Конструирование и изучение иммунобиологических свойств рекомбинантных штаммов Escherichia coli и Vibrio cholerae, продуцирующих протективные антигены - В-субъединицу холерного токсина и адгезин CFA/I

Кобкова, Ирина Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Конструирование и изучение иммунобиологических свойств рекомбинантных штаммов Escherichia coli и Vibrio cholerae, продуцирующих протективные антигены - В-субъединицу холерного токсина и адгезин CFA/I
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование и изучение иммунобиологических свойств рекомбинантных штаммов Escherichia coli и Vibrio cholerae, продуцирующих протективные антигены - В-субъединицу холерного токсина и адгезин CFA/I"

На правах рукописи

КОБКОВА Ирина Михайловна

КОНСТРУИРОВАНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ ESCHERICHIA СОИ И VIBRIO CHOLERAE, ПРОДУЦИРУЮЩИХ ПРОТЕКТИВНЫЕ АНТИГЕНЫ - В-СУБЪЕДИНИЦУ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА И АДГЕЗИИ CFA/I

03.00.07 - микробиология 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов 2005

Работа выполнена в Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор кандидат медицинских наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор биологических наук, профессор

Смирнова Нина Ивановна Чеховская Галина Викторовна

Швиденко Инна Григорьевна Попов Юрий Алексеевич

Ведущая организация:

Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт

Защита состоится <Л0> 2005 г. в часов на заседании дис-

сертационного совета Д 208.078.01 по присуждению ученой степени доктора (кандидата) наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

Автореферат разослан 2005 г.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РосНИПЧИ «Микроб».

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Слудский А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Холера, вызываемая Vibrio cholerae биовара эльтор, остается одной из важнейших проблем здравоохранения многих стран Азии, Африки и Америки. Кроме того, продолжают регистрироваться в странах Юго-Восточной Азии вспышки холеры, вызванные V. cholerae O139 серогруппы [Москвитина Э.А. и др., 2004]. При наличии высокого уровня миграции населения, неблагоприятных социально-экономических условий жизни возможность завоза холеры в Российскую Федерацию реально существует. Вышенаписанное диктует необходимость создания современных и надежных отечественных средств и методов профилактики этого заболевания.

К настоящему времени зарубежные и отечественные исследователи разработали ряд живых и неживых холерных вакцин, проверенных на безопасность, иммуногенность и протективность. Среди них следует отметить широко используемые убитую цельноклеточную оральную вакцину WC/rBS с добавлением очищенной В-субъединицы холерного токсина [Holmgren J. et al, 1999; Supplementary information on vaccine safety, 2000] и таблетированную бивалентную химическую вакцину холероген-анатоксин [Наумов А.В. и др., 1992; Лоцманова Е.Ю. и др., 2002], которые, однако, вызывают лишь частичную защиту от холеры. Что касается известных живых холерных вакцин CVD103-HgR и CVD111, то они, характеризуясь высоким уровнем защиты, имеют выраженную остаточную реактогенность, вызывая у ряда вакцинированных развитие легкой диареи [Kaper J.B. et al., 1989; Levine M.M. et al., 1998; Wiederman С. et al., 1998; Taylor D.N. et al.,1999]. Безусловно, очевиден мощный потенциал ДНК-вакцин, но для развития этого направления требуется дальнейшая работа [Карягина А.С. и др., 2004].

Таким образом, несмотря на попытки многих исследователей в течение более 100 лет создать идеальную холерную вакцину, до сих пор проблема разработки эффективного и безопасного профилактического препарата против холеры остается нерешенной. Отсутствие доступных для нас сведений о сконструированных отечественных живых вакцинных штаммах против холеры, которые были бы не только эффективны, но и безопасны, свидетельствует об актуальности исследований, направленных на получение холерных вакцин нового поколения.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - сконструировать на основе авирулентных штаммов Escherichia coli и V. cholerae серогруппы O139 иммуногенные рекомби-нантные штаммы с гомо- и гетерологичными генами основных протективных антигенов для последующего создания на их основе живых оральных холер -ных вакцин.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Сконструировать на основе штаммов Е. coli M17 и V. cholerae 170 серогруппы 0139 диплазмидные штаммы, содержащие гены, кодирующие биосинтез адгезина CFA/1 и В-субъединицы холерного токсина - основных протективных антигенов.

2. Изучить стабильность наследования введенных гомо- и гетероло-гичных генов ctxB и cfal, определяющих продукцию протективных антигенов в клетках сконструированных штаммов Е. coli и V. cholerae, и определить эффективность их экспрессии.

3. Провести сравнительный анализ колонизирующей способности между сконструированными диплазмидными штаммами Е. coli KM148(pIEM3)(pCFAI) и V. cholerae KM182(pIEM3)(pCFAI) и исходными штаммами Е. coli Ml7 и V. cholerae 170, не содержащими плазмид.

4. На основании клинико-морфологических показателей определить безвредность и изучить иммуногенные и протективные свойства созданных штаммов Е. coliKM148(pIEM3)(pCFAI) и V. cholerae KM182 (pIEM3)(pCFAI).

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ:

Впервые для создания живых холерных вакцин был использован новый подход, состоящий в применении в качестве носителя гомо- и гетероло-гичных протективных антигенов безопасного для человека штамма Е. coli M17, на основе которого изготавливается лечебно-профилактический препарат колибактерин.

Установлено, что в сконструированных штаммах Е. coli KM148(pIEM3)(pCFAI) и V. cholerae KM182(pIEM3)(pCFAI) введенные в составе плазмид клонированные гомо- и гетерологичные гены ctxB и cfal, определяющие биосинтез В-субъединицы холерного токсина и фактора адгезии CFA/I - основных протективных антигенов, стабильно наследуются в условиях in vitro и in vivo. Выявленный уровень биосинтеза В-субъединицы холерного токсина и адгезина СТАЛ в клетках диплазмидных штаммов кишечной палочки и холерного вибриона указывает на эффективную экспрессию введенных генов.

Новые данные получены при исследовании колонизирующей активности штаммов Е. coli KM148(pIEM3)(pCFAI) и V. cholerae KM182(pIEM3)(pCFAI) на модели лабораторных животных (крольчата-сосунки). Установлено, что присутствие в созданных штаммах Е. coli KM148 и V. cholerae KM 182 плазмиды pCFAI обеспечивает повышение их колонизирующей активности, соответственно, в 4000 раз и 1280 раз, по сравнению с исходными штаммами Е. coliМ17 и V. cholerae 170.

Установлено, что сконструированные штаммы обладают выраженными иммуногенными свойствами, вызывая у иммунизированных животных образование в высоких титрах антитоксических и антиколонизирующих антител.

Доказана протективность сконструированных штаммов, которая выразилась в эффективной защите иммунизированных животных от заражения их в высоких дозах (Ю8-109 м.т./мл) вирулентными штаммами холерного вибриона 01 или O139 серогрупп.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. По результатам работы составлены методические рекомендации: «Конструирование потенциально вакцинных штаммов против диарейных заболеваний», которые одобрены Ученым Советом (протокол № 7 от 23.12.2004 г.) и утверждены зам. директора Рос-НИПЧИ «Микроб».

В Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" депонированы два штамма Е. coli Ml7 и два штамма V. cholerae 170 с разным набором генов протективных антигенов - В-субъединицы холерного токсина и ад-гезина CFA/I. Указанные штаммы могут быть использованы для решения прикладных и фундаментальных задач.

Получены три патента на изобретения: патент №2232189 «Штамм бактерий Escherichia coli KM148 - продуцент протективных антигенов, используемых для иммунопрофилактики колибактериоза и холеры» (от 10.07.2004); патент №2238975 «Штамм бактерий Escherichia coli КМ147-продуцент В-субъединицы холерного токсина» (от 27.10.2004), который внесен в базу данных перспективных Российских разработок РОСПАТЕНТа; патент №2236455 «Штамм бактерий Vibrio cholerae KM168 - основа для конструирования живых вакцин против диарейных заболеваний, вызываемых штаммами Vibrio cholerae O139» (от 20.09.2004).

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. На основе авирулентных штаммов кишечной палочки Е. coli M17 и холерного вибриона 0139 серогруппы V. cholerae 170 сконструированы ди-плазмидные штаммы Е. coli KM 148 и V. cholerae KM 182, содержащие гены двух основных протективных антигенов - ctxB, контролирующего биосинтез В-субъединицы холерного токсина, и cfal, ответственного за продукцию адге-зина CFA/I энтеротоксигенных кишечных палочек.

2. Клонированные в составе плазмид гены ctxB и cfal, кодирующие биосинтез В-субъединицы холерного токсина и адгезина CFA/I, стабильно наследуются и эффективно экспрессируются в клетках созданных авирулент-ных штаммов Е. coli KM 148 и V. cholerae KM 182.

3. Присутствие в клетках сконструированных штаммов Е. coli KM 148 и V. cholerae KM 182 плазмиды pCFAI с геном cfal, контролирующим продукцию адгезина CFA/I, обеспечивает значительное повышение их адгезивной способности по сравнению с исходными штаммами Е. coli M17 и V. cholerae 170.

4. Сконструированные рекомбинантные штаммы Е. coli KM 148 и

V cholerae KM 182 на основании клинико-морфологических показателей являются безвредными для лабораторных животных, обладают высокой колонизирующей способностью и выраженными иммуногенными свойствами.

5. Исследуемые штаммы Е. coli KM 148 и V. cholerae KM 182 имеют высокую протективную активность. Они эффективно защищают модельных лабораторных животных от последующего заражения их вирулентными штаммами холерного вибриона О1 и O139 серогрупп.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены и представлены на научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб»» (Саратов, 2001, 2002, 2003); на International Society for Optical Engineering «Optical Technologies in Biophysics and Medicine IV» (Saratov Fall Meeting, 2002); на XI Российском Национальном Конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2004); на научной конференции с международным участием «Современные средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2004); на третьем съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров России «Генетика в XXI веке: современное состоянии и перспективы развития» (Москва, 2004).

ПУБЛИКАЦИИ : По теме диссертации опубликовано 11 научных

работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 249 цитируемых работ. Общий объем диссертации составляет 160 страниц. Текст иллюстрирован 9 таблицами и 16 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы исследования. В работе использованы природные и генетически маркированные штаммы Е. coli и V. cholerae, характеристика которых дана ниже. Штаммы, несущие рекомбинантные плазмиды рШМЗ и pCFAI с клонированными генами В-субъединицы холерного токсина и адгези-на CFA/I, любезно предоставлены сотрудниками ИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи, Москва. При выполнении работы использовались различные микробиологические, генетические, молекулярно-биологические, серологические, биохимические и электронно-микроскопические методы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Конструирование рекомбинантных штаммов Е. coli KM148(pIEM3)(pCFAI) и V. cholerae KM182(pIEM3)(pCFAI). Для решения

поставленной задачи был впервые применен новый подход, заключающийся в том, что в качестве носителя генов протективных антигенов был взят безопасный для человека штамм Е. coli M17, служащий основой для приготовления лечебно-профилактического препарата колибактерина. Вторым носителем генов был не продуцирующий гемолизин (Н1у') мутант природного авиру-лентного штамма O139 серогруппы V. cholerae 170. По данным ПЦР-анализа его геном был лишен основных структурных и регуляторных генов вирулентности ctxA, zot, асе, tcpA, toxTn нуклеотидной последовательности öffRS-сайта для внедрения в хромосому фага вирулентности СТХф [Осин А.В. и др., 2001].

Поскольку установлено, что высокая протективность вакцин против диарейных заболеваний обеспечивается их способностью стимулировать образование антитоксических и антиколонизирующих антител в организме вакцинируемого человека [Меморандум совещания ВОЗ, 1990], для конструирования штаммов, обладающих указанными свойствами, были взяты рекомби-нантная плазмида р1ЕМ3, несущая клонированный ген ctxB, кодирующий продукцию иммуногенной В-субъединицы холерного токсина, а также рекомби-нантная плазмида pCFAl, в состав которой входит клонированный ген cfal, контролирующий биосинтез адгезина CFA/I патогенных для человека штаммов кишечной палочки [Evans D. G., 1979]. Выбор плазмид, отвечающих за продукцию указанных антигенов, был обусловлен тем, что В-субъединица холерного токсина обеспечивает формирование антитоксического иммунитета при холере, a CFA/I - ключевой протективный антиген, обуславливающий образование антиколонизирующего иммунитета [Далин М.В., 1985].

Первый этап исследований состоял в конструировании моноплазмид-ных штаммов Е. coli M17 и V. cholerae 170, содержащих конъюгативную плазмиду р1ЕМ3, несущую клонированный фрагмент хромосомы штамма V. cholerae RV79 с геном ctxB, контролирующим биосинтез В-субъединицы холерного токсина, а также гены резистентности к тетрациклину и канамици-ну [Янишевский Н.В. с соавт., 1987]. Донором плазмиды pIEM3 (TcrKmr) был штамм Е. coli KS164(pIEM3). Для его контрселекции в реципиентные штаммы были введены спонтанные мутации, определяющие резистентность к рифам-пицину (в случае Е. coli M17) или к спектиномицину (в случае V. cholerae 170). Частота конъюгационного переноса плазмиды р1ЕМЗ от донора к реципиентам составила 9х10'5-7х10"5. Проверка 300 произвольно выбранных колоний трансконЪюсайтМ 17 RifTcr и 350 трансконъюгантов V. cholerae 170 SprTpr показала, что все они несли оба маркера плазмиды рШМ3 - резистентность к канамицину и тетрациклину. Полученные моноплазмидные трансконъюганты Е. coli M17(pIEM3) и V. cholerae 170(pIEM3) получили, соответственно, обозначения Е. coliKM147(pIEM3) и V. cholerae KM168(pIEM3).

Затем в сконструированные моноплазмидные штаммы кишечной палочки КМ 147 и холерного вибриона КМ 168, содержащие клонированный ген В-субъединицы холерного токсина, была введена вторая конъюгативная ре-

комбинантная плазмида pCFAI, несущая клонированный ген cfal и ген резистентности к триметоприму (Трг). Донором плазмиды служил штамм Е. coli J53(pCFAl)Tpr. В качестве селективной среды использовали LB-arap, содержавший тетрациклин (10 мкг/мл) и триметоприм (100 мкг/мл). В результате конъюгационных скрещиваний были получены Тсг и Трг трансконъюганты. Частота конъюгационного переноса плазмиды pCFAI составила 3x10 -5х 10 . Все изученные Трг- клоны были одновременно Кшг И Тсг, что указывало на присутствие в них двух плазмид - pIEM3(TcrKmr) и pCFAl(Tpr).

1 23456789 10

^_pCFAI

-pIEM3

Рис. 1. Электрофоретический анализ трансконьюгантов Е. coli KM148, содержащих плазмиды р1ЕМЗ и pCFAI, проведенный по методу С. J. Kado и С. Т. Liu (1981). 1-Е. coli M17(Rif) - исходный штамм; 2-Е. coli KS164(pIEM3) - до-норный штамм pIEM3; 3-Е. coli J53(pCFAl) — донорный штамм pCFAI; 4-10-Е. coli KM148 - трансконъюганты.

Созданные диплазмидные штаммы были обозначены как Е. coli KM148(pIEM3)(pCFAI) и V. cholerae KM182(pIEM3)(pCFAI). Проверка плаз-мидного состава штамма Е. coli KM 148 с помощью электрофореза в агарозном геле показала, что в клетках изучаемого штамма обе плазмиды находились в автономном состоянии (рис.1, дорожки 4-10). Таким образом, сконструированы штаммы кишечной палочки и холерного вибриона серогруппы 0139, содержащие в составе плазмид клонированные гены В-субъединицы холерного токсина и адгезина CFA/I.

2. Изучение стабильности наследования генов протективных антигенов и определение эффективности их экспрессии в созданных штаммах Е. coli KM148 и V. cholerae KM182. Полученные штаммы Е. coli KM 148 и V. cholerae KM 182 будут представлять ценность как потенциальные вакцины лишь при стабильном сохранении и эффективной экспрессии введенных плаз-

мидных генов ctxB и cfal. Для изучения особенностей наследования и экспрессии двух рекомбинантных плазмид в клетках кишечной палочки и холерного вибриона по пять независимо отобранных диплазмидных клонов каждого штамма выращивали в бульоне без антибиотиков в течение 24-72 ч, а изолированные колонии, выросшие на агаре (по 200 колоний от каждого штамма), проверяли по соответствующим маркерам. Было установлено, что все проверенные трансконъюганты Е. coli КМ 148 и V. cholerae КМ 182 имели фенотип КтгТсгТрг. Полученные данные свидетельствуют о том, что сконструированные штаммы сохраняли на протяжении 48-144 генераций обе плазмиды в 100% случаях при выращивании их в неселективных условиях.

