирования // Холера. Вопр. эпидемиол., микробиол. и лаб. диагн.: Матер. Рос. науч. конф. Ростов-на-Дону, 1992. - С.172-174.

18. Гинцбург А.Д., Янишевский Н.Б., Мотин B.JI. с соавторами. Организация и клонирование структурных генов энтеротоксина Vibrio cholerae eltor RV 79 // Молекул, генетика микробиол. и вирусол. 1984. - № 9. - С. 12-19.

19. Гинцбург А.Л., Брюханов А.Ф., Янишевский Н.В. Определение наличия гена токсикообразования у холерного вибриона: методические рекомендации М., 1986.

20. Гинцбург A.JL, Брюханов А.Ф., Янишевский Н.Я., Грижебовский Г.М., Смирнов Г.М. Применение метода генного зондирования для выявления эпидемически опасных штаммов холерных вибрионов // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1987. - №11.-С. 9-13.

21. Гинцбург А.Л., Грижебовский Г.М., Токарская О.Н. с соавт. Изучение полиморфизма штаммов холерного вибриона различного происхождения методом геномной дактилоскопии // Генетика. 1989. - Т. XXV. - № 7. - С. 1320-1324.

22. Грижебовский Г.М. Холера на Кавказе (теоретические и прикладные вопросы эпидемиологии): Автореф. дисс. в форме науч. докл. . докт. мед. наук. -Ставрополь, 1997. 78 с.

23. Давыдова H.A., Куличенко А.Н., Федоров H.A. с соавт. Тест-система для выявления возбудителя холеры методом полимеразной цепной реакции // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1999. - № 79. - С. 72-76.

24. Демкин В.В., Бруханский Г.В., Захаренко В.И. Молекулярная биология микроорганизмов // Генетика. 1994. - Том 30, приложение. - С. 41.

25. Дьяченко А.Г., Липовская В.В., Дьяченко П.А. Особенности иммунного ответа при острых кишечных инфекциях, вызванных патогенными энтеробактериями // Журн. микробиол. 2001. - № 5. - С. 108-113.

26. Ерошенко Г.А., Осин A.B., Смирнова Н.И. Риботипирование штаммов Vibrio cholerae 0139, полученных из различных источников // Проблемы особо опасн. инф. Саратов, 2002. - С. 80-85.

27. Ефременко В.И., Жилченко Е.Б., Савельева И.В. Иммобилизованные системы в диагностике холеры // Холера. Материалы VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «ХОЛЕРА». Ростов-на-Дону, 2003. -С. 196-198

28. Ефремов И.А., Чистяков Д.А., Носиков В.В. анализ полиморфизма двух гипервариабельных районов генома человека в русской популяции Москвы с помощью полимеразной цепной реакции // Молекул, биология. 1996. - № 30.-С. 307-318.

29. Зиатдинов В.Б. Характеристика культур Vibrio cholerae, выделенных в очагаххолеры в г.Казань // Журн. микробиол. 2002. - № 6. - С. 78-80

30. Ильина Т.С., Романова Ю.М. Геномные острова бактерий: организация, функции, роль в эволюции // Молекул, биология. 2002. - Т. 36 - № 2. - С. 228-239.

31. Казакова Е.С., Абрамова Е.Г., Маннаева A.M. с соавт. Фаголизабельные свойства штаммов Vibrio cholerae, выделенных в отдельных регионах Дагестана в 1994 году // Журн. Микробиол. 1995. - №2 (прил.). - С. 78-80.

32. Кокушкин A.M., Смирнова Н.И., Остроумова Н.М. Отчет НИИ «Микроб» по теме: «Изучение механизма фагорезистентности вирулентных vct+ штаммов V.cholerae eltor к холерным диагностическим фагам ХДФ-3,4,5» Саратов, 1998.-36 с.

33. Кутырев В.В., Смирнова Н.И. Генодиагностика и молекулярное типирование возбудителей чумы, холеры и сибирской язвы // Молекул, генетика, микробиол. и виру со л. 2003. - № 1. - С. 6-13

34. Лабораторная диагностика холеры // Методические указания МУ 4.2. 2002.- Москва, 2002.

35. Ливанова Л.Ф., Смирнова Н.И. Определение эпидемической значимости природных штаммов холерных вибрионов //Проблемы особо опасн. инф. -Саратов,- 1994. -№ 4. С. 29-35.

36. Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Пушкарева В.И. с соавт. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий // Под. ред. C.B. Прозоровского. М., 1998. - 256 с.

37. Литвин В.Ю., Марамович A.C., Гинцбург А.Л. Стратегия адаптивной изменчивости холерных вибрионов в природных водоемах // Вестник РАМН- 2001. -№ 11.-С. 20-25.

38. Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Подосинникова Л.С. с соавт. Холера в СССРв перид седьмой пандемии // Вестн. Всесоюз. Микробиол. общ. Ростов-на-Дону, 1990. - Вып. 2. - С. 16-18.

39. Ломов Ю.М. Пандемии холеры и эволюция возбудителя // Холера. Материалы VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «ХОЛЕРА». Ростов-на-Дону, 2003. - С. 13-23.

40. Льюин Б. Гены. М.: Мир, 1987. - 455 с.

41. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.-480 с.

42. Мишанькин Б. Н., Романова JI. В., Ломов Ю. М. с соавт. Vibrio cholerae 0139, выделенные от людей и из воды открытых водоемов: сравнительное генотипирование // Журн. микробиол. 2000. - № 3. - С. 3-7.

43. Мишанькин Б.Н., Ломов Ю.М., Бардых И.Д. с соавт. Эволюция приемов оценки эпидемиологической значимости штаммов холерных вибрионов // Эпидемиология и инфекц. болезни 2002. ~№4. - С.57-61

44. Момыналиев К.Т., Говорун В.М. Перспективы применения методов ДНК-диагностики в лабораторной службе // Клин. лаб. диагностика. 2000. - №5. - С.1-26

45. Монахова Е.В., Михась Н.К., Смоликова A.M., Мишанькин Б.Н. Изучение генетических детерминант токсинов кассеты вирулентности и нейраминидазы холерных вибрионов с помощью молекулярного зондирования // Журн. микробиол. 2001. - № 2. - С. 25-29.

46. Москвитина Э.А., Ломов Ю.М., Голубев Б.П., Пасюков В.В. с соавт. Вспышка холеры в городе Вилково Одесской области в 1991 году // Холера: Материалы Рос. науч. конф. Ростов-на-Дону, 1992. - С. 44-47.

47. Москвитина Э.А., Ломов Ю.М.,Беспалов А.И. Седьмая пандемия холеры: характеристика современного периода // Холера. Материалы VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «ХОЛЕРА». Ростов-на1. Дону, 2003,- С. 24-31

48. Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп при работе методом ПЦР // Методические указания МУ 3.5.5. -1034-01.- Москва, 2001.

49. Омарова Б.К, Асваров Б.М, Адамов А.К. Сравнительная оценка разных методов определения вирулентности холерных вибрионов // Проблемы особо опасн. инф. Саратов, 2000. - № 80. - С. 101-108.

50. Омарова Б.К, Давыдова H.A., Куличенко А.Н. с соавт. Мультиплексная полимеразная цепная реакция для обнаружения и биотипирования токсигенных штаммов Vibrio cholerae II Тез. докл. 3-й Всерос. науч.-практ. конф. М, 2000. - С. 304-307.

51. Онищенко Г.Г, Ломов Ю.М, Покровский В.И. с соавт. // Актуальные проблемы холеры./ Под ред. Покровского В.И. М. - 2000. - С.384.

52. Онищенко Г.Г, Ломов Ю.М, Мишанькин Б.Н. с соавт. Характеристикахолерных вибрионов эльтор, выделенных в г. Казань, в 2001 г. // Журн. микробиол. 2002. - № 2. - С.3-6.

53. Осин А. В. Фенотипический и генетический анализ вирулентных и авирулентных штаммов Vibrio cholerae 0139: Автореф. дис.канд. биол. наук. Саратов, 2002. - 22 с.

54. Осин A.B., Ерошенко Г.А., Лозовский Ю.В., Смирнова Н.И. Сравнительный ПЦР-анализ структуры генома вирулентных и авирулентных штаммов Vibrio cholerae серогруппы 0139 // Проблемы особо опасн. инф. Саратов, 2003. -№85-С. 97-103.

55. Парамонов И.В., Вахнов Е.Ю., Воробьев A.A. Обнаружение и идентификация холерных вибрионов с использованием полимеразной цепной реакции // Проблемы особо опасн. инф. Саратов, 1999. - № 79. - С. 95-102.

56. Подосинникова Л.С., Ломов Ю.М., Власов В.В. с соавт. Молекулярное зондирование холерного вибриона с целью эпидемиологического анализа // Вестник Всесоюзного микробиологического общества. Ростов-на-Дону, 1989.-Вып.1-С. 35-38.

57. Подосинникова Л. С. Холерные вибрионы, выделенные на территории СССР в период седьмой пандемии: Автореф. дис. д-ра мед. наук. Саратов, 1993. -44 с.

58. Подосинникова J1.C., Мазрухо Б.Л., Ломов Ю.М. с соавт. Некоторые особенности Vibrio cholerae, выделенных в Дагестане в 1994 г. // Журн. Микробиол. 1995. - №2 (прил.). - С. 74-77.

59. Ратникова Л.И., Кузьмина Н.Я. Случай холеры в Челябинске // Эпидемиол. инф. болезней. 2002. - № 2. - С. 53-54.

60. Ривкус Ю. 3., Зайцева Т. С., Кочеровская Е. Ю. с соавт. Способность лизировать эритроциты человека как фактор патогенности Vibrio cholerae II Журн. микробиол. 1999. - № 6. - С. 86-87.

61. Романова Ю.М., Бошнаков Р.Х., Баскаков Т.В., Гинцбург А.Л. Механизмы активации патогенных бактерий в организме хозяина // Журн. микробиол.2000.-№4.-С. 7-11.

62. Романова Ю.М., Ильина Т.С., Гинцбург А.Л. Мобильные генетические элементы и их роль в эволюции патогенных бактерий // Вестник РАМН2001.-№ 11. С.15-20.

63. Савельев В.Н. Холера эльтор (эпидемические и микробиологические аспекты): Автореф. дисс. . док. мед. наук. Ставрополь, 1998. - 48 с.

64. Савельев В.Н. Сравнительное изучение клинических проявлений эпидемической и неэпидемической холеры // Холера. Материалы VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «ХОЛЕРА». -Ростов-на-Дону, 2003. С. 244-245.

65. Савостина Е.П., Попов Ю.А., Каштанова Л. Н. Анализ геномного полиморфизма типовых и атипичных штаммов возбудителя чумы с использованием ПЦР с универсальными праймерами // Молекул, генет., микробиол. и вирусол. 2004. - № 1. - С. 22-26.

66. Санитарные правила СП 1.2.011 94 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности». - Москва, 1994

67. Сергиев В.П., Марамович A.C. Эпидемиологические и этиологические проблемы холеры Эль-Тор // ТМЭИ.-1988.-№1.- С. 88-94.

68. Смирнова Н.И. Генетический контроль патогенности Vibrio cholerae: умеренный нитевидный фаг СТХ, кодирующий холерный токсин, и «остров патогенности» // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1999. - №4. -С.3-11

69. Смирнова Н.И. Возбудитель холеры новой 0139 серогруппы: молекулярно-генетические особенности и происхождение // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 2002. - №3. - С.23-33

70. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследований // Под ред. М. О. Бригера. 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1982. - 462 с.

71. Туйгунов М.М., Габидуллин З.Г., Зурочка A.B., Бухарин О.В. Молекулярные механизмы взаимоотношений организма и патогенных энтеробактерий // Журн. микробиол. 2003. - № 4. - С. 23-27.

72. Холера в СССР в период VII пандемии. /Под ред. В.И.Покровского. М:1. Медицина, 2000 - 470 с.

73. Челдышова Н.Б. Дифференциация штаммов Vibrio cholerae Ol с различной эпидемической значимостью на основании четырех генов вирулентности: ctxA, tcpA, toxR и hapA: Дисс. . канд. мед. наук. Саратов, 2002. - 173 с.

74. Четина Е.В., Гинцбург A.A., Грижебовский А.Ф. Исследование эпидемической значимости некультивируемых форм холерных вибрионов методом полимеразной цепной реакции // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. и вирусол. 1992. - № 3. - С. 21-24.

75. Шагинян И.А., Гинцбург А.Л. ПЦР-генетическое типирование патогенных микроорганизмов // Генетика. 1995. - Т. 31. - №5. - С.600 - 610.

76. Шагинян И.А., Першина М.Ю. Генетические маркеры в эпидемиологии бактериальных инфекций // Журн. микробиол. 1997. - № 4. - С.54-59.

77. Шагинян И.А. Роль и место молекулярно-генетических методов в эпидемиологическом анализе внутрибольничных инфекций // Клин, микроб.и антимикроб.терапия. 2000. - № 3. - Т. 2. - С. 82-95.

78. Adair D.M., Worsham P.L., Hill K.K. et al. Diversity in a variable-number tandem repeat from Yersinia pestis // J.Clin.Microbiol. 2000. - Vol. 38. - P. 1516-1519

79. Aidara A., Koblavi S., Boye C.S., et al. Phenotypic and genotypic charakterization of Vibrio cholerae isoletes from a resent cholera outbreak in Senegal: comparison of Guinea-Bissau // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1998. - Vol. 58. - N. 2. - P.163-167.

80. Akopyanz N., Bukanov N.O., Westblom T.U. et al. DNA diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori detected by PCR-based RAPD fingerprinting // Nucleic Acids Res. 1992. -N. 20. -P.5137-5142.

81. Albert M. Epidemiology & molecular biology of Vibrio cholerae 0139 Bengal // Indian J. Med. Res. 1996. - Vol.104. - P. 14-27.

82. Ali M., Emch M., Donnay J.P. et al. Identifying environmental risk factors for endemic cholera: a raster GIS approach // Health & Place 2002. - Vol. 8 - P.201-210.

83. Arakawa E., Murase Т., Matsushita S. et al. Pulsed-field gel electrophoresis-based molecular comparison of Vibrio cholerae Ol isolates from domestic and imported cases of cholera in Japan // J. Clin. Microbiol. 2000. - V. 38. - P. 424^26.

84. Baptista M.A.S. et al., Andrade J.R.C., Vicente A.C.P., et al. The Amazonia variant of Vibrio cholerae: molecular identification and study of virulence genes // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 1998. - Vol. 93, - № 5. -P.601-607.

85. Baselski, V. S., R. A. Medina, and C. D. Parker. Survival and multiplicationof Vibrio cholerae in the upper bowel of infant mice // Infect. Immun. 1978. -22:435^140.

86. Baudry, B., Fasano A., Ketley J., Kaper J. B. Cloning of a gene additional support for, our new model describing production of (zot) encoding a new toxin produced by Vibrio cholerae II Infect. Immun. 1992. - Vol. 60. P. 428- 434.

87. Benitez J.J., Silva A, Finkelstein A. Environvental signals controlling production of hemagglutinin/protease in V cholerae. II Infect Immune. 2001. - Vol.69 - N. 10-P. 6549-6553.

88. Berche P., Poyart C., Adachin E. et al. The novel epidemic strain 0139 is closely related to the pandemic stran 01 of Vibrio cholerae II J. Infect. Dis. 1994. - Vol. 170.-701-704

89. Bhaskaran K., Rouley D., Nutritional stadies on Vibrio cholerae II Gen. Microbiol. 1956. - V.15, N 2. - P.417-422.

90. Bomchil N., Watnick P., Kolter R. Identification and characterization of a Vibrio cholerae gene, mbaA, involved in maintenance of biofilm architecture // J. Bacteriol. 2003. - Vol. 185 - N4 - P. 1384-1390

91. Booth B. A., Finkelstein R. A. Presence of hemagglutinin/protease and other potential virulence factors in 01 and non-Ol Vibrio cholerae. II Journal of Infectious Diseases. 1986. - Vol. 154, № 1. -P.183-186.

92. Boyd E.F., Heilpern J., Waldor M.K. Molecular analyses of a putative CTXcj) precursor and evidence for independent acquisition of distinct CTX(|>s by toxigenic Vibrio cholerae. II J. Bacteriology. 2000. - Vol. 182 - N19 - P. 5530-5538.

93. Boyd E.F., Waldor M.K. Alternative mehanism of cholera toxin aqisinion by Vibrio cholerae\ generalized transduction of CTXcj) by bacteriophage CP-T1. 11 Infection and Immunity. 1999. - Vol. 67. - P.5898-5905.

94. Boyd, E. F., Moyer K.E., Shi L., Waldor M.K. Infectious CTX^ and the vibrio pathogenicity island prophage in Vibrio mimicus: evidence for recent horizontal transfer between V mimicus and V. cholerae II Infect. Immun. 2000. - Vol. 68. -P.1507-1513

95. Boyd E.F., Waldor M.K. Evolutionary and functional analyses of variants of the toxin-coregulated pilus protein TcpA from toxigenic Vibrio cholerae non-01/non0139 serogroup isolates //Microbiology. 2002. - Vol.148. - P.1655-1666.

96. Byun R., Elbourne L. D., Lan R., Reeves P. R. Evolutionary relationships of pathogenic clones of Vibrio cholerae by sequence analysis of four housekeeping genes // Infect. Immun. 1999. - Vol. 67. - P. 1116-1124.

97. Campos J., Fando R., Silva A. et al. Replication function of the RSI element associated with Vibrio cholerae CTXc.} prophage // FEMS Microriol. Lett. 1998. -Vol. 164.-P. 141-147.

98. Chakraborty S., Mukhopadhyay A.K., Bhadra R.K. et al. Virulence genes in environmental srtains of Vibrio cholerae II Appl. Environ. Microbiol. 2000. -Vol.66-N. 9-P. 4022-4028

99. Chhotray G.P., Pal B.B., Khuntia H.K. et al. Incedence and molecular analysis of Vibrio cholerae associated with cholera outbreak subsequent to supper cyclone in Orissa, India//Epidemiol. Infect. -2002. Vol.128. - №2. - P. 131-138

100. Chiang, S. L., Mekalanos J.J. Use of signature-tagged transposon mutagenesis to identify Vibrio cholerae genes critical for colonization // Mol. Microbiol. 1998. -Vol. 27.-P. 797-806.

101. Chiavelli D.A., Marsh J.W., Taylor R.K. The mannose-sensitive hemagglutinin of Vibrio cholerae promotes adherence to zooplankton // Appl. Environ. Microbiol. -2002. Vol.67 - N7 - P.3220-3225

102. Chow K. H., Ng T.K., Yuen K.Y., Yam W.C. Detection of RTX toxin gene in Vibrio cholerae by PCR // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39. - P. 2594-2597.

103. Chun J., Huq A., Colwell R.R. Analysis of 16S-23S rRNA intergenic spacer regions of Vibrio cholerae and Vibrio mimicus // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - Vol. 65 - N. 5 - P. 2202-2208.

104. Coelho A., Andrade J., Vicente A. C., Salles C. New variant of Vibrio cholerae 01 from clinical isolates in Amazonia// J. Clin. Mocrobiol. 1995. - Vol. 33. - P. 114-118.

105. Coelho A., Andrade J. R. C., Vicente A.C.P., DiRita V.J. Cytotoxic cell vacuolating activity from Vibrio cholerae hemolysin // Infect. Immun. 2000. -Vol.68.-N. 3. -P.1700-1705.

106. Colwell R.R., Hug A. Vibrios in the environment: viable but nonculturable // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1994. - Vol. 740. - P.44-54.

107. Cotter P.A., DiRita V.J., Bacterial virulence gene regulation: an evolutionary perspective // Annu. Rev. Microbiol. 2000. - V. 54. - P. 519-565.

108. Crawford J. A., Kaper J. B., DiRita V. J. Analysis of ToxR dependent transcription activation of ompU, the gene encoding a major envelope protein in Vibrio cholerae II Mol. Microbiol. 1998. - Vol. 29. - P. 235-246.

109. Dalsgaard A., Echeverria P., Larsen J. L. et al. Application of ribotyping for differentiating Vibrio cholerae non-Ol isolates from shrimp farms in Thailand // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - Vol. 61. - P. 245-251.

110. Dalsgaard A., Serichantalergs O., Forslund A., et al. Clinical and environment isolates of Vibrio cholerae serogroup 0141 carry the CTX phage and genesencoding the toxin-coregulated pili // J. Clin. Microbiology. 2001. - Vol. 39 - N. 11.-P. 4086-4092.

111. Davis B.M., Kimsey H.H., Kane A.V., et al A satellite phage-encoded antirepressor induces repressor aggregation and cholera toxin gene transfer // The EMBO Journal 2002. - Vol.21 - N. 16 - P.4240-4249.

112. Davis B.M., Moyer K.E., Boyd E.F., Waldor M.K. CTX Prophages in classical biotype Vibrio cholerae: functional phage genes but dysfunctional phage genomes // J. Bacteriology. 2000. - Vol. 182. - N. 24 - P. 6992-6998.

113. Davis B.M., Waldor M.K. Filamentous phages linked to virulence of Vibrio cholerae II Curr. Opinion in Microbiol. 2003. - Vol. 6 - P. 1-8.

114. De S.N., Chatterjee D.N. An experimental study of the mechanism of action of "Vibrio cholerae" on the intestinal mucous membrane // J. Pathol, and Bact. -1953.-Vol. 66.-P. 559-562.

115. Di Giovine F.S., Mee J.B., Duff G.W. Immunoregulatory cytokines // CRC Press, London, UK. 1996. - P.38-65.

116. Diagnostic molecular pathology. A practical approach. / Edited by C.S. Herrington, J.O: McGee, IRL Press Limited, 1992. 558 p.

117. Dziejman M., Balon E., Boyd D., et al. Comparative genomic analysis of Vibrio cholerae'. genes that correlate with cholera endemic and pandemic disease // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - Vol. 99-N. 3. - P. 1556-1561.

118. Dutta N.K., Habbu M.K. Experimental cholera in infant rabbits: method for chemotherapeutic investigation // Brit. J. Pharmacol. 1955. - Vol. 10. - N. 2. - P. 153-159.

119. Farfan M., Minana-Galbis D., Fuste M. C., Loren J. G. Allelic diversity andpopulation structure in Vibrio cholerae 0139 Bengal based on nucleotide sequence analysis//J. Bacteriol. 2002. - V. 184.-P. 1304-1313.

120. Faruque S. M., Albert M., Mekalanos J.J. Epidemiology, genetics, and ecology of toxigenic Vibrio cholerae. II Microbiol, and Molecul. Rev. 1998. - Vol. 62. - P. 1301-1314

121. Faruque S.M., Asadulghani, Rahman M.M., et al. Sunlight-induced propagation of the lysogenic phage encoding cholera toxin. // Infect. Immune. 2000. - Vol. 68. -N. 8.-P. 4795^4-801.

122. Faruque S.M., Rahman S.M., Hasan M.M. et al. Diminished diarrheal response to V. cholerae strains carrying the replicative form of the CTX(|) genome instead of CTX^ lisogens in adult rabbits. // Infect. Immun. 2001. - Vol. 69, № 10. - 60846090.

123. Faruque S.M., Asadulghani, Kamruzzaman et al. RSI element of Vibrio cholerae can propagate horizontally as a filamentous phage exploiting the morphogenesis genes of CTXcjj // Infect. Immun. 2002. - Vol. 70. - N. 1. - P. 163-170.

124. Faruque S.M., Nair G.B. Molecular ecology of toxigenic Vibrio cholerae II Microbiol. Immunol. 2002. - Vol. 46 - P. 59-66.

125. Faruque S.M., Kamruzzaman M., Asadulghani et al. CTXphi-independent production of the RSI satellite phage by Vibrio cholerae 11 Proc.Natl.Acad.Sci USA. 2003. - Vol.100. -N. 3. - P.1280-1285

126. Faruque S.M, Kamruzzaman M, Meraj I.M. et al. Pathogenic potential of environmental Vibrio cholerae strains carrying genetic variants of the toxin-coregulated pilus pathogenicity island // Infect. Immun. 2003. - Vol. 71. - N. 2. -P. 1020-1025

127. Faruque S.M, Zhu J, Asadulghani et al. Examination of diverse toxin-coregulated pilus-positive Vibrio cholerae strains fails to demonstrate evidence for vibrio pathogenicity island phage // Infect. Immun. 2003. - Vol.71 - N6 - P.2993-2999

128. Fasano A, Baudry B, Pulmin D.W. et al. Vibrio cholerae produces a second enterotoxin, which affects intestinal tight junctions // Proc. nat. Acad. Sei. USA. -1991.-Vol. 88.-P. 5242-5246.

129. Fields P. I, Popovic T, Wachsmuth K, Olsvik O. Use of polymerase chain reaction for detection of toxigenic Vibrio cholerae Ol strains from the Latin American cholera epidemic // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30. - P. 2118— 2121.

130. Figueroa-Arredondo P, Heuser J.E, Akopyants N.S. et al. Cell vacuolation caused by Vibrio cholerae hemolysin // Infect. Immun. 2001. - Vol. 69. -N. 3. - P.1613-1624.

131. Finkelstein R.A, Boesman-Finkelstein M, Chang Y. et al. Vibrio cholerae hemagglutinin/protease, colonial variation, virulence and detachment // Infect. Immun. 1992. - V. 60. - P. 472-478.

132. Folgosa E, Mastrandrea S, Cappuccinelli P. et al. Molecular identification of pathogenicity genes and ERIC types in Vibrio cholerae Ol epidemic strains from Mozambique// Epidemiol. Infect.-2001.-Vol. 127.-N. l.-P. 17-25.

133. Fullner K.J., Lencer W.I, Mekalanos J.J. Vibrio cholerae-Induced cellularresponses of polarized T84 intestinal epithelial cell are dependent on production of cholera toxin and the RTX toxin // Infect. Immun. 2001. - Vol. 194. - P. 63106317.

134. Galen J. E., Ketley J. M., Fasano A. et al. Role of Vibrio cholerae neuraminidase in the function of cholera toxin // Infect. Immun. 1992. - Vol. 60. - P. 406-415.

135. Garg P., Nandy R.K., Chauhury P., et al. Emergence of Vibrio cholerae 01 biotype El tor serotype Inaba from the prevailing 01 Ogawa serotype strains in India // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol.38 -N. 11 - P. 4249-4253.

136. Hacia J.G., Collins F.S. Mutation analysis using oligonucleotide microarrays // J. Med. Genet. 1999. - Vol. 36. - P. 730-736.

137. Hanne L.P., Finkelstein R.A. Characterization and distribution of the hemagglutinins production by Vibrio cholerae II Infect. Immun. 1982. - Vol. 36. -P. 209-214.

138. Heid C.A. Real-time quantitative PCR// Genom Res. 1996. - N. 6. - P. 986-994.

139. Heidelberg J.F., Eisen J.A., Nelson W.C., et al. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae II Nature. 2000.1. Vol.406.-P.477-483.

140. Heilpern A.J., Waldor M.K. CTX(|> infection of Vibrio cholerae requires the tolQRA gene products // J. Bacteriol. 2000. - Vol.182 -N.6 - P.1739-1747

141. Heilpern A.J., Waldor M.K. pIIICTX, a predicted CTX(|> minor coat protein, can expand the host range of coliphage fd to include Vibrio cholerae // J.Bacteriol. -2003. Vol.185. -N.3. -P.1037-1044.

142. Higguchi R.J. Kinetic PCR Analysis: Real-time monitoring of DNA amplification reactions // Biotechnology. 1993. -N. 11. - P. 1026-1030.

143. Hoshino K., Yamasaki S., Mukhopadhyay A.K. et al. Development and evolution of a multiplex PCR assay for rapid detection of toxigenic Vibrio cholerae 01 and 0139 // FEMS Immun. And Med. Microbiol. 1998. - Vol. 20. - P. 201 - 207.

144. Hullbert R.R., Taylor R.K. Mechanism of ToxT dependent transcriptional activation at the Vibrio cholerae tcpA promoter // J. Bacteriol. - 2002. - Vol.184 -N. 20 -P.5535-5544.

145. Iida T., Makino K., Nasu H. et al. Filamentous bacteriophages of Vibrio cholerae are integrated into the dif-like site of the host chromosome // J. Bacteriol. 2002. -Vol. 184 -N. 17-P. 4933-4935

146. Iredell J.R., Manning P.A. Biotype-specific tcpA genes in Vibrio cholerae II FEMS Microbiol. Lett. 1994.-Vol. 121.-P. 47-54.

147. Iredell J.R., Manning P.A. Translocation failure of a type 4 pilin: rfb and tcpT mutants in Vibrio cholerae II Gene. 1997. - Vol. 192. - P. 71-77.

148. Iyer R., Wu Z., Woster P.M., Delcour A.H. Molecular basis for the polyamine-OmpF porin interactions: inhibitor and mutant studies // J. Mol. Biol. 2000. -Vol. 297.-P. 933-945.

149. Jenkin C.R., Rowley D. Toxic proteins from Vibrio cholerae and water vibrios which are lethal for mice // J. Gen. Microb. 1959. - Vol. 121. - P. 191-202.

150. Jermyn W.S., E.F. Boyd Characterization of novel Vibrio pathogenicity island (VPI-2) encoding neuraminidase inanH) among toxigenic Vibrio cholerae isolates // Microbiology. 2002. - Vol. 148. - P. 3681-3693.

151. Johansson A., Goransson I., Larsson P., Sjostedt A. Extensive allelic variation among Francisssella turalensis strains in a short-sequence tandem repeat region // J.Clin.Microbiol. 2001. - Vol. 39. - P. 3140-3146

152. Kaper J.B., Mosseley S. L., Falkow S. Molecular characterization of environmental and nontoxigenic strains of V cholerae II Infect. Immun. 1981. - Vol. 32. - P. 661-667.

153. Kaper J.B., Morris J.G., Levin M.M. Cholera // Clin. Microbiol. Rev. 1995. -Vol. 8.-P. 48-89.

154. Kapley A., Purohit H.J. Detection of etiological agent for cholera by PCR protocol. // Med. Sci. Monit. 2001. - Vol. 7. - N. 3. - P. 242-245.

155. Karaolis D. K. R., Johnson J. A., Bailey C. C. et al. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemik strains // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol.95. -N. 6. - P. 3134-3139.

156. Karaolis D.K.K., Kaper J.B. Pathogenicity islands and other mobile virulence elements // Eds J.B.Kaper, J. Hacker. Washington, - 1999. - P.167-187.

157. Karaolis D.K., Lan R., Kaper J.B., Reeves P.R. Comparison of Vibrio cholerae pathogenicity islands in sixth seventh pandemic strains // Infect. Immun. 2001. -Vol. 69.-N3-P. 1947-1952.

158. Kazemi M., Finkelstein R.A. Mapping epitopic regions of cholera toxin B-subunit protein//Mol. Immunol. 1991.-Vol. 28.-P. 865-876.

159. Keasler S. P., Hall R.N. Detecting and biotyping V cholerae 01 with multiplex polimerase chain reaction // Lancet. 1993 - Vol. 341. - P. 1661.

160. Kimsey H.H., Nair G.B., Ghosh A., Waldor M.K. Diverse CTXphis and evolution of new patogenic Vibrio cholerae (letter). // Lancet. 1998. - Vol. 352. - N. 9. - P. 457 - 458.

161. Kirn T.J., Lafferty MJ., Sandoe C.M.P., Taylor R.K. Delineation of pilin domains required for bacterial association into microcolonies and intestinal colonization by Vibrio cholerae II Mol. Microbiol. 2000. - Vol. 35. - N. 4. - P. 896-910.

162. Kovach M. E., Shaffer M.D., Peterson K.M. A putative integrase gene defines the distal end of a large cluster of ToxR-regulated colonization genes in Vibrio cholerae. Microbiology. 1996. - Vol. 142. - P. 2165-2174.

163. Kurazano H., Pal A., Bag P.K. et al. Distribution of genes encoding cholera toxin, zonula occludens toxin, accessory cholera toxin, and El Tor hemolysin in Vibrio cholerae of diverse origins // Microb. Pathol. 1995. - Vol. 18. - P. 231-235

164. Lacey S.W., Cholera: calamitous past, ominous future // J. Clinic. Infect. Disease.1995.-Vol. 20 -P.1409-1419

165. Lan R., Reeves P. R. Recombination between rRNA operons created most of the ribotype variation observed in the seventh pandemic clone of Vibrio cholerae II Microbiology.- 1998.-Vol. 144.-P. 1213-1221.

166. Lan R., Reeves P.R. Pandemic spread of cholera: genetic diversity and relationships within the seventh pandemic clone of Vibrio cholerae determined by amplified fragment length polymorphism //J. Clin. Microbiol. 2002. - Vol.40. -N. 1-P. 172-181.

167. Levine M. M., Kaper J. B., Black R. E., Clements M. L. New knowledge on pathogenesis of bacterial enteric infections as applied to vaccine development // Microbiol. Rev. 1983. - Vol. 47. - P. 510-550.

168. Li M., Shimada T., Morris J. G., et al. Evidence for the emergence of non-Ol and non-0139 Vibrio cholerae strains with pathogenic potential by exchange of O-antigen biosynthesis regions // Infect. Immun. 2002. - Vol.70. - N. 5. - P. 24412453.

169. Lin W., Fullner K.J., Clayton R. et al. Identification of a Vibrio cholerae RTX toxin gene cluster that is tightly linked to the cholera toxin prophage // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96. - P. 1071-1076.

170. Lipp E.K., Rivera I.N., Gil A.I. et al. Direct detection of Vibrio cholerae and ctxA in Peruvian coastal water and plankton by PCR // Appl Environ Microbiol.-2003.

171. Vol. 69.-N. 6.-P. 3676-80.

172. Lyon W.J. TaqMan PCR for detection of Vibrio cholerae 01, 0139, non-01, and non-0139 in pure cultures, raw oysters, and synthetic seawater // Appl. and Environment. Microbiol. 2001. - Vol. 67. - P.4685-4693

173. Makino S.I., Kurazono T., Okuyama Y. et al. Diversity of DNA sequences among Vibrio cholerae 0139 Bengal detected by PCR- based DNA fingerprinting // FEMS Microbiol. Lett. 1995. - Vol.126. - P. 43-48

174. Mallard K.E., Desmarchelier P.M. Detection of heat-stable enterotoxin genes among Australian Vibrio cholerae 01 strainns// FEMS Microbiol. Let. 1995. -Vol. 127.-P. 111-115

175. Manning P.A., Brown M.H., Heuzenroeder MW. Cloning of the structural gene (hly) for the haemolysin of Vibrio cholerae El Tor strain 017 // Gene. 1984. -Vol. 31.-P. 225-231.

176. Manning P.A. The tcp gene cluster of Vibrio cholerae II Gene. 1997. - Vol. 192. -P. 63-70.

177. Marsh J.W., Taylor R.K. Genetic and transcriptional analyses of the V. cholerae mannose-sensitive hemagglutinin type 4 pilus gene locus. // J. Bacteriol. 1999. -Vol. 181.-N. 4. -P.1110-1117.

178. Mekalanos J.J., Rubin E.R., Waldor K.M. Cholera: molecular basis for emergence and pathogenesis. // FEMS Immunology and Medical Microbiology. 1997. - Vol.18. -P.241-248.

179. Merrell D.S., Bailey C., Kaper J.B., et al. The toxR mediated organic acid tolerance response of Vibrio cholerae requires OmpU // J. Bacteriol. - 2001. - Vol. 183-N. 9-P. 2746-2754.

180. Mitra R.K., Nandy R.K., T. Ramamurthy et al. Molecular characterization of rough variants of Vibrio cholerae isolated from hospitalized patients with diarrhea // J. Med. Microbiol. 2001. - Vol. 50 - P. 268-276.

181. Miyagi K., Sano K., Morita C. et al. An improved method for detecting faecal Vibrio cholerae by PCR of the toxin A gene. // J. Med. Microbiol. 1999. - Vol. 48.-P. 883-889.

182. Moxon E.R., Rainey P.B. Adaptive evolution of highly mutable loci in pathogenic bacteria // Current Biology. 1994. - Vol. 4. - N. 1. - P. 24-33.

183. Mukhopadhyay A.K., Chakraborty S., Takeda Y. et al. Characterization of VPI pathogenicity island and CTX(J) prophage in environmental stains of Vibrio cholerae. II J. Bacteriol. 2001. - Vol.183 - N16 - P.4737-3746.

184. Mullis, K. B., Faloona F. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase chain reaction // Methods Enzymol. 1987. - Vol. 155. - P. 335-340.

185. Murley, Y. M., Carroll P. A., Skorupski K et al. Differential transcription of the tcpPH operon confers biotype-specific control of the Vibrio cholerae ToxR virulence regulon // Infect. Immun. 1999. - Vol. 67. - P. 5117-5123.

186. Nakamura Y., Leppert M., O'Connell P. et al. Variable number of tandem repeat (VNTR) markers for human gene mapping // Science. 1987. - Vol. 235. - P. 1616-1622.

187. Nandi B., Nandy R.K., Mukopadhyay S. et al Rapid method for species-specific identification of Vibrio cholerae using primers targeted to the of outer membrane protein OmpW // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38. -N. 11. - P. 4145-4151.

188. Nandi B., Nandy R.K., Vicente A.C.P. et al. Molecular characterization of a new variant of toxin-coregulated pilus protein (TcpA) in toxigenic non-0l/non-0139 strain of Vibrio cholerae II Infect. Immun. 2000. - Vol. 68. - N. 2. - P. 948-952.

189. Nandi S., Maiti D., Saha A., Bhadra R.K. Genesis of variants of Vibrio cholerae 01 biotype El Tor: role of the CTXphi array and its position in the genome // Microbiology. 2003. - Vol. 149. - N. 1. - P. 89-97

190. O'Shea Y.A., Boyd E.F. Mobilization of Vibrio pathogenecity island between Vibrio cholerae isolates mediated by CP-T1 generalized transduction // FEMS Microbiol. Lett. 2002. - Vol. 214.-P. 153-157

191. Ogawa A., Takeda T. The gen encoding the heat-stable enterotoxin of Vibrio cholerae is flanked by 123-base pair direct repeats // Microbiol. Immunol. 1993. -Vol. 37-N. 8. - P.607-616.

192. Olive D. M., Bean P. Principles and applications of methods for DNA-based typing of microbial organisms // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37. - P. 1661-1669.

193. Pal A., Saha P.K., Nair J.B. et al. Clonal analysis of non-toxigenic Vibrio cholerae 01 associated with an outbreak of cholera// Indian J. Med. Res. 1999. - Vol. 109. -P. 208-211.

194. Parsot C., Mekalanos J J. Expression of Vibrio cholerae gene encoding aldehyde dehydrogenase is under control of ToxR the cholera toxin transcriptional activator // J. Bacteriol. 1991. - Vol. 173. -N. 9. - P. 2842-2851.

195. Pearson G. D. N., Woods A., Chiang S. L. et al. CTX genetic element encodes a site-specific recombination system and an intestinal colonization factor // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol. 90. - P. 3750-3754.

196. Pichel M., Rivas M., Chimen I. et al. Genetic diversity of Vibrio cholerae 01 in Argentina and emergence of a new variant 11 J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol. 41. -N. l.-P. 124-134.

197. Pourshafie M. R., Grimont F., Saifi M. and Grimont P.A.D. Molecular epidemioigical study of Vibrio cholerae isplates from infected patients in Tegeran, Iran // J. Med. Microbiol. 2000. - Vol. 49. - P. 1085-1090.

198. Pourshafie M. R., Grimont F., Kohestani and Grimont P.A.D. A molecular and phenotypic study of Vibrio cholerae in Iran // J. Med. Microbiol. 2002. - Vol. 51. -P. 392-398.

199. Provenzano, D., C. M. Lauriano, and K. E. Klose. Characterization of the role of the ToxR-modulated outer membrane porins OmpU and OmpT in Vibrio choleraevirulence // J. Bacteriol. 2001. - Vol. 183. - P. 3652-3662.

200. Qu M., Xu J., Ding Y. et al. Molecular epidemiology of Vibrio cholerae 0139 in China: polymorphism of ribotypes and CTX elements.// J Clin Microbiol. 2003. -Vol. 41.-N. 6.-P. 2306-2310.

201. Reidl J., Klose K. Vibrio cholerae and cholerae: out of the water and into the host //FEMS Microbiol. Rev. 2002. - Vol.26-P. 125-139.

202. Rhine J.A., Taylor R.K. TcpA pilin sequences and colonization requirements for Ol and 0139 Vibrio cholerae II Mol. Microbiol. 1994. - Vol. 13. -N. 6. - P. 1013-1020.

203. Rivera I.N., Chun J., Huq A. et al. Genotypes associated with virulence in environmental isolates of Vibrio cholerae!I Appl. Environ. Microbiol. 2001. -Vol. 67. - N. 6. - P. 2421-2429.

204. Rivera IN, Lipp EK, Gil A. et al. II Method of DNA extraction and application of multiplex polymerase chain reaction to detect toxigenic Vibrio cholerae Ol and 0139 from aquatic ecosystems//: Environ Microbiol. 2003. - Vol. 5. - N. 7. - P. 599-606.

205. Rui Y., Cai C., Xiao B. et al. Simultaneous detection and differentiation of 01 classical El Tor, 0139 and nonOl non0139 strains of Vibrio cholerae by using multiplex PCR// Zhonghua Yu Fang Yi Xue Za Zhi. 2000. - Vol. 34. - N. 5. - P. 278-280

206. Sack D.A., Huda S., Neogi P.K.B. et al. Microtiter ganglioside enzyme-linked immunosorbent assay for Vibrio and Esherichia coli heat labile enterotoxins and antitoxins// J.Clin.Microbiol. 1980. - Vol. 170. - P. 1587-15230

207. Saha P.K., Koley H., Mukhopadhyay A.K. et al. Non-toxigenic Vibrio cholerae 01 serotype Inaba biotype El Tor associated with a cluster of cases of cholera in Southern India// J. Clin. Microbiol. 1996. - Vol. 34. - P. 114-117.

208. Saha S., Sanyal S.C. Cholera toxin gene-positive Vibrio cholerae 01 Ogawa and Inaba strains produce the new cholera toxin // FEMS Microbiol. Lett. 1988. -Vol. 50-P.113-116.

209. Salles C. A., Momen H., Vicente A. C. P., Coelho A. Vibrio cholerae in South America: polymerase chain reaction and zymovar analysis // Trans R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1993. - Vol. 87. - P. 272.

210. Sarkar A., Nandy R.K., Nair G.B., et al. Vibrio pathogenicity island and cholera toxin genetic element-associated virulence genes and their expression in non-Ol non-0139 strains of Vibrio cholerae // Infect. Immun. 2002. - Vol.70 - N. 8 -P.4735-4742.

211. Schumm J.W., Knowlton R.G., Braman J.C. et al. Identification of more than 500 RFLPs by screening random genomic clones// Am.J. Hum. Genet. 1988. - Vol. 42.-P. 143-159.

212. Schwartz D.C., Cantor C.R. Separation of yeast chromosomesized DNAs by pulsefield gradient gel electrophoresis// Cell. 1984. - Vol. 37. - P.67-75.

213. Sears, C. L., Kaper J. B. Enteric bacterial toxins: mechanisms of action and linkage to intestinal secretion // Microbiol. Rev. 1996. - Vol. 60. -N. 1. - P. 167-215.

214. Sechi L.A., Dupre I., Deriu A. el al. Distribution of Vivrio cholerae virulence genes among different Vibrio species in Sardinia, Italy // J. Appl. Microbiol. -2000.-Vol.88.-N. 3. -P.475-481

215. Shangkuan Y. H., Show Y.S., Wang T.M. Multiplex polymerase chain reaction to detect toxigenic Vibrio cholerae and to biotype Vibrio cholerae 01 //J. Appl. Bacteriol. 1995. - Vol. 79. - P. 264-273.

216. Sharma C., Maiti S., Mukhopadhyay A. K. el al. Unique organization of the CTX genetic element in Vibrio cholerae 0139 strains which reemerged in Calcutta, India, in September 1996 // J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35. - P. 3348-3350.

217. Shirai H, Nishibuchi M, Ramamurthy T et al: Polymerase chain reaction for detection of the cholera enterotoxin operon of Vibrio cholerae II J Clin Microbiol. -1991,- Vol. 29.-P. 2517-21

218. Silva A.J., Pham K, Benitez J.A. Haemagglutinin/protease expression and mucin gel penetration in El Tor biotype Vibrio cholerae.ll Microbiology 2003. -Vol. 149-P. 1883-1891

219. Singh D.V., A. Tikoo, Sanyal S.C. Production of the new cholera toxin by environmental isolates of Vibrio cholerae non-Ol// Bact. Pathogenicity. 1996. -Vol. 1.-P. 31-34

220. Singh D.V., Isac S.R., Colwell R.R. Development of a hexaplex PCR assay for rapid detectionof virulence and regulatory genes in Vibrio cholerae and Vibrio mimicus // J. Clin. Microbiol. 2002. - Vol. 40. - N. 11. - P. 4321-4324.

221. Sinha S., Chakraborty R., De K. et al. Escalating assotiation of Vibrio cholerae 0139 with cholera outbreaks in India // J. Clin. Microbiol. 2002. - Vol. 40. - N. 7.-P. 2635-2637.

222. Skorupski K., Taylor R.K. A new level in the Vibrio cholerae ToxR virulence cascade: AphA is required for transcriptional activation of the tcpPH operon (In process citation). // Mol. Microbiol. 1999. - Vol.31, № 3. - P.763-771.

223. Stroeher U.H., Jedani K.E., Manning P.A. Genetic organization of the regions associated with surface polysaccharide synthesis in Vibrio cholerae 01, 0139 and Vibrio anguillarum 01 and 02: a review // Gene. 1998. - Vol. 223 (1-2). -P.269-282.

224. Stull T. L., LiPuma J. J., Edlind T. D. A broad spectrum probe for molecular epidemiology of bacteria: ribosomal RNA // J. Infect. Dis. 1988. - V. 157. - P. 280-286.

225. Svennerholm A.M., Stromberg G.J. Holmgren, J. Purification of Vibrio cholerae soluble haemagglutinin, development enzyme-linked immunosorbent assays for antigen, antibody quantitations // Infect. Immun. 1983. - V. 41. - P. 237.

226. Svennerholm A.M., Wiklund G. Rapid GMrenzyme-linked immunosorbent assay with visual reading for identification of Escherichia coli heat-labile enterotoxin // J. Clin. Microbiol. 1983. - Vol. 17. - P. 262-270.

227. Sykes P.J., Neoh S.H., Brisco M.J. et al. Quantitation of targets for PCR by use oflimitining dilution // BioTechniques. 1995. - N. 13. - P. 444-449

228. Tan N.H. Tan C.S. Acidimetric assay of phospholipase A using egg yolk suspension as substrate // Anal. Biochem. 1988. - V. 170. - P. 282-288.

229. Tenover C.F., Arbeit R.D., Goering R.V. et al Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by puls-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing// J. Cin. Microbiol. 1995. - Vol. 33. - P.2233 - 2239.

230. Toma C., Kuroki H., Nakasone N. et al. Minor pilin subunits are conserved in Vibrio cholerae type IV pili// FEMS Immunol Med Microbiol. 2002. - Vol. 33. -P. 35-40.

231. Trucksis M., Galen J.E., Mishalski J. el al. Accessory cholera enterotoxin (Ace), the third toxin of a Vibrio cholerae virulence cassette // Proc. Notl. Acad. Sci. USA. 1993.-Vol. 90.-P. 5267-5271.

232. Trucksis M., Michalski J., Deng Y. K., Kaper J. B. The Vibrio cholerae genome contains two unique circular chromosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998. -Vol. 95.-P. 14464-14469.

233. Vance R.E., Zhu J., Mekalanos J.J. A consultatively active variant of the quorum-sensing regulator LuxO affects protease production and biofilm formation in Vibrio cholerae II Infect. Immun. 2003. - Vol. 71 - N. 5 - P.2571-2576.

234. Vassart G., Georges M., Monsieur R. at al. A sequence in M13 phage detects hypervariable minisatellites in human and animal DNA// Science. 1987. - Vol.235.-N. 4789. P.683-684

235. Versalovic J., Koeuth T., Lupski J.R. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes// Nucleic.Acids Res. 1991.-Vol. 19.-P.6823-6831.

236. Vicente A.C.P., Coelho A.M., Salles C.A. Detection of Vibrio cholerae and Vibrio mimicus heat stable toxin gen sequence by PCR // J. Med. Microbiol. 1997. -Vol. 46.-P. 398-402.

237. Vos P., Hogers R., Bleeker M. et al. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting// Nucleic.Acids Res. 1995. - Vol. 23. - P. 4407-4417.

238. Wagner P.L., Waldor M.K. Bacteriophage control of bacterial virulence // Infect. Immun. 2002. - Vol.70 - N.8 - P.3985-3993.

239. Waldor M. K., Mekalanos J. J. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin // Science. 1996. - V. 272. - P. 1910-1924.

240. Waldor M. K., Rubin E. J., Pearson G. D. et al. Regulation, replication, and integration functions of the Vibrio cholerae CTX(p are encoded by region RS2 // Mol. Microbiol. 1997. -V. 24. - P. 917-926.

241. Waldor M.K., Lasar S., Kimsey H., Williams J., Mekalanos J.J. CTX<j): a novel filamentous phage encording cholera toxin // Bacterial Protein Toxins: Eighth European Workshop. 1998. - Vol.29. - P. 363-371.

242. Wang S. Y., Lauritz J., Jass J., Milton D. L. A ToxR homolog from Vibrio anguillarum serotype 01 regulates its own production, bile resistance, and biofilm formation // J Bacteriol. 2002. - Vol. 184. -N. 6. - P. 1630-1639.

243. Watnick P.J., Fullner K.J., Kolter R. The role for the mannose-sensitive hemagglutinin in biofilm formation by Vibrio cholerae El Tor // J. Bacteriol.1999.-Vol. 181, N 11. -P. 3606-3609.

244. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers //Nucleic. Acids Res. 1990.-Vol. 18.-P. 7213 -7218

245. Williams J.G., Kubelic A.R., Livak K.J. et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are usful genetic markers// Nucleic. Acids Res. 1990. - Vol. 18. -P. 6531-6535.

246. Wong H.C., Lin C.H. Evaluation of typing of Vibrio parahaemolyticus by three PCR methods using specific primers // J.Clin.Microbiol. 2001. - Vol. 39. - N. 12.-P. 4233-4240

247. Zhang D., Xu Z., Sun W., Karaolis DK. The Vibrio pathogenicity island-encoded Mop protein modulates the pathogenesis and reactogenicity of epidemic Vibrio cholerae II Infect. Immun. 2003. - Vol. 71 - N. 1 - P.510-515.

248. Zhu J., Miller M., Vance R.E., et al. Quorum-sensing regulators control virulence gene expression in Vibrio cholerae // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - Vol. 99 -N. 5-P. 3129-3134

249. Zo Y.G., Rivera I.N.G., Russek-Cohen E. Genomic profiles of clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae 01 in cholera-endemic areas of Bangladesh // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - Vol. 99 - N. 19 - P. 1240912414.

Информация о работе

Костромитина, Елена Александровна
кандидата медицинских наук
Саратов, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Молекулярно-генетические свойства штаммов холерного вибриона эльтор с различной эпидемической значимостью - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы