Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нейраминидаза холерных вибрионов 0139 серогруппы

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дуванова, Ольга Викторовна

Список сокращений.

Введение.^.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Vibrio cholerae 0139 - новый этиологический агент холеры.

1.2. Нейраминидаза: некоторые физико - химические свойства и возможное биологическое значение.

1.2.1. Распространение нейраминидаз в природе. Локализация. Происхождение.

1.2.2. Генетическая детерминированность нейраминидазы у бактерий.

1.2.3. Механизм действия нейраминидазы. Субстратная специфичность.

1.2.4. Некоторые физико - химические свойства нейраминидаз.

1.2.5. Возможное биологическое действие нейраминидаз и связь с патогенностью бактерий.

Собственные исследования

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Использованные в работе штаммы бактерий.

2.2. Химические реактивы.

2.3. Питательные среды.

2.4. Подбор оптимальных условий для продукции нейраминидазы.

2.5. Метод получения бактериальных: экстрактов.

2.6. Метод получения бактериальных фильтратов.

2.7. Методы определения нейраминидазной активности.

2.7.1. Качественный метод оценки нейраминидазной активности холерных вибрионов.

2.7.2. Количественный метод определения фермента.

2.8. Методы выделения, очистки и характеристики нейраминидазы из штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы.

2.9. Получение антисыворотки.

2.10. Метод выявления нейраминовой кислоты с помощью тонкослойной хроматографии.

2.11. Электрофоретические приемы исследования.

2.12. Постановка полимеразной цепной реакции.

2.12.1. Выделение ДНК.

2.12.2. Амплификация ДНК и учет результатов.

2.13. Методы введения плазмидной ДНК в клетки.

2.14. Качественное определение способности холерных вибрионов 0139 серогруппы гидролизовать твины -20,-40,-60,

2.15. Изучение взаимодействия препаратов нейраминидазы с макрофагами.

2.16. Определение фосфатазной активности.

2.17. Определение активности фосфодиэстеразы.

2.18. Определение 5' - нуклеотидазной активности.

2.19. Статистическая обработка результатов. Компьютерное обеспечение исследования.

Глава 3. Компьютерный анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей гена нейраминидазы холерного вибриона биотипа эльтор.

3.1. Нуклеотидный анализ.

3.2. Анализ аминокислотных последовательностей фермента.

Глава 4. Нейраминидаза холерных вибрионов 0139 серогруппы.

4.1. Обнаружение нейраминидазы у вибрионов, выделенных из клинических образцов и воды поверхностных водоемов.

4.2. Выделение и очистка нейраминидазы из штаммов клинического и водного происхождения.

4.3. Изучение некоторых свойств нейраминидаз.

4.3.1. Некоторые физико - химические свойства.

4.3.2. Обнаружение дополнительных ферментативных активностей у нейраминидазы холерного вибриона.

4.3.3. Изучение некоторых биологических свойств препаратов нейраминидазы.

Глава 5. Нейраминидазная активность и другие свойства у вибрионов различной серопринадлежности.

5.1. Ферментативная активность и серопринадлежность вибрионов.

5.2. Сравнительное генотипирование штаммов V. cholerae 0139 серогруппы из различных источников.

5.3. Мутанты V. cholerae 01 серогруппы, негативные по структурному гену нейраминидазы.

5.4. Характеристика некоторых фенотипических признаков холерных вибрионов 013 9 серогруппы различного происхождения

5.5. Изучение способности холерных вибрионов 0139 серогруппы гидролизовать твины.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Нейраминидаза холерных вибрионов 0139 серогруппы"

Актуальность проблемы

Вспышка холеры на Индийском субконтиненте в 1992 - 93 годах, обусловленная холерными вибрионами 0139 серогруппы, высокая контагиоз-ность возбудителя, его сходство с вибрионами эльтор, а также быстрое распространение по многим^с^анам мира объясняют повышенное внимание исследователей к этому новому этиологическому агенту холеры (Albert M.J. et al., 1993; Ramamurthy Т. et al., 1993; Sarkar B.L. et al., 1993; Shimada T. et al., 1993; Dumontier S., Berche P., 1998; Tacket C.O. et al., 1998; Mizunoe Y. et al., 1999; Faruque S.M. et al., 1997, 2000).

Бактерии рода Vibrio обладают широким набором признаков, обеспечивающих их патогенность, а изучение проблемы взаимодействия микро - и макроорганизма неизбежно включает поиск и исследование у микробного агента факторов, способствующих инвазии, приживляемости и экспрессии детерминант вирулентности. В последние годы уточнена биологическая функция многих ферментов, установлена их роль в патогенезе инфекционных процессов. У вибрионов 0139 серогруппы детальное изучение фенотипа только начинается, что в равной степени относится и к изучению ферментативного потенциала.

Нейраминидаза (сиалидаза, ацетилнейраминил - гидролаза, К.Ф. 3.2.1.18.) (Enzyme nomenclature, 1984) относится к классу гидролаз и отщепляет от различных гликопротеинов, гликолипидов и олигосахаридов N - ацетил-нейраминовые (сиаловые) кислоты, находящиеся в терминальном положении и связанные с углеводным компонентом а - гликозидной связью (Езепчук Ю.В., 1985).

Способность синтезировать нейраминидазу была установлена у целого ряда патогенных и непатогенных бактерий, L - форм Erysipelothrix, представителей миксовирусов, грибов, простейших, беспозвоночных, позвоночных животных и человека (Gottschalk A., Bhargava A.S., 1971; Muller Н.Е., 1976; Inoue S. et al., 2001; Вертиев Ю.В., Езепчук Ю.В., 1973; Езепчук Ю.В., 1977; Нико-лов П. и др., 1977; Кобринский Г.Д, 1978,1979).

Осуществляемое нейраминидазой ферментативное десиалирование субстратов является основой биологического эффекта, который вызывает этот фермент как фактор патогенности с функцией распространения у возбудителей инфекционных заболеваний. Предположение об участии нейраминидазы в патогенезе холеры и других инфекций высказывалось многими исследователями (Muller Н.Е., 1971; Milligan T.W. et al, 1980; Vimr E.R. et al., 1988; Souto - Padron T. et al., 1990; Galen J.E. et al., 1992; Marin C. et al., 1995; Вертиев Ю.В., 1974; Соловьев В.Д. и др., 1975; Дурихин К.В. и др., 1976).

Нейраминидаза у холерных вибрионов способна усиливать связывание энтеротоксина с эпителием клеток тонкого кишечника путем превращения поверхностных полисиалоганглиозидов в моносиалоганглиозид GMi, являющийся рецептором холерного токсина (Galen J.E. et al., 1992). Vimr E.R. et al. (1988) не исключали возможного участия энзима в метаболизме через снабжение клеток возбудителя свободными сиаловыми кислотами, которые могли быть использованы в качестве источника углерода.

Несмотря на имеющийся обширный экспериментальный материал по нейраминидазе холерных вибрионов в отечественной и мировой литературе, фермент продолжает оставаться малопонятным для исследователей. Молеку-лярно - биологические и биохимические исследования сиалидазы из различных источников, проведенные в Германии (Roggentin P. et al., 1988), США (Vimr E.R. et al., 1988), Австралии (Berry A. et al., 1988), указывают на неполноту имеющихся данных о структурной организации этого полипептида. А между тем найденные особенности в структуре нейраминидазы РНК - содержащего вируса гриппа WSN, выразившиеся в отсутствии сайта гликозилиро-вания в положении 146 и наличии лизина на С - конце молекулы., по мнению Goto Н., Kawaoka Y. (1998) и Webster R.G. (1999), явились одной из причин необычной патогенности пандемического вируса гриппа ("испанка"), унесшего весной 1918 года не менее 20 миллионов жизней. Можно надеяться, что знание нуклеотидного состава генов гемаглютинина и нейраминидазы позволит разработать лекарственные препараты, эффективные в отношении подобных вирусов в случае их нового появления в популяции чувствительных хозяев.

За последние годы мы не встретили в литературе сведений, касающихся изучения у холерных вибрионов 0139 серогруппы "Бенгал" нейраминидазы, столь "модной" в семидесятые - восьмидесятые годы прошлого века, хотя интерес к аналогичному энзиму у вирусов не ослабевает (Hausmann J. et al., 1997; Arora D.S. et al., 1997; Hayden F.G. et al., 1997; Li W., et al., 1998; Mendel D. В., 1998; Xin X. et al., 1998).

Учитывая возможную биологическую значимость энзима для процессов жизнедеятельности микробной клетки, его участие в реализации патогенных свойств вибрионов (Gottschalk A., Bhargava A.S., 1971; Muller Н.Е., 1971, 1976; Vimr E.R. et al., 1988; Galen J. et al., 1992; Marin C. et al., 1995; Вертиев Ю.В., 1974; Кобринский Г.Д., 1978; Езепчук Ю.В., 1977, 1985 и др.), представлялись актуальным поиск и углубленное изучение этого энзима у холерных вибрионов 0139 серогруппы с учетом имеющихся современных подходов и возможностей практики компьютерного анализа.

Цель работы

Обнаружение и изучение нейраминидазы у холерных вибрионов 0139 серогруппы, выделенных из клинического материала и воды поверхностных водоемов.

Задачи исследования

1. Проведение компьютерного анализа нуклеотидной (НК) и соответствующей аминокислотной (АК) последовательностей гена нейраминидазы холерного вибриона биовара эльтор для прогнозирования и возможного объяснения биологических свойств фермента.

2. Изучение способности холерных вибрионов 0139 серогруппы различного происхождения к продукции нейраминидазы.

3. Получение очищенных препаратов нейраминидазы из клеток штаммов V. cholerae 0139 серогруппы различного происхождения.

4. Изучение некоторых физико - химических и биологических свойств нейраминидазы из вибрионов 0139 серогруппы различного происхождения.

Научная новизна

- Впервые показано, что штаммы V. cholerae 0139 серогруппы различного происхождения, подобно другим представителям рода Vibrio, обладали способностью продуцировать внеклеточный фермент нейраминидазу. Подобраны оптимальные условия для продукции энзима. Выделена, очищена и охарактеризована по некоторым физико - химическим и биологическим свойствам нейраминидаза из клеток штаммов V. cholerae 0139 серогруппы различного происхождения. Показано, что фермент из клинических образцов не обладал способностью расщеплять флюорогенный субстрат 2 - (4' -. метилумбеллифе-рил) - N - ацетил - а - D - нейраминовой кислоты (МУК), что может явиться его своеобразной меткой в отличие от энзима штаммов, выделенных из воды поверхностных водоемов.

- Впервые выполнен компьютерный анализ НК и соответствующей АК последовательностей гена нейраминидазы Vibrio cholerae eltor, на основании которого были предсказаны и в ряде случаев экспериментально подтверждены некоторые свойства фермента. По данным компьютерного анализа показано, что нейраминидаза V. cholerae eltor не содержит в своей структуре цистеин, что влечет за собой нечувствительность к тиолсодержащим реагентам. Аналогичной нечувствительностью характеризуется и фермент из штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы.

- С помощью ПЦР при использовании праймеров Vcnl+Vcn3, Vcn2-bVcn3, Vcn4+Vcn5 впервые получены данные о существовании определенных структурных различий в последовательности генов нейраминидазы у холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп, особенно выраженных в его лидерной части.

- Выявлено, что вибрионы 0139 серогруппы различного происхождения и токсигенности отличаются своей способностью к расщеплению твин - 20, на основании чего предложен микробиологический тест для их дифференциации.

- Изучение комплекса молекулярно - генетических, биохимических и микробиологических признаков штаммов V. cholerae 0139 серогруппы различного происхождения позволяет утверждать о их генетической гетерогенности.

Теоретическая и практическая значимость

Обнаружение и изучение нейраминидазы у Vibrio cholerae 0139 расширило наши представления о патогенетических возможностях нового этиологического агента холеры. Различия в физико - химических свойствах ней-раминидаз вибрионов клинического и водного происхождения способствовали более углубленному пониманию биологических особенностей этих вибрионов, что позволило прийти к заключению об их неклональности. Сделанный вывод может иметь существенное эпидемическое значение.

Использование приемов биоинформатики, компьютерной геномики позволило спрогнозировать и экспериментально подтвердить не только некоторые свойства нейраминидазы Vibrio cholerae eltor, но и облегчило достижение поставленной цели по изучению фермента из вибрионов "Бенгал".

Полученные результаты нашли отражение в методических рекомендациях "Способность расщеплять твин - 20 как дифференциальный тест для вибрионов 0139 серогруппы различного происхождения", утвержденных Ученым Советом Ростовского - на - Дону научно - исследовательского противочумного института (13.05.1999) и опубликованных в виде реферата в Информационном выпуске № 12 "Холера и патогенные для человека вибрионы" (Ростов - на - Дону, 1999).

Депонирован штамм V. cholerae 4011 Аз биовар eltor. Особенностью штамма явилось отсутствие в составе его хромосомы гена, определяющего синтез нейраминидазы, и он может быть использован в научно - исследовательской работе в качестве штамма для изучения роли фермента в патогенезе холеры. Штамму присвоен номер V. cholerae КМ 198 Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" (Саратов, 2000).

Положения, выносимые на защиту :

1. Холерные вибрионы 0139 серогруппы различного происхождения продуцируют нейраминидазу.

2. Нейраминидазы из штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы, выделенных из клинических образцов и воды поверхностных водоемов, отличаются по ряду физико - химических свойств.

3. Структурная организация гена папН у штаммов V. cholerae Ol и 0139 серогруппы различного происхождения различна.

4. Штаммы холерных вибрионов 0139, выделенные из клинических образцов и воды поверхностных водоемов, не являются клональными.

Апробация работы

Результаты исследований были доложены на научных конференциях молодых ученых Ростовского - на - Дону государственного научно - исследовательского противочумного института в 1997 - 2000 гг. План диссертационной работы утвержден Ученым Советом РНИПЧИ 16.02.2001 г. Исследование выполнено в рамках плановой научйой темы : "Холерные вибрионы 0139 : распространение и свойства (№ 065) № гос. регистрации 01.9.50 003720 (Ростов-на-Дону, 1995- 1998).

12

Публикация результатов исследований

Основные положения диссертации отражены в 11 опубликованных работах.

Структура работы

Диссертация изложена на 162 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 83 работы отечественных и 151 зарубежных авторов. Текст иллюстрирован 19 таблицами и 22 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Дуванова, Ольга Викторовна

135 ВЫВОДЫ

1. Штаммы V. cholerae 0139 серогруппы, подобно другим представителям рода Vibrio, обладают способностью продуцировать внеклеточный фермент нейраминидазу.

2. Выделена, очищена и охарактеризована по некоторым физико - химическим и биологическим свойствам нейраминидаза из штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы, изолированных от человека и воды поверхностных водоемов.

3. В отличие от нейраминидаз из вибрионов классического и эльтор биова-ров фермент из клинических образцов V. cholerae 0139 не способен расщеплять флюорогенный субстрат - МУК, что может явиться его своеобразной меткой.

4. Фермент из штаммов V. cholerae 0139, выделенных из воды поверхностных водоемов, обладает способностью расщеплять МУК в отличие от нейраминидазы из штаммов V. cholerae 0139 клинического происхождения.

5. В состав одной серогруппы (V. cholerae 0139) могут входить вибрионы, синтезирующие нейраминидазу с различной субстратной специфичностью.

6. Исследования штаммов 0139 серогруппы в ПЦР с праймерами, синтезированными к гену нейраминидазы вибрионов эльтор, указывают на существование определенных структурных различий в районе лидерной последовательности генов, определяющих синтез фермента у этих вибрионов.

7. Компьютерный анализ показал, что нейраминидаза V. cholerae eltor не содержит в своей структуре цистеин, проявляя при этом нечувствительность к блокаторам сульфгидрильных групп, что оказалось характерным и для фермента из вибрионов 0139 серогруппы.

136

8. Наделенные нейраминидазамн с разными субстратными спектрами вибрионы 0139 серогруппы клинического (токсигенные) и водного (неток-сигенные) происхождения отличаются своей способностью к расщеплению твина - 20, на основании чего предложен микробиологический тест для их дифференциации.

9. Сравнительное генотипирование штаммов 0139 серогруппы, выделенных из материала от людей и воды поверхностных водоемов в однопрай-мерной ПНР с использованием праймера № 15, показало, что при общем сходстве геномов они существенно отличались друг от друга. Несмотря на наличие антигенного родства вибрионы 0139 серогруппы различного происхождения по комплексу молекулярно - генетических, биохимичеу ских и микробиологических признаков штаммов отличаются друг от друга, что позволяет считать их неклональными.

137

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение проблемы патогенности и вирулентности микробов показало, что одним из факторов, способствующих их реализации, являются бактериальные ферменты. Возникновение и развитие инфекционных заболеваний представляет собой, как известно, итог целого ряда последовательно протекающих биологических взаимодействий разной степени сложности, происходящих между макро - и микроорганизмом. При этом считается, что ведущая роль в патогенности микробов принадлежит их токсинам. Значительно меньше известно о болезнетворном влиянии ферментов возбудителей (Коб-ринский Г.Д., 1978; Езепчук Ю.В., 1985).

Как свидетельствуют многочисленные данные литературы, патоген-ность Vibrio cholerae носит выраженный полидетерминантный характер (Trucksis М. et al., 1998; Karaolis D.K.R. et al., 1998), хотя далеко не все ее факторы и их сочетания, необходимые для возникновения клинического заболевания, хорошо изучены.

К числу вспомогательных факторов вирулентности холерных вибрионов относят нейраминидазу, роль которой состоит в усилении связывания холерного токсина с эпителием кишечника и облегчении его проникновения внутрь эпителиоцитов, что повышает тяжесть диареи (Монахова Е. В. и др., 2001).

Несмотря на то, что холерные вибрионы 0139 серогруппы являются модельным объектом изучения различных сторон патогенности и предпринимаются попытки по всестороннему изучению их энзиматического потенциала, к началу наших исследований сведения о нейраминидазе штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы в литературе отсутствовали. Это и оп-* ределило цель настоящей работы, которая состояла в обнаружении и изучении нейраминидазы у холерных вибрионов 0139 серогруппы, выделенных из клинического материала и воды поверхностных водоемов.

В результате проведенного исследования удалось убедительно продемонстрировать способность штаммов новой эпидемически значимой серогруппы V. cholerae 0139 различного происхождения, подобно другим представителям рода Vibrio, продуцировать внеклеточный фермент нейрами-нидазу. Установлено, что все 17 выделенных из клинического материала штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы продуцировали нейрамини-дазу, до 80 % которой приходилось на внеклеточную форму. Средний показатель активности фермента в культуральной жидкости (при использовании в качестве субстрата муцина) составил 17,35 ± 1,22 НЕ/мл, тогда как гидролиз овомуцина был несколько слабее (7,98 ± 0,7 НЕ/мл). Фермент из культураль-ных жидкостей испытанных штаммов способностью расщеплять флюороген-ный субстрат 2-(4'-метилумбеллиферил) - N - ацетил - а - D -нейраминовой кислоты (МУК) не обладал. Среди исследованных штаммов встречались как высокоактивные (Р - 16063, Р - 16064, Р - 16068; Р - 16070), так и наделенные сравнительно низкой нейраминидазной активностью (Р - 16065). Отмеченные колебания величины нейраминидазной активности среди изученных штаммов, видимо, объясняются их индивидуальными особенностями.

Исследованные нами 12 штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы, выделенных из воды, при культивировании в жидкой среде также продуцировали внеклеточный фермент. Средний показатель активности составил 28,4 ±1,7 НЕ/мл при использовании муцина в качестве субстрата, но они легко расщепляли овомуцин и МУК. Среди взятых в эксперимент штаммов встречались варианты с высокой ферментативной активностью (Р - 17682, Р -17674, Р- 17675).

Для выделения и очистки фермента были выбраны штаммы V. cholerae 0139 серогруппы Р - 16064, выделенный из клинического материала, и Р -17682, выделенный из воды, и характеризовавшиеся стабильностью по признаку продукции нейраминидазы.

Исходя из целей выделения и очистки энзима, были подобраны оптимальные условия для получения культуральной жидкости с максимальной ферментативной активностью. Исследования показали, что температурный оптимум роста клеток штамма Р - 16064 приходился на 30 °С, а для штамма Р - 17682 - 35 °С, тогда как активность внеклеточной нейраминидазы в культу-ральной жидкости возрастала по мере роста культуры, достигая максимума к 12 часам.

Использованная схема очистки позволила получить препараты нейраминидазы из штамма V. cholerae Р - 16064 в виде активного белка гликопро-теиновой природы, что совпадает с данными, полученными при компьютерном анализе НК и соответствующей АК последовательностей гена нейраминидазы вибриона эльтор. Выделенный фермент четко окрашивался реактивом Шиффа (специфическим красителем на гликопротеины), что указывало на сложную природу белка с молекулярной массой не менее 260000 Da. При электрофоретическом анализе (без SDS) фермент располагался на границе разделяющего и концентрирующего гелей, причем замена 7,5 % ПААГ на 5% картину не меняла. При проведении электрофореза в денатурирующих условиях (0,1% SDS) нейраминидаза была представлена шестью "компонентами", молекулярная масса которых составляла 90000, 50000, 43000, 35000, 31000 и 10000 Da. Мы намеренно употребили термин "компоненты" из-за сложившегося в литературе мнения об отсутствии у нейраминидазы субъединиц (Rog-gentin P. et al., 1995), хотя у высших она может существовать, например, в виде комплекса с катепсином Аир- галактозидазой (Rottier RJ. et al., 1998). Можно предположить, что полученная нами нейраминидаза находится в агрегированном состоянии без потери каталитической активности.

Изучение субстратной специфичности показало, что выделенная нейраминидаза предпочтительнее расщепляла а - 2 - 3 связь нейраминиллактозы (степень гидролиза - 20,5 %), в то время как высокомолекулярные соединения со связью а - 2 - 6 и а - 2- 8 (муцины, овомуцин) гидролизовались значительно слабее (муцин - 6,8 %, овомуцин - 3,8 %). Сиалидаза вибрионов эльтор и классических расщепляла все эти субстраты с одинаковой интенсивностью (Езепчук Ю.В., 1985). Особенностью нейраминидазы из вибрионов 0139 серогруппы, выделенной из штаммов, полученных из клинического материала, была ее неспособность расщеплять синтетический субстрат МУК, что явилось своеобразной меткой. Ранее при исследовании широкого набора штаммов вибрионов различного таксономического положения Рябухиной О.Ю. и др. (1990) удалось показать, что способностью расщеплять синтетический субстрат обладали только штаммы холерных вибрионов 01 и не - 01 групп, выделенных от человека. Выявленная же инертность изучаемого фермента в отношении флюорогенного субстрата позволяет предположить наличие особенностей в его структуре, по меньшей мере, в районе каталитического центра.

Обнаружены также антигенные отличия от аналогичного фермента холерных вибрионов 01 серогруппы.

Очищенный препарат нейраминидазы активировался ионами кальция, бария, марганца, угнетался ЭДТА, ионами двухвалентного железа и полностью ингибировался SDS. Заметное ингибирующее действие на фермент ионов Fe , а также хелатообразующего агента 3DTA может явиться основанием для предположения о металлопротеиновой природе фермента.

Выделенный фермент оказался нечувствительным к известному бло-катору SH - групп N - этилмалеинимиду (5 mM) (Kruse S. et al., 1996), что может свидетельствовать в пользу отсутствия в его молекуле цистеина, подобно нейраминидазе эльтор вибриона, для которой эта особенность была выявлена по результатам компьютерного анализа. Отсутствие цистеина, а следовательно, SH - групп и дисульфидных связей, должно сопровождаться нечувствительностью активности фермента к блокаторам этих SH - групп и неучастием дисульфидных связей в фолдинге (McGinnes L.F., 1996, 1997), а также в формировании его вторичной и третичной структур. Содержание остатков цистеина в составе нейраминидаз других микроорганизмов колебалось от 1 до 20 : их было больше у вирусов (12-20 остатков) и меньше у бактерий (1-4 остатка).

Энзим из штамма Р - 16064 оказался относительно термостабилен. Оптимум рН действия приходился на 5,6, а Км для нейраминиллактозы составила 1,6x10 "3 М.

При выделении нейраминидазы из вибрионов водного происхождения были использованы, в основном, те же приемы, которые оказались эффективными при очистке фермента из штамма вибрионов 0139 серогруппы, выделенного от человека.

Использованная схема очистки позволила получить активные препараты нейраминидазы с удельной активностью 245 НЕ в виде белка гликопротеи-новой природы с молекулярной массой около 110000 Da. При проведении электрофореза в денатурирующих условиях нейраминидаза была представлена двумя "компонентами", молекулярная масса которых составляла 83000 и 26000 Da. Энзим характеризовался антигенными отличиями от аналогичного фермента холерных вибрионов 01 серогруппы, но проявлял антигенное родство с ферментом из штамма V. cholerae 0139 Р - 16064 клинического происхождения. Оптимум рН фермента - 5,6. Так же, как и энзим из штамма Р -16064, препарат нейраминидазы из штамма Р - 17682 был относительно термостабилен, активировался ионами кальция, бария, марганца, ингибировался 3DTA и ионами Fe и полностью SDS. Подобно нейраминидазе из выделенного от человека штамма вибрионов, он был нечувствителен к N - этилмале-инимиду. Энзим из штаммов V. cholerae 0139, выделенных из воды поверхностных водоемов, по способности расщеплять флюорогенный субстрат 2-(4'-метилумбеллиферил) - N - ацетил - а - D -нейраминовой кислоты и локализации в ПААГ без SDS напоминал фермент из эльтор и классических вибрионов и отличался от нейраминидазы из штаммов V. cholerae 0139 клинического происхождения. Таким образом, в состав одной серогруппы, к которой принадлежат вибрионы 0139, могут входить штаммы, синтезирующие нейрами-нидазу с различной субстратной специфичностью.

Препарат нейраминидазы из штамма V. cholerae 0139 серогруппы Р -17682, подобно энзиму из Е. coli НВ 101 pRD - 39, обладал биологической активностью, угнетая переваривающую способность макрофагов в отношении V. cholerae eltor 1310 и Y. pestis EV - 76 и усиливая цитопатический эффект этих микроорганизмов. К тому же он обладал цитотоксическим действием. Следует отметить, что супрессорный эффект препарата был более выражен в отношении Y. pestis EV - 76, чем V. cholerae eltor 1310.

Результаты изучения первичной аминокислотной последовательности нейраминидазы V. cholerae eltor, указывающие на присутствие мотивов протеин - фосфатазы 2С (остатки 331 - 340), 5' - нуклеотидазы (остатки 25 - 38), белкового домена взаимодействия с фосфотирозином (остатки 248 - 262) и др., явились причиной наших попыток обнаружения фосфатазной и 5' -нуклеотидазной активностей у препаратов фермента из штаммов холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп. Исследуемые препараты обладали четко выявляемой фосфорилирующей, дефосфорилирующей и фосфодиэстеразной активностями, способностью к аутофосфорилированию по остаткам треонина и тирозина, а также 5' - нуклеотидазной активностью, что подтвердило прогноз компьютерного анализа. Не исключено, что выявленные активности участвуют в феномене срочной модификации экспрессии нейраминидазы вибрионов в ответ на меняющиеся условия среды.

Для анализа нуклеотидной и аминокислотной последовательностей была использована приведенная и частично изученная в работе Galen J.E. et al. (1992) последовательность длиной в 2601 нуклеотид из клеток штамма

395 V. cholerae 01 (Огава) (номер при поступлении в GenBank М83562).

По данным компьютерного анализа, нейраминидаза холерного вибриона - гликопротеин с 13 равномерно распределенными по структуре гена сайтами гликозилирования. Аминокислотный состав характеризовался некоторым преобладанием полярных остатков (51,5 %) над неполярными (48,4 %). В целом белковая молекула заряжена отрицательно.

Результаты компьютерного анализа НК и соответствующей АК последовательностей гена нейраминидазы холерного вибриона биовара эльтор позволяют рассматривать нейраминидазу как биологически активную молекулу. В составе гена прослеживаются 112 CG - мотивов, что указывает на потенциальную иммуномодулирующую способность энзима, которая была отмечена Кобринским Г.Д. (1979) еще в 70 - х годах у препарата нейраминидазы из холерных вибрионов при лечении онкологических больных. В изучаемой молекуле фермента помимо обычных антигенных эпитопов выявлено 78 амфипатических аминокислот, способных к формированию, по данным De-Lisi С. и Berzofski J.А. (1985), стабильных структур, склонных к активации Т - клеток. В составе второго и последнего отрезков молекулы прослеживается структурный мотив типа X(D)(Q)NXXXXXP(I)(S)X, характерный для последовательностей, распознающих сайты связывания главного комплекса гисто-совместимости II класса (Rudensky A.G. et al., 1991; Cole G.A. et al., 1995), что позволяет предположить наличие у нейраминидазы холерного вибриона свойств, характерных для суперантигенов. Локализация подобных мотивов в составе "мышиного" токсина чумного микроба позволила в дальнейшем Мишанькину М.Б. (1997) экспериментально подтвердить наличие суперантигенных свойств у этого полифункционального белка Y. pestis.

Эти результаты могут оказаться важными для определения в будущем истинного биологического потенциала нейраминидазы.

Выполненный впервые компьютерный анализ НК и соответствующей АК последовательностей гена нейраминидазы Vibrio cholerae eltor, на основании которого предсказаны и экспериментально подтверждены некоторые свойства ферментов вибрионов G1 и 0139 серогрупп, лишний раз подтверждает перспективность и целесообразность использования методов биоинформатики для целенаправленного изучения свойств биологически активных молекул (Мишанькин М.Б. и др., 2000).

Сконструированные и синтезированные праймеры, предназначенные для выявления лидерной последовательности гена нейраминидазы вибрионов эльтор, были использованы нами для изучения структурной организации гена нейраминидазы у штаммов V. cholerae 0139 серогруппы различного происхождения. С помощью ПЦР при использовании праймеров Vcnl+Vcn3,

Vcn2+Vcn3, Vcn4+Vcn5 впервые получены данные о существовании определенных структурных различий в последовательности генов нейраминидазы у холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп, особенно выраженных в его ли-дерной части, что не могло не отразиться и на других свойствах энзима. Так, праймеры Vcnl + Vcn3 давали четкий сигнал с ДНК из вибрионов 01 серогруппы, но не с 0139.

Выявленные различия в отношении к МУК нейраминидаз штаммов 0139 серогруппы различного происхождения определило наш интерес к изучению их фено - и генотипических признаков на выявление возможных особенностей.

Сравнительное генотипирование штаммов V. cholerae 0139 серогруппы, выделенных из материала от людей и воды поверхностных водоемов в од-нопраймерной ПНР с использованием праймера № 15 показало, что при общем сходстве геномов они существенно отличались друг от друга. Однако штаммы, выделенные из клинического материала, проявляли большее сходство со штаммом V. cholerae 01 (Р - 5879), что совпадает с заключением о генетической близости клинических штаммов 01 и 0139 вибрионов (Jiang S.C. et al., 2000; Singh D.V. et al., 2001). Проведенные в этом направлении углубленные исследования Faruque S.M. et al. (2000) показали, что эпидемические и неэпидемические штаммы V. cholerae 0139 серогруппы имеют разное генетическое происхождение.

Несмотря на наличие антигенного родства, выделенные из клинических образцов и воды поверхностных водоемов вибрионы 0139, не являются клональными в силу существования больших различий в составе их хромосом, что было выявлено в результате ПЦР - генотипирования их ДНК с прай-мером№15. К тому же при сравнительном, изучении электрофореграмм водорастворимых белков штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы различного происхождения отмечено, что они отличались по белковому спектру как качественно, так и количественно.

Обнаружено, что наделенные нейраминидазами с разными субстратными спектрами вибрионы 0139 серогруппы клинического (токсигенные) и водного (нетоксигенные) происхождения хорошо росли на сконструированной дифференциальной среде, хотя и по-разному относились к субстрату твин

- 20. Оказалось, что все выделенные от людей токсигенные штаммы обладали способностью гидролизовать твин - 20, что выражалось в появлении вокруг макроколоний вибрионов четких, темных, непрозрачных зон диаметром 3-7 мм. Выделенные из воды нетоксигенные вибрионы такой способностью не обладали.

На основании этого был предложен тест для дифференциации холерных вибрионов 0139 серогруппы различного происхождения по способности гидролизовать твин - 20 и оформлены методические рекомендации (Дуванова О.В. и др., 1999). В работе были испытаны и твины - 40, -60, -80. Анализ полученных результатов показал, что все штаммы V. cholerae 0139 серогруппы, выделенные из клинического материала, обладали способностью гидролизовать субстраты (твин - 20, - 40, - 60). Исключение составил твин - 80, в отношении которого были инертны как штаммы, выделенные от людей, так и изолированные из воды, хотя Slifkin М. (2000) и удалось использовать твин - 80 для дифференциации различных видов Candida. Штаммы, выделенные от людей, имели фенотип Т20+ Т40+ Т6о+ Т8о", а штаммы, выделенные из воды, - Т20" Т40" TV Т8о". Таким образом, штаммы, изолированные из клинического материала, проявляли способность гидролизовать все твины за исключением твина

- 80, в отличие от штаммов, выделенных из воды, которые не гидролизовали испытанные субстраты.

Причины, лежащие в основе описанного наблюдения, еще только предстоит выяснить, но несложный тест на способность гидролизовать твины может оказаться полезным при эпидемическом расследовании случаев выделения холерных вибрионов 0139 серогруппы из различных источников.

При исследовании коллекции штаммов холерных вибрионов Ol серогруппы различного происхождения были выявлены три негативных по нейра

134 минидазе мутанта: № 4011 Аз и № 1381/291, выделенные из воды, а также № 4090 Аз, выделенный из материала от человека. Штамм № 4011 Аз, особенностью которого явилось отсутствие в составе его хромосомы гена, определяющего нейраминидазную активность, депонирован в коллекции института "Микроб". Он может быть использован в научно - исследовательских работах в качестве лишенного структурного гена папН штамма при изучении роли нейраминидазы в патогенезе холеры.

Обнаружение и изучение нейраминидазы у штаммов V. cholerae 0139 серогруппы расширило наши представления о патогенетических возможностях нового этиологического агента холеры. Различия в физико - химических свойствах нейраминидаз вибрионов клинического и водного происхождения явились причиной более углубленного изучения этих вибрионов, позволившего прийти к заключению об их неклональности, что имеет важное эпидемическое значение.

Проведенные исследования не претендуют на законченность. Напротив, они предполагают продолжение исследований как в плане выяснения структуры, свойств и механизмов регуляции активности и синтеза нейраминидазы, так и изучения ее как возможного суперантигена, вносящего свой вклад в особенности биологии возбудителя.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дуванова, Ольга Викторовна, Ростов-на-Дону

1. Асатиани B.C. Ферментные методы анализа. М.: Наука, 1969. 740 с.

2. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. JI.: Медгиз, 1962. 180 с.

3. Бугоркова С.А., Исупов И.В., Коннов Н.П. Морфологическая характеристика инфекционного процесса, вызванного холерными вибрионами не 01 группы 0139 серовара // Пробл. особо опасн. инф. Саратов, 1999. -Вып. 79. - С. 66 - 72.

4. Булат С.А., Кабоев O.K., Мироненко P.M. и др. Полимеразная цепная реакция с универсальными праймерами для изучения геномов // Генетика. -1992. -Т.28, № 5. С. 19-28.

5. Васильева Г.И., Пустовалов В.Л., Киселева А.К. Цитотоксическое действие фракций экстракта Y. pestis на культуру макрофагов // Мол. структуpa бактериальных токсинов и ген. контроль их биосинтеза : Тез. докл. 1 -ой Всесоюзн. конф. М., 1985. - С. 24.

6. Вертиев Ю.В. Факторы патогенности ферментативной природы // Факторы патогенности микроорг.: хим. природа, биол. функции и генетич. контроль : Тез. 2-го Всесоюз. симпоз. М., 1974. - С. 9 - 10.

7. Вертиев Ю.В., Езепчук Ю.В. Бактериальные нейраминидазы: некоторые физико химические и биологические свойства и связь их с патогенно-стью микробов // Вестн. АМН СССР. - 1973. - № 12. - С. 56 - 61.

8. Водопьянов С.О., Мишанькин М.Б., Олейников И.П. и др. Разработка сцособа выявления гена tcpA холерного вибриона биотипа эльтор и серо-варианта 0139 Бенгал с помощью полимеразной цепной реакции // Биотехнология. 1999.- № 6. - С. 19 - 23.

9. Гинцбург А.Л., Грижебовский Г.М., Токарская О.Н. и др. Изучение полиморфизма штаммов холерного вибриона разного происхождения методом геномной дактилоскопии // Генетика. 1989. - Т. 25, № 7. - С. 1320 - 1324.

10. Гликопротеины в 2 томах. - М.: Мир, 1969.

11. Дегтярева С.Н. Нейраминидаза не агглютинирующихся холерной О сывороткой вибрионов и ее некоторые физико - химические й биологические свойства : Автореф. дис. . канд. биол. наук. - Саратов, 1984. - 22 с.

12. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М. : Мир, 1966. - 816 с.

13. Дурихин К.В., Попова А.Е., Кобринский Г.Д. Продукция холерогена и нейраминидазы холерными вибрионами in vitro // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1976. - № 5. - С. 566 - 568.

14. Евлахова С.П., Мишанькин Б.Н. Протеолитическая и лецитиназная активность холерных вибрионов 0139 серовара // Пробл. сан. эпид. охраны территор. стран СНГ : Тез. докл. Международ, науч. - практ. конф. -Саратов, 1998.-С. 154 - 155.

15. Езепчук Ю.В. Биомолекулярные основы патогенности бактерий. М. : Наука, 1977. - 215 с.

16. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул. М.: Медицина, 1985.-240 с.

17. Езепчук Ю.В., Вертиев Ю.В., Дерендяева Т.Н. Субстратная специфичность бактериальных нейраминидаз // 4 Всесоюзн. биохим. съезд. Тез. науч. сообщ. Москва, 1979. - Т. 2. - С. 34 - 35.

18. Исаева Е.С., Чувакова З.К., Ким Э.В., Толмачева В.П. Структура нейраминидаз ортомиксовирусов // 4 Всесоюзн. биохим. съезд. Тез. науч. сообщ. Москва, 1979. - Т. 2. - С. 37.

19. Исупов И.В., Сагеева О.Ф., Елисеев Ю.Ю. и др. О роли нейраминидазы в происхождении дермонекротического эффекта при использовании некоторых антигенов Vibrio cholerae // Журн. микробиол., эпидемиол. и им-мунобиол. 1993. - № 1. - С. 7 - 11.

20. Карагозова А.В., Меньшикова Е.А. Характеристика штаммов Vibrio cholerae 0139 различного происхождения // Пробл. сан. эпид. охранытерритор. стран СНГ : Тез. докл. Международ, науч. практ. конф. - Саратов, 1998.-С.151-154.

21. Кобринский Г.Д. Об участии нейраминидаз бактерий в развитии заболеваний // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1978. - № 11. - С. 26 - 32.

22. Кобринский Г.Д. Фермент на службе онкологии // Природа. 1979. - № 7. -С. 20-28.

23. Котляр Т.В., Шатаева J1.K., Заикина Н.А. и др. Нейраминидаза непатогенных микроорганизмов рода Arthrobacter // Прикл. биох. и микробиол. 1989. - Т. 25. - Вып .4. - С. 467 - 472.

24. Кроткова М.Р. К методике изучения фагоцитарной реакции в культуре ткани // Лаб. дело. 1971. - № 7. - С. 421 - 423.

25. Кудрякова Т.А., Македонова Л.Д., Качкина Г.В., Саямов С.Р. Бактериофаги Vibrio cholerae 0139 // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммуноби-ол. 2000. - № 6. - С. 28-30.

26. Курбатова Е.М., Карагозова А.В. Выявление вибриоцинов у холерных вибрионов 0139 серогруппы // Пробл. комиссия "Холера и патоген, для человека вибрионы". Ростов - на - Дону, 2000. - Вып. 13. - С. 69 - 71.

27. Кутырев В.В., Куличинко А.Н., Булгакова Е.Г., Смирнова Н.И. Молеку-лярно генетические аспекты ПЦР - диагностики особо опасных инфекций // Генная диагн. особо опасн. инф. : Матер. 1 - й Всерос. науч. -практ. конф. - Саратов, 2000. - С. 14 -17.

28. Ленинджер А. Биохимия. М.: Мир, 1974. - 957 с.

29. Лдпкинд М.А., Цветкова И.В. Нейраминидаза миксовирусов // Успехи биол. химии. 1969. - Т. 10. - С. 138 - 163.

30. Ломов Ю.М., Мишанькин Б.Н., Мазрухо Б.Л. и др. Холерные вибрионы 0139 серовара : свойства и распространение // Пробл. комиссия "Холера и патоген, для человека вибрионы". Ростов - на - Дону, 1998. - Вып. 11.-С. 21 - 24.

31. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д.Г. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. - 479 с.

32. Меньшикова Е. А., Подосинникова Л.С. Гемолитическая активность vct + H'vct' штаммов холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп // Пробл. комиссия "Холера и патоген, для человека вибрионы". Ростов - на - Дону, 2000.-Вып. 13.-С. 68-69.

33. Микробиология и лабораторная диагностика холеры (Краткое руководство). Ростов - на - Дону, 1975. - С. 124.

34. Мишанькин Б.Н., Романова JI.B., Ломов Ю.М. и др Vibrio cholerae 0139, выделенные от людей и из воды открытых водоемов : сравнительное ге-нотипирование // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2000. -№ 3. - С. 3 - 7.

35. Мишанькин Б.Н., Шиманюк Н.Я., Рябухина О.Ю. и др. Молекулярное клонирование генов нейраминидазы Vibrio cholerae El Tor : перспективы использования // Вест, всесоюз. микробиол. об ва. - Ростов - на - Дону, 1989. - Вып. 1.-С. 149- 156.

36. Мишанькин М.Б. Структурно функциональная характеристика "мышиного" токсина чумного микроба : Автореф. дис. . канд. мед. наук. -Ростов - на - Дону, 1997. - 20 с.

37. Николов П., Тодоров Т.Х., Абрашев И. Нейраминидазная активность L-форм Erysiopelothrix // Acta microbiol., virol. et immunol. 1977. - Vol. 5. -P. 18-21.

38. Орлова Н.Г., Мехедов Л.Н. Сравнительное изучение нейраминидазной активности двух штаммов вируса гриппа типа А2 // Вопр. вирусол. -1970.-№3.-С. 341 -346.

39. Осин А.В., Ерошенко Г.А., Коннов Н.П. и др. Фенотипический и генетический анализ штаммов Vibrio cholerae 0139 серогруппы, выделенных из внешней среды // Пробл. особо опасн. инф. Саратов, 2000. - Вып. 80. -С. 93- 100.

40. Осин А.В., Щелканова Е.Ю., Заднова С.П., Ерошенко Г.А. Изучение фе-нотипических особенностей авирулентного штамма 0139 серогруппы Vibrio cholerae KM 115 // Пробл. особо опасн. инф. Саратов, 1999. -Вып. 79.-С. 169- 175.

41. Павлович Н.В., Шиманюк Н.Я., Мишанькин Б.Н. Нейраминидазная активность у представителей рода Francisella // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1992. - № 9 -10. - С. 8 -10.

42. Погорелова Т.Н., Друккер Н.А., Орлов В.И., Крукиер И.И. Прогностическое значение определения активности нейраминидазы в секрете молочных желез при внутриутробной гибели плода // Биохимия. 1997. - № 1. -С. 23 - 24.

43. Родионова И.В. К методике определения твиназ у Francisella tularensis и Fransisella novicida // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1983. -№3.- С. 104- 105.

44. Рябухина О.Ю., Шиманюк Н.Я., Мишанькин Б.Н. Опрделение нейраминидазы у вибрионов 01 и не 01 групп // Лаб. дело 1990. - № 8. - С. 63 -65.

45. Сергеева Л.А. Содержание нейраминовой кислоты в крови у больных брюшным тифом // Ранняя диагностика и лечение инф. болезней : Матер, всесоюз. конф. Т. 2. - Ленингнад, 1969. - С. 158 - 159.

46. Соловьев В.Д., Кобринский Г.Д., Гальцева Г.В., Саямов P.M. О роли нейраминидазы холерных вибрионов в патогенезе экспериментальной холеры // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1975. - № 5. - С. 94 -99.

47. Статистические таблицы для экспресс обработки экспериментального и клинического матерала : Методические рекомендации / Сост. Р.Б. Стрелков. - Обнинск, 1980. - 19 с.

48. Смирнова Н.И., Ерошенко Г.А., Ливанова Л.Ф. и др. Генетический анализ Vibrio cholerae серогруппы 0139 // Пробл. комиссия "Холера и патоген. для человека вибрионы". - Ростов - на - Дону, 2000. - Вып. 13. - С.98 99.

49. Стент Г., Кэлиндар Р. Молекулярная генетика. М.: Мир, 1981. - 646.

50. Тафельштейн Э.Е., Блинова Л.С. Локализация и активность нейраминидазы холерных вибрионов // Науч. докл. высш. школы. Биологические науки. 1979.- №6. -С. 18-20.

51. Тихонов Н.Г. Роль некоторых ферментов холерного вибриона в обеспечении жизнеспособности микробной клетки и развитии инфекционного процесса при холере // Генетика и биохимия вирулент. возбудит, особо опасн. инф : Тез. докл. Волгоград, 1992. - С. 136.

52. Тюкавкина Н.А., Бауков Ю.И. Биоорганическая химия М. : Медицина, 1985.-477 с.

53. Холера в СССР в период VI пандемии / Под ред. В.И. Покровского. М.: Медицина, 2000. - 472 с.

54. Цветкова И.В. Альдолаза нейраминовой кислоты и нейраминидаза в тканях животных // Биохимия. 1965. - Т. 30. - Вып. 2. - С. 407 - 414.

55. Чрлядинова А.В. Изучение биологических свойств холерных вибрионов 0139 серогруппы : Автореф. дис. канд. мед. наук. Ростов - на - Дону, 2000.- 18 с.

56. Шапот B.C. Нуклеазы. М.: Медицина, 1968. - 212 с.

57. Шатаева Л.К., Чернова И.А., Самсонов Г.В. и др. Выделение и свойства нейраминидазы холерных вибрионов // Вопр. мед. химии. 1978. - № 4. -569 - 572.

58. Шевченко Л.А., Филякина Е.С., Мишанькин Б.Н. Фосфатазная активность у представителей Vibrio cholerae 0139 "Бенгал" // Пробл. комиссия

59. Холера и патоген, для человека вибрионы". Ростов - на - Дону, 1999. -Вып. 12.-С. 77-78.

60. Шевченко JI.A., Рябухина О.Ю., Мишанькин Б.Н. Иммобилизованная форма аденилатциклазы возбудителя чумы : получение и устранение ин-гибирующего влияния ионов неорганического фосфата // Биотехнология. 1992. - № 3. - С. 44 - 46.

61. Шиманюк Н.Я., Мишанькин Б.Н. Влияние температуры культивирования на ферменты метаболизма сиаловых кислот у чумного микроба // Микробиол. журнал. 1982. - Т. 44 - Вып. 6. - С. 49 - 53.

62. Шиманюк Н.Я., Мишанькин Б.Н. Выделение и очистка нейраминидазы Yersinia pestis // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1983. -№9.-С. 70-74.

63. Шиманюк Н.Я., Мишанькин Б.Н. Нейраминидаза Esherichia coli // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1986. - № 1. - С. 31 - 35.

64. Шиманюк Н.Я., Мишанькин Б.Н., Куренная И.И. Нейраминидазная активность у представителей рода Yersinia // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1977. - № 5. - С. 51 - 54.

65. Шиманюк Н.Я., Мишанькин Б.Н., Рябухина О.Ю. Получение очищенной нейраминидазы Vibrio cholerae eltor // Биотехнология. 1991. - № 4. - С. 17-18.

66. Шиманюк Н.Я., Мишанькин Б.Н., Рябухина О.Ю., Родионова А.В. Нейраминидазная активность возбудителя псевдотуберкулеза // Совр. аспекты проф. зооноз. инф : Тез. докл. к Всесоюз. науч. конф. спец. противо-чум. учр. Иркутск, 1984. - ч. 3. - С. 55 - 56.

67. Шиманюк Н.Я., Мордвинцева Т.Г., Мишанькин Б.Н. Полимиксинацилаз-ная активность V. cholerae 0139 "Бенгал" // Пробл. комиссия "Холера и патоген, для человека вибрионы". Ростов - на - Дону, 1999. - Вып. 12. -С. 76 - 77.

68. Шиманюк Н.Я., Рябухина О.Ю., Мишанькин Б.Н. Природные и синтетические субстраты для нейраминидазы холернных вбрионов // Обл. науч. -практ. конф. по пробл. "Холера". Тез. докл. Ростов - на - Дону, 1984. - С. 68 - 69.

69. Шиманюк Н.Я., Шишияну М.В., Дуванова О.В., Мишанькин Б.Н. Уреаз-ная активность V. cholerae 0139 "Бенгал" // Пробл. комиссия "Холера и патоген, для человека вибрионы". Ростов - на - Дону, 1999. - Вып. 12. -С. 75 - 76.

70. Шопырева С.В. Vibrio cholerae не 01/не 0139 : генетическое картирование хромосомы и изучение возможности обмена генами О антигена между холерными вибрионами разных серогрупп : Автореф. дис. . канд. биол. наук. - Саратов, 2000. - 22 с.

71. Шубин Г.Г., Мишанькин Б.Н., Дуванова О.В. Нитрификация и денитри-фикация у холерного вибриона // Пробл. комиссия "Холера и патоген, для человека вибрионы". Ростов - на - Дону, 2000. - Вып. 13. - С. 80 - 82.

72. Ada G.L., French E.L. Purification and properties of neuraminidase from Vibrio cholerae // J. Gen. Microbiol. -1961 Vol. 24, № 3. - P. 409 - 421.

73. Albert M.J., Siddique A.K., Islam M.S. et al. Large outbreak of clinical cholera due to Vibrio cholerae non Ol in Bangladesh // Lancet. - 1993. - Vol. 341,№8846.-P. 704.

74. Alhadeff S.I., Jack A. Solubilization, stabilization and isoelectric focusing of human liver neuraminidase activity // Biochem. Biophys. Acta. 1984. - № 2. -P. 159 - 165.

75. Arora D.S., Tijssen P., Dea S., Henrichon M. Complete sequences of the neuraminidase genes of swine influenza viruses (HINi) associated with the respiratory disease in pigs // Virus genes. 1997 - Vol.14, № 3. - P. 251 - 254.

76. Beltran P., Delgado G., Navarro A. et al. Genetic diversity and population structure of Vibrio cholerae // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37, № 3. - p. 581 -590.

77. Berche P., Poyart C., Abachin E. et al. The novel epidemic strain 0139 is closely related to the pandemic strain 01 of Vibrio cholerae // J. Infect. Dis.-1994. Vol. 170, № 3. - P. 701 - 704.

78. Berg Y.O., Lindqvist L., Andersson G., Nord C.E. Neuraminidase Bacteroides fragilis // Appl. Environ. Microbiol. 1983. - Vol. 46, № 1. - P. 75 - 80.

79. Berry A.M., Lock R.A., Paton J.C. Cloning and characterization of nanB, a second Streptococcus pneumoniae neuraminidase gene, and purification of the NanB enzyme from recombinant Escherichia coli // J. Bacteriol. 1996. - Vol. 178.-P. 4854-4860.

80. Berry A.M., Paton J. C., Glare E.M. et al. Cloning and expression of the pneumococcal neuraminidase gene in Escherichia coli // Gene. 1988. - Vol. 71.-P. 299-305.

81. Bhaskaran K., Rowley D. Nutritional studies of Vibrio cholerae // J. Gen. Microbiol. 1956. - Vol. 15. - P. 417 - 422.

82. Bonten E., Spoel A., Fornerod M. et al. Characterization of human lysosomal neuraminidase defines the molecular basis of the metabolic storage disorder sialidosis // Genes and Development. 1996. - Vol. 10. - P. 3156 - 3169.

83. Bosman H.B. Red cell hydrolases III. Neuraminidase activity in isolated human eryhrocyte plasma membranes // Voxsang. 1974. - Vol. 26, № 6. - P. 497-512.

84. Boyd E.F., Moyer K.E., Shi L., Waldor M.K. Infections СТХФ and the Vibrio pathogenicity island prophage in V. mimicus : evidence for recent horizontal transfer between V. mimicus and V. cholerae // Infect. Immun. 2000. - Vol. 68, №3.- P. 1507- 1513.

85. Boyd E.F., Waldor M.K. Alternative mechanism of cholera toxin acquisition by Vibrio cholerae : generalized transduction of CTXtp by bacteriophage CP -T1 // Infect. Immun. 1999. - Vol. 67, № 11. - P. 5898 - 5905.

86. Burge C., Campbell A.M., Karlin S. Over and under-representation of short oligonucleotides in DNA sequences // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1992. - Vol. 89. -P. 1358- 1362.

87. Burmeister W.P., Daniels R.S., Dayan S. et al. Sequence and crystallization of influenza vims В /Beijing/1/87 neuraminidase // Virology. 1991. - Vol. 180.- P. 266 272.

88. Burmeister W.P., Ruigrok R.W. Cusack S. The 2.2 A resolution crystal structure of influenza В neuraminidase and its complex with sialic acid // EMBO J.- 1992.-Vol. 11.-P. 49-56.

89. Burnet F.M., Stone J.D. The receptor destroying enzyme of V. cholerae // Austr. J. Exp. Biol. Med. Sci. 1947. - Vol. 25. - P. 227 - 233.

90. Calia K.E., Murtagh M., Ferraro M.I., Calderwood S.B. Comparison of Vibrio cholerae 0139 with V. cholerae 01 classical and EL Tor biotypes // Infect. Immun. 1994. - Vol. 62, № 4. - P. 1504 - 1506.

91. Camara M., Boulnois G.J., Andrew P.W., Mitchell T. J. A neuraminidase from Streptococcus pneumoniae has the features of a surface protein // Infect. Immun. 1994. - Vol. 62. - P. 3688 - 3695.

92. Cardone M.H., Roy N., Stennieke H.R. et al. Regulation of cell death protease caspase 9 by phosphorylation // Science. - 1998. - Vol. 282, № 5392. - P. 1318-1321.

93. Chakraborty S., Mukhopadhyay A.K., Bhadra R.K. et. al. Virulence genes in environmental strains of Vibrio cholerae // Appl. Environ. Microbiol. 2000. -Vol. 66, №9.-P. 4022-4028.

94. Cohen P. The structure and regulation of protein phosphatase // Annu. Rev. Biochem. 1989. - Vol. 58. P. 453 - 508.

95. Colacino J.M., Chirgadze N.Y., Garman E. et al. A single sequence change destabilizes the influenza virus neuraminidase tetramer //Virology. 1997. - Vol. 236, № l.-P. 66-75.

96. Cole G.A., Tao Т., Hogg T.L. et al. Binding motif predict major histocompatibility complex class II restricted epitopes in the Sendai virus M protein // J. Virol. - 1995. - Vol. 69, № 12. - P. 8057 - 8060.

97. Collins C.H., Lyne P.M., Grange J.M. Species of opportunist and other myco-bactereia // Microbiol. Methods. 6 th edition. London. - 1989. - P. 358 - 362.

98. Comstock L.E., Maneval D., Panigrahi P. et al. The capsule and О antigen in Vibrio cholerae 0139 Bengal are associated with a genetic region not present in Vibrio cholerae 01 // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63, № 1 - P. 317 - 323.

99. Crenells S., Garman E.F., Laver W.G. et al. Crystal structure of Vibrio cholerae neuraminidase reveals dual lectin like domains in addition to the catalytic domain // Structure. - 1994. - Vol. 2. - P. 535 - 544.

100. Crennell S.J., Garman E.F., Laver W.G. et al. Crystal structure of a bacterial sialidase (from Salmonella typhimurium LT2) shows the same fold as an influenza virus neuraminidase. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1993. - Vol. 90. - P. 9852 - 9856.

101. Crennell S J., Garman E.F., Philippon C. et al. The structures of Salmonella typhimurium LT2 neuraminidase and its complexes with three inhibitors at high resolution // J. Mol. Biol. 1996. - Vol. 259. - P. 264 - 280.

102. DeLisi C., Berzofski J.A. T cell antigenic sites tend to be amphipathic structures // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1985. - Vol. 82. - P. 7048 - 7052.

103. Drzeniek R. Viral and bacterial neuraminidases 11 Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1972. - Vol. 59. - P. 35 - 75.

104. Dumontier S., Berche P. Vibrio cholerae 022 might be a putative source of exogenous DNA resulting in the emergence of the new strain of Vibrio cholerae 0139 // FEMS Microbiol. Lett. 1998. - Vol. 164, №1. - P. 91 - 98.

105. Dumontier S., Trieu Cuot P., Berche P. Structural and functional characterization of IS 1358 from Vibrio cholerae // J. Bacteriol. - 1998. - Vol. 180, № 23.-P. 6101 -6106.

106. Enzyme nomenclature. Orlando : Acad. Press. - 1984.- 646 p.

107. Farina C., Luzzi I., Lorenzi N. Vibrio cholerae 02 sepsis in a patient with AIDS // Eur. J. Clin. Infect. Dis. 1999. - Vol. 18, № 3. - P. 203 - 205.

108. Faruque S.M., Alim A.R.M.A., Roy S.K. et al. Molecular analysis of rRNA and cholera toxin genes carried by the new epidemic strain of toxigenic Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 32. - P. 1050- 1053.

109. Faruque S.M., Saha M.N., Asadulghani, et al. Genomic diversity among Vibrio cholerae 0139 strains isolated in Bangladesh and India betwen 1992 and 1998 // FEMS Microbiol. Lett. 2000. - Vol. 2. - P. 254 - 279.

110. Frisch A., Neufeld E.F. A rapid and sensitive assay for neuraminidase: application to cultured fibroblasts // Anal. Biochem. -1979. Vol. 95, № 1. - P. 222 - 227.

111. Galen I.E., Ketley J.M., Fasano A., Richardson S.H. et al. Role of Vibrio cholerae neuraminidase in the function of cholera toxin // Infect. Immun. 1992. -Vol. 60.-P. 1358- 1362.

112. Gallut J., Quiniou J. Взаимодействие вибрионов классической холеры, биотипа Эль Тор и вибрионов НАГ // Бюлл. ВОЗ. 1971. - Т. 42, № з. с. 480-482.

113. Girard J.P., Fernandes B. Studies on the mitogenic activity of trypsin, pronase and neuraminidase on human peripheral blood lymphocytes // Eur. J. Clin. Invest. 1976. - Vol. 6. - P. 347 - 353.

114. Gooley A., Williams K. How to find, identify and quantitate the sugars on proteins //Nature. 1997. - Vol. 385, № 6616. - P. 557 - 559.

115. Goto H., Kawaoka Y. A novel mechanism for the acquisition of virulence by a human influenza A virus // Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. - Vol. 95. - P. 10224 - 10228.

116. Gottschalk A. The chemistry and biology of sialic acids and related substances //Cambridge, London. New York 1960.

117. Gottschalk A., Bhargava A.S. Neuraminidases // J. Enzymes 1971. Vol. 5. -P. 321 -342.

118. Gross R., Rappuoli R. Pertussis toxin promoter sequences involved in modulation // J. Bacteriol. 1989. - Vol. 171, № 7. - P. 4026 - 4030.

119. Harth G., Haidaris C.G., So M. Neuraminidase from Trypanosoma cruzi: analysis of enhanced expression of the enzyme in infectious forms // Proc. Natl. Acad. Sci. 1987. - Vol. 84. - P. 8320 - 8324.

120. Hayden F.G., Osterhaus A.D.M.E., Treanor J.J. et al. Efficacy and safety of the neuraminidase inhibitor zanamivir in the treatment of influenzavims infections // New Engl. J. Med. 1997. - Vol. 337, № 13. - P. 874 - 880.

121. Heidelberg J.F., Eisen J.A., Nelson W.C. et al. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae // Nature. 2000. - Vol. 406. - P. 477 - 483.

122. Henningsen M., Roggentin P.,Schauer R. Cloning, sequencing and expression of the sialidase gene from Actinomyces viscosus DSM 43798 // Biol. Chem. Hoppe Seyler. -1991. - Vol. 372. - P. 1065 - 1072.

123. Hochhut В., Marrero J., Waldor M.K. Mobilization of plasmids and chromosomal DNA mediated by the SXT element, a constin found in Vibrio cholerae 0139 // J. Bacteriol. 2000. - Vol. 182, № 7. - P. 2043 - 2047.

124. Hoyer L.L., Hamilton A.C., Steenbergen S.M., Vimr E. R. Cloning, sequencing and distribution of the Salmonella typhimurium LT2 sialidase gene, nanH, provides evidence for interspecies gene transfer // Mol. Microbiol. 1992. -Vol. 6. - P - 873 - 884.

125. Hubertus N., Fritz Z. Neuraminidase aus Lactobacillus bifidus var. Pennsyl-vanicus // Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. - 1972. - Vol. 353, № 6. - P. 1015-1016.

126. Hubertus N., Ulbrich H., Fritz Z. Isolation, pyrification, and properties of neuraminidase from propionibacterium acnes // Zbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. I. Abt. Orig. 1980. - Bd. 247, № 1. - S. 84 - 94.

127. Ingole К. V., Jalgaonkar S.Y., Fule R.P. Study of proteases and other enzymes of Vibrio cholerae 01 ElTor and 0139 serotypes isolated in Yavatmal (Maharashtra) // Ind. J. Pathol. Microbiol. 1998. - Vol. 41, № 4. - P. 419 - 422.

128. Jiang S.C., Matte M., Matte G. et al. Genetic diversity of clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae determined by amplified fragment lenght polymorphism fingerprinting // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - Vol. 66, № 1.-P. 148- 153.

129. Johnson J.A., Salles C.A., Panigrahi P. et al. Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal is closely related to Vibrio cholerae El Tor but has important differences // Infect. Immun. 1994. - Vol. 62, № 5. - P. 2108 - 2110.

130. Kabayo J.P., Hutchinson D.W. Studies on a neuraminidase from Streptomyces griseus // FEBS Lett. 1977. - Vol. 78, № 2. - P. 221 - 224.

131. Kabir S., Ahmad N., Ali S. Neuraminidase production by Vibrio cholerae 01 and other diarrheagenic bacteria // Infect. Immun. 1984. - Vol. 44, № 3. - P. 747 - 749.

132. Kado C.I., Liu S.T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmid // J. Bacteriol. -1981. Vol. 145, № 3. - P. 1365 - 1373.

133. Karaolis D.K.R., Johnson J.A., Bailey C.C. et al. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains // Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. - Vol. 95. - P. 3134 - 3139.

134. Kelly R.T., Greiff D., Farmer S. Neuraminidase activity in Diplococcus pneumoniae // J. Bacteriol. 1966. - Vol. 91. - P. 601 - 603.

135. Kenney L.J., Bauer M.D., Silhavy TJ. Phosporylation dependent conformational changes in OmpR, an osmoregulatory DNA - binding protein of Escherichia coli 11 Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. - Vol. 92, № 19. - P. 8866 -8870.

136. Khetawat G., Bhadra R.K., Nandi S., Das J. Resurgent Vibrio cholerae 0139 : rearrangement of cholera toxin genetic elements and amplification of rrn op-eron // Infect. Immun. 1999. - Vol.67, № 1. - P. 148 - 154.

137. Khorlin A.Y., Privalova I.M., Zakstelskaya L.Y., Molibod E.V. Synthetic inhibitors of Vibrio cholerae neuraminidase and neuraminidases of some influenza virus strains // FEBS Lett. 1970. - Vol. 8, № 1. - P. 17 - 19.

138. Kimura Y., Matsunada H., Yasuda N. et al. Polymyxin acilase : a new enzyme for preparing starting materials for senusynthetic polymyxin antibiotics // Ag-ric. Biol. Chem. 1989. - Vol. 51, № 6. - P. 1617 - 1623.

139. Kovamees J., Blixenkrone Moller M., Norrby E. The nucleotide and predicted amino acid sequence of the attachment protein of canine distemper virus//Virus Res. -1991. - Vol. 19. - P. 223-234.

140. Kruse S., Rommerencke J., Roggentin P. et al. Influence of cysteine modifications on the activity of a clostridial sialidase // 8 International Congress of Bacteriol. Appl. Microbiol. Jerusalim, Israel; august 18 23. - 1996. - P. 121.

141. Li W., Escarpe P.A., Eisenberg E.J. et al. Identification of GS 4104 as an orally bioavailable prodrug of the Influenza virus neuraminidase inhibitor GS 4071 // Antimicrob. Agents Chemother. 1998. - Vol. 42, № 3. - P. 647 - 653.

142. Lovell D.J., Bibel D.J. Tween 80 medium for differentiating nonpigmented Serrata from other Enterobacteriaceae // J. Clin. Microbiol. 1997. Vol. 5, № 2 . - P. 245-247.

143. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L. et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. -1951. P. 193-265.

144. Marin C., Mosquera J., Rodriguez Iturbe B. Neuraminidase promotes neutrophil, lymphocyte and macrophage infiltration in the normal rat kidney // Kidney International. - 1995. - Vol. 47. - P. 88 - 95.

145. Masai К., Shigeru I., Atsushi K. Fluorometric assay of sialidase activity using sialyl oligosaccharide derivatives. // Glycoconyugates : 6. Int. Symp. Tokyo; sep. 20 25. - 1981. - P. 462 - 463.

146. McGinnes L.W. Disulfide bond formation is a determinant of glycosylation site usage in the hemagglutinin- neuraminidase glycoprotein Newcastle disease virus // J. Virology. 1997. - Vol. 71, № 4. - P. 3083 - 3089.

147. McGinnes L.W. Role of cotranslational disulfide bond formation in the folding of the hemagglutinin neuraminidase protein of Newcastle disease virus // Virology. - 1996. - Vol. 224, № 2. - P. 465 - 476.

148. Milligan T.W., Mattingly H., Straus D.C. Purification and partial characterization of neuraminidase from type 3 group B. streptococci // J. Bacteriol. 1980. -Vol. 144.-P. 164- 172.

149. Mizunoe Y., Wai S.N.,Takade A.,Yoshida S.I. Isolation and characterization of rugose form of Vibrio cholerae 0139 strain MO 10 // Infect. Immun. -1999. Vol. 67, № 2. - P. 958 - 963.

150. Mooi F.R., Bik E.M. The evolution of epidemic Vibrio cholerae strains // Trends Microbiol. 1997. - Vol. 5, №> 4. - P. 161 -165.

151. Myers R.W., Lee R.T., Lee Y.C. et al. The synthesis of 4 methylumbelliferyl a - ketoside of N - acetylneuraminic acid and its use in a fluorometric assay for neuraminidase //Anal. Biochem. - 1980. - Vol. 101, № 1. - P. 166 - 174.

152. Muller H.E. Neuraminidase als Pathogenitatsfaktor bei mikrobiellen Infek-tionen // Zbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. I. Abt. Orig. 1976. - Bd. 235, № 1 -3.-P. 106-110.

153. МйПег H.E. Occurrence of neuraminidase and acylneuraminate pyruvate lyase in a strain of Vibrio falling into Heiberg's group II isolated from a patient with diarrhea // Infect. Immun. 1973. - Vol. 8, № 3. - P. 430 - 433.

154. Muller H.E. Uber das Vorkomme'n von Neuraminidase bei Corynebacterium acnes // Zbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. I Abt. Orig. 1971. - Bd. 156. - S. 240 - 249.

155. Mbller H.E. Neuraminidases of bacteria and protozoa and their pathogenetic role // Behring Inst. Mitt. 1974. - Vol. 55. - P. 34 - 56.

156. Neubert W.J., Willenbrink W. Cloning and sequencing of the HN gene of Sendai virus (strain Fushimi) // Nucleic Acids Res. 1990. - Vol. 18. - P. 6427.

157. Ouchterlony O. Antigen antibody reactions in gels // Arkiv. Mineral. Acad. -1949.-Vol. 26, №14.-P. 1-9.

158. Pardoe G.I. The inducible neuraminidases of pathogenic microorganisms // Behring Inst. Mitt. 1974. - Vol. 55. - P. 103 - 122.

159. Paton J.C., Berry A.M., Lock R.A. et al. Cloning and expression in Escherichia coli of the Streptococcus pneumoniae gene encoding pneumolysin // Infect. Immun. 1986. - Vol. 54. - P. 50 - 55.

160. Potier M., Mameli L., Belisle M. et al. Fluorometric assay of neuraminidase with a sodium (4 methylumbelliferyl - a - D - N - acetylneuraminate) substrate // Anal. Biochem. - 1979. - Vol. 94, № 2. - P. 287 - 296.

161. Potter E.V., Shaughnessy M.A., Poon King Т., Earle D.P. Streptococcal neuraminidase and acute glomerulonephritis // Infect. Immun. - 1982. - Vol. 38. - P. 1196- 1202.

162. Preston L.M., Xu Q., Johnson J.A., et al. Preliminary structure determination of the capsular polysaccharide of Vibrio cholerae 0139 Bengal A 11837 // J. Bacteriol. 1995. - Vol. 177, № 3. - P. 835 - 838.

163. Prioli R.P., Mejia J.S., Aji T. et al. Trypanosoma cruzi : Localization of neuraminidase on the surface of trypomastigotes // Trop. Med. Parasitol. -1991.-Vol. 42.-P. 146- 150.

164. Rafferty J.B., Somers W.S., Saint Girons I., Philips S.E.V. Three - dimensional crystal structures of Escherichia coli met repressor with and without corepressor//Nature. - 1989. - Vol. 341. - P. 705 - 710.

165. Ramamurthy T.S., Garg S., Sharma G.R. et al. Emergence of novel strain of Vibrio cholerae with epidemic potential in southern and eastern India // Lancet. 1993. - Vol. 341, № 8846. - P. 703 - 704.

166. Ribeiro S., Alviano C. S., Silva Filho F.C. et al. Sialic acid is a cell surface component of Entamoeba invadens trophozoites // Microbios. - 1989. - Vol. 57.-P. 121-129.

167. Rivas M.S., Toma S., Miliwelsky E. et al. Cholera isolates in relation to the "eighth pandemic" // Lancet. 1993. - Vol. 342, № 8876. - P. 926 - 927.

168. Roggentin P., Kleineidam R.G., Schauer R. Diversity in the properties of two sialidase isoenzymes produced by Clostridium perfringens spp. // Biol. Chem. 1995.-Vol. 376. -P. 569 -575.

169. Roggentin P., Rothe В., Kaper J.B. et al. Conserved sequences in bacterial and viral sialidases // Glycoconjugate. 1989. - Vol. 6. - P. 349 - 353.

170. Roggentin P., Rothe В., Lothspeich F., Schauer R. Cloning and sequencing of a Clostridium perfringens sialidase gene // FEBS Lett. 1988. - Vol. 238, № 1. -P.31-34.

171. Roggentin Т., Kleinneidam R.G., Schauer R., Roggentin P. Effects of site -specific mutations on the enzymatic properties of a sialidase from Clostridium perfringens // Glycoconjugate. 1992. - Vol. 9. - P. 235 - 240.

172. Rothe В., Roggentin P., Frank R. et al. Cloning, sequencing and expression of a sialidase gene from Clostridium sordellii G 12 // J. Gen. Microbiol. 1989. -Vol. 135,№ 11.-P. 3087-3096.

173. Rottier R.J., Bonten E., d'Azzo A. A point mutation in the neu -1 locus causes the neuraminidase defect in the SM / J mouse // Human Mol. Genetics. 1998. -Vol. 7, №2. -P. 312 -321.

174. Rudensky A.J., Preston Hurlburt P., Hong S.C. et al. Sequence analysis of peptides bound to MHC class II molecules // Nature. - 1991. - Vol. 353. - P. 622 - 627.

175. Russo T.A., Thompson J.S., Godoy V.G., Malamy M. H. Cloning and expression of the Bacteroides fragilis TAL2480 neuraminidase gene, nanH, in Escherichia coli // J. Bacteriol. 1990. - Vol. 172, № 5. - P. 2594 - 2600.

176. Saito Т., Kawaoka Y., Wabster R.G. Loss of glycosylation at Asn 144 alters the substrate preference of the № 8 influenza A virus neuraminidase // J. Vet. Med. Sci. - 1997. - Vol. 59, № 10. - P. 923 - 926.

177. Saito Т., Kawaoka Y., Webster R.G. Phylogenetic analysis of the N8 neuraminidase gene of influenza A viruses // Virology. 1993. - Vol. 193. - P. 868 -876.

178. Sakurada К., Ohta Т., Hasegawa M. Cloning, expression, and characterization of the Micromonospora viridifaciens neuraminidase gene in Streptomyces lividans // J. Bacteriol. 1992. - Vol. 174. - P. 6896 - 6903.

179. Sarkar B.L., De S.P., Sircar B.K. et al. Polymyxin В sensitive strains of Vibrio cholerae non 01 from recent epidemic in India // Lancet. - 1993. - Vol. 341, № 8852.-P. 1090.

180. Sarkar B.L., Jedani K.E., Manning P.A. Genetic organization of the regions assoociated with surface polysaccharide synthesis in Vibrio cholerae 01, 0139 and Vibrio anguillarum Ol and 02 : a review // Gene. 1998. - Vol. 223, № 1 - 2. - P. 269 - 282.

181. Shimada Т., Nair G.B., Deb B.C. et al. Outbreak of Vibrio cholerae non Ol in India and Bangladesh // Lancet. - 1993. - Vol. 341, № 8856. - P. 1347.

182. Singh D.V., Matte M.H., Matte G.R. Molecular analysis of Vibrio cholerae Ol, 0139, non Ol, and non - 0139 strains : clonal relationships between clinical and environmental isolates // Appl. Environ. Microbiol. - 2001. - Vol. 67, №2.-P. 910-921.

183. Slifkin M. Tween 80 opacity test responses of various Candida species // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38, № 12. - P. 4626 - 4628.

184. Souto Padron Т., Harth G., Souza W. Immunocytochemical localization of neuraminidase in Trypanosoma cruzi. // Infect. Immun. - 1990. - Vol. 58, № 3. - P. 586-592.

185. Staerk J., Ronneberger H.J., Wiegandt H. Neuraminidase, a virulence factor in Vibrio cholerae infection? // Behring Inst. Mitt. 1974. - Vol. 55. - P. 145 -146.

186. Stroeher U.H., Jedani K.E., Dredge B.K. et al. Genetic rearrangements in the rfb regions of Vibrio cholerae Ol and 0139 // Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. -Vol. 92, № 22. - P. 10374 - 10378.

187. Swerdlow D.L., Ries A. A. Vibrio cholerae non 01 the eighth pandemic? 11 Lancet. - 1993. - Vol. 342, № 8868. - P. 382 - 383.

188. Tacket C.O., Taylor R.K., Losonsky G. et al. Investigation of the roles of toxin- coregulated pili and mannose sensitive hemagglutinin pili in the pathogenesis of Vibrio cholerae 0139 infection // Infect. Immun. - 1998. - Vol. 66, № 2.- P. 692 695.

189. Takeuchi K., Tanabayashi K., Hishiyama M. et al. Cloning and sequencing ofthe haemagglutinin neuraminidase gene of mumps vims (Miyahara strain) I I Nucleic Acids Res. - 1989. - Vol. 17. - P. 5840.

190. Tandt W.D., Iaeken P., Leroy I. Characteristics of leukocyte and liver MU -NANA sialidase // Glycoconjugates : 6 Int. Symp. Tokyo; sep. 20 25. - 1981. -P. 464.

191. Taylor G.L., Vimr E.R., Garman E.F., Laver W.G. Purification, crystallization and preliminary crystallographic study of neuraminidase from Vibrio cholerae and Salmonella typhimurium LT2 // J. Mol. Biol. 1992. - Vol. 226. - P. 1287- 1290.

192. Tigerstrom R.G. von, Stelmaschuk S. The use of Tween 20 in a sensitive tur-bidimetric assay of lipolytic enzymes // Can. J. Microbiol. 1989. - Vol. 35. -P. 511-514.

193. Tison D.L., Kelly M.T. Vibrio species of medical importance. // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1984. - Vol. 2, № 4. - P. 263 - 276.

194. Tormey M., Maseola L., Kilman L. et al. Imported cholera associated a newly described toxigenic Vibrio cholerae 0139 strain California // Morbid. Mortal. World. Rec. - 1993. -Vol. 42, № 26. - 501 p.

195. Trucksis M., Michalski J., Deng Y.K., Kaper J. B. The Vibrio cholerae genome contains two unique circular chromosomes // Proc. Natl. Acad. Sci. -1998. Vol. 95. - P. 14464 - 14469.

196. Tsurudome M., Bando H., Nishio M. et al. Antigenic and structural properties of a paramyxovirus simian virus 41 (SV41) reveal a close relationship with human parainfluenza type 2 virus // Virology. 1990. - Vol. 179. - P. 738 -748.

197. Verheijen F.W., Palmeri S., Galjaard H. Purification and partial characterization of lysosomal neuraminidase from human placenta // Eur. J. Biochem.1987.-Vol. 162.-P. 63 -67.

198. Vimont S., Dumontier S., Escuer V., Berche P. The rfaD locus : a region of rearrangement inVibrio cholerae 0139 // Gene. 1997. - Vol. 185, № 1. - P. 43 - 47.

199. Vimr E.R., Lawrisuk L., Galen J.E., Kaper I.B. Cloning and expression of the Vibrio cholerae neuraminidase gene nan H in Escherichia coli // J. Bacteriol.1988. Vol. 170, № 4. - P. 1495 - 1504.

200. Waldor M.K., Mekalanos J.J. Emergence of a new cholera pandemic : molecular analysis of virulence determinants in Vibrio cholerae 0139 and development of a live prototype // J. Infect. Dis. 1994. - Vol.170. - P. 278 - 283.

201. Waldor M.K., Mekalanos J.J. ToxR regulates virulence gene expression in non 01 strains of Vibrio cholerae that cause epidemic cholera // Infect. Immun. -1994.-Vol. 62.-P. 72-78.

202. Warren L. The thiobarbituric acid assay of sialic acids // J. Biochem. 1959. -Vol. 234, №8.-P. 1971 - 1975.

203. Watnick P.I., Lauriano C.M., Klose K.E. et al. The absence of a flagellum leads to altered colony morphology, biofilm development and virulence in Vibrio cholerae 0139 //Mol. Microbiol. 2001. - Vol. 39, № 2. - P. 223 - 235.

204. Webster R.G. 1918 Spanish influenza : The secret remain elusive // Proc. Natl. Acad. Sci. -1999. Vol. 96, № 4. - P. 1164 - 1166.162

205. West P.A. The human pathogenic vibrios a public health update with environmental perspectives // Epidemiol. Infect. - 1989. - Vol. 103, № 1. - P. 1 -34.

206. White D.J., Jolley W.L., Purdy C.W., Straus D.C. Extracellular neuraminidase production by a Pasteurella multocida A:3 strain associated with bovine pneumonia // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63, № 5. - P. 1703 - 1709.

207. Xin X., Shioda Т., Fukushima M. et al. Facilitation of HIV 1 isolation from patients by neuraminidase // Arch. Virol. - 1998. - Vol. 143. - P. 85 - 95.

208. Yeh A.K., Carubelli R. The inhibitory effect of halide ions on human polymorphonuclear leukocyte neuraminidase // J. Mol. Med. 1976. - Vol. 1, № 3. -P. 265-271.