В связи с большой важностью вопроса о стабильности наследования обеих плазмид в клетках созданных штаммов в условиях in vivo, нами определялось их наследование при пассировании диплазмидных штаммов в организме лабораторных животных (в опыте было использовано по 12 крольчат-сосунков на каждый штамм). Крольчат-сосунков внутрижелудочно или внут-рикишечно заражали этими штаммами в дозе 1х109 м.т./мл. Через 24 и 48 ч животных умерщвляли хлороформом, а гомогенат тканей толстого и тонкого кишечника высевали на полноценный агар с рифампицином (для кишечной палочки) и спектиномицином (для холерного вибриона). По 300 выросших колоний проверяли на наличие плазмидных маркеров резистентности к соответствующим антибиотикам. В результате установили, что после 24 и 48 ч пребывания в кишечнике крольчат обе плазмиды рШМЗ и pCFAI сохранялись в клетках изученных штаммов в 100% случаях. Таким образом, сконструированные диплазмидные штаммы Е. coli KM 148 и V. cholerae KM 182 и в условиях in vivo стабильно наследовали обе плазмиды.

Для определения продукции В-субъединицы холерного токсина ди-плазмидным штаммом Е. coli KM 148 использовали реакцию пассивного иммунного гемолиза (РПИГ) и иммуноферментный метод (ELISA). Изучение продукции В-субьединицы токсина у 100 независимо полученных диплазмид-ных трансконъюгантов кишечной палочки с помощью РПИГ показало, что все проверенные клоны Е. coli KM 148 продуцировали секретируемую В-субъединицу, но отличались между собой по уровню ее биосинтеза, о чем свидетельствовала различная ширина зон лизиса эритроцитов вокруг их макроколоний (2,0 - 4,0 мм). Для дальнейшей работы были отобраны три транс -конъюганта с наибольшей продукцией этого белка. Проверку популяционного состава трех отобранных трансконъюгантов на продукцию В-субьединицы холерного токсина проводили путем рассева их на плотной среде и последующего анализа 900 изолированных колоний (по 300 колоний от каждого) с помощью РПИГ. В результате были отобраны клоны, однородная популяция клеток которых характеризовалась высоким уровнем продукции секретируе-мой В-субьединицы, поскольку вокруг макроколоний формировалась зона гемолиза шириной около 4 мм (табл.1).

Далее продукцию В-субъединицы холерного токсина диплазмидным штаммом кишечной палочки проверяли с помощью ELISA. Согласно литературным данным, в клетках различных штаммов Е. coli К12, содержащих клонированные гены холерного токсина или его В-субъединицу, более 99% указанного белка не секретируется наружу, находясь, в основном, в периплазме [Gennaro M.L. et al. 1982, Pearson G.D.N., Mekalanos J.J. 1982]. Эти сведения послужили нам основанием для определения присутствия В-субъединицы холерного токсина как в периплазматическом пространстве клеток Е. coli КМ 148, так и в их культуральном супернатанте. В результате впервые было установлено, что в клетках штамма Е. coli KM 148, в отличие от штаммов Е. coli К12, практически 100% продуцируемой В-субъединицы холерного токсина секретируется во внешнюю среду (табл.1).

Более того, следует особо отметить эффективную экспрессию чужеродного клонированного гена ctxB в клетках штамма Е. coli KM148, производного Е. coli M17, поскольку созданный диплазмидный штамм продуцировал почти в 13 раз больше В-субъединицы (10 мкг/мл) по сравнению с содержащим плазмиду штаммом Е. coli К12, в периплазме клеток которого было обнаружено лишь 0,78 мкг/мл этого белка [Янишевский Н.В. с соавт., 1987].

Таблица 1. Результаты определения продукции В-субьединицы холерного токсина клетками штамма Е. coli KM148(pIEM3)(pCFAI) с помощью реакции пассивного иммунного гемолиза и иммуноферментного метода (ELISA)_

Штамм Продукция В-субъединицы холерного токсина по данным РПИГ * (мм) Продукция В-субъединицы холерного токсина по данным ELISA (мкг/мл)

в периплазме клеток в культуральном супернатанте

Е. coli Ml7 0,0 0,0 0,0

Е. coli KS 164 (pIEM3) 0,0 1,0 0,5

E. co//J53(pCFAl) 0,0 0,0 0,0

E.coli KM147(pIEM3) 4,0 0,0 8,0

E. coli KM 148 5,0 0,0 10,0

V. cholerae 569B 5,0 н/о 9,5

Для оценки экспрессии гена В-субъединицы в сконструированном штамме V. cholerae KM 182 были также использованы РПИГ и иммунофер-ментный метод.

Согласно полученным данным введенный ген ctxB эффективно экс-прессировался в клетках штамма V. cholerae KM 182, продуцируя 6,0 мкг/мл секретируемой во внешнюю среду В-субъединицы холерного токсина (табл.2).

В то же время следует отметить, что у V. cholerae KM 182, в отличие от рекомбинантного штамма Е. coli KM 148, уровень биосинтеза В-субъединицы

В целом, полученные данные свидетельствуют о том, что сконструированный штамм V. cholerae KM182 отличается высокой продукцией В-субьединицы холерного токсина, что указывает на эффективную экспрессию гена ctxB в клетках холерного вибриона O139 серогруппы.

Для оценки экспрессии генов фактора адгезии CFA/I в клетках ди-плазмидного штамма Е. coli KM 148 была использована реакция маннозорези-стентной гемагглютинации (МРГА) с человеческими эритроцитами I группы крови, поскольку этот адгезии способен агглютинировать указанные эритроциты.

Таблица 2. Результаты определения продукции секретируемой В-субьединицы холерного токсина штаммом V. cholerae KM182(pIEM3)(pCFAI) с помощью реакции пассивного иммунного гемолиза и иммуноферментного метода (ELISA)._

Штамм Продукция В-субъединицы холерного токсина по данным РПИГ*(мм) Продукция В-субъединицы холерного токсина по данным ELISA (м кг/мл)

V. cholerae 170 0,0 - 0,0

Е. coli KS164(pIEM3) 0,0 0,5

Е. coliJ53(CFA1) 0,0 0,0

V. cholerae KM168(pIEM3) 3,0 5,5

V. choleraeKM 182(pIEM3)(pCFA1) 3,0 6,0

V. cholerae 569B 5,0 9,5

Примечание: *ширина зоны лизиса эритроцитов в мм вокруг макроколоний

Результаты реакции МРГА Е. coli KM 148, выращенного при подобранных нами оптимальных условиях (культивирование штамма при 37° С в течение24 ч на CFA - агаре, затем 18 ч - в CFA - бульоне), представлены в таблице 3.

Оказалось, что исходный штамм Е. coli M17 агглютинирует человеческие эритроциты в титре 1:8, что обеспечивается, видимо, собственными ман-нозорезистентными гемагглютининами/адгезинами. В то же время титр положительной реакции МРГА эритроцитов клетками сконструированного штамма Е. coli KM 148 составлял 1:128, что в 16 раз превышает титр МРГА исходного штамма M17 (табл.3). Эти данные свидетельствуют об эффективной экспрессии генов адгезина CFA/I в клетках штамма Е. coli Ml7.

Наличие пилей адгезии CFA/I в сконструированном штамме Е. coli КМ 148 было подтверждено с помощью электронной микроскопии (рис. 2).

Таблица 3. Результаты определения продукции адгезина CFA/I штаммом Е. coli KM148(pIEM3)(pCFAI) с помощью МРГА с человеческими эритроцитами_

Штаммы Е coli Титры * МРГА человеческих эритроцитов

2 4 8 16 32 64 128 256 512

МП ++++ +++ ++ + - - - - -

J53(pCFAl) ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++ + -

КМ 148 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++ + -

Примечание: количество «+» обозначает интенсивность реакции.

*указанные цифры означают величины, обратные титрам.

Таким образом, на основании данных реакции МРГА и результатов электронно-микроскопического анализа можно заключить, что присутствие генов cfal в клетках штамма КМ 148 обуславливает повышение его адгезивной активности.

Для оценки экспрессии гена фактора адгезии в клетках холерного вибриона была также использована реакция МРГА. Оказалось, что при культивировании V. cholerae KM 182 на агаре YT при 37 °С в течение 24 ч происходит наиболее эффективная экспрессия гена cfal - титр МРГА составил 1:128. Наличие пилей адгезии CFA/I в сконструированном штамме V. cholerae КМ 182 было подтверждено с помощью электронной микроскопии. Из полученных результатов очевидно, что присутствие в клетках сконструированных штаммов Е. coli KM 148 и V. cholerae KM 182 указанных рекомбинантных плазмид обеспечивает высокий уровень продукции двух протективных антигенов - В-субъединицы холерного токсина и адгезина CFA/I.

Рис.2. Электронная микрофотография клетки штамма Е. соИ КМ 148, содержащего на поверхности пили адгезии СЕА/1. Инструментальное увеличение 4,2 хЮ1.

3. Изучение безвредности, колонизирующей способности, иммуногенных и протективных свойств созданных штаммов Е. coli KM148 и V. cholerae КМ 182. В эксперимент для определения безвредности штаммов КМ 148 и КМ 182 на каждый из них было взято по 15 крольчат-сосунков и по 2 взрослых кролика. Суспензии клеток указанных штаммов в дозах 1x109 м.т./мл и 5x109 м.т./мл были введены крольчатам-сосункам двумя способами: внутрикишечно или внутрижелудочно, соответственно. В течение 4 суток с момента инокуляции (период наблюдения) гибели зараженных животных не было, физиологические показатели также оставались в пределах нормы. По истечении указанного времени животных умерщвляли и определяли наличие макроскопических изменений в кишечнике. Оказалось, что у всех опытных животных в просвете кишечника было минимальное количество обычного по консистенции содержимого. На серозной и слизистой оболочках отсутствовали кровоизлияния, поверхность слизистой выглядела бархатистой, Пейеровы бляшки не были редуцированы. Анализ полученных данных позволяет говорить о безвредности сконструированных штаммов Е. coli KM148 и V. cholerae KM182 для модельных лабораторных животных. Для подтверждения сделанного вывода штаммы Е. coli KM 148 и V. cholerae KM 182 дважды пассировали на крольчатах - сосунках и культурами, выделенными из их кишечника после второго пассажа, внутрижелудочно заражали четырех взрослых кроликов дозой 5х1010 м.т./мл. Однако и при указанных условиях заражения у животных не были зарегистрированы какие-либо макроскопические изменения в тонком и толстом кишечнике, а также в других внутренних органах.

Таким образом, на основании клинико-морфологических показателей установлена безвредность сконструированных штаммов Е. coli KM 148 и V. cholerae KM 182. Тем не менее, в дальнейшей работе по изучению их биологических свойств необходимо проведение гистологических исследований для выявления у опытных животных возможных микроскопических изменений в различных органах.

Известно, что одним из условий формирования напряженного иммунитета является длительное персистирование вакцинных штаммов в организме животных. Из этого следует, что потенциально вакцинные штаммы должны эффективно колонизировать слизистую кишечника у иммунизированных животных. Для определения колонизирующей способности штамма кишечной палочки КМ 148 использовали метод N.F. Pierce et al. (1988) с небольшими модификациями. В опыт было взято 10 крольчат-сосунков, которым внутри-кишечно вводили суспензию клеток штамма в дозе 1x109 м.т. в 0,2 мл раствора хлорида натрия. Контрольной группе (6 крольчат-сосунков) таким же способом и в той же дозе вводили суспензию клеток исходного бесплазмидного штамма Е. coli M17. Через 24 ч после заражения из гомогената тонкого и толстого кишечника животных, умерщвленных с помощью хлороформа, производили высевы на полноценный агар с добавлением либо тетрациклина (для

штамма Е coli KM 148 TcrKmr), либо рифампицина (для исходного штамма Е.

coli С помощью последующего подсчета выросших на питательных

1 2

средах колоний определяли количество клеток, прикрепившихся к 1 см стенки кишечника после заражения через 24 ч. В результате было установлено, что штамм Е. coli KM 148 при внутрикишечном заражении эффективно колонизировал и тонкий, и толстый отделы кишечника животных, в то время как исходный штамм Е. coli M17 колонизировал, преимущественно, толстый кишечник. Количество клеток диплазмидного штамма Е. coli KM 148, прикрепившихся к 1 см2 эпителия тонкого кишечника крольчат-сосунков через 24 ч после заражения, составило 3,58x107 м.т./см2, что почти в 4000 раз превышало таковые показатели для исходного штамма Е. coli M17 (8,35x103 м.т./см2) (рис.3).

Что касается эпителия толстого кишечника крольчат, то количество клеток диплазмидного штамма Е. coli KM 148, прикрепившихся к его 1 см2, составляло 2,36x107 м.т./см2, тогда как клеток исходного штамма было лишь 1,11х104м.т./см2 (рис.3). Эти данные указывают на повышение колонизирующей способности толстого кишечника диплазмидным штаммом почти в 2000 раз по сравнению с исходным.

Итак, полученные результаты свидетельствуют о том, что присутствие плазмиды pCFAI с геном cfal в штамме Е. coli KM 148 привело к весьма заметному повышению его колонизирующей способности. При этом штамм Е. coli KM 148 приобрел способность наиболее эффективно заселять тонкий кишечник крольчат-сосунков, по сравнению с его толстым отделом.

Колонизирующую способность диплазмидного штамма V. cholerae КМ 182 также определяли на модели крольчат-сосунков [N.F. Pierce et al., 1988]. С этой целью опытной группе животных (16 крольчат-сосунков) внут-рикишечно вводили 1x109 м.т. штамма V. cholerae KM 182 в 0,2 мл раствора хлорида натрия. Контрольной группе (5 крольчат-сосунков) таким же способом и в той же дозе вводили клетки исходного штамма V. cholerae 170. В результате оказалось, что количество клеток диплазмидного штамма V. cholerae КМ182, прикрепившихся к 1 см2 эпителия стенки тонкого кишечника крольчат-сосунков (7,68x105 м.т./см2), превышало таковые показатели для исходного штамма V. cholerae 170 (6,0х102м.т./см2) почти в 1280 раз. Что касается толстого кишечника крольчат, то на 1 см2 эпителия его стенки было зарегистрировано 4,47x105 м.т./см2 клеток диплазмидного штамма, в то время как прикрепившихся клеток исходного штамма было в 1146 раз меньше (3,9х102м.т./см2).

Важное значение имеют данные, полученные при изучении иммуно-генных свойств сконструированных штаммов Е. coli KM 148 и V. cholerae КМ182.

К coli М17 К cok KM 148

Примечание: светлые столбцы обозначают количество клеток, прикрепив

шихся в тонком, темные столбцы - в толстом кишечнике.

Рис.3. Количество клеток кишечной палочки, прикрепившихся к 1 см2 стенки тонкого и толстого отделов кишечника кролика через 24 ч после внутрикишечно-го введения исходного и диплазмидного штаммов Е. coli.

Первый этап исследования состоял в иммунизации шести взрослых кроликов путем трехкратного внутрижелудочного введения им суспензии клеток штамма Е. coli KM 148 в следующих дозах: 1x108 (вводилась одному кролику), 1x109 (вводилась одному кролику), 5x109 (вводилась 2-м кроликам) и 5х1010 м.т./мл (водилась 2 кроликам). Иммуногенное действие штамма оценивалось путем определения в сыворотке крови антиколонизирующих и антитоксических антител. Для выяснения динамики накопления указанных антител, сыворотки крови от животных получали на 7, 14, 21, 28, 35,42 и 49 сутки после первой иммунизации. Далее, мы провели серию экспериментов по качественному и количественному определению антиколонизирующих и антитоксических антител в полученных сыворотках. С целью исключения получения недостоверных результатов из сывороток удалили гетерологичные антитела к другим поверхностным антигенам Е. coli (О2-антигену, белкам внешней мембраны и т.д.). Для этого все образцы сывороток дважды сорбировали живыми и инактивированными клетками исходного штамма Е. coli M17, на поверхности которых имеется О2-антиген, но отсутствуют пили адгезии CFA/I.

По результатам дот-иммуноанализа (качественный метод) сыворотки иммунизированных кроликов содержали антитела как к адгезину CFA/I, так и к В-субьединице холерного токсина. Количественная оценка образования изучаемых антител проводилась с помощью развернутой реакции агглютинации в пробирках (определение антител к адгезину CFA/I) и ELISA (определение антител к В-субьединице холерного токсина). Данные реакции агглютинации

свидетельствовали о присутствии антител к адгезину СБА/Г в высоких титрах. При этом титр антител заметно повышался на протяжении 42 суток. Так, если титр антиколонизирующих антител через 7 и 28 суток после иммунизации составлял, соответственно, 1:10 и 1:1280, то на 42 сутки он достигал 1:10240, оставаясь неизменным во время всего периода наблюдения (табл.4).

Таблица 4. Результаты определения антиколонизирующих и антитоксических антител с помощью реакции агглютинации и ELISA в сыворотках крови кроликов после внутрижелудочного введения им клеток штамма Е. coli KM148

Сутки после Среднеарифметические титры Среднегеометрические

иммунизации антител к адгезину CFA/I* титры (в ед/мл) антиток-

сических антител

7 10 1600

14 160 3200

21 640 3200

28 1280 3200

35 2560 12800

42 10240 12800

49 10240 12800

Примечание:* в реакции агглютинации использовались антисыворотки, адсорбированные клетками исходного штамм Е. coli M17 для удаления антител к другим поверхностным структурам.

Исходя из результатов экспериментов, следует считать, что полученный штамм Е. coli KM148, за счет эффективной продукции адгезина CFA/I, вызывает образование у вакцинированных животных антиколонизирующих антител, обладающих агглютинирующей активностью.

При определении уровня антител к В-субьединице холерного токсина с помощью ELISA было выявлено, что нарастание их титра происходило более быстро, чем антител к адгезину CFA/I. Уже на 14 день после иммунизации среднегеометрические титры этих антител достигали 1:3200. Максимальный титр антитоксических антител (1:12800) регистрировался на 35 сутки после иммунизации и сохранялся на протяжении всего срока наблюдения - 49 суток (табл.4).

Таким образом, в результате проведенной работы установлено, что штамм Е. coli KM 148, несущий рекомбинантные плазмиды с генами протек-тивных антигенов, обладает высокой иммуногенностью, поскольку у иммунизированных животных происходит образование значительного количества антитоксических и антиколонизирующих антител.

Для определения иммуногенной активности штамма V. choleras КМ 182 проводили трехкратную внутрижелудочную иммунизацию 7-и взрослых кроликов суспензией клеток этого штамма в дозах 1х109 (вводилась 4-м кроликам) и 5х1010м.т./мл (вводилась 3-м кроликам). Сыворотки крови от животных получали на 7, 14, 21, 28, 35, 42 и 49 сутки после первой иммунизации для выявления динамики накопления антиколонизирующих и антитоксических антител в полученных сыворотках. По результатам качественного метода ДИА в сыворотках иммунизированных кроликов присутствовали антитела как к адгезину CFA/I, так и к В-субьединице холерного токсина. При количественной оценке образования антиколонизирующих антител с помощью описанного выше способа было установлено, что нарастание антител в крови к CFA/I также происходило на протяжении 42 суток, как и в случае штамма Е. coli KM148. Максимальный титр составлял 1:20480 (табл.5).

Таблица 5. Результаты определения антиколонизирующих и антитоксических антител с помощью реакции агглютинации и ELISA в сыворотках крови кроликов после внутрижелудочного введения им клеток штамма V. choleraeKM182

Сутки после иммунизации Среднеарифметические титры антител к адгезину CFA/I* Среднегеометрические титры (в ед/мл) антитоксических антител

7 10 800

4 160 1600

21 1280 3200

28 2560 6400

35 10240 6400

42 20480 12800

49 20480 25600

Примечание: * В реакции агглютинации использовались антисыворотки, адсорбированные клетками исходного штамм V. cholerae 170 для удаления антител к другим поверхностным структурам.

На основании этих данных следует считать, что сконструированный штамм V. cholerae KM 182 за счет эффективной продукции адгезина CFA/I способен вызывать образование у вакцинированных животных антиколонизирующих антител, обладающих агглютинирующей активностью.

Что касается динамики образования антител к В-субьединице холерного токсина, определенной с помощью ELISA, то было выявлено более быстрое нарастание их титра в крови иммунизированных животных по сравнению с антительным ответом на адгезии CFA/I. Уже на 21 сутки после иммуни-

зации среднегеометрические титры этих антител составили 1:3200 и на 49 сутки- 1:25600 (табл.5).

Подводя итог проведенной работе, следует сделать заключение, что диплазмидный штамм холерного вибриона 0139 серогруппы, несущий реком-бинантные плазмиды с генами протективных антигенов В-субьединицы холерного токсина и адгезина CFA/I, обладает выраженной иммуногенной активностью.

Протективные свойства штамма Е. coli KM 148 оценивались двумя способами - по снижению адгезии к кишечному эпителию клеток вирулентного штамма у иммунного кролика, а также на модели иммунизированных внут-рижелудочно через зонд взрослых кроликов указанным штаммом и последующем заражении их высоковирулентным штаммом с помощью RITARD-техники.

Для определения адгезии клеток вирулентных штаммов в лигирован-ных петлях тонкой кишки взрослых кроликов была проведена трехкратная иммунизация 4-х животных штаммом Е. coli KM148 в дозе 5x1010 м.т./мл с интервалом в 28 суток. В качестве контроля было взято 4 неиммунных кролика. Затем в дотированные петли тонкой кишки опытных и контрольных животных было введено 106 м.т./мл вирулентных штаммов V. cholerae RV79 и М698. Через 4 ч после заражения животных умерщвляли и по методу, описанному в Методических рекомендациях «Основные требования к вакцинным штаммам холерного вибриона» (2003), определяли индекс адгезии. В результате было установлено, что у иммунных кроликов индексы адгезии были более чем в 100 раз ниже по сравнению с контрольными животными. Так, в случае вирулентного штамма М698 этот показатель для иммунного кролика составлял 0,00869, а для контрольного - 0,9236. Из этого следует, что у иммунных кроликов происходит накопление в крови антиадгезивных антител, которые защищают их от заражения вирулентными штаммами холерного вибриона.

Протективные свойства штамма кишечной палочки с помощью RITARD-техники оценивали также на модели 18 иммунизированных внутри-желудочно взрослых кроликов, которых на 14-е сутки после последней иммунизации заражали штаммом V. cholerae М698 в дозах 108 и 109 м.т./мл. Контролем служили 3 интактных животных, зараженных аналогичным образом. Наблюдения за экспериментальными животными осуществляли в течение 5 суток. Регистрировали признаки экспериментальной холеры (наличие диареи) и морфологические изменения как у опытных, так и контрольных животных, погибших или умерщвленных хлороформом через 5 суток (наличие кровоизлияний на серозной и в слизистой оболочках кишки, воспаление на поверхности слизистой, развитие резких дистрофических изменений паренхиматозных элементов на внутренних органах, степень наполнения кишечника содержимым). Интактные кролики, зараженные по методу RITARD вирулентным

штаммом V. ско1вгав М698, пали в течение 24 ч после заражения с характерной для холерной инфекции острой диареей с последующим высевом чистой культуры холерного вибриона.

Все опытные животные в зависимости от иммунизирующих и заражающих доз были поделены на 6 групп (табл.6). Анализ полученных данных показал, что иммунизирующие дозы 108 и 109 м.т./мл (1-я и 2-я группы) не могут обеспечить 100% защиту привитых кроликов. У погибших без внешних признаков диареи животных было умеренное количество жидкого содержимого в их кишечнике. При вскрытии выживших и забитых через 5 суток после заражения из опытной группы было отмечено, что поверхность слизистой была с признаками умеренного воспаления, а в тонком кишечнике содержалось незначительное количество жидкости с примесью слизи. Следовательно, у этой группы животных отмечались признаки энтерита различной интенсивности (табл.6).

При повышении иммунизирующей дозы до 5х109 м.т./мл (3-я и 4-я группы) наблюдалась 100% защита опытных животных. Однако вскрытие умерщвленных кроликов показало у них остаточное проявление энтерита (умеренная инъекция сосудов, в тонком кишечнике единичных животных -скудное количество жидкости со слизью). Увеличение иммунизирующей дозы в 10 раз (5-я и 6-я группы) обеспечила полную защиту животных от заражения при отсутствии у них видимых признаков инфекции (табл.6).

Таблица 6. Дозы заражения и иммунизации, использованные для изучения про-тективных свойств потенциально вакцинного штамма Е. coli KM 148

N группы Доза иммунизации (м.т./мл) Доза заражения (м.т./мл) % выживших животных Клиническое проявление инфекционного процесса

Контроль 0 109 0 ++++

1 10s 109 75 ++

2 109 108 80 + +

3 5х109. 108 100 +

4 5х109 109 100 +

5 5х1010. 108 100 -

6 5х1010 109 100 -

Таким образом, оптимальная доза иммунизации, защищающая лабораторных животных от развития инфекционного процесса при заражении их высоковирулентным штаммом V. ско1вгав М698 в дозах 108 -109 м.т./мл, составляла 5 х 1010 м.т./мл.

Протективные свойства штамма V.cholerae КМ 182 были также оценены на модели восьми иммунизированных внутрижелудочно взрослых кроликов клетками указанного штамма с последующим заражением штаммом V.cholerae Р16064 серогруппы 0139 по методу ШТАШБ. Животных опытной группы на 14 сутки после последней иммунизации заражали штаммом V. cho-lerae Р16064 в дозах 108 и 109 м.т./мл. Контролем служили 2 интактных животных, зараженных аналогичным образом. Наблюдения за экспериментальными животными вели в течение 5 суток. Описание указанных выше морфологических изменений как у опытных, так и у контрольных животных проводили по мере их гибели или после умерщвления их хлороформом по истечении 5 суток. Интактные кролики, зараженные по методу ШТАШБ вирулентным штаммом V.cholerae Р16064 в дозе 109 м.т./мл, пали в течение 24 ч после заражения с характерной для холерной инфекции картиной острой диареи с последующим высевом чистой культуры холерного вибриона.

Все выжившие кролики из опытной группы (срок наблюдения 5 суток) были умерщвлены хлороформом. В зависимости от иммунизирующей и заражающей доз, представленных в табл. 7, опытные животные были поделены на три группы. Все животные 3-х опытных групп, зараженные вирулентным штаммом в дозах 108 и 109 м.т./мл, доживали до 5-х суток (время наблюдения) в 100% случаев и не имели выраженных изменений со стороны внутренних органов.

Таблица 7. Дозы заражения и иммунизации, используемые для изучения про-тективных свойств потенциально вакцинного штамма V.cholerae КМ182

Контроль 0 109 0 ++++

1 109 108 100 -

2 109 109 100 -

3 5х1010 108 100 -

Полученные результаты дают основание считать, что штамм V. cholerae КМ 182 обладает выраженной протективностью при иммунизирующей дозе 109 м.т./мл.

Подводя итог комплексного исследования, связанного с конструированием диплазмидных штаммов кишечной палочки и холерного вибриона, несущих клонированные гены основных протективных антигенов, и изучением их иммуногенных и протективных свойств, следует отметить, что полученные результаты свидетельствуют о решении важной практической задачи - создания потенциально вакцинных штаммов против холеры, вызываемой вирулент-

ными штаммами V. cholerae O1 и 0139 серогрупп.

ВЫВОДЫ:

1. На основе авирулентных штаммов кишечной палочки Е. coli M17 и холерного вибриона 0139 серогруппы V. cholerae 170 сконструированы ди-плазмидные штаммы Е. coli KM148(pIEM3)(pCFAI) и V. cholerae KM182(pIEM3)(pCFAI), содержащие клонированные гены ctxB и cfa\, контролирующие, соответственно, продукцию В-субьединицы холерного токсина и адгезина CFA/I - основных протективных антигенов.

2. Установлено, что сконструированные штаммы Е. coli KM 148 и V. cholerae KM 182 стабильно наследуют в условиях in vitro и in vivo плазмид-ные гены ctxB и cfal, ответственные за биосинтез В-субьединицы холерного токсина и пилей адгезии, соответственно.

3. Показано, что созданные штаммы Е. coli KM 148 и V. cholerae КМ 182 имеют высокий уровень продукции В-субьединицы холерного токсина и адгезина CFA/I за счет эффективной экспрессии введенных клонированных генов ctxB и cfal.

4. На основании клинико-морфологических показателей установлена безвредность рекомбинантных штаммов Е. coli KM148 и V. cholerae KM182 для модельных лабораторных животных. Сконструированные штаммы, введенные внутрикишечно и внутрижелудочно крольчатам-сосункам (1х109 и 5х109 м.т./мл.), не вызывали гибели животных, заболеваний или макроскопических изменений в их кишечнике, а также в других внутренних органах (в почках, печени, селезенке).

5. Доказано, что штаммы Е. coli KM 148 и V. cholerae KM 182 способны к более эффективной колонизации тонкого и толстого кишечника крольчат-сосунков по сравнению с исходными штаммами, не содержащими плазмид. При подсчете количества клеток бактерий, находящихся на 1 см2 поверхности тонкого отдела кишечника, установлено, что колонизирующая активность штаммов Е. coli КМ148 и V. cholerae KM182 в 4000 и 1280 раз, соответственно, превышает таковую исходных штаммов Е. coli М17 и V. cholerae 170.

6. Рекомбинантные штаммы Е. coli KM148 и V. cholerae KM182 обладают выраженными иммуногенными свойствами. Трехкратная внутрижелу-дочная иммунизация взрослых кроликов живой культурой указанных штаммов вызывала образование в сыворотке крови специфических антитоксических и антиадгезивных антител в высоких титрах.

7. Показано, что рекомбинантные штаммы Е. coli КМ148 и V. cholerae KM 182 имеют выраженную протективность. Они способны защищать организм лабораторных животных от заражения вирулентными штаммами холерного вибриона 01 или 0139 серогрупп.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Захарова Т.Н., Ливанова Л.Ф., Кобкова И.М., Киреев М.Н., Смирнова Н.И. Выделение и очистка адгезина CFA/I из клеток штамма Escherichia coli JP53 (pCFAl) и получение антител к этому протективному антигену //Матер. VI Российского съезда врачей-инфекционистов - С.-Петербург, 2003. - С. 146.

2. Кобкова И.М., Ливанова Л.Ф., Чеховская Г.В., Смирнова Н.И. Конструирование штамма Escherichia coli - продуцента протективных антигенов // Матер. конф. "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями". Третья междунар. конф., посв. 80-летию ин-та им. Пастера. - С.-Петербург, 2003. - С. 166.

3. Lotsmanova E.Y., Kravtsov A.L., Livanova L.F., Kobkova I.M, Kuznetsov O.S., Shchukovskaya T.N., Kutyrev V.V. Flow cytofluorometric monitoring of leukocyte apop-tosis in experimental cholera // Proc. SPIE - 2003. - V. 5068. - P. 462-466.

4. Кобкова И.М., Ливанова Л.Ф., Осин А.В., Смирнова Н.И. Получение авирулентно-го штамма холерного вибриона 0139 серогруппы, продуцирующего иммуногенную В-субъединицу холерного токсина // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2004.-Вып. 1(87).. -С.45-47

5. Кобкова И.М., Ливанова Л.Ф., Осин А.В., Смирнова Н.И. Авирулентный штамм Vibrio cholerae 0139 серогруппы - продуцент протективных антигенов // Матер. третьего съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров России «Генетика в XXI веке: совр. состояние и перспективы развития» 6-12 июня 2004 г, С.382

6. Кобкова И.М., Ливанова Л.Ф., Осин А.В., Смирнова Н.И. Конструирование и изучение иммунобиологических свойств рекомбинантного штамма Vibrio cholerae 0139 серогруппы - кандидата в вакцинные штаммы // Матер. науч. конф. с международным участием «Совр. средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций» - С.-Петербург, 2004. - Том 1. - С. 152

7. Кобкова И.М., Ливанова Л.Ф., Чеховская Г.В., Лоцманова Е.Ю., Смирнова Н.И. Иммуногенные и протективные свойства сконструированного рекомбинантного штамма Escherichia coli KM 148 - кандидата в живую противохолерную вакцину // Матер. XI Рос. Национального Конгресса "Человек и лекарство" - Москва, 2004. - С. 796.

8. Кобкова И.М., Ливанова Л.Ф., Заднова С.П., Смиронова С.М. Антигенные свойства рекомбинантного штамма Vibrio cholerae 170(pIEM3)(pCFA/I) 0139 серогруппы // Холера. Матер. Российской научно-практич. конф. по проблеме «ХОЛЕРА». - Ростов-на-Дону, 2004.- С 89-90.

9. Пат. на изобретение №2232189 Ru. С 12 N 1/21 - Штамм бактерий Escherichia coli KM 148 - продуцент протективных антигенов, используемых для иммунопрофилактики колибактериоза и холеры / Смирнова Н.И., Чеховская Г.В., Ливанова Л.Ф., Кобкова И.М. (Россия)-2002.-8 с.

10. Пат. на изобретение №2236455 Ru. С 12 N 1/21 - Штамм бактерий Vibrio cholerae KM 168 - основа для конструирования живых вакцин против диарейных заболеваний, вызываемых патогенными штаммами Vibrio cholerae 0139 / Осин А.В., Ливанова Л.Ф., Кобкова И.М., Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И. (Россия) - 2003. - 8 с.

11. Пат. на изобретение №2238975 Ru. С 12 N 1/21 - Штамм бактерий Escherichia coli KM 147 — продуцент В-субъединицы холерного токсина / Смирнова Н.И., Чеховская

Г.В., Ливанова Л.Ф., Кобкова И.М. (Россия) - 2003. - 8 с.

Сдано в набор 2005г. Подписано к печати 14.02.05. Формат 84x108 1/6. печать лазерная. Бумага финская Гарнитура Таймс. Объем 1,1 усл.пл. Тираж 100 экз.

".hl

KOS"

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Кобкова, Ирина Михайловна

СПИСОК ПРИНЯТЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Основные протективные антигены возбудителя холеры.

1.1.1. Протективные антегены Vibrio cholerae Ol серогруппы.

1.1.2. Протективные антигены V. cholerae 0139 серогруппы.

1.2. Протективные антигены кишечной палочки.

1.3. Живые холерные вакцины.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.Г.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Бактериальные штаммы.

2.2. Питательные среды и реактивы.

2.3. Методы.

2.3.1. Конъюгационные скрещивания.

2.3.2. Метод популяционного анализа для изучения стабильности наследования плазмид в клетках изучаемых штаммов.

2.3.3. Скрининг плазмид по методу C.J. Kado, S.T. Liu (1981).

2.3.4. Электрофорез белков холерного вибриона в полиакриламидном геле.

2.3.5. Реакция маннозорезистентной гемагглютинации (МРГА).

2.3.6. Реакция пассивного иммунного гемолиза (РПИГ) и иммуноферментный анализ (ELISA).

2.3.7. Электронно-микроскопическое исследование.

2.3.8. Определение продукции фосфолипазы и растворимой гемагглю-тинин/протеазы.

2.3.9. Определение безвредности сконструированных штаммов на модельных лабораторных животных.

2.3.10. Исследование колонизирующей способности созданных диплаз-мидных штаммов.

2.3.11. Изучение антигенных свойств диплазмидных штаммов.

2.3.12. Получение адсорбированной антисыворотки к адгезину CFA/I и В-субъединице холерного токсина.

2.3.13. Дот-иммуноанализ (ДИА).

2.3.14. Развернутая реакция агглютинации в пробирках для определения титра антител к адгезину CFA/I в крови иммунизированных животных.

2.3.15. Иммуноферментный метод (ELISA).

2.3.16. Оценка протективности сконструированного штамма Е. coli КМ148 по снижению количества вирулентных вибрионов, прикрепившихся к кишечному эпителию иммунных кроликов.

2.3.17. Метод RITARD, использованный для определения протективных свойств сконструированных штаммов.

ГЛАВА 3. КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ Е. COLI

КМ148(pIEM3)(рCFAI) И V. CHOLERAE KM182(pIEM3)(pCFAI).

3.1. Создание диплазмидного штамма Е. coli М17, содержащего реком-бинантные плазмиды с клонированными генами В-субъединицы холерного токсина и адгезина CFA/1.

3.2. Получение авирулентного диплазмидного штамма V. cholerae 0139 серогруппы, содержащего рекомбинантные плазмиды с клонированными генами В-субъединицы холерного токсина и адгезина CFA/I.J.

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ НАСЛЕДОВАНИЯ ГЕНОВ ПРОТЕК-ТИВНЫХ АНТИГЕНОВ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИХ ЭКСПРЕССИИ В СОЗДАННЫХ ШТАММАХ Е. COLI

KM148(pIEM3)(pCFAI) И V. CHOLERAE KM182(pIEM3)(pCFAI).

4.1. Определение стабильности наследования рекомбинантных плаз-мид в клетках штаммов Е. coli KM148(pIEM3)(pCFAI) и V. cholerae KM182(pIEM3)(pCFAI) в условиях in vitro и in vivo.

4.2. Изучение экспрессии введенных генов протективных антигенов в клетках штаммов Е. coli КМ148 и V. cholerae КМ182.

4.2.1. Определение экспрессии генов В-субъединицы холерного токсина в клетках исследуемых штаммов.

4.2.2. Определение экспрессии генов адгезина СРАЯ в клетках штаммов Е. coli КМ148 и V. cholerae КМ182.

4.2.3; Изучение влияния чужеродного гена cfal на экспрессию собственных генов протективных антигенов у V. cholerae КМ182.

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ БЕЗВРЕДНОСТИ, КОЛОНИЗИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ, АНТИГЕННЫХ И ПРОТЕКТИВНЫХ СВОЙСТВ СКОНСТРУИРОВАННЫХ ДИПЛАЗМИДНЫХ ШТАММОВ Е. COLI КМ pIEM3)(pCFAI) И V. CHOLERAE KM182(pIEM3)(pCFAI).

5.1. Изучение безвредности штаммов Е. coli КМ148 и V. cholerae КМ

5.2. Определение колонизирующей способности исследуемых диплаз-мидных штаммов.

5.2.1. Определение колонизирующей способности штамма кишечной палочки Е. coli КМ148.

5.2.2. Определение колонизирующей способности штамма холерного вибриона 0139 серогруппы V. cholerae КМ182.

5.3. Определение антигенных свойств сконструированных диплазмид-ных штаммов Е. coli КМ148 и V. cholerae КМ182.

5.3.1. Определение антигенных свойств штамма Е. coli КМ148 по накоплению в сыворотке крови иммунизированных животных антико-лонизирующих и антитоксических антител.

5.3.2. Определение антигенных свойств штамма V. cholerae КМ182 по накоплению в сыворотке крови иммунизированных животных анти-колонизирующих и антитоксических антител.

5.4. Определение протективных свойств исследуемых штаммов.

5.4.1. Определение протективности штамма Е. coli КМ148 по снижению количества вирулентных вибрионов, прикрепившихся к кишечному эпителию иммунных кроликов.

5.4.2. Определение протективных свойств штамма кишечной палочки

Е. coli КМ148 методом RITARD.

5.4.3. Определение протективных свойств сконструированного штамма

V. cholerae КМ182 методом RITARD.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Конструирование и изучение иммунобиологических свойств рекомбинантных штаммов Escherichia coli и Vibrio cholerae, продуцирующих протективные антигены - В-субъединицу холерного токсина и адгезин CFA/I"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Холера — тяжелое диарейное заболевание, вызываемое вирулентными штаммами Vibrio cholerae, остается одной из важнейших проблем здравоохранения многих стран мира. В начале 21 века продолжаются крупные эпидемии и вспышки этого заболевания в странах Азии, Африки и Америки. Так, с 2001 г. по 2003 г. зарегистрировано 420752 больных холерой эльтор в 52 странах мира. Что касается V. cholerae 0139 серогруппы, то вспышки холеры, вызванные этим возбудителем, регистрируются на ограниченной территории стран Юго-Восточной Азии. Стало известно, что вирулентные штаммы возбудителя холеры этой новой серогруппы вызвали недавнюю крупную вспышку холеры (30000 больных) в Дакке и на прилегающих к ней территориях [Faruque S.M. et al., 2003; Москвитина Э.А. и др., 2004]. При наличии высокого уровня миграции населения, неблагоприятных социально-экономических условий жизни возможность завоза холеры в Россию реально существует. Вышесказанное диктует необходимость создания современных и надежных отечественных средств и методов профилактики этого особо опасного инфекционного заболевания.

К настоящему времени зарубежные и отечественные исследователи разработали ряд живых и неживых холерных вакцин, проверенных на безопасность, имму-ногенность и протективность. Среди них следует отметить убитую цельноклеточ-ную оральную вакцину WC/rBS с добавлением очищенной В-субъединицы холерного токсина, лицензированную в ряде стран, которая, несмотря на широкое ее использование, вызывает лишь частичную защиту от холеры [Holmgren J. et al, 1999; Taylor D.N. et al., 2000]. Практическое применение получила и лицензированная в

России таблегированная бивалентная химическая вакцина «холероген-анатоксин +0-антиген», которая оказалась более эффективной по сравнению с описанной выше [Наумов А.В. и др., 1992; Лоцманова Е.Ю. и др., 2002].

Что касается известных живых холерных вакцин CVD 1 ОЗ-HgR и CVD 111, то они, характеризуясь наибольшим эффектом вакцинации, в большинстве случаев имеют выраженную остаточную реактогенность, вызывая у ряда вакцинированных развитие легкой диареи [Kaper J.B. et al., 1989; Levine М.М. et al., 1998; Wiederman С. et al., 1998; Taylor D.N. et al, 1999].

Альтернативным способом доставки антигенов в организм человека является иммунизация участками ДНК, кодирующими антигенные белки возбудителя. Экспрессия соответствующих генов в клетках хозяина приводит к развитию иммунного ответа и, как следствие, к защите от инфекции [Карягина А.С. и др., 2004]. Безусловно, очевиден мощный потенциал данной технологии для решения задач специфической профилактики, но в этом направлении необходимы дальнейшие исследования.

Таким образом, несмотря на попытки многих исследователей в течение более 100 лет создать идеальную холерную вакцину, до сих пор проблема разработки эффективного и безопасного профилактического препарата против холеры остается нерешенной. Отсутствие доступных для нас сведений о сконструированных отечественных живых вакцинных штаммов против холеры, которые были бы не только эффективны, но и безопасны, свидетельствует об актуальности исследований, направленных на получение холерных вакцин нового поколения.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - сконструировать на основе авирулентных штаммов Escheriтивных антигенов безопасного для человека штамма Е. coli Ml 7, на основе которого изготавливается лечебно-профилактический препарат колибактерин.

Установлено, что в сконструированных штаммах Е. coli I<M148(pIEM3)(pCFAI) и V. cholerae KM182(pIEM3)(pCFAI) введенные в составе плазмид клонированные гомо- и гетерологичные гены cixB и cfal, определяющие биосинтез В-субъединицы холерного токсина и фактора адгезии CFA/I - основных протективных антигенов, стабильно наследуются в условиях in vitro и in vivo. Выявленный уровень биосинтеза В-субъединицы холерного токсина и адгезина CFA/I в клетках диплазмидных штаммов кишечной палочки и холерного вибриона указывает на эффективную экспрессию введенных генов.

Новые данные получены при исследовании колонизирующей активности штаммов Е. coli KM148(pIEM3)(pCFAI) и V. cholerae KM182(pIEM3)(pCFAI) на модели лабораторных животных (крольчата-сосунки). Установлено, что присутствие в созданных штаммах Е. coli КМ148 и V. cholerae КМ182 плазмиды pCFAI обеспечивает повышение их колонизирующей активности, соответственно, в 4000 раз и 1280 раз, по сравнению с исходными штаммами Е. coli М17 и V. cholerae 170.

Установлено, что сконструированные штаммы обладают выраженными им-муногенными свойствами, вызывая у иммунизированных животных образование в высоких титрах антитоксических и антиколоиизирующих антител. Доказана про-тективность сконструированных штаммов, которая выразилась в эффективной за

8 9 щите иммунизированных животных от заражения их в высоких дозах (10 -10 м.т./мл) вирулентными штаммами холерного вибриона 01 или 0139 серогрупп.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

По результатам работы составлены методические рекомендации: «Конструирование потенциально вакцинных штаммов против диарейных заболеваний», которые одобрены Ученым Советом (протокол № 7 от 23 декабря 2004 г.) и утверждены зам. директора РосНИПЧИ «Микроб».

В Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" депонированы два штамма Е. coli Ml7 и два штамма V choleraellO с разным набором генов протективных антигенов - В-субъедипицы холерного токсина и адгезина CFA/I. Указанные штаммы могут быть использованы для решения прикладных и фундаментальных задач.

Получены три патента на изобретения патент № 2232189 «Штамм бактерий Escherichia coli KM 148 - продуцент протективных антигенов, используемых для иммунопрофилактики колибактериоза и холеры» (от 10.07.2004); патент № 2238975 «Штамм бактерий Escherichia coli КМ147-продуцент В-субъединицы холерного токсина» (от 27.10.2004), который внесен в базу данных перспективных Российских разработок РОСПАТЕНТа; патент № 2236455 «Штамм бактерий Vibrio cholerae KM 168 — основа для конструирования живых вакцин против диарейных заболеваний, вызываемых штаммами Vibrio cholerae 0139» (от 20.09.2004).

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. На основе авирулентных штаммов кишечной палочки Е. coli М17 и холерного вибриона 0139 серогруппы V cholerae 170 сконструированы диплазмид-ные штаммы Е. coli КМ148 и V. cholerae КМ182, содержащие гены двух основных протективных антигенов - ctxB, контролирующего биосинтез В-субъединицы холерного токсина, и cfal, ответственного за продукцию адгезина CFA/I энтеротокси-генных кишечных палочек.

2. Клонированные в составе плазмид гены ctxB и cfal, кодирующие биосинтез В-субъединицы холерного токсина и адгезина CFA/I, стабильно наследуются и эффективно экспрессируются в клетках созданных авирулентных штаммов Е. coli КМ 148 и V. cholerae КМ182.

3. Присутствие в клетках сконструированных штаммов Е. coli КМ 148 и V. cholerae КМ 182 плазмиды pCFAI с геном cfal, контролирующим продукцию адгезина CFA/I, обеспечивает значительное повышение их адгезивной способности по сравнению с исходными штаммамиЕ. coliMll и V. cholerae 170.

4. Сконструированные рекомбинаитные штаммы Е. coli КМ 148 и V. cholerae КМ 182 на основании клинико-морфологических показателей являются безвредными для лабораторных животных, обладают высокой колонизирующей способностью и выраженными иммупогенными свойствами.

5. Исследуемые штаммы Е. coli КМ148 и V. cholerae КМ182 имеют высокую протективную активность. Они эффективно защищают модельных лабораторных животных от последующего заражения их вирулентными штаммами холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Материалы диссертации доложены и представлены на научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2001, 2002, 2003); на International Society for Optical Engineering «Optical Technologies in Biophysics and

Medicine IV» (Saratov Fall Meeting, 2002); на XI Российском Национальном Конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2004); на научной конференции с международным участием «Современные средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2004); на третьем съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров России «Генетика в XXI веке: современное состоянии и перспективы развития» (Москва, 2004).

ПУБЛИКАЦИИ.

По теме диссертации опубликовано 11 научных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. ;

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов,

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Кобкова, Ирина Михайловна

ВЫВОДЫ

1. На основе авнрулентных штаммов кишечной палочки Е. coli Ml7 и холерного вибриона 0139 серогруппы V. cholerae 170 сконструированы диплазмидные штаммы Е. coli KM 148(pIEM3)(pCFA/I) и V. cholerae KM182(pIEM3)(pCFA/I), содержащие клонированные гены ctxВ и cfa 1, контролирующие, соответственно, продукцию В-субьединицы холерного токсина и адгезина CFA/I - основных протективных антигенов.

2. Установлено, что сконструированные штаммы Е. со//КМ148 и V. cholerae КМ 182 стабильно наследуют в условиях in vitro и in vivo плазмидные гены ct:сВ и cfa\, ответственные за биосинтез В-субьединицы холерного токсина и пилей адгезии, соответственно.

3. Показано, что созданные штаммы Е. coli КМ148 и V. cholerae КМ182 имеют высокий уровень продукции В-субьединицы холерного токсина и адгезина CFA/1 за счет эффективной экспрессии введенных клонированных генов ctx В и cfa\.

4. На основании клинико-морфологических показателей установлена безвредность рекомбинантных штаммов Е. coli КМ148 и V. cholerae КМ182 для модельных лабораторных животных. Сконструированные штаммы, введенные внутрики-шечно и внутрижелудочно крольчатам-сосункам (1x109 и 5x109 м.т./мл.), не вызывали гибели животных, заболеваний или макроскопических изменений в их кишечнике, а также в других внутренних органах (в почках, печени, селезенке). 5. Доказано, что штаммы Е. coli КМ148 и V. cholerae КМ182 способны к более эффективной колонизации тонкого и толстого кишечника крольчат-сосунков по сравнению с исходными штаммами, не содержащими плазмид. При подсчете количества клеток бактерий, находящихся на 1 см2 поверхности тонкого отдела кишечника, установлено, что колонизирующая активность штаммов Е. coli КМ 148 и V. cholerae КМ182 в 4000 и 1280 раз, соответственно, превышает таковую исходных штаммов Е. coli М17 и V. cholerae 170.

6. Рекомбинантные штаммы E.coli КМ 148 и V. cholerae КМ182 обладают выраженными иммуногенными свойствами. Трехкратная внутрижелудочная иммунизация взрослых кроликов живой культурой указанных штаммов вызывала образование в сыворотке крови специфических антитоксических и антиадгезивных антител в высоких титрах.

7. Показано, что рекомбинантные штаммы Е. со//КМ148 и V. cholerae КМ182 имеют выраженную протективность. Они способны защищать организм лабораторных животных от заражения вирулентными штаммами холерного вибриона 01 или 0139 серогрупп.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В связи с тем, что до сих пор ни одна из известных холерных вакцин пока не соответствует идеальному профилактическому препарату, проблема разработки эффективных и безопасных вакцинных штаммов остается актуальной.

В результате развития генной инженерии появилась возможность конструировать живые вакцины путем введения в клетки выбранного штамма-носителя чужеродных и (или) собственных клонированных генов протективных антигенов с помощью векторных плазмид. В состав плазмиды, несущей клонированные гены антигенов, входят, как правило, маркерные гены, которые, чаще всего, сообщают клетке устойчивость к определенным антибиотикам. Вследствие таких свойств рекомбинантных плазмид вакцинный штамм (или кандидат в вакцинный) легко отделить от других штаммов путем высева на селективный агар. v

На первом этапе работы перед нами встал вопрос о выборе генов протективных антигенов для включения их в состав потенциально вакцинных штаммов. Согласно современным представлениям, инфекционный процесс при холере складывается из двух основных этапов: 1) колонизации тонкого кишечника вирулентными штаммами V. cholerae, прикрепившимися к кишечному эпителию, и 2) продукции ими холерного секретируемого энтеротоксина. Следовательно, для предотвращения развития холеры вакцины должны содержать антигены, которые обусловили бы образование антиколонизирующих и антитоксических антител.

Исходя из этих теоретических положений, была поставлена задача сконструировать рекомбинантные штаммы, которые содержали бы клонированные гены двух основных протективных антигенов - адгезина CFA/I, присутствующего у патогенных для человека штаммов Е. coli, и В-субьединицы холерного токсина. При стабильном наследовании введенных генов и их высокой активности в бактериальных клетках нового хозяина, такие штаммы должны обусловить у привитых формирование антиколонизирующего и антитоксического иммунитета и обеспечить защиту их от заражения вирулентными штаммами холерного вибриона.

Второй важнейший вопрос заключался в выборе нами носителя протективных антигенов. В связи с большим значением, которое придается безопасности вакцинного препарата, мы впервые использовали новый подход, взяв в качестве носителя указанных генов протективных антигенов хорошо изученный штамм Е. coli Ml7, который используется в России для производства колибактерина - препарата, предназначенного для лечения и профилактики кишечных заболеваний у человека. Выбор указанного штамма для пашей работы был обусловлен доказанной на протяжении десятков лет его безопасностью для живого организма.

Для конструирования потенциально вакцинного штамма против холеры, вызываемой вирулентным штаммом V. cholerae 0139 серогруппы, в качестве носителя протективных антигенов был взят авирулентный штамм V. cholerae 170, выделенный из открытых водоемов Московской области, геном которого был лишен основных и второстепенных структурных и регуляторных генов вирулентности: ctxA, zot, асе, toxТ, кодирующих и контролирующих продукцию основного холерного токсина и дополнительных токсинов Zot и Асе. Важное значение имело также отсутствие в геноме этого штамма гена tcpA, кодирующего основную субъединицу токсин-корегулируемых пилей адгезии, которые являются не только ключевым фактором колонизации, но и выполняют роль рецептора для фага вирулентности СТХф (с/хАВ, zot, асе), а также нуклеотидной последовательности attRS - сайта для внедрения указанного фага в хромосому. Указанные генетические особенности штамма V. cholerae 170 свидетельствуют о том, что этот штамм практически не может реверсировать в вирулентный путем приобретения профага СТХф в результате горизонтального переноса генов. Кроме того, выбранный штамм V. cholerae 170 из-за внесенной мутации в ген hly, кодирующей биосинтез термолабильного гемолизина, утратил способность к биосинтезу этого белка [Осин А.В. и др., 2002], который является цитотоксином.

Основным итогом исследований, представленных в первом разделе экспериментальной части данной работы, является конструирование па основе выбранных штаммов Е. coli Ml7 и V. cholerae 170 штаммов Е. coli KM148(pIEM3)(pCFAI) и V. cholerae KM182(pIEM3)(pCFAI), содержащих две плазмиды с генами основных протективных антигенов - секретируемой В-субьединицы холерного токсина и поверхностной структуры адгезипа CFA/I. Поскольку, было установлено, что указанные плазмиды не включились в состав хромосомы, а сохранялись в клетке в автономном состоянии, встал вопрос о стабильности их наследования штаммами Е. coli КМ 148 и V. cholerae КМ 182. Важность этого вопроса была обусловлена тем, что только штамм со стабильным наследованием плазмид, несущих необходимые гены, мог представлять интерес для последующей работы по конструированию потенциально живой вакцины. Проведенные исследования позволили сделать вывод, что обе плазмиды с клонированными генами ctxQ и cfal стабильно наследовались клетками штаммов Е. coli КМ 148 и V. cholerae КМ 182 в условиях in vitro и in vivo.

Вторым не менее важным был вопрос о том, могут ли введенные на плазми-дах гены etx В и cfal, свойственные, соответственно, патогенным штаммам V. cholerae и Е. coli, активно функционировать или экспрессироваться в клетках нового хозяина - Е. coli М17 (в случае гена ctxB) и V. cholerae 170 (в случае гена cfal), генетическая организация которых может иметь определенные отличия от таковой указанных возбудителей инфекционных болезней. Серологические и биохимические исследования, а также эксперименты на модельных лабораторных животных убедительно показали, что введенные на плазмидах гомо- и гетерологич-ные гены протективных антигенов активно выражаются в клетках рекомбинантно-го штамма кишечной палочки Е. coli KM148(pIEM3)(pCFAI) и холерного вибриона 0139 серогруппы V. cholerae KM182(pIEM3)(pCFAI). Об этом свидетельствует тот факт, что полученные рекомбинантные штаммы кишечной палочки и холерного вибриона 0139 серогруппы в значительных количествах продуцируют адгезин CFA/I и В-субьединицу холерного токсина. Так, за счет присутствия в клетках штаммов Е. coli КМ148 и V. cholerae КМ182 адгезина CFA/I, их способность к заселению тонкого кишечника крольчат-сосунков возросла в 4000 и 1280 раз, соответственно, по сравнению с исходными штаммами, не содержащими плазмид. Что касается продукции В-субьединицы холерного токсина, то, согласно данным им-муноферментного метода (ELISA), штаммы Е. coli KM148(pIEM3)(pCFAI) и V. cholerae KM182(pIEM3)(pCFAI) продуцируют, соответственно, 10 и 6 мкг/мл секретируемого белка. Полученные данные имеют не только большое практическое значение, но и представляют значительный интерес для фундаментальных исследований, так как свидетельствуют о том, что механизм секреции белков в штаммах Е. coli М17, на основе которого получен штамм КМ148, и других штаммов кишечной палочки, отличается, так как последние практически не секретируют в культуральную среду В-субьединицу холерного токсина.

Другим аспектом практического использования полученных данных об эффективной экспрессии чужеродного гена сйсВ в клетках Е. coli Ml7 является конструирование моноплазмидного авирулентного штамма Е. со//М17(р1ЕМЗ), обозначенного нами как Е. coli КМ 147, являющегося продуцентом иммуногенной

В-субъединицы холерного токсина. Приоритетность этой работы подтверждена получением патента на изобретение, который внесен в базу данных перспективных Российских разработок РОСПАТЕНТа.

Представляют интерес данные о том, что за счет увеличения копийности плазмиды рЕЕМЗ с генами ctxQ при выращивании штаммов Е. coli КМ 148 (pIEM3)(pCFAI) и V. cholerae KM182(pIEM3)(pCFAI) на среде с повышенной дозой тетрациклина, получены клоны этих штаммов, продуцирующие в 1,5 раза больше В-субьединицы холерного токсина по сравнению с исходными диплазмидными штаммами. Полученные результаты могут использоваться при создании высокопродуктивных штаммов иммуногенной В-субьединицы на основе авирулентных штаммов Е. coli КМ 148 и V. cholerae КМ182, очищенные препараты которой широко используются в производстве диагностических и профилактических средств.

Центральное место в проблеме создания живых вакцин нового поколения занимают вопросы их безопасности, иммуногенности и протективности. На первом этапе этой работы для оценки безопасности полученных штаммов мы подвергли их доступным нам испытаниям на модели различных лабораторных животных (крольчат-сосунков и взрослых кроликов). Все опытные животные после введения им внутрижелудочно 1х109 м.т./ мл клеток штаммов Е. coli КМ148 или V. cholerae КМ 182 выжили. При вскрытии этих умерщвленных хлороформом животных не было обнаружено никаких выраженных морфологических изменений во внутренних органах. Таким образом, на основании клинико - морфологических показателей был сделан вывод о безопасности сконструированных штаммов. Безусловно, что для подтверждения этого вывода необходимы гистологические исследования патоморфологов, которые к настоящему времени уже завершились.

Одним из основных свойств вакцинных штаммов должна быть их иммуно-генность, т.е. способность вызывать в организме привитых животных образование антиколонизирующих и антитоксических антител в достаточно значимом количестве. Для оценки иммуногенных свойств штаммов Е. coli KM 148(pIEM3)(pCFAI) и V. cholerae KM182(pIEM3)(pCFAI) мы провели внутрижелудочную иммунизацию взрослых кроликов их клетками, а затем изучили динамику накопления антител в сыворотке крови. Оказалось, что созданные штаммы действительно вызывают образование у привитых животных в высоких титрах антитоксических, а также антиколонизирующих антител, которые обладают агглютинирующей способностью. При этом заметное накопление антител в крови происходило через 35-49 суток после первой вакцинации. Высокие титры антител в крови к адгезину CFA/I и

В-субъединице холерного токсина указывают на выраженное иммуногенное действие созданных штаммов.

Итак, проведенные на модели лабораторных животных эксперименты свидетельствуют о том, что сконструированные рекомбинантные диплазмидные штаммы Е. coli KM 148(pIEM3)(pCFAI) и V. cholerae KM182(pIEM3)(pCFAI) являются безопасными и обладают иммуногенными свойствами.

Закономерно встает вопрос о протективности созданных штаммов. С учетом полученных экспериментальных данных следует считать, что протективный эффект штаммов Е. coli КМ 148 и V. cholerae КМ 182 достаточно высок, поскольку они защищали организм привитых лабораторных животных от заражения вирулентными штаммами холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп в дозах 1х108-1хЮ9 м.т./мл.

Более того, присутствие в плазмидах этих штаммов генов, обуславливающих резистентность к тетрациклину и триметоприму, дает возможность легко обнаруживать созданные штаммы как в организме привитых лабораторных животных, так и при различных лабораторных исследованиях.

Таким образом, в представленной работе на основе использования авиру-лентных штаммов Е. coli Ml7 и V. cholerae 170 серогруппы 0139 сконструированы штаммы Е. coli KM17(pIEM3)(pCFAI) и V. cholerae КМ182 (pIEM3)(pCFAI), несущие клонированные гены В-субъединицы холерного токсина и адгезина CFA/I, иммунобиологические свойства которых позволяют рассматривать их в качестве потенциально вакцинных.

Перспективы дальнейших исследований заключаются в продолжении изучения иммуногенных и протективных свойств созданных штаммов для получения экспериментальных доказательств, что штамм Е. coli КМ148 может использоваться как поливалентная живая вакцина против диарейных заболеваний, вызываемых не только V. cholerae 01 и 0139 серогрупп, но и энтеропатогенными штаммами кишечной палочки. Полученные авирулентные моноплазмидные штаммы Е. coli КМ147 и V. cholerae КМ168 - продуценты иммуногенной В-субъединицы холерного токсина после изучения особенностей экспрессии гена ctxВ при выращивании штаммов в производственных условиях могут применяться для получения этого протективного антигена и последующего создания на его основе диагностических тест-систем.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Кобкова, Ирина Михайловна, Саратов

1. Аболина Т.А. Мембранные белки холерного вибриона // Матер. I научн. конф. мол. спец. противочум. учрежд. Кавказа, Кафан. Ставрополь, 1986. - С. 90-94.

2. Адамов А.К. Иммунология холеры. Саратов: изд-во Сарат. ун-та, 1981. - 320 с.

3. Адамов А.К., Павлова Ю.П. Влияние иммунных антител и ферментного звена ксантин на Vibrio cholerae IIЖМЭИ. 1990. - № 2. - С. 6-10.

4. Адамов А.К., Ломов Ю.М., Малеев В.В. с соавт. Холера в СССР в период VII пандемии // Под ред. В.И. Покровского. М., 2000. - 472С.

5. Александров Н. И., Гефен Н.Е. О методах специфической профилактики кишечных инфекций (холера, брюшной тиф, паратифы, дизентерия) // Активная специфическая профилактика инфекционных заболеваний и пути ее усовершенствования.- Москва, 1962. С. 154-183.

6. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях// JL, 1962

7. Блохина И.Н., Дорофейчук В.Г. Дисбактериозы // JI. Медицина, 1979. 176 с.

8. Бондаренко В.М., Мавзютов А.Р., Габидуллин З.Г. Термолабильные энтероток-сины условно-патогенных представителей Enterobactericeae// ЖМЭИ. 1998. -№ 3.- С. 104-107.

9. Бондаренко В.М., Мавзютов А.Р., Голкочева Е. Секретируемые факторы пато-генности энтеробактерий // Журн. микробиол. 2002. - № 1. - С. 84-90.

10. Бугоркова Т.В., Елисеев Ю.Ю. Амилазная активность холерных вибрионов различной вирулентности // Тез. Всес. научн. конф. "Актуальные вопросы микробиологии, лабораторной диагностики и профилактики холеры". Ростов-на-Дону, 1983.-С. 98-100.

11. Бельков В.В. Нестабильность рекомбинантных молекул // Генетика. 1983. -Т. 19, № 10. - с. 1573-1581.

12. Гайлонская И.Н., Жукова Э.В., Шагинян И.А., Святой В.И. Роль энтеротоксина и нейраминидазы в биологической активности вибрионов El tor // ЖМЭИ. -1982.-№ 9. -С. 90-93.

13. Гинцбург A.JL, Янишевский Н.В., Мотин B.JT. с соавт. Природа последовательностей RS1, фланкирующих ген vet, кодирующий синтез холерного токсина; у Vibrio cholerae eltor // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1986. - № 2. — С. 11-19.

14. Гофман E.JL, Король В.В., Рожков Е.В. и др. Выделение, очистка и характеристика растворимого гемагглютинина холерного вибриона // Холера. Матер. Российской научно-практической конференции по проблеме «ХОЛЕРА». Ростов-на-Дону, 1992.-С. 94-96.

15. Далин М.В., Фиш Н.Г. Адгезины микроорганизмов // Итоги науки и техники.-Серия микробиология. М., 1985. - Т. 16. - 107 с.

16. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул // М. Медицина. 1985.240 с.

17. Заболотный Д. К. Вопрос о предохранительных прививках против холеры . Со-общ. на заседании 2-го отд-ния русского об-ва охранения народного здравия 21 декабря 1907 // Журн. русс, об-ва охранения народного здравия. 1907. - № 10 -12. - С. 248-249.

18. Заболотный Д.К. О вакцинации против холеры // Тр. Поволж. обл. противохолерного съезда. 4.2. Самара, 1908. - С. 65-66.

19. Заднова С.П. Функциональная роль ToxR-регулируемых белков внешней мембраны Vibrio cholerae И Проблемы особо опасн. инф. — Саратов, 2004. — Вып. 1(87)-С. 9-13.

20. Карягина А.С., Народницкий А.С., Апт А.С., Гинцбург A.JI. Геномика и генная инжененрия: рациональные подходы для разработки новых средств борьбы с туберкулезом // Журн. микробиол. 2004. - № 4 - С. 94-101.

21. Исупов И.В., Бугоркова С.А., Кутырев В.В. Патоморфологические аспекты доклинических испытаний различных вакцин против чумы, сибирской язвы и холеры // Саратов, 2004. 179 с.

22. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. III. Структура О-специфических полисахаридов // Биохимия. 1994.

23. Т. 59, №. 12. С. 1784-1851.

24. Королева Г.В., Король В.В., Смоликова JI.M. и др. Адгезивные свойства вибрионов разных видов и адгезивных препаратов // Холера. Матер. Рос. научн. конф. Ростов-на-Дону, 1992. - С. 88-89.

25. Король В.В., Рожков Е.В., Гофман E.JI. и др. Антигены адгезии холерных вибрионов и перспективы их применения для профилактики холеры // Холера. Матер. Рос. научн. конф. Ростов-на-Дону, 1989. - С. 92.

26. Костюкова Н.Н. Начальный этап инфекционного процесса — колонизация и пути ее предотвращения // ЖМЭИ. 1989. - № 9. - С. 103-110.

27. Левина Л.А., Зайцева Е.В., Темпер P.M. и др. Иммунологическая активность бактерий штамма Escherichia coli Ml 7, используемого при изготовлении коммерческого препарата колибактерина // ЖМЭИ. 1994. - №.5. - С. 63-66.

28. Марков Е.Ю., Урбанович Л.Я., Колесник Р.С. и др. Клеточные мембраны холерного вибриона как основа высокоиммуногенного вакцинного препарата против холеры // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. 2004. - Т. 2, № 1. - С. 127-138.

29. Мечников И.И. Очерк современного состояния микробиологии холеры (1896) // Мечников И.И. Акад. собр. соч. -М., 1959. Т. 10. - С. 64-78.

30. Мишанькин Б.Н., Шиманюк Н.Я., Рябухина О.Ю. и др. Штамм Escherichia coli

31. НВ101 pRD39 продуцент нейраминидазы холерного вибриона // А. с. 1210278 СССР. - Заявл. 09.08.84. Опубл. 23.02.87. - Бюл. № 7.

32. Мишанькин Б.Н., Ломов Ю.М., Шиманюк Н.Я. с соавт. Нейрамипидазная активность у вибрионов различной серопринадлежности // Холера и патогенные для человека вибрионы. Ростов-на-Дону, 2000. — Вып. 13. - С. 78-80.

33. Москвитина Э. А., Ломов Ю.М., Федоров Ю.М. и др. Оценка эпидемической ситуации по холере в мире, странах СНГ и России в XXI веке. Прогноз // Холера и патогенные для человека вибрионы Ростов-на-Дону, 2004. - С. 9-13.

34. Мухаринский А.А. К вопросу о противохолерных прививках (реферат) // Тр. и протоколы Кав. мед. об-ва. 1908 - Отд. I. - С. 242-275

35. Набиев Э.Г., Осауленко О.В., Пинигин А.Ф. Лецитиназная активность холерных и нсагглютинирующихся О-холерной сывороткой вибрионов // ЖМЭИ. 1987. -№ 2. - С. 15-18.

36. Наумов А.В., Джапаридзе М.Н., Адамов А.К. и др. Оральная холерная химическая таблетированная вакцина, изготовленная в институте «Микроб» // Холера (Вопр. эпидемиол. и лаб. диагн.): Матер. Рос. научн. конф. Ростов-на-Дону, 1992. - С.191-192.

37. Основные требования к вакцинным штаммам холерного вибриона // Методические указания МУ 3.3.1,- 2003. Москва, 2003. - 46 с.

38. Полоцкий Ю.Е., Авдеева Т.А. Адгезивность, инвазивность и энтеротоксиген-ность возбудителей кишечных инфекций // ЖМЭИ. 1981. - № 5. - С. 23-32.

39. Приказ Минздрава России от 27.07.2001 №229 // Холера. Ростов-на-Дону, 2003

40. Разработка вакцин против холеры и диареи, вызываемой энтеротоксигенными Escherichia coli. Меморандум совещания ВОЗ. — 1990. — Т. 68, № 3. С. 19-30.

41. Санитарные правила СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I II групп патогенности (опасности)» - Москва, 2003. — 81 с.

42. Смирнов Г.Б. Генетическая и молекулярная организация оперонов токсигенно-сти Escherichia coli и Vibrio cholerae и механизмы антитоксического иммунитета // Молекул. Генетика. 1984. - № 12. - С. 3-16.

43. Смирнова Н.И. Адгезины Vibrio cholerae: фенотипический анализ и генетический контроль синтеза // Ж. Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. — 1995. -№ 3. С. 18-26.

44. Смирнова Н.И., Чеховская Г.В., Давыдова Н.И. Фенотипический анализ двух морфологически разных типов колоний Vibrio cholerae 0139 // Мол. генет., микробиол. и вирус. 1995. -№ 3. - С. 30-34.

45. Смирнова Н. И., Кутырев В. В. Эволюция генома возбудителя холеры // Журн. мол. генет. 2004. - №4. - С. 3-13.

46. Уралева B.C., Гулида М.М. Характеристика протеазной активности штаммов и мутантов Vibrio cholerae с различивши биологическими свойствами // ЖМЭИ.1988.-№9.-С. 7-10.

47. Федорова В.А., Девдариани 3.JL, Громова О.В., Ливанова Л.Ф. Некоторые им-мунохимичеекие и иммунологические свойства капсульного антигена V.cholerae 0139 серовара// Мол. генет. 1997. - № 3. - С. 12-20.

48. Щелканова Е.Ю., Смирнова Н.И. Новые гены Vibrio cholerae 0139 и их роль в патогенности // Пробл. особо опасных инф. Саратов, 1998. - С.31-37.

49. Щуковская Т.Н., Дятлов И.А., Смирнова Н.И. Основы иммунологической эффективности и безопасности холерных вакцин нового поколения // Холера. Матер. VIII Рос. науч.-практ. конф. по пробл. «Холера». Ростов-на-Дону, 2003. -С. 219-224.

50. Яговкин Э.А. Иммунохимические и биологические свойства липополисахаридов холерного вибриона эльтор: Автореф. дис. канд. мед. наук. Саратов, 1982. -20 с.

51. Янишевский Н.В., Гинцбург А.Л., Вертиев Ю.В. и др. Конструирование рекомбинантных плазмид, кодирующих биосинтез В-субъедипицы холерного токсина // Молек. Генетика. 1987. - № 4. - С.26-32.

52. Albert M.J., Ansaruzzaman М., Bardhan Р.К. et al. Large epidemic of cholera-like disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal // Lancet.-1993.- Vol. 342,-P. 387-390.

53. Albert M.J., Alam K., Hamidur R. et al. Lack of cross-protection against diarrhea due to Vibrio cholerae 01 after oral immunization of rabbits with V. cholerae 0139 Bengal //J. Infect. Dis. 1994. - Vol. 169. - P. 709-710.

54. Barrineau P., Gilberd, P., Jackson, W.J. et al. The DNA sequence of the mercury re-sistence operon of the IncFII plasmid NR1 // J. Mol. Appl. Genet. 1984. - Vol. 2. - P. 601-619.

55. Benitez J.A., Garcia L., Silva A. et al. Preliminary assessment of the safety and im-munogenicity of a new СТХф-negative, hemagglutinin/protease-defective El Tor strain as a cholera vaccine candidate // Infect. Immun.-1999. Vol.67, N 2. - P. 539545.

56. Besser R.E., Feikin J.E., Eberhart-Phillips et al. Diagnosis and treatment of cholera in the United States: are we prepared // JAMA 1994. - Vol. 272. - P. 1203-1252.

57. Bhaskaran K., Rouley D. Nutritional stadies on Vibrio cholerae II Gen. Microbiol. — 1956. Vol. 15, N 2. - P. 417-422.

58. Bik E.M., Bunschoten A.E., Gouw R.D., Mool F.R. Genesis of the nowel epidemic Vibrio cholerae 0139 strain: evidence for horizontal transfer of genes involved in polysaccharide synthesisn // The EMBO Journal. 1995. - Vol. 14, N 2. - P. 209-216.

59. Black R.E., Levine M.M., Clements M.L. et al. Protective efficacy in humans of killed whole-vibrio oral cholerae vaccine with and without the В subunit of cholerae toxin // Infect. Immun. 1987. - Vol. 5. - P. 1116-1120.

60. BondreV.P., Srivastava R., Sinha V.B., Srivastava B.S. Screening of TnphoA mutant of Vibrio cholerae 0139 for identification of antigens involved in colonization // J. Med. Microbiol. 1997. - Vol. 46. - P. 1007-1011.

61. Boyd E. F., Waldor M. K. Evolutionary and functional analyses of variants of the toxin-coregulated pilus protein TcpA from toxigenic Vibrio cholerae non-Ol/non0139 serogroup isolates //Microbiology. -2002. Vol. 148.-P. 1655-1666

62. Bradley D.E., Taylor D.E., Cohen D.R. Specification of surface mating system among conjugative drug resistance plasmids in Escherichia coli K12 // Bacterid. 1980. -Vol.143, N3.-P. 1466-1470.

63. Bramucci M.G., Holmes R.K. Radial passive immune hemolysis assay for detection of heat labile enterotoxin produced by individual colonies of E. coli or V. cholerae // J. Clin. Microbial. 1978. - Vol. 2, N 2. - P. 252-255.

64. Broady K.W., Rietschel E., Luderitz O. The chemical structure of the lipid A component of lipopolysaccharides from Vibrio cholerae II J. Biochem. 1981. - Vol. 115.-P. 463-468.

65. Calain P., Chaine J. P., Johnson E. et al. Can oral cholera vaccination play a role in controlling a cholera outbreak? // Vaccine. 2004. - Vol. 22, N19. - P. 2444-2451.

66. Centre for Disease Control. Morbid. Mortat. Wkly. Rep. 37 (1998) 617-624.

67. Centers for Disease Control and Prevention (CVD). Cholera epidemic after increased civil conflict Monrovia, Liberia, June-September 2003 // MMWR Morb. Mortal Wkly Rep. 2003. - Vol. 52(45), N 14. - P. 1093-1095.

68. Centers for Disease Control and Prevention (CVD). Cholerae epidemic associated with raw vegetables Lusaka, Zambia, 2003-2004 // MMWR Morb. Mortal Wkly Rep. - 2004. - Vol. 53(34), № 3. - P. 783-786.

69. Chakrabarti S.R., Chaudhuri K., Seen K., Das J. Porins of Vibrio cholerae: purification and characterization of OmpU // J. Bacteriol. 1996. - Vol. 178, N 2. - P. 524530.

70. Chatterjee S.N., Chaudhuri К. Lipopolysaccharides of Vibrio cholerae. I. Physical and chemical characterization // Biochim. Biophys. Acta. 2003. - Vol. 1639, N 2 - P. 6579.

71. Chatterjee S.N., Chaudhuri K. Lipopolysaccharides of Vibrio cholerae; II Genetics of biosynthesis // Biochim. Biophys. Acta. 2004. - Vol. 1690, N 2. - P. 93-109.

72. Chiang S.L., Mekalanos J.J. Construction of a Vibrio cholerae vaccine candidate using transposon deliveiy and FLP recombinase-mediated excision // Infect. Immun.-2000. -Vol. 68, N 11. P. 6391-6397.

73. Chitnes D.S., Sharma K.D., Kamat R.S. Role of somatic antigen of Vibrio cholerae in adhesion to intestinal mucosa // J. Med. Microbiol. 1982. - Vol. 5. - P. 53-61.

74. Chongsa-nguen M., Chaicumpa W., Ruangkunaporn Y., Looarecsuwan S. Immuno-genicity of two formulation of oral cholerae vaccines in Thai volunteers // Vaccine. -1991.-Vol. 9, N 1.-P. 53-59.

75. Clements J.D., Sack D.A., Harris J.R. et al. Field trial of oral cholera vaccines in Bangladesh: results from three-year follow-up // Lancet. 1990. - Vol. 270. - P. 273.

76. Comstock L. E., Maneval D., Paningrahi P. The capsule and O-antigen in Vibrio hol-erae 0139 Bengal are associated with a genetic region not present in Vibrio cholerae 01 // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63, N 1. - P. 317-323.

77. Coster T.S., Killeen K.P., Waldor M.K. et al. Safety, immunogenicity, and efficacy of live attenuated Vibrio cholerae 0139 vaccine prototipe // Lancet. 1995. - Vol. 345. -P. 949-952.

78. Cray W. C., Tokunaga E., Pierse N. F. Successful colonization and immunization ofadult rabbits by oral inoculation with Vibrio cholerae Ol // Infect. Immun. 1983. -Vol. 41, N2.-P. 735-741.

79. Cray W. C. J., Mekalanos J. J., J. B. Kaper et al. Role of cholera toxin in enteric colonization by Vibrio cholerae Ol in rabbits // Infect. Immun. 1988. - Vol. 50. - P. 813-816.

80. Cvjetanovic B. Earlier field studies of the effectiveness of cholerae vaccines // Proc. Cholera Res. Symp. Honolulu, Hawaii, 1965. Washington, 1965. - P.355-361.

81. Dietrich G., Griot-Wenk M., Metcalfe J.C. et al. Experience with registered mucosal vaccines // Vaccine. 2003. - Vol. 21, N 7-8. - P. 678-683.

82. Dutta N.K., Habbu M.K. Experimental cholera in infant rabbits: a method for chemo-therapeutic investigation//Brit. J. Pharmacol. Vol. 256, N. 23. - P. 12252-12256.

83. Eco F. O., Schukovskaya Т., Lotzmanova E. Y. Evaluation of the protective efficacy of Vibrio cholerae ghost (VCG) candidate vaccines in rabbits // Vaccine. 2003. -Vol. 21.-P. 3663-3674.

84. Evans D.G., Evans D.J., Clegg S., Pauley J.A. Purification and characterization of the CFA1 antigen of enterotoxigenic Escherichia coli II Inf. Immun. 1979. - Vol.25, N 2. -P. 738-748.

85. Fane S., Sen A.K., Banerjee W. et al. Lipid A mutant of Vibrio cholerae-. isolation andpartial characterization // Biochem Biophys. Res. Commun. 1990. - Vol. 169, N 1. -P. 116-122.

86. Farve D., Struck M.-M., Cryz S.J.Jr, Viret J.-F. Further molecular characterization and stability of the live oral attenuated cholera vaccine strain CVD103-HgR // Vaccine. -1996.-Vol. 14, N6. P. 526-531.

87. Faruque S. M., Chowdhury N., Kamruzzaman M. et. al. Reemergence of epidemic Vibrio cholerae 0139, Bangladesh // Emerg. Infect. Dis. 2003. - Vol. 9, N 9. - P. 1116-1122.

88. Faruque S. M., Sack D. A., Col well R. R. et al. Emergence and evolution of Vibrio cholerae 0139 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - Vol. 100, N 3. - P. 1304-1309.

89. Faruque S.M., Zhu J. Asadulghani Examination of diverse toxin-coregulated pilus-positive Vibrio cholerae strains fails to demonstrate evidence for Vibrio pathogenicity island phage // Infect. Immun. 2003. - Vol.71, N6. - P. 2993-2999.

90. Ferran I. Morphologien bacilla cholera und vaccination gegen cholera //.Dtsch. Med. Zeitung. 1885. - № 15. - S. 4-6.

91. Ferran I. Estadisticas de la inoculacion preventiva del cholera morbo asiatico. 2 Serie. Valensia, 1886.

92. Finkelstein R.A., LoSpalluto J. J. Pathogenesis of experimental cholera: preparationand isolation of choleragen and choleragenoid // J. Exp. Med. — 1969. Vol. 130. — P. 185-202.

93. Finkelstein R.A., Burks M. F., Zupan A. et al. Epitopes of the cholera family of en-terotoxins //Rev. Infect. Dis. 1987. - Vol. 9. - P. 544-546.

94. Finkelstein R. A., Boesman- Finkelstein M., Chang Y. et al. Vibrio cholerae hemag-glutinin/protease, colonial variation, virulence, and detachment // Infect. Immun. -1992.-Vol. 60. P.472-478.

95. Finkelstein R.A. Why do we not yet a suitable vaccine against cholera? // Cholera and gastrointestinale erkrankugen // Int. Symp. and 100 jahrigen Bestehens Hyg. Inst., 1992.-S. 34-35.

96. Forrest B.D., LaBrooy J.T. In vivo evidence of immunological maskiing of the V. cholerae O-antigen of a hybrid Salmonella typhy Ty221-a-Vibrio cholerae oral vaccine in Humans//Vaccine. 1991. - Vol. 9, N7. - P. 515-520.

97. Foster R.N., Noble S. Bivalent cholerae and typhoid vaccine // Drugs. 1999. - Vol. 58, N 1.-P. 91-96.

98. Freter R., Jones G. M. Adhesiveproperties of Vibrio cholerae: nature of the in terac-tion with intact mucosal surfaces // Infect. Immun. 1976. - Vol. 14. - P. 246-256.

99. Fuerst J.A., Perry J.W. Demonstration of lipopolisacharide of sheathed flagella of Vibrio cholerae 01 by protein A-gold immunoelectron microscopy // J. Bacteriol. -1988.-Vol. 170.-P. 1488-1494.

100. Galen J.E., Ketley J. M., Fasano A. et al. Role of Vibrio cholerae neuraminidase in the function of cholera toxin // Infect.Immun. 1992. - Vol. 60. - P. 406-415.

101. Ghosh S., Campbel A.M., Unusual cross-reactions among monoclonal antibodies to bacterial antigenes: idiotypic and competitive binding analysis // FEMS Microbiol. Immunol. 1988. - Vol. 1, N 1. - P. 3-8.

102. Gennaro M.L., Greenway P.J., Broadhent D.A. The expression of biologically active cholera toxin in Escherichia coli 11 Nucl. Acid. Res. 1982. - V.10, N.16. - P. 48834890.

103. Gianelli V., Fontana M. R., Guigliani M.M. et al. Protease susceptibility and toxicity of heat-labile enterotoxins with a mutation in the active site or in the protease-sensitive loop // Infect. Immun. 1997. - Vol. 65, N1. - P. 331-334.

104. Gotuzzo E., Butron В., Sease C. et al. Safety, immunogenicity, and excretion pattern of single-dose live oral cholera vaccine CVD103-HgR in Peruvian adults of high and low socioeconomic levels // Infect. Immun. 1993. - Vol. 64 - P. 3994-3997.

105. Guidoling A., Manning P.A. Geneties of Vibrio cholerae and its bacteriophages // Microbiol. Rev. 1987. - Vol. 51, N 2. - P. 285-298.

106. Haffkine W. Les vaccinations anticholeriques aux Indes // Bull. Inst. Pasteur. 1906. -Vol. 4.-P. 635.

107. Hall R.H., Khambaty L.M., Kothary M. et al. Non-01 Vibrio cholerae II Lancet. -1993.-Vol. 32.-P. 430.

108. Hanne L.F., Finkelstein R.A. Characterization and distribution of the hemagglutinins produced by Vibrio cholerae II Infect. Immun. 1982. - Vol. 36. - P. 209-214.

109. Hase C.C., Thai L.C., Boesman-Finkelstein M. et al. Construction and characterization of recombinant V. cholerae strains produsing inactive cholera toxin analoges //1.fection. Immunity. Ang. 1994. - P. 3051-3057.

110. Hawkes R., Niday E., Gordon J. A dot immunobinding assay for monoclonal and other antibodies // Analit. Biochem. 1982. - Vol. 119. - P. 142-147.

111. Heidelberg J.F., Eisen J.A., Nelson W.C. et al. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae II Nature. 2000. - Vol. 406. - P. 477-483.

112. Herrington D.A., Hall R.H., Losonsky G. et al. Toxin, toxin-coregulated pili, and the toxR regulon are essential for Vibrio cholerae pathogenesis in humans // J. Exp. Med. 1988,-Vol.

113. Hisatsune K., Hayashi M., Haishima Y., Kondo S. Relationship between structure and antigenicity of 01 Vibrio cholerae lipopolysaccharide // J. Gen. Microbiol. 1989. -Vol. 135.-P. 1901-1907.

114. Hisatsune K., Kondo S. O-antigenic lipopolysaccharide of Vibrio cholerae 0139 Bengal a new epidemic strain for recent cholera in the Indian subcontinent//Biochem. and Biophys. Res. Communicatioms. 1993. - Vol. 196, N 3. - P. 1309-1316.

115. Holmgren, J., C. Czerkinsky, N. Lycke, and A.M. Svennerholm. Mucosal immunity: implications for vaccine development // Immunobiol. 1992. - Vol. 184. - P. 157— 179.

116. Honda T, Finkelstein R Selection and characteristics of a Jansen W.H., mutant lacking the A (ADP-ribosylating) proportion of the cholera enterotoxin // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1979. - Vol. 76, N 4. - P. 2052-2056.

117. Honda Т., Takeda Y., Miwatani T. Isolation of special antibodies which react only with homologous enterotoxins from Vibrio cholerae and enterotoxigenic Escherichia coli //Infect. Immun. 1981. - Vol. 34, N 2. - P. 333-336.

118. International Travel and Health, WHO, 2000

119. Ito Т., Hiramatsu K., Ohshita Y., Yokota T. Mutation in the rfbT gene are responsible for the Ogawa to Inaba serotipe conversion in Vibrio cholerae 01 // Microbiol. Immunol. 1993. - Vol. 37. - P. 281-288.

120. Jalajakumari, M. В., and P. A. Manning. Nucleotide sequence of the gene, ompW, encoding a 22 kDa immunogenic outer membrane protein of Vibrio cholerae II Nucleic Acids Res. 1990.- Vol. 18.-P. 2180.

121. Jansen W.H., Gielen H., Rijpkema S.S., Guinee P.A. Priming and boosting of the rabbit intestinal immune sistem with live and killed, smoth and rough V cholerae cells // Microb. Pathog. MIC., 1988. - Vol. 4(1). - P. 21-26.

122. Jobling M.G., Holmes R.K. Biological and biochemical characterization of variant A subunits of cholera toxin constructed by site-directed mutagenesis // J. Bacteriol. -2001.-Vol. 183, N 13.-P. 4024-4032.

123. Johnson J.A., Panigrahi P., Morris J.G. Non-Ol Vibrio cholerae NRT36S produces a polysaccharide capsule that determines colony morphology, serum resistance and virulence in mice //J. Infect. Immun. 1992. -Vol. 60, N 3. - P. 864-869.

124. Johnson G., Osek J., Svennerholm A.M., Holmgren F. Immune mechanism and protective antigens of Vibrio cholerae serogroup 0139 as a basis for vaccine development // Infect. Immun. 1996. - Vol.6. - P. 3778-3785.

125. Jones G.W., Abrams G.D., Freter R. Adhesive properties of Vibrio cholerae: adhesion to isolated rabit brushborder membranes and hemagglutinating activity // Infect. Immun. 1976. - Vol. 14, N 1. - P. 232-239.

126. Kabir Sh., Ali Sh. Characterisation of surfase properties of Vibrio cholerae II Infect. Immun. 1983. - Vol. 39,N3-P. 1048-10458.

127. Kabir Sh. Immunochemical properties of the major outer membrane proteins of Vibrio cholerae II Infect. Immun. 1983. - Vol. 39, N 1 - P. 452-455.

128. Kabir Sh., Ahmad N., Ali Sh. Neuraminidase production by Vibrio cholerae 01 and other diarrheagenic bacteria // Infect. Immun. 1984. - Vol. 44, N 3. - P. 747-749.

129. Kabir Sh. Preparation and immunogenicity of a bivalent cell-surfase protein-polysaccharide conjugate of Vibrio cholerae II J. Med. Microbiol. 1987. - Vol. 23, N 1. - P. 9-18.

130. Kado C. I., Liu S. T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmid // J. Bacteriol. 1981. - Vol. 145, N 3. - P. 1365-1373.

131. Kaper J. В., Lockman H, Baldini M.M., Levine M.M. Recombinant nontoxigenic Vibrio cholerae strain as attenuated cholera vaccine candidates // Nature. 1984. - Vol. 308, N5960.-P. 655-658.

132. Kaper J.B., Modley, H.L.T., Michalski, J.M., et al. Recent advances in developing a safe and effective live oral attenuated V cholerae vaccine//Advances in Research on

133. Cholera and Related iarrhease. 1989. - Vol. 6. - P. 161-167.

134. Kaper J.В., Srivastava B.S. Genetics of cholera toxin // Indian J. Med. Res. А. -1992.-Vol. 95.-P. 165-167.

135. Kaper J.B., Fasano A., Trucksis M. Toxins of Vibrio cholerae // In I.K.Wachsmuth, P. Blake and O. Olsvik. Vibrio cholerae and cholera: molecular to global perspectives. ASM Press, Washington, 1994. P. 145-176.

136. Kaper J.B., Morris J. G., Levine M. Cholera // Clin. Microbiol. Rev. 1995. - Vol. 8, N l.-P. 48-86.

137. Karaolis D. К. K., Kaper J. B. Pathogenicity island and other mobile virulence elements // Eds. J. B. Kaper, J. Hacker. Washington, 1999. - P. 167-187.

138. Kenne L., Lindberg E., Unger P. et al. Structural studies of the Vibrio cholerae CD-antigen // Carbohydr. Res. 1982. - Vol. 100. - P. 341-349

139. Kirkpatrick B. D., Alston W. K. Current immunizations for travel // Curr. Opin. Infect. Dis. 2003. - Vol. 16, N 5. - P. 369-74.

140. Kirn T.J., Lafferty M.J., Sandoe C.M.P., Taylor R.K. Delineation of pilin domains required for bacterial association into microcolonies and intestinal colonization by Vibrio cholerae II Mol. Microbiol. 2000. - Vol. 35, N 4. - P. 67-84.

141. Kirn T. J., Bose N., Taylor R.K. Secretion of a soluble colonization factor by the TCPtype 4 pilus biogenesis pathway in Vibrio cholerae U Mol. Microbiol. 2003. - Vol. 49, N 1. — P. 81-92.

142. Klipstein F., Engert R. F., Clements J. D. Development of a vaccine of cross-linked heat-labile enterotoxins that protects against Escherichia coli producing either entero-toxin//Infect. Immun. 1982. - Vol. 37. - P. 550-557.

143. Kondo S., Iguchi Т., Hisatsune K. A comparative study of the sugar composition of LPS isolated from Vibrio cholerae, Vibrio albensis and Vibrio metschnikovii II J. Gen. Microbiol. 1988. - Vol. 134 (Pt6). - P. 1699-1705.

144. Kumar S., Ray P., Singh H., Ganguly N. K. Immunogenicity and protective role of an IgA reactive 31-kDa antigen of Vibrio cholerae 0139 // J. Med. Microbiol. 2001. -Vol. 50.-P. 489-498.

145. Lagos R., Fasano A., Wasserman S.S. et al. Effect of small bowel bacterial overgrowth on the immunogenicity of single-dose live oral cholera vaccine CVD 103-HgR //J. Infect. Dis.- 1999.-Vol. 180.-P. 1709-1712.

146. Lang H.A., Palva E.T. The ompS gene of Vibrio cholerae encodes a growth-phase-dependent maltoporin //Mol. Microbiol. 1993. - Vol. 10. - P. 891-901.

147. Lebens M., Shahabi V., Backstrom M. et al. Synthesis of hybrid molecules between heat-labile enterotoxin and cholera toxin B-subunits: potential for use in a broadspectrum vaccine // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64, N 6. - P. 2144-2150.

148. Ledon Т., Valle E., Valmaseda T. et al. Construction and characterization of 0139 cholera vaccine candidates // Vaccine. 2003. - Vol. 21, N 11-12. - P. 1282-1291.

149. Levine M.M., Nalin D.R., Craig J.P. et al. Immunity tu cholera in man: relative role of antibacterial versus antitoxic immunity // Trans. R. Soc. 1979. -Vol. 73. - P. 3-9.

150. Levine M.M., Kaper J.B., Black R.E., Clements M.L. New knowledge on pathogenesis of bacterial enteric infections as applied to vaccine development // Bact. Rev. -1983. Vol. 47, N 4. - P. 510-550.

151. Levine M. M., Kaper J. В., Herrington et al. Safety, immunogenicity, and efficacy of recombinant live oral cholera vaccines, CVD103 and CVD103-HgR // Lancet ii. -1988.-Vol.2.-P. 467-470.

152. Levine M.M. and Kaper J. B. Live oral vaccines against cholera: an update // Vaccine. 1993.-Vol. 11.-P. 207-212.

153. Levine M. M., Kaper J. B. Live oral cholera vaccine: from principle to product // Bull. Inst. Pasteur. 1995. - Vol. 93. - P. 243-253.

154. Levine M. M., Kaper J. В., Nataro J. P. et al. Investigation of the roles of toxin-coregulated pili and mannose-sensitive hemagglutinin pili in the pathogenesis of Vibrio cholerae 0139 infection // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66. - P. 692-695.

155. Li M., Shimada Т., Morris J. G., et al. Evidence for the emergence of non-Ol and non-0139 Vibrio cholerae strains with pathogenic potential by exchange of O-antigen biosynthesis regions // Infect. Immun. 2002. - Vol. 70, N 5. - P. 2441-2453.

156. Liang W., Wang S., Yu F. et al. Construction and evaluation of a safe, live, oral Vibrio cholerae vaccine candidate, IEM108 11 Infect. Iramun. 2003. - Vol. 71, N 10. -P. 5498-5504.

157. Lugtenberg В., Bronstein H., van Selm N., Peters R. Peptidoglycan associated outer membrane proteins in gram-negative bacteria // Biochim. Biophys. Acta. — 1977. — Vol. 433.-P. 118.

158. Manning P.A. Involvement of cell envelope components in the pathogenesis of Vibrio cholerae: targets for cholera vaccine development // Vaccine. 1987. - Vol. 5, N 2. -P. 83-87.

159. Manning P.A., Haynes D.R. A common immunogenic Vibrio cholerae outer membrane protein // FEMS Microbiol. Lett. 1984. - Vol. 24. - P.297-302.

160. Manning P.A. Bartowsky E. J., Leavesly D. I. et al. Molecular cloning immune sera of a 22-kDa minor outer membrane protein of Vibrio cholerae II Gene. 1985. - Vol. 34, N 1. - P. 95-103.

161. Manning P. A. Involvement of cell envelope components in the pathogenesis of Vibrio cholerae: targets form cholerae vaccine development // Vaccine. 1987. - Vol. 5, N 2.-P. 83-87.

162. Manning P.A., Stroeher U.H., Morona R. Molecular basis for O-antigen biosynthesis in Vibrio cholerae 01: Ogawa-Inaba switching II Vibrio cholerae and cholera: molecular to global perspectives. ASM Press.-Washington, D.C., 1994. P. 77-94.

163. Marchlewiez B.A., Finkelstein R.A. Immunologic differences among the cholera/coli family of enterotoxins II Diag. Microbiol. Infect. Dis. 1983. -Vol. 1. - P. 129-138.

164. Marphy G.L., Dallas W.S. Analisys of two genes encoding heat-labile toxins and located on a single Ent plasmid from Escherichia coli II Gene. 1991 - Vol. 103. - P. 37-43.

165. Mekalanos J.J. Duplications and amplification of toxin genes in Vibrio cholerae II Cell. 1983. - Vol. 35, N 1. - P. 253-263.

166. Mekalanos J.J., Swartz G. D., Pearson N. et al. Cholerae toxin genes: nucleotide sequence, deletion analysis and vaccine development // Nature (London). 1983. - Vol. 306. - P. 551-557.

167. Merrell D.S., Bailey C., Kaper J.B., Camilli A. The ToxR-mediated organic acid tolerance response of Vibrio cholerae requires OmpU I I J. Bacteriol. 2001. - Vol. 183, N9.-P. 2746-2754.

168. Michalski, J., J.E. Galen, A. Fasano, and J.B. Kaper. CVD 110, an attenuated ibrio cholerae Ol El Tor live oral vaccine strain // Infect.Immun. 1993. - Vol. 61. - P. 4462-4468;

169. Mooi F.R., Bik E.M. The evolution of epidemic Vibrio cholerae strains // Trends Microbiol. 1997. - Vol. 5, N 4. - P. 161-165.

170. Mudd S., Anderson T.F., Selective "staining" for electron microscopy. The effect of heavy metal salts on individual bacterial cells // Exp. Med. 1942. - Vol.76. - P. 103107.

171. Naficy, A., M.R. Rao, C. Paquet, et al. Treatment and vaccination strategies to control cholera in sub-Saharan refugee settings: a cost-effectiveness analysis // JAMA 1996. -Vol. 279.-P. 521-525.

172. Nair G.B., Ramamurthy Т., Bhattachatya S.K. et al. Spread of Vibrio cholerae 0139 Bengal in India// J. Infect. Dis. 1994. - Vol. 169. - P. 1029-1034.

173. Nakasone N., Iwanaga M. Characterization of the outermembrane proteins of Vibrio cholerae expressed in vivo culture // Microbiol. Immunol. 2002. - Vol. 46, N 1. - P. 47-50.

174. Nashar Т.О., Hirst T.R., Williams N.A. Modulation of B-cell activation by the B-subunit of Escherichia coli enterotoxin: receptor interaction up-regulates MHC class II, B7, CD40, CD 25 and ICAM-1 // Immunol. 1997. - Vol. 91, N. 4. - P. 572-579.

175. Nelson E.T., Clements J. D., Finkelstein R. A. Vibrio cholerae adherence and colonization in cholera: electron microscopic study//Infect. Immun. 1976. - Vol.14. - P. 527-547.

176. Nicolle C., Conor A., Conseil R. Sur l'injection intraveineuse du vubrion cholerique vivant//C. R. Acad. Sci. 1912. - Vol. 154. - P. 1823.

177. Noriega F.R., Losonsky G., Wang J.Y. et al. Futher characterization of AroA virG

178. Shigella flexneri a strain CVD 1203 as a mucosal Shigella vaccine and as a live-vector vaccine for delivering antigens of enterotoxigenic Escherichia coli II Infect. Immun.- 1996. Vol. 64, N 1. - P. 23-27.

179. Pal S., Sasmal D., Guhathakurta В., Mair G. B. et al. Electrophoretic mobility and immune response of outer membrane proteins of Vibrio cholerae 0139 // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996.-Vol. 15.-P. 143-148.

180. Pearson D.N., Mekalanos J.J. Molecular cloning of Vibrio cholerae enterotoxin genes in Escherichia coli K-12 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. - Vol. 79, N. 9 - P. 2976-2980.

181. Pierce N. E., Cray V.C., Kapper, J.В., Mekalanos J. J. Determinants of immunogenic-ity and mechanisms of protection by virulent and mutant Vibrio cholerae 01 in rabbits // Infect. Immun. 1988. - Vol. 56, N 1. - P. 142-148.

182. Pitisuttithum P., Cohen M. В., Phonrat B. et al. A human volunteer challenge model using frozen bacteria of the new epidemic serotype, Vibrio cholerae 0139 in Thai volunteers // Vaccine. 2002. - Vol. 20. - P. 920-925.

183. Pizza M., Giuliani M. M., Fontana M. R. et al. Mucosal vaccines: non toxic derivatives of LT and CT as mucosal adjuvants // Vaccine. 2001. - Vol. 19. - P. 25342541.

184. Provensano D., Schumacher D.A., Barker J.L., Klose K.E. The virulence regulatory protein ToxR mediates enhanced bile resistance in Vibrio cholerae and other pathogenie Vibrio species II Infect. Immun. 2000. - Vol. 68, N 3. - P. 1491-1497.

185. Rajanna C., Wang J. et al. The Vibrio pathogenicity island of epidemic Vibrio cholerae forms preeise extrachromosomal circular excision products // J. Bacteriol. -2003. Vol. 185, N 23. - P. 6893-68901.

186. Redmond J.W. The 4-amino sugars present in the lipopolysaccharides of Vibrio cholerae and related vibrions // Biochem. Biophys. Acta. 1978. - Vol. 542. - P. 378-384.

187. Redmond J.W. The structure of the O-antigenic Side Chain of the lipopolysaccharides of Vibrio cholerae 569B (Inaba) // Biochem. Biophys. Acta. 1979. - Vol. 584. - P. 346-352.

188. Reidl J., Klose К. E. Vibrio cholerae and cholera: out of the water and into the host // FEMS Microbiol. Rev. 2002. - Vol. 26. - P. 125-139.

189. Sack R.B., Miller C.E. Progressive changes of vibrio serotypes in gem-free mice infected with Vibrio cholerae И J. Bacteriol. 1969. - Vol. 99. - P. 688-695.

190. Sandkvist M., Hirst T.R., Bagdasarian M. Alterations at the carboxyl terminus change assembly and secretion properties of the B-subunit of Escherichia coli heat-labile en-terotoxin // J. Bacteriol. 1987. - Vol. 169, N 10. - P. 4570-4576.

191. Schodel F., Will H., Johansson S. et al. Synthesis in Vibrio cholerae and secretion of hepatitis В virus antigens fused to Escherichia coli heat-labile enterotoxin subunit В // Gene. 1991.-Vol. 99. - P. 255-259.

192. Sears C.L., Kaper J.B. Enteric bacterial toxins: mechanism of actionand linkage to intestinal secretion // Microbiol. Rev. 1996. - Vol. 60, N 1. - P. 167-215.

193. Sengupta D.K., Sengupta Т.К., Chose A.C. Major outer membrane proteins of Vibriocholerae and their role in induction of protective immunity through inhibition of intestinal colonization // Infect. Immun. 1992. - Vol. 60. - P. 4848-4855.

194. Sengupta D.K., Boesman-Finkelstein M., Finkelstein R.A. Antibody against the capsule of Vibrio cholerae 0139 protects against experimental challenge // Infect. Immun. 1996. - Vol. 6, N 1. - P. 343-345.

195. Sengupta D.K., Sengupta Т.К., Ghose A.C. Major outer membrane proteins of Vibrio cholerae and their role in induction of protective immunity through inhibition of intestinal colonization // Infect. Immun. 2000. - Vol. 60. - P. 4848-4855.

196. Shimada Т., Nair G.B., Deb B.C. et al. Outbreak of Vibrio cholerae non-01 in India and Bangladesh // Lancet. 1993. - Vol. 341. - P. 1347.

197. Shimada Т., Arakawa E., Iton К et al. Two strains of Vibrio cholerae non-Ol pos-sesing somatic (O) antigen factors in common with Vibrio cholerae serogroup 0139 synonym "Bengal" // Current Microbiology. 1994. - Vol. 29. - P. 331-333.

198. Silva A.J., Mohan A., Benitez J.A. Cholerae vaccine candidate 638: intranasal immu-nogenicity and expression of a foreign antigen from the pulmonary pathogen Coccidi-oides immitis // Vaccine. 2003. - Vol. 21, N 32. - P. 4715-4721.

199. Spangler B.D. Structure and function of cholera toxin and the related Escherichia coli heat-labile enterotoxin // Microbiol. Rev. 1992. - Vol. 56. - P. 622-647.

200. Sperandio V., Giron J. A., Silveira W.D. et al. Characterization of the outer membrane protein OmpU of Vibrio cholerae II Abstracts of the 94th General Meeting of the American Society for Microbiology 1994. Washington, D. C., 1994. - P. 248.

201. Sperandio V., Giron J. A., Silveira W. D., Kaper J. B. The OmpU membrane protein, a potential adherence factor of Vibrio cholerae II Infect. Immun. 1995. - Vol. 63, N 11.-P. 114-118.

202. Sperandio V., Bailey C., Giron J.A., DiRita V.J., Silveira W.D., Vettore A.L, Kaper J.B. Cloning and characterization of the gene encoding the OmpU outer membrane protein of Vibrio cholerae II Infect. Immun. 1996. - Vol. 64, N 12. - P. 5406-5409.

203. Spira W.M., Sack R.B., Froelich J.F. Simple adult rabbit model for Vibrio cholerae and enterotoxigenic Esherichia coli deiarrhea // Infect. Immun. 1981. - Vol. 32. -P. 739-747.

204. Stevenson G., Leavesley D.I., Lagnado C.A. et al. Purification of the 25-kDa Vibrio cholerae major outer-membrane protein and the molecular cloning of its gene: ompV // Eur. J. Biochem. 1985. - Vol. 148, N 2. - P. 385-390.

205. Stroeher U.H., Karageorgos L.E., Morona R., Manning P.A. Serotype conversion in Vibrio cholerae Ol И Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1992.- Vol. 89 P. 2566-2570.

206. Stroeher, U.H., K.E. Jedani, and P.A. Manning. Genetic organization of the regions associated with surface polysaccharide synthesis in Vibrio cholerae Ol, 0139 and Vibrio anguillarum Ol and 02: a review // Gene. 1998. - Vol. 223. - P. 269-282.

207. Su-Arehawaratana P., Singharaj P., Taylor D.N. et al. Safety and immunogenicity of different immunization regimens of CVD103-HgR live oral cholera vaccine in soldiersand civilians in Thailand//J. Infect. Dis. 1992.-Vol. 165.-P. 1042-1048.

208. Suharyono C. Simanjuntak, N. Witham, et al. Safety and immunogenicity of a single-dose, live oral cholera vaccine CVD103-HgR in 5-9-year old Indonesian children // Lancet 1992. - Vol. 340. - P. 689-694.

209. Sun D., Mekalanos J.J., Taylor R.K. Antibodies directed against the toxin-coregulated pilus isolated from Vibrio cholerae provide protection in the infant mouse experimental cholera model // J. Infect. Dis. 1990. - Vol. 161. - P. 1231-1236.

210. Svennerholm A.M., and J. Holmgren. Synergistic protective effect in rabbits of immunization with Vibrio cholerae lipopolysaccharide and toxin/loxoid // Infect. Immun. 1976,- Vol. 13. - P. 735-740.

211. Svennerholm A. M., Steele D. Microbial-gut interactions in health and disease. Progress in enteric vaccine development // Best. Pract. Res. Clin. Gastroenterol. — 2004. -Vol. 18, N2-P. 421-445.

212. Swerdiow D.L., Ries A. Vibrio cholerae non 01 — the eighth pandemic 7 // Lancet. -1993. Vol. 342, N 8868. - P. 382-383.

213. Tacket, C.O., Losonsky G., Nataro J.P. Onset and duration of protective immunity in challenged volunteers after vaccination with live oral cholera vaccine CVD103-HgR // J. Infect. Dis. 1992. - Vol. 166. - P. 837-841.

214. Tacket C.O., Losonsky G., Nataro J.P. et al. Initial clinical studies of CVD112 Vibrio cholerae 0139 live oral vaccine: safety and efficacy against experimental challenge // J. Infect. Dis. 1995. - Vol. 172.-P. 883-886

215. Tacket C.O., Kotloff K.L., Losonsky G. et al. Volunteer studies investigating thesafety and efficacy of live oral El Tor Vibrio cholerae Ol vaccine strain CVD 11 // Am. J.Trop. Med. Hyg. 1997. - Vol. 56. - P. 533-537.

216. Tackct C.O., Taylor R.K., Losonsky G. et al. Investigation of the roles of toxin-coregulated pili and mannose-sensitive hemagglutinin pili in the pathogenesis of Vibrio cholerae 0139 infection // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66. - P. 692-695.

217. Tan N.H. Tan C.S. Acidimetric assay of phospholipase A using egg yolk suspension as substrate // Anal. Biochem. 1988. - Vol. 170. - P. 282-288.

218. Taylor R.K., Miller V.L., Furlong D.B., Mekalanos J.J. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - Vol. 84, N 9. - P. 2833-2837.

219. Taylor D.N., Killeen K.P., Hack D.C. et al. Development of a live, oral, attenuated vaccine against El Tor cholera // J. Infect. Dis. 1994. - Vol. 70. - P. 1518-1523.

220. Taylor D.N., J. Rizzo, R. Meza et al. Cholera among Americans living in Peru // Clin. Infect. Dis. 1996. - Vol. 22. - P. 1108-1109.

221. Taylor D.N., C.O. Tacket, Losonsky, O. Castro et al. Evaluation of a bivalent (CVD 103-HgR/CVD 111) live oral cholera vaccine in adult volunteers from the United States and Peru // Infect. Immun. 1997. - Vol. 65. - P.3852-3856.

222. Taylor D. N., Cardenas V., Sanchez J. L. et al. Two-year study of the protective efficacy of the oral whole cell plus recombinant В subunit cholera vaccine in Peru // J. Infect. Dis.-2000.-Vol. 181.-P. 1667-1673.

223. Trach D.D., Cam P.D., Ke N.T. et al. Investigations into the safety and immunogenicity of a killed oral cholera vaccine developed in Viet Nam // Bulletin of the World Health Organization. 2002. - Vol. 80, N 1. - P. 2-8.

224. Trucksis M., Mishalski J., Deng Y. K., Kaper J.B. The Vibrio cholerae genome contains two unique circular chromosomes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1998. — Vol. 95.-P. 14464-14469.

225. Valle E., Ledon ТТ., Cedre В., Campos J., Valmaseda T. et all. Construction and characterization of a nonproliferative El Tor cholera vaccine candidate derived from strain 638 // Infect. Immun. 2000. - Vol. 68, N 11. - P. 6411-6418.

226. Vimr E. R., Lawrisuk L., Galen J. et al. Cloning and expression of the Vibrio cholerae neuraminidase gene nanH in Escherichia coli II J. Bacteriol. 1988. - Vol. 170, № 4. -P. 1495-1504.

227. Viese A., Brandenburg K., Ulmer A., Seydel U., Muller-Loennies S. The dual role of lipopolysaccharide as effector and farget molecules // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 380. - P. 767-784.

228. Vijayashree S., Nayak N., Panigrahi D., Sehgal S. Role of cell surface antigens of Vibrio cholerae 01 and non 01 serovars in intestinal adhesion // Indian. J. Pathol. Microbiol. 2003. - Vol. 46, N 2. - P. 259-260.

229. Viret J. F., Dietrich G., Favre D. Biosafety aspects of the recombinant live oral Vibrio cholerae vaccine strain CVD 103-HgR // Vaccine. 2004. - Vol. 22, N 19. - P. 2457-69

230. Waldor M.K., Mekalanos J.J. Emergence of a new cholera pandemic: molecular analysis of virulence determinants in Vibrio cholerae 0139 and development of a live vaccine prototype // J. Infect. Dis. 1994. - Vol. 170. - P. 278-283.

231. Waldor M.K., Mekalanos J.J. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin//Science. 1996,-Vol. 272.-P. 1910-1914.

232. Ward H.M., Manning P.A. Mapping of chromosomal loci-associated with lipopoly-saccharides synthesis and serotype specificity in Vibrio cholerae 01 by transposone mutagenesis using Tn5 and Tn2680 // Mol. Gen. Genet. 1989. - Vol. 218. - P. 367370.

233. Wiedemann, G., H. Kollaritsch, E. Jeschko et al. Adverse events after oral vaccination against cholera with CVD 103-HgR // Wien. Klin. Wochenschr. 1998. - Vol. 110.-P. 376-378.

234. Weintraub A., Winmalm G., Jansson P. E. et al. Vibrio cholerae 0139 Bengal possesses a capsular polysaccharide which may confer increased virulence // Mic. Pathog. 1994. - Vol.16. - P. 235-243.

235. Winner L., Mark J., Weltzin R. New model for analysis of mucosal immunity: intestinal secretion of specific monoclonal immunoglobulin A from hibridoma protects againts Vibrio cholerae infection // Infect. Immun. 1991. - Vol.5, N 3. - P. 9777км Н

236. World Health Organization, Geneva. Wkly. Epidemiol. Rec. 73 (1998) 201 -208

237. Yamamoto Т., Nakasone Т., Miyata T. et al. Evolution and structure of two ADP-ribosylation enterotoxins, Escherichia coli heat-labile toxin and cholera toxin // FEBS Lett. 1984. - Vol. 169. - № 2. - P. 241-246.

238. Young D.V., Broadbent D.A. Effect of extracellular protease production in bacteriophage sensitivity of Vibrio cholerae II Trans. R. Sos. Trop. Med. Hyg. 1985. - Vol. 79, N 5. - P. 687-689.

Информация о работе

Кобкова, Ирина Михайловна
кандидата медицинских наук
Саратов, 2005
ВАК 03.00.07

Диссертация

Конструирование и изучение иммунобиологических свойств рекомбинантных штаммов Escherichia coli и Vibrio cholerae, продуцирующих протективные антигены - В-субъединицу холерного токсина и адгезин CFA/I - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы