Молекулярно-генетический анализ штаммов Vibrio cholerae O139

Ерошенко, Галина Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетический анализ штаммов Vibrio cholerae O139
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ штаммов Vibrio cholerae O139"

На нравах рукописи

ЕРОШЕНКО Галина Александровна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ШТАММОВ ¥1В«10СИ01Е«АЕ0 139

03.00.07—микробиология 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Саратов - 2004

Работа выполнена в Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные консультанты:

доктор биологических наук, профессор Смирнова Нина Ивановна доктор медицинских наук, профессор Кутырев Владимир Викторович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Подосинникова Людмила

Сергеевна

доктор биологически наук, профессор Попов Юрий Алексеевич доктор биологических наук, профессор Панасенко Валерий Иванович

Ведущая организация : Институт эпидемиологии и микробиологии

им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (г. Москва)

Защита состоится 8 октября 2004 г. в 10. 00 на заседании диссертационного совета Д208.078.01 по присуждению ученой степени доктора (кандидата) наук при Российском научно-исследовательском проти— тивочумном институте "Микроб' Министерства здравоохранения Российской Федерации (410005, г. Саратов, ул. Университеская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб".

Автореферат разослан "¿3" д^цпй- 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Слудский А.А.

3 tW5tY

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Холера продолжает оставаться одной из наиболее социально значимых инфекций. Ежегодно во Всемирную организацию здравоохранения поступают сведения о более, чем 100.000 больных холерой. Заболеваемость регистрируется во многих странах мира, расположенных на территориях практически всех континентов, в том числе и в России [Онищенко Г.Г., 2002; 2004; Weekly epidemiological record, 2002; 2003].

До недавнего времени все эпидемии холеры вызывались вирулентными вибрионами серогруппы О1, в то время как вибрионы других серогрупп были причиной лишь локальных вспышек холероподобных инфекций. В 1992 г. в Южной Индии впервые были зарегистрированы эпидемии холеры, обусловленные холерным вибрионом ранее неизвестной 0139 серогруппы. Они продолжались в 1992-1993 гг., в течение которых V.cholerae 0139 (синоним Бенгал) распространился на территорию Бангладеш и других азиатских стран таких, как Пакистан, Непал, Китай, Таиланд, Афганистан, Малазия, а также был вынесен на территорию других континентов [Albert М. J., et al, 1993; Nair G. В. et al., 1995, Faruque S.M. et al, 1998]. Завозные случаи были зарегистрированы в России и в других странах СНГ, а также в США. В настоящее время по данным ВОЗ V.cholerae 0139 является причиной 17% случаев холеры, регистрируемых в мире [Москвитина Э.А. с соавт., 2003; Sinha S. et al, 2003].

Появление нового возбудителя холеры, его высокая вирулентность (высокий процент летальности среди заболевших), мощный эпидемический потенциал, обусловивший вынос инфекции на территорию различных континентов, а также значительная вариабельность структуры генома V.cholerae 0139 привлекли к нему внимание исследователей во всем мире, поскольку все эти свойства могли свидетельствовать о происходящем в природе процессе образования нового патогенного клона V.cholerae, способного вызвать новую пандемию холеры.

Однако, несмотря на всеобщий интерес к V.cholerae 0139 и уже более чем десятилетний опыт его изучения, до сих пор остается неясным, обладает ли V.cholerae 0139 «пандемическими» свойствами и представляет ли он реальную угрозу для человечества как этиологический агент будущей восьмой пандемии холеры. Происхождение «нового» возбудителя холеры до сих пор не установлено. Не выяснены мо-

Р<>С НАЦИОНАЛЬНЛЧ.

библиотека J

лекулярно-генетические механизмы, которые привели к появлению V. cholerae 0139. Предполагается, что это событие произошло благодаря переносу генетической информации от неизвестного донора в штамм биовара эльтор серогруппы 01, который, вероятно, был осуществлен с помощью бактериофага или конъюгативной плазмиды [Johnson J.A. et al, 1994; Mooi R.K.. Bic E.M.. 1997; Faruque S.M. et al., 2003]. Структурно-функциональные особенности генома возбудителя холеры серогруппы 0139 исследованы далеко недостаточно. Не установлены причины высокой вариабельности различных областей хромосомы V.cholerae 0139, связанных с вирулентностью. Не изучена структура хромосомной области, содержащей гены биосинтеза нового поверхностного антигена — полисахаридной капсулы, который отсутствует у возбудителя 01 серогруппы.

Остается невыясненным участие в изменчивости вирулентных и антигенных свойств патогенных вибрионов 0139 серогруппы мобильных генетических элементов, в том числе и умеренного холерного бактериофага, впервые обнаруженного в штаммах V.cholerae 0139. Исследование изменений, происходящих в геноме возбудителя холеры 0139 серогруппы, может пролить свет на пути образования новых патогенных штаммов V.cholerae с измененными свойствами.

Практически не изучены молекулярно-генетические особенности штаммов 0139 серогруппы, выделенных на территории России и стран СНГ, так же как не описаны свойства других вирулентных штаммов 0139 серогруппы, выделенных при локальных вспышках, зарегистрированных за пределами эндемичных очагов холеры.

точников. Вместе с тем отсутствуют эффективные системы молекулярного типиро-вания, представленные комплексом методов, использование которых позволит не только провести дифференциацию штаммов V сНо1вгав 0139, но и повысить эффективность проводимого эпидемиологического мониторинга штаммов холерных вибрионов, выделяемых из объектов окружающей среды. Не разработана стандартная систематическая номенклатура молекулярных подтипов, в соответствие с которой могут быть классифицированы вновь выделяемые изоляты. Отсутствуют базы данных с генетическими характеристиками ранее выделенных на территории Российской Федерации штаммов V.cholвraв 0139.

Появление V.cholвraв 0139 потребовало создания специфических профилактических средств против нового возбудителя холеры, а также средств его диагностики. В настоящее время отсутствуют эффективные вакцины против V.cholвraв 0139, а также штаммы-продуценты с высоким уровнем биосинтеза ключевых фак-, торов вирулентности и иммуногенности, которые могут послужить основой для создания живых вакцин против возбудителя холеры 0139 серогруппы и найти применение в производстве химических холерных вакцин и диагностических тест-систем.

Все это диктует необходимость проведения разносторонних и глубоких исследований структуры и функции генома вирулентных и «водных» штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы, генетического контроля регуляции экспрессии генов вирулентности, создания эффективной системы молекулярного типирования вибрионов и разработки средств профилактики и диагностики V.cholвraв 0139.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ — Молекулярно — генетический и фенотипический анализ штаммов V.cholвraв 0139, имеющих различную эпидемическую значимость, и выявление новых механизмов образования штаммов возбудителя холеры с измененной экспрессией генов вирулентности.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Провести сравнительный анализ продукции факторов вирулентности и им-муногенности, а также устойчивости к антибиотикам у штаммов V.cholвraв 0139, выделенных от больных и из водных экосистем на территории Российской Федерации и стран СНГ.

2. Получить новые данные о генетической организации штаммов V.cholerae 0139 различного происхождения и установить связь выявленных свойств с их вирулентностью.

3. Провести генетическое картирование гена cap, контролирующего биосинтез нового поверхностного антигена — полисахаридной капсулы, определить его локализацию относительно других генов вирулентности и выяснить значение этого локуса для реализации патогенности возбудителя холеры 0139 серогруппы.

4. Определить роль профага 139 в изменчивости вирулентных и антигенных свойств возбудителя холеры 0139 и 01 серогруппы.

5. Изучить возможность обмена генетической информацией между V.cholerae 01 и 0139 серогрупп и образования патогенных штаммов с новыми свойствами.

6. На основе ПЦР - и риботипирования установить происхождение и эпидемическую значимость V.cholerae 0139, циркулирующих в открытых водоемах Российской Федерации.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА:

Получены приоритетные данные об особенностях структуры генома штаммов V.cholerae 0139, выделенных от больных и из объектов окружающей среды на территории Российской Федерации и стран СНГ. Впервые на основе комплексного методического подхода с использованием анализа полиморфизма длин рестрикцион-ных фрагментов и ПЦР - анализа различных ключевых генов вирулентности и жизнеобеспечения установлены принципиальные отличия в структурно-функциональной организации геномов возбудителя холеры 0139 серогруппы и холерных вибрионов, выделенных из водных экосистем на территории России и стран СНГ. Показано, что вирулентность возбудителя холеры 0139 серогруппы связана с присутствием в его геноме мобильных генетических элементов, содержащих гены патогенности, - двух профагов СТХ (ctx A, zot, асе) и RSI (rstC), острова патогенности VPI (tcpA, toxT), а также сайта для внедрения фагов в хромосому - нуклеотид-ной последовательности attRS.

тогенности VPI, и последовательность attRS. Из этого следует, что авирулентность «водных» вибрионов O139 серогруппы связана с отсутствием основных генов вирулентности, расположенных на мигрирующих генетических элементах (МГЭ). Впервые выявлено, что в составе хромосомы авирулентных штаммов присутствует ген порообразующего токсина rtxA, гены toxR и hap А, которые также обнаружены и у вирулентных штаммов, что указывает на их участие в процессах жизнедеятельности клетки.

Впервые показано, что гены токсинообразования ctxAB могут быть переданы в авирулентные холерные вибрионы 0139 серогруппы в составе рекомбинантных плазмид и эффективно экспрессироваться в них с образованием секретируемого и биологически активного холерного токсина, но эти вибрионы остаются авирулент-ными из-за отсутствия у них других ключевых генов вирулентности.

Впервые обнаружено, что штаммы возбудителя холеры O139 серогруппы, выделенные в России, характеризуются вариабельностью участка ДНК, связанного с продукцией холерного токсина. Изменчивость этого района подтверждается присутствием в нем различного количества копий профагов вирулентности СТХ и RS1, прилегающих к хромосомным участкам с различной организацией.

Впервые изучена структура участка хромосомы, ответственного за биосинтез нового поверхностного антигена возбудителя холеры V.cholerae 0139. Установлено, что вблизи гена cap, кодирующего биосинтез полисахаридной капсулы, располагается геном профага 139, а также гены mot и msh, определяющие подвижность и продукцию маннозочувствительных гемагглютинирующих пилей адгезии, что указывает на большое значение этой области в вирулентности и персистенции вибрионов 0139 серогруппы. Выявлено, что профаг 139 индуцирует хромосомные перестройки в близлежащих к нему генах вирулентности и, таким образом, играет важную роль в изменении признаков вирулентности и антигенности у возбудителя холеры V.cholerae 0139.

Впервые установлено, что фаг 139 оказывает влияние на продукцию основного фактора вирулентности - холерного токсина у штаммов возбудителя холеры О1 серогруппы классического и эльтор биоваров. Его интеграция в геном V.cholerae O1 приводит к изменению активности глобального регуляторного гена toxR и структурной организации участка хромосомы, содержащего гены токсинообразования. Вы-

явленный новый механизм регуляции генной активности у возбудителя холеры 01 серогруппы использован для создания принципиально нового способа получения штаммов возбудителя холеры с измененной продукцией холерного токсина.

Впервые на основе разработанной системы молекулярного типирования проведено комплексное генотипирование штаммов 0139 серогруппы, полученных от больных и из воды поверхностных водоемов. С помощью метода риботипирования показано, что вирулентные штаммы, выделенные в 1993 г. в Ростовской области относятся к новому риботипу, отсутствующему в международной классификации и обозначенному как R-I. На основе ПЦР — и риботипирования показано отсутствие близких эволюционных связей между клиническими и «водными» вибрионами, выделяемыми из воды в различных областях Российской Федерации.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ:

Создана эффективная система молекулярного типирования штаммов V. cholerae 0139 и О1, основанная на сочетании модифицированного метода риботипирования и ПЦР-типирования со случайными праймерами, использование которой позволит повысить эффективность проводимого эпидемиологического мониторинга штаммов холерных вибрионов, выделяемых из объектов окружающей среды. В результате ее применения установлено, что штаммы 0139 серогруппы, циркулирующие в настоящее время в открытых водоемах на территории различных областей Российской Федерации, эпидемически безопасны, и в случае их выделения не требуется проведения комплекса защитных мер, применяемых при обнаружении вирулентных штаммов V.cholerae.

На основании разработанных приемов составлены и утверждены Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол Ученого Совета РосНИПЧИ «Микроб» №9 от 18.12.2003 г) методические рекомендации «Риботипирование штаммов Vibrio cholerae» и «Получение штаммов Vibrio cholerae с измененной продукцией холерного токсина с помощью умеренного бактериофага 139».

Материалы исследований вошли в методические указания «Основные требования к вакцинным штаммам холерного вибриона» по федеральному уровню внедрения, которые одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол Ученого Совета РосНИПЧИ «Микроб» № 4 от 13.04.2004 г.) и Ученым Советом Ростов-

ского научно-исследовательского противочумного института (протокол №2 от18. 02. 2004 г.).

В Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" (Саратов) депонирована коллекция из 18 генетически модифицированных штаммов V.cholвraв О1 и 0139 с измененным биосинтезом факторов вирулентности, иммуногенности и жизнеобеспечения, которая является основой для проведения микробиологического, биохимического и генетического изучения роли этих факторов в патогенезе и иммуногенезе холеры. Входящие в состав этой коллекции штаммы О1 и O139 серогрупп с высоким уровнем продукции таких протективных антигенов, как В-субъединица XT, 0139 антиген и капсула, белки внешней мембраны рекомендуются для производства живых и химических холерных вакцин, а также средств диагностики холеры.

Получен патент на изобретение штамма бактерий КМ 195 — продуцента холерного токсина II типа и способ получения штаммов (патент на изобретение №2172776 выдан 27 августа 2001 г. Приоритет от 17.07.2000 г.). Штамм V.cholвraв KM 195 с гиперпродукцией XT, характерного для холерных вибрионов биовара эльтор, предназначен для использования его при производстве холерных химических вакцин. Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение штамма бактерий V.cholвraв КМ 168 — основы для конструирования живых вакцин против диарей-ных заболеваний, вызываемых патогенными штаммами V.cholвraв 0139 по заявке № 2003 131 557/13, дата приоритета 27.10. 2003 .

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ-

1. Клинические штаммы V.cholвraв 0139 значительно отличаются от штаммов этой же серогруппы, выделенных из воды открытых водоемов на территории России, по продукции следующих факторов вирулентности и иммуногенности: 0139 антигена, маннозочувствительных гемагглютинирующих пилей адгезии, ферментов патогенности фосфолипазы и растворимой гемагглютинин/протеазы, гемолизина и по подвижности. Они имеют также неодинаковую устойчивость к четырем изученным антибиотикам.

2. Геномы возбудителя холеры и «водных» штаммов V.cholвraв 0139 имеют различную структуру. Патогенность штаммов, выделенных от больных, определяет-

ся присутствием в их геноме мобильных генетических элементов, содержащих ключевые структурные и регуляторные гены вирулентности, - профаги СТХ (ctxA, z,ot, асе) и RSI (rstC), остров патогенности VPI (tcpA, toxT), а также генов, расположенных на основной части хромосмы - attRS, toxR, hap A, rtxA. Авирулентность холерных вибрионов, изолированных из водной среды, связана с отсутствием в их хромосоме указанных МГЭ и нуклеотидной последовательности attRS.

3. «Водные» штаммы 0139 серогруппы могут стать токсигенными в результате приобретения ими генов токсигенности в составе конъюгативных плазмид, но они остаются авирулентными для лабораторных животных из-за отсутствия в их геноме других ключевых генов патогенности.

4. Вирулентные штаммы серогруппы 0139, выделенные от больных на территории Российской Федерации в 1993 г., отличаются друг от друга по структурной организации хромосомных областей, содержащих профаги вирулентности СТХ и RS1, что указывает на значительную изменчивость участков генома, связанных с продукцией холерного токсина.

5. Ген нового поверхностного антигена - полисахаридной капсулы у возбудителя холеры 0139 серогруппы локализован в участке генома, содержащем гены вирулентности mot и mshA, определяющие подвижность холерного вибриона и продукцию маннозочувствительных гемагглютинирующих пилей адгезии, а также геном умеренного фага 139, что указывает на большую значимость этого региона для патогенности и выживания в неблагоприятных условиях внешней среды.

6. Умеренный холерный бактериофаг 139 вносит значительный вклад в изменчивость генома возбудителя холеры 0139, вызывая образование хромосомных перестроек в близлежащих к нему генах вирулентности mot и cap. У возбудителя холеры О1 серогруппы фаг 139 изменяет регуляцию экспрессии генов холерного токсина, что указывает на новый механизм контроля генной активности.

7. На основе данных молекулярного типирования показано, что вирулентные и «водные» штаммы 0139 серогруппы представляют собой различные филогенетические линии эволюции холерных вибрионов, что свидетельствует об эпидемической безопасности «водных» вибрионов, выделяемых на территории Российской Федерации. Рибо- и ПЦР- типирование с использованием случайных праймеров перспективны для проведения молекулярно-эпидемиологического исследования холеры.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации представлены на итоговых научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» "Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб" (Саратов, 1997-2001 гг.); конференции, посвященной 70 — летию научно-исследовательского института микробиологии МО РФ (г. Киров, 1998); на совещаниях проблемной комиссии 46.04 межведомственного Научного Совета по санитарно-эпидемической охране территории РФ (г. Ростов - на/Дону, 1999 — 2004 гг.); юбилейной научной конференции "Проблемы медицинской и экологической биотехнологии", посвященной 25-летию ГНЦ прикладной микробиологии (г. Оболенск, 1999 г.), международной конференции по природно-очаговым инфекциям (г. Улан-Батор, 1999 г.), на IV Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (г. Москва, 2002 г.), на научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» (г. Москва, 2002 г), на конференции межведомственного совета государств - участников СНГ (г. Саратов, 2002), на IV межгосударственной научно - практической конференции государств — участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекций (г. Саратов, 2003 г).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликованы 42 печатные работы, из них 17 в центральных изданиях. Список публикаций приведен в конце автореферата.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация состоит из введения, семи глав собственных исследований, содержащих обзор литературы, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 469 цитируемых работ. Общий объем диссертации составляет страниц. Текст иллюстрирован 19 таблицами и 37 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы. В работе использованы штаммы V.cholerae серогрупп О1 и O139, штаммы серогрупп не О1/не 0139, а также штаммы Escherichia coli и плазмиды с клонированными структурными и регуляторными генами холерного токсина (XT) V. cholerae. Для культивирования бактерий и изучения их фенотипиче-ских свойств применялись общепринятые среды и методы. Штаммы V.cholerae с из-

мененными признаками получали методом индуцированного мутагенеза с использованием мутагена Ы-метил-Ы'-нитро-нитрозогуанидина (НГ) по методу Е.А. Adelberg et al. (1965). Конъюгационные скрещивания проводили по D.E. Bradley et al. (1980). Продукцию маннозочувствительных гемагглютинирующих пилей адгезии (МЧГА) изучали по методу L.P. Наппе и R.A. Finkelstein (1982), фосфолипазы по N.H. Tan, C.S.Tan (1988), растворимой гемагглютинин/протеазы по R.A. Finkelstein et al. (1992), гемолизина по A.M. Svennerholm et al. (1983). Определение плазмидного состава проводили по методу C.J. Kado, S.T. Liu (1981). Фаговую ДНК экстрагировали по общепринятому методу [Т. Маниатис с соавт., 1984]. Трансдукционные скрещивания выполняли по методу J.E. Ogg (1981). Электронная микроскопия выполнялась методом негативного контрастирования [Mudd S., Anderson T.F., 1942] с использованием натриевой или калиевой соли фосфорновольфрамовой кислоты. Продукцию XT определяли с помощью радиального пассивного иммунного гемолиза (РПИГ) по И.А. Шагиняну, Б.М. Маракуше (1983), иммуноферментного метода GMi ELISA [Svennerholm A.-M., Wikland G., 1983] и посредством титрации токсина в кожной пробе [Craig J.P., 1965]. Вирулентность штаммов определяли по N.K.Datta и M.K.Habbu (1955). Выделение хромосомной ДНК и ДНК-ДНК гибридизацию по Саузерну проводили по Т. Маниатис с соавт. (1984). Электрофоретический анализ белков осуществляли по методу В. Lugtenberg et al. (1977). Генотипирование штаммов с использованием однопраймерной ПЦР проводили по методу G. Vassart et al. (1987).

Результаты исследований.

1. Анализ фенотипических свойств штаммов V.cholerae O139, полученных от больных и из объектов окружающей среды. Для проведения сравнительного анализа фенотипических свойств штаммов 0139 серогруппы, полученных из различных источников, было взято 20 авирулентных штаммов V.cholerae 0139, выделенных из воды открытых водоемов в Московской и Новосибирской областях в 1996-1999 гг., а также 8 вирулентных штаммов той же серогруппы, полученных в Ростовской области в 1993 г., в Киргизии в 1994 г. и в Индии в 1992-1993 гг.

Основной итог указанных работ заключался в выявлении у двух групп холер -ных вибрионов как общих, так и разных свойств Оказалось, все клинические и вод-

ные вибрионы 0139 серогруппы прототрофы и образуют новый поверхностный антиген - капсулу, о наличии которой судили по морфологии колоний, а также по данным электронно-микроскопического исследования. В то же время экспрессия другой поверхностной структуры - 0139 антигена в целом была несколько выше у «водных» вибрионов, чем у клинических. Так у 10 из 20 проверенных штаммов, выделенных из воды открытых водоемов, титр агглютинации с 0139 холерной диагностической сывороткой был выше титра агглютинации большинства штаммов, выделенных от больных в России, Киргизии и Индии.

Изучение других фенотипических признаков показало, что у клинических штаммов 0139 серогруппы свойства, необходимые для выживания в организме человека, выражены более значительно, чем у штаммов этой серогруппы, выделенных из воды. Вирулентные вибрионы продуцируют белок внешней мембраны Отри, защищающий клетку от солей желчи и других анионных детергентов [Ргоуешапо Б. в( а1., 2001]. Они гораздо более подвижны, поскольку им необходимо преодолеть слизистый барьер кишечника, чтобы достигнуть лежащие под ним эпителиальные клетки. Они образуют МЧГА, которые, вероятно, принимают участие в колонизации кишечника. Также установлено, что уровень продукции ферментов патогенности -фосфолипазы и гемагглютинипротеазы у клинических штаммов значительно выше, чем у штаммов, выделенных из воды. В то же время гемолитическая активность «водных» вибрионов в несколько раз выше, чем у вирулентных вибрионов, что согласуется с данными других исследователей [Подосинникова Л.С. с соавт., 1993]. «Водные» вибрионы 0139 серогруппы не образуют МЧГА и белка ОтрИ, но продуцируют белок ОтрТ, который, видимо, защищает вибрионы от воздействия неблагоприятных факторов внешней среды.

При проверке вирулентных штаммов 0139 серогруппы, выделенных в России и других странах СНГ, на чувствительность к антибиотикам, выявлено, что они устойчивы к триметоприму, сульфаметаксозолу, стрептомицину, что определяет высокую вероятность участия в этом процессе 8ХТ генетического элемента, кодирующего устойчивость к этим антимикробным агентам. «Водные» 0139 вибрионы чувствительны к указанным антибиотикам. Однако все они, независимо от времени и места выделения, устойчивы к другому антибиотику - ампициллину.

Таким образом, анализ экспериментальных данных свидетельствует о существовании между штаммами У.ско1егае 0139, выделенными от больных и из объектов окружающей среды, важных фенотипических различий, которые отражают их адаптацию к различным условиям обитания.

2. Сравнение генетической организации штаммов У.еко1егае O139, выделенных от людей и из воды поверхностных водоемов. Отсутствие сведений о генетических свойствах штаммов УсНокгав 0139, вызвавших вспышки холеры за пределами эндемичных очагов, включая и Россию, явилось основанием для изучения их геномов и сравнения с таковыми авирулентных штаммов. В качестве объектов исследования служили штаммы, выделенные от больных в Ростовской области в 1993 г. В результате были получены приоритетные данные о вариабельности у изученных штаммов участка хромосомы, содержащего профаги вирулентности СТХ и Я81.

Для определения числа копий профага СТХ хромосомную ДНК вирулентных штаммов Р16064, Р16065 и Р16131 обрабатывали эндонуклеазой Ръй, рестрикцион-ные фрагменты разделяли в агарозном геле и переносили на нейлоновые фильтры для гибридизации с меченным дигоксигенином СТ зондом, в качестве которого использовали ХЬа1 - Шиси фрагмент рекомбинантной плазмиды рСТИО с клонированными генами ХТ [Гинцбург А.Л. с соавт., 1984]. Установлено, что в хромосомах штаммов Р16064 и Р16131 присутствует по две копии сЫАБ генов, в то время как в штамме Р16065 содержится только одна копия этих генов (рис. 1А). Для выяснения расположения копий генов сЫАБ относительно друг друга у изучаемых штаммов их хромосомная ДНК была рестрицирована ферментом НтйШ, не имеющим сайтов узнавания в пределах СТХф, перенесена на нейлоновые фильтры, а затем гибриди-зовалась с СТ зондом. Было показано, что у штаммов Р16064, Р16065 и Р16131 гены сЫАБ лежат в пределах одного НтйШ фрагмента, что свидетельствует об их локализации в непосредственной близости друг от друга, как и у вибрионов эльтор (рис 1Б). Вместе с тем, молекулярная масса НтйШ фрагментов у всех трех штаммов была разной, что указывает на существование различий между изучаемыми штаммами в структурной организации участка хромосомы, содержащего гены с&АБ.

Поскольку у бенгальских штаммов 0139 серогруппы фаг СТХф, как правило,

Рис.1. Блот-гибридизация по Саузерну хромосомной ДНК штаммов V. chol-erae 0139 с СТ зондом: А. 1) Р16064, 2) Р16065, 3) Р16131, 4) КМ115, 5) 62, обработанных Pstl; Б 1) Р16064 , 2) Р16065, 3) Р16131, обработанных ШМШ. Справа указаны размеры Шп4Ш фага А. (т.п.н.).

фланкирован геномом другого профага RSI, rstC ген которого усиливает транскрипцию генов XT, было решено проверить, не содержится ли он в хромосоме изучаемых штаммов. Для этого их ДНК расщепляли одновременно эндонуклеазами BgUlи Pstl. Выбор указанных эндонуклеаз был обусловлен тем, что ДНК RS1 не содержит сайта узнавания для Pstl, но имеет сайт для Bglll [Гинцбург А.Л. с со-авт,1986]. Фрагменты хромосомы, образованные после ее обработки эндонуклеазами, гибридизовались с СТ зондом, а также с Pstl фрагментом рекомбинантной плаз-миды рСТ105, содержащим кроме ctxAB генов большую часть последовательности RSI. Исключение Bglll-PstI фрагментов, выявляемых СТ зондом (рис.2А), позволило обнаружить фрагменты, содержащие последовательность RS1 (рис.2Б). Таким образом, если с СТ зондом у штаммов Р16064 и Р16131 гибридизовалось два фрагмента, то при гибридизации с Pstl фрагментом плазмиды рСТ105 (ctxAB + RSI) у штамма Р16064 было образовано пять фрагментов (ввиду увеличенной интенсивности окрашивания нижний фрагмент, видимо, двойной) и, вероятно, он содержит три копии профага RS1. У штамма Р16131 количество BgUl - Pstl фрагментов, включающих RS1, и их размеры отличаются от штамма Р16064. Эти данные служат основанием для утверждения о том, что в штамме Р16131 присутствует больше копий профага RS1, чем в штамме Р16064. Анализ полученных данных свидетельствует о том, что штамм Р16064 имеет такую же структуру ctxAB области хромосомы, как и боль-

' 1 ' *,}, I J J 4

, '*> 23 6"

5 J^-» 46 • 6 »6

3 at * 4 26 tint •

ЭК A * ■

.23 -—1 96

* i

А Б

Рис. 2. Блот-гибридизация по Саузерну хромосомной ДНК, обработанной эн-донуклеазами Pstl +BgHl, с СТ зондом (А) и с СТ + RS1 зондом (Б) штаммов: 1) Р16064, 2) Р16065 3) Р16131 4) КМ115 5) 62. Справа указаны размеры HindlU рест-риктов фага X (т. п. н.).

шинство бенгальских штаммов, выделенных в 1992-1993 гг., которые имели две копии генов токсигенности, расположенные тандемно друг за другом и разделенные двумя копиями генома RS1. По-видимому, третья последовательность RS1 фланкирует гены ctxAB у штамма Р16064 со стороны 5; конца. V.cholerae PI6131 значительно отличается по структуре хромосомной области, кодирующей гены токсиген-ности, как от штамма Р16064, так и бенгальских штаммов, описанных в литературе. Штамм Р16065, также входящий в группу изученных штаммов, содержит всего одну копию генов ctxAB, локализованную в профаге СТХ и одну копию профага RS1. Эти факты говорят о том, что ctxAB область штаммов Vcholerae 0139, выделенных в 1993 г. в Ростовской области, отличается значительной вариабельностью.

Параллельно было проведено генное зондирование штаммов 0139 серогруп-пы, выделенных из воды поверхностных водоемов в 1996 - 1999 гг. в России, для выявления в их хромосоме генов, входящих в состав профагов вирулентности. Оказалось, что ни один из фрагментов ДНК штаммов V.cholerae KM115 и 62 не гибри-дизовался с СТ зондом, что указывает на отсутствие у них не только гена ctxA, что согласуется с ранее полученными данными [Ганин B.C. с соавт., 1997; Мишанькин Б. Н. с соавт., 2000], но и гена ctxB (рис. 1А, рис.2А). Установлено также, что авиру-лентные штаммы КМ115 и 62 не содержат и генома RSl(p (рис.2Б).

•—21 67

•—9 46 « 6 66

• 4 26

—2 3

• 1 96

Геном «водных» штаммов V.cholerae O139 был также изучен на содержание кластера генов rtx, кодирующих биосинтез пороформирующего токсина RTX, который вызывает развитие диареи [Бондаренко В. М. с соавт., 2002]. Зондирование ДНК атоксигенных штаммов V.cholerae 0139 Pstl фрагментом рекомбинантной плазмиды рСП 10 [Гинцбург А.Л. с соавт., 1984], несущей по нашим данным кроме клонированных генов XT, также и часть кластера генов rtx, показало наличие фрагментов, гибридизующихся с этим зондом, что позволило нам высказать предположение о присутствии генов токсина RTX у «водных» 0139 штаммов. Также установлено, что в геноме авирулентных штаммов содержится глобальный регулятор-ный ген toxR. В то же время они лишены профага 139, который присутствует в хромосоме большинства бенгальских штаммов.

Данные ДНК-ДНК гибридизации были подтверждены с помощью полимераз-ной цепной реакции со специфическими праймерами (таблица 1), полученными при исследовании геномов 32 штаммов V.cholerae 0139, из которых 20 были авиру-лентные, выделенные в Российской Федерации, а 12 - клинические, полученные на территории как РФ и других стран СНГ, так и Индии. Показано, что в хромосоме всех вирулентных штаммов присутствуют гены, входящие в состав мигрирующих генетических элементов, - ctxAB, zot, асе, кодирующие биосинтез трех холерных токсинов и расположенные на фаге СТХср (табл. 1 графы 2, 3, 4); последовательность генома профага RSI, rstC ген которого выполняет антирепрессорные функции, (графа 5); attRS - сайт интеграции фагов СТХф и RS1 ф (графа 6); ген tcpA, кодирующий продукцию ТКПА и toxT, контролирующий экспрессию факторов вирулентности, (графа 7, 8), которые входят в состав острова патогенности VPI. Кроме того, на основной части хромосомы находится глобальный регуляторный ген toxR (графа 9), ген биосинтеза порообразующего токсина rtx (графа 10) и ген hap, ответственный за продукцию растворимой гемагглютининпротеазы, (графа 11).

Наличие генов ctxAB, zot, асе и rstC, входящих в состав фагов вирулентности СТХф и RSlcp, а также tcpA и toxT, расположенных на острове патогенности VPI, свидетельствует о присутствии в геноме клинических штаммов, выделенных на территории России и стран СНГ, этих МГЭ, что и является причиной вирулентности изученных штаммов O139 серогруппы.

Таблица 1. Выявление основных генов, связанных с вирулентностью, в геноме штаммов V. cholerae 0139 методом ПЦР.

Группы штаммов V. cholerae 0139 СТХ RSIcp attRS VPI toxR rtxA hap A

ctxA Асе zot (rsiQ tcpA toxT

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Авирулентные - - - - - - - + + 4-

Вирулентные + + + + + + + + + +

В то же время все 20 штаммов, выделенных из воды, из 10 тестированных генов содержали только гены rix, toxR и видоспецифический ген hap А. Из полученных данных следует, что авирулентность водных вибрионов обусловлена отсутствием в их геноме тестируемых профагов вирулентности и острова патогенности. Кроме того, изоляты, выделенные из воды, не содержат в хромосоме последовательности attRS, и вследствие этого не могут превратиться в эпидемически опасные стабильные лизогены, содержащие фаги СТХср и RS1 (р.

3. Генетический анализ хромосомной cap области V.cholerae O139 и роль умеренного фага 139 в изменении вирулентных и антигенных свойств возбудителя холеры O139 серогруппы.

Одним из важных и перспективных результатов нашего исследования явился генетический анализ хромосомной области клинических штаммов, содержащей ген cap нового поверхностного антигена - полисахаридной капсулы. Для картирования гена cap использован Hfr донор, созданный ранее на основе штамма V.cholerae

PI6064 серогруппы 0139 [Смирнова Н.И. с соавт., 1996], а также изогенные поли-маркированные мутанты, полученные нами методом индуцированного мутагенеза. В результате конъюгационных скрещиваний установлено, что при переносе фрагментов хромосомы от донора в реципиентные штаммы ген cap в качестве неселек-тмруемого маркера наследуют 4 класса рекомбинантов с фенотипом Arg +, Pur+,

Ilv Ura Частота переноса этих маркеров составляет от 2,1х 10 -5 до 6,6 х 10~б. На

основе высокой частоты совместного переноса гена cap с генами риг и arg (65,56 % и 38,69 %) нами сделан вывод о том, что этот ген капсулообразования располагается на хромосоме межу генами, кодирующими биосинтез пурина и аргинина.

Проведенные в дальнейшем эксперименты позволили обнаружить присутствие в этой хромосомной области генов вирулентности и персистенции - mot и mshA, определяющих подвижность и продукцию МЧГА. Другой важный вывод, сделанный нами на основе полученных данных, заключается в том, что в этом же участке хромосомы находится геном профага 139, имеющего высокий процент совместного наследования (около 86%) с генами cap и mot.

Результаты анализа полученных сведений позволяют говорить о следующем положении генетических маркеров в изучаемом участке хромосомы:

O...A/S-90 -...arg-90 - (cap-90- mot-90 - профаг) - pur-90 - ilv-91 (mshA) - ига-91.

Тот факт, что фаговый геном интегрирован в хромосому в непосредственной близости от генов патогенности cap и mot, свидетельствует о том, что при неточном вырезании фаг 139 может индуцировать хромосомные перестройки в близлежащих к нему генах. Чтобы подтвердить справедливость этого предположения, мы провели изучение популяции 4-х произвольно взятых штаммов O139 серогруппы V020, РО7, МО45 и Р16065 с целью выявления спонтанных нелизогенных клеток с последующим определением у них продукции капсулы, подвижности и питательных потребностей. Фенотипический анализ показал, что среди нелизогенных клонов штамма V020 90,9 % клеток утратили способность продуцировать капсулу, поскольку они формировали прозрачные колонии. Бескапсульными также оказались 100 % нелизогенных клонов, выделенных из штамма Р16065. В случае штамма РО7 одновременная потеря фага и капсулы отмечалась лишь у 33,3 % от общего количества нелизогенных клеток. В то же время у штамма МО45 потеря фага ни в одном случае не сопровождалась появлением бескапсульных вариантов.

Кроме того, среди нелизогенных клонов двух штаммов V020 и РО7 были обнаружены клоны с измененной подвижностью, которая значительно уменьшилась у большинства нелизогенных клеток, составляя от 66,70 % до 33,33% по сравнению с исходным штаммом. Среди клеток штаммов РО7 и Р16065, утративших фаг 139, выделены также клоны, которые отличаются от исходных клонов по биосинтезу пурина. Эти данные свидетельствуют о том, что геном фага 139, включенный в бактери-

альную хромосому многих штаммов V.cholerae O139 серогруппы, является причиной фенотипической изменчивости возбудителя холеры данной серогруппы, обусловливая возникновение мутаций в близлежащих к нему генах cap, mot и риг, продукты которых важны для развития инфекционного процесса при холере. Таким образом, нами впервые показано существенное влияние профага 139 на изменчивость важнейших биологических свойств V.cholerae 0139. Широкое распространение умеренного фага 139 среди различных штаммов V.cholerae 0139 указывало на возможное его участие в горизонтальном переносе генов.

В этой связи нами было проведено изучение трансдуцирующих свойств холерного умеренного фага 139. Способность к трансдукции у фага 139 проверяли на модели штамма 01 серогруппы классического биовара V.cholerae 145 и штамма биовара эльтор CRC158-67. Установлено, что фаг 139 способен переносить хромосомные гены в штаммы обоих биоваров 01 серогруппы. У штамма 145 классического биовара трансдукция происходила с частотой 1,0 КГ7, при этом в большинстве случаев переносился гена риг. На модели штамма биовара эльтор CRC158-67 частота трансдукции была значительно выше, чем у классических холерных вибрионов, и составляла для маркера риг - 7,0 ' 10"6, для маркера arg - 1,5" 10 б . Образование главным образом трансдуктантов с фенотипом Риг+, позволяет предположить, что эта трансдукция носит специфический характер и ограничивается генами, расположенными вблизи от локуса прикрепления фага 139.

Таким образом, фаг 139 играет значительную роль в изменении свойств у штаммов возбудителей холеры обеих серогрупп. Хотя молекулярные механизмы горизонтального переноса генов, которые привели к образованию специфичного для V.cholerae O139 кластера генов, кодирующего биосинтез О-антигена, неизвестны, чаще всего в литературе высказывается мнение, что эти гены могли быть перенесены с помощью умеренного холерного бактериофага [Mooi R.K.. Bic E.M.. 1997; Fa-ruque S.M. et ai, 2003]. Поскольку в этом регионе нами картировано расположение профага 139, возможно, что именно этот фаг участвовал в переносе генов, результатом которого стало появление кластера генов биосинтеза нового 0139 антигена.

4. Умеренный холерный бактериофага 139 определяет новый механизм изменения экспрессии генов холерного токсина у V.cholerae O1.

В связи с заметной ролью профага 139 в изменчивости различных свойств возбудителей холеры серогрупп О1 и 0139, нами была определена его структурная организация и другие свойства. Электронно-микроскопическое изучение фага 139 позволило отнести его к V морфологической группе классификации по А.С. Тихо-ненко (1968). Фаговые частицы состоят из крупной гексагональной головки диаметром около 60 нм и хорошо выраженного покрытого сокращающимся чехлом хвостового отростка длиной примерно 100 нм. Проведенный с использованием эндо-нуклеаз HindlII, PstI, EcoKV, Xbal, ВатШи Xhol рестрикционный анализ позволил установить, что ДНК фага 139 имеет сайты рестрикции для всех указанных ферментов, кроме Xhol. Размер генома фага 139, определенный путем суммирования размеров рестриктов, составляет около 33,5 т.п.н. Показано, что ДНК фага 139, содержащаяся в фаговых частицах, является двунитевой, линейной и включает в себя cos сайт (от англ. cohesive end site), т.е. содержит «липкие» концы.

Методом гибридизации на фильтрах тотальной ДНК штаммов с меченными 32Р HindIII-фрагментами ДНК фага, взятыми в качестве зонда, было изучено 22 вирулентных штамма V.cholerae серогруппы 0139, выделенных в России и за рубежом. Установлено, что значительное количество штаммов возбудителя холеры серогруппы O139 (68,18 % из числа проверенных), содержат в геноме умеренный фаг 139. Они образуют фаговые частицы, способные инфицировать клетки чувствительных штаммов. Было также изучено распространение фага 139 среди 23 штаммов V. cholerae классического, 49 штаммов эльтор биоваров и среди 47 штаммов V.cholerae не 01/не 0139 серогруппы, выделенных в разные годы на различных территориях. Полученные данные указывают на широкое распространение умеренного фага 139 среди штаммов V.cholerae 01 биовара эльтор, так как 46,9 % штаммов дали положительный сигнал гибридизации с фаговым зондом. При изучении профиля гибридизации хромосомы этих холерных вибрионов с Hindlll фрагментами фага 139 было установлено, что количество и размеры гибридизующихся Pst\ фрагментов ДНК одинаковы у различных штаммов холерного вибриона биовара эльтор (CRC158/67, 17/64, 14035 АТСС) (рис. 3 дорожки 2,4,6). При этом картина гибридизации хромосомной ДНК вибрионов эльтор полностью совпадает с таковой у штамма 0139 серо-

1 2 3 4 5 6

Рис. 3. Блот-гибридизация по Саузерну хромосомной ДНК штаммов V. ска1егае разных серогрупп, обработанных эндонуклеазой Дорожка 1 - Р16064 0139 серогруппы, дорожка 2 - СКС185/67 биовара эльтор, дорожка 3 - 2А классического биовара, дорожка 4 - 17/64 биовара эльтор, дорожка 5 - 12795-62 не 01 серогруппы, дорожка 6 - 14035 АТСС биовара эльтор. В качестве зонда использовали ДНК фага 139, обработанную эндонуклеазой ШпйШ.

группы Р16064 (рис. 3 дорожка 1), что свидетельствует в пользу близкого родства У.скакгае серогруппы 0139 и У.скакгае серогруппы 01 биовара эльтор. Что касается холерных вибрионов классического биовара, то из 23 изученных штаммов 12 (52,1 %) содержат ДНК, гомологичную фагу 139, однако, профиль гибридизации классического штамма У.скакгае 2А (рис. 3 дорожка 3) значительно отличается от такового 0139 серогруппы и штаммов биовара эльтор. Эти данные указывают на то, что в этом штамме, так же как и в других штаммах классического биовара, присутствует последовательность ДНК, близкородственная фагу 139. Содержащие фаг штаммы вибрионов эльтор, как правило, продуцируют его на газоне индикаторного штамма, тогда как штаммы классических вибрионов таким свойством не обладают. Из 47 проверенных штаммов не 01/не 0139 серогрупп 4 (или 8,5 %) гибридизова-лись с фаговым зондом. При этом их профиль гибридизации значительно отличался от профиля как вибрионов 0 1, так и 0139 серогрупп (рис. 3 дорожка 5). Отсутствие фага в геноме более 90 % изученных штаммов У.скакгае не О1/не 0139, а также резистентность этих штаммов к указанному фагу, видимо, свидетельствует о слабой эволюционной связи между новыми эпидемическими штаммами и неагглютини-рующимися вибрионами.

Довольно широкое распространение профага 139 среди штаммов У.скокгае 01 ставит вопрос о его роли в их вирулентности. Одним из основных итогов этой работы стало получение приоритетных данных о существовании новых механизмов регуляции экспрессии генов XT у возбудителя холеры, обусловленных присутствием в его геноме профага 139.

Для проведения работы были взяты штаммы У.ско1егае 569B и Дакка35 серо-группы 01 классического биовара, а также У.ско1егае MAK757 биовара эльтор, которые инфицировали бактериофагом 139, и впоследствии изучали свойства полученных клонов, лизогенных по фагу. Лизогены были устойчивы к суперинфицированию фагом 139 и сами продуцировали фаг. Для подтверждения присутствия профага 139 в хромосоме ДНК этих штаммов обрабатывали эндонуклеазой БЫЛИ и после разделения фрагментов в агарозном геле переносили на нейлоновые фильтры для гибридизации с меченными дигоксигенином БМШ фрагментами ДНК фага. Как оказалось, в хромосоме штаммов 569В, Дакка35 и МАК757, лизогенных по фагу 139, присутствуют все фрагменты этого фага (рис.4 дорожки 3,5,8,9), в то время как у исходных штаммов они отсутствуют (рис.4, дорожки 2,4,6,7). В то же время в геноме классических штаммов 569В и Дакка35 выявляется последовательность ДНК, близкородственная фагу (рис.4 дорожки 2,6,7).

Далее у лизогенных по фагу 139 штаммов У.скокгае 01 была определена продукция ХТ. Оказалось, что биосинтез ХТ у лизогенов У.скокгае 569В в три раза превышает его продукцию у исходного штамма и составляет 18,0 мкг/мл. Данные кожной пробы по Крейгу также подтверждают повышение продукции ХТ у этих штаммов. Следует отметить, что внедрение фага в хромосому штамма 569В сопровождалось изменением продукции токсина в 100% случаев (проверено с помощью РПИГ 300 независимо полученных лизогенных клонов).

Изучение продукции ХТ у штамма У.скокгае МАК757 биовара эльтор показало, что в этом случае лишь 1% лизогенных клеток характеризуется измененным уровнем биосинтеза ХТ (проверено с помощью РПИГ 700 независимо полученных лизогенов). В то же время у этих лизогенов продукция токсина возрастает в 30 раз по сравнению с исходным штаммом и составляет 3,2 мкг/мл. Изучение популяции клеток исходного штамма МАК757 (проверено 700 колоний) не выявило клеток с

I234S678»

•mfmm _.•»*

Рис. 4. Блот-гибридизация по Саузерну хромосомных ДНК штаммов V.cholerae классического биовара и их лизогенных производных, рестрицированных эндонуклеазой Н/ndIII, с Hindlll фрагментами ДНК фага 139, меченными дигоксиге-нином.

1 - ДНК фага 139, ДНК штаммов: 2 - 569В, 3 - 569В(139), 4 - МАК757, 5 - МАК757 (139), 6, 7 - Дакка35, 8 - Дакка35(139), 9 - ДНК фага 139.

гиперпродукцией XT.

Внедрение фага в хромосому другого классического штамма Дакка35 привело к резкому снижению биосинтеза этого белка. Так, исходный штамм Дакка35 продуцировал 12,0 мкг/мл XT, тогда как у лизогенных клонов его продукция составляла лишь 0,1 мкг/мл. Нами также показано, что интеграция фагового генома в хромосому еще одного классического штамма 145, высокочувствительного к фагу 139, не вызывает у него изменения биосинтеза XT (проверено 300 колоний).

Таким образом, впервые получены экспериментальные данные, указывающие на то, что умеренный фаг 139, выделенный из штамма 0139 серогруппы, способен вызвать изменение продукции XT у штаммов 01 серогруппы. Эти данные ставят вопрос о механизме наблюдаемого явления. Для проверки того, не содержит ли фаг 139 структурных (ctxAB) или регуляторных (toxR) генов XT были проведены эксперименты по гибридизации фагового генома с двумя ДНК зондами. В качестве первого использовали СТ зонд (Xbal - Hindi фрагмент плазмиды рСТ110), содержащий большую часть последовательности ctxAB генов, размером 0,84 т.п.н. [Гинибург А. Л. с соавт.,1984]. Вторым служил toxR зонд, представляющий собой EcoRl фрагмент плазмиды pVM55 размером 0,6 т.п.н. с частью гена toxR [Miller V. L., Mekalanos J. J., 1988]. Для фрагментирования фаговой ДНК использовали соответственно эндо-

нуклеазы и ЕсоЯ1. В результате было показано, что геном фага 139 не содержит ни структурных генов с?хАВ, ни регуляторного гена ?охЯ, т.к. ни один из его фрагментов не гибридизовался с этими зондами. Не было получено также данных, о том, что внедрение фагового генома в хромосому холерных вибрионов могло индуцировать амплификацию генов, участвующих в биосинтезе ХТ. При гибридизации PstI фрагментов хромосомной ДНК исходных штаммов V. ско1егае 569В, Дакка35 и МАК757 и их лизогенов с СТ и ?охЯ зондами выявлено, что лизогенные по фагу 139 клетки не отличались от исходных по количеству генов токсигенности и содержали по две копии генов с?хАВ и по одной копии гена ?охЯ. В то же время, в отличие от лизогенного штамма 569В классического биовара, имеющего тот же профиль гибридизации с СТ зондом, что и исходный У.ско1егае 569В (рис 7. дорожки 1, 2), у ли-зогенного штамма биовара эльтор МАК757 наблюдается иная картина. Исходный штамм У.ско1егае МАК757 несет две копии генов с?хАВ, расположенных на Рзй фрагментах размером 5,7 и 7,0 т.п.н. (рис. 5 дорожка 3), тогда как у высокотокси-генного лизогена этого штамма одна из копий генов с1хАБ локализована на Рзй фрагменте, имеющем большую молекулярную массу, чем 7 т.п.н. (рис. 5, дорожка 4). В противоположность этому у низкотоксигенного лизогена штамма Дакка35 (рис. 5 дорожка 5) Рзй фрагмент ДНК, несущий одну из копий генов с?хАВ, имел меньшую молекулярную массу (7,0 т.п.н. вместо 9,0 т.п.н.) по сравнению с таковым у исходного штамма (рис. 5 дорожка 6).

Причина выявленных различий в структурной организации участка хромосомы в районе локализации одной из копий генов токсигенности у штаммов МАК757 и Дакка35 осталась пока неясной. Маловероятно, что наблюдаемое событие связано с внедрением фагового генома в этот район хромосомы, поскольку полученные ранее данные (см. раздел 3) показали, что местоположение профага 139 находится в участке генома, связанном с биосинтезом капсулы.

Таким образом, повышение продукции токсина у штаммов У.ско1егае 01 классического и эльтор не обусловлено появлением в их хромосоме дополнительных копий генов, участвующих в биосинтезе этого белка. Можно предположить, что внедрение в бактериальный геном фага 139 приводит к изменению транскрипционной активности одного из двух основных регуляторных генов ?охЯ и ?охТ, которые осу-

ществляют координированную позитивную регуляцию экспрессии не только генов ХТ, но и белка внешней мембраны Отри, ТКПА и других факторов патогенности.

Рис. 5. Блот-гибридизация по Саузерну хромосомной ДНК штаммов V. ска1егае О1 и их лизогенных производных, рестрицированных эндонуклеазой с СТ зондом, меченным дигоксигенином. 1 - 569В (классического биовара), 2 - 569В (139), 3 - МАК757 (биовара эльтор), 4 - МАК757(139), 5 - Дакка35 (классического биовара), 6-Дакка 35(139).

Действительно, изучение профиля белков внешней мембраны исследуемых штаммов классического биовара показало, что внедрение фага 139 в хромосому приводит к значительному повышению у них уровня продукции белка 0три, который у исходных штаммов присутствует лишь в небольшом количестве. В то же время по продукции ТКПА лизогенные штаммы не отличались от исходных. Из этих данных следует, что встраивание профага 139 в хромосому холерного классического вибриона обусловливает изменение транскрипционной активности гена 1ахВ,, на что указывает заметное изменение продукции лишь тех факторов вирулентности (ХТ и белок ОтрИ), экспрессия которых регулируется непосредственно белком ТохК. Однако механизм изменения активности регуляторного гена 1ахЕ. под действием фага 139 остается неизвестным и требует дальнейшего исследования. Изучение профиля белков внешней мембраны у клонов V.cкаleгae МАК757, лизогенных по фагу 139, показало, что в отличие от классических штаммов увеличения продукции белка 0три у них не происходит, что указывает, в свою очередь, на отсутствие изменений в транскрипции гена 1ахЯ. Ранее было показано, что вибрионы эльтор могут

та*. 1 2 3 4 5 6

' I

синтезировать XT в лабораторных условиях только тогда, когда экспрессия гена toxT происходит независимо от гена toxR [DiRita V.J.et al, 1996]. Возможно, что у лизогенных штаммов МАК757 происходит нарушение взаимодействия этих двух регуляторных генов, что и вызывает значительное повышение продукции XT. Однако это предположение также нуждается в дальнейшем подтверждении.

5. Обмен генетической информацией между вирулентными и а вирулентным и штаммами V.cholerae 0139. В результате проведенных выше экспериментов мы установили, что авирулентные штаммы 0139 серогруппы, выделяемые в различных регионах Российской Федерации, значительно отличаются по фенотипическим и генетическим свойствам от вирулентных вибрионов этой серогруппы, полученных из клинических источников. Однако остается неясным, могут ли «водные» вибрионы приобрести основные гены вирулентности в результате горизонтального переноса генов, и будут ли эти гены экспрессироваться в их клетках.

Дня получения ответа на этот вопрос в клетки авирулентного штамма 0139 серогруппы V.cholerae 170, выделенного из воды Москвы - реки в 1999 г. и не содержащего в геноме основных генов вирулентности и сайта attRS, была передана рекомбинантная плазмида рСО 107-2 Ктг Тсг с клонированными генами XT [Гинц-бург А.Л. с соавт., 1986]. Предварительно в ген hly, ответственный за продукцию гемолизина у этого штамма была введена, мутация, в результате которой он стал не-гемолитичным. Частота передачи плазмиды от донорного штамма Е. coli KS 1574 (рС0107- 2) Ктг Тсг в клетки холерного вибриона была невысока и составила 2,0x108.

Наследование плазмиды у полученных рекомбинантов Vcholerae 170 Hly подтверждалось появлением устойчивости к тетрациклину, а также присутствием в их клетках плазмидного репликона, который по размерам практически не отличался от плазмиды рС0107- 2. Вместе с тем, чувствительность клеток сконструированного штамма Vcholerae 170 Hly" (pCO 107-2) к канамицину позволяет утверждать, что введенная в них плазмида утратила транспозон mmi-kan, входящий в ее состав. На присутствие в клетках трансконъюгантов плазмиды рС0107- 2 с клонированными генами XT указывают также положительные результаты ПЦР-анализа с соответствующими праймерами для амплификации фрагмента гена ctxA

Следующий не менее важный вопрос, на который следовало получить ответ, состоял в том, происходит ли экспрессия введенных генов XT в клетках авирулент-ного штамма 0139 серогруппы. С помощью методов РПИГ и GM, ELISA были проведены эксперименты по изучению способности полученного штамма V. cholerae 170 (рСО 107-2) Тсг продуцировать XT. По данным РПИГ уровень продукции XT оказался достаточно высоким, хотя был примерно в два раза меньше, чем у контрольного высокотоксигенного штамма 569В. Количественный показатель уровня биосинтеза XT был определен нами с помощью иммуноферментного метода GMi ELISA. Если высокотоксигенный штамм V.cholerae 569B продуцировал 12 мкг/мл секретируемого XT, то у V.cholerae 170 Hly" (рСО 107-2) Тсг продукция этого белка составила - 7,6 мкг/мл. Эти данные свидетельствуют об активной экспрессии генов ctxAB в клетках авирулентного штамма 0139 серогруппы. Более того, токсин обладал и биологической активностью, которая была определена в кожной пробе Крейга и практически не отличалась от таковой у токсина штамма классического биовара 569В (1:3000-1:4000). Высокий уровень токсина, продуцируемый полученным штаммом, по-видимому, связан с локализацией генов ctxAB не на хромосоме, а на плазмидном репликоне. Стабильность наследования плазмиды в клетках полученного штамма in vitro составила 99,0 % .

При внутрикишечном заражении крольчат-сосунков клетками плазмидного штамма V.cholerae 170 (рСО 107-2) в дозе 109 кл./мл и последующем высеве вибрионов из тонкого и толстого кишечника на простые среды без антибиотиков было получено всего 200 изолированных колоний, которые и проверили на резистентность к тетрациклину. Установлено, что плазмида сохраняется у 87,5 % клонов. Из этого следует, что стабильность наследования вибрионами плазмиды с генами XT в условии in vivo была также высока. В то же время отсутствие холерогенного эффекта и каких- либо изменений в тонком и толстом кишечнике у всех зараженных животных указывает на авирулентность штамма, несмотря на то, что он имеет гены ctxAB и активно продуцирует XT. Причиной выявленного несоответствия между токсигенно-стью и авирулентностью сконструированного штамма является отсутствие в его геноме других ключевых генов вирулентности, локализованных на МГЭ.

Эти сведения представляют особую важность, поскольку позволяют сделать вывод о том, что обитающие в открытых водоемах России авирулентные штаммы

0139 серогруппы не могут быть эпидемически опасными даже при получении ими генов XT.

Другая не менее важная задача была связана с изучением возможности передачи хромосомных генов от вирулентных штаммов V.cholerae 0139 к авирулентным вибрионам с помощью конъюгации. В качестве Hfr донора был использован ранее сконструированный штамм КМ2362, производный вирулентного штамма Р16064 серогруппы O139 [Смирнова Н. И. с соавт., 1996]. Полимаркированные реципиенты были получены при обработке авирулентного штамма 170 серогруппы 0139 НГ по методу Е.А Adelberg et д/.(1965). В результате проведенных скрещиваний донорно-го и реципиентных штаммов было отобрано 6 классов рекомбинантов - Asp+, Trp+, Ilv+, Ura+, His* и Arg+. Оказалось, что частоты наследования селектируемых маркеров донора реципиентными штаммами весьма невысоки и составляют 10~7 - 10~8. Поскольку этот показатель во многом зависит от степени гомологии хромосом скрещиваемых штаммов, то его низкая величина свидетельствует об отсутствии значительной гомологии между хромосомами вирулентного донорного и авиру-лентного реципиентного штаммов 0139 серогруппы.

У полученных классов рекомбинантов также определяли показатели совместного наследования селектируемых маркеров с неселектируемыми, которые выражались как отношение числа рекомбинантов, получивших неселектируемый маркер донора, к общему количеству рекомбинантов данного класса. Оказалось, что совместное наследование рекомбинантами селектируемых и неселектируемых маркеров донора в ряде случаев происходит довольно часто. Так, при скрещивании КМ2362 с полиауксотрофным реципиентом КМ 158 рекомбинанты, получившие маркер ига, в 85% наследовали и маркер arg. В скрещиваниях КМ2362 с КМ170-1 в 42,64% и 43,96 % случаев были обнаружены рекомбинанты с совместным наследованием маркеров his и trp. В то же время среди более 1000 проверенных рекомбинантов различных классов, полученных в 50 независимых скрещиваниях, не было обнаружено ни одного клона, получившего от донора такие гены вирулентности как ctxAB и tcpA. Также не были переданы гены msh, кодирующие биосинтез МЧГА

Таким образом, анализ представленных данных, с одной стороны, указывает на возможность переноса небольших фрагментов хромосомы от вирулентных V.cholerae 0139 к авирулентным штаммам этой серогруппы. С другой стороны по-

лученные сведения позволяют говорить об отсутствии значительного генетического сходства вирулентных штаммов с авирулентными, поскольку частота образования различных рекомбинантов, в значительной мере зависящая от степени гомологии хромосомы ДНК донора и реципиента, была низкой.

6. Молекулярное типирование штаммов У.скоЬггаг O139 с различной эпидемической значимостью. Происхождение вибрионов 0139 серогруппы, выделяемых из воды поверхностных водоемов в России, остается до сих пор неустановленным. В частности неясно, являются ли «водные» вибрионы производными вирулентных вибрионов этой серогруппы, претерпевшими значительные изменения в результате приспособления к новой среде обитания, или они - естественные обитатели водоемов, существовавшие во внешней среде задолго до появления вирулентных V.cкаleгae 0139. В связи с этим, был проведен сравнительный анализ геномов этих штаммов на основе разработанной нами модификации метода риботипирования. В банке данных "ОепБапк" были получены последовательности генов 168 и 238 рРНК V.cкаleгae и с помощью компьютерной программы "ОепЯиппег" рассчитаны прай-меры для амплификации фрагментов генов 168 и 238 рРНК, которые имели следующую структуру:

168рРНК:

5'-АСАСООТССАОАСТССТАС -31

5'-ССААСАТТТСАСААСАСО -31

238 рРНК:

5 ' -GGGAACTGAAA.CATCT.AAG-3 '

5 ' - TGAATATAAGTCGCTGACC - 3 ' Амплификацию ДНК в полимеразной цепной реакции с рассчитанными нами прай-мерами проводили по ниже указанной программе: 1-й цикл — 95 °С, 5 мин; 2-35-й циклы - 95 °С, 30 сек; 61 °С, 40 сек; 72 °С, 30 сек. Были получены специфические амплификаты, имевшие размеры для 168 рРНК - 761 т.п.н. и для 238 рРНК 401 т.п.н., которые метили дигоксигенином и впоследствии использовали в качестве зондов на гены рРНК в реакции блот-гибридизации по Саузерну.

Для риботипирования были использованы вирулентные и авирулентные штаммы 0139 серогруппы, выделенные на территории России и СНГ, а также вирулентный штамм 8в24 из Индии (1992) и штамм V.cholerae 569В классического биовара. В качестве вирулентных были выбраны штаммы Р16064, Р16065 и Р16131, выделенные от больных в 1993 г. в Ростовской области, а также штаммы 1306 и 1311, полученные в 1994 г. в Киргизии. В группу авирулентных штаммов были включены штаммы, выделенные из вод р. Оби КМ115 (1996 г.) и Р17778 (1998 г.), а также штаммы 228 (1997 г.), 62 (1998 г.), 170 (1999 г.) из вод Москвы-реки.

Их хромосомную ДНК выделяли, фрагментировали с помощью эндонуклеазы рестрикции Bgll, разделяли в агарозном геле методом электрофореза и переносили на нейлоновые фильтры для гибридизации с зондами на гены 168 и 238 рРНК. Использование зонда на 23 8 рРНК выявило различную картину гибридизации у вирулентных и авирулентных штаммов V.cholerae 0139. Все вирулентные штаммы, полученные в Ростовской области, показали единый профиль гибридизации с зондом на 238 рРНК. С ними совпадал профиль гибридизации штамма 1306 из Киргизии и бенгальского штамма 8в24. В то же время классический штамм 569В имел значительные отличия в структуре генов рРНК от штаммов 0139 серогруппы. Авирулентные 0139 штаммы отличались от всех изученных вирулентных штаммов, но были идентичны между собой. Таким образом, использование зонда на 23 8 рРНК позволяет дифференцировать вирулентные штаммы V.cholerae 0139 от авирулентных, а также вирулентные штаммы 0139 серогруппы от вирулентных классических штаммов. Однако при этом не удается выявить различия в структуре генома внутри группы вирулентных штаммов 0139 серогруппы, так как они имели одинаковый профиль гибридизации с этим зондом.

Указанные различия у клинических штаммов были обнаружены с помощью зонда на последовательность гена 168 рРНК. Как и в случае с 23 8 рРНК зондом, штаммы, полученные в Ростовской области, показали одинаковую структуру гт оперонов (рис. 6 дорожки 1, 2, 3), которая, однако, уже отличалась от штамма 8в24 (рис. 6 дорожка 11). Разница между ними заключалась в наличии у ростовских штаммов двух дополнительных фрагментов в профиле гибридизации: одного - высокомолекулярного (около 20 т.п.н.) и второго, располагающегося в средней части дорожки, размером около 5 т.п.н. Эти фрагменты отсутствовали у штамма 8в24. Сравнение

картины гибридизации штаммов Р16064, Р16065 и Р16131 с образцами риботипов штаммов, выделенных на Индийском полуострове между 1992 и 2000 гг., свидетель-

1 2 3 * } 6 1 8 9 ю и 12 13

Рис. 6. Блот-гибридизация по Саузерну штаммов V.cholerae 0139 с зондом на гены 168 рРНК. 1) Р16064; 2) Р16065; 3) Р16131; 4)1306; 5) 1311; 6) КМ115; 7) 62; 8) 170; 9)228; 10) Р17778; 11) 8в24; 12) 569В; 13) Фаг ШтШ+ЕсоШ.

ствует в пользу того, что штаммы ростовской группы должны быть отнесены к новому риботипу, который не представлен в схеме 8.М.Рагщие (1999) и который мы предлагаем обозначить как Я-1. По нашим данным штамм 8в24, выделенный в Индии в 1992 г. (рис. 6 дорожка 11), относится к риботипу В-1, в который входят большинство бенгальских штаммов во время первых эпидемий, вызванных V.cholerae 0139. Отличия в риботипах ростовских штаммов и 8в24 связаны, вероятно, с тем, что штамм, завезенный в Россию и послуживший причиной вспышки в Ростовской области в 1993 г. имел другой риботип по сравнению с 8в24. Штамм 1306 (рис. 6 дорожка 4), выделенный в Киргизии в 1994 г., совпадал по профилю гибридизации с российскими штаммами и поэтому также может быть отнесен к риботипу Я-1. Возможно, эти штаммы занесены на территорию СНГ из одного и того же эндемичного по холере региона. Другой киргизский штамм - 1311 (рис. 6, дорожка 5) отличался от предыдущих штаммов отсутствием высокомолекулярного фрагмента в профиле гибридизации, но содержал, в отличие от бенгальского штамма 8в24, один из центральных фрагментов размером около 5 т.п.н. Классический штамм 569В имел риботип, значительно отличавшийся от риботипов штаммов 0139 серогруппы (рис. 6 дорожка 12).

При использовании зонда на 168 рРНК, так же, как и в случае с зондом на 238 рРНК, авирулентные штаммы 0139 серогруппы показали единый профиль гибридизации и четко дифференцировались от вирулентных штаммов V.cholerae 01 и V.cholerae 0139 (рис. 6 дорожки 6, 7, 8, 9, 10). Их риботип мы обозначили как N^1. Единообразие структуры рРНК генов авирулентных штаммов 0139 серогруппы, выделенных на географически удаленных друг от друга территориях в разное время, вызывает удивление, так как ранее было показано, что авирулентные штаммы холерных вибрионов не 01/не 0139 серогруппы отличаются значительным разнообразием структуры генов рРНК [Ба^аагё А. et al, 1995]. Единый риботип авирулентных штаммов 0139 серогруппы, выделенных из р. Обь и Москва, свидетельствует, по- видимому, о существовании механизма селективного отбора для вибрионов этой серогруппы с данной структурой рРНК.

Таким образом, на основе риботипирования штаммов 0139 серогруппы, выделенных от больных людей и из воды поверхностных водоемов, установлено, что они не имеют близкого эволюционного родства. Однако, опыт использования методов генотипирования на моделях различных бактерий показал, что оно должно основываться на результатах, по крайней мере, двух методов, подтверждающих данные друг друга. В связи с этим было решено проверить правильность сделанных нами выводов с помощью другого метода - однопраймерной ПЦР, показавшей свою эффективность при изучении других бактерий. Для типирования штаммов 0139 серогруппы мы применили праймер, обозначенный как 15 - (5' ОАОООТООСООТТСТ3'), который обеспечивал однопраймерную «случайную» амплификацию фрагментов ДНК [Уаззай в. et al., 1987].

Амплификацию ДНК в ПЦР проводили по следующей программе: 1-5 циклы -95 °С, 2 мин, 40 °С, 2 мин, 72 °С, 2 мин; 6-35 цикл - 95 °С,1 мин, 53 °С, 3 мин, 72 °С, 2 мин; 36 цикл 95 °С, 2 мин, 53 °С, 2 мин, 72 °С , 2 мин.

В условиях однопраймерной ПЦР все вирулентные штаммы 0139 серогруппы,

независимо от места и времени их выделения, имели идентичные ПЦР - профили,

которые отличались от профиля классического штамма 569В. Из этого следует, что

использование однопраймерной ПЦР позволяет разделять штаммы, относящиеся к

0139 серогруппе и к 01 серогруппе крзрщчщ^^^д^щД^П

I БИБЛИОТЕКА ] I С.Пет«р«ук I » 4) Ж ю \

«Водные» вибрионы имели ПЦР - профили идентичные между собой, что подтверждает генетическую однородность этой группы. В целом же картина расположения полос у «водных» штаммов 0139 серогруппы принципиально отличалась от вирулентных штаммов 0139 и 01 серогрупп, что также доказывает отсутствие эволюционной близости между ними и вирулентными вибрионами. ПЦР-типирование подтверждает вывод, сделанный нами ранее с помощью риботипиро-вания, об удаленности штаммов 0139 серогруппы клинического и «водного» происхождения друг от друга.

Учитывая показанные в предыдущих главах глубокие фенотипические и генетические различия между клиническими и «водными» вибрионами У.ско1егае 0139, и также опираясь на результаты риботипирования и ПЦР-типирования этих групп, следует, признать, что вирулентные и авирулентные вибрионы 0139 серогруппы представляют собой две независимые филогенетические линии холерных вибрионов. Наличие 0139 антигена у обеих групп штаммов является, на наш взгляд, результатом конвергенции в независимой эволюции обеих групп вибрионов. Из этого следует, что, штаммы У.сШегае 0139, выделяемые из водоемов в различных регионах Российской Федерации в настоящее время, практически не имеют эпидемического значения и в случае их выделения не требуется проведения комплекса защитных мер, применяемых при обнаружении вирулентных штаммов Уско!егае.

Таким образом, в данной работе создано новое научное направление в генетике патогенных вибрионов — изучение структуры и функций генома вирулентных и авирулентных штаммов V. ско1егае новой 0139 серогруппы, имеющих различное происхождение. Определена связь патогенных свойств возбудителя холеры с присутствием в его геноме мобильных генетических элементов, несущих гены вирулентности, - профагов СТХ и К81, острова патогенности УР1. Авирулентность «водных» вибрионов обусловлена отсутствием в его геноме указанных МГЭ.

Проведен детальный генетический анализ хромосомной области, содержащей гены новых поверхностных антигенов, и обнаружена их сцепленность с другими генами вирулентности и персистенции, что определяет ее важную роль в реализации патогенных свойств вибрионов.

Получены приоритетные данные об участии умеренного фага 139 в образовании штаммов V ско1егае 0139 с измененной экспрессией ключевых генов вирулент-

ности и антигенности. Выявлен и изучен новый механизм регуляции экспрессии генов холерного токсина у традиционных возбудителей холеры 01 серогруппы, обусловленный внедрением в их хромосому генома профага 139, который является характерным генетическим элементом У.ско1егае 0139.

Использованные эффективные методы молекулярного типирования позволили выявить эволюционно сложившиеся различия между вирулентными и авирулент-ными штаммами У.ско1егае 0139 и подтвердить эпидемическую безопасность последних.

Перспектива работы в плане получения новых фундаментальных и прикладных научных знаний заключается в изучении динамики и направленности геномного полиморфизма клинических штаммов У.ско1егае 0139 с целью прогнозирования возможности образования эпидемически опасных патогенных вибрионов с новыми свойствами, затрудняющими диагностику и профилактику холеры, в выявлении ранее неизвестных генетических и фенотипических особенностей авирулентных и вирулентных вибрионов 0139 серогруппы, отражающих эволюционно сложившиеся различия между ними, определении роли различных профагов в негативном и позитивном контроле экспрессии генов патогенности, в совершенствовании молекуляр-но-эпидемиологического анализа патогенных вибрионов.

ВЫВОДЫ:

1. Клинические и выделенные из воды открытых водоемов на территории России штаммы У.ско1егае 0139 отличаются друг от друга по способности к биосинтезу различных факторов патогенности и иммуногенности. Возбудитель холеры серо-группы 0139 в отличие от «водных» вибрионов продуцирует маннозочувствитель-ные гемагглютинирующие пили адгезии, белок внешней мембраны Отри, имеет высокий уровень биосинтеза 0139 антигена, фосфолипазы, растворимой гемагглю-тинин/протеазы, но не способен к эффективной продукции гемолизина. Сравниваемые штаммы характеризуются также разной чувствительностью к антибиотикам.

2. Выявлены принципиальные отличия в структуре геномов возбудителя холеры 0139 серогруппы и холерных вибрионов, выделенных из водных экосистем на территории России и стран СНГ. Вирулентность возбудителя холеры 0139 серогруппы связана с присутствием в его геноме МГЭ, содержащих гены патогенности,

- двух профагов СТХ (ctx A, z,ot, асе) и RSI (rstC), острова патогенности VPI (tcpA, toxT), а также нуклеотидной последовательности attRS - сайта для внедрения фагов в хромосому. Авирулентность «водных» вибрионов обусловлена отсутствием указанных МГЭ. Гены toxR, rtxA, hapA, локализованные на основной части хромосомы, имеются у всех штаммов, что указывает на их участие в процессах жизнедеятельности клетки.

3. Впервые показано, что авирулентные холерные вибрионы 0139 серогруппы могут приобретать в составе рекомбинантных плазмид структурные гены ctxAB. Их эффективная экспрессия приводит к продукции этими штаммами значительного количества секретируемого и биологически активного холерного токсина, но не может обеспечить развития инфекционного процесса у лабораторных животных из-за отсутствия в геноме других ключевых генов вирулентности.

4. Впервые обнаружено, что геномы клинических штаммов V.cholerae 0139, выделенных на территории России, несут различное количество копий профагов вирулентности СТХ и RS1, а также отличаются друг от друга по структуре хромосомных областей, содержащих их, что определяется вариабельностью бактериального участка ДНК, связанного с продукцией холерного токсина.

5. Впервые установлено, что в геноме возбудителя холеры O139 серогруппы вблизи гена cap, кодирующего продукцию нового поверхностного антигена - капсулы и картированного между маркерами риг и arg, локализован геном профага 139, а также гены вирулентности и персистенции mot и mshA, определяющие подвижность и продукцию маннозочувствительных гемагглютинирующих пилей адгезии. Присутствие указанных генов в одном участке хромосомы определяет его большую значимость для патогенности вибрионов и их выживания в неблагоприятных условиях внешней среды.

6. Холерный умеренный бактериофаг 139 содержится в геноме почти 70 % изученных вирулентных штаммов V.cholerae 0139. Впервые доказано, что он относится к специализированным трансдуцирующим фагам, способным обеспечить перенос генетической информации от возбудителя холеры серогруппы 0139 к патогенным штаммам V.cholerae 01.

7. Умеренный фаг 139, содержащийся в геноме возбудителя холеры V.cholerae 0139 в виде профага, вызывает изменение его важных биологических свойств. Ин-

дукция профагом хромосомных перестроек в близлежащих к нему генах cap и mot приводит к образованию штаммов с пониженной вирулентностью и измененными антигенными свойствами.

8. Впервые выявлено участие профага 139 в регуляции генной активности у возбудителя холеры 01 серогруппы. Показано, что внедрение умеренного фага 139 в хромосому нового хозяина V.cholerae 01 приводит к изменению продукции ключевого фактора вирулентности — холерного токсина. Выявление нового механизма регуляции генной активности определяет возможность конструирования штаммов V. cholerae 01 классического и эльтор биоваров с повышенной продукцией холерного токсина.

9. На основе ПЦР - и риботипирования показано, что возбудитель холеры V. cholerae O139 и авирулентые вибрионы 0139 серогруппы представляют собой различные филогенетические линии эволюции холерных вибрионов, что в совокупности с данными о фенотипических и генетических различиях служит доказательством эпидемической безопасности вибрионов 0139 серогруппы, выделяемых в настоящее время из воды открытых водоемов на территории Российской Федерации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Смирнова Н.И., Ливанова Л.Ф., Ерошенко Г.А Изучение способности к продукции холерного экзотоксина у природных штаммов Vibrio cholerae II Журн. микробиол. -1990. - №3. - С. 6-9.

2. Ерошенко ГА, Смирнова Н.И. Трансдукция у холерного вибриона классического и эльтор биоваров // Проблемы особо опасн. инф.. - Саратов, 1993. - №3 (73).- С. 202 - 205.

3. Смирнова Н.И., Чеховская Г.В., Давыдова Н.И., Ливанова Л.Ф. Ерошенко ГА, Остроумова Н.М. Фенотипический анализ двух морфологически разных типов колоний колоний Vibrio cholerae 0139 // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол.. -1995. - № 3. - С. 30-34.

4. Smirnova N.I., Livanova L.F., Chekhovskaya G.V., Davidova N.I., Yeroshenko G.A. Virulence-associated characteristic and phage lysogenicity of two mor-

phologically distinct colonies of Vibrio cholerae 0139 serogroup // FEMS Microbiol. Lett. - 1996. -Vol. 136.-P. 175-180.

5. Смирнова Н.И., Ливанова Л.Ф., Ерошенко ГА, Чеховская Г.В., Давыдова Н.И, Шопырева СВ. Создание системы конъюгационного переноса хромосомы и генетическое картирование хромосомы Vibrio cholerae серогруппы 0139 // Молекул, генетика, микробиол и вирусол. - 1996. - №2. - С. 14-18.

6. Смирнова Н.И., Щелканова Е.Ю., Ерошенко Г.А. Генетический анализ хромосомной области Vibrio cholerae 0139, несущей гены капсулы. // Мат. науч.-практ. конф. поев. 100-летию образования противочумной службы России . — Сара-тов.-1997.-Т.2. - С. 153.

7. Ерошенко Г.А., Лазовский Ю.В., Щелканова Е.Ю., Конов Н.П., Савостина Е.П. Умеренный фаг Vibrio cholerae 139 // Там же. - С. 155.

8. Смирнова Н.И., Чеховская Г.В. Ерошенко Г.А. Генетический анализ участка хромосомы Vibrio cholerae, содержащего гены 0139 антигена и капсулы // Там же. - С. 147.

9. Смирнова Н.И., Щелканова Е.Ю., Ерошенко ГА, Ливанова Л.Ф. Изучение распространенности и роли умеренного фага V.cholerae 0139 в фенотипической изменчивости возбудителя холеры // Проблемы особо опасн. инф..- Саратов, 1998. -С.163-169.

10. Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И., Кириллина О .А. Умеренный холерный фаг 139 и его влияние на продукцию токсина у штаммов холерного вибриона // Проблемы особо опасн. инф. - Саратов, 1998. — Вып.78.- С. 122-128.

11. Ерошенко Г.А., Кириллина О.А., Смирнова Н.И. Вызванное фагом изменение продукции токсина у клеток холерного вибриона классического и эльтор био-варов // Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария. Материалы конф. поев. 70-летию НИИ микробиологии МО РФ. (Киров, 30 ноября -1 декабря Киров, 1998) // Под ред. Е.В.Пименова., И.В. Дармова -Киров: НИИ микробиологии МО РФ, 1998. - С.91.

12. Осин А.В., Щелканова Е.Ю., Заднова СП., Ерошенко Г.А Изучение фе-нотипических особенностей авирулентного штамма 0139 серогруппы Vibrio cholerae КМ115 // Проблемы особо опасн. инф. — Саратов, 1999.- Вып.79. - С.163-169.

13. Смирнова Н.И., Ерошенко Г.А., Щелканова Е.Ю., Ливанова Л.Ф., Коннов Н.П. Умеренный фаг Vibrio cholerae 0139: характеристика и роль в изменении эк-прессии хромосомных генов вирулентности // Молекул генетика, микробиол.и виру-сол. - 1999. -№ 1. - С. 17-22.

14. Осин А.В, Щелканова Е.Ю., Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И. Изучение фенотипических и генетических особенностей авирулентных холерных штаммов O139 серогруппы // Проблемы медицинской экологической биотехнологии.: Тез. докл. юбилейной, научн. конф, поев.25-летию ГНЦ прикладной микробиологии (Оболенск, 14-15 декабря 1999)- Оболенск, 1999 г. - С..117.

15. Ерошенко ГА, Смирнова Н.И. Изменение токсигенных и антигенных свойств клеток Vibrio.cholerae 01, вызванное умеренным фагом 139 // Centre for Control and Research of natural infectious diseases. Scientific Journal. - Ulaanbaator, 1999.-№7.-C.239-241.

16. Кириллина О.А., Ерошенко Г. А., Щеканова Е.Ю., Смирнова Н.И. Структурный анализ ДНК умеренного холерного бактериофага 139 // Там же. - С. 248-249.

17. Ливанова Л.Ф., Чеховская Г.В., Ерошенко ГА, Лазовский Ю.В., Захарова Т.Л. Штаммы Vibrio.cholerae сероваров 01 и 0139, продуцирующие основные протективные антигены // Журн. микробиол.— 2000. — №3 - С. 47-51.

18. Осин А.В., Ерошенко Г.А., Коннов Н.П., Кузнецов О.С., Смирнова Н.И. Фенотипический и генетический анализ штаммов Vibrio cholerae 0139 серогруппы, выделенных из внешней среды // Проблемы, особо опасн. инф. - Саратов, 2000. -Вып. 80.-С. 93-101

19. Щелканова Е.Ю., Ерошенко Г.А., Осин А.В., Коннов Н.П., Смирнова Н.И. Трансдуцирующие свойства умеренного холерного фага 139 // Там же - С. 6163.

20. Ерошенко Г.А., Ливанова Л.Ф., Лазовский Ю.В., Смирнова Н.И. Изучение механизма изменения продукции холерного токсина у Vibrio.cholerae 01, вызванное фагом 139 // Там же. - С.63-65.

21. Щелканова Е.Ю., Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И. Умеренные холерные фаги Vibrio cholerae 0139 //Холера и патогенные для человека вибрионы. Материалы пробл. комиссии.- Ростов-на-Дону.- 2001.- Вып. 14. - С. 38-39.

22. Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И. Штамм бактерий V.cholerae eltor KM195 — продуцент холерного токсина II типа, способ получения штамма. Патент на изобретение №2172776, 2001.

23. Ерошенко ГА, Осин А.В., Челдышова Н.Б., Смирнова Н.И. Генетические особенности авирулентных и вирулентных штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы, выделенных на территории России // Проблемы особо опасн. инф. Саратов, 2001 г.-С.69-75

24. Щелканова Е.Ю., Ерошенко ГА, Осин А.В., Смирнова Н.И. Определение локализации умеренного холерного фага 139 на хромосоме штаммов Vibrio, cholerae 0139 и О1 серогруппы // Проблемы, особо опасн. инф. - 2001 .-№1 (81).-С.76-85.

25. Ерошенко Г.А., Коннов Н.П., Щелканова Е.Ю., Волков Ю.П. Электронно- микроскопическое исследование умеренного фага Vibrio cholerae 0139. XIX Российская конференция по электронной микроскопии ЭМ'2002: Тез. докл. научн. конф., Черноголовка, 2002. — С.215.

26. Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И. Изменение биосинтеза холерного токсина у Vibrio cholerae O1 при интеграции умеренного фага 139 в бактериальную хромосому// Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. — 2002. - №2. — С.9-14.

27. Ерошенко Г.А., Осин А.В., Смирнова Н.И. Риботипирование штаммов Vibrio cholerae 0139, полученных из различных источников // Проблемы особо опасных инф. - 2002. - С. 80 - 85.

28. Ерошенко Г.А., Осин А.В., Смирнова Н.И. Молекулярное типирование Vibrio cholerae 0139 // Холера и патогенные для человека вибрионы. Материалы пробл. комиссии.- Ростов-на-Дону.- 2002.-Вып.15.- С.57-59.

29. Щелканова Е.Ю., Осин А.В., Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И. Изучение возможности генетического обмена между штаммами Vibrio cholerae 0139, выделенными из различных источников // Там же. - С. 75-76.

30. Ерошенко Г.А. Изменение признаков биовара у клеток Vibrio cholerae classica, устойчивых к классическому холерному фагу // Там же. — С. 72-75.

31. Осин А. В., Ерошенко Г. А., Щелканова Е. Ю., Смирнова Н. И. Молеку-лярно-генетический анализ штаммов Vibrio cholerae 0139, выделенных на террито-

рии России из различных источников // Генодиагностика инф. заболеваний. Тез. докл. 4-й Всероссийской науч.-практ. конф., Москва, 2002. - С.287-289.

32. Ерошенко Г. А., Осин А.В., Смирнова Н.И. ПЦР- анализ штаммов Vibrio cholerae 0139, выделенных из различных источников // Там же. - С. 127-129

33. Ерошенко Г.А., Щелканова Е.Ю. Анализ структуры ctxAB области штаммов Vibrio cholerae 01, выделенных в период, предшествовавший седьмой пандемии холеры.// Холера и патогенные для человека вибрионы. Материалы пробл. комиссии.- Ростов-на-Дону.- 2003.-Вып. 16.- С. 137-140.

34. Осин А.В., Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И. Распространение генов вирулентности среди штаммов Vibrio cholerae 0139 различного происхождения и определения генетического родства между ними // Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней. Материалы 4-й Межгосударственной науч.-практ. конф. государств-участников СНГ (30 сентября - 2 октября 2003 г. Саратов). -Саратов, 2003. - С. 135-138.

35. Осин А.В. Ерошенко Г.А., Лазовский Ю.В. Смирнова Н.И. Сравнительный ПЦР-анализ структуры генома вирулентных и авирулентных штаммов Vibrio cholerae серогруппы 0139 // Проблемы особо опасных инф. - Саратов, 2003. -Вып.85. -С.97-103.

36. Ерошенко Г.А., Щелканова Е.Ю., Демьянова Л.П., Коровкина Г.И., Зи-нина О.С. Изменение свойств биовара у клеток Vibrio cholerae 01 классического биовара // Там же. - С.62-69.

37. Осин А.В., Ерошенко Г.А Использование вариабельности генов ггп для типирования штаммов Vibrio cholerae 0139 // VI Российский съезд врачей-инфекционистов (Санкт-Петербург, 29-31 октября 2003 г.) Материалы съезда.. -Санкт-Петербург. - 2003 г.- С. 125.

38. Ерошенко Г.А., Кутырев В.В. Молекулярные аспекты изучения возбудителей особо опасных инфекций // Проблемы особо опасн. инф.- 2003.- Вып.86. С.54-68

39. Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И. Роль умеренного бактериофага 139 в изменении продукции холерного токсина у Vibrio cholerae классического биовара // Генетика.- 2004.- №4.- С.445-453.

40. Ерошенко ГЛ., Осин А.В., Щелканова Е.Ю., Смирнова Н.И. Сравнительный анализ геномов вирулентных и авирулентных штаммов Vibrio cholerae 0139 // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол.- 2004.- №2. - С. 11-16

41. Щелканова Е.Ю., Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И. Влияние фага 139 на изменение продукции холерного токсина у штаммов классического биовара Vibrio cholerae 01 //IX Всероссийск. научн.-практ. конф. «Молодые ученые в медицине». Тез.докл.- Казань, 2004 - С. 141-143.

42. Осин А.В., Ливанова Л.Ф., Ерошенко ГА., Заднова СП., Смирнова Н.И. Особенности экспрессии рекомбинантной плазмиды с генами холерного токсина в клетках авирулентного штамма V.cholerae серогруппы 0139 // Биотехнология. — 2004.-№3.-С. 12-18

Сдано в набор 15.08. 04 г. Подписано к печати 15.08. 04 г. Форма! 60 х 84 1/16 Печать лазерная. Объем 2, 0 усл. п.л. Тираж 100 экз.

Отпеча!ано на полиграфическом оборудовании РосНИПЧИ

«Микроб» Минздрава России

410005, г.Саратов, ул. Университетская, 46

Р154 06

РНБ Русский фонд

2005-4 12658

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Ерошенко, Галина Александровна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1.1. Бактериальные штаммы.

1.2. Питательные среды и реактивы.

1.3. Используемые методы.

ГЛАВА 2. АНАЛИЗ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ШТАММОВ У.СНО

ЬЕЯАЕ 0139, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ.

2.1. Микробиологические и биохимические свойства вибрионов серогрупп01 и 0139 (обзор литературы).

2.2. Фенотипический анализ штаммов V. скокгае 0139 различной вирулентности.

2.2.1. Определение продукции капсулы и 0139 антигена.

2.2.2. Сравнительный анализ питательных потребностей, подвижности, продукции пил ей адгезии и устойчивости к антибиотикам.

2.2.3. Определение продукции белков внешней мембраны, ферментов патогенности (протеазы, фосфолипазы) и гемолизина.

ГЛАВА 3. СРАВНЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ШТАММОВ V.

СНОЬЕЯАЕ 0139, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БОЛЬНЫХ И ИЗ ВОДЫ ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОДОЕМОВ.

3.1. Организация генома У.сИокгае 01 и 0139 (обзор литературы).

3.2. Сравнительный анализ генома вирулентных и авирулентных штаммов V. сНокгае 0139.

3.2.1. Изучение структурной организации участков хромосомы вирулентных штаммов 0139 серогруппы, содержащих генытокси-нообразования с&АВ.

3.2.2. Генное зондирование авирулентных штаммов V. скокгае для выявления в их хромосоме структурных и регуляторных генов вирулентности, а также последовательности ДНК ЯЭ1 и генома умеренного фага 139.

3.2.3. Сравнительный ПЦР - анализ структуры генома вирулентных и авирулентных штаммов V. скокгае серогруппы 0139.

ГЛАВА 4. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ САР ОБЛАСТИ ХРОМОСОМЫ V.

СНОЬЕЯАЕ 0139 И РОЛЬ УМЕРЕННОГО ФАГА 139 В ИЗМЕНЕНИИ ВИРУЛЕНТНЫХ И АНТИГЕННЫХ СВОЙСТВ ВОЗ

БУДИТЕЛЯ ХОЛЕРЫ СЕРОГРУППЫ 0139.

4.1. Генетический контроль биосинтеза 0139 антигена и полисахарид-ной капсулы (обзор литературы).

4.2. Генетическое картирование гена cap с помощью метода конъюгации.

4.3. Определение сцепленности гена cap с генами, контролирующими подвижность холерных вибрионов и биосинтез маннозочув-ствительных гемагглютинирующих пилей адгезии.

4.4. Определение локализации умеренного фага 139.

4.5. Роль фага 139 в фенотипической изменчивости V.cholerae 139.

4.6. Трансдуцирующие свойства умеренного фага 139.

ГЛАВА 5. ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА У V.CHOLERAE 01, ВЫЗВАННОЕ ФАГОМ 139.

5.1. Умеренные бактериофаги V .cholerae 0139 и их роль в изменении свойств возбудителя холеры (обзор литературы).

5.2. Морфология фага 139 и физическая характеристика его ДНК.

5.3. Определение присутствия фага 139 в различных штаммах V. cholerae 0139.

5.4. Изучение распространенности умеренного фага 139 среди штаммов V.cholerae 01 и не 01/не 0139 серогрупп.

5.5. Изменение биосинтеза холерного токсина у V.cholerae 01 при интеграции умеренного фага 139 в бактериальную хромосому.

5.5.1. Молекулярно - биологический анализ штаммов V.cholerae 01, инфицированных фагом 139.

5.5.2. Продукция холерного токсина у клеток V. cholerae 01, лизогенных по фагу 139.

5.6. Роль фага 139 в изменении свойств, связанных с вирулентностью, у V.cholerae 01 классического биовара.

5.6.1. Изучение чувствительности различных штаммов 01 серогруппы классического биовара к умеренному фагу 139.

5.6.2. Влияние фага 139 на продукцию холерного токсина у штаммов V.cholerae 01 классического биовара.

5.6.3. Изучение механизма изменения продукции холерного токсина у штаммов V.cholerae 01 классического биовара, лизогенных по фагу 139.

ГЛАВА 6. ОБМЕН ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИЕЙ МЕЖДУ ВИРУЛЕНТНЫМИ И АВИРУЛЕНТНЫМИ ШТАММАМИ У.СНОЬЕЫЕ 0139.

6.1. Генетический обмен у V. ско1егае и его роль в образовании вирулентных штаммов (обзор литературы).

6.2. Особенности наследования и экспрессии в клетках авирулентного штамма V. ско1егае 0139 рекомбинантной плазмиды с генами холерного токсина.

6.3. Обмен хромосомными генами между вирулентными и авирулент-ными штаммами V. ско1егае 0139.

ГЛАВА 7. МОЛЕКУЛЯРНОЕ ТИПИРОВАНИЕ ШТАММОВ V. СНОЬЕЫЕ 0139 С РАЗЛИЧНОЙ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТЬЮ.

7.1. Происхождение У.ско1егае 0139 (обзор литературы).

7.2. Риботипирование штаммов У.сИо1егае, полученных от больных и из объектов внешней среды.

7.3. Генотипирование штаммов У.сИо1егае 0139 с использованием од-нопраймерной ПЦР.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетический анализ штаммов Vibrio cholerae O139"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Холера продолжает оставаться одной из наиболее социально значимых инфекций. Ежегодно во Всемирную организацию здравоохранения поступают сведения о более, чем 100.000 больных холерой. Заболеваемость регистрируется во многих странах мира, расположенных на территориях практически всех континентов, в том числе и в России [Weekly epidemiological record, 2002; 2003; Онищенко Г.Г., 2000; Онищенко Г.Г. с соавт., 2000; 2002; 2004].

Из 206 известных серогрупп V.cholerae вибрионы только серогруппы 01 и 0139 способны вызвать заболевание. До недавнего времени все эпидемии холеры вызывались вирулентными вибрионами серогруппы 01, в то время как вибрионы других серогрупп были причиной лишь локальных вспышек холероподобных инфекций. В 1992 г в Южной Индии были впервые зарегистрированы большие эпидемии холеры, вызванные холерным вибрионом ранее неизвестной 0139 серогруппы. Они продолжались в 1992-1993 гг., в течение которых V. cholerae 0139 (синоним Бенгал) распространился на территорию Бангладеш и других азиатских стран таких, как Пакистан, Непал, Китай, Таиланд, Афганистан, Малазия. Завозные случаи были зарегистрированы в России и в других странах СНГ, а также в США [Albert М. J. et al., 1993; Nair G. В. et al., 1995, Faruque S.M. et al., 1998; Москвитина Э.А. с соавт., 1999; Сагимбек У.А. с соавт., 2004]. В настоящее время холерные вибрионы серогруппы 0139 являются причиной 17 % случаев холеры регистрируемых в мире [Sinha S. eta/., 2002; Москвитина Э.А. с соавт., 2003].

Появление нового возбудителя холеры, его высокая вирулентность (высокий процент летальности среди заболевших), мощный эпидемический потенциал, обусловивший вынос инфекции на территорию различных континентов, а также значительная вариабельность структуры генома V.cholerae 0139 привлекли к нему внимание исследователей во всем мире, поскольку все эти свойства moi ли свидетельствовать о происходящем в природе процессе образования нового патогенного клона V.cholerae, способного вызвать новую пандемию холеры [Waldor М.К., Mekalanos J.J., 1994].

Происхождение «нового» возбудителя холеры до сих пор не установлено. Не выяснены молекулярно-генетические механизмы, которые привели к появлению V. cholerae 0139. Предполагается, что это событие произошло благодаря переносу генетической информации от неизвестного донора в штамм биовара эльтор серо-группы 01, который, вероятно, был осуществлен с помощью бактериофага или конъюгативной плазмиды [Johnson J.A. et al., 1994; Mooi R.K. Bic E.M. 1997; Fa-ruque S.M. et al., 2003]. Структурно-функциональные особенности генома возбудителя холеры серогруппы 0139 исследованы далеко недостаточно. Не установлены причины высокой вариабельности различных областей хромосомы V.cholerae 0139, связанных с вирулентностью. Не изучена структура участка хромосомы, содержащего гены биосинтеза нового поверхностного антигена - полисахариднои капсулы, который отсутствует у возбудителя 01 серогруппы.

Остается невыясненным участие в изменчивости вирулентных и антигенных свойств патогенных вибрионов 0139 серогруппы мобильных генетических элементов, в том числе и умеренного холерного бактериофага 139, впервые обнаруженного в штаммах У.сИокгае 0139. Исследование изменений, происходящих в геноме возбудителя холеры 0139 серогруппы, может пролить свет на пути образования новых патогенных штаммов ¥.сИо1егае с измененными свойствами.

Практически не изучены молекулярно-генетические особенности штаммов 0139 серогруппы, выделенных на территории России и других стран СНГ, так же как не описаны свойства других вирулентных штаммов 0139 серогруппы, выделенных при локальных вспышках, зарегистрированных за пределами эндемичных очагов холеры.

Большую проблему для эпидемиологов представляют атоксигенные вибрионы 0139 серогруппы, которые выделяются из воды поверхностных водоемов на территории Российской Федерации. В 1996-2002 гг. такие штаммы были выделены в Новосибирской, Московской, Ростовской областях и в Калмыкии [Ганин В. С. с соавт., 1997; Ломов Ю. М., с соавт., 2000; Юорегян А. А. с соавт., 2002]. Практически не изучены их фенотипические свойства и структура генома, отсутствуют сведения об их происхождении, генетической связи с вирулентными штаммами и эпидемической значимостью. Для установления эволюционной связи между вирулентными и «водными» вибрионами необходимо провести молекулярное типиро-вание штаммов 0139 серогруппы, полученных из различных источников. Вместе с тем отсутствуют эффективные системы молекулярного типирования, представленные комплексом методов, использование которых позволит не только провести дифференциацию штаммов У.сИо1егае 0139, но и повысить эффективность проводимого эпидемиологического мониторинга холерных вибрионов, выделяемых из объектов окружающей среды. Не разработана стандартная систематическая номенклатура молекулярных подтипов, в соответствие с которой могут быть классифицированы вновь выделяемые изоляты. Отсутствуют базы данных с генетическими характеристиками ранее выделенных на территории Российской Федерации штаммов У.скокгае 0139.

Появление У.скокгае 0139 потребовало создания специфических профилактических средств против нового возбудителя холеры, а также средств его диагностики. В настоящее время отсутствуют эффективные вакцины против У.скокгае 0139, а также штаммы-продуценты с высоким уровнем биосинтеза ключевых факторов вирулентности и иммуногенности, которые могут послужить основой для создания живых вакцин против У.скокгае 0139 и найти применение в производстве химических холерных вакцин и диагностических тест-систем.

Все это диктует необходимость проведения разносторонних и глубоких исследований структуры и функции генома вирулентных и «водных» штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы, генетического контроля регуляции экспрессии генов вирулентности, создания эффективной системы молекулярного типиро-вания вибрионов и разработки средств профилактики и диагностики У.скокгае 0139.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - Молекулярно - генетический и фенотипический анализ штаммов У.скокгае 0139, имеющих различную эпидемическую значимость, и выявление новых механизмов образования штаммов возбудителя холеры с измененной экспрессией генов вирулентности.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Провести сравнительный анализ продукции факторов вирулентности и иммуногенности, а также устойчивости к антибиотикам у штаммов Ускокгае

0139, выделенных от больных и из водных экосистем на территории Российской Федерации и стран СНГ.

2. Получить новые данные о генетической организации штаммов V. cholerae 0139 различного происхождения и установить связь выявленных свойств с их вирулентностью.

3. Провести генетическое картирование гена cap, контролирующего биосинтез нового поверхностного антигена - полисахаридной капсулы, определить его локализацию относительно других генов вирулентности и выяснить значение этого локуса для реализации патогенности возбудителя холеры новой серогруппы.

4. Определить роль профага 139 в изменчивости вирулентных и антигенных свойств возбудителя холеры 0139 и 01 серогрупп.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА:

Получены приоритетные данные об особенностях структуры генома штаммов V.cholerae 0139, выделенных от больных и из объектов окружающей среды на территории Российской Федерации и стран СНГ. Впервые на основе комплексного методического подхода с использованием анализа полиморфизма длин рестрикци-онных фрагментов и ПЦР - анализа различных ключевых генов вирулентности и жизнеобеспечения установлены принципиальные отличия в структурнофункциональной организации геномов возбудителя холеры 0139 серогруппы и холерных вибрионов, выделенных из водных экосистем на территории России и стран СНГ. Показано, что вирулентность возбудителя холеры 0139 серогруппы связана с присутствием в его геноме мобильных генетических элементов, содержащих гены патогенности, - двух профагов СТХ (ctx А, zot, асе) и RSI (rstC), острова патогенности VPI (tcpA, toxT), а также сайта для внедрения фагов в хромосому - нуклеотидной последовательности attRS.

Впервые установлено, что в геноме вибрионов 0139 серогруппы, выделенных из воды, отсутствуют гены не только холерного токсина ctxAB, но и гены дополнительных холерных токсинов zot и асе, локализованных на фаге СТХф, а также последовательность другого фага RSlcp, гены tcpA, toxT, входящие в состав острова патогенности VPI, и последовательность attRS. Из этого следует, что ави-рулентность «водных» вибрионов 0139 серогруппы связана с отсутствием основных генов вирулентности, расположенных на МГЭ. Впервые выявлено, что в составе хромосомы авирулентных штаммов присутствует ген порообразующего токсина rix А, гены toxR и hap А, которые также обнаружены и у вирулентных штаммов, что указывает на их участие в процессах жизнедеятельности клетки.

Впервые обнаружено, что штаммы возбудителя холеры 0139 серогруппы, выделенные в России, характеризуются вариабельностью участка ДНК, связанного с продукцией холерного токсина. Изменчивость этого района подтверждается присутствием в нем различного количества копий профагов вирулентности СТХ и t

RSI, прилегающих к хромосомным участкам с различной организацией.

Впервые изучена структура участка хромосомы, ответственного за биосинтез новых поверхностных антигенов возбудителя холеры V.cholerae 0139. Установлено, что вблизи гена cap, кодирующего биосинтез полисахаридной капсулы, располагается геном профага 139, а также гены mot и msh, определяющие подвижность и продукцию маннозочувствительных гемагглютинирующих пилей адгезии, что указывает на большое значение этой области в вирулентности и персистенции вибрионов 0139 серогруппы. Выявлено, что профаг 139 индуцирует хромосомные перестройки в близлежащих к нему генах вирулентности и, таким образом, играет важную роль в изменении признаков вирулентности и антигенности у возбудителя холеры V.cholerae 0139:

Впервые установлено, что фаг 139 оказывает влияние на продукцию основного фактора вирулентности - холерного токсина у штаммов возбудителя холеры 01 серогруппы классического и эльтор биоваров. Его интеграция в геном V. chol-erae 01 приводит к изменению активности глобального регуляторного гена toxR и структурной организации участка хромосомы, содержащего гены токсинообразо-вания. Выявленный новый механизм регуляции генной активности у возбудителя холеры 01 серогруппы использован для создания принципиально нового способа получения штаммов возбудителя холеры с измененной продукцией холерного токсина.

Впервые на основе разработанной системы молекулярного типирования проведено комплексное генотипирование штаммов 0139 серогруппы, полученных от больных и из воды поверхностных водоемов. С помощью метода риботипирования показано, что штаммы, выделенные в 1993 г. в Ростовской области относятся к новому риботипу, отсутствующему в международной классификации и обозначенному как R-I. На основе ПЦР - и риботипирования установлено отсутствие близких эволюционных связей между клиническими и «водными» вибрионами, выделяемыми из воды в различных областях Российской Федерации.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ:

Создана эффективная система молекулярного типирования штаммов V.cholerae 0139 и 01, основанная на сочетании модифицированного метода риботипирования и ПЦР-типирования со случайными праймерами, использование которой позволит повысить эффективность проводимого эпидемиологического мониторинга за штаммами холерных вибрионов, выделяемыми из объектов окружающей среды. В результате ее применения установлено, что штаммы 0139 серогруп-пы, циркулирующие в настоящее время в открытых водоемах на территории различных областей Российской Федерации, эпидемически безопасны, и в случае их выделения не требуется проведения комплекса защитных мер, применяемых при обнаружении вирулентных штаммов V.cholerae.

Материалы исследований вошли в методические указания «Основные требования к вакцинным штаммам холерного вибриона» по федеральному уровню внедрения, которые одобрены Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол Ученого Совета № 4 от 13.04.2004 г.) и Ученым Советом Ростовского научно-исследовательского противочумного института (протокол Ученого Совета № 2 от 18.02.2004 г.).

В Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" (Саратов) депонирована коллекция из 18 генетически модифицированных штаммов У.ско1егае 01 и 0139 с измененным биосинтезом факторов вирулентности, иммуногенности и жизнеобеспечения, которая является основой для проведения микробиологического, биохимического и генетического изучения роли этих факторов в патогенезе и иммуногенезе холеры. Входящие в состав этой коллекции штаммы 01 и 0139 серогрупп с высоким уровнем продукции таких протективных антигенов, как В-субъединица холерного токсина, 0139 антиген и капсула, белки внешней мембраны рекомендуются для производства живых и химических холерных вакцин, а также средств диагностики холеры.

Получен патент на изобретение штамма бактерий КМ195 - продуцента холерного токсина II типа и способ получения штаммов (патент на изобретение №2172776 выдан 27 августа 2001 г. Приоритет от 17.07.2000 г.). Штамм У.сНокгае КМ 195 с гииерпродукцией холерного токсина, характерного для холерных вибрионов биовара эльтор, предназначен для использования его при производстве холерных химических вакцин. Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение штамма бактерий У.сНо1егае КМ168 - основы для конструирования живых вакцин против диарейных заболеваний, вызываемых патогенными штаммами У.сНо1егае 0139 по заявке № 2003 131 557/13, дата приоритета 27.10. 2003.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ;

1. Клинические штаммы V.cholerae 0139 значительно отличаются от штаммов этой же серогруппы, выделенных из воды открытых водоемов на территории России, по продукции следующих факторов вирулентности и иммуногенности: 0139-антигена, маннозочувствительных гемагглютинирующих пилей адгезии, ферментов патогенности фосфолипазы и растворимой 1емаплютинин/про1еазы, гемолизина и по подвижности. Они имеют также неодинаковую устойчивость к четырем изученным антибиотикам.

2. Геномы возбудителя холеры и «водных» штаммов V. cholerae 0139 имеют различную структуру. Патогенность штаммов, выделенных от больных, определяется присутствием в их геноме мобильных генетических элементов, содержащих ключевые структурные и регуляторные гены вирулентности, - профаги СТХ (ctxA, zot, асе) и RSI (rstC), остров патогенности VPI (tcpA, to:с), а также генов, расположенных на основной части хромосомы - attRS, toxR, hapA, rtxA. Авирулентность холерных вибрионов, изолированных из водной среды, связана с отсутствием в их хромосоме указанных МГЭ и нуклеотидной последовательности attRS.

3. «Водные» штаммы 0139 серогруппы могут стать токсигенными в результате приобретения ими генов токсигенности в составе конъюгативных плаз-мид, но они остаются авирулентными для лабораторных животных из-за отсутствия в их геноме других ключевых генов патогенности.

СТХ и RSI, что указывает на значительную изменчивость участков генома, связанных с продукцией холерного токсина.

5. Ген нового поверхностного антигена - полисахаридной капсулы у возбудителя холеры 0139 серогруппы локализован в участке генома, содержащего гены вирулентности mot и mshA, определяющие подвижность холерного вибриона и продукцию маннозочувствительных гемагглютинирующих пилей адгезии, а также геном умеренного фага 139, что указывает на большую значимость этого региона для патогенности и выживания в неблагоприятных условиях внешней среды.

6. Умеренный холерный бактериофаг 139 вносит значительный вклад в изменчивость генома возбудителя холеры 0139, вызывая образование хромосомных перестроек в близлежащих к нему генах вирулентности moi и cap. У возбудителя холеры 01 серогруппы фаг 139 изменяет регуляцию экспрессии генов холерного токсина, что указывает на новый механизм контроля генной активности.

7. На основе данных молекулярного типирования показано, что вирулентные и «водные» штаммы 0139 серогруппы представляют собой различные филогенетические линии эволюции холерных вибрионов, что указывает на эпидемическую безопасность «водных» вибрионов, выделяемых на территории Российской Федерации. Рибо- и ПЦР- типирование с использованием случайных праймеров перспективны для проведения молекулярно-эпидемиологического исследования холеры.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации представлены на итоговых научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» "Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб" (Саратов, 1997-2001 гг.); на конференции, посвященной 70 - летию научноисследовательского института микробиологии МО РФ (г. Киров, 1998); на совещаниях проблемной комиссии 46.04 межведомственного Научного Совета по санитар но-эпидемической охране территории РФ (г. Ростов - на / Дону, 1999 - 2004 гг.); юбилейной научной конференции "Проблемы медицинской и экологической биотехнологии", посвященной 25-летию ГНЦ прикладной микробиологии (г. Обо-ленск, 1999 г.), международной конференции по природно-очаговым инфекциям (г. Улан-Батор, 1999 г.), на IV Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (г. Москва, 2002 г.), на научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» (г. Москва, 2002 г), на конференции межведомственного совета государств - участников СНГ (г. Саратов, 2002), на IV межгосударственной научно -практической конференции государств - участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекций (г. Саратов, 2003 г).

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликованы 42 научные работы, из них 17 в центральных изданиях

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ерошенко, Галина Александровна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Вид бактерий Vibrio cholerae объединяет как свободно живущие холерные вибрионы, обитающие в водных экосистемах, так и патогенные вибрионы, способные при попадании в организм человека колонизировать тонкий кишечник и вызывать патологический процесс. К настоящему моменту известно 206 серогрупп V.cholerae, отличающихся по структуре О-антигена. До недавнего времени считалось, что холерные вибрионы только серогруппы 01 могут вызывать эпидемии и пандемии холеры. Появление V.cholerae 0139, послужившего причиной больших эпидемии холеры в Индии (Бенгалии) в 1992-1993 гг., быстрое распространение его на территорию соседних азитских стран и вынос инфекции на другие континенты поставил вопрос о начале восьмой пандемии холеры, вызванной новым этиологическим агентом - холерным вибрионом серогруппы 0139.

Этот вопрос и к настоящему моменту остается открытым. Однако ряд факюв свидетельствует в пользу того, что V.cholerae 0139 может действительно вызвать новую пандемию холеры. В отличие от других вибрионов не 01 серогруппы, этот возбудитель обладает высоким эпидемическим потенциалом и уже в течении более, чем десяти лет вызывает эпидемии холеры в Южной Азии. На протяжении всего времени своего существования патогенные вибрионы 0139 серогруппы успешно конкурируют с вибрионами 01 серогруппы биовара эльтор на территориях, эндемичных по холере. Успех этот, возможно, связан с непрерывным изменением организации генома V.cholerae 0139, затрагивающим как гены вирулентности, так и гены, обеспечивающие жизнедеятельность клеток. В некоторых областях хромосомы V.cholerae 0139 изменения происходят даже с большей скоростью, чем у штаммов 01 серогруппы биовара эльтор, вызвавших текущую пандемию холеры [Faruque S.M. et al, 1999;

2003]. Все детерминанты вирулентности, выявленные на сегодняшний момент у штаммов седьмой пандемии, обнаружены и у патогенных вибрионов 0139 серогруп-пы, в том числе и «острова пандемичности», которые по данным М. ег а1.

2002] могут отвечать за пандемические свойства возбудителя холеры. Все эти факты, а также наблюдаемый с начала нового тысячелетия рост заболеваемости холерой «Бенгал» (ТЧа1г С.В. е1 а1, 2002; вш^ Р. еГ а1., 2003; БшЬа 8., е1 а/., 2003] могут свидетельствовать в пользу того, что У.ско1егае 0139 способен вызвать новую пандемию холеры.

Несмотря на интенсивное изучение возбудителя холеры, проводимое в последние годы с привлечением новейших достижений современной фундаментальной науки, остаются невыясненными механизмы формирования новых патогенных штаммов У.сИокгае, и, в частности, те молекулярные процессы, которые привели к образованию возбудителя холеры 0139 серогруппы. Для их выявления необходимо тщательное изучение структурно-функциональных особенностей генома патогенных вибрионов 01 и 0139 серогрупп, включающее исследование не только основных генов вирулентности, но и других генов, которые вносят свой вклад в патологический процесс, а также обеспечивают сохранение этих патогенов во внешней среде. Необходимо проводить дальнейшее исследование свойств авирулентных вибрионов, живущих в поверхностных водоемах, так как между ними и вирулентными вибрионами, также проводящими часть своего жизненного цикла во внешней среде, могут происходить процессы генетического обмена.

К настоящему моменту установлено, что У.сИокгае 0139 является неоднородной серогруппой, состоящей из вирулентных штаммов, образующих основные факторы патогенности - ХТ и ТКПА, и нетоксигенных штаммов, не продуцирующих ХТ и

ТКПА [РороуюИ Т. ег а!., 1995; ВеНгап Р. еГ а/., 1999; БагГап М. е* а1,. 1999; Рагицие Б. М., Asadulghani е/ а/., 2000]. Эпидемическое значение последних остается невыясненным. Вероятно, они не представляют собой такой опасности как вибрионы первой группы. Однако их происхождение не установлено. Не изучена возможность конверсии этих авирулентных вибрионов в вирулентные штаммы и, следовательно, не оценен до конца их эпидемический потенциал. В тоже время, начиная с 1996 гг., такие вибрионы выделяются из поверхностных водоемов на обширных пространствах России в Новосибирской, Московской, Ростовской областях и Калмыкии. В связи с этим изучение свойств «водных» вибрионов и оценка их эпидемическою шиенциала представляет собой задачу большого научно-практического значения.

В 1993 году на территории Ростовской области, а в 1994 г. и в другой стране СНГ - Киргизии от больных были выделены вирулентные штаммы V. скокгае 0139. Был изучен ряд свойств этих изолятов [Смирнова Н.И. с соавт., 1996; Чеховская Г. В. с соавт. 1997, Монахова Е.В. с соавт., 2002]. Однако структура их геномов, и, в частности, строение областей токсигенности, капсулообразования и других локусов пато-генности остались до конца не исследованными. В литературе практически не описаны свойства штаммов 0139 серогруппы, вызвавших вспышку за пределами эндемичных территорий. Изучение генетических особенностей таких штаммов и, в частности штаммов, выделенных в России и странах СНГ, может внести свой вклад в исследование изменчивости У.сИокгае 0139 и роли в этом процессе экологических факторов и иммунного статуса населения, а также поможет в уточнении возможных путей заноса холерных штаммов на территорию стран СНГ.

Для решения вышеуказанных вопросов нами проведено изучение свойств V. скокгае 0139, выделенных от больных людей и из объектов внешней среды на территории Российской Федерации и других стран СНГ. На первом этапе исследования был проведен сравнительный анализ продукции этими штаммами факторов вирулентности и иммуногенности, в том числе продукции ряда ферментов, факторов ад1 е-зии и белков внешней мембраны, а также устойчивости к антибиотикам. Выявлено существование важных отличий между клиническими и «водными» вибрионами. Как и следовало ожидать, у вирулентных штаммов 0139 серогруппы свойства, необходимые для выживания в организме человека, выражены более значительно, чем у штаммов, выделенных из воды. В частности, они более подвижны, что вполне объяснимо, поскольку вирулентные вибрионы должны преодолеть слизистый барьер кишечника, чтобы достигнуть лежащий под слизью слой эпителиальных клеток. Они образуют значительное количество белка внешней мембраны OmpU, продукция которог о необходима вибрионам, попавшим в желудочно-кишечный тракт, так как этот белок обладает протективными свойствами и защищает клетку от бактерицидного действия солей желчи и других анионных детергентов. Белок OmpU полностью отсутствует у изученных нами авирулентных штаммов 0139 серогруппы, но они содержат белок OmpT, который, вероятно, способствует выживанию вибрионов в условиях внешней среды. Вирулентные вибрионы 0139 серогруппы образуют МЧГА, в то время как у авирулентных штаммов продукция этих пилей отсутствует. Считается, что МЧГА вносят свой вклад в вирулентность V.cholerae [Johnson G. et al., 1994; Fullner K. J., Mekalanos J.J., 1999]. По продукции ферментов патогенности - фосфолипазы и про-теазы вирулентные штаммы также превосходят авирулентные. В то же время гемолитическая активность у «водных» вибрионов в несколько раз выше, чем у клинических штаммов, что подтверждает существующее мнение о том, что авирулентные штаммы отличаются высоким уровнем продукции гемолизина [Подосинникова Л. С., 1993].

Еще более значительные отличия между штаммами V.cholerae 0139, полученными из клинических источников и из воды, были установлены при изучении их генетических свойств. Исследование генома вирулентных V. cholerae 0139, выделенных в 1993 г. в Ростовской области, методом блот-гибридизации по Саузерну показало, что все они содержат в составе хромосомы гены, ответственные за биосинтез ХТ, но структура ctxAB области хромосомы у этих штаммов различна. Штамм Р16064 имеет расположение генов ctxAB, характерное для большинства штаммов V.cholerae 0139, полученных в 1992-1993 гг. [Bhadra R.K. et al., 1995]. Он содержит две копии генов ctxAB, которые также разделены двумя RSltp, в то время как третья из последовательностей RSlcp фланкирует вторую копию генов ctxAB со стороны 5f конца. В тоже время другой штамм - Р16131, несмотря на то, что он также содержит две копии генов токсигенности, значительно отличается по размеру фрагментов рестрикции хромосомы, несущих эти гены, и по количеству последовательностей RSl(p от штамма Р16064 и от бенгальских штаммов этого периода, описанных в литературе. Третий штамм этой группы - Р16065 содержит, по нашим данным, всего одну копию генов ctxAB и одну копию последовательности RS1, расположенных на фрагменте атипично большого для возбудителя холеры размера. Эти факты свидетельствуют о значительной изменчивости участка генома V.cholerae 0139, связанного с продукцией основного фактора патогенности - ХТ.

Исследование геномов штаммов V. cholerae 0139, выделенных из поверхностных водоемов, установило, что они не содержат не только генов ctxA и tcpA, как было показано ранее [Балахонов C.B. с соавт., 1998; Водопьянов С. О. с соавт., 1999; Балахонов C.B., 2000; Мишанькин Б. H., с соавт., 2000; Давыдова Н. А. с соавт., 2001], но что они не несут гена ctxB, асе и zot, а также RSlcp. Однако ДНК-ДНК гибридизация выявила наличие у «водных» штаммов 0139 серогруппы последовательности H [Мо-тин B.JI., 1988], которая, видимо, содержит кластер токсина RTX, ответственного за цитотоксическую активность вибрионов [Lin W. et al., 1999; Бондаренко В. M. с соавт., 2002], или его часть. Зондирование хромосом авирулентных штаммов 0139 серогруппы toxR зондом помогло установить, что они, как и вирулентные V. cholcrae 0139 содержат глобальный ген-регулятор toxR, который кроме регуляции генов вирулентности, контролирует и другие функции, важные для жизнедеятельности клеток.

Полученные с помощью блот-гибридизации по Саузерну результаты исследований генома вирулентных и авирулентных штаммов 0139 серогруппы были расширены на основе использования ПЦР, позволившей провести изучение 32 штаммов V. cholerae 0139, 20 из которых были авирулентными штаммами, выделенными в России. У всех авирулентных штаммов было подтверждено отсутствие генов ctxA, tcpA, zot, асе и RSlcp. Использование праймеров на последовательность гена rtxA доказало правильность нашего предположения о наличии у всех изученных авирулентных вибрионов серогруппы 0139 кластера генов, определяющего биосинтез токсина RTX. Нами также впервые показано отсутствие у авирулентных штаммов 0139 серогруппы atfRS сайта, необходимого для интеграции в хромосому фага СТХф, несущего гены ХТ. Это значит, что фаг не может внедряться в геном этих штаммов и образовывать стабильные лизогены, что свидетельствует в пользу их эпидемической безопасности.

Были также получены новые данные об отсутствии у «водных» штаммов регу-ляторного гена toxT, необходимого для экспрессии факторов вирулентности. Поскольку методом ПЦР у этих вибрионов показано отсутствие и гена tcpA, то можно сделать вывод об отсутствии в хромосоме авирулентных V. скокгае 0139 не только последовательности фага СТХф, но и острова патогенности УР1, содержащего гены ТКПА и белка ТохТ. В тоже время у всех 20 авирулентных штаммов выявлено присутствие регуляторного гена 1охК и гена растворимой гемагглютинин/протеазы -кар А.

Изучение 12 клинических штаммов российского и бенгальского происхождения показало, что они содержат все десять тестируемых генов (ыхА, го^ асе, аПЯБ, гя/С (Я81ф), 1срА, ШхЯ, ЮхТ, НхА, карА), в то время как в хромосомы авирулентных вибрионов включено лишь 30 % из них. Таким образом, проведенное исследование позволило установить, что геном вирулентных штаммов У.скокгае 0139 имеет сложную организацию и содержит, так же как и вирулентные вибрионы серогруппы 01 острова патогенности и персистенции, которые интегрированы в основную часть хромосомы. В тоже время нами впервые показано, что авирулентные 0139 вибрионы не несут генома фага СТХф, острова патогенности УР1 и, скорее всего, не содержат острова персистенции, поскольку у них отсутствует продукция МЧГА, гены которых являются генетическим маркером этого острова. Очевидно, что различная организация геномов штаммов 0139 серогруппы определяет различный эпидемический потенциал этих штаммов.

Несмотря на то, что вибрионы 0139 серогруппы, выделенные из внешней среды, лишены основных генов вирулентности и значительно отличаются от вирулентных V. скокгае 0139 по фенотипическим свойствам, существует вероятность того, что они могут изменить свою эпидемическую значимость в результате приобретения ими генов вирулентности. Горизонтальный перенос генов согласно современным представлениям является одним из основных механизмов образования новых вирулентных штаммов. Для изучения того, как изменятся свойства водных 0139 вибрионов при получении ими генов основного фактора вирулентности - ХТ, в авирулент-ный штамм серогруппы 0139 V. cholerae 170 были введены в составе рекомбинант-ной нлазмиды рСО 107-2 гены токсигенности ctxAB. Следует отметить, что частота передачи плазмиды была невысокой и составила лишь 2,0 х10~7. Рекомбинантная плазмида рСО 107-2 стабильно сохранялась в клетках нового хозяина. Проверка свойств сконструированного штамма V. cholerae 170 рСО 107-2 выявила у него высокий уровень продукции ХТ. В реакции GM] ELISA количество образуемого токсина составило 7,6 мкг/мл. Кроме того, этот белок обладал и высокой биологической активностью, которая была определена в реакции кожной пробы по Крейгу и соответствовала активности токсина вирулентного штамма 569В серогруппы Ol классическо-гого биовара. Большое количество синтезируемого ХТ у штамма V. cholerae 170 рСО 107-2, скорее всего, объясняется плазмидной локализацией генов ctxAB и их большей копийностью, а также может быть связано с ToxR - независимой регуляцией экспрессии генов токсигенности, находящихся на внехромосомном репликоне [S Lazar S, Waldor М, 1998]. Несмотря на высокий уровень продукции ХТ, штамм V. cholerae 170 рСО 107-2 остался авирулентным для лабораторных животных и не вызвал у них диареи, вероятно, из-за отсутствия у него основного фактора адгезии -ТКПА и способности колонизировать тонкий кишечник животных, а также OTcyici-вия других генов вирулентности. Из этого следует, что обитающие в водоемах России авирулентные вибрионы 0139 серогруппы, выделяемые в настоящее время, не становятся эпидемически опасными даже при получении ими генов ХТ.

Несмотря на огромный интерес исследователей к новому поверхностному антигену V.cholerae 0139 - полисахаридной капсуле, генетический контроль ее биосинтеза остался до сих пор невыясненным. В связи с этим нами были проведены эксперименты по установлению локализации гена cap на хромосоме V.cholerae 0139 с помощью конъюгационного переноса хромосомных генов. В результате проведенных исследований показано, что cap расположен между генами риг и arg, контролирующими, соответственно, биосинтез пурина и аргинина. В этом же регионе хромосомы располагается еще один ген патогенности mot, определяющий подвижность вибрионов, а также последовательность ДНК умеренного фага семейства каппа, обозначенного нами как фаг 139. Установлено, что включенный в геном профаг может при неточном вырезании из хромосомы индуцировать перестройки в близлежащих к нему генах cap, mot и pur. Это свойство профага 139 является причиной частого появления мутантов штаммов V.cholerae 0139 с измененной экспрессией таких важных прина-ков бактериальной клетки как подвижность, биосинтез полисахаридной капсулы и пуриновых оснований. Более того, тесная сцепленность 139 профага с геном cap указывает на возможную роль фага в эволюции бенгальских штаммов, поскольку к настоящему времени сформировалось представление, согласно которому новый эпидемический штамм возник в результате переноса генетической информации от неизвестного донора к V.cholerae биовара эльтор с помощью трансдукции [Mooi F.R., Bik Е.М., 1997].

В результате проведенных исследований нами получены важные данные о том, что умеренный фаг 139 действительно способен переносить хромосомные гены. По

6 7 казано, что он с частотой n х 10" - 10 " осуществляет перенос, в основном, гена риг. Все трансдуктанты Pur+ были лизогенными по фагу 139. Трансдукция хромосомных генов в вибрионы 01 серогруппы биовара эльтор происходит более эффективно (n \ 10 "6), чем вибрионов классического биовара (n х 10 "7-'Ю *8). Перенос фагом 139 строго определенного гена pur + с последующей лизогенизацией клеток позволяет заключить, что этот фаг осуществляет специфическую трансдукцию, в отличие от других холерных бактериофагов [Ogg J.E. et al., 1981; Кудрякова Т.А. с соавт., 1983; Ерошен-ко Г.А. с соавт., 1986; Boyd Е. F., Waldor М. К., 1999].

Такая важная роль умеренного фага 139 в изменчивости генома возбудителя холеры послужила основанием для изучения морфологических и генетических свойств умеренного фага 139, его распространенности среди штаммов 01 и 0139 се-рогрупп и его роли в вирулентности возбудителя холеры. Нами показано, что ДНК фага 139, находящаяся в фаговых частицах, выделяемых лизогенным штаммом 0139 серогруппы V.cholerae PI6064, является двунитевой и линейной и содержит cos сайт. Размер фаговой ДНК - 33,5 т.п.н., что составляет, примерно 1,3 % от размера хромосомы бенгальских штаммов [Majumder R. et al., 1996; Chatterjee S. et al., 1998]. Фаговая ДНК содержит сайты для нескольких изученных рестриктаз: Hindlll, PstI, EcoRV, Xbal и BamHl. Электронно-микроскопический анализ фага 139 показал, что фаговые частицы состоят из крупной гексагональной головки и хорошо выраженною покрытого сокращающимся чехлом хвостового отростка, что позволило отнести его к V морфологической группе по А.С. Тихоненко [1968].

Заслуживают внимания данные, свидетельствующие о широком распространении умеренного фага 139 среди различных бенгальских штаммов. Согласно полученным нами сведениям, из 22 проверенных бенгальских штаммов, выделенных в России, Индии и полученных из Франции, 15 штаммов или 68,18 % содержат в геноме фаг, причем профиль гибридизации фрагментов профага с фаговым зондом совпадает у всех изученных штаммов. Эти данные, а также результаты генетического картирования профага и нестабильность строго определенных генов у разных штаммов 0139 серогруппы служат доказательством наличия в хромосоме бенгальских штаммов предпочтительного сайта интеграции для 139 фага.

С помощью ДНК-ДНК гибридизации установлено, что фаг 139 также широко распространен в штаммах 01 серогруппы биовара эльтор. 46,9 % изученных нами штаммов этого биовара несли профаг, идентичный фагу 139. Хромосомные профили гибридизации профага у бенгальских штаммов и холерных вибрионов эльтор одинаковы. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что новый эпидемический штамм 0139 серогруппы мог произойти от вибрионов биовара эльтор. В то же время в геноме 50 % штаммов классического биовара содержится последовательность ДНК близкородственная фагу, но не имеющая полной гомологии с ним. Возможно, это последовательность дефектного каппа фага VcA2, присутствующего в хромосоме многих классических штаммов [Siddique K.A.I., Bhattacharyya F.K., 1987]. У вибрионов не 01 серогруппы фаг 139 встречается довольно редко: Лишь 8,5 % штаммов не 01 серогруппы давали положительный сигнал гибридизации с фаговым зондом.

Штаммы 01 серогруппы биовара эльтор, не содержащие фага 139, легко инфицируются им с образованием стабильных лизогенов. Штаммы классического биовара по литературным данным резистенты к этому фагу из-за присутствия в их геноме каппа-подобной последовательности, однако, данных подтверждающих это предположение явно недостаточно [Reidl J., Mekalanos J. J., 1995]. Проведенные нами эксперименты позволили установить, что все 16 изученных штаммов классического биовара были чувствительны к бактериофагу 139, несмотря на то, что многие из них содержали в геноме близкородственный каппа фаг. Но чувствительность таких штаммов была значительно ниже, чем у вибрионов, не содержащих эту последовательность

ДНК. По-видимому, клетки вибрионов серогруппы 01 могут быть инфицированы фагом 139 при спонтанной утрате каппа-подобного профага.

Нами были проведены исследования по изучению влияния фага 139 на продукцию у штаммов серогруппы 01 основного фактора вирулентности - ХТ. В результате этого впервые получены данные о возможном изменении уровня биосинтеза ХТ у традиционного возбудителя холеры при внедрении в его геном умеренного фага 139, выделенного из штамма возбудителя холеры 0139 серогруппы. Показано, что при ли-зогенизации фагом 139 штамма МАК757 серогруппы 01 биовара эльтор у 1% клеток наблюдается значительное повышение биосинтеза ХТ, которое в 30 раз превышает продукцию этого белка у нелизогенного штамма. Кроме того, лизогенные клетки штамма М757 с высокой продукцией токсина получают способность синтезировать этот фактор патогенности т \itro, в то время как исходный штамм М757, как и все штаммы биовара эльтор, в этих условиях его не образуют.

Изучение токсинопродукции у штаммов классического биовара, лизогенизиро-ванных бактериофагом 139, показало, что этот фаг может послужить причиной изменения уровня биосинтеза ХТ и у классических штаммов. При этом воздействие фага на продукцию ХТ неоднозначно. У лизогенного штамма 569В происходит повышение биосинтеза этого фактора патогенности в три раза. В отличие от штамма МАК757 биовара эльтор оно наблюдается у всех лизогенных клеток. У друго! о классическо1 о штамма - Дакка35, который является природным гиперпродуцентом ХТ, интеграция фага в хромосому приводит к практически полной потере способности у всех клеток образовывать ХТ, в то время как у изученных в нашей работе штаммов классического биовара - 145, 22 и 29 продукция ХТ остается на прежнем уровне. Все эти факты ставят вопрос о механизме воздействия фага 139 на токсигенность штаммов классического и эльтор биоваров. Наиболее рациональным объяснением наблюдаемых изменений является то, что интеграция фага 139 приводит к изменению либо структурных, либо регуляторных генов биосинтеза ХТ. Действительно, в ряде случаев у лизоген-ных штаммов с измененной продукцией ХТ (МАК757 и Дакка35) происходит изменение размеров фрагмента ДНК, несущего одну из копий генов с£хАВ, которое может быть вызвано либо перестройкой структурных генов токсиногенеза, либо генетического окружения этого региона. Однако у других штаммов (569В) повышение продукции ХТ не сопровождается структурными перестройками сгхАВ региона, и, по-видимому, они не могут быть главной причиной наблюдаемого явления у всех штаммов. Тот факт, что продукция ХТ повышается или понижается у лизогенов в несколько или даже в десятки раз, скорее свидетельствует в пользу изменения регуляторных механизмов токсиногенеза.

По нашим данным, у штаммов класссического биовара, лизогенных по фагу 139, происходит повышение уровня транскрипции основного регуляторного гена ЮхЯ. Это подтверждается значительным увеличением у лизогенов количества белка внешней мембраны Отри, биосинтез которого, как и ХТ, непосредственно регулируется белком ТохЯ. В то же время активность другого регуляторного гена /ох Г остается незатронутой, поскольку у лизогенных по фагу 139 классических штаммов, продукция ТКПА, которая контролируются белком ТохТ, сохраняется на исходном уровне.

У вибрионов биовара эльтор, изменения регуляторной системы носят иной характер. У них не отмечено увеличения уровня биосинтеза белка внешней мебраны Отри, а, следовательно, и повышения транскрипции гена ЮхЯ. Возможно, что увеличение образования ХТ у лизогенов биовара эльтор связано с более активной экспрессией гена toxT, которая может быть причиной возрастания продукции ХТ у штаммов биовара эльтор in vitro. Это происходит тогда, когда экспрессия гена toxT у вибрионов эльтор выходит из под контроля регуляторного белка ToxR [DiRita V.J. et al, 1996]. Таким образом, в основе повышения продукции ХТ у вибрионов биовара эльтор, лизогенных по фагу 139, может все же, в конечном счете, лежать изменение экспрессии белка ToxR и нарушение его влияния на ген toxT. Однако точный механизм изменения активности регуляторных генов toxR и toxT под действием фага 139 остается неизвестным и требует дальнейшего исследования.

Изменение продукции ХТ у штаммов серогруппы 01, лизогенных по фагу 139, может быть связано не только с генами toxR или toxT, но и другими регуляторными генами, роль которых в каскадном механизме регуляции экспрессии факторов вирулентности V.cholerae пока еще изучена недостаточно. Н.И. Смирновой с соавт.[1995] было показано, что в wb* области хромосомы штамма V.cholerae Дакка35 располагается ген tox-2, который является причиной повышенной продукции ХТ у штаммов классического биовара. Поскольку сайт интеграции фага 139 также располагается в непосредственной близости от этих генов, то вполне вероятно, что внедрение фага в хромосому у лизогенных клеток штамма V.cholerae Дакка35 приводит к нарушению структуры или функции регуляторного гена tox-2, что и вызывает резкое снижение продукции ХТ у лизогенного штамма Дакка35. Ввиду таких событий повышение активности регуляторного гена toxR, о котором можно судить по увеличению биосинтеза белка OmpU у этого лизогена, не обеспечивает усиления транскрипции генов ctxAB.

Таким образом, следует сделать важный вывод о том, что внедрение фага 139 в хромосому V.cholerae Ol может служить существенным фактором вариабельности патогенных свойств традиционного возбудителя холеры и, следовательно, изменения эпидемической опасности этих штаммов.

Нами также было проведено изучение присутствия фагов каппа в геноме авиру-лентных штаммов, выделенных из поверхностных водоемов в различных областях России. ДНК-ДНК-гибридизация по Саузерну показала, что ни один из них не содержал фага 139, что, по-видимому, является причиной отсутствия у них фенотипической изменчивости признаков, кодируемых генами, расположенными в области локализации фага. В частности, в популяции авирулентных штаммов 0139 серогруппы не обнаруживаются бескапсульные клетки, которые выявляются с высокой частотой у вирулентных штаммов.

Проведенное сравнение свойств вирулентных и авирулентных штаммов 0139 серогруппы установило существование значительных фенотипических и генетических различий между ними. Однако вопрос о родственных связях этих штаммов остается изученным не до конца, так же как остается неясным происхождение авирулентных 0139 вибрионов, выделяемых в различных областях Российской Федерации. Возможно, что они неродственны вирулентным У.ско1егае 0139 и ведут свое происхождение от природного вибриона, получившего 0139 антиген независимо от вирулентных штаммов |Тапщие Б.М. е/ а1., 2000; Бающие Б.М. е/ а1., 2003].

Для ответа на эти вопросы нами проведен анализ различных штаммов У.ско1егае 0139 с помощью методов молекулярного типирования, которые вносят значительный вклад в изучение родственных связей бактерий. Одним из наиболее эффективных методов молекулярного типирования является разновидность анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (Ш^Р) - риботипирование, в котором используются генетические зонды на гены рРНК. Нами разработана модификация метода риботипирования, доступная для отечественных исследователей, которая показала свою эффективность при генотипировании штаммов 0139 серогруппы, имеющих различное происхождение. С учетом особенностей генетической карты ггп оперонов У.скокгае нами рассчитаны праймеры на последовательности генов 168 и 23 Б рРНК и подобраны оптимальные условия проведения ПЦР. Полученные в ПЦР амплифика-ты использованы нами в качестве зондов для изучения генов рРНК у штаммов У.ско/егае. Показано, что применение зонда на 238 рРНК позволяет дифференцировать вирулентные штаммы 0139 серогруппы от авирулентных 0139 вибрионов и от холерных вибрионов 01 серогруппы классического биовара. Использование зонда на 16Б рРНК дает возможность также проводить дифференциацию среди вирулентных 0139 штаммов, выделенных на различных территориях. Установлено, что штаммы 0139 серогруппы, полученные в 1993 г. в Ростовской области, и штамм 1306 из Киргизии относятся к новому риботипу, не описанному в литературе и обозначенному нами как Я-1. На основе метода риботипирования показано также, что «водные» штаммы V. скокгае 0139 представляют собой обособленную группу вибрионов, значительно отличающуюся по структуре ггп оперонов от вирулентных вибрионов той же серогруппы.

Полученные результаты были подтверждены с помощью другого метода -однопраймерной ПЦР, показавшей свою эффективность при изучении различных бактерий [УазБаП О. е? а1., 1987; Булат С.А. с соавт., 1992; Мишанькин Б.Н. с соавт., 2000]. В результате проведенных исследований установлено, что ПЦР-типирование с помощью однопраймерной (случайной) ПЦР позволяет дифференцировать вирулентные штаммы 0139 серогруппы от вирулентных штаммов 01 серогруппы классического биовара, а также вирулентные штаммы 01 и 0139 серогрупп от авирулентных штаммов 0139 серогруппы. Использование этого метода подтвердило вывод, сделанный с помощью риботипирования, о том, что штаммы 0139 серогруппы клинического происхождения не имеют близкого родства со штаммами этой серогруппы, выделенными из воды. Учитывая показанные нами глубокие микробиологические, биохимические и генетические различия между вирулентными и авиру-лентными V. cholerae 0139, а также опираясь на результаты молекулярного типиро-вания этих штаммов, следует признать, что вирулентные и авирулентные вибрионы 0139 серогруппы представляют собой различные филогенетические линии холерных вибрионов. Наличие 0139 антигена у вирулентных и авирулентных штаммов является, на наш взгляд, случайным совпадением в независимой эволюции обеих групп вибрионов.

Несмотря на то, что авирулентные V. cholerae 0139 могут получать генетическую информацию от вирулентных холерных штаммов, уровень генетического обмена между ними, который мы наблюдали в эксперименте, невысок. К тому же маловероятным кажется факт одновременного получения авирулентными штаммами нескольких факторов вирулентности, кодируемых генами, расположенными в различных областях хромосомы. Поэтому штаммы V. cholerae 0139, выделяемые из водоемов в различных регионах Российской Федерации в настоящее время, не имеют эпидемического значения.

Таким образом, в данной работе создано новое научное направление в генетике патогенных вибрионов - изучение структуры и функций генома вирулентных и авирулентных штаммов V.cholerae новой 0139 серогруппы, имеющих различное происхождение.

Получены приоритетные данные о новом механизме образования штаммов У.сИокгае 0139 с измененной экспрессией ключевых генов вирулентности и анти-генности за счет участия в этих событиях профага 139. Выявлен и изучен новый механизм регуляции экспрессии генов холерного токсина у традиционных возбудителей холеры 01 серогруппы, обусловленный внедрением в их хромосому генома профага 139, который является характерным генетическим элементом У.сИокгае 0139.

Создана эффективная система молекулярного типирования штаммов V скокгае 0139 и 01, основанная на сочетании модифицированного метода риботи-пирования и ПЦР-типирования со случайными праймерами, использование которой позволит повысить эффективность проводимого эпидемиологического мониторинга штаммов холерных вибрионов, выделяемых из объектов окружающей среды. Ее применение выявило эволюционно сложившиеся различия между вирулентными и ави-рулентными штаммами У.сИокгае 0139 и подтвердило эпидемическую безопасность последних.

Перспектива работы в плане получения новых фундаментальных и прикладных научных знаний заключается в изучении динамики и направленности геномного полиморфизма клинических штаммов У.сИокгае 0139 с целью прогнозирования возможности образования эпидемически опасных патогенных вибрионов с новыми свойствами, затрудняющими диагностику и профилактику холеры, в выявлении ранее неизвестных генетических и фенотипических особенностей авирулентных и вирулентных вибрионов 0139 серогруппы, отражающих эволюционно сложившиеся различия между ними, определении роли различных профагов в негативном и позитивном контроле экспрессии генов патогенности, в совершенствовании молекулярно-эпидемиологического анализа патогенных вибрионов.

1. Клинические и выделенные из воды открытых водоемов на территории России штаммы V.cholerae 0139 отличаются друг от друга по способности к биосинтезу различных факторов патогенности и иммуногенности. Возбудитель холеры, в отличие от «водных» вибрионов, продуцирует маннозочувствительные гемагглютинирующие пили адгезии, белок внешней мембраны OmpU, имеет высокий уровень биосинтеза 0139 антигена, фосфолипазы, растворимой гемагглютинин/ протеазы, но не способен к эффективной продукции гемолизина. Сравниваемые штаммы характеризуются также разной чувствительностью к антибиотикам.

2. Выявлены принципиальные отличия в структуре геномов возбудителя хол-леры 0139 серогруппы и холерных вибрионов, выделенных из водных экосистем на территории России и стран СНГ. Вирулентность возбудителя холеры 0139 серогруппы связана с присутствием в их геноме МГЭ, содержащих гены патогенности, - дву\ профагов СТХ (ctx А, zot, асе) и RS 1 (rstC), острова патогенности VPI (tcpA, toxT), а также нуклеотидной последовательности attRS - сайта для внедрения фагов в хромосому. Авирулентность «водных» вибрионов обусловлена отсутствием указанных МГЭ. Гены toxR, rtxA, hapA, локализованные на основной части хромосомы, имеются у всех штаммов, что указывает на их участие в процессах жизнедеятельности клетки.

3. Впервые показано, что авирулентные холерные вибрионы 0139 серогруппы, могут приобретать в составе рекомбинантных плазмид структурные гены ctxAB. Их эффективная экспрессия приводит к продукции этими штаммами значительного количества секретируемого и биологически активного холерного токсина, но не может обеспечить развития инфекционного процесса у лабораторных животных из-за отсутствия в геноме других ключевых генов вирулентности.

5. Впервые установлено, что в геноме возбудителя холеры 0139 серогруппы вблизи гена cap, кодирующего продукцию нового поверхностного антигена - капсулы и картированного между маркерами риг и arg, локализован геном профага 139, а также гены вирулентности и персистенции mot и mshA, определяющие подвижность и продукцию маннозочувствительных гемагглютинирующих пилей адгезии. Присутствие указанных генов в одном участке хромосомы определяет его большую значимость для патогенности вибрионов и их выживания в неблагоприятных условиях внешней среды.

7. Умеренный фаг 139, содержащийся в геноме возбудителя холеры V.cholerae 0139 в виде профага, вызывает изменение его важных биологических свойств. Индукция профагом хромосомных перестроек в близлежащих к нему генах cap и mot приводит к образованию штаммов с пониженной вирулентностью и измененными антигенными свойствами.

8. Впервые выявлено участие профага 139 в регуляции генной активности у возбудителя холеры 01 серогруппы. Показано, что внедрение умеренного фага 139 в хромосому нового хозяина У.сИо1егае 01 приводит к изменению продукции ключевого фактора вирулентности - холерного токсина. Выявление нового механизма регуляции генной активности определяет возможность конструирования штаммов У.сИокгае 01 классического и эльтор биоваров с повышенной продукцией холерного токсина.

9. На основе ПЦР - и риботипирования показано, что возбудитель холеры V сИокгае 0139 и авирулентные вибрионы 0139 серогруппы представляют собой различные филогенетические линии эволюции холерных вибрионов, что в совокупности с данными о фенотипических и генетических различиях служит доказательством эпидемической безопасности вибрионов 0139 серогруппы, выделяемых в настоящее время из воды открытых водоемов на территории Российской Федерации.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Ерошенко, Галина Александровна, Саратов

1. Адамов А.К. Иммунология холеры Саратов: изд-во Сарат. ун-та, 1981.320 С.

2. Адамов А.К., Ломов Ю.М., Малеев В.В. с соавт. Холера в СССР в период VII пандемии / Под. ред. В.И. Покровского. М., 2000. - 472 С.

3. Адамов А. К., Наумшина М. С. Холерные вибрионы. Саратов, 1984. -328 С.

4. Андросова C.B., Быстрый Н.Ф., Хотько Н.И. Изучение влияния природных экологических факторов на микроорганизмы рода Vibrio в открытых водоемах // Микробиол., лаб. диагн. и специф. профилактика карантинных инфекций. Саратов, 1989. - С. 126-132.

5. Арутюнов Ю.И., Дрожевкина М.С., Черкасова Л.Р. с соавт. Характеристика холерных вибрионов, циркулировавших в VII пандемию на различных территориях // Журн. микробиол.- 1982. -N3. С.52-54.

6. Арутюнов Ю.И., Мишанькин Б.Н., Ломов Ю.М. Холера: цикличность эпидемических осложнений на континентах и их гелиообусловленность // Эпи-демиол. инф. болезней. 2002. - N 4.- С.8-11.

7. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях.—Л., 1962.

8. Балахонов С. В. Геномные маркеры возбудителя чумы, псевдотуберкулеза, холеры, бруцеллеза: Дис. д-ра мед. наук. Иркутск, 2000. - 263 с.

9. Балахонов C.B., Ганин B.C., Урбанович Л.Я. с соавт. Определение генных детерминант холерного энтеротоксина методом полимеразной цепной реакции // Журнал инфекционной патологии. 1998. - N 4. - С. 52-54.

10. Балахонов C.B., Ганин B.C., Урбанович Л.Я., с соавт. Сравнительное изучение различных методов определения токсигенности Vibrio cholerae // Молекул. генетика.- 1999.- N 1.- С.9-12.

11. Балахонов C.B., Миронова Л.В., Марамович A.C. с соавт. ПЦР-детекция маркеров эпидемической значимости штаммов Vibrio cholerae 0139, изолированных в Сибири // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. — 2001. N 2. - С.24-26.

12. Бароян О.В.// Холера Эль-Тор. М., «Медицина», 1971. - С.254.

13. Беляков В.Д., Марамович A.C., Каминский Г.Д. Гетерогенность и изменчивость популяций Vibrio cholerae eltor и их роль в развитии эпидемического процесса // Журн. микробиол. 1996. - N 2. - С. 91-97.

14. Бондаренко В. М., Мавзютов А. Р., Golkocheva Е. Секретируемые факторы патогенности энтеробактерий // Журн. микробиол. 2002. - N 1. - С. 84-90.

15. Булат С.А., Кабоев O.K., Мироненко P.M. с соавт. // Генетика. 1992 -Т.28, N 5. - С. 19-28.

16. Водопьянов С.О., Парамонов И.В., Сучков И.Ю. с соавт. Конструирование специфических праймеров для выявления гена toxR холерного вибриона // Биотехнология. 2001. - № 5. - С. 70-74.

17. Водопьянов С.О., Олейников И.П., Гончаров Е.К. с соавт. Вариабельный тандемный повтор Vea Vibrio cholerae // Мол. биология. — 2002. Т.36, N 6. — С.1074-1079

18. Воронежская Л.Г. Холерные вибрионы не 01 группы (биологическая характеристика): Автореф. дисс. в форме науч. доклада . докт. мед. наук. -Саратов, 1994. 65 с.

19. Ганин B.C., Урбанович Л.Я., Марамович A.C. с соавт. Vibrio cholerae 0139 («Бенгал») в Сибири // Матер, науч. конф. поев. 100-летию образования .противочумной службы России. — Саратов, 1997. Т.1.- С.30.

20. Гинцбург А.Л., Брюханов А.Ф., Янишевский Н.Б. с соавт. Применение метода генного зондирования для выявления эпидемически опасных штаммов холерных вибрионов. // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1987. -N 11.-С. 9-13.

21. Гинцбург А.Л., Грижебовский Г.М., Токарская A.C. с соавт. Изучение полиморфизма штаммов холерного вибриона различного происхождения // Генетика. 1989. - Т. XXV.-N 7. - С. 1320-1324.

22. Гинцбург А. Л., Янишевский Н. В., Мотин В. Л. с соавт. Организация и клонирование структурных генов энтеротоксина Vibrio cholerae eltor RV79// Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1984. - N 9. - С.12-18.

23. Гинцбург А. Л., Янишевский Н. В., Мотин В. Л. с соавт. Природа последовательностей RS1, фланкирующих ген vet, кодирующий синтез холерного токсина; у Vibrio cholerae eltor // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. — 1986. N 2. - С.11-19.

24. Гордеева Л.А., Седова А.Г., Ковтунова А.И. Эпидемиология НАГ-инфекций в Астраханской области // Тез. к обл. науч.-практ. конф. "Итоги и перспективы профилактики ООИ". Астрахань, 1989. - С. 43-44.

25. Давыдова Н. А. Конструирование тест-системы для выявления возбудителя холеры методом полимеразной цепной реакции: Дис. канд. биол. наук. -Саратов., 2001.- 159 с.

26. Домарадский И.В. Вирулентность бактерий как функция адаптации // Журн. микробиол. 1997. - Т. 149. - С. 31-35.

27. Дунаев Г.С., Зыкин Л.Ф. НАГ-инфекция самостоятельная нозологическая единица // Особо опасные и редко встречающиеся тропические инфекции. -Волгоград, 1980. - С.28-29.

28. Ермольева З.В., Краснова И.Н., Ведышина Е.А. Неагглютинирующиеся вибрионы у людей с кишечными заболеваниями // Актуальные вопросы микробиологии. Москва, 1970. - С. 64-65.

29. Ерошенко Г. А. Получение ауксотрофных мутантов холерного вибриона методом индуцированного мутагенеза. — В кн.: Молекул, биол. и генетика особо опасных инф., Саратов, 1982. ч. I. - С. 23-27.

30. Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И., Остроумова Н.М. Трансдукция холерного вибриона // Молекул, биол. и микробиол. природно-очаговых инф. Саратов, 1986.-С. 116-121.

31. Ильина Т.С. Структурная организация и механизмы перемещения генных кассет, кодирующих резистентность к антибиотикам и факторы вирулентности бактерий // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 2001. - N 1. - С. 3-12.

32. Ильина Т.С., Романова Ю.М. Геномные острова бактерий: организация, функции, роль в эволюции // Молекул, биол. 2002. - Т. 36, N 2. - С.228-239.

33. Инструкция по контролю специфической стерильности экспериментальных препаратов, приготовленных из культур чумного и холерного микробов. Утверждено ГУКИ МЗ СССР. Москва. 1982 г.

34. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. I. Общая характеристика липополисахаридов и структура липида А (обзор) // Биохимия. 1993. - Т. 58, Вып.2. - С. 166-181.

35. Король В. В., Смоликова JI. М., Гофман Е. JI. Изучение взаимосвязи некоторых признаков вирулентности возбудителя холеры // В кн.: Тез. докл., предст. на науч.-практ. конф. по актуал. вопр. пробл. «Холера». Ростов-на-Дону., 1984.-С. 54-56.

36. Кудрякова Т.А., Дрожжевкина М.С., Богданова М.И. // Трансдуцирующая активность бактериофагов холерных вибрионов // В кн: Актуал. вопр. имму-нол., аллергол.и мол. биол. Краснодар, 1983. -235.

37. Кудрякова Т.А., Мишанькин Б.Н., Македонова Л.П. Филаментозные бактериофаги холерных вибрионов 0139 серогруппы «Бенгал» // «Актуальные вопросы особо опасных инфекций». Матер, региональной науч.-пракг. конф. Нальчик, 2000. С. 61-62

38. Кудрякова Т. А., Черкасова Л.П. Трансдуцирующие фаги холерных вибрионов эльтор // Изд. Сев. -Кавказ, науч. центра высш. школы естеств. наук. -1987. -N.1 С.97-100.

39. Лабораторная диагностика холеры // Методические указания МУ 4.2. -2002. Москва, 2002.

40. Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Пушкарева В.И. и др. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий // Под. ред. C.B. Прозоровского. М., 1998. -256 с.

41. Литвин Л.Ю. , Марамович А.С., Гинцбург А.Л. Стратегия адаптивной изменчивости холерных вибрионов в природных водоемах // Вестник РАМН. — 2001.-N 11.-2001.

42. Ломов Ю. М., Мазрухо Б. Л., Мишанькин Б. Н. с соавт. Случай завоза на территорию России холеры, вызванной новым сероваром // Журн. микробиол. 1995. - N 2. - С. 97-101.

43. Мавзютов А.Р., Фиалкина C.B., Бондаренко В.М. «Острова» патогенности условно-патогенных энтеробактерий // Журн. Микробиол. 2002. -N 6. — С.5-9

44. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.-480 с.

45. Марамович A.C., Пинигин А.Ф. Эндемичные очаги холеры в Африке // ЖМЭИ- 1995.-N2.-C.101-107

46. Миллер Д. Эксперименты в молекулярной генетике // М., 1976. 396 с.

47. Мишанькин Б. Н., Романова Л. В., Ломов Ю. М. с соавт. Vibrio cholerae 0139, выделенные от людей и из воды открытых водоемов: сравнительное генотипирование // Журн. микробиол. 2000. - N 3. - С. 3-7.

48. Момыналиев К.Т., Говорун В.М. Перспективы применения методов ДНК-диагностики в лабораторной службе // Клин. лаб. диагностика. 2000. - N 5.- С.1-26

49. Монахова Е.В., Михась Н.К., Смоликова A.M., Мишанькин Б.Н. Изучение генетических детерминант токсинов кассеты вирулентности и нейраминида-зы холерных вибрионов с помощью молекулярного зондирования // Журн. микробиол. 2001. - N 2. - С. 25-29.

50. Монахова Е.В., Михась Н.К., Мазрухо Б.Л. Изменчивость СТХ элемента, интегрированного в геном некоторых токсигенных штаммов холерных вибрионов Бенгал // Проблемы особо опасных инф. - 2003. -Вып.85. -С.90-96.

51. Мотин В.JI. Структурная организация хромосомы холерных вибрионов в области токсинообразования: конструирование вектора для создания живой вакцины: Автреф. дис. канд. биол. наук. М., 1988. — 22 с.

52. Омарова Б.К., Давыдова Н.А., Куличенко А.Н. с соавт. Мультиплексная полимеразная цепная реакция для обнаружения и биотипирования токсиген-ных штаммов Vibrio cholerae // Тез. докл. 3-й Всерос. науч.-практ. конф. -М., 2000. С. 304-307

53. Онищенко Г.Г. Актуальные проблемы холеры М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2000.-384 с.

54. Онищенко Г.Г., Ганин В.С., Голубинский Е.П. Вибрионы не 01 серологической группы и их значение в патологии человека // М. 2001. - 348 с.

55. Онищенко Г.Г., Глухов А.И., Грачев Е.С. с соавт. Анализ ДНК штаммов V. cholerae методом полимеразной цепной реакции // Журн. микробиол. 1996. - № 4. - С. 38-41.

56. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Покровский В.И. с соавт. // Актуальные проблемы холеры. // Под ред. Покровского В.И. М. - 2000. - С.384.

57. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Мишанькин Б.Н. с соавт. Характеристика холерных вибрионов эльтор, выделенных в г.Казань, в 2001 г. //Журн. микробиол. 2002. - N 2. - С.3-6.

58. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Мазрухо Б.Л. с соавт. Характеристика культур холерных вибрионов 01, изолированных из объектов окружающей среды на территории Российской Федерации в 2002 г. // Журн. микробиол. — 2004. -N 2. -С.3-7.

59. Остерман JI. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука, 1981. - 288 с.

60. Остроумова Н.М. Роль умеренных холерных фагов в популяционной изменчивости холерного вибриона // Проблемы особо опасных инф.-1993. -N 3.(73)-С.114-126.

61. Остроумова Н.М., Мороз В.П., Синичкина H.A. с соавт. Лизогенные системы и свойства умеренных фагов Vibrio cholerae 0139 серовара // Проблемы особо опасных инф. Саратов, 1998. — С. 141-147.

62. Парамонов И.В., Вахнов Е.Ю., Воробьев A.A. Обнаружение и идентификация холерных вибрионов с использованием полимеразной цепной реакции // Проблемы особо опасн. инф. Саратов, 1999. - N 79. - С. 95-102.

63. Писанов P.B. Zot и Асе дополнительные токсины, входящие в состав кассеты вирулентности холерных вибрионов // Проблемы особо опасн. инф. — Саратов, 2002. - С. 15-21

64. Подосинникова Л.С., Ломов Ю.М., Власов В.В.с соавт. Молекулярное зондирование холерного вибриона с целью эпидемиологического анализа // Вестник Всесоюзного микробиол. общества. Ростов-на-Дону, 1989. -Вып.1-С. 35-38.

65. Подосинникова JI. С. Холерные вибрионы, выделенные на территории СССР в период седьмой пандемии: Автореф. дис. д-ра мед. наук. — Саратов, 1993.-44 с.

66. Развых В.М. Биологические свойства НАГ-вибрионов и особенности их циркуляции: Автореф. дис. уч. ст. канд. мед. наук. Москва, 1984. - 22 с.

67. Ривкус Ю. 3., Зайцева Т. С., Кочеровская Е. Ю. с соавт. Способность лизи-ровать эритроциты человека как фактор патогенности Vibrio cholerae // Журн. микробиол. 1999. - N 6. - С. 86-87.

68. Романова Ю. М., Гинцбург А. Л. Участие мобильных элементов в формировании свойств патогенных бактерий // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. М., 1999. - N 2. - С. 22-29.

69. Романова Ю.М., Ильина Т.С., Гинцбург А.Л. Мобильные генетические элементы и их роль в эволюции патогенных бактерий // Вестн. РАМН. -2001. N И. - С.15-20

70. Савельев В.Н. Холера эльтор (эпидемические и микробиологические аспекты): Автореф. дисс. . док. мед. наук. Ставрополь, 1998. - 48 с.

71. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)». Москва. 2003.

72. Семиотрочев В. JI. Энтеропатогенные свойства штаммов холерных вибрионов, продуцирующих гемолизин I типа подтипа Р // Тез. докл. Всесоюз. науч. конф. «Актуальные вопр. микробиол., лаб. диагн. и профилакт. холеры». Ростов-на-Дону, 1988.-С. 119-120.

73. Середин В.Г., Мухамедов С.М., Инжеватова М.В. К вопросу о роли холерных вибрионов не 01 группы (НАГ-вибрионов) в экологической структуре острых кишечных инфекций в Узбекистане // Тез. Всесоюз. науч. конф. Ростов-на-Дону, 1988. С. 276-279.

74. Смирнова Н.И. Адгезины Vibrio cholerae: фенотипический анализ и генетический контроль синтеза // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. -1995.-N3.-С. 18-26.

75. Смирнова Н.И. Генетический контроль патогенности Vibrio cholerae: умеренный нитевидный фаг СТХ, кодирующий холерный токсин и остров патогенности // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1999. - N 4. - С. 1-15.

76. Смирнова Н.И. Возбудитель холеры новой 0139 серогруппы: молекуляр-но-генетические особенности и происхождение // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 2002. - N 3. - С.23-33

77. Смирнова H. И., Ильина Т. С, Ливанова Л. Ф., Смирнов Г. Б. Генетический анализ мутаций, влияющий на синтез соматического О-антигена у холерного вибриона // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1985. - N 10.-С. 3-8.

78. Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Генодиагностика и молекулярное типиро-вание возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 2003.-N 1. - С.6-14.

79. Смирнова Н.И., Чеховская Г.В., Давыдова Н.И. Фенотипический анализ двух морфологически разных типов колоний Vibrio cholerae 0319 // Мол. генетика, микробиол. и вирус. 1995. -N 3. - С. 30-34.

80. Смирнова Н.И., Шопырева С.Ф., Ливанова Л.Ф., Журавлева Е.А. Возникновение токсигенных штаммов Vibrio cholerae не-Ol серогруппы в результате обмена генетической информацией // Генетика 1996. - Т. 32, N 6. -С.744-749

81. Соловьев В.Д., Кобринский Г.Д., Гальцева Г.В. с соавт. О роли нейрами-нидазы холерных вибрионов в патогенезе экспериментальной холеры // Журн. микробиол.- 1976.-N 5.-С.94-95.

82. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследований Под ред. М. О. Бригера. — 3-е изд., перераб. и доп. М.: Медицина, 1982.-462 с.

83. Тихоненко A.C. Ультраструктура вирусов бактерий. -Москва, 1968.170 С.

84. Ткаченко B.B. Липополисахариды холерного вибриона и некоторых эн-теробактерии // Журн. микробиол. 1982. - N 2. - С. 20-28.

85. Топорков A.B., Заднова С.П., Смирнова Н.И. Генетический контроль регуляции экспрессии основных генов патогенности у возбудителя холеры // Проблемы особо опасн. инф. Саратов, 2003. - N 85 - С. 113-121

86. Федоров Ю.М., Кокушкин A.M., Омариева Э.Я. с соавт. Особенности эпидемиологии холеры на современном этапе седьмой пандемии // Проблемы особо опасн. инф. Саратов, 2000. - Вып.80 . - С. 29 -35.

87. Федорова В.А., Девдариани З.Л., Громова О.В., Ливанова Л.Ф. Некоторые иммунохимические и иммунологические свойства капсульного антигена V.cholerae 0139 серовара // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. -1997.-N3.-С. 12-20.

88. Челдышева Н. Б. Дифференциация штаммов Vibrio cholerae 01 с различной эпидемической значимостью на основании четырех генов вирулентности: ctxA, tcpA, toxR и hapA: Дис. канд. мед. наук. Саратов, 2002. - 173 с.

89. Чеховская Г. В., Смирнова Н. И. Создание и свойства штаммов Vibrio cholerae серовара 0139 с повышенной продукцией холерного токсина // Генетика. 1994. - Т. 30. - С. 177-178.

90. Чеховская Г. В. Генетический анализ области Vibrio cholerae 0139, содержащий гены О-антигена: Автореф. дис. канд. мед. наук. Саратов, 1997.-44 С.

91. Шагинян И.А. Роль и место молекулярно-генетических методов в эпидемиологическом анализе внутрибольничных инфекций // Клин, микробиол. и антимикроб, терапия. 2000. - Т.2 , N3. - С.82-95.

92. Шагинян И.А., Гинцбург A.JI. ПЦР — генетическое типирование патогенных микроорганизмов // Генетика. 1995. - Т.31 , N 5. - С.600-610.

93. Шагинян Б.М., Маракуша Б.И. Модификация метода пассивного иммунного гемолиза на плотной среде для выявления продукции термостабильных энтеротоксинов штаммами холерных вибрионов и кишечной палочки // Журн. микробиол. 1983. - N 7. - С. 92-96.

94. Шагинян И.А. , Першина М.Ю. Генетические маркеры в эпидемиологии бактериальных инфекций // Журн. микробиол. -1997. -N 4. С.54-59.

95. Шопырева С. Ф. Vibrio cholerae не 01/не 0139: генетическое картирование хромосомы и изучение возможности обмена генами О-антигена между холерными вибрионами разных серогрупп: Дис. канд. биол. наук. Саратов., 2000. - 173 с.

96. Щелканова Е.Ю., Заднова С.П., Коннов Н.П., Смирнова Н.И. Методические рекомендации по идентификации капсульных и бескапсульных штаммов Vibrio cholerae 0139 серогруппы при помощи холерных бактериофагов «20» и «Инаба». Саратов, 1998. - 6 с.

97. Щелканова Е.Ю., Смирнова Н.И. Новые гены Vibrio cholerae 0139 и их роль в патогенности // Пробл. особо опасных инф. Саратов, 1998. - С.31-37.

98. Щелканова Е. Ю., Чеховская Г. В., Смирнова Н. И. Бескапсульные мутанты Vibrio cholerae 0139 серогруппы: получение, идентификация и использование для изготовления диагностической 0139 антисыворотки // Журн. микробиол. 2000. - N 1. - С. 34-37.

99. Яговкин Э.А. Иммунохимические и биологические свойства липополиса-харидов холерного вибриона эльтор: Автореф. дис. ст. канд. мед. наук. -Саратов, 1982.-С.20.

100. Янишевский Н.В., Гинцбург A.JL, Вертиев Ю.В. с соавт. Конструирование рекомбинантных плазмид, кодирующих биосинтез В-субъединицы холерного токсина// Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1987. - N 4. -С.26-32.

101. Adelberg E.A., Mandel M., Chen G.G. Optimal condition for mutagenesis by N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine in Escherichia coli K12 // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1965. - Vol. 18, N 5. - 6. - P.788-795.

102. Albert M. Epidemiology & molecular biology of Vibrio cholerae 0139 Bengal // Indian J. Med. Res. 1996. - Vol. 104. - P. 14-27.

103. Albert M. J., Anzaruzzaman M., Bardan P. K. Large epidemic of cholera-like desease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal // Lancet. 1993. - Vol. 342. - P. 387-390

104. Albert M. J., Bhuiyan N. A., Talukder K. A. et al. Phenotypic and genotypic changes in Vibrio cholerae 0139 Bengal // J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35. -P. 2588-2592.

105. Albert M. J., Qadri F., Bhuiyan N. A. et al. Phagocytosis of Vibrio cholerae 0139 Bengal by human polymorphonuclear leukocytes // Clin, and Diagn. Lab. Immun. 1999. - Vol. 6. - P. 276-278.

106. Albert M. J., Siddique A. K., Islam M. S. Large outbreak of clinical cholera due to Vibrio cholerae non-01 in Bangladesh // Lancet. 1993. - Vol. 341. -P.704.

107. Amita, Chowdhury S.R., Thungapathra M. et al. // Class I integrons and SXI elements in El tor strains isolated before and after 1992 Vibrio cholerae 0139outbreak, Calcutta, India // Emerging Infect. Dis. 2003. - Vol.9 - N 4. - P.500-502

108. Arakawa E., Murase Т., Matsushita S. et al. Pulsed-field gel electrophoresis-based molecular comparison of Vibrio cholerae 01 isolates from domestic and imported cases of cholera in Japan // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - P. 424-426.

109. Attridge S. R., Rowley D. The role of the flagellum in the adherence of Vibrio cholerae // J. Infect. Dis. 1983. - Vol. 147. - P864-872.

110. Attridge S.R., Manning P.A., Holmogren J., Jonson G. Relative significance of mannose-sensitive hemagglutinin and toxin-coregulated pili in colonization of infant mice by Vibrio cholerae El Tor// Infect.Immun. 1996. - Vol.64., N 1. — P.3369-3373

111. Attridge S. R., Qadri F., Albert M. J., Manning P. A. Susceptibility of Vibrio cholerae 0139 to antibody-dependent, complement-mediated bacteriolysis // Clin, and Diagn. Lab. Immun. 2000. - V. 7. - P. 444-450.

112. Bandry В., Fasano A., Ketly J. Cloning of a gene (zot) encoding a new toxin produced by Vibrio cholerae // Inf. Immun. 1992. - Vol. 60 - P. 428 - 434

113. Barua D. History of cholera. In: Cholera (Barua D. and Greenough III, W.B., Eds.), 1991. P. 1-35. Plenum. New York.

114. Basu A., Garg P., Datta S., et al. Vibrio cholerae 0139 in Calcutta, 19921998: incidence, antibiograms, and genotypes // Emerging Infect, diseas. 2000. - Vol.6. - N2 - P.139-147.

115. Basu, A., Mukhopadhyay A. K., Garg P. et al. Diversity in the arrangement of the CTX prophages in classical strains of Vibrio cholerae 01 // FEMS Microbiol. Lett. 2000. - Vol.182. - P. 35-40.

116. Behari J., Stagon L., Calderwood S. B. pepA, a gene mediating pH regulation of virulence genes in Vibrio cholerae // J. Bacteriol. 2001. - Vol. 183. - P. 178188.

117. Beltran P., Delgado G., Navarro A. et al. Genetic diversity and population structure of Vibrio cholerae // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37. - P. 581-590.

118. Berche P., Poyart C., Adachin E. et al. The novel epidemic strain Ol39 is closely related to the pandemic stran Ol of Vibrio cholerae // J. Infect. Dis. -1994.-Vol. 170.-701-704

119. Bhadra R. K., Roychoudhury S., Banerjee R. K. et al. Cholera toxin (CTX) genetic element in Vibrio cholera 0139 // Microbiology. 1995. -Vol. 141. - P. 1977-1983.

120. Benitez J.J., Silva A, Finkelstein A. Environvental signals controlling production of hemagglutinin/protease in Vibrio cholerae. // Infect. Immun. -2001. Vol. 69, N10. - P. 6549-6553.

121. Bhaskaran K., Rouley D., Nutritional studies on Vibrio cholerae // Gen. Microbiol. 1956. - V.15, N 2. - P.417-422.

122. Bhaskaran K. Genetic recombination in Vibrio cholerae // Ind. J. Med. Res.-1974. Vol.62, N 6. - P.807-819

123. Bik E. M., Bunschoten A. E., Gouwn R.D. Genesis of the novel 8 epidemic Vibrio cholerae 0139 strain: evidence for horizontal transfer of genes involved in polysaccharide syntesis // EMBO. 1995. - Vol.14, N 2. - P.209-216.

124. Bik E.M., Gouw R.D., Mooi P.R. DNA fingerprinting of Vibrio cholerae strains with a novel insertion sequence elements: a tool to identify epidemic strains // Clin. Microbiol. 1996. - Vol.34, N6. - P. 1453-1461.

125. Bina J.E., Mekalanos J.J. Vibrio cholerae tolC is required for bile resistance and colonization // Infect. Immun. 2001. - Vol. 69, N 7. - P. 4681-4685.

126. Bomchil N., Watnick P., Kolter R. Identification and characterization of a Vibrio cholerae gene mbaA, involved in maintenance of biofilm architecture // J. Bacteriol. 2003. - Vol.185 -N4 - P.1384-1390

127. Booth B.A., Boesman-Finkelstein M., Finkelstein R.A. Vibrio cholerae soluble hemagglutinin/protease is a metalloenzyme.// Infect. Immun. 1983. - Vol. 42. -639-644.

128. Booth B.A., Boesman-Finkelstein M., Finkelstein R.A. Vibrio cholerae hemagglutinin/protease nicks cholera enterotoxin // Infect. Immun. 1984. - Vol. 45. - 558-560.

129. Booth B. A., Finkelstein R. A. Presence of hemagglutinin/protease and other potential virulence factors in Ol and non-01 Vibrio cholerae. // Journal of Infectious Diseases. 1986.-Vol. 154, № 1.-P.183-186.

130. Boyd E. F., Waldor M. K. Alternative mechanism of cholera toxin acquisition by Vibrio cholerae: generalized transduction of CTXcp by bacteriophage CP-T1 // Infect. Immun. 1999. - Vol. 67. - P. 5898-5905.

131. Boyd E. F., Heilpern A. J., Waldor M. K. Molecular analysis of a putative CTXcp precursor and evidence for independent acquisition of distinct CTXcps by toxigenic Vibrio cholerae // J. Bacteriol. 2000. - Vol. 182. - P. 5530-5538.

132. Boyd E. F., Waldor M. K. Evolutionary and functional analyses of variants of the toxin-coregulated pilus protein TcpA from toxigenic Vibrio cholerae non-01/non-0139 serogroup isolates // Microbiology. 2002. - Vol. 148. - P. 16551666

133. Bradley D.E., Taylor D.E., Cohen D.R. Specification of surface mating system among conjugative drug resistance plasmids in Escherichia coli K12 // Bacteriol. -1980. Vol.143, N 3. - P. 1466-1470.

134. Bredly D.K. Ultrastructure of bacteriophages and bactericins // Bacteriol. Rev.- 1967.- Vol.31, N 4. P. 230 - 234.

135. Broady K.W., Rietschel E., Luderitz O. The chemical structure of the lipid A component of lypopolysaccharides from Vibrio cholerae // Biochem. 1981. -Vol.115.-P. 463-468.

136. Brown M.H., Manning P.A. Haemolysin genes of Vibrio eholerae: presence of homologous DNA in non-haemolytic 01 and haemolytic non-Ol strains // FEMS Microbiol. Lett. -1985. -Vol.30, N 1-2.- P. 197-201.

137. Brown R.C., Taylor R.K. Organization of tcp, acf, and toxT genes within a ToxT- dependent operon // Mol. Microbiol. 1995. - Vol. 16. - P. 425-439.

138. Byun R., Elbourne L. D., Lan R., Reeves P. R. Evolutionary relationships of pathogenic clones of Vibrio eholerae by sequence analysis of four housekeeping genes // Infect. Immun. 1999. - Vol. 67. - P. 1116-1124.

139. Calia K.E., Murtagh M., Ferraro M.J., Calderwood S.B. Comparison of Vibrio eholerae 0139 with V.cholerae 01 classical and El Tor biotypes // Infect. Immun. 1994. - Vol.62. -P.1504-1506.

140. Campos J., Fando R., Silva A. et al. Replication function of the RSI element associated with Vibrio eholerae CTXcJ) prophage // FEMS Microriol. Lett. 1998. -Vol. 164.-P. 141-147.

141. Campos J., Martinez E., Suzarte E. et al. VGJ(}), a novel filamentous phage of Vibrio eholerae, integrates into the same chromosomal site as CTXcJ) // J.Bacterid. 2003. - Vol.185. - P.5685-5696.

142. Carniel E., Guilvout I., Prentice M. Characterization of a large chromosomal "high-pathogenicity island" in biotype IB Yersinia enterocolitica // J. Bacteriol.1996. Vol.178, N23. - P.6743-6751.

143. Carroll P.A., Tashima K.T., Rogers M.B. et al. Phase variation in tcpH modulates expression of the ToxR regulon in Vibrio eholerae // Mol. Microbiol.1997.-Vol. 26.-P. 1099-1111.

144. Chakraborty S., MukhopadhyaY A. K., Bhadra R. K. et al. Virulence genes in environmental strains of Vibrio cholerae // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66.-P. 4022-4028.

145. Champion G.A., Neely M.N., Brennan M.A., DiRita V.J. A branch in the regulatory cascade of Vibrio cholerae revealed by characterization of toxT mutant strains // Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 23. - P. 323-331.

146. Chattopadhyaya R., Ghose A.C. Model of Vibrio cholerae toxin coregulated pilin capable of filament formation // Protein. Eng. 2002. - Vol. 15, № 4. - P. 297-304.

147. Chiang S.L., Mekalanos J.J. Use of signature tagged transposon mutagenesis to identify Vibrio cholerae genes critical for colonization // Mol. Microbiol. — 1998.-Vol. 27.-P. 797-806

148. Chiang S.L., Tailor R.K., Koomey M., Mekalanos J.J. Single amino acid substitutions in the N-terminus of Vibrio cholerae TcpA affect colonization, autoagglutination, and serum resistance // Mol. Microbiol. 1995. - Vol. 17. - P. 1133-1142.

149. Chiavelli D.A., Marsh J.W., Tailor R.K. The mannose-sensitive hemagglutinin of Vibrio cholerae promotes adherence to Zooplankton // Appl. Environ. Microbiol. -2001. -Vol.67. -P.3220-3225.

150. Chithis D.S., Sharma K.D., Kamat R.S. Role of somatic antigen of Vibrio cholerae in adhesion to intestinal mucosa // Med. Microbiol. 1982. - Vol.15, N 1. -P. 53-61.

151. Cholera Working Group. International center for diarrhea disease research, Bangladesh. Large epidemic of cholera-like disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal // Lancet. 1993. - Vol.342. - P. 387-390.

152. Chongsa-Nguen M., Chalcumpa W., Moolasart P. et al. Vibrio cholerae 0139 Bengal in Bangkok // Lancet. 1993. - Vol. 341. - P. 1347.

153. Chun J., Huq A., Colwell R.R. Analysis of 16S-23S rRNA intergenic spacer regions of Vibrio cholerae and Vibrio mimicus // Appl. Environ. Microbiol. -1999. Vol.65 - N5 - P.2202-2208

154. Codeco C.T. Endemic and epidemic dynamics of cholera: the role of the aquatic reservoir // BMC Infect. Dis. 2001. - P. 13.

155. Coelho A., Andrade J. R. C., Vicente A.C.P., DiRita V.J. Cytotoxic cell vacuolating activity from Vibrio cholerae hemolysin // Infect. Immun. 2000. -Vol.68.-N. 3.-P. 1700-1705

156. Comstock L. E., Maneval D., Paningrahi P. The capsule and O-antigen in Vibrio cholerae 0139 Bengal are associated with a genetic region not present in Vibrio cholerae 01 // Infect. Immun. 1995. - Vol.63, N 1. - P. 317-323.

157. Cotter P.A., DiRita V.J., Bacterial virulence gene regulation: an evolutionary perspective // Annu. Rev. Microbiol. 2000. - Vol. 54. - P. 519-565.

158. Craig J.P. A permeability factor (toxin) found in choler stools and culture filtrates and its neutralization by convalescent cholera sera // Nature. 1965. -Vol. 207, N 4997.-P. 614-616.

159. Crawford J. A., Kaper J. B., DiRita V. J. Analysis of ToxR dependent transcription activation of ompU, the gene encoding a major envelope protein in Vibrio cholerae // Mol. Microbiol. 1998. - Vol. 29. - P. 235-246.

160. Crawford J.A., Krukonis E.S., DiRita V.J. Membrane localization of the ToxR winged-helix domain is required for TcpP-mediated virulence gene activation in Vibrio cholerae // Mol. Microbiol. 2003. - Vol.47 - N5 - P. 1459-1473

161. Dalsgaard A., Echeverria P., Larsen J. L. et al. Application of ribotyping for differentiating Vibrio cholerae non-Ol isolates from shrimp farms in Thailand // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - Vol. 61. - P. 245-251.

162. Dalsgaard A., Serichantalergs O., Forslund A., et al. Clinical and environment isolates of Vibrio cholerae serogroup 0141 carry the CTX phage and genes encoding the toxin-coregulated pili // J. Clinical. Microbiology. 2001. - Vol. 39. -P. 4086-4092.

163. Davis B.M., Kimsey H. H., Chang W., Waldor M. K. The Vibrio cholerae 0139 Calcutta CTXcp is infectious and encodes a novel repressor // J Bacteriol. -1999.-Vol. 181.-P. 6779-6787.

164. Davis B.M., Moyer K.E., Boyd E.F., Waldor M.K. CTX Prophages in classical biotype Vibrio eholerae: functional phage genes but dysfunctional phage genomes // J. Bacteriol. 2000. - Vol. 182. - P. 6992-6998.

165. Davis B.M., Waldor M.K. Filamentous phages linked to virulence of Vibrio eholerae // Curr. Opinion in Microbiol. 2003. - Vol.6 - P. 1-8.

166. Dhar R., Mahbool A., Thafoor A. Unusual non-serogroup 01 Vibrio eholerae bacteremia associated with liver disease // Clin. Microbiol. 1989. - Vol.63. - P. 2853-2855.

167. DiRita V.J. Co-ordinate expression of virulence genes by ToxR in Vibrio eholerae. //Mol. Microbiol. 1992. - Vol. 6. - P. 451-458.

168. DiRita V. J., Parsot C., Jander G., Mekalanos J. J. Regulatory cascade controls virulence in Vibrio eholerae // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991. Vol. 88. - P. 5403-5407.

169. DiRita V.J., Mekalanos J.J. Periplasmic interaction between two membrane regulatory proteins, ToxR and ToxS, results in signal transduction and transcriptional activation // Cell. 1991. - Vol. 64. - P. 29-37.

170. Donlan R.M. Biofilms: microbial life on surfaces // Emerging Infect. Dis. -2002. Vol.8 - N9 - P.881 -890

171. Dumontier, S., Berche P. Vibrio cholerae 022 might be a putative source of exogenous DNA resulting in the emergence of the new strain of Vibrio cholerae 0139 //FEMS Microbiol. Lett. 1998.-Vol. 164.-P. 91-98.

172. Dutta N.K., Habbu M.K. Experimental choler in infant rabbits: a method for chemotherapeutic investigation // Brit. J. Pharmocol. 1955. - Vol. 10, N 2. - P. 1898-1899.

173. Dziejman M., Mekalanos J.J. Analyses of membrane protein interaction: ToxR can dimerize the amino terminus of phage lambda repressor. // Mol. Microbiol. -1994.-Vol. 13.-P. 485-494.

174. Dziejman M., Kolmar H., Fritz H.J., Mekalanos J.J. ToxR cooperative interactions are not modulated by environmental conditions or periplasmic domain confarmation (In process citation) // Mol. Microbiol. 1999. - Vol. 31. - P. 305317.

175. Dziejman M., Balon E., Boyd D. et al. Comparative genomic analysis of Vibrio cholerae: gene that correlate with cholera endemic and pandemic disease // PNAS. 2002. - Vol. 99. - 1556-1561.

176. Ehara M., Ishibashi M., Ishinose Y. et al. Purification and partial characterization of fimbriae of Vibrio cholerae Ol // Vaccine. 1987. - Vol.5. -P.283-288.

177. Eko F.O., Mayr U.B., Attridge S.R., Lubitz W. Characterization and immuno-genicity of Vibrio cholerae ghosts expressing toxin-coregulated pili // J. Biotechnology. 2000. - Vol.83. - P. 115-123.

178. Faast R., Ogierman M.A., Stroeher U.H., Manning P.A. Nucleotide sequence of the structural gene tcpA for a major pilin subunit in Vibrio cholerae // Gene. -1989.-Vol. 85.-P. 229-233.

179. Farfan M., Minana-Galbis D., Fuste M. C., Loren J. G. Allelic diversity and population structure in Vibrio cholerae 0139 Bengal based on nucleotide sequence analysis // J. Bacteriol. 2002. - Vol. 184. - P. 1304-1313.

180. Faruque S. M., Albert M., Mekalanos J.J. Epidemiology, genetics, and ecology of toxigenic Vibrio cholerae. // Microbiol, and Molecul. Rev. 1998. - Vol.62. -P. 1301-1314.

181. Faruque S. M., Asadulghani, Alim A. R., et al. Induction of the lysogenic phage encoding cholera toxin in naturally occurring strains of toxigenic Vibrio cholerae Ol and 0139 // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66. - P. 3752-3757.

182. Faruque S. M., Asadulghani, Kamruzzaman M. RSI element of Vibrio cholerae can propagate horizontally as a filamentous phage exploiting the morphogenesis genes of CTX(p // Infect. Immun. 2002. - Vol. 70, - P. 163-170.

183. Faruque S. M., Asadulghani, Rahman M. .M. et al. Sunlight-induced propagation of the lysogenic phage encoding cholera toxin // Infect. Immun. -2000. Vol. 68. - P. 4795-4801.

184. Faruque A. S., Fuchs G. J., Albert M. J. Changing epidemiology of cholera due to Vibrio cholerae 01 and 0139 Bengal in Dhaka, Bangladesh II Epidemiol. Infect. 1996. - Vol. 116. - P. 275-278.

185. Faruque S. M., Rahman M. M., Asadulghani et al. Lysogenic conversion of environmental Vibrio mimicus strains by CTXcp // Infect. Immun. 1999. - Vol. 67.-P. 5723-5729.

186. Faruque S.M., Rahman S.M., Hasan M.M. et al. Diminished diarrheal response to V. cholerae strains carrying the replicative form of the CTX<|) genome instead of CTX(j> lisogens in adult rabbits. // Infect. Immun. 2001. - Vol. 69, N 10. -6084-6090.

187. Faruque S. M., Sack D.A., Sack B et al. Emergence and evolution of Vibrio cholerae 0139//PNAS.-2003.-Vol 100., N3 .- P. 1304-1309.

188. Faruque S. M., Siddique A. K., Saha M. N. et al. Molecular characterization of a new ribotype of Vibrio cholerae Ol39 Bengal associated with an outbreak of cholera in Bangladesh//J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37.-P. 1313-1318.

189. Fasano A., Baudry B., Pulmin D.W. et al. Vibrio cholerae produces a second enterotoxin, which affects intestinal tight junctions // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1991. - Vol. 88. - P. 5242-5246.

190. Fields P. I., Popovic T., Waehsmuth K., Olsvik O. Use of polymerase chain reaction for detection of toxigenic Vibrio cholerae 01 strains from the Latin American cholera epidemic // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30. - P. 21182121.

191. Figueroa-Arredondo P., Heuser J.E., Akopyants N.S. et al. Cell vacuolation caused by Vibrio cholerae hemolysin // Infect. Immun. 2001. - Vol.69. - N. 3. -P.1613-1624.

192. Finkelstein R.A., Boesman-Finkelstein M., Chang Y. et al. Vibrio cholerae hemagglutinin/protease, colonial variation, virulence and detachment // Infect. Immun. 1992. - Vol. 60. - P. 472-478.

193. Finkelstein R. A., Boesman-Finkelstein M., Sengupta D. K. et al. Colonial opacity variations among the choleragenic vibrios // Microbiology. 1997. - Vol. 13.-P. 23-24.

194. Finn Th. M., Reiser J., Germanier R., et al. Cell-associated hemagglutinin-deficient mutant of Vibrio cholerae // Infect. Immun. 1987. -Vol. 55. - P. 942946.

195. Fisher-Hock S.P., Khan A., Inam-ul-Haq et al. Vibrio cholerae 0139 in Karachi, Pakistan // Lancet. 1993. - Vol. 342, N 8884. - P. 1422-1423.

196. Freter R., 0,Brien. Role of Chemotaxis in association of motile bacteria with intestinal mucosa: fitness and virulence of nonchemotactic Vibrio cholerae mutants in infant mice. // Infect.Immun. 1981. - Vol. 34. - P.222-233.

197. Fuerst J. A., Perry J. W. Demonstration of lipopolysaeeharide on sheathed flagella of Vibrio cholerae 01 by protein A-gold immunoelectron microscopy // J. Bacterid.- 1988.-Vol. 170.-P. 1488-1494.

198. Fullner K.J., Mekalanos J.J. Genetic characterization of a new type IV-A pilus gene cluster found in both classical and El Tor biotypes of Vibrio cholerae // Infect. Immun. 1999. - Vol.67. - P. 1339-1404.

199. Fuqua C., Parsek M.R., Greenberg E.P. Regulation of gene expression by cell-to-cell communication: acyl-homoserine lactone quorum sensing // Annu. Rev. Microbiol. 2001. - Vol. 35. - P. 439-468.

200. Galen J.E., Ketley J.M., Fasano A. et al. Role of Vibrio cholerae neuraminidase in the function of cholera toxin // Infect. Immun.- 1992. Vol.60. -P.406-415.

201. Garg P., Ayadanian A., Smith S. et al. Molecular epidemiology of Ol39 Vibrio cholerae: mutation, latheral gene transfer, and founder flush // Emerging infectious diseases. 2003. - Vol. 9, №7. - P. 810-814.

202. Gardel C.L., Mekalanos J.J. Alterations in Vibrio cholerae motility phenotypes correlate with changes in virulence factor expression // Infect. Immun. 1996. -Vol.6,N6.-P. 226-2255.

203. Garg P., Nandy R. K., Chaudhury P. Emergence of Vibrio cholerae Ol biotype El Tor serotype Inaba from the prevailing Ol Ogawa serotype strains in India // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - P. 4249-4253.

204. Gerdes J.C., RomigW.R. Genetic basic of toxin production and pathogenesis in Vibrio cholerae: evidence against phage conversion // Infect. Immun. 1975.-.Vol. 11, N 3. - P.445-452.

205. Ghosh C., Nandy R. K., Dasgupta S. K. et al. A search for cholera toxin (CT), toxin coregulated pilus (TCP), the regulatory element ToxR, and other virulence factors in non-01/non-0139 Vibrio cholerae // Microb. Pathog. 1997. - Vol. 22. -P. 199-208.

206. Goldberg I., Mekalanos J. J. Effect of a recA mutation on cholera toxin gene amplification and deletion events // J. Bacteriol. 1986. - Vol. 165. - P. 723-731.

207. Guidolin A., Manning P. A. Genetics of Vibrio cholerae and its bacteriphages // Microbiol. Rev. 1987. - Vol.51, N 2. - P. 285-298.

208. Guidolin A., Morelli G., Kamke M. et al. Vibrio cholerae bacteriophage CP-T1 :characterization of bacteriophage DNA and restriction analysis // J. Virol. -1984.-Vol.51, N 1.-P. 163-169.

209. Gupta S., Chowdhury R. Bile affects production of virulence factors and motility of Vibrio cholerae // Infect.Immun. 1997. - Vol.65. - P.l 131-1134.

210. Hacker J., Blum-Oehler G., Muhldorfer J., Tschape H. // Mol. Microbiol. 1997.- Vol. 23. P. 1089-1097.

211. Hacker J., Kaper J.B. Pathogenicity islands and the evolution of microbes // Annu. Rev. Microbiol. 2000. - Vol. 54. P. 641-679

212. Hall R.H., Khambaty L.M., Kothary M. et al. Non-01 Vibrio cholerae // Lancet. 1993. - Vol.32. - P. 430.

213. Hall R.H., Losonsky G., Mekalanos J.J. et al. Immunogenicity of Vibrio cholerae Ol toxin-coregulated pili in experimental and clinical cholera // Infect. Immun. 1991.-Vol. 59.-P. 2508-2512.

214. Hanne L.P., Finkelstein R.A. Characterization and distribution of the hemagglutinins production by Vibrio cholerae // Infect. Immun. 1992. - Vol.36. -P. 209-214.

215. Hase C.C., Barquera B. Role of sodium bioenergetics in Vibrio cholerae // Biochim. Biophys. Acta. 2001. - Vol. 1505. - P. 169-178.

216. Hase C. C., Finkelstein R.A. Cloning and nucleotide sequence of the Vibrio cholerae hemagglutinin/protease (HA/Protease) gene and construction of an HA/Protease-negative strain // J. Bacteriol. 1991. - Vol. 173. - P.3311-3317.

217. Hase C. C,, Mekalanos J. J. TcpP protein is a positive regulator of virulence gene expression in Vibrio cholerae // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1998. Vol. 95. - P. 730-734.

218. Hase C.C., Mekalanos J.J. Effects of changes in membrane sodium flux on virulence gene expression in Vibrio cholerae // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -1999. Vol. 96. -P.3183-3187.

219. Heidelberg J.F., Eisen J.A., Nelson W.C., et al. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae.// Nature. — 2000. — Vol.406. P.477-483.

220. Heilpern A. J., Waldor M. K. CTXtp infection of Vibrio cholerae requires the tolQRA gene products // J Bacteriol. 2000. - Vol. 182. - P. 1739-1747.

221. Herrington D.A., Hall R.H., Losonsky G. et al. Toxin, toxin-coregulated pili and the toxR regulon are essential for Vibrio cholerae patogénesis in humans // J. Exp. Med. 1988. - Vol. 168. - P. 1487-1492.

222. Higa N., Honma J., Albert J.M. et al. Characterization of Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal isolated from patients with cholera-like disease in Bangladesh // Microbiol. Immun.- 1993. Vol.37. - P. 971-974

223. Higgins D.E., Nazareno E., DiRita V.J. The virulence gene activator ToxT from Vibrio cholerae is a member of the AraC family of transcriptional activators // J. Bacteriol. 1992. - Vol. 174, N 21. - P. 6974-6980.

224. Higgins D.E., DiRita V.J. Transcriptional control of toxT, a regulatory gene in the ToxR regulon of Vibrio cholerae // Mol. Microbiol. 1994. - Vol.14. - P.17-29.

225. Higgins D.E., DiRita V.J. Genetic analysis of the interaction between Vibrio cholerae transcription activator ToxR and toxT promoter DNA // J. Bacteriol. -1996. Vol. 178, №4.-P. 1080-1087.

226. Hisatsune K., Kondo S., Isshiki J. O-antigenic lipopolysacharide of Vibrio cholerae 0139 Bengal a new epidemic strain for recent cholera in the Indiansubcontinent // Biochemical and Biophysical Res. Communications. 1993. -Vol.196, N3.-P. 1309-1316.

227. Hochhut B., Lotfi Y., Mazel D., et al. Molecular analysis of antibiotic resistance gene clusters in Vibrio cholerae 0139 and Ol SAXT constins // Antimicrob. agents chemother. 2001. - Vol.45 -N11 - P.2991-3000

228. Hochhut B., Marrero J., Waldor M. K. Mobilization of plasmids and chromosomal DNA mediated by the SXT element, a constin found in Vibrio cholerae 0139 // J. Bacteriol. 2000. - Vol. 182. - P. 2043-2047.

229. Hochhut B., Waldor M. K. Site-specific integration of the conjugal Vibrio cholerae SXT element into prfC // Mol. Microbiol. 1999. - Vol. 32. - P. 99-110.

230. Holliday R.A. A new method for the identification of biochemical mutants of microorganism // Nature. 1956. - Vol. 178, N 4540. - P. 987.

231. Holliger P., Riechmann L. A conserved infection pathway for filamentous bacteriophages is suggested by the structure of the membrane penetration domain of the minor coat protein g3p from phage fd // Structure. — 1997. Vol. 5. - P. 265-275.

232. Honda T., Booth B.A., Boesman-Finkelstein M., Finkelstein R.A. Comparative study of Vibrio cholerae non-01 protease and solubb hemagglutining with this of Vibrio cholerae 01 // Infect. Immun. 1987. - Vol. 55, N2.-P. 451-454.

233. Huber K.E., Waldor M.K. Filamentous phage integration requires the host recombinases XerC and XerD // Nature. 2002.- Vol.417. - P.656-659.

234. Hullbert R.R., Taylor R.K. Mechanism of ToxT — dependent transcriptional activation at the Vibrio cholerae tcpA promoter // J; Bacteriol. 2002. - Vol.184, N20 - P.5535-5544

235. Iida T., Makino K., Nasu H. et al. Filamentous bacteriophages of vibrios are integrated into the dif-like site of the host chromosome // J.Bacteriol. 2002. -Vol.184.-P.4933 -4935.

236. International center for diarrhea disease research, Bangladesh. Recent diarrhea epidemic in Bangladesh used by a new strain of Vibrio cholerae non-Ol // Glimpse. 1993. - Vol.15, N 2. - P. 1-3.

237. Iredell J.R., Manning P.A. Biotype-specific tcpA genes in Vibrio cholerae // FEMS Microbiol. Lett. 1994. - Vol. 121. - P. 47-54.

238. Iredell J.R., Manning P.A. Translocation failure of a type 4 pilin: rfb and tcpT mutants in Vibrio cholerae // Gene. 1997. - Vol. 192. - P. 71-77.

239. Islam M.S., Hasan M.K., Miah M.A., Qadri F. Isolation of Vibrio cholerae 0139 Bengal Arom water in Bangladesh // Lancet. 1993. - Vol.32, N 8868. - P. 430.

240. Iwanaga M., Yamamoto K., Higa N. et al. Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae Ol El Tor // Microbiol. Immunol. -1986.- V.30.-P.1075-1083.

241. Jermyn W.S., Boyd E.F. Characterization of novel Vibrio pathogenicity island (VPI-2) encoding neuraminidase (nanH) among toxigenic Vibrio cholerae isolates // Microbiology.- 2002. Vol. 148. -P.3681-3693.

242. Johnson G., Osek J., Svennerholm A.M., Holmgren F. Immune mechanism and protective antigens of Vibrio cholerae serogroup 0139 as a basis for vaccine development// Infect. Immun. 1996. - Vol.6. - P. 3778-3785.

243. Johnson J.A., Salles C.A., Panigrahi P., Albert M.J. Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal is closely related to Vibrio cholerae Eltor but has important differenes // Infect. Immun. -1994. Vol.62, N 5. - P. 2108-2110.

244. Jones G. W., Freter R. Adhesive properties of Vibrio cholerae: nature of the interaction with isolation rabbit brush border membranes and human erythrocytes // Infect. Immun. 1976. -Vol. 14. - P. 240-245.

245. Jonson G., Holmgren J., Svennerholm A.-M. Epitope differences in toxin-coregulated pili produced by classical and El Tor Vibrio cholerae 01 // Microb Pathog.- 1991. -Vol. 11.-P. 179-188.

246. Jonson G., Lebens M., Holmgren J. Cloning and sequencing of Vibrio cholerae mannose-sensitive haemagglutinin pilin gene: localization of mshA within a cluster of type 4 pilin genes // Mol. Microbiol. 1994. - Vol.13 - N1 - P. 109-118

247. Jonson G., Svennerholm A.-M., Holmgren J. Analysis of expression of toxin-coregulated pili in classical and El Tor Vibrio cholerae 01 in vitro and in vivo // Infect. Immun. 1992. - Vol. 60. - P. 4278-4284.

248. Jouravleva E.A., McDonald G.A., Garon C.F. et al. The Vibrio cholerae mannose-sensitive hemagglutinin is the receptor for a filamentous bacteriophage from Vibrio cholerae 0139 //Infect.Immun. 1998. - Vol.66. - P.2535-2539.

249. Kado C. I., Liu S. T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmid//J. Bacteriol. 1981.-Vol. 145, N3.-P. 1365-1373.

250. Kaper J.B., Fasano A., Trucksis M. Toxins of Vibrio cholerae // Vibrio cholerae and cholera: Molecular to global, perspectives. Edited by L.K. Wahsmuth, P.A.Blake, O. Olsvik. ASM Press, Washington, 1994. P. 145-176.

251. Kaper J.B., Morris J.G., Levine M.M. Cholera // Clin. Microbiol. Rev. 1995. - Vol.8. - P. 48-86.

252. Kapfhammer D., Blass J., Evers S., Reidl J. Vibrio cholerae phage K139: Complete genome sequence and comparative genomics of related phages // J.Bacteriol. 2002. - Vol.184. - P.6592-6601.

253. Kar S., Ghosh R.K., Ghosh A.N. et al. // Integration of the DNA of a novel filamentous bacteriophage FSK from Vibrio cholerae 0139 into the host chromosomal DNA // FEMS Microbiol. Lett. 1996. - Vol.145. - P. 17-22.

254. Karaolis D.K.K., Kaper J.B.//Pathogenicity islands and other mobile virulence elements/ Eds J.B.Kaper, J. Hacker. Washington, - 1999. - P. 167-187.

255. Karaolis D.K., Lan R., Reeves P.R. Molecular evolution of the seventh-pandemic clone of Vibrio cholerae and its relationship to other pandemic and epidemic Vibrio cholerae isolates // J. Bacteriol. 1994. - Vol. 176, N 20. - P. 6199-6206.

256. Karaolis D. K. R., Lan R., Reeves P. R. The sixth and seventh cholera pandemics are due to independent clones separately derived from environmental, nontoxigenic, non-Ol Vibrio cholerae // J. Bacteriol. 1995. — Vol. 177. - P. 3191-3198.

257. Karaolis D. K. R., Johnson J. A., Bailey C. C. et al. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95, N 6. - P.3134-3139.

258. Karaolis D.K.R, Kaper J.B. Vibrio cholerae TCP: trifunctional virulence factor?: Response. // Trends Microbiol. 1999. - Vol. 7, № 10. - P. 393.

259. Karaolis D. K. R., Somara S., Maneval D. R. et al. A bacteriophage encoding a pathogenicity island, a type-IV pilus and a phage receptor in cholera bacteria // Nature. 1999. - Vol. 399. - P. 375-379.

260. Keasler S. P., Hall R.N. Detecting and biotyping V. cholerae 01 with multiplex polimerase chain reaction // Lancet 1993 - Vol. 341. - P. 1661.

261. Khetawat G., Bhadra R.K., Nandy S., et al. Resurgent Vibrio eholerae 0139: rearrangement of cholera toxin genetic elements and amplification of rrn operon // Infect. Immun. 1999. - Vol.67, N1 - P.148-154

262. Kimsey H. H., Nair G. B., Ghosh A., Waldor M. K. Diverse CTXcp and evolution of new pathogenic Vibrio eholerae (letter) // Lancet. 1998. - Vol. 352. - P. 457-458.

263. Kimsey H. H., Waldor M. K. CTX(p immunity: application in the development of cholera vaccines // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998. Vol. 95. - P. 70357039.

264. Kimsey H.H., Waldor M.K. Vibrio eholerae Hemagglutinin/Protease inactivates CTX(p // Infect. Immun. 1998. - Vol.66, N 9. - P. 4025-4029.

265. Kirn T.J., Lafferty M.J., Sandoe C.M.P., Taylor R.K. Delineation of pilin domains required for bacterial association into microcolonies and intestinal colonization by Vibrio eholerae // Mol. Microbiol. 2000. - Vol. 35, N 4. - P. 67-84.

266. Klose K.E., Mekalanos JJ. Differential regulation of multiple flagellins in Vibrio eholerae // J. Bacteriol. 1998. - Vol.180, N2 - P.303-316

267. Kovach M.E., Shaffer M.D., Peterson K.M. A putative integrase gene defines the distal end of a large cluster of ToxR-regulated colonization genes in Vibrio eholerae // Microbiology. 1996. - Vol. 142. - P. 2165-2174.

268. Kovachicova G., Skorupski K. A Vibrio eholerae LysR homolog, AphA, cooperates with AphA at the tcpPH promoter to activate expression of the ToxR virulence cascade // J. Bacteriol. 1999. - Vol. 181, N 14. - P. 4250-4256.

269. Kovachicova G., Skorupski K. Differential activation of the tcpPH promoter by AphB determines biotype specificity of virulence gene expression in Vibrio cholerae //J. Bacteriol. 2000. - Vol. 182, N 11. - P. 3228-3238.

270. Kovachicova G., Skorupski K. Binding site requirements of the virulence gene regulator AphB: differential affinities for the Vibrio cholerae classical and El Tor tcpPH promoters // Mol. Microbiol. 2002. - Vol. 44. - P. 533-547.

271. Krukonis E. S., Yu R. R., DiRita V. J. The Vibrio cholerae ToxR/TcpP/ToxT virulence cascade: distinct roles for two membrane-localized transcriptional activators on a single promoter // Mol. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - P. 67-84.

272. Lan R., Reeves P. R. Recombination between rRNA operons created most of the ribotype variation observed in the seventh pandemic clone of Vibrio cholerae //Microbiology. 1998.-Vol. 144.-P. 1213-1221.

273. Lazar S., Waldor M.K. ToxR-independent expression of cholera toxin of repli-cative form of CTXcp // Infect. Immun. 1998. - Vol.66, N 1. - P. 394-397.

274. Lee S.H., Butler S.M., Camili A. Selection for in vivo regulators of bacterial virulence // Proc.Natl. Acad. Sci. 2001 . -Vol.98. - P.6889-6894.

275. Lee S.H., Hava D.L., Waldor M.K., Camilli A. Regulation and temporal expression patterns of Vibrio cholerae virulence genes during infection // Cell. -1999. Vol. 99, N 6. - P. 625-634.

276. Levine M. M., Kaper J. B., Black R. E., Clements M. L. New knowledge on pathogenesis of bacterial enteric infections as applied to vaccine development // Microbiol. Rev. 1983.-Vol. 47. - P. 510-550.

277. Li C. C., Crawford J. A., DiRita V. J., Kaper J. B. Molecular cloning and transcriptional regulation of ompT, a ToxR-repressed gene in Vibrio cholerae // Mol. Microbiol. 2000. - Vol. 35. - P. 189-203.

278. Li C.C., Merrell D.S., Camilli A., Kaper J.B. ToxR interferes with CRP-dependent transcriptional activation of ompT in Vibrio cholerae // Mol. Microbiol. -2002.- Vol. 43, N6. -P. 1577-1589.

279. Li M., Shimada T., Morris J. G., et al. Evidence for the emergence of non-Ol and non-0139 Vibrio cholerae strains with pathogenic potential by exchange of O-antigen biosynthesis regions // Infect. Immun. 2002. - Vol.70, N 5. - P. 24412453.

280. Lin W., Fullner K. J., Clayton R. et al. Identification of a Vibrio cholerae RTX toxin gene cluster that is tightly linked to the cholera toxin prophage // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999.-Vol. 96.-P. 1071-1076.

281. Lugtenberg B., Bronstein H., van Selm N., Peters R. Peptidoglycan -associated outer membrane proteins in gramm-negative bacteria // Biochim. Bio-phys. Acta. 1977. - Vol.433. -P.118.

282. Madico G., Checkley W., Gilman R. H., et al. Active surveillance for Vibrio cholerae 01 and vibriophages in sewage water as a potential tool to predict cholera outbreak // Clin. Microbiol. 1996. - Vol.3, N 12. - P. 2968-2972.

283. Manning P.A. The tcp gene cluster of Vibrio cholerae // Gene. 1997. - Vol. 192.-P. 63-70.

284. Manning P.A., Brown M.H., Heuzenroeder MW. Cloning of the structural gene (hly) for the haemolysin of Vibrio cholerae El Tor strain 017 // Gene. -1984.-Vol. 31.-P. 225-231.

285. Marinaro M, Fasano A, De Magistris MT. Zonula occludens toxin acts as an adjuvant through different mucosal routes and induces protective immune responses // Infect Immun.- 2003. Vol.71, N 4. - P. 1897-902.

286. Marsh J. W., Taylor R. K. Genetic and transcriptional analyses of the Vibrio cholerae mannose-sensitive hemagglutinin type 4 pilus gene locus // J. Bacterid.-1999.-Vol. 181. P. 1110-1117.

287. Medrano A.I., DiRita V.J., Castillo G., Sanchez J. Transient transcriptional activation of the Vibrio cholerae El Tor virulence regulator toxT in response to culture conditions // Infect. Immun. 1999. - Vol. 67, N 5. - P. 2178-2183.

288. Mekalanos J. J. Duplication and amplification of toxin genes in Vibrio cholerae // Cell. 1983. - Vol. 35. - P. 253-263.

289. Mekalanos J.J., Rubin E.J., Waldor M.K. Cholera: molecular basis for emergence and pathogenesis U FEMS Microbiol. Lett. 1997. - Vol.18. - P. 241248.

290. Merrell D.S., Bailey C., Kaper J.B., et al. The toxR mediated organic acid tolerance response of Vibrio cholerae requires OmpU // J. Bacteriol. - 2001. -Vol.183 - N9 - P.2746-2754

291. Merrell D.S., Camilli A. Regulation of Vibrio cholerae genes required for acid tolerance by a member of the "ToxR-like" family of transcriptional regulators // J. Bacteriol. 2000. - Vol. 182, N 19. - P. 5342-5350.

292. Miller J.F. Bacteriophage and the evolution of epidemic cholera // Inf. Immun. -2003. Vol. 7, N 6. - P.2981-2982.

293. Miller M.B., Bassler B.L. Quorum sensing in bacteria // Annu. Rev. Microbiol. -2001.-Vol. 55.-P. 165-199.

294. Miller V.L., DiRita V.J., Mekalanos J.J. Identification of toxS, a regulatory gene whose product enhances toxR- mediated activation of the cholera toxin promoter // J. Bacteriol. 1989. - Vol. 171, N 3. - P. 1288-1293.

295. Miller V. L., Taylor R. K., Mekalanos J. J. Cholera toxin transcriptional activator ToxR is a transmembrane binding protein // Cell. 1987. - Vol. 48. - P. 271-279.

296. Minami A., Hashimoto S., Abe H. et al. Cholera enterotoxin production in Vibrio cholerae Ol strains Ol isolated from the environment and from humans in Japan // Appl.Environ. Microbiol. 1991. - Vol., N 8. - P.2151-2157.

297. Mitra S.N., Kar S., Ghosh R.K. et al. Presence of lysogenic phage in the outbreak strains of Vibrio cholerae 0139// J. Med. microbiol/ 1995. - Vol. 42. -P.399 -403.

298. Mooi F.R., Bik E.M. The evolution of epidemic Vibrio cholerae strains // Trends Microbiol. 1997. - Vol.5, N4. - P. 161-165.

299. Mudd S., Anderson T.F., Selective "staining" for electron microscopy. The effect of heavy metal salts on individual bacterial cells // Exp. Med. 1942. -Vol.76. - P. 103-107.

300. Mukhopadhyay A.K., Chakraborty S., Takeda Y. et al. Characterization of VPI pathogenicity island and CTXcp prophage in environmental stains of Vibrio cholerae. // J. Bacteriology. 2001. - Vol. 183. - P. 4737-3746.

301. Murley, Y. M., Behari J., Griffin R., Calderwood S.B. Classical and El Tor biotipes of Vibrio cholerae differ in timing of transcription of tcpPH during growth in inducing conditions // Infect. Immun. 2000. - Vol. 68, N 5. - P. 30103014.

302. Murley, Y. M., Carroll P. A., Skorupski K et al. Differential transcription of the tcpPH operon confers biotype-specific control of the Vibrio cholerae ToxR virulence regulon // Infect. Immun. 1999. - Vol. 67. - P. 5117-5123.

303. Nagamune K., Yamamoto K., Naka A. et al. In vitro proteolytic processing and activation of the recombinant precursor of El Tor cytolysin/hemolysin

304. Pro/HlyA) of Vibrio cholerae by soluble hemagglutinin/protease of V. cholerae, trypsin, and other protease // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64. - P. 4655-4658.

305. Nair G.B., Bag P.K., Ramamurthy J., Takeda I. et al. Evolution of DNA probes for specific ditection of Vibrio holerae 0139 Bengal // Clin. Microbiol. -1995. Vol.33, N 8. - P. 2186-2187.

306. Nair G.B., Albert M.J., Shimada T., Takeda Y. Vibrio cholerae 0139 Bengal, the new serogroup causing cholera // Rev. Med. Microbiol. 1996. - Vol.7. - P. 43-51.

307. Nair G.B., Faruque Sh.M., Bhuiyan N.A. et al New variants of Vibrio cholerae 01 Biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh// J Clin Microbiol. 2002 . -Vol. 40, N 9.-P. 3296-3299

308. Nandi S, Maiti D, Saha A, Bhadra RK. Genesis of variants of Vibrio cholerae 01 biotype El Tor: role of the CTXphi array and its position in the genome.// Microbiology. 2003. - Vol. 149 (Pt 1). - P. 89-97.

309. Nandy R.K., Sengupta D.K., Mukhopadhyay S., Ghose A.S. A comparative study of the properties of Vibrio cholerae 0139, 01 and other non-01 strains // Med. Microbiol. 1995. - Vol. 2. - P. 251-257.

310. Nelson E. T., Clements J. D., Finkelstein R. A. Vibrio cholerae adherence and colonization in experimental cholera: electron microscopic studies // Infect. Immun. 1976. -Vol. 14. - P. 527-547.

311. Nesper J., Blab J., Fountoulakis M. et al. Characterization of the major control region of Vibrio cholerae bacteriophaqge K139:immunity, exclusion and integration // J. Bacteriol. 1999. - Vol. 188, N9. - P. 2902-2913

312. Nesper J., Kapfhammer D., Klose K. et al. Characterization of Vibrio cholerae 01 antigen as the bacteriophage K139 receptor and identification of IS 1004 insertions aborting 01 antigen biosynthesis // J. Bacterial. 2000. - Vol.182. -P.5097-5104.

313. Nesper J., Kraib A., Schild S. et al. Comparative and genetic analyses of the putative Vibrio cholerae lipopolysaccharide core oligosaccharide biosynthesis (wav) gene cluster // Infect. Immun. 2002. - Vol. 70, N 5. - P. 2419-2433.

314. Nesper J., Lauriano C.M, Klose K.E. et al. Characrerization of Vibrio cholerae Ol El Tor galU ana galE mutants: influence on lipopolysaccharide, colonization and biofi 1 mformation // Infect. Immun.- 2001. Vol.69. - P.435-445

315. Nye M.B., Pfau J.D., Skorupski K., Taylor R.K. Vibrio cholerae H-NS silences virulence gene expression at multiple steps in the ToxR regulatory cascade //J. Bacteriol.-2000.-Vol. 182, N 15. P. 4295-4303.

316. Ogg J.E., Shrestha N.B., Poudyal L. Phage-induced changes in Vibrio cholerae: serotype and biotype conversions // Infect.Immun. 1978. -Vol.19, N1. -P.231-238.

317. Ogg J.E., Timme T.L., Alemohammad M.M. General transduction in Vibrio cholerae // Infect. Immun. 1981. - Vol. 31, N 2.- P.737-741.

318. Olive D. M., Bean P. Principles and applications of methods for DNA-based typing of microbial organisms // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37. - P. 16611669.

319. O'Shea Y.A., Boyd E.F. Mobilization of Vibrio pathogenecity island between Vibrio cholerae isolates mediated by CP-T1 generalized transduction // FEMS Microbiol. Lett. 2002.-Vol. 214.-P. 153-157

320. Pajni S., Sharma C., Bhasin N. et al. (). Studies on the genesis of Vibrio cholerae 0139: Identification of probable progenitor strains // J. Med. Microbiol. 1995.-Vol. 42.-P. 20-25.

321. Pal S., Sasmal D., Guhathakurta B. et al. Electrophoretic mobility and immune response of outer membrane proteins of Vibrio cholerae 0139 // FEMS Immunol. Med. Microbiol. -1996.-Vol. 15.-P.143-148.

322. Pascual M., Bouma M.J., Dobson A. P. Cholera and climate: revisiting the quantitative evidence // Microbes and infection. 2002, - Vol.4. - P.237-245.

323. Pearson G. D., Woods A., Chiang S. L., Mekalanos J. J. CTX genetic element encodes a site-specific recombination system and an intestinal colonization factor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol. 90. - P. 3750-3754.

324. Pfau J.D., Taylor R.K. Mutations in toxR and toxS that separate transcriptional activation from DNA binding at the cholera toxin gene promoter // J. Bacteriol. -1998. Vol. 180, N 17. - P. 4724-4733.

325. Popovic T., Fields P. I., Olsvik O. et al. Molecular subtyping of toxigenic Vibrio cholerae 0139 causing epidemic cholera in India and Bangladesh, 1992-1993 //J. Infect. Dis.- 1995.-Vol. 171.-P. 122-127. '

326. Prabhakar H., Lei M., Kaur H. Outbreak of gastroenteritis due to a new strain of non O group 1 Vibrio cholerae, in Luahiana in may-august 1993 // Ind. J. Med. Res. 1994.-Vol. 99.-P. 107-108.

327. Preston L.M., Xa Q., Johnson J.A., Joseph A. Preliminary structure determination of the capsular polysaccharide of Vibrio cholerae 0139 Bengal A11837 // Bacteriol. 1995. - Vol. 177, N 3. - P. 835-838.

328. Provensano D., Schumacher D.A., Barker J.L., Klose K.E. The virulence regulatory protein ToxR mediates enhanced bile resistance in Vibrio cholerae and other pathogenic Vibrio species // Infect. Immun. 2000. - Vol. 68, N 3. - P. 1491-1497.

329. Provenzano D., C. M. Lauriano, and K. E. Klose. Characterization of the role of the ToxR-modulated outer membrane porins OmpU and OmpT in Vibrio cholerae virulence // J. Bacteriol. 2001. - Vol. 183. - P. 3652-3662.

330. Qu M., Xu J., Ding Y. et al. Molecular epidemiology of Vibrio cholerae 0139 in China: polymorphism of ribotypes and CTX elements.// J Clin Microbiol.-2003. Vol.41, N6. - P. 2306-2310.

331. Ramamurthy T.S., Garg S., Sharma G.R. Emergence of novel strain of Vibrio cholerae with epidemic potential in southern and eastern India // Lancet. 1993. -Vol. 341.-P. 703-704.

332. Raziuddin S. Studies of the polysaccharides (0-antigen) of Vibrio cholerae // Biochem. Biophys. 1977. - Vol.14. - P. 262-263.

333. Raziuddin S. Toxin and immunological properties of the lipopolysaccaride (O-antigens) from Vibrio eltor // Immunochemistry. 1978. - Vol.15, N 9. - P.611-614.

334. Reidl J., Klose K. Vibrio cholerae and cholerae: out of the water and into the host//FEMS Microbiol. Rev. 2002. - Vol. 26-P. 125-139

335. Reidl J., Mekalanos J. J. Characterization of Vibrio cholerae bacteriophage K139 and use of a novel mini transposon to identify a phage-encoded virulence factor // Mol. Microbiol. 1995. - Vol. 18. - P. 685-701.

336. Rhine J.A., Taylor R.K. TcpA pilin sequences and colonization requirements for 01 and 0139 Vibrio cholerae // Mol. Microbiol. 1994. - Vol. 13, № 6. - P. 1013-1020.

337. Rijpketa S.T., Jansen W.H., Gielen H., Guince P.A. Immunoglobulins in bile and serum of the rabbit associated with protection after Vibrio cholerae infection and vaccination // Microbiol. Pathog. 1987. - Vol.3, N 5. - P. 365-375.

338. Rivas M., Toma C., Miliwebsky E. et al. Cholera isolates in relation to the "eighth pandemic." // Lancet. 1993. - Vol. 342. - P. 926-927.

339. Rivera I.N., Chun J., Huq A. et al. Genotypes associated with virulence in environmental isolates of Vibrio cholerae // Appl. Environ. Microbiol. 2001. -Vol.67, N 6. - P. 2421-2429

340. Rossi M., Maurano F.„ Luongo D. et al. Zonula occludens toxin (Zot) interferes with the induction of nasal tolerance to gliadin // Immunol. Lett. — 2002. -Vol. 81.-P. 217-/221.

341. Rubin E., Lin W., Mekalanos J.J. et al. Replication and integration of a Vibrio cholerae cryptic plasmid linked to the CTX prophage //Mol. Microbiol. 1998. -Vol. 28.-P. 1247-1254.

342. Said B., Smith H. R., Scotland S. M., Rowe B. Detection and differentiation of the gene for toxin co-regulated pili (tcpA) in Vibrio cholerae non-01 using the polymerase chain reaction // FEMS Microbiol. Lett. 1995. - Vol. 125. - P. 205— 210.

343. Salles C. A., Momen H., Vicente A. C. P., Coelho A. Vibrio cholerae in South America: polymerase chain reaction and zymovar analysis // Trans R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1993. - Vol. 87. - P. 272.

344. Sarkar A., Nandy R.K., Nair G.B., et al. Vibrio pathogenicity island and cholera toxin genetic element-associated virulence genes and their expression in non-Ol non-0139 strains of Vibrio cholerae // Infect. Immun. 2002. - Vol.70 , N 8 -P.4735-4742

345. Schneider D.R., Parker C. D. Isolation and 'characterization of protease-deficient mutants of Vibrio cholerae // Journal of Infectious Diseases. 1978. -Vol. 138. - P.143-151.

346. Schuhmacher D.A., Klose K.E. Environmental signals modulate ToxT-dependent virulence factor expression in Vibrio cholerae // J.Bacteriol. 1999. -Vol.181.-P.1508-1514.

347. Sears C. L., Kaper J. B. Enteric bacterial toxins: mechanisms of action and linkage to intestinal secretion // Microbiol. Rev. 1996. - Vol. 60. - P. 167-215.

348. Sechi L.A., Dupre I., Deriu A. et al. Distribution of Vibrio cholerae virulence genes among different Vibrio species in Sardinia, Italy // J. Appl. Microbiol. -2000. Vol. 88, N3. - P.475-481

349. Sengupta D.K., Boesman-Finkelstein M., Finkelstein R.A. Antibody against the capsule of Vibrio cholerae 0139 protects against experimental challenge // Infect. Immun. 1996. - Vol. 6, N 1. - P. 343-345.

350. Sharma C., Maiti S., Mukhopadhyay A. K. et al. Unique organization of the CTX genetic element in Vibrio cholerae 0139 strains which reemerged in Calcutta, India, in September 1996 // J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35. - P. 3348-3350.

351. Sharma C., Thungapathra M., Ghosh A. et al. Molecular analysis of non-Ol, non-0139 Vibrio cholerae associated with an unusual upsurge in the incidence of cholera-like disease in Calcutta, India // J. Clin. Microbiol. 1998. - Vol. 36. - P. 756-763.

352. Shimada T., Nair G.B., Deb B.C., Albert M.J. Outbreak of Vibrio cholerae non-01 in India and Bangladesh // Lancet.- 1993. Vol. 341. - P. 1347.

353. Siddique K.A.I., Bhattacharyya F.K. Phage-induced change of toxinogenesis in Vibrio cholerae // J.Med. Microbiol.- 1987. Vol.23, N 4. - P.331-335.

354. Silva A.J., Pham K., Benitez J.A. Haemagglutinin/protease expression and mucin gel penetration in El Tor biotype Vibrio cholerae// Microbiology. — 2003.-Vol. 149. -P.1883-1891.

355. Singh D.V., Matte M.H., Matte G.R. et al. Molecular analyses of Vibrio cholera Ol, 0139, non-Ol and non-0139 strains: clonal relationships between clinical and environmental isolates // Appl. and Environmental Microbiol. 2001. -Vol. 67.-P. 910-921.

356. Sinha S., Chakraborty R., De K. et al. Escalating association of Vibrio cholerae 0139 with cholera outbreaks in India // J.Clin.Microbiol.- 2002. Vol. 40. -P.2635-2637.

357. Skorupski K., Taylor R.K. Control of the ToxR virulence regulon in Vibrio cholerae by environmental stimuli // Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 25. - P. 10031009.

358. Skorupski K., Taylor R.K. A new level in the Vibrio cholerae ToxR virulence cascade: AphA is required for transcriptional activation of the tcpPH operon // Mol. Microbiol. 1999. - Vol. 31, N 3. - P. 763-771.

359. Smirnova N.I., Cheldyshova N.B., Zadnova S.P., Kutyrev V.V. Molecular-genetic peculiarities of classical biotype Vibrio cholerae the etiological agent ofthe last outbreak Asiatic cholera in Russia // Microbial Pathogenesis. 2004. -Vol. 36. P.130-139.

360. Sozhamannan S., Deng Y. K., Li M. et al. Cloning and sequencing of the genes downstream of the wbf gene cluster of Vibrio cholerae serogroup 0139 and analysis of the junction genes in other serogroups // Infect. Immun. 1999. — Vol. 67.-P. 5033-5040.

361. Sperandio V., Giron J. A., Silveira W. D., Kaper J. B. The OmpU membrane protein, a potential adherence factor of Vibrio cholerae // Infect. Immun. 1995. — Vol. 63.-P.4433-4438.

362. Stroeher, U. H., Parasivam G., Dredge B. K., Manning P. A. Novel Vibrio cholerae 0139 genes involved in lipopolysaccharide biosynthesis // J. Bacteriol. -1997. Vol. 179. - P.2740-2747.

363. Stroeher U.H., Jedani K.E., Manning P.A. Genetic organization of the regions associated with surface polysaccharide synthesis in Vibrio cholerae 01, 0139 and Vibrio anguillarum 01 and 02: a review // Gene. 1998. - Vol.223 (1-2). -P.269-282.

364. Stull T. L., LiPuma J. J., Edlind T. D. A broad spectrum probe for molecular epidemiology of bacteria: ribosomal RNA // J. Infect. Dis. 1988. - Vol. 157. - P. 280-286.

365. Sun D., Mekalanos J.J., Taylor R.K. Antibodies directed against the toxin-coregulated pilus isolated from Vibrio cholerae provide protection in the infant mouse experimental cholera model // J. Infect. Dis. 1990. - Vol. 161.-P. 12311236.

366. Svennerholm A.M., Stromberg G.J. Holmgren, J. Purification of Vibrio cholerae soluble haemagglutinin, development enzyme-linked immunosorbent assays for antigen, antibody quantitations // Infect. Immun. 1983. - Vol. 41. - P. 237.

367. Svennerholm A.M., Wiklund G. Rapid GM 1-enzyme-linked immunosorbent assay with visual reading for identification of Escherichia coli heat-labile enterotoxin // J. Clin. Microbiol. 1983. - Vol.17.- P. 262-270/

368. Swerdlow D.L., Ries A. Vibrio cholerae non-01 the eighth pandemic? // Lancet. 1993. - Vol. 242, N 8868. - P. 282-283.

369. Tackett C. O., Taylor R. K., Losonsky G. et al. Investigation of the roles of toxin-coregulated pili and mannose-sensitive hemagglutinin pili in the pathogenesis of Vibrio cholerae Ol39 infection // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66.-P. 692-695.

370. Tagomori K., Iida T., Honda T. Comparison of genome structures of vibrios, bacteria possessing two chromosomes // J. Bacteriol. 2002. - Vol.184, N16 -P.4351-4358

371. Takeya K., Shimodori Sh. "Prophage typing" of EL Tor vibrios // J.Bacteriol.-1963. - Vol.85, N4. - P.957-958.

372. Tan N.H. Tan C.S. Acidimetric assay of phospholipase A using egg yolk suspension as substrate // Anal. Biochem. 1988. - Vol. 170. - P. 282-288.

373. Tarasevich I.V., Shaginyan I.A., Mediannikov O.Y. Problems and perspectives of molecular epidemiology of infectious diseases // Ann N.Y. Acad. Sei. 2003. -N. 990.-P. 751-756

374. Taylor R. K., Miller V. L., Furlong D. B., Mekalanos J. J. Use of phoA gene fusions to identify a pilus eolonizatipn factor coordinately regulated with cholera toxin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987. Vol. 84. - P. 2833-2837.

375. Thelin K.H., Taylor R.K. Toxin-coregulated pilus, but not mannose-sensitive hemagglutinin, is required for colonization by Vibrio cholerae El Tor biotype and 0139 strains // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64. - P. 2853-2856.

376. Thomas S., Williams S.G., Manning P.A. Regulation of tcp genes in classical and El Tor stains of Vibrio cholerae // Gene. 1995. - Vol. 166. -P.43-48.

377. Trucksis M., Galen J.E., Mishalski J. et al. Accessory cholera enterotoxin (Ace), the third toxin of a Vibrio cholerae virulence cassette // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol. 90. - P. 5267-5271.

378. Trucksis M., Michalski J., Deng Y. K., Kaper J. B. The Vibrio cholerae genome contains two unique circular chromosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998. Vol. 95. - P. 14464-14469.

379. Van Belkum A. High-throughput epidemiopogic typing in clinical microbiology // Clin. Microbiol. Infect. 2003. - Vol. 2 -N. 2. - P. 86-100

380. Vance R.E., Zhu J., Mekalanos J.J. A constitutively active variant of the quorum-sensing regulator LuxO affects protease production and biofilm formation in Vibrio cholerae // Infect.Immun. 2003. - Vol.71. - P.2571-2576.

381. Vassart G., Georges M., Monsier R. et al. A sequence in M13 phage detects hypervariable minisatellites in human and animal DNA // Science. -1987. Vol. 235, N 4789. -P.683-684.

382. Voss E., Attridge S.R. In vitro production of toxin-coregulated pili by Vibrio cholerae El Tor // Microb. Pathog. 1993. - Vol. 15. - P. 255-268.

383. Voss E., Manning P.A., Attridge S.R. The toxin-coregulated pilus is a colonization factor and protective antigen of Vibrio cholerae El Tor // Microb. Pathog. 1996,-Vol. 20.-P. 141-153.

384. Wachsmuth, I.K., Evins G.M., Fields P.I. et al. The molecular epidemiology of cholera in Latin America // J. Infect. Dis. 1993. - Vol. 167. - P. 621-626.

385. Wagner P.L., Waldor M.K. Bacteriophage control of bacterial virulence // Infect. Immun. 2002. - Vol.70, N8 -P.3985-3993.

386. Wai S.N., Mizunoe Y., Takade A. et al. Vibrio cholerae 01 strain TS1-4 produces the exopolysaccharide materials that determine colony morphology, stress resistance, and biofilm formation // Appl. Environ. Microbiol. 1998. -Vol.64. - P.3648-3655

387. Waldor M. K., Colwell R., Mekalanos J. J. The Vibrio cholerae 0139 serogroup antigen includes an O-antigen capsule and lipopolysaccharide virulence determents // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 91. - P. 11388-11392.

388. Waldor M.K., Lasar S., Kimsey H., Williams J., Mekalanos J J. CTXcp: a novel filamentous phage encording cholera toxin // Bacterial. Protein Toxins: Eighth European Workshop. 1998. - Vol. 29. - P. 363-371.

389. Waldor M. K., Mekalanos J. J. Vibrio cholerae 0139 specific gene sequences //Lancet. 1994. -Vol. 343. -P. 1366.

390. Waldor M.K., Mekalanos J.J. Emergence of a new cholera pandemic: molecular analysis of virulence determinants in Vibrio cholerae 0139 anddevelopment of a live vaccine prototype // J.Infect. Dis. 1994. - Vol.170. - P. 278-283.

391. Waldor M. K., Mekalanos J. J. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin // Science. 1996. - Vol. 272. - P. 1910-1924.

392. Waldor M. K., Rubin E. J., Pearson G. D. et al. Regulation, replication, and integration functions of the Vibrio cholerae CTXcp are encoded by region RS2 // Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 24. - P. 917-926.

393. Waldor M. K., Tschape H., Mekalanos J. J. A new type of conjugative transpo-son encodes resistance to sulfamethoxazole, trimethoprim, and streptomycin in Vibrio cholerae 0139 // J. Bacteriol. 1996. - Vol. 178. - P. 4157-4165.

394. Wang S. Y., Lauritz J., Jass J., Milton D. L. A ToxR homolog from Vibrio anguillarum serotype 01 regulates its own production, bile resistance, and biofilm formation // J Bacteriol. 2002. - Vol. 184. - P. 1630-1639.

395. Wang S.Y., Lauritz J., Jass J. Role for the major outer-membrane protein from Vibrio anguillarum in bile resistance and biofilm formation // Microbiology -2003. Vol.149 - P.1061-1071

396. Ward H. M., Morelli G., Kamke M. et al. A physical map of the chromosomal region determining O-antigen biosynthesis in Vibrio cholerae // Gene. 1987. -Vol. 55.-P. 197-204.

397. Watnick P.J., Fullner K.J., Kolter R. The role for the mannose-sensitive hemagglutinin in biofilm formation by Vibrio cholerae El Tor // J. Bacteriol. -1999.-Vol. 181, N 11.-P. 3606-3609.

398. Watnick P.I., Lauriano C.M., Klose K.E. et al. The absence of a flagellum leads to altered colony morphology, biofilm formation and virulence in Vibrio cholerae 0139//Mol. Microbiol.-2001.-Vol. 39. -P.223-235.

399. Weekly epidemiological records. 2002 - 2003. - Vol. 77-78.

400. Weintraub A., Winmalm G., Jansson P. E. et al. Vibrio cholerae 0139 Bengal possesses a capsular polysaccharide which may confer increased virulence // Mic. Pathog. 1994. - Vol. 16. - P. 235-243.

401. Wibbenmeyer J.A., Provensano D., Landry C.F. et al. Vibrio cholerae OmpU and OmpT porins are differentially affected by bile // Infect. Immun. 2002. -Vol. 70.-P. 121-126.

402. Wong S.M., Carroll P.A., Rahme L.G. Modulation of expression of the ToxR regulon in Vibrio cholerae by a member of two-component family of response regulators // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66, N 12. - P. 5854-5861.

403. Wu Z., Nybom P., Magnusson K-E. Distinct effects of Vibrio cholerae hemag-glutinin/protease on the structure and localization of the tight junction-associated proteins occludin and ZO-1. //Cell. Microbiol 2000. - Vol. 2. - P. 11-17.

404. Yamasaki S., Garg S, Nair G. B., Takeda Y. Distribution of Vibrio cholerae 01 antigen biosynthesis genes among 0139 and other non-01 serogroups ol Vibrio cholerae // FEMS Microbiol. Lett. 1999. - Vol. 179. - P. 115-121.

405. Yamasaki, S., Shimizu T., Hoshino K. et al. Y. The genes responsible for O-antigen synthesis of Vibrio cholerae 0139 are closely related to those of Vibrio cholerae 022 // Gene. 1999. - Vol. 237. - P. 321-332.

406. Yancey R. J., Willis D. L., Berry L. J. Role of motility of in experimental cholera in adult rabbits // Infect. Immun. 1978. -Vol. 22. - P. 387-392.

407. Yu R.R., DiRita V.J. Analysis autoregulatory loop controlling ToxT, cholera toxin, and toxin-coregulated pilus production in Vibrio cholerae // J. Bacteriol. -1999.-Vol. 181, №8.-P. 2584-2592.

408. Yu R.R., DiRita V.J. Regulation of gene expression in Vibrio cholerae by ToxT involves both antirepression and RNA polymerase stimulation // Mol. Microbiol.-2002.-Vol. 43, N 1.-P. 119-134.

409. Zhang D., Xu Z., Sun W., Karaolis DK. The Vibrio pathogenicity island-encoded Mop protein modulates the pathogenesis and reactogenicity of epidemic Vibrio cholerae // Infect. Immun. 2003. - Vol.71, N1 - P.510-515t \

410. Zhu J., Miller M.B., Vance R.E. et al. Quorum-sensing regulators control virulence gene expression in Vibrio cholerae // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. -Vol. 99.-P. 3129-3134.

Информация о работе

Ерошенко, Галина Александровна
доктора биологических наук
Саратов, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Молекулярно-генетический анализ штаммов Vibrio cholerae O139 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы