Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дифференциация штаммов VIBRIO CHOLERAE O1 с различной эпидемической значимостью на основании четырех генов вирулентности ctxA, tcpA, toxR и hapA

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Дифференциация штаммов VIBRIO CHOLERAE O1 с различной эпидемической значимостью на основании четырех генов вирулентности ctxA, tcpA, toxR и hapA"

РГ5 ОД

2 2 А Л Р 2002

ЧЕЛДЫШОВА Надежда Борисовна

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ШТАММОВ ЩВЫО СНОЬЕЯАЕ 01 С РАЗЛИЧНОЙ ЭПИДЕМИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТЬЮ НА ОСНОВАНИИ ЧЕТЫРЕХ ГЕНОВ ВИРУЛЕНТНОСТИ: <*хА, 1срА,

^хИ и ЬарА

03.00.07 — микробиология 14.00.30— эпидемиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов, 2002

Работа выполнена в Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор В.В. Кутырев, доктор биологических наук, профессор Н.И.Смирнова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Л.В. Самойлова

доктор биологических наук, ст.н.с. Ю.М. Романова

Ведущая организация: Ростовский-на-Дону научно-исследовательский

противочумный институт

Защита состоится « 2 » апреля 2002 г. в [О часов на заседании Диссертационного Совета Д 208.078.01 по присуждению ученой степени доктора (кандидата) наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» (410005, г. Саратов, Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РосНИПЧИ «Микроб».

Автореферат разослан <¿8 » февраля 2002 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

доктор биологических наук, профессор Г.А. Корнеев

Г)

/ ^

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Холерные вибрионы биовара эльтор, выделяемые из внешней среды, относятся к двум разным вариантам, один из которых способен вызывать эпидемии, тогда как второй эпидемически безопасен. В этой связи в системе эпидемиологического надзора за холерой важнейшее значение имеет как своевременное выделение штаммов холерного вибриона из различных объектов внешней среды, так и оценка их эпидемической значимости. В последние годы решению этих задач в значительной мере способствует использование полимеразной цепной реакции (ПЦР). Тем не менее, к моменту начала наших исследований не было информации об использовании в ПЦР видоспецифического генного маркера для идентификации вибрионов вида Vibrio cholerae. Основным же критерием эпидемически опасных штаммов V. cholerae 01 считалось присутствие в их геноме структурных генов ctxAB (или vctAB), кодирующих биосинтез холерного токсина [Гинцбург A.M. с соавт., 1987; 1988; Четина Е.В. с соавт., 1992; 1993; Подосинникова JI.C., 1993; Оншценко Г.Г. с соавт. 1996; Грижебовский A.JL, 1997; Балахонов C.B., 2000; Давыдова Н.А. с соавт., 1999; 2001], локализованных в геноме нитевидного фага СТХф [Waldor М.К., Mekalanos J.J., 1996]

Однако гены ctxAB не могут использоваться в качестве единственной генетической метки эпидемически опасных штаммов, так как они не уникальны не только для возбудителя холеры, но и для вида V. cholerae. Так, указанные гены присутствуют в хромосоме 2,0-4,0% штаммов V.cholerae не 01/не 0139 серогрупп [Ломов Ю.М. с соавт., 1992; Москвитина Э.А. с соавт., 1992; Воронежская Л.Г., 1994; Said В. et al., 1995; Kaper J.B. et al., 1995; Chakraborty S. et al., 2000; Dalsgaard A. Et al., 2001;], a также y ряда штаммов другого вида V. mimicus [Kaper J.B. et al, 1986; Farugue S.M. et al., 1999; Boyd E.F. et al., 2000], которые не способны вызывать эпидемии холеры.

Более того, так как вирулентность возбудителя холеры полидетерминантна, наличие генов ctxAB в геноме V. cholerae не является достаточным условием для развития инфекционного процесса, поскольку у этого возбудителя имеются другие ключевые гены вирулентности, без

которых развитие активного инфекционного процесса при холере невозможно.

Отсутствие к началу нашей работы ПЦР-тест-системы, позволяющей идентифицировать вибрионы вида Vibrio cholercie и наиболее полно оценивать их эпидемический потенциал, послужило основанием для разработки комплексного ПЦР-аналюа, дающего возможность выявлять в геноме изучаемых штаммов видоспецифический ген и ключевые гены вирулентности, без которых развитие холерной инфекции невозможно. В качестве видоспецифического нами был взят хромосомный ген hapA, кодирующий биосинтез растворимой гемагглютинин/протеазы (РГ/П) и присутствующий в хромосоме всех штаммов вида V. cholerae. Для получения более полной и объективной информации об эпидзначимости вибрионов в качестве генных маркеров вирулентности, кроме гена ctxA, были использованы гены tcpA и toxR. Основанием для их выбора служит тот факт, что оба гена относятся к ключевым генам патогенности. Продукт гена tcpA - основная субъединица токсин-корегулируемых пилей адгезии (ТКПА), которые обеспечивают колонизацию вибрионами тонкого кишечника человека, без чего развитие инфекции невозможно. Ген toxR обусловливает экспрессию генов ctxA и tcpA. Более того, комплексный ПЦР-анализ вибрионов позволит решить и другие задачи, связанные с большой вариабельностью генома холерных вибрионов. Так, ПЦР-тестирование основных генов вирулентности (ctxA, tcpA и toxR) среди штаммов, выделенных из различных регионов, будет служить основой для определения тактики и необходимого объема противохолерных мероприятий.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - комплексное ПЦР-тестирование штаммов V. cholerae эльтор и классического биоваров, выделенных из объектов внешней среды, от больных и носителей, на наличие в их геноме видоспецифического гена hapA и трех основных генов вирулентности (ctxA, tcpA, toxR) для их идентификации и оценки эпидемической значимости.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Определить возможность использования комплексной ПЦР, основанной на амплификации 4 генетических детерминант (видоспецифи-

ческого гена ЬарА и основных генов вирулентности - сГчА. СсрА н Го.хЯ). для идентификации и оценки эпидемической значимости различных штаммов V. с1ю1егае еЬог.

2. С помощью комплексного ПЦР-анализа определить сходство и различие в наборе основных генов вирулентности в геноме штаммов V. с!ю1егае еНог, выделенных на административных территориях Нижнего Поволжья с различным эпидемическим потенциалом.

3.С целью ретроспективного анализа эпидемиологической ситуации на территории Нижнего Поволжья, Дагестана и Туркменистана изучить распространенность генов с1хА, 1срА, ЬхЯ и ЬарА среди штаммов холерного вибриона, выявленных из различных источников в указанных регионах.

4. Провести ПЦР-тестирование штаммов V. с1ю1егае еког, лишенных гена ctxA, на присутствие в их хромосоме генов других токсинов: zot и асе.

5. Разработать мультиплексную ПЦР.

6. Изучить молекулярно-генетические особенности штаммов V. с!ю!егае классического биовара, выделенных во время вспышки холеры в 1942 году.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ Для идентификации и наиболее полной оценки эпидемической значимости штаммов V. ско1егае еког, выделенных от больных, носителей и из объектов внешней среды в благополучные и неблагополучные по холере годы разработан новый методический прием, основанный на выявлении с помощью ПЦР видоспецифического гена ЬарА и трех основных генов вирулентности с1хА, 1:срА и ЬхЛ. Эффективность использования комплексного ПЦР-анализа для решения указанных задач доказана при тестировании 90 музейных штаммов холерного вибриона с различной эпидемической значимостью.

Установлено присутствие гена ЬарА в геноме всех изученных штаммов, независимо от источника их выделения, что подтверждает его стабильность и видоспецифичность. Штаммы, выделенные из объектов внешней среды в период эпидосложнений, - гетерогенны по набору генов вирулентности ,с1хА, 1:срА, 1охК. На основании их сочетания в геноме ПЦР-тестируемых штаммов предложена следующая оценка их эпидзначимости: а) штаммы с генотипом с<хА+ 1срА+ toxR+ - эпидемически опасны; б) штаммы с генотипом с1хА" 1:срА" 1охЯ" или с<зсА" 1:срА" 1охБ1+ — эпидемически безопасны; в) штаммы с генотипом с1хА" ^рА+ 1охК+ или

ctxA' tcpA" toxR.1 - потенциально опасны.

Впервые получены сведения о распространенности генов ctxA, tcpA, toxR и hapA среди штаммов V. cholerae eltor, выделенных на территориях Нижнего Поволжья, Дагестана и Туркменистана, на основании которых впервые проведен ретроспективный анализ эпидсобытий, имевших место в этих регионах. В результате получены приоритетные данные о том, что высокий уровень вибрионосительства в Туркменистане был обусловлен тем, что около 40 % носителей были инфицированы нетоксигенными штаммами, имеющими гены tcpA (ctxA" tcpA+ toxR+), обеспечивающими продукцию основного фактора колонизации. Выявлено как сходство, так и различие в структуре генома штаммов V. cholerae, выделенных на трех административных территориях Нижнего Поволжья (Астраханская, Саратовская и Волгоградская область), отличающихся друг от друга эпидемическим потенциалом. Установлено, что существует определенная связь между эпидемическим потенциалом территории и набором генов вирулентности в штаммах, циркулирующих среди людей и во внешней среде. На модели вирулентных штаммов V. cholerae классического биовара впервые показано, что развитие эпидемического процесса при холере определяют не только ключевые гены патогенности, но и другие гены (гены ауксотрофности и hapA), мутации в которых приводят, видимо, к развитию нетипичной клинической картины и эпидемического процесса. Разработана мультиплексная ПЦР-система, позволяющая одновременно идентифицировать штаммы V. cholerae eltor и оценивать их эпидзначимость на основе определения видоспецифического гена hapA и трех генов вирулентности ctxA, tcpA, toxR. Разработка указанной мультиплексной системы в значительной мере расширяет наши возможности при анализе структуры генома различных штаммов.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ По результатам работы составлено методическое пособие «Идентификация штаммов Vibrio cholerae и определение их эпидемической значимости с помощью ПЦР-анализа четырех генов вирулентности ctxA, tcpA, toxR и hapA», которое одобрено Ученым Советом (протокол № 10 от 28 декабря 2001 г.) и утверждено зам. директора Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб».

Депонированы в Российском коллекции патогенных бактерии "Микроб" 6 штаммов V. cholerae классического и эльтор бмовара с различным набором основных генов патогенностн ctxA, tcpA, toxR и неодинаковой продукцией холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии - ключевых факторов патогенностн. Указанные штаммы предназначены для использования в прикладных и фундаментальных исследованиях.

Получено разрешение о выдаче патента на изобретение по заявке № I 200 112 1037/13 с приоритетом от 26 07.2001 «Штамм бактерий V. cholerae КМ200 - продуцент холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии».

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Новый методический прием для идентификации и определения эпидемической значимости различных штаммов V. cholerae eltor, основанный на комплексном ПЦР-тестировании видоспецифического гена hapA и трех генов вирулентности ctxA, tcpA и toxR.

2. Штаммы с генотипом ctxA+ tcpA+ toxR+ - эпидемически опасные; штаммы с генотипом ctxA" tcpA" toxR" или ctxA" tcpA", toxR+ - эпидемически безопасные; штаммы с генотипом ctxA" tcpA+ toxR+ или ctxA+ tcpA" toxR+ -имеют потенциальную эпидемическую значимость.

3. Набор генов вирулентности в геноме штаммов V. cholerae eltor, выделенных от больных, носителей и из объектов внешней среды в неблагополучные по холере годы в Саратовской, Волгоградской и Астраханской областях, полностью коррелирует с эпидемическим потенциалом территории.

4. Для ретроспективного анализа эпидсобытий на территориях Нижнего Поволжья, Дагестана, Туркменистана изучена распространенность генов ctxA, tcpA, toxR и hapA среди 341 штамма, выделенного от больных, носителей и из объектов внешней среды.

5. Мультиплексная ПЦР-система, позволяющая идентифицировать вибрионы вида V. cholerae eltor и оценивать их эпидемическую значимость на основе определения в геноме V. cholerae eltor видоспецифического hapA и трех генов вирулентности: ctxA, tcpA, toxR.

6. Сведения о молекулярно-генетических особенностях штаммов

Г. chtilerae, выделенных в период нетипичной эпидемической вспышки азиатской холеры в 1942 году.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Материалы диссертации доложены и представлены на научно-практической конференции РосНИПЧИ «Микроб»: «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2000); Проблемной комиссии межведомственного научного совета по санитарно-эпидемической охране территории РФ (Ростов-на-Дону, 2000); на 1-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генная диагностика инфекционных болезней» (Саратов, 2000); на научно-практической конференции РосНИПЧИ «Микроб»: «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2001).

ПУБЛИКАЦИИ. Основные результаты диссертации изложены в 10 опубликованных научных работах.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация состоит из введения, обзора литературных данных, материалов и методов, 5 глав собственных исследований, заключения и выводов. Работа' изложена на \ЦГ страницах машинописного текста, включая 17 рисунков, 16 таблиц. Список цитированной литературы содержит 256 работы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы. В работе использовано 372 природных штаммов холерных вибрионов и других патогенных бактерий. Применяли общепринятые методы культивирования и анализа фенотипов, ПЦР на наличие различных генов вирулентности, . определение продукции холерного токсина с помощью пассивной иммунной реакции на плотной среде по Bramucci M.G., Holmes R.K (1978), GMjELISA по Svennerholm А.М., Wiklund G. (1983), выявление растворимой гемагглютинин/протеазы по Finkelstein R.A. et al. (1992). Экспрессию ТКПА определяли в реакции самоагглютинации [Chiang S.L. et al., 1995] и иммуноблот-анализом по Towbin A. et al. (1979). Вирулентность штаммов определена по Dutta N.K и M.K.Habbu (1955), их питательные потребности - по общепринятой методике.

о

Результаты исс.педомни П.

1. Определение возможности использования тест-системы, основанной на амплификации четырех генетических детерминант методом ПЦР, для оценки эпидемического потенциала штаммов холерного вибриона, выделяемых из различных источников. Первый этап нашей работы состоял в подборе специфических праймеров для выявления указанных генов в хромосоме изучаемых штаммов и определения оптимальных условий для проведения ПЦР. К моменту начала нашей работы праймеры ctxA2 и ctxA3, обеспечивающие амплификацию фрагмента гена ctxA длиной в 564 п.н. уже использовались Куличенко А.Н. и Давыдовой H.A. (Лаборатория диагностики инфекционных болезней РосНИПЧИ «Микроб»), которые любезно предоставили их нам. Для обнаружения гена tcpA у холерных вибрионов биовара эльтор были выбраны праймеры, описанные S.Keasler, R.Hall (1993): tcpEa (5'GAAGAA GTTTGTAAAAGAAGAACAC'3) и tcpEb (5'GAAAGGACCTTCTTTCACG TTG'3). Эти праймеры обеспечивали амплификацию фрагмента гена tcpA длиной 471 п.н. Для выявления гена toxR были подобраны праймеры toxRl (5'ATGACTTTGTTTGGCGAGAG"3) и toxR2 (5' GATTGGCTTGGGTTAGT GAG'3), которые обусловливали амплификацию фрагмента этого гена длиной 397 п.н. Определение гена hapA проводили с парами праймеров hapAI (5'TCAACTACAACACCGCAGAC'3) и hapA2 (5'GACGACAATCCC AAGAAGAG'3) размером 20 нуклеотидов каждый. Длина амплификата составляла 270 п.н.

Проверка специфичности выбранных праймеров проводилась с помощью 4 различных штаммов нехолерных вибрионов (V. metchnicovii, V. parahaemoliticus, V. vulnificus, V. anguilarum), а также E. coli, S. enteritidis, Sh. flexneri, A. hydrofilae. Для выявления гена hapA были взяты 8 штаммов V. cholerae 0139 и V. cholerae не Ol/не 0139. В качестве положительного контроля использовали референс штамм V. cholerae eltor МАК757, содержащий изучаемый набор генов вирулентности. Отрицательным контролем служила реакционная смесь без ДНК-матрицы. Полученные результаты ПЦР показали, что специфические продукты амплификации фрагментов генов ctxA, tcpA, toxR и hapA указанных выше размеров

образуются лишь у штамма Г. с/ю/егас с/Юг МАК757. Что касается гена 11арА, то специфический амплификат регистрировался также у всех штаммов V. с!ю1егае 0139 и V. с1ю1ете не 01/не 0139. ДНК нехолерных вибрионов и других грамотрицательных бактерий не служила матрицей для синтеза выбранных фрагментов четырех изучаемых генов (ахА, 1срА, ЮхЯ и ЬарА) и результаты ПЦР были отрицательными. Таким образом, подобранные нами праймеры были специфичными и могли быть использованы в дальнейшей работе.

Для оценки эффективности использования комплексного ПЦР-тестирования было отобрано 90 различных штаммов Кс!ю1егае 01 биовара эльтор, выделенных в Поволжском регионе от больных, носителей и из внешней среды в 1970-1999 гг. Все отобранные штаммы были проверены по основным признакам, характерным для вида V. с!ю1егае 01. В результате ПЦР-тестирования установлено, что все взятые для анализа штаммы содержали в хромосоме ген ЬарА, что указывает на его видоспецифичность. Оценка эпидзначимости вибрионов эльтор показала, что все изученные штаммы, выделенные от больных и носителей, содержали полный набор генов вирулентности (с1хА, и;рА, ЮхЫ) и следовательно, бьши эпидемически опасны.

Поскольку в практике эпидемиологического надзора за холерой наибольшее значение имеет молекулярно-биологический мониторинг штаммов, выделенных из различных объектов внешней среды, мы провели аналогичное комплексное ПЦР-тестирование 30 штаммов, выделенных из внешней среды примерно в этот же период времени (1970-1978 гг.). С помощью ПЦР-анализа было установлено, что штаммы, выделяемые из объектов внешней среды в период эпидосложнений, характеризуются различным набором детерминант вирулентности. Так, около 60,0 % изученных штаммов содержали весь тестируемый набор генов вирулентности йхА, йрА, ЬхК В то же время бьши обнаружены штаммы (37,0 % от числа изученных), лишенные генов сЫА и йфА, однако содержащие в своем геноме ген ЬхЛ. Кроме того, был выделен 1 штамм (3,0 %), у которого отсутствовали сразу три гена вирулентности: с1хА, Ь:рА и ШхК..

Еще большее разнообразие в наборе генов вирулентности имеется у штаммов, выделенных в эпидемически благополучный по холере период.

и

Наибольшее количество штаммов - .19 из 30 (63,3 %), выделенных в период с 1981 по 1999 г. из внешней среды, было лишено генов с1хА и 1срА, но имели гены 1охЯ, что указывало на их эпидемическую безопасность. Заслуживает внимания обнаружение в поверхностных водоемах при отсутствии больных и носителей 2 штаммов (6,7 %) с полным набором генов вирулентности. Такие штаммы требуют дополнительного изучения, поскольку можно полагать, что у них отсутствует экспрессия генов йхА и (или) гсрА. Особый интерес, на наш взгляд, представляет обнаружение в эпидемически благополучный период из воды поверхностных водоемов атоксигенных (с1хА") штаммов (20,0% от числа изученных), но содержащих гены 1срА. Принимая во внимание тот факт, что штаммы, содержащие ТКПА, могут быть инфицированы фагом СТХф, содержащим гены с1хАВ, следует заключить, что такие штаммы с генотипом с1хА" 1срА+ 1охЯ+ могут оцениваться как штаммы, имеющие потенциальную эпидемическую опасность. В целом ген 1охЯ отсутствовал у 10,0 % штаммов.

Таким образом, главный итог нашей работы, представленный в главе 3, состоит в том, что получены экспериментальные доказательства эффективности комплексного ПЦР-тестирования различных штаммов V. сИокгае еЬог, Детальный анализ полученных данных о структуре генома изученных штаммов позволил сделать ряд важных заключений. Во-первых, ген ИарА присутствует в геноме всех изученных штаммов, независимо от источника их выделения и, следовательно, может служить как видоспецифический генный маркер. Во-вторых, на основе обнаруженных нами различий в сочетании генов вирулентности в геноме разных штаммов мы предлагаем дать следующую оценку эпидзначимости вибрионам эльтор: а) штаммы с генотипом с1хА+, 1срА+, 1ох11+ - эпидемически опасны; б) штаммы с генотипом с1хА", 1срА", 1охЯ+ или с1хА", 1срА", ^хЛ" - эпидемически безопасны; в) штаммы с генотипом с1хА", ^рА4", 1охЯ+ -потенциально эпидемически опасны. Данные эпидемиологического обследования территории Нижнего Поволжья по холере полностью совпадают с результатами комплексного ПЦР-анализа, что еще раз подтверждает эффективность этого приема.

2. Сравнительный ПЦР-анализ эпидемической значимости штаммов V. сЬо1егае еНог, выделенных на различных административных территориях Нижнего Поволжья в 1970 - 2000 гг.

Доказанная эффективность комплексного ПЦР-анализа для оценки эпидзначимости штаммов позволила нам использовать этот прием для получения ответа на один из важных эпидемиологических вопросов: существует ли какая-либо связь между эпидемическим потенциалом территории и набором генов вирулентности в геноме циркулирующих на ней штаммов V. сЬо1егае еНог? Для получения ответа на него мы с помощью ПЦР изучили 244 штамма, выделенные в Саратовской, Волгоградской и Астраханской областях, эпидемический потенциал которых был разным. Было взято 109 штаммов из Астрахани, 64 штамма из Волгограда, 71 штамма из Саратова в эпидемически неблагополучные (1970-1978 гг.) и благополучные (1979-2001 гг.) годы. Анализ полученных данных показал, что между штаммами, циркулирующими среди больных, носителей и во внешней среде на территории с разным эпидемическим потенциалом в эпидемически неблагополучный период (1970-1978 гг.), существуют четкие различия в наборе генов вирулентности (табл. 1). Если в Астраханской области, эпидемический потенциал которой наиболее высок, штаммы с генотипом с1хА+, 1срА+, 1ох11+, выделенные от людей и из внешней среды составили 80,0 % от числа изученных , то в Саратовской области, эпидемический потенциал которой весьма низкий, число таких штаммов снизилось до 64,5 %. В то же время количество штаммов, лишенных ключевых генов вирулентности, было обратно пропорционально эпидемическому потенциалу территорий. В Астраханской области эпидемически неопасные штаммы составили 4,0 % от числа выделенных, в Волгоградской области - 20,0 % и в Саратовской области - 32,2 % (табл. 1).

Что касается полученных нами сведений о структуре генома штаммов, выделенных в спокойные по холере годы (1979-2000 гг.), то следует признать, что во внешней среде на всех сравниваемых территориях доминировали эпидемически безопасные (сЛхА", 1срА\ Юх11+ или ФхА", 1срА", 1охК.") штаммы, которые составили 66,7 - 80,0 % от количества изученных. Тем не менее, даже в Саратовской области было выделено 5,0 % штаммов с полным набором генов вирулентности. Обнаружение

Таблица I. Результаты ПЦР-тестирования штаммов Г. с/юктис а1гог, выделенных в эпидемически неблагополучный по холере период (1970-1978 гг.) на наличие в их геноме гена ЬарА п трех генов вирулентности (с1хА, ^рА, ЮхЫ)

Регион Источник выделения Всего Эпидемически опасные штаммы Потенциально опасные штаммы Эпидемически безопасные штаммы

с1хА+, (:срА+, изхЫ1", 1}арА+ йхА", (:срА+, ЬарА+ с1хА+, крА", 1ох!1+, ЬарА+ сГхА", 1срА", 1охК+, ЬарА+ йхА", (.срА~, 1охЫ", ЬарА+

Астраханская область 1.. внешняя среда 15 10 (66,7 %) 0 0 3 (33,3 %) 0

люди 60 56 (93,3 %) 3 (5,0 %) 1 (1,7 %) 0 0

Волгоградская область внешняя среда 15 9 (60,0 %) 0 0 6 (40,0 %) 0

люди 29 26 (89,7 %) 1 (3,4%) 0 2 (6,9 %) 0

Саратовская область внешняя среда 12 3 (25,0 %) 1 (8,3 %) 0 7 (58,4 %) 1 (8,3 %)

люди 19 17 (89,5 %) 0 0 2 (10,5 %) 0

штаммов с генами с1хА, 1срА и юхН. в воде открытых водоемов в спокойные по холере годы ставит вопрос об их происхождении, а также об их роли в возникновении эпидемического процесса. Несомненный интерес представляют обнаруженные нами на территории всех трех областей в воде открытых водоемов штаммы, имеющие лишь один из ключевых генов вирулентности - либо с1хА, либо йрА, при наличии в их геноме гена ЮхЯ. Несмотря на то, что такие штаммы встречаются весьма редко (5,0-15,0% случаев), их выделение затрудняет оценку эпидситуации, хотя мы их оценили как потенциально опасные.

Особого внимания заслуживают штаммы из внешней среды, несущие фаг СТХф с неполным набором генов, входящих в его состав. Обнаружены штаммы, лишенные генов с1хА, но имеющие гены других токсинов - и асе. При этом такие нетоксигенные штаммы были выделены в Астрахани в 2000 году от больного диареей и двух контактных с ним носителей. Более того, в ходе дальнейшего их анализа выяснилось, что все эти штаммы несли еще и ген токсина Лх. Из этого следует, что возможной причиной гастроэнтерита больного явилось инфицирование его штаммом с генотипом с1хА", асе+, го^, г!х+. Выделение таких штаммов ставит вопрос о том, достаточно ли проводить тестирование штаммов лишь на наличие ключевых генов патогенности? Видимо, в отдельных случаях при неясной эпидобстановке существует необходимость в тестировании штаммов на наличие других токсинов.

3. Сопоставление распространенности генов с1хА, 1срА, 1охИ и ЬарА среди штаммов холерного вибриона эльтор, выделенных в различных регионах (в Нижнем Поволжье, Дагестане, Туркменистане). Сведения о распространенности генов вирулентности среди различных штаммов холерного вибриона представляют не только фундаментальный интерес, но позволяют провести ретроспективный анализ эпидсобытий, происходивших на указанных территориях. В этой связи одной из задач нашего исследования было комплексное ПЦР-тестирование 341 штамма, выделенных на трех территориях: в Нижнем Поволжье, Дагестане и Туркменистане. Оказалось, что в неспокойные по холере годы на территории всех трех регионов тестируемые гены вирулентности - (с1хА, 1:срА, ШхЯ) были широко распространены среди штаммов, выделенных от

больных, носителей, а также из внешней среды. Тем не менее, обращает на себя внимание тот факт, что часть больных н носителей (4,8-16,7 %), которые выявлены во всех трех регионах, были инфицированы вибрионами, лишенными либо двух структурных генов патогенности (ctxA", tcpA", toxR+), либо одного из них (ctxA или tcpA). Эти данные ставят вопрос о том, за счет каких же токсинов была вызвана у данных больных диарея, если указанные штаммы не имели генов ctxA, контролирующих продукцию холерного токсина. Для получения ответа на него необходимо более глубокое изучение структуры генома нетоксигенных штаммов холерного вибриона.

Для благополучного по холере периода характерно отсутствие генов ctxA и tcpA в геноме большинства штаммов (табл. 2). Тем не менее, в этот период в ряде штаммов, выделенных из внешней среды, присутствует полный набор генов вирулентности (ctxA, tcpA, toxR). Опять возникает вопрос — откуда появились такие штаммы ctxA+, tcpA+, toxR+, hapA+ при отсутствии эпидемии? Может быть, водная среда действительно может служить в качестве резервуара как токсигенных, так и нетоксигенных штаммов V. cholerae eltor. Поиск ответа на него не входил в задачу нашей работы. Тем не менее, необходимость решения такой проблемы в будущем очевидна.

Большого внимания, на наш взгляд^ заслуживают данные, позволившие оценить эпидобстановку в Туркменистане в 70-80 годы прошлого столетия. Туркменистан был одной из территорий, где наблюдалась выраженная контаминация объектов внешней среды слабовирулентными холерными вибрионами. Более того, в Туркменистане регистрировался высокий уровень вибрионосительства, длительность которого в ряде случаев достигала 12-13 дней. Все это указывало на способность вибрионов, обитающих в воде открытых водоемов, приживаться в организме человека. Однако на этом фоне было зарегистрировано лишь две вспышки холеры: в Фирюзе (1965 г.) и в Иолотани (1972 г.). В результате острых дискуссий между различными группами исследователей относительно оценки эпидситуации на этой территории и необходимости проведения в полном объеме противоэпидемических мероприятий было сделано заключение, что слабовирулентные вибрионы эльтор вызывали в Туркменистане развитие своеобразного эпидемического процесса.

к.

Таблица 2. Распространенность генов вирулентности среди штаммов Г. скок'гие еИог, выделенных на различных административных территориях от больных, носителей и из внешней среды в эпидемически благополучный период.

я о X и к X <о с; <и 2 т к Всего Эпидемически опасные штаммы Потенциально опасные штаммы Эпидемически безопасные штаммы

О-. К я с1хА+, с1хА", с1хА", с1хА",

о н о 1срА+, крА+, 1срА", (срА~, 1срА",

К Ь>х11+, 1ох!1+, Юх11+, ЬхЯ",

ЬарА+ ЬарА+ ЬарА+ ЬарА+ ЬарА+

внешняя 87 7 И 2 61 6

среда (8,0 %) (12,7%) (2,3 %) (70,1 %) (6,9 %)

нй и К 22 § носители 7 0 0 0 6,0 (85,7 %) 1 (14,3 %)

5 о 3 со к о 5 с больные 0 0 0 0 0 0

я внешняя среда 2 0 0 0 2 (100,0%) 0

са н о <и носители 0 0 0 0 0 0

св «

больные 0 0 0 0 0 0

И св Н о К К <и внешняя среда 22 1 (4,5 %) 4 (18,2%) 0 17 (77,3 %) 0

а £ носители 19 0 7 (36,8 %) 0 12 (63,2 %) 0

Комплексный ПЦР-анализ штаммов V. сЪо1егае еИог, выделенных на территории Туркменистана, позволил сделать ряд важных выводов, вносящих ясность в происходившие там события. Во-первых, полный набор генов вирулентности присутствовал в штаммах, выделенных от больных и носителей, а также из. внешней среды лишь в период эпидосложнений - то есть в 1965 и. Л 972 годах. Во-вторых, штаммы, выделенные в благополучные по холере годы из внешней среды, в 77,3 % случаев были действительно, эпидемически безопасны, так как были лишены генов ФхА и 1срА. Лишь 4,5 % штаммов, обитающих в воде открытых водоемов, несли полный набор генов вирулентности, что характерно и для других территорий. В-третьих, было обнаружено, что в отличие от Нижнего Поволжья и Дагестана, в Туркменистане 36,8 % носителей было инфицировано нетоксигенными штаммами, имеющими гены ЮрА, продукт которых ТКПА и обеспечивал эффективную колонизацию вибрионами тонкого кишечника человека. Такие штаммы обитали и во внешней среде (18,2 %). Именно это обстоятельство обусловило и другие особенности эпидпроцесса в Туркменистане -формирование у значительной части населения антибактериального иммунитета.

Таким образом, предложенный нами приём, основанный на ПЦР-тестировании трех генов вирулентности позволил выяснить причины нетипичности эпидпроцесса в Туркменистане. Получение таких приоритетных данных о наличии большого числа штаммов V. скокгае еНог лишь с генами Юр указывает также на необходимость дальнейшего анализа штаммов из этого региона, поскольку полученные данные расширят наши представления об эпидемическом потенциале этих вибрионов эльтор.

4. Разработка мультиплексной ПЦР для идентификации и определения эпидемической значимости штаммов V. ско1егае. Важным практическим результатом нашей работы явилась разработка мультиплексной ПЦР, позволяющей одновременно исследовать геном вибрионов на присутствие в нем четырех генов: йхА, ЮрА, 1охЫ, ЬарА. Решение указанной выше задачи в значительной мере расширяет наши

возможности для дальнейшего изучения структуры генома различных штаммов с целью более полного определения их эпидемического потенциала.

1 23456789 10 11 12

ctxA (564 п.н.) tcpA (471 п.н.). toxR (397 п.н hapA (270 п.н.

Рис. 1 Определение генов ctxA, tcpA, toxR и hapA с помощью мультиплексной ПЦР у штаммов V. cholerae eltor.

1. - 1275 (Дагестан, больной); 2. - 128 (Саратов, внешняя среда); 3. - 655 (Саратов, внешняя среда); 4. - 12D (Дагестан, больной); 5. - 20 (Саратов, внешняя среда); 6. - В23 (Волгоград, внешняя среда); 7. - Контаминационный контроль (реакционная смесь без ДНК матрицы); 8. - МАК 757 (Положительный контроль); 9. - МАК 757 (ctxA); 10. - МАК 757 (tcpA); И. - МАК 757 (toxR); 12. - МАК 757 (hapA).

5. Изучение с помощью комплексного ПЦР-анализа молекулярно-генетнческнх особенностей штаммов Vibrio cholerae classica, вызвавших эпидемию азиатской холеры в России в 1942 году. В 1961 г. произошла смена биовара возбудителя холеры: классический биовар был замещен вирулентными штаммами вибрионов эльтор. Но остался открытым вопрос, почему более патогенный возбудитель холеры был замещен менее патогенным. Анализ литературных данных позволяет придти к заключению, что основная причина этих событий - наличие определенных особенностей в структуре и функции генома классических вибрионов [Mekalanos J.J. et al., 1983; Гинцбург A.JI. с осавт., 1985;Waldor M.K. et al., 1997; Davis M. K. et al., 2000; Watnick P.J., 2000; Ильина T.C., 2001; Farugue Sh.M. et al., 1998; 2002; Dziejman M. et al., 2002].

Поскольку в нашем распоряжении была уникальная коллекция

классических штаммом холерного вибриона, вызвавших нетипичную в клиническом и эпидемическом отношении вспышку азиатской холеры на территории бывшего СССР, когда во многих странах мира, видимо, уже доминировали вибрионы эльтор, мы попытались с помощью разработанного нами комплексного ПЦР-анализа обнаружить молекулярно-генетические особенности в их геноме и сравнить их с таковыми у вибрионов эльтор.

На первом этапе нашей работы для решения вопроса о вирулентности изучаемых штаммов, мы провели ПЦР-тестирование 10 произвольно отобранных штаммов, выделенных в 1942 г. (9 штаммов) от больных и из внешней среды (1 штамм) на территории Поволжья с целью определения в их хромосоме основных генов патогенности: ctxA, tcpA, toxR, а также ген hapA. Оказалось, что генотип всех проверенных штаммов был ctxA+, tcpA+, toxR+, hapA+.

Затем мы изучили продукцию ими XT в условиях in vitro двумя методами: РПИГ и GM,ELISA. Оказалось, что из 10 исследованных 8 штаммов продуцируют, по крайней мере, не менее 0,6 мкг/мл XT (табл.3). При этом был выявлен штамм (М29) с таким высоким уровнем продукции XT, который характерен лишь для двух известных высокотоксигенных штаммов: V. cholerae classica 569В и Дакка 35 (табл. 3) [Смирнова Н.И., 1999.]. На высокий уровень экспрессии другого гена вирулентности tcpA указывали данные самоагглютинации бактерий и иммуноблот с антисывороткой к ТКПА, любезно предоставленной нам R. Taylor (США). Полученные сведения об активности генов ctxA и tcpA указывают на вирулентность этих штаммов (табл. 3).

Для проверки этого вывода мы провели исследование вирулентности 5 произвольно выбранных штаммов на модели кроликов-сосунков по методу Datta и Habbu. Результаты экспериментов были следующие: 1 штамм (или 20 %) был высоковирулентным, 3 штамма (или 60 %) -слабовирулентными, 1 — штамм (или 20%) — авирулентным.

Обнаруженное противоречие между высоким уровнем биосинтеза основных факторов патогенности и пониженной вирулентностью у изученных штаммов требовали дальнейшего анализа причин такого несоответствия. Поэтому у классических вибрионов мы изучили ряд

Таблица 3. Продукция холерного токсина (ХТ), токснн-корегулируемых пилей адгезии (ТКПА) штаммами V. с1го1егае с1сих1са, выделенными во время эпидемии азиатской холеры в России.

Штаммы Продукция ХТ по данным Продукция ТКПА по данным

РПИГ* (зона гемолиза в мм) GM, ELISA (мкг/мл) Реакции самоагглютинации* * Иммуно-блота

М8 1.0 4,3 4- н.о

М9 0 2,3 - нет

М14 1.5 6,5 -ь да

М16 1.0 4,8 -н- н.о

М18 0 1,9 - нет

М19 1.0 4,2 + н.о

М22 2.0 9,2 -Н-+ н.о

М24 0 2,4 ++ да

М29 4.0 14,0 -Н-+4- да

МЗО 1.0 3,9 ++ да

569В 3.0 10,0 + Н.0

2414 5.0 40,0 ( Í П да

Примечание: Одна звездочка - ширина зоны гемолиза вокруг макроколоний штаммов на LB-среде с добавлением 1,0 % отмытых эритроцитов указывает на уровень продукции секретируемого ХТ; две звездочки - «мм» или «+++» - самоагглютинация за счет ТКПА всех или почти всех бактериальных клеток, осевших на дно пробирки; «++» или «+» самоагглютинация значительной или незначительной части бактериальных клеток; «-» - отсутствие самоагглютинации клеток; штаммы 569В и 2414 взяты в качестве положительных контролей, продуцирующих ХТ и ТКПА; штамм МАК757 биовара эльтор использован как отрицательный контроль относительно продукции ХТ и ТКПА; н.о - не определяли.

свойств, которые, не являясь основными факторами патогенности, тем не менее могли оказать влияние на их вирулентность.

В первую очередь мы определили уровень продукции этими штаммами секретпруемон ГА/П, поскольку, по данным ПЦР-аналнза, все штаммы имели структурный ген hapA, кодирующий бмосинтез этого белка. Тестирование штаммов по этому свойству было вызвано тем, что ГА/П вносит большой вклад в вирулентность и эпидемичность штаммов [Booth В. A. et al., 1984; Finkelstein R.A. et al., 1992; Herrington D.A. et al., 1988]. Однако из 10 изученных штаммов лишь 1 штамм (М9), выделенный из речной воды, I продуцировал этот секретируемый белок. У остальных 9 штаммов продукция ГА/П не была обнаружена.

Далее мы определили питательные потребности классических штаммов, вызвавших эпидемию, поскольку известно, что мутации в некоторых генах ауксотрофности могут снизить вирулентность. Полученные нами данные были также неожиданными: если природные штаммы холерных вибрионов, как правило, являются прототрофами, то все 10 изученных штаммов оказались ауксотрофами (Риг- или Аго" или Cys-) или полиауксотрофами (Pur-, Cys" или Pur", Aro~). Таким образом, приведенные факты говорят о наличии существенных различий между типичными возбудителями азиатской холеры и изученными штаммами, которые, за счет мутаций в геноме, были ауксотрофами и не продуцировали ГА/П.

Итак, полученные данные подтверждают высказанное нами предположение, что в геноме классических вибрионов возможно, происходило накопление различных мутаций, ослабивших его общую вирулентность, которая является полидетерминантным свойством, а также способность сохраняться во внешней среде.

Таким образом, в данной работе представлен новый методический прием, основанный на комплексном ПЦР-анализе различных штаммов V. cholerae eltor, который, на наш взгляд, вносит определенный вклад в решение одного из центральных вопросов эпидемиологического надзора за холерой - идентификацию вибрионов вида V. cholerae и оценку их эпидзначимости. Разработанная нами мультиплексная ПЦР, позволяющая одновременно исследовать геном вибрионов на присутствие в нем видоспецифического гена ЬарА и трех генов вирулентности ctxA, tcpA и toxR), безусловно, расширяет возможности для использования этого метода в различных учреждениях практического здравоохранения.

одновременно с нами, либо позже разработали ПЦР-тест-снстемы для выявления в геноме V. cholerae двух (ctxA и tcpA) пли трех (ctxA, tcpA и toxR) генов вирулентности [Водопьянов С.О. с соавт., 1999; Парамонов И.В. с соавт. 1999; Сучков И.В. с соавт., 2000; 2001; Голубинский Е.П. с соавт., 2001], что лишь подчеркивает актуальность выбранного нами направления исследований.

ВЫВОДЫ

3. Разработан новый методический прием для идентификации и определения эпидемической значимости различных штаммов V. cholerae eltor, основанной на комплексном ПЦР-тестировании видоспецифического гена hapA и генов вирулентности ctxA, tcpA, toxR.

4. На основе данных комплексного ПЦР-анализа 244 штаммов V. cholerae eltor, выделенных в эпидемически благополучные и неблагополучные периоды, предлагается следующая оценка их эпидемической значимости: штаммы с генотипом ctxA+ tcpA+ toxR+ -эпидемически опасны; штаммы с генотипом ctxA- tcpA- toxR- или ctxA-tcpA-, toxR+ — эпидемически безопасны; штаммы с генотипом ctxA- tcpA+ toxR+ или ctxA+ tcpA- toxR+ - потенциально эпидемически опасны.

5. Выявлена прямая связь между эпидемическим потенциалом территории и набором генов вирулентности в геноме штаммов, выделенных от людей, носителей и из внешней среде при ПНР-анализе 244 штаммов V. cholerae eltor, выделенных на административных территориях Нижнего Поволжья (Астраханская, Волгоградская и Саратовская области.

6. Впервые получены сведения о распространенности генов ctxA, tcpA, toxR и hap А среди 341 штамма V. cholerae eltor, выделенных на территориях Нижнего Поволжья, Дагестана и Туркменистана, которые позволили провести ретроспективный анализ эпидсобытий на указанных территориях. Получены приоритетные данные о том, что на территории Туркменистана, в отличие от Дагестана и Нижнего Поволжья, 36,8 % носителей инфицированы нетоксигенными вибрионами, несущими гены tcpA, которые контролируют биосинтез основного фактора колонизации.

7. Обнаружены штаммы V. cholerae eltor, лишенные генов ctxAB, но имеющих гены других токсинов (zot, асе, rtx), выделенные от больного

гастроэнтеритом и контактного с ним, а также из внешней среды.

1. Разработана мультиплексная ПЦР для одновременного выявления и определения эпидемической значимости V. cholerae eltor, которая основана на использовании 4 пар праймеров для амплификации фрагментов хромосомных генов ctxA, tcpA, toxR, hapA. Мультиплексная ПЦР в значительной мере расширит наши возможности в получении наиболее полной информации об эпидемическом потенциале штаммов.

2. Установлено, что изученные штаммы V. cholerae классического биовара, выделенные в период вспышки азиатской холеры в 1942 году, несли видоспецифический ген hapA и полный набор генов вирулентности ctxA, tcpA, toxR, которые, как правило, эффективно экспрессировались. В то же время была выявлена нетипичность указанных штаммов, которая состояла в их поли- и моноауксотрофности, а также неспособности продуцировать растворимую гемагглютинин/протеазу.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Смирнова Н.И., Кириллина O.A., Бирюкова(Челдышова) Н.Б., Кутырев В.В. Генетические маркеры эпидемически значимых штаммов холерного вибриона // Проблемы особо опасн. инф. - Саратов, 1999. - Вып. 79.-С. 25-35.

2. Смирнова Н.И., Кириллина O.A., Челдышова Н.Б., и др. Дифференциация штаммов Vibrio cholerae eltor по их эпидемической значимости с помощью новых диагностических холерных бактериофагов эльтор ctx+ и ctx " и полимеразной цепной реакции // Журн. микробиол. -2001.-№6.-С. 11-16.

3. Смирнова Н.И., Кириллина O.A., Челдышова Н.Б., Кутырев В.В.. Изучение распространенности основных генов вирулентности среди различных штаммов Vibrio cholerae eltor для определения их эпидемической значимости // Молекул, генетика. - 2001. - № 3. - С. 23-28.

4. Смирнова Н.И., Челдышова Н.Б., Заднова С.П., Кутырев В.В. Молекулярно-генетические особенности штаммов Vibrio cholerae classica, вызвавших эпидемию азиатской холеры в России в 1942 году // Молекул, генетика. - 2001. - № 4. - С. 12-16.

5. Челдышова Н.Б., Смирнова Н.И.. Кнрилпна O.A. и др. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов V. choleras Ol, выделенных из внешней среды в Саратовской области // Холера и патогенные для человека вибрионы (Информация проблемной комиссии (46.04) межведомственного научного совета по санитарно-эпидемической охране территории РФ (46.00).-Ростов-на-Дону, 2000.-Вып. 13. - С. 27-29.

6. Челдышова Н.Б., Кириллина O.A., Ливанова Л.Ф. и др. ПЦР-анализ штаммов Vibrio cholerae Ol, выделенных на территории Нижнего Поволжья // Генная диагн. особо опасн. инф. Материалы I Всеросс. науч,-практ. конф. - Саратов, 2000. - С. 28-29.

7. Челдышова Н.Б., Кириллина O.A., Ливанова Л.Ф. и др. Сравнительный анализ эффективности новых диагностических холерных бактериофагов эльтор ctx+, ctx" и полимеразной цепной реакции при определении эпидемической значимости штаммов V. cholerae eltor II Проблемы особо опасн. инф.- Саратов,2001, —Вып. 81.—С. 125—131.

8. Челдышова Н.Б., Ливанова Л.Ф., Заднова С.П. и др. Экспрессия основных генов патогенности и вирулентность штаммов V.cholerae classica, выделенных во время эпидемии азиатской холеры в России // Холера и патогенные для человека вибрионы (Информация проблемной комиссии (46.04) межведомственного научного совета по санитарно-эпидемической охране территории РФ (46.00). - Ростов-на-Дону, 2001. -Вып. 14. - С. 34-36.

9. Заднова С.П., Топорков A.B., Челдышова Н.Б., Смирнова Н.И. Продукция токсин-корегулируемых пилей адгезии природными штаммами холерного вибриона // Там же. - С.36-38.

10. Костромитина Е.А., Челдышова Н.Б., Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Оценка эпидемической значимости штаммов V. cholerae eltor, выделенных на территории Туркменистана по данным полимеразной цепной реакции и чувствительности к холерным диагностическим фагам ctx+, ctx" // Там же. - С. 22-24.