Штаммы Vibrio cholerae биовара эльтор с изменной продукцией холерного токсина: получение и молекулярно-генетический анализ

Горяев, Артем Анатольевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Штаммы Vibrio cholerae биовара эльтор с изменной продукцией холерного токсина: получение и молекулярно-генетический анализ
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Штаммы Vibrio cholerae биовара эльтор с изменной продукцией холерного токсина: получение и молекулярно-генетический анализ"

ÜÜ3479Ü71

ГОРЯЕВ Артем Анатольевич

Штаммы Vibrio cholerae биовара эльтор с измененной продукцией холерного токсина: получение и молекулярно-генетический анализ

03.00.07 - микробиология

- 8 ОПТ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САРАТОВ-2009

003479071

Работа выполнена в ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Смирнова Нина Ивановна

Официальные оппопенты: доктор биологических наук, профессор доктор медицинских наук, старший научный сотрудник

Ильина Тамилла Сергеевна

Плотников Олег Петрович

Ведущая организация:

ФГУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири н Дальнего Востока»

Защита состоится «27» октября 2009 г. в 10^ часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» (410005, г. Саратов, Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб».

Автореферат разослан «22 » е&г ¡у/гл? 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук,

старший научный сотрудник

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Напряженная эпидемическая ситуация в мире, обусловленная продолжающимися вспышками и эпидемиями холеры в странах Юго-Восточной Азии и Африки, создают реальную возможность завоза этой инфекции на территорию России (Андрусенко и др., 2009; Ломов, 2009; Марамович и др., 2009; Safa et al, 2008; Taneja et al, 2009). К настоящему времени известно, что в результате эволюции в пределах вида образовалось три эпидемически опасных штамма, отличающихся друг от друга по структуре и функциям генома - V. choleras 01 серогруппы классического биовара, V. cholerae 01 серогруппы биовара эльтор и V. cholerae 0139 серогруппы. V.cholerae классического биовара был, видимо, возбудителем первых шести пандемии (1817-1923 гг.) азиатской холеры. Однако к началу прошлого столетия эта вибрионы были вытеснены на эндемичной для них территории холерными вибрионами биовара эльтор, которые вызвали текущую, 7-ю, пандемию холеры, начавшуюся в 1961 г. и продолжающуюся до сих пор (Бароян, 1971; Смирнова, Кутырев, 2004; Farnque et al., 1998; Sack et al, 2004). Что касается внезапно появившегося в 1992 г. в Индии и Бангладеш эпидемически опасного штамма V.cholerae ранее неизвестной 0139 серогруппы, то прогноз ряда исследователей о начале новой, 8-ой, пандемии холеры, связанной с этим возбудителем, пока не оправдался (Ramamurthy et al., 1993; Mukhopadhyay et al., 1995).

Секвенированне генома V.cholerae показало, что основные факторы его патогенности расположены на мобильных генетических элементах (МГЭ) -умеренных профагах (С'ТХср и RS1), «островах патогенности» (VPI-1, VPI-2) и «пандемичности» (VSP-I, VSP-2). Ключевым фактором патогенности возбудителя холер является холерный токсин (XT), биосинтез которого определяется генами ctxAB, входящими в состав профага СТХф. При этом холерные вибрионы классического биовара продуцируют XT 1-ого типа, a V.cholerae биовара эльтор - XT 2-ого типа. Наличие большого числа МГЭ определяет высокую вариабельность генома возбудителя холеры, которая выражается в изменении его размеров и функции за счет потери или приобретения мобильных элементов. Такие изменения генома могут обусловить появление новых клонов с разным набором генов патогенности. Так, в последнее время происходит формирование патогенных клонов V. cholerae биовара эльтор, отличительной особенностью которых является присутствие либо

МГЭ, либо их отдельных генов, характерных только для классических вибрионов. Наибольший интерес представляют штаммы V.cholerae биовара эльтор, содержащие классический профаг СТХф и продуцирующие XT 1-ого типа. Такие штаммы, как правило, более вирулентные и вызвали эпидемические вспышки холеры в Бангладеш, Мозамбике, Индии и Вьетнаме (Safa et al., 2006; Raychoudhuri et al, 2008; Safa et al, 2008; Nguyen et al, 2009; Taneja et al, 2009). Наряду с появлением атипичных штаммов с повышенной вирулентностью значительную проблему представляют .и нетоксигенные клоны, сохранившие весь набор других известных генов патогенности. Эти штаммы являются потенциально эпидемически опасными и способны вызывать диарейные заболевания за счет, видимо, дополнительных факторов патогенности (Онищенко и др., 2007; Монахова и др., 2009; Boyd et al., 2000; Pichel et al., 2003; Sing et al., 2001). Одним из возможных механизмов образования таких атоксигенных клонов может быть спонтанная утрата генома лрофага СТХф (Кульшань и др., 2006; Смирнова и др., 2007).

Таким образом, вполне очевидна актуальность исследований, направленных на дальнейшее изучение механизмов формирования атипичных штаммов с измененными вирулентными свойствами V.cholerae. В первую очередь большой интерес представляют исследования механизмов образования высокотоксигенных штаммов V.cholerae биовара эльтор. Эта проблема имеет не только существенное фундаментальное значение, но и представляет практическую ценность, поскольку штаммы с высоким уровнем продукции XT 2-ого типа могли бы использоваться для получения этого белка, необходимого дая создания более эффективных холерных диагностических и профилактических препаратов. Широкое распространение среди разных штаммов транспозонов, локализованных на плазмидах или входящих в состав интегронов, и их большой вклад в эволюцию патогенных бактерий позволяют рассмотреть возможность их участия в изменении продукции холерного токсина у возбудителя холеры эльтор.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ - получение и сравнительный анализ фенотипических и молекулярно-генетических свойств различных атипичных по продукции холерного токсина штаммов V.cholerae биовара эльтор.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. С помощью транспозона Tn5-Mob (KmR) на модельном штамме V.cholerae МАК757 биовара эльтор получить мутанты с измененной продукцией ХТ.

2. Провести сравнительный фенотипический анализ исходного штамма и мутантов с измененной продукцией ХТ, определив продукцию гемолизина, растворимой гемагглютинин/протеазы (РГАП), маннозо-чувствительных гемагглкшширующих пилей адгезии (МЧПА), экзополисахарида, а также подвижность и способность образовывать биопленку; дать оценку вирулентности сравниваемых штаммов.

3. Провести молекулярно-генетический анализ транспозонных мутантов с измененным уровнем продукции холерного токсина.

4. Сравнить протеомные профили исходного штамма и мутанта с гиперпродукцией ХТ.

5. Выделить, очистить и изучить антигенные свойства ХТ 2-ого типа, продуцируемого созданным штаммом V.cholerae биовара эльтор с гиперпродукцией этого белка.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА:

Обнаружено, что внедрение транспозона Tn5-Mob (KmR) в хромосому модельного штамма V.cholerae МАК757 биовара эльтор, несущего две копии профага СТХ<р, в 5 % случаев приводит к образованию различных мутантов с измененной продукцией ХТ. В результате молекулярно-генетического анализа впервые показано, что у мутантов I группы (KmR Тох+++) произошла индуцированная транспозоном утрата одной из копий профага и сохранение в коровой области второй копии лишь генов ctxAB. Уровень биосинтеза ХТ у таких клонов, потерявших более 60 % генома коровой части оставшегося профага, но сохранивших лишь оперон ctxAB, возрастает более чем в 2000 раз по сравнению с исходным штаммом, составляя 43,0±3,2 мкг/мл по данным ELISA. Во II группе мутантов (KmR Тох^) всграивание транспозона в хромосому привело к потере одной копии профага с сохранением всех генов второй копии, что обусловило увеличение уровня биосинтеза ХТ более чем в 100 раз (2,7±0,7 мкг/мл). В Ш группу входили нетоксигенные мутанты (KmR Тох~), возникшие в результате утраты всех генов двух копий профагов за исключением гена rstR. Таким образом, показан новый, раннее не известный путь образования штаммов холерного

вибриона как с повышенной токсигенностыо, так и лишенных этого свойства.

При сравнительном анализе протеомов исходного штамма (МАК757 Тох+) и его мутанта с гиперпродукцией ХТ (МАК757 KmR Тох"1"1"'') обнаружено, что в клетках МАК757 KmR Тох+++ из 531 выявленного белка редукция генома профага сопровождается изменением содержания 27 белков, ' из которых репрессируется синтез 23 белков, связанных, в основном, с энергетическим обменом, и индуцируется синтез 4 белков, участвующих в транспорте аминокислот. В целом, полученные данные указывают на происходящие изменения клеточного метаболизма и энергетического гомеостаза у штамма МАК757 KmR Тох""^, что связано, видимо, с гаперэкспрессией генов ХТ.

Показано, что полученные мутанты как с повышенной продукцией ХТ, так и утратившие способность синтезировать этот белок (вследствие делеции обеих копии профага СТХ<р) могут сохраняться в составе биопленки в течение длительного периода.

Впервые создан бесплазмидный штамм V.cholerae биовара эльтор с высоким уровнем продукции ХТ. Приоритетность этих данных подтверждена получением патента №2326941 "Штамм бактерий Vibrio cholerae-продуцент холерного токсина II типа".

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ:

В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» депонирована изогенные штаммы V.cholerae биовара эльтор с различной экспрессией генов с 1хЛВ, которые могут быть использованы для получения новых данных о механизмах регуляции активности генов ХТ и о влиянии уровня продукции этого фактора патогенности на развитие холерогенной реакции. Полученный штамм с высоким уровнем продукции ХТ 2-ого типа может быть использован для получения этого белка с целью изготовления более эффективных иммунодиагностических и профилактических препаратов против холеры, вызванной V.cholerae биовара эльтор.

По результатам работы составлены методические рекомендации: «Использование транспозона Tn5-Mob для получения ппаммов Vibrio cholerae с измененной продукцией холерного токсина», одобренные Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол №1 от 09 апреля 2009 г.) и утвержденные директором института 24 апреля 2009 г.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Внедрение транспозона Тп5-МоЬ (Кшк) в хромосому модельного штамма V.cholerae МАК757 биовара эльтор приводит к образованию мутантов трех типов, отличающихся по продукции ХТ. Мутанты 1-ого типа МАК757 KmR по данным иммуноферменгаого метода GMi ELISA, продуцируют 43,0±3,2 мкг/мл ХТ, что более чем в 2000 раз превышает уровень биосинтеза этого белка у исходного штамма. У мутантов П-ого типа МАК757 KmR Tox** уровень биосинтеза ХТ возрос в более чем 100 раз и состава! 2,7±0,7 мкг/мл. И в последнюю группу входили мутанты MAK757KmRTox~ утратившие способность к продукции ХТ.

2. Обнаруженное повышение продукции ХТ у транспозонных мутантов модельного штамма V.cholerae МАК757 не связано с усилением активности глобальных регудяторных генов toxR н ТохТ, а обусловлено изменением генома профага СТХср, индуцированным Tn-элементом. Внедрение транспозона TnS-Mob в бактериальный геном обусловило появление мутантов 3-х типов с редуцированным геномом профага. У мутантов I типа выявлена деления одной копии СТХср и потеря всех генов коровой области второй копии, за исключением оперона ctxAB (KmR Тох™~). Мутанты II типа утратили одну копию СТХф с сохранением всех генов второй копии (KmR Тох"4"). У мутантов П1 типа произошла потеря обеих копий профага СТХф, за исключением гена rstR (KmR Тох~).

3. Транспозонные мутанты с повышенным уровнем биосинтеза ХТ и не продуцирующие этот белок не отличаются от исходного штамма по продукции секретируемой растворимой гемагглютинин/протеазы и термолабильного гемолизина, но имеют повышенную подвижность. Штаммы с измененной продукцией ХТ способны формировать биопленку, что указывает на возможность их сохранения во внешней среде в течение длительного периода. Штаммы с повышенной продукцией ХТ были более вирулентны.

4. По данным сравнительного анализа протеомов исходного штамма V.cholerae МАК757 Тох'и его транспозонного шпертоксигенного мутанта МАК757 KmR Тох^ делеция генома профага СТХф у последнего сопровождалась изменением экспрессии ряда бактериальных генов. Среди 531 белков, выявленных в клетке, изменено содержание 27 белков (или 5%), связанных в основном с энергетическим обменом или участвующих в транспорте аминокислот.

5. Сконструированный ппамм V.cholerae МАК757 KmR Тох+++ биовара эльтор является стабильным и эффективным продуцентом XT 2-ого типа и может быть использован в производстве для получения этого белка. Определены оптимальные условия выращивания этого штамма: казеиновый бульон, без добавления канамицина, 3 О °С, pH 7,6, время культивирования - 8 часов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ:

.Материалы диссертации доложены и представлены.на научно-практических конференциях РосНИПЧИ "Микроб" "Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте "Микроб" (Саратов, 2008, 2009 гг.), на Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера» (Ростов-на-Дону, 2008, 2009 гг.), на Всероссийской конференции "Фундаментальная наука и клиническая медицина" (Санкт-Петербург, 2007 г.), на XV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2008 г.), на Российской школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Пущино, 2008 г.), а также на III Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике "Геномика и эволюция" (Звенигород, 2008 г.).

ПУБЛИКАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ:

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, а также получен один патент на изобретение.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ:

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 202 цитируемую работу, из них 166 зарубежных и 36 отечественных. Общий объем диссертации составляет 126 страниц. Текст иллюстрирован 11 таблицами и 20 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы.

В работе использовали токсигенные штаммы V. chola-ae Olceporpymnj эльтор и классического биоваров, полученные из ПСПБ «Микроб», а также штамм Escherichia coli SI7-1 (pSUPSOl 1) и транспозон Tn5-Mob (KmR), предоставленные ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. Культивирование бактерий проводили в бульоне и агаре LB, а также в казаминовом, AKI и казеиновом бульонах. Применяли традиционные и современные

микробиологические, биохимические, серологические, генетические и молекулярно-биологические методы. В частности определение продукции холерного токсина проводили с помощью реакции пассивного иммунного гемолиза (РПИГ) (Braraucei, Holmes, 1978) и иммуноферментного метода GMi ELISA (Svennerholm, Wikland, 1983). Вирулентность изучаемых штаммов определяли путем внутрикшпечного заражения крольчат-сосунков по Dutta N.K. и Habbu M.K. (1955). Для определения фенотшшческих признаков применяли стандартные методы. Выделение холерного токсина осуществляли с помощью модифицированной процедуры, описанной Rappaport R.S. et al. (1974). Выделение хромосомной и плазмидной ДНК осуществляли по общепринятым методам. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в микропробирках объемом 600 мкл на программируемом термостате «Терцик» как описано ранее (Осин и др., 2005). Секвенирование генов холерного токсина проводили на автоматическом секвенаторе «ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer». Протеомный анализ проводили в Центре постгеномных технологий ГУ НИИ БМХ им. В.Н. Ореховича РАМН (г. Москва).

Результаты исследований

1. Получение транспозонных мутантов V.cholerae биовара эльтор с измененной экспрессией генов холерного токсина. В последние годы стало известно, что одним из основных направлений эволюционных преобразований генома возбудителя холеры является формирование штаммов с античной токсигенностью. В связи с возникновением природных высокотоксигенных и нетоксигенных штаммов очевидна актуальность исследований, направленных на изучение механизмов изменения генома профага СТХср, кодирующего XT. Широкое распространение транспозонов среди различных бактериальных геномов и их значимый вклад в приобретение и потерю генетического материала патогенными бактериями позволяет рассмотреть возможность их участия в реорганизации генома профага СТХ<р у возбудителя холеры эльтор. В этой связи на первом этапе были проведены эксперименты по внедрению транспозона в геном штаммов V.cholerae биовара эльтор. Выбор транспозона Tn5-Mob, производного Tn5 (KmR), содержащго oriT плазмиды pRP4, обозначенный как Mob-сайт (Simon R_, 1984), был определен рядом причин: 1) этот Tn-элемент имеет предпочтительные сайты внедрения в хромосомную область V.cholerae, содержащую профаг СТХ<р (Журавлева Е.А., 1991).

2) способен индуцировать вторичные мутации, находящиеся в непосредственной близости от сайтов интеграции (Журавлева Е.А., 1991). 3) штаммы V.cholerae, содержащие Tn5-Mob в хромосоме, могут быть использованы впоследствии для конструирования на их основе Hfr - доноров путем введения в клетки плазмиды -помощника pRP4AKirf (Kms, TcR, ApR) с tra-опероном (Журавлева Е.А., 1991; Simon R„ 1984).

Вектором транспозона. Tn5-Mob (KmR) служила конъютативная плазмида pSUP5011 (ApR, CmR, KmE) - производная плазмиды pBR325 (ApR, CmR), сконструированная и описанная Simon R. (1984). Донором плазмиды был иггамм E.coli S17-1, несущий плазмиду pSUP5011. Рещшиентом был выбран токсигенный штамм V.cholerae МАК757 биовара эльтор, выделенный от больного в 1937 г. в Индонезии. Выбор данного реципиента был обусловлен отсутствием у него гемолитической активности, что позволяло использовать для определения продукции ХТ у большого количества трансконьюгантов простой метод - РПИГ на плотной среде. Введение плазмиды pSUP5011 в клетки штаммов V.cholerae осуществляли путем скрещивания донорного штамма Е. coli S17-1 (pSUP5011) с реципиентным токсигенным штаммом V.cholerae МАК757 V.cholerae биовара эльтор. Частота конъюгационного переноса плазмиды pSUP5011 in E.coli S17-1 в клетки V.cholerae МАК757 составляла 5,5 10"5.

Исключение Tn-элемента из плазмидной ДНК и внедрение его в бактериальную хромосому производили путем излечивания клеток от плазмиды, одновременно создав условия для селекции клонов, сохранивших Tn5-Mob. С этой целью 15 произвольно выбранных KmR, CmR, ApR-трансконьюгантов засевали в 5 мл минимальной среды с добавлением 50 мкг/мл канамицина, резистентность к которой определяется транспозоном, и выращивают при 4 °С в течение семи суток. При таких неблагоприятных условиях бесплазмидные клоны имели селективное преимущество по сравнению с клетками, несущими плазмиду. Затем у выросших клонов методом реплик определяли резистентность к антибиотикам, кодируемых плазмидой (CmR, ApR) и транспозоном (KmR). При проверке по маркерам 2100 изолированных колоний были обнаружены 263 клона, утративших плазмидные маркеры CmR и ApR, но сохранивших устойчивость к канамицину, кодируемую транспозоном Tn5-Mob. Утрата клонами резистентности к амлицилину и хлорамфениколу при сохранении

лекарственной устойчивости к канамицину, определяемой транспозоном, свидетельствуют о транспозиции Тп-.элемента из плазмидного генома в хромосому. Частота образования KmR, Cms, Aps - клонов составляла 12,5%.

На следующем этапе полученные KmE, Cms, Aps - клоны проверяли с помощью РПИГ на продукцию ХТ, полагая, что внедрение Tn5-Mob в хромосомную область, содержащую профаг СТХф, в ряде случаев может привести к изменению биосинтеза этого белка. Действительно, среди проверенных 263 KmR, Cms, Aps -. клонов были обнаружены транспозанты, которые отличались по продукции ХТ от исходного штамма. При этом такие клоны входили в три группы. Первая из них состояла из шести Ктк-клонов с гиперпродукцией ХТ (рис. 1, колонии 7-10). Вторая - из двух Ктк-клонов, имеющих умеренное повышение уровня биосинтеза этого белка (рис. 1, колонии 3-6). А в третью группу входили клоны, не продуцирующие ХТ (рис. 1, колонии 11-14). Согласно данным количественного иммуноферментного метода GM] ELISA, продукция токсина у клонов I-rpynnbi, обозначенных нами как RmR Тох^, составила 43±3,2 мкг/мл, что превышало более 2000 раз биосинтез ХТ исходным штаммом (0,02 мкг/мл). У клонов И-группы KmR Тох"^ продукция ХТ возросла более чем в 100 раз, составляя 2,7±0,7 мкг/мл. И в последнюю Ш-группу вошли нетокеигенные мутанты (KmR Тох"), не продуцирующие ХТ (табл. 1).

1-2 высокотоксигенный штамм V.cholerae 569В классического биовара, взятый в качестве положительного контроля; 3-6 - V. cholerae МАК757 KmR Тох^; 7-10 - V. cholerae МАК757 KmE Tox***; 11-14 - V. cholerae МАК757 Km* Tox~; 15-18 - V. cholerae MAK757 Tox+(исходный).

Рисунок 1. Продукция холерного токсина штаммами V. cholerae МАК757 бивара эльтор, определенная с помощью реакции пассивного иммунного гемолиза.

Таким образом, внедрение Тп5-МоЬ в хромосому холерного вибриона действительно вызывает изменения экспрессии генов с!хЛВ, которое в 3,0 % случаев выражается в появлении клонов с повышенной продукцией ХТ. Существование разных классов инсерционных мутантов с повышенной продукцией ХТ (Тох+++ и Тох++) либо полностью атоксигенных (Тох~) может свидетельствовать о наличии разных механизмов регуляции экспрессии генов сГхАВ, индуцируемых Тп-элементом.

Таблица 1. Результаты сравнительного фенотипического анализа исходного

штамма V.cholerae МАК757 и мутантов с измененной продукцией холерного токсина

Фенотипический анализ Штаммы

МАК757 Тох+ (исходный) I группа П группа III группа

KmRToxw KmR Тох++ KmR Тох~

Продукция токсина, мкг/мл (по данным GMi ELISA) 0,02 43,0±3,2 2,7±0,7 0,00

Протеаза - - - -

Гемолитическая активность - - - -

Подвижность (мм) 2-3 9-10 20-20 25-26

Продукция MSHA, титр то10 1*Ю10 1*10'° l*10ia

Продукция экзополисахарида + + + +

Биопленка (ОП, D=610 нм) 0,64±0,07 0,46±0,05 0,43±0,05 0,43±0,04

На следующем этапе работы был проведен сравнительный анализ основных фенотипических свойств исходного штамма и его транспозонных мутантов с различной продукции ХТ. Полученные инсерционные мутанты не отличались по продукции растворимой гемагглютинин/протеазы (РГА/П) и гемолизина от исходного штамма (табл. 1), также не выявлено различии по продукции экзополисахарида и маннозочувствительных пилей адгезии (МЧПА). При сравнительном анализе подвижности оказалось, что проверяемые штаммы отличались по этому свойству (табл. 1). Если исходный штамм МАК757 был относительно малоподвижен (зона ореола вокруг макроколоний составляла 2-3 мм), то внедрение Tn5-Mob в геном профага СТХф привело к существенному увеличению подвижности. Так, у инсерционных мутантов с гиперэкспрессией ХТ подвижность составляла 9-10 мм, у штаммов с умеренной продукцией ХТ - 20-22 мм, а у атоксигенных штаммов 25-26 мм (табл. 1). Было установлено, что мутанты как с повышенной продукцией ХТ, так и атоксигенные способны формировать биопленку на абиотической поверхности. Эти

данные указывают на возможность сохранения мутантов с измененной продукцией ХТ во внешней среде.

Выявленное в условиях in vitro изменение экспрессии генов ctxAB у инсерционных мутантов V.cholerae ставит вопрос об уровне токеигенности этих штаммов в условиях in vivo. Для его решения была определена токсигенностъ полученных пггаммов Тох^, Тох+~ и Тох- на модели изолированных петель тонкого кишечника взрослого кролика и кожной пробе по Крейгу. В результате обнаружили, что при внутрикишечном заражении модельных животных исходным штаммом и мутантами Тох+++ и Тох^ наблюдалась патоморфологическая картина, типичная для токсигенных штаммов. При этом индекс наполнения жидкостью ¡полированных петель кишечника для всех был выше единицы (табл. 2). В то же время атоксигенный штамм (KmR Тох-) не вызвал заметных изменений в кишечнике. Результаты оценки токсигенности в кожной пробе по методу Creig подтвердили данные, полученные при определении уровня продукции этого белка GM] ELISA. В условиях in vivo мутанты Тох"" и Тох'*" продуцировали в 400 и 20 раз больше ХТ, чем исходный штамм.

При определении уровня вирулентности было установлено, что клоны KmR Тох4" при заражении кроликов-сосунков оказались более вирулентными: они вызывали развитие выраженного специфического холерогенного эффекта и при этом все крольчата пали в течение первых 24 часов. Штаммы с умеренной продукцией ХТ (KmR Тох4"') также вызывали холерогенный эффект, но животные погибали в течение 48 часов. Атоксигенные клоны (KmR Тох-) были авирулентны. При этом по приживаемости в кишечнике кроликов-сосунков холерные вибрионы с различным уровнем продукцией ХТ практически не отличались друг от друга, что, видимо, связанно с одинаковой экспрессией ключевого фактора колонизации - токсин-коррегулируемык пилей адгезии (ТКПА).

Таким образом, основной итог работы на этом этапе состоял в том, что с помощью транспозонного мутагенеза впервые получены штаммы V.cholerae биовара эльтор с гиперпродукцией ХТ 2-ого типа, а также нетоксигенные мутанты, относящиеся к потенциально эпидемически опасным штаммам. Изменение вирулентности у штаммов было прямо связано с изменением у них уровня продукции ХТ. Заслуживает также внимание тот факт, что высокотоксигенные штаммы

способны сохраняться в окружающей среде в составе биопленки, что указывает на необходимость проведения адекватного и постоянного мониторинга внешней среды.

2. Молекулярно-генетический анализ транспозонных мутантов с измененной продукцией холерного токсина. Обнаруженное изменение продукции XT у Кт*-клонов могло бьпь следствием повышенной активности глобальных регуляторных генов toxR ц/или toxТ. Как известно, в регуляторном каскаде ген toxR также осуществляет непосредственный контроль биосинтеза белков внешней мембраны - позитивный для OmpU, негативный для OmpT.

Если в инсерционных мутантах Tox*4 и Tox*** повышена активность гена toxR, то эти штаммы должны отличаться от исходного по продукции белка OmpU, экспрессия которого позитивно регулируется непосредственно ToxR. Изучение профиля белков внешней мембраны указанных штаммов показало, что внедрение Tn5-Mob в хромосому штамма МАК757 не привело к изменению их продукции. Следовательно, активность регуляторного гена toxR в этих штаммах не изменилась (табл. 3). В случае изменения активности другого регуляторного гена toxT инсерционные мутанты с увеличенной продукции XT должны также иметь и высокий уровень продукции ТКПА. Определение продукции ТКПА методом самоагглютинации бактериальных клеток показало, что инсерционные мутанты, независимо от продукции ими XT, не отличаются от исходного штамма по уровню биосинтеза указанных пилей. Эта данные указывают на одинаковую активность регуляторного гена toxT у всех изученных пггаммов.

Таким образом, анализ полученных результатов свидетельствуюто том, что повышение продукции XT у инсерционных мутантов Tox4-*" и Тох^+ не связано с изменением активности глобальных регуляторных генов toxR и toxT.

Другая возможная причина измененной экспрессии генов ctxAB у инсерционных мутантов - реоргашгзация генома профага СТХ<р, вызванная Tn5-Mob, поскольку известно, что внедрение Tn-элементов может вызывать различные мутации, включая делеции различной протяженности (Хесин, 1984). Для проверки этого предположения провели ПЦР-аналга хромосомной ДНК исходного штамма и его транспозонных мутантов, определяя наличие или отсутствие всех генов, входящих в состав генома профага СТХф. Оказалось, что если в геноме исходного штамма МАК757 и его инсерционного мутанта KmR Тох++ с умеренной продукцией XT присутствовали все

тестируемые гены, то в случае инсерционных мутантов 1-ой группы с гиперпродукцией ХТ (Кшк Тох+++) и атоксигенных клонов Ктк Тох~ картина была иной (табл. 2). Так, у трансиозангов Кшй Тох+<^ из шести определяемых генов коровой области (ссгЛ, с£гД гоГ, асе, ог/11 и сдэ) сохранились лишь два - сгхА и с!хВ : (табл. 2). В то же время присутствовали все гены К.82-области (пгА, тВ, гзгК). Что касается инсерционных. мутантов Ш-ей группы, то у них были делегированы все б генов коровой области (сгхА, с1хВ, :ог, асе, огД1, сер), также 2 гена 1182-области (га/Л и Сохранился лишь один ген тК, кодирующий биосинтез репрессора профага СТХф.

Таблица 2. Результаты ПЦР-анализа исходного штамма У.скокгае МАК757 и его инсерционных мутантов, содержащих транспозон Тп5-МоЬ в бактериальном геноме

Штаммы Тп5-МоЬ Тестируемые гены профага СТХф

ахА саВ 201 асе огД/ сер гегЛ пгВ

МАК757 (исходный) - + + + + + + + + +

1-группа Кшк Тох+~ + + + - - - - + +

П-группа Кшк Тох++ + + + -г + + + + + +

Ш-группа Кта Тох~ + +

Представленные данные позволяют сделать заключение, что причшт изменения экспрессии продукции ХТ у изучаемых мутантов состоит в реорганизации генома профага СТХф, индуцированной транспозоном. При этом три типа выявленных мутантов (Тох^, Тох++ и Тох~) различаются по характеру реорганизации СТХф.

Присутствие в хромосоме исходного штамма МАК757 двух копии профага СТХф, расположенных в тандемном порядке, ставит вопрос о том, сохранились ли две копии оперона с/хАВ в инсерционных мутантах (Тох+т+ и Тох^) с повышенной продукцией ХТ. Для ответа на него были проведены эксперименты по ДНК-ДНК гибридизации. С этой целью хромосомную ДНК штаммов обрабатывали рестрикгазой, а в качестве зонда использовали амплификат гена с/хА из профага СТХф. В результате было установлено, что в отличие от исходного штамма МАК757, у которого две копии генов сгхАВ располагались на Рзй-фрагментах размером 5,7 и 7,0 т.п.н. (рис. 2, дорожка 1), у инсерционных мутантов Кшк Тох+т и Кш8 Тох^*

гибршщзовался только один фрагмент, что указывает на присутствие в их хромосомах лишь одной копии оперона с&ЛВ. У клонов Ктк Тох~, не содержащих оперон сГхАВ, по данным ПЦР-анализа, отсутствовали обе копии профага (рис. 2, дорожка 4).

Д.......2.... 3 ... 4

1) - МАК757 Тох+ (исходный); 2) - МАК757 Кт* Тох^; 3) - МАК757 Ктк Тох^; 4) - Кт* Тох~.

Рисунок 2. Блот-гибридизация РйЙ-фрагментов хромосомных ДНК У.сЬо/егае МАК757 с разной продукцией холерного токсина, с зондом СТХф (амплификат гена

сЫ).

Анализ нуклеотидных последовательностей генов сгхЛ и саВ, проведенный с помощью их секвенирования, показал полную идентичность их структуры с исходным штаммом. Отсутствие между сравниваемыми штаммами различий в нуклеотидной последовательности генов сГ.хА и ОхВ, кодирующих биосинтез ХТ, свидетельствует в пользу предположения о том, что повышенный уровень экспрессии этих генов у Тох+++ и Тох++ мутантов может быть связан с изменениями в промоторной области оперона с1хАВ, индуцированными внедрившимся Тп-элементом. Однако этот вопрос нуждается в дальнейшем изучении.

Совокупность данных ПЦР-анализа и ДНК-ДНК-гибридизации позволяют представить предполагаемую схему образования транспозонных мутантов 3-х типов: Кшк Тох^, Ктк Тох4^ и Ктк Тох~. В пользу предположения о внедрении Тп-элемента в одну из копий профага СТХф между генами го( и сЬсА свидетельствует тот

факт, что этот участок генома является АТ-богатой областью. Затем внедрившийся транспозон индуцировал образование делений различной протяженности в областях генома, прилегающих к сайту его внедрения. Мутанты KmR Тох" возникли в результате делеций, видимо, лишь одной копии профага СГХср. Вследствие этого такие мутанты но данным ПЦР-анализа имели все ; тестируемые гены профага, сохранившиеся во второй копии (табл. 2). У инсерционных мутантов KmR Тох^ делеция была протяженнее, вызвав потерю одной копий профага СТХ<р и 60 % генов (гог, асе, orfU, сер) второй его копий. Наиболее протяженная делеция у мутантов KmR Тох (утрата обеих копий профага с сохранением ими лишь гена rstR из RS2-o6nacm) обусловила образование нетоксигенных клонов.

При изучении плазмидного профиля транспозонного мутанта МАК757 KmRTox'H+KmR Aps Cms методом Кадо для подтверждения отсутствия в его клетках векторной плазмиды pSUP5011 (ApR CmR) были получены неожиданные данные. В клетках этого штамма были обнаружены три плазмиды, отсутствующие у исходного штамма МАК757 и отличающиеся по размерам от векторной плазмиды pSUP5011. Если размер плазмиды pSUP5011 составлял 12,6 т.п.н. (Simon, 1987), то размер обнаруженных плазмид был 3,6 т.п.н., 7,2 т.п.н. и 14,4 т.п.н.

Одним из предположений появления в транспозонных мутантах плазшзд могло быть образование репликативной формы (РФ) профага СГХср, что объяснило бы высокий уровень продукции ХТ. Для подтверждения справедливости данного предположения мы выделили плазмидную ДНК и провели ПЦР-анализ каждой плазмиды. В результате оказалось, что структура трех плазмид штамма МАК757 Тох^+ KmR Aps Cms однотипна. В их состав входит фрагмент транспозона Tn5-Mob, включающий ген резистентности к канамицину, и два гена из фаговой RS2-o6.Tacni -rstA и rs/B. Ни один ген коровой области профага CTXtp, включая оперон ctxAB, не был обнаружен ни в одной плазмиде. Из этих данных следует, что высказанное нами предположение об образовании РФ профага не подтвердилось.

Дальнейший рестрикционный анализ этих плазмидных ДНК с использованием эндонуклеазных рестриктаз Pstl и Bglll показал, что рестрикционные фрагменты трех плазшзд идентичны. Следовательно, на основе анализа полученных данных можно говорить о том, что в геноме штамма МАК757 Тох^ KmR Aps Cms присутствует всего одна плазмида, обозначенная нами как pRS-KanR, но в форме моно-, ди- и

тетрамеров. Механизм образования плазмиды pRS-KanR пока не ясен. Возможно, образование плазмиды pRS-KanR связано с редупяикативной транпгаицией Tn5-Mob из хромосомы, при этом была «захвачена» часть генов RS2-o6nacTH (гstA и rstB), прилегающей непосредственно к транспозону. Для полного решения этого вопроса нужны дополнительные исследования.

3. Сравнительный анализ протеомов V.cholerae МАК757 и его транспозонного мутанта с гиперпродукцией холерного токсина. Для выяснения влияния измененного генома ггрофага СТХср, обусловленных внедрившимся транспозоном Tn5-Mob, на экспрессию других хромосомных генов был проведен сравнительный анализ протеомов изогенных штаммов - исходного штамма МАК757 и его инсерционного мутанта с гиперпродукцией ХТ (KmR Тох"1"1^). Протеомный анализ проводили в Центре постгеномных технологии при НИИ БМХ им. Б.Н.Ореховича. При компьютерном анализе протеомов был выявлен 531 белок. Установлено, что в клетках транпозонного мутанта Кшк Тох++~ с гиперпродукцией ХТ, по сравнению с исходным штаммом, изменяется экспрессия 27 белков (рис. 3), из которых 23 белка имели пониженную, а 4 белка повышенную концентрацию.

Ш Ш

34 2$

Обозначение: 1 - Аконитат-гидратаза; 2 - ABC (АТФ-связывающий белок); 3 -Шаперон 60 кДА; 4 - Гипотетический белок VCA0108; 5 - А субьединица АТФ-синтазы; 6 - Гипотетический белок VchoV5 02002147 + Na+-NADH-y6HXHHOH редуктаза; 7 - Ка+-К'А1)Н-убихинон редуктаза; 8 - 3-оксоацил синтетаза; 9 - ABC (периплазматический белок); 10 - Аденилаткиназа; 11 - 50S рибосомный белок L5; 12 - Гипотетический белок VCA0I07; 13 - Мембранный белок ОтрН; 14 - RstB

Рисунок 3. Двумерный электрофорез в ПААГ белковых экстрактов исходного штамма V.cholerae МАК757 и его транспозонного мутанта с гиперпродукцией ХТ

(Km^Tox^). .

Оказалось, что у штамма с гиперпродукцией ХТ снижено содержание белков, связанных с энергетическим обменом (рис. 3, пятна 5, 6, 7 и 10), но повышена концентрация белков, участвующих в транспорте аминокислот (рис. 3, пятна 2 и 9). В целом полученные данные указывают на заметное функциональное изменение клеточного метаболизма и энергетического гомеостаза у штамма V.cholerae МАК757 KmR Тох+", что связано, видимо, с изменением структуры участка хромосомы, содержащей две копии профага СГХ<р, определивший суперпродукцию ХТ.

4. Получение очищенного холерного токсина 2-ого типа и полнклоналыюй антисыворотки к нему. Реальная возможность завоза холеры эльгор на территорию Российской Федерации из стран Азии и Африки указывает на необходимость создания эффективных диагностических и профилактических препаратов, важным компонентом которых является иммуногенная В-субъединпца. ХТ 2-ого типа, который продуцируют эпидемически опасные штаммы V.cholerae биовара эльтор. В качестве штамма продуцента этого антигена возможно использование транспозонного мутанта KmR Тох1^" штамма V.cholerae МАК757 биовара эльтор, который продуцирует ХТ 2-ого типа в количестве 43,2 мкг/мя по данным GM! ELISA. В этой связи на первом этапе были определены оптююльные условия культивирования этого штамма в лабораторных условиях. В результате было установлено, что оптимальными условиями для накопления биомассы и синтеза ХТ является казеиновая среда (pH 7,6) при культивировании в течение 8 часов.

Так как выращивание в лабораторных условиях значительно отличается от производственных, на следующем этапе были проведены эксперименты по выращиванию штамма-продуцента ХТ 2-ого шла в полупроизводственных условиях - малообъемное культивирование в колбах Эрленмейера (объем питательной среды 200 мл) на термостатируемой качалке RC-TK (США). В результате было показано, что при культивировании штамма V. cholerae МАК757 KmR Тох++т в течение 8 ч в казеиновой среде (pH 7,6) без добавления канамицина накопление биомассы составило И млрд. м.к./мл, а продукция ХТ достигала 14,25±1,47 мкг/мл. При культивировании в среде, содержащей канамицин в концентрации 25 uteri мл, выход биомассы и ХТ остается довольно низким.

При использовании штамма в качестве продуцента ХТ одним из важных является вопрос о стабильности наследования хромосомной мутации, определившей его фенотип Тох^. В этой связи у 600 произвольно отобранных клонов, полученных при рассеве бульонной культуры (казеиновый бульон, рН 7,6, 30 °С, 8 часов культивирования), МАК757 Ктя Тох+++ на плотной среде без канамицина, проверяли продукцию ХТ с помощью РПИГ. Оказалось, что лишь 5 клонов (или 0,8%) утратили фенотип Тох^. Из этого следует, что выявленные условия культивирования пггамма МАК757 Ктк Тох+++ (казеиновый бульон, рН 7,6, 30 °С, 8 часов) действительно являются оптимальными для стабильной и эффективной продукции его клетками ХТ.

На следующем этапе был выделен ХТ 2-ого типа по методу К-аррарой 11.8. сч а\. (1974). Выход очищенного токсина составил 60 мкг/мл или 12 % от общего количества белка в исходном препарате. Специфическую активность определяли в РИД с моноспецифической антитоксической сывороткой. Полученный токсин образовывал одну линию преципитата, титр реакции составлял 1:16. Чистоту и гомогенность препарата контролировали с помощью электрофореза в нолиакрила>,шдном геле. Результаты показали, что в очищенном нами препарате обнаруживаются две белковые полосы, идентичные по расположению субъединиц А-(27,2 кД) и пенгамеру В-субъединнцы (58 кД) коммерческого препарата ХТ (Б1§та, США). При изучении антигенных свойств выделенного ХТ 2-го типа на модели кроликов породы шиншиллы было установлено, что токсин образовывал одну линию преципитации с антитоксической сывороткой. Титр реакции составил 1:16, что указывает на способность выделенного ХТ 2-ого типа образовывать специфические антитела, а также на эффективность и специфичность полученных антисывороток. При изучении биологической активности вьщеленного ХТ 2-го типа в кожной пробе по Крейгу было показано, что максимальное разведение данного белка, обусловливающего положительную реакцию, составляло 1:100000, что сопоставимо с активностью ХТ 1-го типа продуцируемого высокотоксигенным штаммом У.с1ю!егае 569В классического биовара.

Таким образом, сконструированный штамм V. сЬоХегае Кта Тох^+ -гиперпродуцент холерного токсина 2-ого типа, оказался стабильным и эффективным продуцентом указанного иммуногенного белка и может быть рекомендован к использованию в производственных условиях для получения этого антигена с целью

создания на его основе более эффективных диагностических и профилактических препаратов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Вопрос о механизме формирования атипичных по вирулентности штаммов У.с1ю!егае остается малоизученным. Вместе с тем эта проблема является одной из приоритетной, поскольку в современный период возбудитель эпидемий холеры в Африке и Азии относится к штаммам У.сЬокгае с измененной токсигенностью. Нами впервые получены данные об изменениях продукции ХТ у модельного штамма V. с1ю!егае МАК757 биовара эльтор в результате внедрения транспозона Тп5-МоЬ в геном профага СТХср, кодирующего ХТ, и индукции им делеций в этом мобильном элементе.

Полученные делеционные мутанты являются ценным материалом для изучения регуляции биосинтеза токсина. Дальнейшее исследование таких мутантов даст возможность уточнить и расширить существующее представление о механизмах токсинообразовання. Разлетные изменения генома профага СТХф, индуцируемые внедрившимся в хромосому транепозоном, могут внести заметный вклад в изучение проблемы формирования штаммов с атипичной токсигенностью. И этот путь формирования высокотоксигенных и нетоксигенных клонов, основанный на перестройках ДНК, связанных с проникновением в геном патогенных бактерий новых для них мобильных элементов, представляет большой интерес, поскольку такие события могут играть важную роль в эволюции генома возбудителя холеры.

Проведенные эксперименты позволили решить важную практическую задачу -создан высокопродуктивный штамм продуцент ХТ. Выявлены оптимальные условия (казеиновая среда, рН=7,6, 30 °С, 8 часов) малообъемного культивирования этого штамма У.с!ю1егае МАК757 Кт" Тох+++ биовара эльтор для максимальной продукции ХТ 2-ого типа, который может быть использован для изготовления более специфических холерных диагностических и профилактических препаратов.

ВЫВОДЫ

1. Внедрение транспозона Тп5-МоЬ (Ктк) в хромосому модельного вирулентного

штамма У.ско1егаг МАК757 биовара эльтор с частотою 5,5* 10"3 вызывает

образование различных мутантов с измененной продукцией холерного токсина -с высоким (43 мкг/мл) и умеренным (2,7 .мкг/мл) уровнем биосинтеза этого белка, а также нетоксигенных клонов.

2. В результате фенотипического анализа показано, что транспозонные мутанты с измененной продукцией холерного токсина не отличаются от исходного штамма по продукции секретируемой растворимой гемагглютинин/протеазы и термолабильного гемолизина, имеют повышенную подвижность и способны формировать биопленку, что указывает на возможность их сохранения во внешней среде в течение длительного периода.

3. Обнаружен более высокий уровень вирулентности транспозоннх мутантов с повышенной продукцией холерного токсина, который выражается в 100% летальности экспериментальных животных через первые 24 часа после заражения.

4. Выявленное изменение продукции холерного токсина у транспозонных мутантов штамма У.сЪо1егае МАК757 биовара эльтор обусловлено разной по протяженности делецией генома профага СТХф, ицдуцированой внедрением транспозона Тп5-МоЬ. Утрата только одной копии профага СТХф была характерна для Ктк Тох^ клонов. Более протяженная делеция была обнаружена у Ктк Тох+Т+ клонов и выражалась в потере одной из двух копий профага и всех генов коровой области второй копии за исключением оперона ыхЛВ, что привело к его гиперэкспрессии. Самая протяженная делеция была у Кт11 Тох- мутантов, которые утратили все гены профага СТХф за исключением гена га/Л.

5. Впервые проведен сравнительный анализ двух протеомов исходного штамма V. с!ю1егае МАК757 биовара эльтор и его транспозонного мутанта с гиперпродукции ХТ (КтЕ Тох^4). Обнаружено, что из 531 выявленного белка у мутанта с повышенной продукцией ХТ изменено содержание 27, из которых репрессируется синтез 23 белков, в основном связанных с энергетическим обменом, и индуцируется синтез только 4 белков, участвующих в транспорте аминокислот.

6. Подобраны оптимальные условия культивирования созданного штамма У.сЬокгае МАК757 Ктк Тох*4* биовара эльтор для получения ХТ. Получен и очищен холерный токсин 2-ого типа, обладающий антигенными свойствами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Щелканова Е.Ю., Горяев A.A. Изменение экспрессии ключевых генов патогенности и иммуногенности Vibrio cholerae с помощью транспозона Тп5-Mob // Материалы X Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье». - Санкт-Петербург, 2007. -С. 534-535.

2. Горяев A.A., Щелканова Е.Ю., Лозовский Ю.В., Тучков И.В., Смирнова Н.И. Конструирование рекомбинантного штамма Vibrio cholerae биовара эльтор -гиперпродуцента холерного токсина П типа и определение оптимальных условий для продукции этого бежа в лабораторных условиях // Проблемы особо опасных инфекций. - 2008. - Вып. 95. - С. 56 - 59.

3. Горяев А. А. Редукция генома щзофага вирулентности СТХф, индуцированная внедрением в хромосому Vibrio cholerae транпозона Tn5-Mob // Тезисы докладов X международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов -2008». - Москва, 2008. - С. 64 - 65.

4. Горяев A.A., Щелканова Е.Ю., Лозовский Ю.В., Смирнова Н.И. Конструирование штамма Vibrio cholerae биовара эльтор - продуцента холерного токсина II типа, выделение и изучение антигенных свойств секретируемого токсина // Сб. матер, проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы». -Ростов-на-Дону, 2008. - Вып. 21. - С. 89 - 91.

5. Патент №2326941 Штамм бактерий Vibrio cholerae-продуцент холерного токсина П типа // Бюллетень изобретений. - 2008. - Бюл. №17.

6. Горяев А. А. Сверхэкспрессия генов холерного токсина, связанная с изменением генома профага СТХф Vibrio cholerae II Материалы международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» посвященная 40-летию ГосНИИ Генетики. - Москва - Пущино, 2008. - С. 133 -134.

7. Щелканова Е.Ю., Горяев A.A., Смирнова Н.И.. Изменение генома профага СТХф Vibrio cholerae биовара эльтор, вызываемое транспозоном Tn5-Mob //

Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2008. - №3. - С. 11 -17.

8. Смирнова Н.И., Чеядышова Н.Б., Горяев А.А., Лозовский Ю.В., Кутырев В.В. Эволюция генома Vibrio cholerae: пути формирования атипичных штаммов II Проблемы особо опасных инфекций. - 2008. - Вып. 97. - С. 5 - 11.

9. Горяев А.А., Смирнова Н.И. Изменение продукции холерного токсина Vibrio choleme в результате реорганизации генома профага СТХф Н Сб. матер, проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы». - Ростов-на-Дону, 2009. - Вып. 22. - С. 89 - 91.

10. Горяев А.А., Смирнова Н.И. Изменение экспрессии генов холерного токсина, индуцируемое внедрением транспозона Tn5-Mob в геном профага СТХср Vibrio cholerae II Сб. материалов V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. - Москва, 2009. - 2009. - Ч. 1. - С. 20.

ГОРЯЕВ Артем Анатольевич

ШТАММЫ ПВЫО СИ01£ШЕ БИОВАРА ЭЛЬТОР С ИЗМЕНЕННОЙ ПРОДУКЦИЕЙ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА; ПОЛУЧЕНИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГННЕТИЧЕСХИЙ АНАЛИЗ

03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидат биологических наук

Подписано к печати 1S.09.2009 г. Формат 60x34/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Гарнитура «Тайме». Усл.-печ. л. 1. Тираж 100. Заказ № 866.

Отпечатано с оригинал-макета в ООО «Принт-Клуб» 410026, г. Саратов,, ул. Московская, 160. Тел.: (845-2) 507-888

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Горяев, Артем Анатольевич

СПИСОК ПРИНЯТЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ПРОФАГ ВИРУЛЕНТНОСТИ СТХср: СТРУКТУРА ГЕНОМА И ФУНКЦИИ БЕЛКОВ.

1.1. Профаг вирулентности СТХф.

1.1.1. Коровая область.

1.1.2. Я82-область.

1.2. Жизненный цикл профага СТХф.

2.1. Вариабельность генома профага СТХф.

2.2. Гибридные штаммы V.cholerae биовара эльтор, несущие профаг СТХф классического биовара.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Бактериальные штаммы.

2.2. Питательные среды и культивирование штаммов.

2.3. Методы.

2.3.1. Определение продукции растворимой гемагглютинин/протеазы, подвижности и способности формировать биопленку.

2.3.2. Оценка продукции холерного токсина с помощью реакции пассивного иммунного гемолиза и иммуноферменого GM

ELISA.

2.3.3. Определение биологической активности холерного токсина по методу Creig.

2.3.4. Конъюгационные скрещивания донорных и реципиентных штаммов.

2.3.5. Внедрение транспозона Tn5-Mob в хромосому штаммов V.cholerae.

2.3.6. Выделение хромосомной и плазмидной ДНК.

2.3.7. Рестрикционный анализ плазмидной и хромосомной ДНК.

2.3.8. ПЦР-анализ бактериального генома исследуемых штаммов с использованием различных специфичных олигонуклеотидных праймеров.

2.3.9. Определение копийности генов ctxAB, кодирующих биосинтез холерного токсина, с помощью ДНК-ДНК гибридизации.

2.3.10. Секвенирование генов холерного оперона.

2.3.11. Протеомный анализ.

2.3.12. Определение продукции белков внешней мембраны с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.

2.3.13. Получение очищенного холерного токсина и специфических поликлональных антител к нему.

2.3.14. Внутрикишечное заражение крольчат-сосунков клетками изогенных штаммов с разным уровнем продукции холерного токсина.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСПОЗОННЫХ МУТАНТОВ V. CHOLERAE БИОВАРА ЭЛЬТОР С ИЗМЕНЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНОВ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА.

3.1. Введение в клетки модельного штамма V.cholerae биовара эльтор рекомбинантной плазмиды pSUP5011 (ApR CmRKmR), содержащей транспозон Tn5-Mob. r s s

3.2. Получение транспозонных мутантов (Km , Ар , Cm ) с измененной продукцией холерного токсина.

3.3. Фенотипический анализ инсерционных мутантов с измененной продукцией холерного токсина.

3.4. Сравнительный анализ вирулентных свойств различных мутантов с измененным уровнем биосинтеза холерного токсина.

ГЛАВА 4. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ТРАНСПОЗОННЫХ МУТАНТОВ С ИЗМЕНЕННОЙ ПРОДУКЦИЕЙ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА.

4.1. Изучение активности регуляторных генов toxR и toxT, контролирующих экспрессию генов ctxAB.

4.2. Сравнительный анализ структуры генома профага СТХф у исходного штамма и его транспозонных мутантов.

4.3. Определение количества копий профага СТХф в хромосоме полученных транспозонных мутантов.

4.4. Секвенирование оперона ctxAB штаммов МАК757 и его транспозонных мутантов.

4.5. Анализ плазмидного профиля штамма KmR Тох^.

ГЛАВА 5. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПРОТЕОМОВ V. CHOLERAE МАК

И ЕГО ТРАНСПОЗОННОГО МУТАНТА С ГИПЕРПРОДУКЦИЕЙ ХОЛЕРНОГО

ТОКСИНА.

5.1. Получение и сравнительный анализ протеомных карт изучаемых штаммов.

5.2. Выявление белков, изменивших экспрессию в результате влияния на них транспозонной мутации в геноме профага СТХср.

ГЛАВА 6. ПОЛУЧЕНИЕ ОЧИЩЕННОГО ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА 2 ТИПА И ПОЛИКЛОНАЛЬНОЙ АНТИСЫВОРОТКИ К НЕМУ.

6.1. Определение оптимальных условий культивирования сконструированного штамма гиперпродуцента холерного токсина.

6.2. Выделение и очистка холерного токсина 2-ого типа.

6.3. Получение специфической поликлональной антисыворотки к холерному токсину 2-ого типа.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Штаммы Vibrio cholerae биовара эльтор с изменной продукцией холерного токсина: получение и молекулярно-генетический анализ"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Напряженная эпидемическая ситуация в мире, обусловленная продолжающимися вспышками и эпидемиями холеры в странах Юго-Восточной Азии и Африки, создают реальную возможность завоза этой инфекции на территорию России (Андрусенко и др., 2009; Ломов, 2009; Марамович и др., 2009; Safa et al, 2008; Taneja el al, 2009). К настоящему времени известно, что в результате эволюции в пределах вида образовалось три эпидемически опасных штамма, отличающихся друг от друга по структуре и функциям генома - V. cholerae 01 серогруппы классического биовара, V. cholerae 01 серогруппы биовара эльтор и V. cholerae 0139 серогруппы. V.cholerae классического биовара был, видимо, возбудителем первых шести пандемии (18171923 гг.) азиатской холеры. Однако к началу прошлого столетия эти вибрионы были вытеснены на эндемичной для них территории холерными вибрионами биовара эльтор, которые вызвали текущую, 7-ю, пандемию холеры, начавшуюся в 1961^ г. и продолжающуюся до сих пор (Бароян, 1971; Смирнова, Кутырев, 2004; Faruque et al., 1998; Sack et al, 2004). Что касается внезапно появившегося в-1992 г. в Индии и Бангладеш эпидемически опасного штамма V.cholerae ранее неизвестной 0139 серогруппы, то прогноз ряда исследователей о начале новой, 8-ой, пандемии холеры, связанной с этим возбудителем, пока не оправдался (Ramamurthy et al., 1993; Mukhopadhyay et al., 1995; Смирнова, 2002).

Секвенирование генома V.cholerae показало, что основные факторы его патогенности расположены на мобильных генетических элементах (МГЭ) -умеренных профагах (СТХср и RS1), «островах патогенности» (VPI-1, VPI-2) и «пандемичности» (VSP-1, VSP-2). Ключевым фактором патогенности возбудителя холер является холерный токсин (XT), биосинтез которого определяется генами ctxAB, входящими в состав, профага СТХф. При этом холерные вибрионы классического биовара продуцируют XT 1-ого типа, a V.cholerae биовара эльтор -XT 2-ого типа. Наличие большого числа МГЭ определяет высокую вариабельность генома возбудителя холеры, которая выражается в изменении его размеров и функции за счет потери или приобретения мобильных элементов. Такие изменения генома могут обусловить появление новых клонов с разным набором генов патогенности. Так, в последнее время происходит формирование патогенных клонов V. cholerae биовара эльтор, отличительной особенностью которых является присутствие либо МГЭ, либо их отдельных генов, характерных только для классических вибрионов. Наибольший интерес представляют штаммы V.cholerae биовара эльтор, содержащие классический профаг СТХф и продуцирующие XT 1-ого типа. Такие штаммы, как правило, более вирулентные, вызвали эпидемические вспышки холеры в Бангладеш, Мозамбике, Индии и Вьетнаме (Safa et al., 2006; Raychoudhuri et al, 2008; Safa et al, 2008; Nguyen et al, 2009; Taneja et al, 2009). Наряду с появлением атипичных штаммов с повышенной вирулентностью, значительную проблему представляют и нетоксигенные клоны, сохранившие весь набор других известных генов патогенности. Эти штаммы являются потенциально эпидемически опасными и способны вызывать диарейные заболевания за счет, видимо, дополнительных факторов патогенности (Онищенко и др., 2007; Монахова и др., 2009; Boyd et al., 2000; Pichel et al., 2003; Sing et al., 2001). Одним из возможных механизмов образования таких атоксигенных клонов может быть спонтанная утрата генома профага СТХф (Кулынань и др., 2006; Смирнова и др., 2007).

Таким образом, очевидна актуальность исследований, направленных на дальнейшее изучение механизмов формирования атипичных штаммов с измененными вирулентными свойствами V.cholerae. В первую очередь большой интерес представляют исследования механизмов образования высокотоксигенных штаммов V.cholerae биовара эльтор. Эта проблема имеет не только существенное фундаментальное значение, но и представляет практическую ценность, поскольку штаммы с высоким уровнем продукции XT 2-ого типа могли бы использоваться для получения этого белка, необходимого для создания более эффективных -холерных диагностических и профилактических препаратов. Широкое распространение среди разных штаммов транспозонов, локализованных на плазмидах или входящих в состав интегронов, и их большой вклад в эволюцию патогенных бактерий позволяют рассмотреть возможность их участия в изменении продукции холерного токсина у возбудителя холеры эльтор.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - получение и сравнительный анализ фенотипических и молекулярно-генетических свойств различных атипичных по продукции холерного токсина штаммов V.cholerae биовара эльтор.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. С помощью транспозона Tn5-Mob (KmR) на модельном штамме V.cholerae МАК757 биовара эльтор получить мутанты с измененной продукцией XT.

2. Провести сравнительный фенотипический анализ исходного штамма и мутантов с измененной продукцией XT, определив продукцию гемолизина, растворимой гемагглютинин/протеазы (РГАП), маннозо-чувствительных гемагглютинирующих пилей адгезии (МЧПА), экзополисахарида, а также подвижность и способность образовывать биопленку; дать оценку вирулентности сравниваемых штаммов.

4. Сравнить протеомные профили исходного штамма и мутанта с гиперпродукцией XT.

5. Выделить, очистить и изучить антигенные свойства XT 2-ого типа, продуцируемого созданным штаммом V.cholerae биовара эльтор с гиперпродукцией этого белка.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА:

Обнаружено, что внедрение транспозона Tn5-Mob (KmR) в хромосому модельного штамма V.cholerae МАК757 биовара эльтор, несущего две копии профага СТХср, в 5% случаев приводит к образованию различных мутантов с измененной продукцией XT. В результате молекулярно-генетического анализа впервые показано, что у мутантов I группы (KmR Тох4"'^) произошла индуцированная транспозоном утрата одной из копий профага и сохранение в коровой области второй копии лишь генов ctxAB. Уровень биосинтеза XT у таких клонов, потерявших более 60% генома коровой части оставшегося профага, но сохранивших лишь оперон ctxAB, возрастает более чем в 2000 раз по сравнению с исходным штаммом, составляя 43,0±3,2 мкг/мл по данным ELISA. Во II группе мутантов (KmR Тох*"1") встраивание транспозона в хромосому привело к потере одной копий профага с сохранением всех генов второй копии, что обусловило увеличение уровня биосинтеза XT более чем в 100 раз (2,7±0,7 мкг/мл). В III группу входили нетоксигенные мутанты (KmR Тох~), возникшие в результате утраты всех генов двух копий профагов за исключением гена rstR. Таким образом, показан новый, раннее не известный путь образования штаммов холерного вибриона как с повышенной токсигенностыо, так и лишенных этого свойства.

При сравнительном анализе протеомов исходного штамма (МАК757 Тох+) и его мутанта с гиперпродукцией, XT (МАК757 KmR Тох444") обнаружено, что в клетках МАК757 KmR Тох^ из 531 выявленного белка редукция генома профага сопровождается- изменением содержания 27 белков' из которых репрессируется синтез 23, связанных, в основном, с энергетическим обменом, и индуцируется синтез 4 белков, участвующих в транспорте аминокислот. В целом, полученные данные указывают на происходящие изменения клеточного метаболизма и энергетического гомеостаза у штамма МАК757 KmR Тох"144", что связано, видимо, с гиперэкспрессией генов XT.

Показано, что полученные мутанты как с повышенной продукцией XT, так и утративших способность синтезировать этот белок (вследствие делеции обеих копий профага СТХф) могут сохраняться в составе биопленки в течение длительного периода.

Впервые создан бесплазмидный штамм V.cholerae биовара эльтор с высоким уровнем продукции XT. Приоритетность этих данных подтверждена получением патента №2326941 "Штамм бактерий Vibrio c/zo/егае-продуцент холерного токсина II типа".

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ:

В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» депонированы изогенные штаммы V.cholerae биовара эльтор с различной экспрессией генов ctxAB, которые могут быть использованы для получения новых данных о механизмах регуляции активности генов XT и о влиянии уровня продукции этого фактора патогенности на развитие холерогенной реакции. Полученный штамм с высоким уровнем продукции XT 2-ого типа может быть использован для получения этого белка с целью изготовления более эффективных иммунодиагностических и профилактических препаратов против холеры, вызванной V.cholerae биовара эльтор.

По результатам работы составлены методические рекомендации: «Использование транспозона Tn5-Mob для получения штаммов Vibrio cholerae с измененной продукцией холерного токсина», одобренные Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол №1 от 09 апреля 2009 г.) и утвержденные директором (24 апреля 2009 г.).

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Внедрение транспозона Tn5-Mob (KmR) в хромосому модельного штамма V.cholerae МАК757 биовара эльтор приводит к образованию мутантов трех типов, отличающихся по продукции XT. Мутанты 1-ого типа МАК757 KmR Тох444", по данным иммуноферментного метода GM] ELISA, продуцируют 43,0±3,2 мкг/мл XT, что более чем в 2000 раз превышает уровень биосинтеза этого белка у исходного штамма. У мутантов П-ого типа МАК757 KmR Тох4 ' уровень биосинтеза XT возрос в более чем 100 раз и составил 2,7±0,7 мкг/мл. И в последнюю группу входили мутанты МАК757 KmR Тох~ утратившие способность к продукции XT.

2. Обнаруженное повышение продукции XT у транспозонных мутантов модельного штамма V.cholerae МАК757 не связано с усилением активности глобальных регуляторных генов toxR и toxT, а обусловлено изменением генома профага СТХф, индуцированным Tn-элементом. Внедрение транспозона Tn5-Mob в бактериальный геном обусловило появление мутантов 3-х типов с редуцированным геномом профага. У мутантов I типа выявлена делеция одной копии СТХф и потеря всех генов коровой области второй копии, за искючением оперона ctxAB (KmR Tox4"**). Мутанты II типа утратили одну копию СТХф с сохранением всех генов второй копии (KmR Тох^). У мутантов III типа произошла потеря обеих копий профага СТХф, за исключением гена rstR (KmR Тох-).

3. Транспозонные мутанты с повышенным уровнем биосинтеза XT и не продуцирующие этот белок не отличаются от исходного штамма по продукции секретируемой растворимой гемагглютинин/протеазы и-' термолабильного гемолизина, но имеют повышенную подвижность. Штаммы с измененной продукцией XT способны формировать биопленку, что указывает на возможность их сохранения во внешней среде в течение длительного периода. Штаммы с повышенной продукцией XT были более вирулентны.

4. По данным сравнительного анализа протеомов исходного штамма V.cholerae МАК757 Тох+ и его транспозонного гипертоксигенного мутанта МАК757 KmR Тох+++ делеция генома профага СТХф у последнего сопровождалась изменением экспрессии ряда бактериальных генов. Среди 531 белков, выявленных в клетке, изменено содержание 27 белков (или 5%), связанных в основном с энергетическим обменом или участвующих в транспорте аминокислот.

5. Сконструированный штамм V.cholerae МАК757 KmR Тох"4" биовара эльтор является стабильным и эффективным продуцентом XT 2-ого типа и может быть использован в производстве для получения этого белка. Определены оптимальные условия выращивания этого штамма: казеиновый бульон, без добавления канамицина, 30 °С, рН 7,6, время культивирования - 8 часов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ:

Материалы диссертации доложены и представлены на научно-практических конференциях РосНИПЧИ "Микроб" "Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте "Микроб" (Саратов, 2008, 2009 гг.), на Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера» (Ростов-на-Дону, 2008, 2009 гг.), на Всероссийской конференции "Фундаментальная наука и клиническая медицина" (Санкт-Петербург, 2007 г.), на XV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2008 г.), на Российской школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Пущино, 2008 г.), а также на III Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике "Геномика и эволюция" (Звенигород, 2008 г.).

ПУБЛИКАЦИИ:

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК, а также получен один патент на изобретение.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ:

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, глав собственных исследований, заключения, выводов и- списка использованных источников, включающего 201 цитируемую работу, из них 165 зарубежных и 36 отечественных. Общий объем диссертации составляет 125 страниц. Текст иллюстрирован 11 таблицами и 20 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Горяев, Артем Анатольевич

ВЫВОДЫ

1. Внедрение транспозона Tn5-Mob (KmR) в хромосому модельного вирулентного штамма V.cholerae МАК757 биовара эльтор с частотою 5,5* 10~5 вызывает образование различных мутантов с измененной продукцией холерного токсина - с высоким (43 мкг/мл) и умеренным (2,7 мкг/мл) уровнем биосинтеза этого белка, а также нетоксигенных клонов.

3. Обнаружен более высокий уровень вирулентности транспозонных мутантов с повышенной продукцией холерного токсина, который выражается в 100% летальности экспериментальных животных через первые 24 часа после заражения.

4. Выявленное изменение продукции холерного токсина у транспозонных мутантов штамма V.cholerae МАК757 биовара эльтор обусловлено разной по протяженности делецией генома профага СТХф, индуцированой внедрением транспозона Tn5-Mob. Утрата только одной копии профага СТХф была характерна для KmR Тох^ клонов. Более протяженная делеция была обнаружена у KmR Тох444" клонов и выражалась в потере одной копии профага и всех генов коровой области второй копии за исключением оперона ctxAB, что привело к его гиперэкспрессии. Самая протяженная делеция была у KmR Тох~ мутантов, которые утратили все гены профага СТХф за исключением гена rstR.

5. Впервые проведен сравнительный анализ двух протеомов исходного штамма V. cholerae МАК757 биовара эльтор и его транспозонного мутанта с гиперпродукции XT (KmR Tox^t+). Обнаружено, что из 531 выявленного белка у мутанта с повышенной продукцией XT изменено содержание 27, из которых репрессируется синтез 23 белков, в основном связанных с энергетическим обменом, и индуцируется синтез только 4 белков, участвующих в транспорте аминокислот.

6. Подобраны оптимальные условия культивирования созданного штамма V.cholerae МАК757 KmR Tox^f+ биовара эльтор для получения XT. Получен и очищен холерный токсин 2-ого типа, обладающий антигенными свойствами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На протяжении около 50 лет (с 1961 г. - по настоящее время) эпидемии холеры, вызванные V.cholerae биовара эльтор, многократно создавали сложные эпидемические ситуации во многих странах мира, включая и Российскую Федерацию. Так, по данным ВОЗ, в 2009 г. на юге Африки в Зимбабве эпидемия холеры эльтор охватила более 83000 человек, из которых 3806 умерло. Возрастающая актуальность проблемы холеры определяется еще и тем, что в современный период происходит, как указывалось выше, формирование более токсигенных природных штаммов возбудителя за счет изменения его генома. Обнаружение природных штаммов с измененной экспрессией генов холерного токсина, вызвавших эпидемии в Юго-Восточной Азии и Африке, указывает на необходимость проведения экспериментальных исследований, направленных на изучение механизма этого процесса.

В представленной работе впервые изучена роль транспозона Tn5-Mob в изменении генома профага СТХф, кодирующего XT - ключевой фактор вирулентности, и показан ранее неизвестный путь возникновения штаммов с повышенной токсигенностью. Внедрившийся транспозон явился горячей точкой для рекомбинаций, обусловивших образование делеций разной протяженности. Впервые обнаружено, что утрата одной копии профага, а также 4 генов коровой области второй копий с сохранением в ней лишь оперона ctxAB, обусловила образование штаммов с гиперпродукцией XT. Такие делеционные мутанты по данным GMi ELISA продуцируют XT больше в 2000 раз (43 мкг/мл) по сравнению с исходным штаммом (0,02 мкг/мл). Кроме того выявлены мутанты, имеющие делецию лишь одной копии профага СТХф, но сохранившие все гены второй копии. Утрата только одной копии профага также привела к повышению экспрессии сохранившихся генов ctxAB, хотя в этом случае продукция XT у делеционных мутантов повысилась примерно в 150 раз и составила 2,7 мкг/мл.

Поскольку экспрессия структурных генов ctxAB, входящих в состав профага СТХф, контролируется глобальными регуляторными генами toxR и toxT, встал вопрос об их участии в повышении экспрессии сохранившихся генов XT. Однако проведенные исследования показали, что изменение продукции XT у этой группы транспозонных мутантов не связанно с повышением активности регуляторных генов toxR и toxT. Тем не менее, несмотря на то, что механизм значительного повышения экспрессии генов ctxAB у делеционных мутантов остается! пока неизвестным, представленные данные позволяют сделать заключение, что транспозоны могут внести большой вклад в изменении активности генов основного фактора вирулентности у возбудителя холеры. На основе выявленной нами зависимости активности генов ctxAB от делеции генома профага можно предположить, что такие делеции приводят к формированию новых последовательностей в промоторной области оперона ctxAB, .кодирующего XT.

Самостоятельный интерес представляют данные об образовании нетоксигенных штаммов в результате делеции обеих копий профага СТХф. Такие штаммы, сохранившие весь известный набор других генов вирулентности и относящиеся к потенциально эпидемически опасным, нередко выделяются как от носителей, так и из разных объектов внешней среды. Между тем вопрос об их происхождении до сих пор остается малоизученным. Ранее были опубликованы данные, согласно которым нетоксигенные клоны могут формироваться из токсигенных в результате спонтанной утраты профага СТХф в результате относительно длительного пребывания возбудителя в водной среде (Кульшань и др., 2006). Нами, напротив, впервые показано, что удаление из хромосомы практически двух копий профага (за исключением гена репрессора rstR) вирулентного штамма, не находящегося в водной среде, может быть индуцировано внедрившимся в геном возбудителя транспозоном. В целом, эти сведения, наряду с данными о путях возникновения высокотоксигенных штаммов холерного вибриона, являются существенным вкладом в понимание природы изменчивости патогенности возбудителя холеры.

Одним из важных итогов работы явилось выявление уровня вирулентности полученных супертоксигенных и нетоксигенных мутантов, а также изучение их способности формировать биопленку. Супертоксигенные мутанты KmR Tox444" оказались более вирулентными, по сравнению с исходным штаммом. Основанием для такого заключения служит тот факт, что указанные штаммы KmR Tox444" при развитии выраженного холерогенного эффекта вызвали гибель всех зараженных животных уже в течение первых 24 часов после их заражения. В то же время все проверенные нетоксигенные (KmR Tox ) штаммы оказались авирулентными, поскольку из-за отсутствия продукции XT не могли вызвать у зараженных животных развитие холерогенной реакции. Необходимо особо отметить, что как супертоксигенные, так и нетоксигенные штаммы сохранили способность формировать биопленку, что указывает на возможность их длительного сохранения во внешней среде.

Утрата части генома, имевшая место у изучаемых мутантов, и повышение экспрессии генов ctxAB могли изменить уровень экспрессии других хромосомных генов. Для проверки данного предположения был проведен сравнительный анализ протеомов двух изогенных фенотипически разных вариантов модельного штамма V.cholerae МАК757 - исходного (Тох+) и супертоксигенного (KmR Tox444). В результате установлено, что у гипертоксигенных штаммов действительно изменено содержание 27 белков из 531 выявленных. Индуцируется синтез только 4 белков, связанных с транспортом веществ. В то же время синтез 23 белков, участвующих в основном в энергетическом обмене, был значительно снижен. Таким образом, полученные данные указывают на заметное функциональное изменение клеточного метаболизма у штамма KmR Тох44 , которое, возможно, связано с гиперпродукцией XT.

Полученные данные, о ранее неизвестных путях возникновения гипертоксигенных и нетоксигенных штаммов холерного вибриона, открывают широкие перспективы в плане получения новых фундаментальных научных знаний о молекулярно-генетических механизмах изменения патогенных и иммуногенных свойств возбудителя холеры, которые необходимы для понимания эволюции его генома, и своевременного прогнозирования возникновения штаммов с ранее неизвестными вирулентными и диагностическими свойствами.

Следует отметить также, что проведенная работа имеет важное практическое значение. Создан штамм с высоким уровнем продукции холерного токсина 2-ого типа, В-субъединица которого относится к основным протективным антигенам и определяет формирование антитоксического иммунитета при холере. Кроме того выявлены оптимальные условия (казеиновая среда, рН=7,6, 30 °С, 8 часов) малообъемного культивирования этого штамма (V.cholerae МАК757 KmR Тох444" биовара эльтор) для максимальной продукции XT, который может быть использован для изготовления более специфических холерных диагностических и профилактических препаратов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Горяев, Артем Анатольевич, Саратов

1. Адамов А. К., Наумшина М. С. Холерные вибрионы. Саратов, -1984. - 328 с.

2. Бароян О.В. Холера Эль-Тор. М.: Медицина, 1971. - 254 с.

3. Журавлева Е.А. Обмен генетической информацией между Vibrio cholerae 01 и не 01. Автореф. дис. . канд. биол. наук.- Саратов, 1993. -24с.

4. Журавлева Е.А., Смирнова Н.И. Использование транспозонов для изучения генетической организации Vibrio cholerae не 01 с помощью Tn5-Mob // Молекул. Генетика, микроб, и вирусол. 1991. -№ 5. - С. 15-19.

5. Гинцбург А.Л., Янишевский Н.В., Мотин В.Л. и др. Организация и клонирование структурных генов энтеротоксина Vibrio cholerae eltor RY79 // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1984 - № 9. - С. 12 - 18.

6. Гинцбург А. Л., Янишевский Н.В., Мотин В. Л. и др. Природа последовательностей RSI, фланкирующих ген vet, кодирующих синтез холерного токсина у Vibrio cholerae eltor II Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1986. - № 2. - С. 11 - 18.

7. Захарова Т.Л. Создание и свойства штаммов холерного вибриона с повышенной продукцией протективных антигенов: Автореф. дис. . канд. биол. наук.- Саратов, 1997. 20с.

8. Ерошенко Г.А. Молекулярно-генетический анализ штаммов Vibrio cholerae0139: Дисс. . док. биол. наук. Саратов, 2004. - 298 с.

9. Жуков-Вережников Н.Н., Мусабаев И.К., Завьялов Н.К. Клиника, лечение и профилактика холеры. Ташкент: Медицина, 1966. - 435 с.

10. Ильина Т.С. Механизмы горизонтального переноса генов: роль бактериофагов и интегронов в эволюции патогенных бактерий // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 2003. - № 4. - С. 3 - 10.

11. Ильина Т.С. Суперинтегроны бактерий источники новых генов с адаптивными функциями // Генетика. - 2006. - Т. 42, № 11. - С. 1536 - 1546.

12. Ильина Т.С., Романова Ю.М. Геномные острова бактерий: организация, функции, роль в эволюции // Молекулярная биология. 2002. - Т. 36. - № 2. -С. 228-239.

13. Кулынань Т.А., Топорков А.В., Смирнова Н.И. Генетические изменения вирулентных штаммов холерных вибрионов биовара эльтор при их обитании в водной среде // Проблемы особо опасных инфекций. 2006. - Вып. 91. - С. 41 -44.

14. Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Адаменко О.Л. и др. Эпидемиологическая обстановка по холере в мире, странах СНГ и России (1999-2008 гг.) // Материалы проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы». 2009. - Вып. 22. - С. 15-19

15. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Пер с анг. -М.: Мир, 1984.-480 с.

16. Марамович А.С., Урбанович Л.Я., Балахонов С.В. и др. Эпидемиологический риск заноса и распространения холеры в регионе Сибири и Дальнего Востока

17. Материалы проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы». 2009. - Вып. 22. - С. 32-36

18. Марамович А.С., Урбанович Л .Я., Миронова Л.В., Куликалова Е.С. Эволюция эпидемиологии холеры // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -2006.-№6.-С. 63-71.

19. Мишанькин Б.Н., Романова Ю.М., Ломов Ю.М. и др. Vibrio cholerae 0139, выделенные от людей и из воды открытых водоемов: сравнительное генотипирование // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2000. - N З.-С. 3-7.

20. Монахова Е.В., Писанов Р.В. Токсины холерных вибрионов // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 2005. - № 1. - С. 7 - 18.

21. Монахова Е.В., Ломов Ю.М., Михась Н.К., Писанов Р.В. Структура и изменчивость неполного СТХ-элемента холерных вибрионов // Пробл. особо опасных инф. 2007. - № 1. - С. 58 - 61.

22. Можаров О.Т. Оптимизация выделения собственных плазмид чумного микроба. Молекулярная биология и генетика возбудителей особо опасных инфекций. Часть I. научно-тематический сборник. Изд-во Саратов, ун-та, 1982, с. 48-52

23. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Москвитина Э.А. с соавт. Холера в начале XXIвека, прогноз // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. — 2005. № 3. — С. 44 - 48.

24. Осин А.В., Нефедов К.С., Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И. // Генетика. 2005. -Т. 41, № 1.-С. 1-10.

25. Смирнова Н.И. Генетическая организация холерных вибрионов различных биоваров: Автреф. дис. док. биол. наук. Саратов, 1989. - 45с.

26. Смирнова Н.И., Ливанова Л.Ф., Давыдова Н.И. и др. Получение штаммов Vibrio cholerae продуцентов холерного токсина и В-субъединицы холерного токсина // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1993. - № 3. - С. 30-35.

27. Смирнова Н.И. Адгезины Vibrio cholerae: фенотипический анализ и генетический контроль синтеза // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. -1995. -№3.- С. 18-26.

28. Смирнова Н.И. Генетический контроль патогенности Vibrio cholerae: умеренный нитевидный фаг СТХ, кодирующий холерный токсин и остров патогенности // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1999. - № 4. - С. 1 - 15.

29. Смирнова Н.И. Возбудитель холеры новой 0139-серогруппы: молекулярно-генетические особенности и происхождение // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 2002. - № 3. - С. 23 - 33.

30. Смирнова Н.И., Кокушкин A.M. Эпидемически значимые штаммы холерного вибриона: генетические особенности и возникновение // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2001. - №3. - С. 25 - 30.

31. Смирнова Н.И., Кульшань Т.А., Челдышова Н.Б., Осин А.В. Структурные и функциональные изменения генома возбудителя холеры в водной среде // Эпидемиология и инфекционные заболевания. 2007а. - №5. - С. 22 - 27.

32. Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Эволюция возбудителя холеры // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 2004. - № 4. - С. 3 - 13.

33. Смирнова Н.И., Челдышова Н.Б., Горяев А.А. и др. Эволюция генома Vibrio cholerae: пути формирования атипичных штаммов // Пробл. особо опасных инф. 2008. - № 3. - С.

34. Albert M.J., Siddique А.К., Islam M.S. et al. Large outbreak of clinical cholera due to Vibrio cholerae non-Ol in Bangladesh // Lancet. 1993. - Vol. 341. - P. 704.

35. Ansaruzzaman M., Bhuiyan N.A., Nair G.B. et al. The Mozambique Cholera Vaccine Demonstration Project Coordination Group. Cholera in Mozambique, variant of Vibrio cholerae // Emerg Infect Dis. 2004. - Vol. 10. - P. 2057 - 2059.

36. Attridge S.R., Manning P.A., Holmgren J., Jonson G. Relative significance of mannose-sensitive hemagglutinin and toxin-coregulated pili in colonization of infantmice by Vibrio cholerae El Tor // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64, N 8. - P. 3369 -3373.

37. Attridge S.R., Voss E., Manning P.A. Pathogenic and vaccine significance of toxin-coregulated pili of Vibrio cholerae El Tor // J Biotechnol. 1999. - Vol. 73. - P. 109-117.

38. Badizadegan K., Wheeler H. E., Fujinaga Y. et al. Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2004. - Vol. 287. - P. 1453 - 1462.

39. Beaber J.W., Hochhut В., Waldor M.K. Genomic and functional analyses of SXT, an integrating antibiotic resistance gene transfer element derived from Vibrio cholerae II J. Bacteriol. 2002. - Vol. 184, N 15. - P. 4259 - 4269.

40. Beck N.A., Krukonis E.S., DiRita V.J. TcpH influences virulence gene expression in Vibrio cholerae by inhibiting degradation of the transcription activator TcpP // J. Bacteriol. 2004. - Vol. 186.-P. 8309- 8316.

41. Benitez J.A., Silva A.J., Finkelstein R.A. Environmental signals controlling production of hemagglutinin/protease in Vibrio cholerae II Infect. Immun. 2001. -Vol. 69, N 10. - P.6549 - 6553.

42. Beyhan S., Tischler A.D., Camilli A., Yildiz F.H. Differences in gene expression between the classical and El Tor biotypes of Vibrio cholerae Ol II Infect. Immun.2006. Vol. 74, N 6. - P. 3633 - 3642.

43. Bhadra R.K., Roychoudhury S., Banerjee R.K. et al. Cholera toxin (CTX) genetic element in Vibrio cholerae 0139 // Microbiology. 1995. - Vol. 141. - P. 19771983.

44. Bhaskaran K., Rowley D. Nutritional studies on Vibrio cholerae IIJ Gen Microbiol. 1956. - Vol. 15, N 2. - P. 417 - 422.

45. Bhattacharya S.K., Bhattacharya M.K., Nair G.B. et al. Clinical profile of acute diarrhoea cases infected with the new epidemic strain of Vibrio cholerae 0139: designation of the disease as cholera // J Infect. 1993. - Vol. 27, N 1. - P. 11 - 15.

46. Bina J., Zhu J., Dziejman M., et al. ToxR regulon of Vibrio cholerae and its expression in vibrios shed by cholera patients // Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 2003. Vol. 100.-P. 2801 -2806.

47. Biskri L., Bouvier M., Guerout A.M. et al. Comparative Study of Class 1 Integron and Vibrio cholerae Superintegron Integrase Activities // J. Bacteriol. 2005. - Vol. 187, N5.-P. 1740- 1750.

48. Blakely G.W., Davidson A.O., Sherratt DJ. Binding and cleavage of nicked substrates by site-specific recombinases XerC and XerD // J. Mol. Biol. 1997. -Vol. 265.-P. 30-39.

49. Booth B.A., Boesman-Finkelstein M., Finkelstein R.A. Vibrio choleraehemagglutinin/protease nicks cholera enterotoxin // Infect. Immun. 1984. - Vol. 45.-P. 558- 560.

50. Boyd E.F., Heilpern A.J., Waldor M.K. Molecular analyses of a putative СТХф precursor and evidence for independent acquisition of distinct СТХф by toxigenic Vibrio cholerae И J. Bacteriol. 2000. - Vol. 182. - P. 5530 - 5538.

51. Boyd E. F., Moyer К. E., Shi L. et al. Infectious СТХф and the vibrio pathogenicity island prophage in Vibrio mimicus, evidence for recent horizontal transfer between V. mimicus and V. cholerae // Infect. Immun. 2000. Vol. 68. - P. 1507 - 1513.

52. Boyd E.F., Waldor M.K. Evolutionary and functional analyses of variants of the toxin-coregulated pilus protein TcpA from toxigenic Vibrio cholerae non-Ol-non-0139 serogroup isolates//Microbiol. -2002. Vol. 148. - P. 1655 - 1666.

53. Bramucei M. G., Holmes R.K. Radial passive immune hemolysis assay for detection of heat labile enterotoxin produced by individual colonies of E. coli or V. cholerae II J. Clin. Microbiol. 1978. - Vol. 2, N 2. - P. 252 - 255.

54. Brown R.C., Taylor R.K. Organization of the tcp, acf, and toxT genes within a ToxT-dependent operon I I Mol. Microbiol. 1995. - Vol. 16. - P. 425 - 439.

55. Camberg J. L., Johnson T. L.? Patrick M. et al. Synergistic stimulation of EpsE ATP hydrolysis by EpsL and acidic phospholipids // EMBO J. 2007. - Vol. 26. - P. 19 -27.

56. Campos J., Fando R., Silva A. et al. Replication function of the RSI element associated with Vibrio cholerae СТХФ prophage // FEMS Microbiol. Lett. 1998. -Vol. 164.-P. 141-147.

57. Carroll P.A., Tashima K.T., Rogers M.B. et al. Phase variation in tcpH modulatesexpression of the ToxR regulon in Vibrio cholerae // Mol Microbiol. 1997. - Vol. 25, N 6. - P. 1099- 1111.

58. Chakrabarti A.K., Chaudhuri K., Sen K., Das J. Porins of Vibrio cholerae: purification and characterization of OmpU // J. Bacteriol. 1996. - Vol. 178. - P. 524 - 530.

59. Chakraborty S., Mukhopadhyay A.K., Bhadra R.K. et al. Virulence genes in environmental strains of Vibrio cholerae II Appl. Environ. Microbiol. 2000. Vol. 66.-P. 4022-4028.

60. Chaudhuri K., Chatterjee S.N. Cholera Toxins. Berlin: Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2009. - 322 c.

61. Chiang S.L., Taylor R.K., Koomey M., Mekalanos J.J. Single amino acid substitutions in the N-terminus of Vibrio cholerae TcpA affect colonization, autoagglutination, and serum resistance // Mol. Microbiol. 1995. - Vol. 17, N 6. -P.1133 - 1142.

62. Chiavelli D.A., Marsh J.W., Taylor R.K. The mannose-sensitive hemagglutinin of Vibrio cholerae promotes adherence to zooplankton // Appl. Environ. Microbiol. -2001. Vol. 67, N 7. - P. 3220 - 3225.

63. Clark C.A., Purins L., Keawrakon et al. The Vibrio cholerae 01 chromosomal integron//Microbiology. -2000. Vol.146. - P. 2605 - 2612.

64. Codeco C.T. Endemic and epidemics dynamics of cholera: the role of the aquatic reservoir // BMC Infec. Dis. 2001. - Vol. 1. - P. 1471 - 2334.

65. Coelho A., de Oliveira Santos E., Faria M.L. et al. A proteome reference map for Vibrio cholerae El Tor // Proteomics. 2004. - Vol. 4, N 5. - P. 1491 - 1504.

66. Crawford J.A., Kaper J.B., DiRita V.J. Analysis of ToxR-dependent transcription activation of ompU, the gene encoding a major envelope protein in Vibrio cholerae /I Mol. Microbiol. 1998. - Vol. 29. - P. 235 - 246.

67. Crawford J.A., Krukonis E.S., DiRita V.J. Membrane localization of the ToxR winged-helix domain is required for TcpP-mediated virulence gene activation in Vibrio cholerae II Mol. Microbiol. 2003. - Vol. 47, N 5. - P. 1459 - 1473.

68. Davis B.M., Kimsey H.H., Kane A.V. et al. A satellite phage-encoded antirepressor induces repressor aggregation and cholera toxin gene transfer // EMBO. 2002. -Vol. 21.-P. 4240-4249.

69. Davis B.M., Lawson E.H., Sandkvist M. et al. Convergence of the secretory pathways for cholera toxin and the filamentous phage, СТХф // Science. 2000a. -Vol. 288.-P. 333 - 335.

70. Davis B.M., Moyer K.E., Boyd E.F., Waldor M.K. CTX prophages in classical biotype Vibrio cholerae: functional phage genes but dysfunctional phage genomes // J. Bacteriol. 2000b. - Vol. 182, N 24. - P. 6992 - 6998.

71. Davis B.M., Waldor M.K. Filamentous phages linked to virulence of Vibrio cholerae // Curr. Opinion in Microbiol. 2003. - Vol. 6, N 1. - P. 35-42.

72. DiRita V.J., Mekalanos J.J. Periplasmic interaction between two membrane regulatory proteins, ToxR and ToxS, results in signal transduction andtranscriptional activation // Cell. 1991. - Vol. 64. - P. 29-37.

73. Dominguez P., Velasco G., Barros F., Lazo P.S. Intestinal brush border membranes contain regulatory subunits of adenylyl cyclase // PNAS. 1987. - Vol. 84, N 20. -P. 6965 - 6969.

74. Dziejman M., Mekalanos J.J. Analyses of membrane protein interaction: ToxR can dimerize the amino terminus of phage lambda repressor. // Mol. Microbiol. 1994. -Vol. 13.-P. 485 -494.

75. Dziejman M., Balon E., Boyd D. et al. Comparative genomic analysis of Vibrio cholerae: genes that correlate with cholera endemic and pandemic disease // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - Vol. 99, N 3. - P. 1556 - 1561.

76. Dutta N.K., Habbu M.K. Experimental cholera in infant rabbits: a method for chemotherapeutic investigation // Brit. J. Pharmacol. 1955. - Vol. 256, N 23. - P. 12252 - 12256.

77. Faruque S.M., Albert M.J. and Mekalanos J.J. Epidemiology, genetics an ecology of toxigenic Vibrio cholerae // Microbiol. Mol. Rev. 1998. - Vol. 62. - P. 1301 -1314.

78. Faruque S.M., Asadulghani, Kamruzzaman M. et al. RSI Element of Vibrio cholerae Can Propagate Horizontally as a Filamentous Phage Exploiting the Morphogenesis Genes of СТХф // Infection and Immunity. 2002. - Vol. 70, N 1. -P.163 - 170.

79. Faruque S.M., Biswas K., Udden S.M.N, et al. Transmissibility of cholera: In vivo-formed biofilms and their relationship to infectivity and persistence in the environment//PNAS.-2006.-Vol. 103,N. 16.-P. 6350-6355.

80. Faruque S.M., Kamruzzaman M., Asadulghani et al. СТХф-independent production of the RSI satellite phage by Vibrio cholerae И PNAS. 2003. - Vol. 100, N 3. - P. 1280- 1285.

81. Faruque S.M., Kamruzzaman M., Meraj I.M. et al. Pathogenic Potential of Environmental Vibrio cholerae Strains Carrying Genetic Variants of the Toxin-coregulated Pilus Pathogenicity Island // Infection and Immunity. 2003. - Vol. 71, No 2.-P. 1020- 1025.

82. Faruque S.M., Tam V.C., Chowdhury N. et al. Genomic analysis of the Mozambique strain of Vibrio cholerae Ol reveals the origin of El Tor strainscarrying classical CTX prophage // PNAS. 2007. - Vol. 104. - P. 5151 -5156.

83. Fasano A., Baudry В., Pumplin D.W. et al. Vibrio cholerae produces a second enterotoxin, which affects intestinal tight junctions // PNAS. 1991. - Vol. 15, N 88(12).-P. 5242-5246.

84. Fasano A. Regulation of intercellular tight junctions by zonula occludens toxin andits eukaryotic analogue zonulin // Ann N Y Acad Sci. 2000. - Vol. 915. - P. 214 -222.

85. Fujinaga Y., Wolf A. A., Rodighiero C. et al. Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulum // Mol. Biol. Cell. 2003. - N. 14. - P. 4783 - 4793.

86. Galen J.E., Ketley J.M., Fasano A. et al. Role of Vibrio cholerae neuraminidase in the function of cholera toxin // Infect. Immun. 1992. - Vol. 60. - P. 406 - 415.

87. Gill D.M., Meren R. ADP-ribosylation of membrane proteins catalyzed by cholera toxin: basis of the activation of adenylate cyclase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1978. Vol. 75. - P. 3050 - 3054.

88. Heidelberg J.F., Eisen J.A., Nelson W.C. et al. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae И Nature. 2000. - Vol. 406. -P. 477-483.

89. Heilpern A.J., Waldor M.K. pIIICTX, a predicted СТХФ minor coat protein, can expand the host range of coliphage fd to include Vibrio cholerae II J. Bacteriol. -2003. Vol. 185, N 3. - P. 1037 - 1044.

90. Hitchcock P.J., Brown T.M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels // J. Bacteriol. 1983.-Vol. 154, N1.-P. 269-277.

91. Holmgren J. Actions of cholera toxin and the prevention and treatment of cholera // Nature. 1981. - Vol. 292, N. 5822. - P. 413 - 417.

92. Hung D.T., Mekalanos, J J. Bile acids induce cholera toxin expression in Vibrio cholerae in a ToxT-independent manner // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. Vol. 102.-P. 3028 -3033.

93. Huber K.E., Waldor M.K. Filamentous phage integration requires the host recombinases XerC and XerD // Nature. 2002. - Vol. 417. - P. 656 - 659.

94. Iwanaga M., Yamamoto K. New medium for the production of cholera toxin by Vibrio cholerae 01 biotype El Tor // J Clin Microbiol. 1985. - Vol. 22, N 3. - P. 405 - 408.

95. Jobling M.G., Holmes,R.K. Mutational analysis of ganglioside GMl-binding ability, pentamer formation, and epitopes of cholera toxin В (CTB) subunits and CTB/heatlabile enterotoxin В subunit chimeras // Infect. Immun. 2002. - Vol. 70. -1260- 1271.

96. Jermyn W.S., Boyd E.F. Characterization of novel Vibrio pathogenicity island (VPI-2) encoding neuraminidase (nanH) among toxigenic Vibrio cholerae isolates // Microbiology. 2002. - Vol. 148. - P. 3681 - 3693.

97. Jobling M.G., Holmes R.K. Characterization of hapR, a positive regulator of Vibrio cholerae HA/protease gene hap, and its identification as a functional homologue ofthe Vibrio harveyi luxR gene // Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 26. - P. 1023 - 1034.

98. Jiang S., Chu W., Fu W. Prevalence of Cholera Toxin Genes (c/xA and zot) among Non-01/0139 Vibrio cholerae Strains from Newport Bay, California//Applied and Environmental Microbiology. 2003. - Vol. 69, N 12 - P. 7541- 7544.

99. Kado C.I., Liu S.T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids // J Bacteriol. 1981. - Vol. 145, N 3. -P. 1365 - 1373.

100. Karaolis D.K.R., Johnson J.A., Bailey C.C. et al. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemik strains // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95, N 6. - P. 3134 - 3139.

101. Karaolis D.K., Somara S., Maneval D.R.J. et al. A bacteriophage encoding a pathogenicity island, a type-IV pilus and a phage receptor in cholera bacteria // Nature. 1999. - Vol. 399. - P. 375 - 379.

102. Karaolis D.K., Kaper J.B. Vibrio cholerae TCP: a trifunctional virulence factor?: Response // Trends in Microbiology. 1999. - Vol. 7. - P. 393.

103. Kaper J.B., Morris J.G., Levin M.M. Cholera // Clin. Microbiol. Rev. 1995. -Vol. 8,N 1.-P. 48 - 89.

104. Kimsey H.H., Waldor M.K. The CTXphi repressor RstR binds DNA cooperatively to form tetrameric repressor-operator complexes // J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 23, N279(4).-P. 2640-2647.

105. Koonin E.V. The second cholera toxin, Zot, and its plasmid-encoded and phage-encoded homologues constitute a group of putative ATPases with an altered purine NTP-binding motif// FEBS Lett. 1992. - Vol. 312, N 1. - P. 3 - 6.

106. Kovach M.E., Shaffer M.D., Peterson K.M. A putative integrase gene defines thedistal end of a large cluster of ToxR-regulated colonization genes in Vibrio cholerae //Microbiology. 1996. - Vol. 142. - P. 2165 - 2174.

107. Krukonis E.S., Yu R.R., DiRita J.J. The Vibrio cholerae ToxR/TcpP/ToxT virulence cascade: distinct roles for two membrane-localized transcriptional activators on a single promoter // Mol. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - P. 67 - 84.

108. Labbate M., Boucher Y., Joss M.J. et al. Use of chromosomal integron arrays as a phylogenetic typing system for Vibrio cholerae pandemic strains // Microbiology. -2007. Vol. 153, N 5. - P. 1488 - 1498.

109. Lee J.H., Han K.H., Choi S.Y. et al. Multilocus sequence typing (MLST) analysis of Vibrio cholerae 01 El Tor isolates from Mozambique that harbour the classical CTX prophage // J Med Microbiol. 2006. - Vol. 55. - P. 165 - 170.

110. Maiti D., Das В., Saha A. et al. Genetic organization of pre-CTX and CTX prophages in the genome of an environmental Vibrio cholerae non-Ol, non-0139 strain //Microbiology. -2006. Vol. 152, N 12.-P. 3633 - 3641.

111. Majoul I.V., Bastiaens P.I. and Soling, H.D. Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum, studies with cholera toxin in Vero cells // J. Cell Biol. 1996. - Vol. 133. P. 777 -789.

112. Martinez-Hackert E., Stock A.M. Structural relationships in the OmpR family of winged-helix transcription factors // J Mol Biol. 1997. - Vol. 269, N 3. - P. 301 -312.

113. Matson J.S. et al. Regulatory networks controlling Vibrio cholerae virulence gene expression // Infect Immun. 2007. - Vol. 75, N 12. - P. 5542 - 5549.

114. McLeod S.M., Waldor M.K. Characterization of XerC- and XerD-dependent CTX phage integration in Vibrio cholerae // Mol. Microbiol. 2004. - Vol. 54, N 4. - P. 935 -947.

115. McLeod S.M., Kimsey H.H., Davis B.M., Waldor M.K. СТХФ and Vibrio cholerae: exploring a newly recognized type of phage-host cell relationship // Mol. Microbiol. 2005. - Vol. 57, N 2. - P. 347 - 356.

116. Meibom K.L., Blokesch M., Dolganov N.A. et al. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae II Science. 2005. - Vol. 310 (5755). - P. 1824 -1827.

117. Merritt E.A., Sarfaty S., Van Den Akker F. et al. Crystal structure of cholera toxin B-pentamer bound to receptor GM1 pentasaccharide // Protein Sci. 1994. - N 3. -P. 166- 175.

118. Moyer K.E., Kimsey H.H., Waldor M.K. Evidence for a rolling-circle mechanism of phage DNA synthesis from both replicative and integrated forms of СТХФ // Mol. Microbiol.-2001.-Vol. 41.-P. 311 -323.

119. Mukhopadhyay A.K., Saha P.K., Garg S. et al. Distribution and virulence of Vibrio cholerae belonging to serogroups other than 01 and 0139: a nationwide survey // Epidemiol Infect. 1995. - Vol. 114, N 1. -P. 65 - 70.

120. Murley Y.M., Carroll P.A., Skorupski K. et al. Differential Transcription of the tcpPH Operon Confers Biotype-Specific Control of the Vibrio cholerae ToxR Virulence Regulon // Infection and Immunity. 1999. - Vol. 67, N 10. - P. 5117 -5123.

121. Murphy R., Boyd F. Three pathogenicity island of Vibrio cholerae can excise fromthe chromosome and form circular intermediates // J. Bacteriol. 2008. - Vol. 190, N2.-P. 636-647.

122. Nair G.B., Qadri F., Holmgren J. et al. Cholera due to altered El Tor strains of Vibrio cholerae 01 in Bangladesh // J Clin Microbiol. 2006. - Vol. 44. - P. 4211 -4213.

123. Nesper J., Lauriano C.M., Klose K.E. et al. Characterization of Vibrio cholerae Ol El Tor galU and galE mutants: influence on lipopolysaccharide structure, colonization, and biofilm formation // Infect. Immun. 2001. - Vol. 69, N 1. - P. 435 - 445.

124. Nguyen B.M., Lee J.H., Cuong N.T. et al. Cholera outbreaks caused by an altered Vibrio cholerae Ol El Tor biotype strain producing classical cholera toxin В in Vietnam in 2007 to 2008 // Clin Microbiol. 2009. - Vol. 47, N 5. - P. 1568 - 1571.

125. O'Farrell P.H. High Resolution two-dimensional electrophoresis of proteins // J. Biol. Chem. -1975. Vol. 250. - P. 4007 - 4021.

126. O'Neal C.J., Jobling M.G., Holmes R.K. et al. Structural basis for the activation of cholera toxin by human ARF6-GTP // Science. 2005. - Vol. 309, N 5737. - P. 1093 - 1096.

127. O'Shea Y.A., Boyd E.F. Mobilization of the Vibrio pathogenicity island between Vibrio cholerae isolates mediated via CP-T1 generalized transduction // FEMS

128. Microbiol. Lett. -2002. Vol. 214. - P. 153 - 157.

129. Olsvik, Wahlberg J, Petterson В et al. Use of automated sequencing of polymerase chain reaction-generated amplicons to identify three types of cholera toxin subunit В in Vibrio cholerae 01 strains // J Clin Microbiol. 1993. - Vol. 31. - P. 22 - 35.

130. Pfau J.D., Taylor R.K. Mutations in toxR and toxS that separate transcriptional activation from DNA binding at the cholera toxin gene promoter // J. Bacteriol. -1998. Vol. 180, N 17. - P. 4724 - 4733.

131. Pearson G.D., Woods A., Chiang S.L., Mekalanos J J. CTX genetic element encodes a site-specific recombination system and an intestinal colonization factor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol. 90. - P. 3750 - 3754.

132. Rader A.E., Murphy J.R. Nucleotide sequences and comparison of the hemolysin determinants of Vibrio cholerae El Tor RV79 (Hly+) and RV79(#/y-) and classical 569B(Hly-) И Infect Immun. 1988. - Vol. 56, N 6. - P. 1414 - 1419.

133. Prouty M.G., Osorio C.R., Klose K.E. Characterization of functional domains of the Vibrio cholerae virulence regulator ToxT // Mol. Microbiol. 2005. - Vol. 58, N 4. -P. 1143- 1156.

134. QingHua Z., XiaoMei Y., BoQing L. et al. Proteome analysis of sorbitol fermentation specific pritein in Vibrio cholerae by 2-DE and MS // Proteomics. -2006.-Vol. 6.-P. 1848- 1855.

135. Qu M., Xu J., Ding Y. et al. Molecular epidemiology of Vibrio cholerae 0139 in China: polymorphism of ribotypes and CTX elements // J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol. 41, N 6. - P. 2306 - 2310.

136. Radloff R., Bauer W., Vinograd J. A dye-buoyant-density method for the detectionand isolation of closed circular duplex DNA: the closed circular DNA in HeLa cells //Proc Natl Acad Sci. 1967.-Vol. 57, N 5. P. 1514-1521.

137. Rajanna C., Wang J., Zhang D. et al. The Vibrio pathogenicity island of epidemic Vibrio cholerae forms precise extrachromosomal circular excision products // J. Bacterid.-2003.-Vol. 185, N23.-P. 6893-6901.

138. Ramamurthy Т., Garg S., Sharma R. et al. Emergence of novel strain of Vibrio cholerae with epidemic potential in southern and eastern India // Lancet. 1993. -Vol. 341, N 8846. - P. 703 - 704.

139. Rappaport R.S., Rubin B.A., Tint H. Development of a purified cholera toxoid. I. Purification of toxin // Infect Immun. 1974. - Vol. 9, N 2. - P. 294-303.

140. Raufinan J.P. Cholera // American Journal of Medicine. 1997. - Vol. 104. - P. 386 -394.

141. Raychoudhuri A., Mukhopadhyay A.K., Ramamurthy T. et al Biotyping of Vibrio cholerae 01: time to redefine the scheme // Indian J Med Res. 2008. Vol. 128, N 6.-P. 695 -698.

142. Raychoudhuri A., Patra Т., Ghosh K. et al. Classical ctxB in Vibrio cholerae 01, Kolkata, India // Emerg Infect Dis. 2009. - Vol. 15.-P. 131 - 132.

143. Rhine J.A., Taylor R.K. TcpA pilin sequences and colonization requirements for 01 and 0139 Vibrio cholerae //Mol. Microbiol. 1994. - Vol. 13. - P. 1013- 1020.

144. Rowe-Magnus D.A., Mazel D. Integrons: natural tools for bacterial genome evolution // Curr Opin Microbiol. 2001. - Vol. 4, N 5. - P. 565 - 569.

145. Rowe-Magnus D.A., Guerout A.M., Mazel D. Bacterial resistance evolution by recruitment of super-integron gene cassettes // Mol Microbiol. 2002. - Vol. 43, N 6.-P.1657- 1669.

146. Rubin E.J., Lin W., Mekalanos J.J., Waldor M.K. Replication and integration of a Vibrio cholerae cryptic plasmid linked to the CTX prophage I I Mol. Microbiol. -1998. Vol. 28. - P. 1247 - 1254.

147. Sack D., Sack R„ Nair G., Siddique A. Cholera // The Lancet. 2004. - Vol. 363, N 9404.-P. 223 -233.

148. Safa A., Bhuyian N.A., Nusrin S. et al. Genetic characteristics of Matlab variants of Vibrio cholerae 01 that are hybrids between classical and El Tor biotypes // J. Med. Microbiol. 2006. - Vol. 55. - P. 1563 - 1569.

149. Safa A., Sultana J., Cam P.D. et al. Classical cholera toxin producing Vibrio cholerae 01 hybrid El Tor strains in Asia and Africa // Emerg Infect Dis. 2008. -Vol. 14.-P. 987- 988.

150. Sanchez J., Holmgrenb J. Cholera toxin structure, gene regulation and pathophysiological and immunological aspects // Cell Mol Life Sci. 2008. - Vol. 65, N9.-P. 1347- 1360.

151. Sanchez J., Medina G., Buhse T. et al. Expression of cholera toxin under non-AKI conditions in Vibrio cholerae El Tor induced by increasing the exposed surface of cultures//J. Bacteriol. 2004. - Vol. 186. -P. 1355 - 1361.

152. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc Natl Acad Sci USA.- 1977. Vol. 74, N 12. - P. 5463 - 5467.

153. Sasmal D., Guhathakurta В., Ghosh A.N. et al. Purification of a mannose/glucose-specific hemagglutinin/lectin from a Vibrio cholerae 01 strain // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1999. - Vol. 23. - P. 221 - 227.

154. Silva A.J., Leitch G.J., Camilli A., Benitez J.A. Contribution of Hemagglutinin/Protease and Motility the Pathogenesis of El Tor Biotype Cholera // Infection and Immunity. 2006. - Vol. 74, N 4. - P. 2072-2079.

155. Sharma C., Maiti S., Mukhopadhyay A.K. et al. Unique organization of the CTX genetic element in Vibrio cholerae 0139 strains which reemerged in Calcutta, India, in September 1996 // J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35. - P. 3348 - 3350.

156. Silva A.J., Pham K., Benitez J.A. Hemagglutinin/protease expression and mucin gel penetration in El Tor biotype Vibrio cholerae И Microbiology. 2003. - Vol. 149. -P. 1883- 1891.

157. Simon R. High frequency mobilization of gram-negative bacterial replicons by the in vitro constructed Tn5-Mob transposon // Mol Gen Genet. 1984. - Vol. 196, N3.-P. 413-420.

158. Snyder L., Champness W. Molecular genetics of bacteria. 3d ed. - ASM Press,2007.-735 p.

159. Sperandio V., Bailey C., Giron J.A. et al. Cloning and characterization of the gene encoding the OmpU outer membrane protein of Vibrio cholerae II Infect. Immun. -1996. Vol. 64, N 12. - P. 5406 - 5409.

160. Stonehouse E., Kovacikova G., Taylor R.K., Skorupski K. Integration host factor positively regulates virulence gene expression in Vibrio cholerae И J. Bacteriol.2008.-Vol. 190, N 13.-P. 4736-4748.

161. Stroeher U.H., Jedani K.E., Manning P.A. Genetic organization of the regions associated with surface polysaccharide synthesis in Vibrio cholerae Ol, 0139 and Vibrio anguillarum Ol and 02: a review // Gene. 1998. - Vol. 223. - P. 269 -282.

162. Sun D., Lafferty M.J., Peek J.A., Taylor R.K. Domains within the Vibrio cholerae toxin coregulated pilin subunit that mediate bacterial colonization // Gene. 1997. -Vol. 192.-P. 79- 85.

163. Svennerholm A.-M., Wiklund G. Rapid GMi-enzyme-linked immunosorbent assay with visual reading for identification of Escherichia coli heat-labile enterotoxin // J. Clin. Microbiol. 1983. - Vol. 17. - P. 262 - 270.

164. Taneja N., Mishra A., Sangar G. et al. Outbreaks Caused by New Variants of Vibrio cholerae 01 El Tor, India // Emerging Infectious Diseases. 2009. - Vol. 15, N 2. -P. 352-354.

165. Thelin K.H., Taylor R.K. Toxin-coregulated pilus, but not mannose-sensitive hemagglutinin, is required for colonization by Vibrio cholerae 01 El Tor biotype and 0139 strains // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64, N 7. - P. 2853 - 2856.

166. Trucksis M., Conn T.L., Wasserman S.S., Sears C.L. Vibrio cholerae ACE stimulates Ca(2+)-dependent Cl(-)/HCO(3)(-) secretion in T84 cells in vitro // Am J Physiol Cell Physiol. 2000. - Vol. 279, N 3. - P. 567 - 577.

167. Trucksis M., Galen J.E., Mishalski J. et al. Accessory cholera enterotoxin (Ace), the third toxin of a Vibrio cholerae virulence cassette // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1993. Vol. 90. - P. 5267 - 5271.

168. Trucksis M., Michalski J., Deng Y.K., Kaper J.B. The Vibrio cholerae genome contains two unique circular chromosomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. -Vol. 95.-P. 14464-14469.

169. Val M.E., Bouvier M., Campos J. et al. The single-stranded genome of phage CTX is the form used for integration into the genome Vibrio cholerae II Mol. Cell. -2005. Vol. 19, N 4. - P. 433 - 435.

170. Vance R.E., Zhu J., Mekalanos J.J. A constitutively active variant of the quorumsensing regulator LuxO affects protease production and biofilm formation in Vibrio cholerae // Infect. Immun. 2003. - Vol. 71, N 5. - P. 2571 - 2576.

171. Voss E., Manning P.A., Attridge S.R. The toxin-coregulated pilus is a colonization factor and protective antigen of Vibrio cholerae El Tor I I Microb. Pathog. 1996. -Vol. 20.-P. 141-53.

172. Waldor M.K., Colwell R., Mekalanos J.J. The Vibrio cholerae 0139 serogroup antigen includes an О antigen capsule and lipopolysaccharide virulence determinants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 91. - P. 11388 - 11392.

173. Waldor M.K., Mekalanos J.J. ToxR regulates virulence gene expression in non-01 strains of Vibrio cholerae that cause epidemic cholera // Infect. Immun. 1994. -Vol. 62, N 1.-P. 2853 -2856.

174. Waldor M.K., Mekalanos J.J. Lysogenic conversion by a filamentous bacteriophage encoding cholera toxin // Science. 1996. - Vol. 272. - P. 1910 - 1914.

175. Waldor M.K., Rubin E.J., Gregory D.N. et al. Regulation, replication, and integration functions of the Vibrio cholerae CTX(p are encoded by regions RS2 // Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 24. - P. 917 - 926.

176. Waldor M.K., Lazar S., Kimsey H. et al. СТХф: a novel filamentous phage encoding cholera toxin / Bacterial Protein, Toxins. Eds. Hacker et al. Jena, 1998. -P. 363-371.

177. Waldor M.K., Tschape H., Mekalanos J.J. A new type of conjugative transposon encodes resistance to sulfamethoxazole, trimethoprim, and streptomycin in Vibrio cholerae 0139 // J. Bacteriol. 1996. - Vol. 178, N 14. - P. 4157 - 4165.

178. Watnick P.I., Fullner K.J., Ко Iter R. A role for the mannose-sensitive hemagglutininin biofilm formation by Vibrio cholerae El Tor // J. Bacteriol. 1999. - Vol. 181. -P. 3606-3609

179. Watnick P.I., Kolter R. Steps in the development of a Vibrio cholerae El Tor biofilm // Mol. Microbiol. 1999. - Vol. 34, N 3. - P.586-595.

180. Watnick P.I., Lauriano C.M., Klose K.E. et al. The absence of a flagellum leads to altered colony morphology, biofilm development and virulence in Vibrio cholerae 0139 // Mol. Microbiol. 2001. - Vol. 39. - P. 223 - 235.

181. Williams S.G., Manning P.A. Transcription of the Vibrio cholerae haemolysin gene, hlyA, and cloning of a positive regulatory locus, hlyU II Mol Microbiol. 1991. - N 5.-P. 2031.

182. Withey J.H., DiRita V.J. The toxbox: specific DNA sequence requirements for activation of Vibrio cholerae virulence genes by ToxT // Mol. Microbiol. 2006. -Vol. 59.-P. 1779- 1789.

183. Uma G, Chandramohanakumar N. Vibrio cholerae CTXPhi phage repressor gene is borne on an insertion sequence-like element and encodes a putative transposase // Appl. Bioinformatics. 2006. - Vol. 5, N 1. - P. 21 - 28.

184. Yu R.R., DiRita V.J. Analysis autoregulatory loop controlling ToxT, cholera toxin, and toxin-coregulated pilus production in Vibrio cholerae II J. Bacteriol. 1999. -Vol. 181, N8.-P. 2584-2592.

185. Yu R.R., DiRita V.J. Regulation of gene expression in Vibrio cholerae by ToxT involves both antirepression and RNA polymerase stimulation // Mol. Microbiol. -2002. Vol. 43, N 1. - P. 119 - 134.

186. Udden S.M., Zahid M.S., Biswas K. et al. Acquisition of classical CTX prophage from Vibrio cholerae 0141 by El Tor strains aided by lytic phages and chitin-induced competence // PNAS. 2008. - Vol. 105, N 33. - P. 11951 - 11956.

Информация о работе

Горяев, Артем Анатольевич
кандидата биологических наук
Саратов, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Штаммы Vibrio cholerae биовара эльтор с изменной продукцией холерного токсина: получение и молекулярно-генетический анализ - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Штаммы Vibrio cholerae биовара эльтор с изменной продукцией холерного токсина: получение и молекулярно-генетический анализ - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы