Сравнительный анализ фенотипических и молекулярно-генетических свойств холерных вибрионов эльтор, выделенных до начала и в период седьмой пандемии холеры

Нефедов, Константин Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительный анализ фенотипических и молекулярно-генетических свойств холерных вибрионов эльтор, выделенных до начала и в период седьмой пандемии холеры
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ фенотипических и молекулярно-генетических свойств холерных вибрионов эльтор, выделенных до начала и в период седьмой пандемии холеры"

На правах рукописи

□□34663

НЕФЕДОВ Константин Сергеевич

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ ЭЛЬТОР, ВЫДЕЛЕННЫХ ДО НАЧАЛА И В ПЕРИОД СЕДЬМОЙ ПАНДЕМИИ ХОЛЕРЫ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

О 2 ДПР 2033

Саратов 2009

003466313

Работа выполнена в ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация:

ГУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф.Гамалеи РАМН»

Защита состоится ¿Ь&^^&^С'с^ 2009 г. в ^^^^часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» (410005, г. Саратов, Университетская, 46).

Автореферат разослан «/37» 2009 г.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РосНИПЧИ "Микроб".

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Смирнова Нина Ивановна

Плотников Олег Петрович Замараев Валерий Семенович

/б

Слудский А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Механизм эволюции патогенных бактерий - одна из центральных проблем медицинской микробиологии. Решение этой проблемы позволяет выяснить причины генетического разнообразия возбудителей инфекционных болезней и провести прогнозирование появления новых эпидемически опасных вариантов. Vibrio cholerae, имеющий повышенную эпидемическую значимость, является возбудителем холеры, острого диа-рейного заболевания с массивной дегидратацией, унесшего миллионы человеческих жизней за семь известных пандемий. Распространение холеры во многих странах мира определяет реальную возможность ее завоза на территорию России. Непосредственным напоминанием об этой угрозе являются недавние эпидемические вспышки холеры в Дагестане (1994 г., 1998 г.), Дальнем Востоке и Приморье (1999 г.), Татарстане (2001 г.), а также спорадические случаи заболевания (Челябинск, 2000 г.; Калмыкия, 2002 г.; Башкортостан, 2004 г., 2008 г; Тверская область 2005 г.; Мурманск, 2006 г.). Согласно современным представлениям, в пределах вида V.cholerae образовалось три эпидемически опасных варианта: холерные вибрионы Ol-серогруппы классического биовара, вызвавшие, видимо, первые 6 пандемий азиатской холеры (1817-1923 гг.), холерные вибрионы Ol-серогруппы биовара эльтор - возбудитель текущей, 7-ой, пандемии (с 1961 г. по настоящее время) и внезапно появившийся в 1992 г. высоковирулентный штамм V.cholerae 0139-серогруппы, с которым связывали начало 8-ой пандемии холеры.

Поскольку в современный период продолжается 7-ая пандемия холеры, ее возбудитель остается в центре внимания многих исследователей. Секвениро-вание генома V.cholerae биовара эльтор (Heidelberg et al., 2000) позволило выявить следующие его основные особенности: а) в отличие от многих других патогенов в клетках V.cholerae имеется 2 кольцевые хромосомы, различающиеся по размеру и функции; б) основные гены вирулентности возбудителя входят в состав различных мобильных генетических элементов (двух профагов и пяти геномных островов), локализованных в основном на большой хромосоме.

Мобильность этих элементов и нестабильность их геномов, а также изменение в настоящее время экологии и иммунного статуса человека во многих регионах мира, включая Россию, - все это создает предпосылки для образования штаммов с ранее неизвестными свойствами. Такая ситуация диктует необходимость выяснения основных направлений эволюции возбудителя холеры эльтор в современный период. Однако для получения такой информации необходимы полные сведения об эволюции генома этого возбудителя в недалеком прошлом. В этой связи очевидна актуальность исследований, направленных на решение этой проблемы. Несмотря на большой интерес исследователей к этому вопросу, пока нет единой точки зрения на происхождение возбудителя

холеры эльтор. При анализе 2-х предпандемических и 3-х пандемических штаммов выявлены лишь особенности генетической' организации этих изоля-тов (Вг1е^ап е1 а!., 2002). Полученные ранее сведения о структуре и функции генома предпандемических штаммов явно недостаточны. Практически отсутствуют данные о функции островов пандемичности У8Р-1 и У8Р-2, имеющихся в геноме клинических штаммов, выделенных во время 7-ой пандемии холеры. Информация о геномных вариациях природных штаммов У.с1ю!егае биовара эльтор, циркулирующих на разных территориях в период эпидемического неблагополучия по холере, является также неполной. Получение новых фундаментальных сведений о фенотипических и генетических особенностях штаммов, выделенных до и во время 7-ой пандемии холеры эльтор, позволит получить более полную картину об эволюции этого возбудителя и выяснить механизмы, лежащие в основе адаптации этого патогена к меняющимся условиям внешней среды. Эти сведения будут служить основой для решения такой важной прикладной задачи, как паспортизация штаммов Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб", а также для разработки новых средств диагностики и дифференциации штаммов с разным эпидемическим потенциалом.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - выявление фенотипических и генетических особенностей предпандемических и пандемических штаммов У.ско1егае биовара эльтор.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1.Провести сравнительный анализ различных фенотипических свойств пред-пандеми-ческих и пандемических штаммов холерных вибрионов биовара эльтор.

2.Изучить распространенность профагов и геномных островов, связанных с вирулентностью и персистентностью, среди предпандемических штаммов V. ско1егаг биовара эльтор.

3.Исследовать экспрессию генов вирулентности и персистенции, локализованных в геноме предпандемических штаммов.

4.Изучить распространенность островов пандемичности У8Р-1 и У8Р-2 среди различных пандемических изолятов; определить роль последних в жизнеспособности этих штаммов.

5.Провести молекулярное типирование штаммов У.ско1егае биовара эльтор, выделенных до и в период 7-ой пандемии холеры, для определения их филогенетических связей.

6.Изучить генетическое разнообразие природных штаммов У.ско1егае биовара эльтор, выделенных на разных территориях во время эпидосложнений по холере.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА:

Показано, что предпандемические штаммы V.cholerae биовара эльтор, независимо от времени их выделения (1910 г. и 1937 г.) и вирулентности, не отличались от штаммов, изолированных во время 7-ой пандемии, по серологическим, биохимическим свойствам и резистентности к диагностическим холерным бактериофагам. Вместе с тем впервые выявлено, что предпандемические штаммы, в отличие от пандемических, не имели устойчивости к изученным антибиотикам.

При сравнительном анализе геномов предпандемических и пандемических штаммов обнаружено, что регуляторные гены toxR, luxX, ItixS, hns и pepA, входящие в состав различных систем регуляции, являются наиболее древними. Впервые определено присутствие в геноме всех изученных предпандемических штаммов острова персистенции в окружающей среде EPI, что указывает на его древнее происхождение. Установлено наличие в геноме вирулентных предпандемических штаммов двух копий профага СТХф и дефектного острова патогенности VPI-2, лишенного одного (гер!803) или двух (папН, гер1803) тестируемых генов. Показано широкое распространение двух островов пандемичности VSP-1 и VSP-2 среди штаммов V. cholerae биовара эльтор, выделенных во время 7-ой пандемии холеры, что подтверждает их важную роль в формировании пандемического потенциала у этого возбудителя. Новыми являются данные о генетическом разнообразии природных клинических штаммов, связанном с нестабильностью геномов VP1-2, а также VSP-1 и VSP-2. Впервые обнаружено, что риботипирование и RAPD-ПЦР-типирование позволяют дифференцировать предпандемические и пандемические штаммы V.cholerae биовара эльтор.

Приоритетное значение имеют результаты, полученные при анализе функций геномов мобильных элементов. Выявлен высокий уровень экспрессии генов msh, локализованных в составе EPI, что свидетельствует об участии этого геномного острова в образовании биопленки предпандемическими штаммами. Впервые экспериментально доказана более высокая жизнеспособность пандемических штаммов в водной среде по сравнению с предпандемическими изолятами, что с высокой вероятностью связано с присутствием в геноме первых островов пандемичности VSP-1 и VSP-2.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ:

Создан комплекс мультиплексных ПЦР, предназначенных для выявления в геноме штаммов V.cholerae основных генов вирулентности и персистенции. На основе разработанных тест-систем оформлены методические рекомендации "Мультиплексный ПЦР-анализ для изучения генетического разнообразия и выявления атипичных штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор", которые одобрены Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 10 от 18 декабря 2007 г.) и утверждены директором института 18 декабря 2007 г.

Создана коллекция, состоящая из 18 авторских штаммов V.cholerae

биовара эльтор, которая включает штаммы с различным набором генов вирулентности и пандемичности. Эти штаммы могут быть использованы для выяснения и уточнения роли мобильных элементов в проявлении вирулентных свойств штаммов и их адаптации к меняющимся условиям окружающей среды. Штаммы коллекции депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб".

Полученная информация о наличии или отсутствии в геноме 124 природных штаммов 20-25 различных генов будет использована для геномной паспортизации штаммов из Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб".

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1.Штаммы V.cholerae биовара эльтор, выделенные до начала и в разные периоды седьмой пандемии холеры, не различаются по продукции 01-антигена, термолабильного гемолизина, растворимой гемагглютинин/протеазы, белков внешней мембраны OmpU и OmpT, а также чувствительности к холерным диагностическим эльтор и классическим бактериофагам. Вместе с тем предпан-демические штаммы имеют выраженные отличия от пандемических относительно их резистентности к изученным антибиотикам.

2.В геноме авирулентных и вирулентных предпандемических штаммов присутствуют общие структурные (hapA, rtxA, attRS) и регуляторные (toxR, luxO, luxS, hns, pepA) гены, a также остров персистенции в окружающей среде EPI. Предпандемические штаммы способны образовывать биопленку, что связано с эффективной экспрессией генов, контролирующих подвижность (mot), биосинтез экзополисахарида (eps) и маннозочувствительных пилей адгезии (msh), последние из которых входят в состав EPI.

3.Геном вирулентных предпандемических штаммов содержит две копии профага С'ГХф, а также два острова патогенности VPI-1 и VPI-2, из которых последний является дефектным. Ключевые гены вирулентности ctxAB и tcpA-F, входящие в состав СТХ<р и VPI-1, эффективно экспрессируются у предпандемических штаммов, что обеспечивает развитие экспериментальной холерной инфекции у модельных инфицированных животных.

4.Вирулентные штаммы, выделенные во время 7-ой пандемии холеры, имеют характерные генетические особенности, связанные с присутствием в их геноме дополнительных мобильных элементов - профага RSlcp и двух островов пандемичности VSP-1 и VSP-2. Уровень выживаемости в водной среде вирулентных пандемических штаммов, содержащих в геноме VSP-1 и VSP-2, значительно выше по сравнению с таковым у вирулентных штаммов, изолированных до начала текущей пандемии и не имеющих этих геномных островов.

5.Пандемические штаммы V.cholerae биовара эльтор, выделенные из разных источников (больные, носители, внешняя среда) на различных территориях в эпидемически опасные периоды, являются генетически неоднородными вследствие утраты геномов мобильных элементов (СТХср, RSl<p, VSP-1 и VSP-

2) или их отдельных генов (СТХф и УР1-2), а также и результате полиморфизма гена (срЛ, входящего в состав УР1-1. Вариабельность генома профага СТХср лежит в основе изменения вирулентных свойств различных штаммов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ:

Материалы диссертации доложены и представлены на научно-практических конференциях РосНИПЧИ "Микроб" "Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте "Микроб" (Саратов, 2004, 2005, 2007 гг.), а также на Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных и специалистов '"Окружающая среда и здоровье" (Суздаль, 2005 г.) и Всероссийской конференции "Фундаментальная паука и клиническая медицина" (Санкт-Петербург, 2007 г.).

ПУБЛИКАЦИИ:

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из Них 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ:

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 219 цитируемые работы, из них 54 отечественных и 165 зарубежных. Общий объем диссертации составляет 153 страниц. Текст иллюстрирован 14 таблицами и 15 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы. В обзоре представлен анализ публикаций о различных мобильных генетических элементах У.с1ю1егае, связанных с вирулентностью, нандемичностыо и устойчивостью к лекарственным препаратам - бактериофагах, геномных островах, а также интегронах. Рассмотрены известные данные об эволюции генома этого V. сИокгас биовара эльтор.

Материалы и методы. В работе использовали 140 штаммов УсЬо/егие эльтор и классического биоваров, включая нзоляты, выделенные до начала 7-ой пандемии холеры. Применяли традиционные и современные микробиологические, биохимические, серологические, генетические и молскулярио-биологические методы.

Результаты исследований

1. Сравнительный фснотипичсский анализ штаммов У.с/ю1егае биовара эльтор, выделенных до начала и в разные периоды седьмой пандемии холеры. Не имея полных сведений о биолог ическом разнообразии штаммов У.сИо/егае биовара эльтор, выделенных до начала текущей пандемии холеры, трудно выяснить направление эволюции генома этого патогена в современный период. В этой связи на первом этане работы был проведен сравнительный анализ фенотиничсских свойств пяти преднандемических и 38 пандемических штаммов. Согласно ранее известным свойствам пять взятых пред-пандемических штаммов относятся к двум разным группам. В первую входит штамм У.сЬо1егае АТСС14033, изолированный в 1910 г. на карантинной стан-

ции Эль Тор (Синайский полуостров), который может рассматриваться в качестве представителя эльтор вибрионов, впервые обнаруженных в 1905 г. в фекалиях паломников (Бароян О.В., 1971; Тудор В. и др. 1981; Chastel С., 2007). Вторая группа состоит из четырех клинических штаммов (Celebes30, МАК97, МАК676 и МАК757), выделенных в 1937 г. на острове Сулавеси или Целебес (Индонезия) во время локальной вспышки холеры. Пандемические штаммы были представлены изолятами, выделенными в различные периоды 7-ой пандемии холеры: начальный (1961-1969 гг.), через 10-15 лет после начала пандемии (1970-1975 гг.) и в современный (1993-2005 гг.).

Фенотипический анализ был начат с определения у штаммов основных диагностически значимых свойства - способности к синтезу соматического Ol-антигена (с выяснением серовара) и чувствительность к холерным фагам эльтор и классическому. Оказалось, что независимо от периода выделения все исследованные штаммы продуцировали полноценный Ol-антиген серовара Огава или Инаба. Следует лишь отметить тот факт, что все вирулентные штаммы, выделенные до начала пандемии холеры эльтор, относились к серо-вару Огава. Вместе с тем в 26,3% случаев пандемические штаммы имели серо-вар Инаба. Что касается чувствительности к холерным диагностическим бактериофагам, то, независимо от вирулентности и пандемического потенциала, все изученные штаммы лизировались в ДРТ бактериофагом эльтор, но были резистентны к классическому бактериофагу.

Затем был проведен сравнительный анализ продукции гемолизина пред-пандемическими и пандемическими штаммами, так как вопрос о времени возникновения первых гемолитически неактивных штаммов остается до конца неизученным. В результате установлено, что большинство предмандемических штаммов, включая и авирулентный изолят АТСС14033, действительно продуцируют значительное количество термолабильного гемолизина. Вместе с тем среди них был обнаружен вирулентный штамм МАК757, не способный к биосинтезу этого белка. Что касается изученных клинических штаммов, изолированных в период пандемии, то они представляли собой гетерогенную группу, в которой гемолитически активными были в основном штаммы, выделенные в первые годы пандемии.

Кроме того, у штаммов была определена продукция растворимой гемагглюти-нин/протеазы (РГА/П), поскольку этот фермент наиболее важен для проявления вирулентных свойств холерного вибриона. Оказалось, что все предпанде-мические штаммы независимо от их вирулентности продуцировали эту про-теазу, в целом не отличаясь по уровню ее биосинтеза от штаммов, выделенных в период пандемии. Далее, предпандемические и пандемические штаммы были исследованы относительно продукции ими двух белков внешней мембраны OmpU и OmpT, которые защищают клетку от действия неблагоприятных факторов среды. Сравнение профиля белков внешней мембраны у изучаемых штаммов показало, что четыре (АТСС14033, МАК97, МАК676, МАК757) из

пяти исследуемых предпандемических изолятов имели выраженную продукцию белка Отри (мол. масса 38,0 кДа) и наличие лишь следов белка Отр'Г с молекулярной массой 40,0 кДа, что характерно и для пандемических штаммов (рис.1)

1 2 3 4 5 6 7

1 - АТСС14033, авирулентный штамм, выделенный в 1910 г.; 2,3,4,5 -МАК.97, JV1AK676, МАК757, Celebes30 соответственно - клинические штаммы, выделенные во время локальной вспышки холеры в 1937 г.; 6, 7 - В1654, Malacca 1 соответственно - штаммы с пандемическим потенциалом, выделенные от больных во время 7-ой пандемии холеры.

Рисунок 1. Электрофорез в 11% SDS-ПААГ лизатов клеток штаммов V.cholerae биовара эльтор с различным пандемическим потенциалом.

Особый интерес представляет вопрос о том, на каком этапе эволюции возбудителя холеры начали формироваться штаммы, устойчивые к антибиотикам. В этой связи мы провели сравнительный анализ резистентности к антибиотикам изучаемых штаммов. Полученные данные показывают, что авирулентный и вирулентный штаммы, выделенные до начала текущей пандемии холеры, были чувствительны к изучаемым лекарственным препаратам (табл. 1). Чувствительными к ним оказались также исследуемые штаммы, изолированные в начале пандемии холеры (1961 - 1966 гг.). Однако штаммы, изолированные в более поздние годы пандемии, характеризовались уже множественной лекарственной устойчивостью (табл. 1).

Итак, в результате впервые проведенного сравнительного анализа феноти-пических свойств предпандемических и пандемических штаммов V.cholerae биовара эльтор показано, что сравниваемые штаммы имели следующие идентичные фенотипические свойства: продуцировали 01 антиген, термолабильный гемолизин, РГА/П, а также белки внешней мембраны. Из этого следует, что у исследуемых штаммов гены, определяющие эти свойства, имеют древнее происхождение.

Вместе с тем впервые выявленные различия в устойчивости к изучаемым антибиотикам между преднандемическими и пандемическими штаммами свидетельствуют о том, что появление резистентных штаммов произошло после приобретения V. cholerae биовара эльтор пандемического потенциала.

2. Структурный и функциональный анализ генома предпандемических штаммов холерных вибрионов эльтор. Для проявления вирулентности возбудителю холеры абсолютно необходимы гены ctxAB, ответственные за

Таблица 1. Резистентность к антибиотикам предпандемических и пандемических штаммов У.сЬо1егае биовара эльтор. ______

Штамм Год выделения Кт Ар Тр Ст Тс щ

Предпандемические штаммы

АТСС 14033 1910 в 8 в Б Б 8

МАК97 1937 в в в Б Б Б

МАК676 1937 8 8 Б в Б Б

МАК757 1937 Б в Б Б Б Б

СеЬЬеэЗО 1937 8 Б Б Б Б в

Пандемические штаммы

31 1961 в Б Б Б Б Б

34 Филип. 1961 в Б Б Б Б

М-537 1961 Б Б Б Б Б Б

М-538 1961 в в в Б Б Б

28Афг. 1965 в в Б Б Б Б

М-309 1965 Б в Б Б Б Б

34 Каюм 1966 Б Б в Б Б Б

М 1275 1993 в Б Г Г Б Б

М 1286 1994 в в Г 8 Б Б

М 1292 1994 в Б г Г Б Б

М 1321 1998 в г Г Б Б

М 1326 1998 в г Б Б Б

М 1328 1998 Б в г Г Б Б

М 1347 2001 Б 8 г Б Б Б

М 1380 2001 5 Б г Б Б Б

М 1429 2004 Г Б г Г Г Б

Примечание: г или в - резистентность или чувствительность к антибиотикам; Кш - канамицин, Аш - ампициллин, Тр - триметоприм, Ст - хлорамфеникол, Тс - тетрациклин, ШГ- рифампицин.

продукцию холерного токсина (СТ), а также ¡срА-Р, кодирующие биосинтез токсинкорегулируемых пилей адгезии (ТСР) — основного фактора колонизации. Поскольку указанные гены входят соответственно в состав профага СТХср и острова патогенности УР1-1, то была изучена распространенность этих мобильных элементов среди предпандемических штаммов. Кроме того определяли присутствие в их геноме профага К81(р, а также второго острова патогенности УР1-2, которые несут дополнительные гены вирулентности. Использовали моно- и мультилокусные ПЦР с 19 парами специфических праймеров, а также ДНК-ДНК гибридизацию. В результате установлено, что геном авирулентного штамма АТСС14033 был лишен всех 10 тестируемых генов, входящих в со-

став двух профагов С'ГХф и RSl(p и двух ОГ1 VPI-1 и VPI-2. Отсутствие в геноме штамма АТСС14033 всех известных МГ'Э с ключевыми генами иатоген-ности подтверждает неспособность выделяемых в тог период вибрионов эль-тор вызывать холеру. Вместе с тем наличие в хромосоме altRS-носледовательности свидетельствует о возможности внедрения в '»тот сайт бактериофага СТХср. Кроме тога, было установлено присутствие в геноме структурных генов hapA и rtxA, кодирующих биосинтез гемагглюти-нин/протеачы и токсина RTX (табл. 2).

Следующий этап работы состоял в исследовании генома четырех клинических штаммов, изолированных в 1937 г. на о. Целебес. Оказалось, ч то геномы этих штаммов (Celebes30, МАК97, МАК676, МАК.757) имеют не только сходство с геномом АТСС14033 (наличие нуклеотидпой последовательности aftRS, генов hap А и rtxA), но и значительные отличия. В хромосомах трех штаммов (Celebes30, МАК676 и МАК757) обнаружен профаг С'ГХф п Oil VPI-1. Вместе с тем геном штамма МАК97 был лишен профага СТХф, о чем судили но отсутствию генов с/хА, zot и асе (табл. 2). Наличие или отсутствие профага СТХф в геноме штаммов было подтверждено ДИК-ДНК гибридизацией с молекулярным СТ-зондом. Полученные данные позволили заключить, что в геноме штаммов МАК757, Celebcs30 и МАК676 находятся по две копии профага СТХф (рис. 2, дорожка 1, 2,4). Вместе с тем изучаемые штаммы не имели второго профага RS1 ф, присутствующего в геноме пандемических штаммов (табл. 2).

Появление в геномах изучаемых штаммов генов tcpA и с/хА в составе Oil VP1 и профага СТХф соответственно указывает на формирование клона, способного вызывать развитие холерной инфекции, что согласуется с данными других исследователей. Вместе с тем впервые установлено, что геномы этих штаммов содержали неполноценный ОП VP1-2, лишенный ряда генов (табл. 2). Эти данные свидетельствуют о нестабильной структуре генома Oil VP1-2. Таким образом, иредпандемические штаммы были вирулентны, но их геномам, в отличие от пандемических, были присущи две специфические особенности -наличие дефектного ОП VPI-2 и отсутствие профага RS1 (р. Проявление вирулентности возбудителя контролируют не только структурные, но и различные регуляториые гены, в связи с чем была изучена их распространенность среди предпандемичсских штаммов. Использовали ГИДР- анализ с применением 8 пар специфических праймеров для тестирования в геноме изучаемых штаммов трёх групп регуляторных генов. Первая группа состояла из 4 ключевых генов, участвующих в позитивном многокаскадном процессе регуляции активности генов, входящих в ToxR-регулоп: toxR, loxT, IcpP, 1срИ. Вторая включала основные гены регуляторной системы "quorum sensing" (QS) luxS и /ихО. В третью входили гены рерА и hns, осуществляющие негативную регуляцию экспрессии генов вирулентности clxAB и tcpA. Результаты Г1ЦР-тестирования авирулентного нредпандемического штамма АТСС14033 показа-

Таблица 2. Результаты изучеиия геномов предпандемических штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор с помощью моно и мультилокусной ПЦР со специфическими праймерами

Штаммы

АТСС 14033* *

Тестируемые гены о ГО rsi 4) X¡ <U TJ O * * ^ * VO < S * t-§ S

1910 1937 1937 1937 1937

ctxA - + - + +

Профаг С'ГХф асе - + - + +

zot - + - + +

Профаг RSI9 rstC - - — - -

tcpA - + + + H

VPI-1 aldA - + + + +

тор - + + -i- +

bel 1760 - + + + +

VPI-2 nanti - + - + +

repl803 - — - - -

VSP-1 deoOl 75 - - — - -

tnp0185 - — - - -

VSP-2 pro0490 - - - - „

pro0496 - - — - -

ЕР1 mshA, mshQ + + -I- + +

Гены коровой области хромосомы hapA + + + 4 +

aííRS + + + + +

rtxA + + + +

Примечание: * - авирулентиый штамм (Синайский и/о, 1910 г.); ** - клинические штаммы (о.Целебес, 1937 г.).

ли, что в его геноме из изученных генов, контролирующих экспрессию ТохИ-регулона, имеется лишь глобальный регуляторный ген (охЯ. Гены ЮхТ, (срИ и 1срР отсутствуют. Вместе с тем хромосома АТСС14033 содержит гены 1ихБ и 1ихО, которые у пандемических штаммов контролируют экспрессию как генов вирулентности, гак и генов, участвующих в образовании биоплёнки, а также гены рерА и Ьт. Поскольку геном АТСС 14033 лишён основных структурных генов патогенности (с/хА, 1срА), присутствие регуляторных генов 1охК, рерА,

1 2 3 4 М

1 - МАК757; 2 - Celebes30; 3 - МАК97; 4 - МАК676; М - ДНК фага X, рест-рицированное EcoRI/llindlll (указаны размеры рестриктов) Рисунок 2. Блот-гибридизация но Саузерну хромосомных ДНК предпандеми-ческих штаммов, рестрицированных эндонуклеазой Pstl, с молекулярным зондом CT (амшшфицированный фрагмент гена ctxA из профага СТХф).

hns, luxS и htxO может свидетельствовать о выполнении ими других функции в клетке, связанных, видимо, с обеспечением их жизнеспособности. ПЦР-тестирование клинических штаммов показало, что в отличие от «вирулентного штамма А ТСС 14033, в геномах трёх штаммов (МЛК97, МАК676 и МАК757) были обнаружены регуляторные гены toxT, tcpP и tcpH из ОП VPI-1. В то же время хромосома штамма Celebes30 была лишена гена tcpP, что может указывать на нестабильную структуру ОП VPI-1 у предпандемических вирулентных штаммов. Изоляты В1654, Malaccal, выделенные во время 7-ой пандемии холеры и взятые для сравнения, не отличались от вирулентных предпандемических штаммов по составу изученных регуляторных генов. Отсутствие различий в составе регуляторных генов между вирулентными предианде-мическими и пандемическими штаммами показывает и подтверждает тот факт, что эволюционные преобразования генома авирулентных предпандемических штаммов были связаны не с приобретением новых регуляторных систем. Вполне очевидно, что у "древних" генов-регуляторов появились новые функции, связанные с контролем экспрессии чужеродных генов вирулентности, полученных авируленгным штаммом в процессе эволюции.

Для изучения у предпандемических штаммов уровня экспрессии генов ctxAB, входящих в состав СТХф, была определена продукция ими холерного токсина (в условиях in vitro) с помощью иммуноферментного метода GMj ELISA. Оказалось, что авирулентный штамм А ТСС 14033 действительно не продуцирует токсин, поскольку не имеет генов ctxAB. Что касается вирулентных штаммов, то из 3-х изученных 2 изолята МАК.676 и МАК.757 синтезируют

соответственно 0,18 и 0,13 мкт/мл СТ. Вместе с тем, у клинического штамма Celebes30 продукция токсина не выявлена, что может быть связано с отсутствием в его геноме одного из регуляторных генов - tcpP. Взятые для сравнения пандемические штаммы в целом не отличались по биосинтезу этого белка от токсигеиных предпандемических изолятов, что указывает на одинаковый уровень экспрессии у них генов ctxAB.

Далее, для сопоставления вирулентных свойств взятых штаммов мы провели инутрикишсчнос заражение крольчат-сосунков клетками предпандемических и пандемических изолятов. В результате установлено, что среди четырёх предпандемических штаммов лишь МАК97 оказался авирулентным из-за отсутствия в его геноме профага СТХср. Три предпандемических штамма МАК757, МЛК676 и Celebes30, имеющие ключевые структурные и регуля-ториые гены вирулентности, также как и пандемический штамм эффективно колонизировали топкий кишечник и вызывали через 24-48 ч развитие типичного холерогениого синдрома, который выражался в сильном растяжении нетель тонкого и толстого кишечника за счёт наполнения их прозрачной жидкостью. Эти данные указывают на отсутствие различий между предпандемиче-скими и пандемическими штаммами в проявлении вирулентных свойств.

Поскольку эволюция патогенных бактерий связана не только с приобретением ими вирулентных свойств, но и с повышением их уровня адаптации к окружающей среде, возник вопрос о том, имеется ли в геноме предпандемических штаммов остров псрсистенции EPI. ПЦР-анализ показал, что геном ави-рулептпого штамма АТСС14033 содержит ЕР1. Этот мобильный элемент имелся также в хромосоме всех 4-х вирулентных штаммов, выделенных в 1937 г. Вместе с тем геномы всех изученных штаммов были лишены островов пан-демичности VSP-I и VSP-2 (табл. 2). Выявление ЕР1 в геноме самого древнего из изученных вибрионов свидетельствует в пользу предположения, что этот остров является одним из «старейших».

Обнаружение острова нерсистенции в геноме предпандемических штаммов ставит вопрос о способности этих изолятов образовывать бионленку в условиях in vitro, которая защищает индивидуальные клетки от воздействия различных повреждающих факторов внешней среды. Поскольку для формирования биопленки необходим биосинтез не только маннозочувствительных пилен адгезии (MSHA), определяемый генами msh, локализованными на EPI, но и продукция экзополисахарида, а также подвижность вибрионов, то вначале была дана оценка экспрессии генов, контролирующих проявление этих свойств. В результате установлено, что все проверенные штаммы были подвижны, а также продуцировали MSIIA и экзополисахарид. Затем мы провели моделирование процесса образования биопленки на абиотической поверхности - 96-луночной полистироловой панели. Оказалось, что как предпандемиче-ские так и пандемические штаммы были способны формировать биопленку на абиотической поверхности, практически не отличаясь друг от друга по этому свойству (рис. 3). Поскольку бнопленка является идеальным местом для гори-

зонтального переноса генов от одних бактерий к другим, можно предположить, что именно в ее составе происходили дальнейшие преобразования генома эт ого патогена.

Ja 1,8

§ 1.6

£ 1.4

го 1,2

1 1

Е 0,8

и, 0,6

rs л

о 0,4

® 0,2 S О

1 2 3 4 5 Предпандемические

9 10 11 12 13

Пандемические

Обозначения: I - АТСС14033, 2 МАК97, 3 - МАК676, 4 - МАК757, 5 - Cel-ebes30, 6 - С418, 7 - С443, 8 - М1292, 9 - М1326, 10-М1328, 11 -М1347, 12-М1380, 13 - 74, 14 - М8, 15 - 641/67 CRC 1DH; ОП - оптическая плотность, измеренная на спектрофотометре.

Рисунок 3. Образование биоиленки штаммами V. cholerae.

3. Молскулярно-геиетические особенности штаммов V.cholerae биовара эльтор, вызвавших 7-ю пандемию холеры. В 2002 г. Dziejman et al., изучив геномы трех штаммов, выделенных в Гонконге (1961 г.), Бангладеш (1971 г.) и Перу (1991 г.), высказали предположение о том, что их пандемический потенциал связан с присутствием в их хромосоме двух дополнительных геномных островов VSP-1 и VSP-2. Между тем до сих пор отсутствуют полные сведения о распространенности этих островов иандемичности среди других штаммов, изолированных на разных территориях и в различные периоды седьмой пандемии. Для решения этиого вопроса был проведен ПЦР-анализ геномов 20 клинических штаммов V.cholerae биовара эльтор, выделенных на различных географически удаленных территориях и в разные периоды 7-ой пандемии холеры, в геноме которых, согласно нашим данным, имелись црофаг СТХф и ОП VP1-1 (рис. 4 А). Кроме того, нами было установлено, что в их геноме присутствует дополнительный црофаг RSlcp. При этом, по данным ДНК-гибридизации с молекулярным зондом RS, в хромосоме 5 штаммов из 6 исследуемых имеет ся но две копии ирофага RS Up (рис. 4 Б), Что касается ос тровов иандемичности, то их имели все исследованные штаммы независимо от времени их выделения.

Присутствие в геноме всех исследованных штаммов VSP-1 и VSP-2 показывает и подтверждает ранее полученные данные о том, что процесс формирования возбудителя 7-ой пандемии холеры был связан с приобретением уже вирулентными вибрионами эльтор указанных геномных островов. Вместе с тем до сих пор отсутствуют сведения о роли VSP-1 и VSP-2 в выживаемости

J 2 i 4 5 6 M I 2 3 4 5 6 M

Л Б

А. ДНК-гибридизация Pstl-фрагментов хромосомной ДНК с молекулярным зондом СТ (амилифицированный фрагмент гена ctxA из профага С'ГХф): 1-6 -ДНК штаммов M8IH, М656, 28Афг„ Т-4, 34Филинн, 1/67; М ДНК фага А. рестрицированная EcoR[/HindiII.

Б. ДНК-гибридизация Bglll хромосомных фрагментов пандемических штаммов с молекулярным зондом RS (амилифицированный фрагмент гена rslC из профага KSlcp): 1-6 - ДНК штаммов М656, 28Афг., Т-4, 34Филипп., 1/67, М818; М ДНК фагаХ, рестрицированная EcoRl/Hindltl.

Рисунок 4. Блот-гибридизация по Саузерну хромосомных ДНК пандемических штаммов V.cholerae биовара эльтор, рестрицировапных эндонуклеазами, с молекулярными зондами СТ и RS, мечеными дигоксигенином.

клинических штаммов V.cholerae биовара эльтор в окружающей среде, которая в значительной мере может определя ть пандемический потенциал возбудителя. В этой связи были проведены модельные эксперименты по определению конкурирующей способности вирулентных предцандемических и пандемических штаммов в условиях in vitro. В стерильную речную воду вносили одинаковое количество клеток 1-ого нредиаидемического и 1-ого пандемического штамма и проводили сравнение их выживаемости через 7 и 14 дней после совместного культивирования. В результате впервые обнаружено, что при совместном культивировании тестируемых штаммов в речной воде уровень выживаемое™ пандемических штаммов был в 3-47000 раз выше, чем предцандемических. Эти данные свидетельствуют в пользу предположения о том, что геномные острова VSP-1 и VSP-2 действительно играют большую роль в адаптации холерных вибрионов к окружающей среде.

Обнаруженные как сходство, так и различия в структуре и функциях геномов предцандемических и пандемических штаммов ставят вопрос об их генетических связях.

I 2345678 9 10 II UM

.............-21227

—' - -xff-чЫ , i

К* \ - r i

|Ц| pa «V* ^Й» Щ|| ... Щ| ЦЩ Дд

_ 5148 HH 497.)

42Mi

—202*7 •1904

Предиандемические штаммы: I - МЛК757, 2-3 - Celebes 30, 4 - МЛК.97, 5 -MAK676, 6 - ATCC14033. Пандемические штаммы: 7 - M818, 8 - M656, 9 -28Афг„ 10 - T-4, 11 - 34Филип„ 12 - 1/67. М ДНК фага А., рестрицированная EcoRI/HindlJI.

Рисунок 5. Риботипирование (гибридизация зонда 16S с Bgll фрагментами рестрикции) штаммов V.cholcrae биовара эльтор, выделенных до начала и во время 7-ой пандемии холеры.

С этой целью было проведено их молекулярное тинирование. В качестве основных методов анализа были выбраны риботипирование и КЛР1)-1ЩР-типирование. Результаты риботииирования позволили раздели ть тестируемые штаммы на три основные группы, каждая из которых относилась к одному и тому же риботину: авирулентный предиандемический, вирулентные предиандемические и вирулентные пандемические (рис. 5). Таким образом, риботипирование обеспечило четкую дифференциацию предпандемических и пандемических штаммов и показало, что исследуемые штаммы по структуре тт-оперонов следует отнести к 3-м разным риботипам. Необходимо отмети ть, что штаммы, выделенные в разные периоды 7-ой пандемии холеры, относятся к одному риботину и являются, вероятно, потомками одного клона. Вирулентные предиандемические штаммы входят в другую, но также генетически однородную труппу, что может свидетельствовать в пользу предположения об их клональном происхождении. Выявленные различия в структуре ггп-онероиов между 3-мя группами ш таммов, безусловно, отражают эволюционные изменения их геномов. Вместе с тем наличие идентичных фрагментов, гибридизи-рующихся со специфическим зондом, может служить указанием на их общее происхождение.

Результаты RAPD-ЛЦР-типирования со случайным праймером 12.81 (AACGCGCAAC) полностью совпадают с результатами риботииирования.

4. Генетическое разнообразие природных штаммов V. с hole тс биовара эльтор, выделенных во время 7-ой пандемии холеры. Самостоятельный интерес представляло изучение генетического разнообразия пандемических природных штаммов, выделенных во время энидосложнсний. Изучено 99 природных штаммов, изолированных от больных (89), носителей (5) и водной среды (5) в период энидосложнсний по холере. Проведено ГЩР-тестирование

21 гена, локализованного на профагах СТХ<р и RSlcp, а также геномных островах EPI, VPI-1, VPI-2, VSP-1 и VSP-2. В результате обнаружено 20 ipyiiu природных штаммов, геномы которых отличались от типичных по разным свойствам.

Таблица 3. Результаты анализа генетического разнообразия природных штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор, выделенных во время седьмой пандемии холеры на территории Юго-Восточной Азии и Российской Федерации._

Гены ctxA асе | zot j t rstC | îcpA toxT j aldA & S hell760 rtanH oo S "-Ч c> О -S! !Q 00 c> t 0 Os g O, pro0496 mshQ ! attRS rtxA %

Кол-во штаммов с указанным набором генов 58 4 4 4 4 4 + + 4- 4- + + 4 4 4 4 4 4 4 58,58

10 4 4 4 4 4 + 4- 4- - 4 - 4 4 4 4 4 4 4 10,1

5 4 4 4 + 4 4- 4- + + 4- + 4 4 4 4 4 4 - 5,05

5 - - - - 4 + + 4 - 4- - - - - - 4 4 4 5,05

3 4 4 + 4 4 + 4- 4- 4- - 4- 4 4 4 4 4 4 - 3,03

2 - - - 4 4 + 4- 4- 4- 4- + 4 4- 4 4 4 4 4 2,02

2 - - - - 4 + 4- + - 4- - - 4 4 4 4 4 4 2,02

1 - — - 4 4 + 4- 4 4- 4- 4 - - - - 4 4 4 1,01

1 4 4 4 - - 4- 4- 4- 4- 4- 4 - - - - 4 4 4 1,01

1 4 4 4 4 4 + 4- - - 4- - - - 4 4 4 4 4 1,01

1 4 4 - 4 + + + 4 4- - -f 4 4 4 4 4 4 - 1,01

1 4 4 4 4 + + + 4- - 4- - - - 4 4 4 4 4 1,01

1 4 + - 4 + + 4- 4- + + 4 4 4 4 4 4 4 4 1,01

1 4 4 4 - + + 4- + 4- 4- 4 + 4 1,01

1 - 4 4 - 4- + + 4- + + 4 - - - - 4 - 4 1,01

1 4 4 4 - - 4- + 4- 4- + 4 - - - - 4 - 4 1,01

1 - - 4 4 + + + 4- 4- + 4 4 4 4 4 -1- 4- - 1,01

1 - - — 4 + + + 4 - 4- - 4 4 4 4 4 4 4 1,01

1 - - - - 4- + + 4 - + 4 4 4 1,01

1 4 - - 4 4- + 4- 4- + 4 4 4 4 4 4 4 4 4 1,01

1 - - - - + + 4- 4- - + _ 4 4 - 4 4 4 1,01

Показано, что генетическое разнообразие штаммов определяется в основном утратой мобильных элементов или их отдельных генов (табл. 3). Утрата генома ирофага СТХф или его отдельных генов происходит в 18% случаев. Частичная потеря генов УР1-2 наблюдается в 27,3% случаев. Острова нанде-мичности У8Р-1 и У8Р-2 утрачиваются также довольно часто - в 13,1% и 12,1% случаев соответственно.

Вместе с тем установлено стабильное наследование ОП УР1-1, несущего

гены (срА-Р, кодирующего биосинтез основного фактора колонизации. Лишь 2 штамма (5/66 и С\¥6) либо не имели гена (срА, либо нуклеотидная последовательность этого гена отличалась от типичной для вибрионов эльтор.

В этой связи было проведено секвенирование гена ¡срА у штамма У.ско1егае СШ6. Анализ нуклеотидной последовательности показал, что ген ¡срА штамма С\У6 действительно отличается от типичного по 44 нуклеотидам, но имеет значительную гомологию с геном 1срЛ У.сЬо1егае 569В классического биовара, взятого в качестве контроля (рис. 6).

Обнаружение штамма с комбинированными свойствами возбудителей двух биоваров подтверждает предположение ряда исследователей о том, что в современный период происходит горизонтальный перенос генов вирулентности от классических холерных вибрионов, образовавших природный резервуар генов патогенности, к холерным вибрионам эльтор.

80 100 НО 120 130

.......-ТС АСАТЗАС"" АС ТААТСАТТСТТСТС^С.ТАТ ТА ТСССТСТССТСТСА ССОССТС?.....

..................... • -о.....с.....а- -с........о.....т- -а.....о.......

190 200 210 220 230 340

•■■'CTGCGCAAñAXCTAAACAGCGT&CAAAT^GCÍUiTGACACA/LACTTATCOTAG'í'CTTGG"--

.....А- -Т........с - -Т-САА-С- - -G-0--OC-T--T........................

260 270 2SO 290 300 310

••"GTACCGCAAACGCAAATGCTGCTACACAGCXaGCTAATGGTTTGGTCAGCCTXGGTAAGG

.....А* - А- • ТО -Т- -G-CA.......OTA.....А- -ТСА' -С.....Т- • ТТ- А.....АА

..... . . • А■ 'TG• Т• • -GCC- «С - - А- -ООСС- ■ - А* - ТС- ' ■ О.....Т- * -Т- А- • - - - - А

320 330 340 350

?Т ТСAGCT GA? GAGGCAAAGAATC C2TTCACTGGT AC AG СТАТЬ.........

•А- - -Т-С...........А- -С- -А- - - -Т-.....................

• • -G -G.....А - -Т- • А.....А.....А.....................

Идентичные нуклеотидные последовательности представлены точками; замены нуклеотидных последовательностей выделены жирным шрифтом. Рисунок 6. Сопоставление нуклеотидной последовательности гена tcpA природного штамма V.cholerae CW6 биовара эльтор с таковой референс штамма V.cholerae N16961 биовара эльтор и V.cholerae 569В классического биовара.

Таким образом, показано, что в основе генетического разнообразия штаммов лежит нестабильность геномов их мобильных элементов, связанных с вирулентностью и/или пандемичностью. Заслуживают внимания результаты, указывающие на циркуляцию в природных популяциях штаммов, геном которых был очень сходен с геномами вирулентных предпандемических изолятов. Эти 4 штамма (5/66, 6/67, CW6 и МЕ7) не имели ни профага RSlcp, ни островов пандемичности VSP-1 и VSP-2 при наличии других мобильных элементов, связанных с вирулентностью. Следует также отметить, что представленные нами данные о генетическом разнообразии клинических штаммов V.cholerae биовара эльтор, отличаются от ранее полученных результатов, согласно которым эти изоляты являются генетически однородной популяцией. Проведение в

N16961 Hefeceaoe 569В СИ6

N16961 Reference S69B CW6

N16961 Refer-euoe 569В CW6

N16961 Reference 569В CW6

настоящей работе более глубокого анализа их геномов позволило впервые выявить более высокий уровень их генетического разнообразия, который связан с утратой ими островов мандемичности или отдельных генов из острова наго-генности VPI-2.

Выявление штаммов V.cholerae биовара эльтор с вариабельным геномом профага СТХср позволило изучать особенности инфекционного процесса при экспериментальной инфекции, вызванной природными изолятами, несущими различный набор фаговых генов ctxA, zot и асе (с/хА ' zot' асе*; ctxA ' zof асе*; clxA' zot' асе'; ctxA' zot* ace; ctxA' zof асе). Экспериментальную инфекцию воспроизводили на 37 кроликах-сосунках. В результате было установлено, что все ctxA ' штаммы, независимо от присутствия генов zot или асе, были вирулентны. Отсутствие гена ctxA при сохранении zot и асе определяло развитие энтеропатотениого синдрома, что характерно для слабовирулентных штаммов. Утрата всех генов профаг а приводила к авируленгности штамма. Таким образом показана явная связь между характером инфекционного процесса у модельных животных и вариабельностью генома профага.

Итак, выявленное генетическое разнообразие природных штаммов свидетельствует о том, что формирование генетически измененных патогенных вариантов происходит постоянно и с довольно высокой частотой. Эти события указывают на необходимость проведения мониторинга внешней среды с использованием адекватных диагностических средств. Полученные данные о наличии или отсутствии в геноме 99 природных штаммов 20-25 различных генов будут использованы для геномной паспортизации штаммов V.cholerae, хранящихся в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб».

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе впервые проведен комплексный сравнительный анализ феиотипических и генетических свойств 25 предпандемических и пандемических шамшт V.cholerae биовара эльтор для углубления наших знаний об эволюции генома этого патогена. Основным итогом фенотииического анализа явилось выявление идентичных серологических, биохимических свойств, а также резистентности к диагностическим фагам у всех изученных штаммов, независимо от времени выделения, их вирулентности и пандемического потенциала. Преднандемические штаммы отличались от пандемических лишь появлением у последних устойчивости к изученным антибиотикам.

Генетический анализ предпандемических штаммов показывает присутствие в их геноме общих с пандемическими штаммами структурных и регуля-торных генов (attRS, hapA, rtxA; toxR, luxO, luxS, hns, рерА), а также мобильного элемента EPI. Несомненно, что эти гены и геномный остров ЕР1 имеют древнее происхождение. Впервые показано, что преднандемические штаммы, как и пандемические изоляты способны формировать бионленку в условиях in vitro. Это свойство указывает на возможность сохранения их во внешней среде в течение длительного периода. Вместе с тем выявлены и подтверждены раз-

личия между геномами вирулентных предпандемических и пандемических штаммов. Показано, что в отличие от клинических изолятов, выделенных в 1937 г. и содержащих в геноме профаг СТХф, а также ОП УР1-1 и дефектный ОП УР1-2, пандемические штаммы имели дополнительные мобильные элементы - профаг 1ср и острова пандемичности УБР-] и У8Р-2. Эти данные полностью согласуются с результатами других исследователей. Кроме того, впервые установлено, что пандемические штаммы, имеющие У8Р-1 и У8Р-2, характеризуются большей выживаемостью в водной среде по сравнению с вирулентными предпандемическими изолятами, лишенными этих геномных островов. Выявленные различия в выживаемости между сравниваемыми штаммами подтверждают участие У8Р-1 и УБР-2 в формировании пандемического потенциала у возбудителя последней пандемии холеры.

Полученная информация о фенотипических и генетических особенностях предпандемических и пандемических штаммов, а также данные риботипиро-вания и ЛАРО-ПЦР-типирования свидетельствует в пользу предположения о следующих этапах эволюции генома возбудителя холеры эльтор: авирулент-ные предпандемические штаммы У.сИо1егае еког —> вирулентные предпанде-мические штаммы У.сНо1егае еког —> вирулентные пандемические штаммы У.сИо1егае еког. Это означает, что происходило поэтапное обогащение генома авирулентного штамма-предшественника различными МГЭ, связанными с вирулентностью и пандемичностью.

Самостоятельный интерес представляют данные о генетическом разнообразии 99 природных штаммов У.ско1егае биовара эльтор, выделенных в период 7-ой пандемии холеры во время эпидосложнений. В результате выявлено 20 групп штаммов, отличающихся от типичных отсутствием того или иного мобильного элемента (профагов СТХф, К81 ф, островов пандемичности У8Р-1 и У8Р-2) либо отдельных генов, входящих в состав СТХф и/или УР1-2. Вместе с тем на основе секвенирования гена Хер А из ОП УР1-1 были обнаружены штаммы У.сНо1егае биовара эльтор с гибридным геном 1срА, имеющим значительную область гомологии с геном ¡срА холерных вибрионов классического биовара. Выявленное генетическое разнообразие природных штаммов свидетельствует о продолжающихся изменениях генома возбудителя холеры эльтор, в результате которых могут сформироваться новые варианты патогенных клонов с новыми диагностически значимыми и вирулентными свойствами.

Полученные фундаментальные данные явились основой для решения ряда прикладных вопросов.

ВЫВОДЫ

1.Авирулентные и вирулентные штаммы V.cholerae биовара эльтор, выделенные до начала 7-ой пандемии, не отличаются от пандемических изолятов по серологическим и биохимическим свойствам, а также резистентности к холерным диагностическим бактериофагам. Вместе с тем сравниваемые штаммы имеют разную чувствительность к изученным лекарственным препаратам.

2.В геномах авирулентных и вирулентных предпандемических штаммов холерных вибрионов эльтор содержатся общие регуляторные гены toxR, luxO, luxS, hns, pepÂ, a также мобильный генетический элемент - остров персистен-ции EPI, что свидетельствует об их древнем происхождении.

3.Впервые показано, что преднандемические штаммы, содержащие EPI, способны формировать биопленку, что указывает на возможность сохранения их во внешней среде в течение длительного периода.

4.Выявлены значительные различия между геномами авирулентных и вирулентных предпандемических штаммов. В геноме вирулентных штаммов, в отличие от авирулентных, присутствуют дополнительные мобильные элементы: две копии профага СТХф и два острова патогенное™ VP1-I и VPI-2, из которых последний является дефектным. Эффективная экспрессия ключевых генов патогенности ctxAB и tcpA, входящих в состав соответственно СТХф и VP1-1, определяет способность этих штаммов вызывать экспериментальную холерную инфекцию у биомоделей.

5.Показано широкое распространение островов пандемичности VSP-1 и VSP-2 среди штаммов V.cholerae биовара эльтор, выделенных во время 7-ой пандемии холеры. Впервые обнаружен более высокий уровень выживаемости в водной среде пандемических штаммов по сравнению с предпандемическими, что подтверждает роль VSP-I и VSP-2 в формировании пандемического потенциала у возбудителя холеры эльтор.

6.Генетическое разнообразие изученных пандемических штаммов, выделенных в эпидемически опасные периоды, выражается в присутствии в природных популяциях изолятов, не имеющих либо таких мобильных элементов как СТХф, RS^, VSP-I или VSP-2, либо отдельных генов СТХф и VPI-2. Кроме этого при анализе нуклеотидных последовательностей обнаружены штаммы, содержащие VPI-1 с гибридным геном tcpA. Показано, что в основе изменения вирулентных свойств различных штаммов лежит вариабельность генома профага СТХф.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Осин A.B., Нефёдов К.С., Смирнова Н.И. Гетерогенность структуры генома предпандемических и пандемических штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор // Холера и патогенные для человека вибрионы. - Ростов-на-Дону, 2004.-Вып. 17.-С. 58-59.

2. Смирнова Н.И., Осин A.B., Нефедов К.С., Краснов Я.М., Гусева Н.П. Полиморфизм гена tcpA, участвующего в контроле биосинтеза основного фактора колонизации, у предпандемических и пандемических штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор // Медицинская микробиология - XXI век. - Саратов, 2004.-С. 205-207.

3. Осин A.B., Нефедов К.С., Смирнова Н.И. Роль мобильных генетических элементов в изменении вирулентных и эпидемических свойств холерных вибрионов биовара эльтор // Материалы I Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность». - М., 2004. - С. 145-146.

4. Осин A.B., Нефедов К.С., Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И. Сравнительный анализ геномов холерных вибрионов эльтор, выделенных до начала и в разные периоды седьмой пандемии холеры // Генетика. - 2005. - Т. 41, №1. - С. 1-10.

5. Нефёдов К.С., Осин A.B., Смирновой Н.И. Генетическое разнообразие пандемических штаммов холерных вибрионов биовара эльтор, выделенных из различных источников на территории Юго-Восточной Азии // Проблемы особо опасных инфекций. - Саратов, 2005. - Вып. 1. - С. 46-51.

6. Нефедов К.С., Осин A.B., Смирнова Н.И. Влияние мобильных генетических элементов на вирулентность и эпидемический потенциал холерных вибрионов биовара эльтор // Материалы Всеросс. научно-практ. конф. «Окружающая среда и здоровье». - Суздаль, 2005. - С. 172-175.

7. Нефедов К.С., Осин A.B., Ливанова Л.Ф., Смирнова Н.И. Фенотипическая и генотипическая характеристика предпандемических штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор. // Сб. матер, проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы». - Ростов-на-Дону, 2005. - Вып. 18. - С. 81-82.

8. Осин A.B., Нефедов К.С., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Смирнова Н.И. Мультилокусное секвенирование предпандемических и пандемических штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор // Материалы VII межгосударственной научно-практической конф. государств - участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств участников Содружества Независимых Государств». - Оболенск, 2006. - С. 117-118.

9. Смирнова Н.И., Нефёдов К.С., Осин A.B., Ливанова Л.Ф., Краснов Я.М. Изучение распространенности регуляторных генов, контролирующих экспрессию генов вирулентности, среди штаммов Vibrio cholerae биовара

эльтор с разным пандемическим потенциалом // Молекул, генетика. - М., 2007. -№ 1.-С. 15-22.

10. Нефедов К.С., Осин A.B. Изменчивость структуры профага вирулентности СТХф Vibrio cholerae и ее влияние на течение инфекционного процесса // Материалы X Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей «Человек и его здоровье». - СПб., 2007. - С. 304-305.

11. Смирнова Н.И., Осин A.B., Нефедов К.С., Кульшань Т.А., Заднова С.П., Ливанова Л.Ф., Топорков A.B., Кутырев В.В. Вариабельность генома профага СТХф и ее роль в изменении вирулентных свойств Vibrio cholerae биовара эльтор // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2007. - №.6. - С.20-26.

12. Осин A.B., Нефедов К.С., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Смирнова Н.И Типирование штаммов V.cholerae биовара эльтор методом мультилокусного секвенирования // Сб. трудов 6-ой Всеросс. научн.-практ. конф. «Молекулярная диагностика - 2007». - М., 2007 - Т.1. - С.389-391.

13. Осин A.B., Нефедов К.С., Кульшань Т.А., Челдышова Н.Б., Смирнова Н.И. Эволюционные преобразования генома возбудителя холеры эльтор и их роль в возникновении штаммов с разным эпидемическим потенциалом // Матер. IX съезда Всерос. научно-практ. об-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - М., 2007. - Т. 1. - С. 182-183.

Сдано в набор 14.01.09 г. Подписано к печати 16.01.09. Формат 84x108 1/6. печать лазерная. Бумага финская Гарнитура Тайме. Объем 1,1 усл.п.л. Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Нефедов, Константин Сергеевич

СПИСОК ПРИНЯТЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Мобильные генетические элементы Vibrio cholerae биовара эльтор, связанные с вирулентностью.

1.1.1 Бактериофаги.20

1.1.2 Острова патогенности и пандемичности.26

1.1.3 Суперинтегроны и интегроны V.cholerae.33

1.2. Изменения генома V.cholerae биовара эльтор в процессе эво

ЛЮЦИИ.'.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Бактериальные штаммы.42

2.2 Питательные среды и реактивы.45

2.3. Методы.

2.3.1. Культивирование штаммов.

2.3.2. Определение продукции растворимой гемагглюти-нин/протеазы.

2.3.3 Определение подвижности.

2.3.4. Определение продукции 01 антигена.

2.3.5 Определение чувствительности к холерным диагностическим бактериофагам.

2.3.6 Определение продукции маннозо-чувствительных гемагг-лютинирующих пилей адгезии.

2.3.7 Определение способности формировать биопленку.47

2.3.8 Определение продукции холерного токсина.48

2.3.9 Определение конкурентных способностей.

2.3.10 Электрофорез в полиакриламидном геле.

2.3.11 Выделение экзополисахарида и количественное определение его содержания.

2.3.12 Полимеразная цепная реакция.51

2.3.13 Выделение хромосомной ДНК.

2.3.14 Секвенирование ДНК.

2.3.15 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 56

2.3.16 Внутрикишечное заражение модельных животных.

2.3.17 Гибридизация хромосомной ДНК по Саузерну и риботипирование штаммов V.cholerae биовара эльтор.

ГЛАВА 3. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ФЕНОТИПИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ШТАММОВ V.CHOLERAE БИОВАРА ЭЛЬТОР, ВЫДЕЛЕННЫХ ДО НАЧАЛА И В РАЗНЫЕ ПЕРИОДЫ СЕДЬМОЙ ПАНДЕМИИ ХОЛЕРЫ.58

3.1. Изучение серологических свойств, чувствительности к диагностическим фагам и гемолитической активности.59

3.2. Изучение основных биохимических свойств, связанных с вирулентностью.65

3.3. Сопоставление устойчивости к лекарственным препаратам у предпандемических и пандемических штаммов.59.-7 ^

ГЛАВА 4. СТРУКТУРНЫЙ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНОМА ПРЕДПАНДЕМИЧЕСКИХ ШТАММОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ ЭЛЬТОР.

4.1. Распространение профагов и островов патогенности среди природных штаммов, выделенных до начала седьмой пандемии холеры.72

4.2. Выяснение присутствия в геноме предпандемических штаммов регуляторных генов, контролирующих экспрессию основных генов вирулентности.77

4.3. Сравнение нуклеотидных последовательностей основных структурных и регуляторных генов вирулентности пред-пандемических штаммов.82

4.4. Определение токсигенности и вирулентности предпандеми-ческих штаммов.85

4.5. Определение присутствия острова персиситенции у пред-пандемпческих штаммов и изучение их способности к образованию биопленки.88

ГЛАВА 5. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ШТАММОВ V.CHOLERAE БИОВАРА ЭЛЬТОР, ВЫ

ЗВАВШИХ 7-Ю ПАНДЕМИЮ ХОЛЕРЫ.

5.1. Выявление в геноме пандемических штаммов новых мобильных элементов - островов пандемичности VSP-1 и VSP-2.95

5.2. Сравнительный анализ жизнеспособности предпандемических и пандемических штаммов V.cholerae биовара эльтор 99

5.3. Молекулярное типирование штаммов холерных вибрионов эльтор, выделенных до и во время седьмой пандемии.100

ГЛАВА 6. ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ПРИРОДНЫХ ШТАММОВ V.CHOLERAE БИОВАРА ЭЛЬТОР ВЫДЕЛЕННЫХ ВО ВРЕМЯ 7-ОЙ ПАНДЕМИИ ХОЛЕРЫ.

6.1. Выявление природных штаммов с дефектными геномными островами, связанными с вирулентностью или паидемичностью.108

6.2. Вариабельность геномов профагов СТХср и RSlcp.111

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительный анализ фенотипических и молекулярно-генетических свойств холерных вибрионов эльтор, выделенных до начала и в период седьмой пандемии холеры"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Механизм эволюции патогенных бактерий - одна из центральных проблем медицинской микробиологии. Решение этой проблемы позволяет выяснить причины генетического разнообразия возбудителей инфекционных болезней и провести прогнозирование появления новых эпидемически опасных вариантов. Vibrio cholerae, имеющий повышенную эпидемическую значимость, является возбудителем' холеры, острого диарейного заболевания с массивной дегидратацией, унесшего миллионы человеческих жизней за семь известных пандемий: Распространение холеры во многих странах мира определяет реальную возможность ее завоза на территорию России.' Непосредственным напоминанием об этой угрозе являются недавние эпидемические вспышки холеры* в Дагестане (1994 г., 1998 г.), Дальнем-Востоке и Приморье (1999 г.), Татарстане (2001 г.), Ростовской области (2005 г.), а также спорадические случаи заболевания^ (Челябинск, 2000 г.; Калмыкия, 2002 г.; Башкортостан, 2004 г., 2008 г; Тверская область 2005 г.; Мурманск, 2006 г.). Согласно современным представлениям, в пределах вида V. cholerae образовалось три эпидемически опасных варианта: холерные вибрионы 01-серогруппы классического биовара, вызвавшие; видимо, первые 6 пандемий азиатской холеры (1817-1923 гг.), холерные вибрионы Ol-серогруппы биовара эльтор - возбудитель текущей, 7-ой, пандемии (с 1961 г. по настоящее время) и внезапно появившийся в 1992 г. высоковирулентный штамм V. cholerae 0139-серогруппы, с которым связывали начало 8-ой пандемии холеры.

Поскольку в современный период продолжается 7-ая пандемия холеры, ее возбудитель остается в центре внимания многих исследователей. Секвенирование генома V. cholerae биовара эльтор< (Heidelberg J.F et al., 2000) позволило выявить следующие его основные особенности: а) в отличие от многих других патогенов в клетках V. cholerae имеется 2 кольцевые хромосомы, различающиеся по размеру и функции; б) основные гены вирулентности возбудителя входят в состав различных мобильных генетических элементов (двух профагов и пяти геномных островов), локализованных в основном на большой хромосоме.

Мобильность этих элементов и нестабильность их геномов, а также изменение в настоящее время экологии if иммунного статуса человека во многих регионах мира, включая- Россию, - все это создает предпосылки для образования штаммов с ранее неизвестными свойствами. Такая ситуация» диктует необходимость выяснения основных направлений эволюции возбудителя холеры эльтор в современный период. Однако для получения такой информации необходимы полные сведения об-эволюции генома этого возбудителя в недалеком прошлом. В этой' связи очевидна актуальность исследований, направленных на решение этой проблемы. Несмотря на большой интерес исследователей к этому вопросу, пока нет единой точки зрения на происхождение возбудителя холеры эльтор. При анализе 2-х предпандемических и 3-х пандемических- штаммов выявлены лишь особенности генетической организации этих изолятов (Dziejman М. et al., 2002). Полученные ранее сведения о структуре и функции генома предпандемических штаммов явно недостаточны. Практически отсутствуют данные о функции островов пандемичности VSP-1 и VSP-2, имеющихся в геноме клинических штаммов, выделенных во время 7-ой пандемии холеры. Информация о геномных вариациях природных штаммов V. cholerae биовара эльтор, циркулирующих на разных территориях в период эпидемического неблагополучия по холере, является также неполной. Получение новых фундаментальных сведений о фенотипических и генетических особенностях штаммов, выделенных до и во время 7-ой пандемии холеры эльтор, позволит получить более полную картину об эволюции этого возбудителя и выяснить механизмы, лежащие в основе адаптации этого патогена к меняющимся условиям внешней среды. Эти сведения будут служить основой для решения такой важной прикладной задачи, как паспортизация штаммов Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб", а также для разработки новых средств диагностики и дифференциации штаммов с разным эпидемическим потенциалом.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - выявление фенотипических и генетических особенностей предпандемических и пандемических штаммов V. cholerae биовара эльтор.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Провести сравнительный анализ различных фенотипических свойств предпандемических и пандемических штаммов холерных вибрионов биовара эльтор.

2. Изучить распространенность профагов и геномных островов, связанных с вирулентностью и персистентностью, среди предпандемических штаммов V. cholerae биовара эльтор.

3. Исследовать экспрессию генов вирулентности и персистенции, локализованных в геноме предпандемических штаммов.

4. Изучить распространенность островов пандемичности VSP-1 и VSP-2 среди различных пандемических изолятов; определить роль последних в жизнеспособности этих штаммов.

5. Провести молекулярное типирование штаммов V. cholerae биовара эльтор, выделенных до и в период 7-ой пандемии холеры, для определения их филогенетических связей.

6. Изучить генетическое разнообразие природных штаммов V. cholerae биовара эльтор, выделенных на разных территориях во время эпидосложнений по холере.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА:

Показано, что предпандемические штаммы V. cholerae биовара эльтор, независимо от времени их выделения (1910 г. и 1937 г.) и вирулентности, не отличались от штаммов, изолированных во время 7-ой пандемии, по серологическим, биохимическим свойствам и резистентности к диагностическим холерным бактериофагам. Вместе с тем впервые выявлено, что предпандемические штаммы, в отличие от пандемических, не имели устойчивости к изученным антибиотикам.

При сравнительном анализе геномов предпандемических и пандемических штаммов обнаружено, что регуляторные гены toxR, luxX, hixS, hns и pep А, входящие в состав различных систем регуляции, являются наиболее древними. Впервые определено присутствие в геноме всех изученных предпандемических штаммов острова персистенции в окружающей среде EPI, что указывает на его древнее происхождение. Установлено наличие в геноме вирулентных предпандемических штаммов двух копий профага СТХф и дефектного острова патогенности VPI-2, лишенного одного (гер1803) или двух (папН, гер1803) тестируемых генов. Показано широкое распространение двух островов пандемичности VSP-1 и VSP-2 среди штаммов V. cholerae биовара эльтор, выделенных во время 7-ой пандемии холеры, что подтверждает их важную роль в формировании пандемического потенциала у этого возбудителя. Новыми являются данные о генетическом разнообразии природных клинических штаммов, связанном с нестабильностью геномов VPI-2, а также VSP-1 и VSP-2. Впервые обнаружено, что риботипирование и RAPD-ПЦР-типирование позволяют дифференцировать предпандемические и пандемические штаммы V. cholerae биовара эльтор.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ:

Создан комплекс мультиплексных ПЦР, предназначенных для выявления в геноме штаммов V, cholerae основных генов вирулентности и персистенции. На основе разработанных тест-систем оформлены методические рекомендации "Мультиплексный ПЦР-анализ для изучения генетического разнообразия и выявления атипичных штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор", которые одобрены Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 10 от 18 декабря 2007 г.) и утверждены директором института 18 декабря 2007 г.

Создана коллекция, состоящая из 18 авторских штаммов V. cholerae биовара эльтор, которая включает штаммы с различным набором генов вирулентности и пандемичности. Эти штаммы могут быть использованы для выяснения и уточнения роли мобильных элементов в проявлении вирулентных свойств штаммов и их адаптации к меняющимся условиям окружающей среды. Штаммы коллекции депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб".

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Штаммы V. cholerae биовара эльтор, выделенные до начала и в разные периоды седьмой пандемии холеры, не различаются по продукции 01-антигена, термолабильного гемолизина, растворимой гемагглютинин/протеазы, белков внешней мембраны OmpU и ОшрТ, а также чувствительности к холерным диагностическим эльтор и классическим бактериофагам. Вместе с тем предпандемическне штаммы имеют выраженные отличия от пандемических относительно их резистентностик изученным антибиотикам.

2. В геноме авирулентных и вирулентных предпандемических штаммов присутствуют общие структурные (hapA, rtxA, attRS) и регуляторные (toxR, hvcO, luxS, hns, pepA) гены, а также» остров персистенции в окружающей среде EPI. Предпандемическне штаммы способны образовывать биопленку, что связано с эффективной экспрессией генов, контролирующих подвижность (mot), биосинтез экзополисахарида (eps) и маннозочувствительных пилей адгезии (msh), последние из которых входят в состав EPI.

3. Геном вирулентных предпандемических штаммов содержит две копии профага СТХф, а также два острова патогенности YPI-1 и YPI-2, из которых последний молодых учёных и специалистов "Окружающая среда и здоровье" (Суздаль, 2005 г.) и Всероссийской конференции "Фундаментальная наука и клиническая медицина" (Санкт-Петербург, 2007 г.).

ПУБЛИКАЦИИ:

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ:

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 219 цитируемых работ, из них 54 отечественных и 165 зарубежных. Общий объем диссертации составляет 153 страницу. Текст иллюстрирован 14 таблицами и 15 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Нефедов, Константин Сергеевич

ВЫВОДЫ

1 .Авирулентные и вирулентные штаммы V. cholerae биовара эльтор, выделенные до начала 7-ой пандемии, не отличаются от пандемических изолятов по серологическим и биохимическим свойствам, а также резистентности к холерным диагностическим бактериофагам. Вместе с тем сравниваемые штаммы имеют разную чувствительность к изученным лекарственным препаратам.

2.В геномах авирулентных и вирулентных предпандемических штаммов холерных вибрионов эльтор содержатся общие регуляторные гены toxR, luxO, luxS, hns, рерА, а также мобильный генетический элемент - остров персистенции EPI, что свидетельствует об их древнем происхождении.

3.Впервые показано, что предпандемическне штаммы, содержащие EPI, способны формировать биопленку, что указывает на возможность сохранения их во внешней среде в течение длительного периода.

4.Выявлспы значительные различия между геномами авирулентных и вирулентных предпандемических штаммов. В геноме вирулентных штаммов, в отличие от авирулентных, присутствуют дополнительные мобильные элементы: две копии профага СТХф и два острова патогенности VPI-1 и VPI-2, из которых последний является дефектным. Эффективная экспрессия ключевых генов патогенности ctxAB и tcpA, входящих в состав соответственно СТХф и VPI-1, определяет способность этих штаммов вызывать экспериментальную холерную инфекцию у биомоделей.

5.Показано широкое распространение островов пандемичности VSP-1 и VSP-2 среди штаммов V. cholerae биовара эльтор, выделенных во время 7-ой пандемии холеры. Впервые обнаружен более высокий уровень выживаемости в водной среде пандемических штаммов по сравнению с предпандемическими, что подтверждает роль VSP-1 и VSP-2 в формировании пандемического потенциала у возбудителя холеры эльтор.

6.Генетическое разнообразие изученных пандемических штаммов, выделенных в эпидемически опасные периоды, выражается в присутствии в природных популяциях изолятов, не имеющих либо таких мобильных элементов, как СТХф, 1181ф, VSP-1 или VSP-2, либо отдельных генов СТХф и VPI-2. Кроме этого при анализе нуклеотидных последовательностей обнаружены штаммы, содержащие VPI-1 с гибридным геном tcpA. Показано, что в основе изменения вирулентных свойств различных штаммов лежит вариабельность генома профага СТХф.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе впервые проведен комплексный сравнительный анализ фенотипических и генетических свойств 25 предпандемических и пандемических штаммов V. cholerae биовара эльтор для углубления наших знаний об эволюции генома этого патогена. Необходимость проведения такой работы была связана с тем, что, несмотря на многочисленные исследования в этом направлении, до сих пор нет единой точки зрения относительно происхождения возбудителя 7-ой пандемии холеры (Faruque S.F., Nair G.B., 2008; О'Shea Y.A., 2004b; Yoon S.S., Mekalanos J.J., 2006). Понимание эволюционных преобразований генома V. cholerae биовара эльтор в прошлом необходимо для выяснения механизмов и направления эволюции в современный период. Поучение таких сведений является основой для прогнозирования появления патогенных клонов с новыми диагностически значимыми и вирулентными свойствами, что необходимо для своевременной разработки адекватных диагностических и профилактических средств.

Основным итогом исследований фенотипических свойств явилось выявление идентичных серологических и биохимических свойств, а таюке резистентности к холерным диагностическим бактериофагам у всех изученных штаммов, независимо от времени выделения (1910 г., 1937 г., 1962 - 2005 гг.), их вирулентности и пандемического потенциала. Предпандемическне штаммы отличались от пандемических лишь появлением у последних устойчивости к изучаемым антибиотикам.

Генетический анализ предпандемических штаммов показывает присутствие в их геноме общих с пандемическими штаммами структурных и регуляторных генов (attRS, hapA, rtxA; toxR, luxO, luxS, hns, рерА), а также мобильного элемента EPI. Несомненно, что эти гены и геномный остров EPI имеют древнее происхождение. Впервые показано, что предпандемические штаммы, как и пандемические изоляты, способны формировать биопленку в условиях in vitro. Это свойство указывает на возможность сохранения их во внешней среде в течение длительного периода. Вместе с тем выявлены и подтверждены различия между геномами вирулентных предпандемических и пандемических штаммов. Показано, что в отличие от клинических изолятов, выделенных в 1937 г. и содержащих в геноме профаг СТХф, а также ОП VPI-1 и дефектный ОП VPI-2, пандемические штаммы имели дополнительные мобильные элементы — профаг RS^ и острова пандемичности VSP-1 и VSP-2. Эти данные полиостью согласуются с результатами других исследователей. Кроме того, впервые установлено, что пандемические штаммы, имеющие VSP-1 и VSP-2, характеризуются большей выживаемостью bi водной среде по сравнению с вирулентными предпандемическими изолятами, лишенными этих геномных островов. Выявленные различия в выживаемости между сравниваемыми штаммами подтверждают участие VSP-1 и VSP-2 в формировании пандемического потенциала у возбудителя последней пандемии холеры.

Полученная информация о фенотипических и генетических особенностях предпандемических и пандемических штаммов, а также данные риботипирования и RAPD-ПЦР-типирования свидетельствует в пользу предположения о следующих этапах эволюции генома возбудителя холеры эльтор: авирулентные предпандемические ш гаммы V. cholerae eltor —» вирулентные предпандемические штаммы V. cholerae eltor —> вирулентные пандемические штаммы V. cholerae eltor.

Это означает, что происходило поэтапное обогащение генома авирулентного штамма-предшественника различными МГЭ, связанными с вирулентностью и пандемичностью.

Самостоятельный интерес представляют также данные о генетическом разнообразии 99 природных штаммов V. cholerae биовара эльтор, выделенных в период 7-ой пандемии холеры во время эпидосложнений. В результате выявлено 20 групп природных штаммов, отличающихся от типичных отсутствием того или иного мобильного элемента (профагов СТХср, RSlcp, островов пандемичности VSP-1 и VSP-2) либо отдельных генов, входящих в состав СТХф и/шиг VPI-2. Вместе с тем на основе секвенирования гена tcpA из ОП VPI-1 и анализа полученных данных были обнаружены штаммы холерных вибрионов эльтор с гибридным' геном tcpA, имеющим значительную область гомологии с геном tcpA холерных вибрионов классического биовара. Хотя'частота встречаемости таких изолятов невелика, тем не менее эти данные свидетельствуют о том, что в современный период происходит горизонтальный перенос генов вирулентности от V. cholerae cholerae к V. cholerae eltor. В целом, из анализа представленных данных очевидно, что утрата генетического материала играет ведущую роль в- формировании генетически измененных штаммов. Следует особо отметить тот факт, что клинические штаммы также оказались генетически неоднородными из-за нестабильности геномных островов VPI-2, VSP-1 и VSP-2. Выявленное генетическое разнообразие природных штаммов свидетельствует о продолжающихся изменениях генома возбудителя холеры эльтор, в результате которых могут сформироваться новые варианты патогенных клонов с новыми диагностически значимыми и вирулентными свойствами.

Полученные фундаментальные данные являются основой для решения ряда прикладных вопросов. Показана возможность использования риботипирования и RAPD-ПЦР-типирования для дифференциации предпандемических и пандемических штаммов, первые из которых до сих пор выделяются как от больных диареей, так и из внешней среды. Кроме того, полученные данные о наличие (или отсутствии) в геноме более 124 природных штаммов, выделенных на разных территориях и в различные годы (1910-2005 гг.), 20-25 структурных и регуляторных генов, локализованных как в коровой части хромосомы так и на мобильных элементах, будут использованы для генетической паспортизации штаммов V. cholerae биовара эльтор, хранящихся в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб".

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Нефедов, Константин Сергеевич, Саратов

1. Адамов А. К., Наумшина М. С. Холерные вибрионы. Саратов. -1984. -328 с.

2. Андрусенко ИТ., Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Подосинникова Л.С., Иванова С.М. Холерные вибрионы 01 и 0139 серогрупп: чувствительность к антибиотикам в период седьмой пандемии // Журн. микробиол. 2008. -№ 3. - С. 107-114.

3. Бароян О.В. Холера Эль-Тор. Москва. -1971. - 254 с.

4. Гинцбург A.M., Ильина Т.С., Романова Ю.М. "Quorum sensing" или социальное поведение бактерий // Журн. микробиол. 2003. - № 5. - С. 86-93.

5. Ерошепко Г.А. Молекулярно-генетический анализ штаммов Vibrio cholerae 0139: Дисс. . док. биол. наук. Саратов. - 2004.-298 с.

6. Жуков-Вережников Н.Н., Мусабаев И.К., Завьялова Н.К. Клиника, лечение и профилактика холеры. Ташкент. - 1966. - 438 с.

7. Заднова С.П., Лозовский Ю.В. Механизмы секреции грамотрицательныхбактерий // Пробл. особо опасных инф. 2005. — Вып. 90. - С. 11-16.

8. Ильина Т.С., Смирнов Г.Б. Мигрирующие генетические элементы и их роль в эволюции // Итоги науки и техники. 1979. — № 10. - С. 99-153.

9. Ильина Т.С. Транспозоны бактерий и способы их перемещений // Генетика. 1986.-Т. 22. -№ 11.-Р. 2572-2582.

10. Ильина Т.С. Структурная организация и механизмы перемещений генных кассет, кодирующих резистентность к антибиотикам и факторы вирулентности бактерий // Молекул, генетика. — 2001. № 1. - С. 3-12.

11. Ильина Т.С., Романова Ю.М. Геномные острова бактерий: организация, функции, роль в эволюции // Молекул, биол. 2002. - Т. 36. - № 2. - С. 228-239.

12. Ильина Т.С. Механизмы горизонтального переноса генов: роль бактериофагов и интегронов в эволюции патогенных бактерий // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 2003. - № 4. - С. 3-10.

13. Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург A.J1. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития // Генетика. 2004. - Т. 40. - № 11. - С. 1445-1456.

14. Ильина Т.О. Суперинтегроны бактерий источники новых генов с адаптивными функциями // Генетика. - 2006. - Т. 42. - № 11. - С. 15361546.

15. Инструкция по контролю специфической стерильности экспериментальных препаратов, приготовленных из культур чумного и холерного микробов. Утверждено ГУКИ МЗ СССР. Москва. - 1982 г.

16. Ковалевская Н.П. Мобильные генные кассеты и интегроны // Молекулярная биология. 2002. - Т. 36. - № 2. - С. 261-267.

17. Кутырев В.В., Смирнова Н.И. Эпидемически опасные штаммы холерного вибриона: молекулярно-генетические аспекты их происхождения и эволюции // Пробл. особо опасных инф. 2004. - Вып. 88. - С. 5-9.

18. Лабораторная диагностика холеры. Методические указания МУ 4.2.221807. Москва. - 2007.

19. Литвин В.Ю. Экосистемный пусковой механизм эпидемического проявления сапронозов (на примере холеры эльтор) // Журн. микробиол. -1996. — № 3. С. 11-15.

20. Литвин В.Ю., Марамович А.С., Гинцбург А.Л. Стратегия адаптивной изменчивости холерных вибрионов в природных водоемах // Вестник РАМН. -2001. -№ 11. -С. 20-25.

21. Ломов Ю.М. Эволюция возбудителя холеры и прогноз по этой инфекции на ближайшее будущее // Эпидемиол. и инфекц. болезни. 2004. - № 1. — Р. 7-12.

22. Ломов Ю.М. Холера и проблемы биотерроризма // Эпидемиол. и инфекц. болезни 2008. - № 2. - С. 4-6.

23. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Пер с анг. Москва. - 1984. - 480с.

24. Марамович А.С., Погорелов В.И., Урбанович Л.Я., Шкаруба Т.Т. Холера эльтор в Латинской Америке // Журн. микробиол. 2001. - № 5. - С. 82-90.

25. Марамович А.С., Урбанович Л.Я., Миронова Л.В., Куликалова Е.С. Эволюция эпидемиологии холеры // Журн. микробиол. 2006. - № 6. - С. 63-71.

26. Миндлин С.З., Петрова М.А., Басс И.А., Горленко Ж.М. Происхождение, эволюция и миграция генов лекарственной устойчивости // Генетика. -2006.-Т. 42. -№ 11.-С. 1495-1511.

27. Монахова Е.В., Мнхась И.К., Смоликова Л.М., Мишанькин Б.Н. Изучение генетических детерминант токсинов кассеты вирулентиости и нейраминидазы холерных вибрионов с помощью молекулярного зондирования // Журн. микробиол. 2001. - № 2. - Р. 25-29.

28. Монахова Е.В., Писанов Р.В. Токсины холерных вибрионов // Молекул, генетика.-2005.-№ 1.-С. 7-18.

29. Монахова Е.В., Писанов Р.В., Гончарова Л.А., МИхась Н.К., Непомнящая Н.Б., Асеева Л.Е., Каграманов B.C. Клонирование и экспрессия гена гемагглютинин/протеазы (hapA) Vibrio cholerae в Escherichia coli И Биотехнология. 2006. - № 6. - С. 8-15.

30. Монахова Е.В., Ломов Ю.М., Михась Н.К., Писанов Р.В. Структура и изменчивость неполного СТХ-элемента холерных вибрионов // Проблемы особо опасных инфекций. 2007. - Вып. 93. - С. 58-61.

31. Москвитина Э.А. Современные тенденции в развитии седьмой пандемии холеры // Пробл. особо опасных инф. 2008. - Вып. 95. - С. 22-26.

32. Никитина Г.П., Урюпина Н.В. Методические особенности применения гемолитического теста для дифференциации биотипов холерных вибрионов // Пробл. особо опасных инф. 1974. - Вып. 40. - С. 88-92.

33. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Федоров Ю.М., Подосинникова Л.С., Горобец А.В. Холера в начале XXI века. Прогноз // Журн. микробиол. 2005. - № 3. - С. 44-48.

34. Осин А.В., Ерошенко Г.А., Лозовский Ю.В., Смирнова Н.И. Сравнительный ПЦР-анализ структуры генома вирулентных и авирулентных штаммов Vibrio cholerae серогруппы 0139 // Пробл. особо опасных инф. Саратов, 2003. - № 85 - С. 97-103.

35. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультра-центрифугирование. Москва, -1981. - 288 с.

36. Писанов Р.В., Гончаров Е.К., Монахова Е.В., Алексеева Л.П., Мишанькин Б.Н. Клонирование и экспресиия гена zot (zonula occludens toxin) Vibrio cholerae в Escherichia coli И Молекул, генетика. 2005. — № 1. - С. 28-32.

37. Подосинншсова J1. С. Холерные вибрионы, выделенные на территории СССР в период седьмой пандемии: Автореф. дис. д-ра мед. наук. -Саратов,-1993.-44 с.

38. Романова Ю.М., Ильина Т.С., Гинцбург А.Л. Мобильные генетические элементы и их роль в эволюции патогенных бактерий // Вестник РАМН. — 2001.-№ 11.-С. 15-20.

39. Савостина Е.П., Попов Ю.А., Каштанова Л. Анализ геномного полиморфизма типовых и атипичных штаммов возбудителя чумы сиспользованием ПЦР с универсальными праймерами // Молекул, генетика,микробиол. и вирусол. 2004. - № 1. - С. 23-31.

40. Смирнов Г.Б. Механизмы приобретения и потери генетической информации бактериальными геномами // Успехи современной биологии. -2008. Т. 128. - № 1. - С. 52-76.

41. Смирнова Н.И. Возбудитель холеры новой 0139-серогруппы: молекулярно-геиетические особенности и происхождение // Молекул, генетика. 2002. - № 3. - С. 23-33.

42. Смирнова Н.И., Костромитина Е.А., Челдышова Н.Б., Кутырев В.В. Отличия в составе генов вирулентности в штаммах Vibrio cholerae eltor, выделенных из разных источников на территории Туркменистана. // Молекул, генетика. 2002. - № 4. - С. 2-18.

43. Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Эволюция генома возбудителя холеры // Молекул, генетика. 2004. - № 4. - С. 3-13.

44. Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Сравнительный анализ молекулярно-генетических особенностей геномов и их эволюционных преобразований у возбудителя холеры, чумы и сибирской язвы // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 2006. - № 2. - С. 9-19.

45. Стогова А.Г. Стандартная методика определения гемолитической активности холерных вибрионов эльтор И 12-я межресп. науч.-практ. конф. противочумн. учрежд. Сред. Азии и Казахстана по профилакт. чумы. — Алма-Ата, 1985. - С. 285-286.

46. Телесманич Н.Р. Общебиологическая роль гемолизина холерныхвибрионов // Int. J. Immunorehabilitation. 2002. - Т. 4. - № 2. - С. 222-227.

47. Тудор В., Страти И. Оспа. Холера. Бухарест. -1981. - 360 с.

48. Хесин Р.Б. Непостоянство генома. Москва. -1984. — 472 с.

49. Челдышова Н.Б. Дифференциация штаммов Vibrio cholerae 01 с различной эпидемической значимостью на основании четырех генов вирулентности: ctxA, tcpA, toxR и hapA: Дисс. . канд. мед. наук. Саратов, - 2002. - 173 с.

50. Attridge S.R., Voss Е., Manning Р.А. The role of toxin co-regulated pili in the pathogenesis of Vibrio cholerae 01 EbTor // Microb. Pathog. — 1993. Vol. 15. -P. 421-431.

51. Beck N.A., Krukonis E.S., DiRita V.J. TcpH Influences virulence gene expression in Vibrio cholerae by inhibiting degradation of the transcription activator TcpP // J. Bacteriol. 2004. - Vol. 186, N 24. - P. 8309-8316.

52. Behari J., Stagon L., Calderwood S.B. pepA, a gene mediating pH regulation of virulence genes in Vibrio cholerae // J. Bacteriol. 2001. - Vol. 183, N 1. - P. 178-188.

53. Benitez J.A., Silva A.J., Finkelstein R.A. Environmental signals controlling production of hemagglutinin/protease in Vibrio cholerae // Infect. Immun. -2001. Vol. 69, N-10. - P. 6549-6553.

54. Bhaskaran К., Rouley D., Nutritional stadies on Vibrio cholerae II Gen. Microbiol. 1956. - Vol. 15, N 2. - P. 417 - 422.

55. Bik E.M., Bunschoten A.E., Gouw R.D., Mooi F.R. Genesis of the novel epidemic Vibrio cholerae 0139 strain: evidence for horizontal transfer of genes involved in polysaccharide synthesis // The EMBO Journal. 1995. - Vol. 14, N 2.-P. 209-216.

56. Bina J., Zhu J., Dziejman M., Faruque S., Calderwood S., Mekalanos J. ToxR regulon of Vibrio cholerae and its expression in vibrios shed by cholera patients // Proc. Natl. Acad. Sci. 2003. - Vol. 100, N 5. - P. 2801-2806.

57. Biscri L., Bouvier M., GuMrout A.-M. Boisnard S., Mazel D. Comparative study of class 1 integron and Vibrio cholerae superintegron integrase activites // J. Bacterid.- 2005. -Vol. 185, N5.-P. 1740-1750.

58. Booth B.A., Boesman-Finkelstein M., Finkelstein R.A. Vibrio cholerae hemagglutinin/protease nicks cholera enterotoxin // Infect. Immun. 1984. -Vol. 45.-P. 558-560.

59. Boyd E.F., Waldor M.K. Evolutionary and functional analyses of variants of the toxin-coregulated pilus protein TcpA from toxigenic Vibrio cholerae non-01/non-0139 serogroup isolates // Microbiol. 2002. - Vol. 148. - P. 16551666.

60. Carroll P.A., Tashima K.T., Rogers M.B., DiRita V.J., Calderwood S.B. Phase variation in tcpH modulates expression of the ToxR regulon in Vibrio cholerae // Mol. Microbiol. 1997.-Vol. 25, N6.-P. 1099-1111.

61. Chastel C. The centenary of the discovery of the Vibrio El Tor (1905) or dubious beginnings of the seventh pandemic of cholera // Hist. Sci. Med. 2007. - Vol. 41, N 1. -P. 71-82.

62. Chattopadhyay K., Bhattacharyya D., Banerjee K.K. Implication of amphiphilicity and lipid-induced conformational change for its pore-forming activity // Eur. J. Biochem. 2002. - Vol. 269. - P. 4351-4358.

63. Chen Y., Stine O.C., Morris J.G., Johnson J.A. Genetic variation of capsule/LPS biogenesis in two serogroup 031 Vibrio cholerae isolates // FEMS Microbiol. Lett.-2007.-Vol. 273.-P. 133-139.

64. Chiavelli D.A., Marsh J.W., Taylor R.K. The mannose-sensitive hemagglutinin of Vibrio cholerae promotes adherence to zooplankton // Appl. and Envir. Microbiol. 2001. - Vol. 67, N. 7. - P. 3220-3225.

65. Clark Ch.A., Purins L. Kaewracon P. The Vibrio cholerae 01 chromosomal integron // Microbiol. 2000. - Vol. 146. - P. 2605-2612.

66. Cotter P.A., DiRita V.J. Bacterial virulence gene regulation: an evolutionary perspective // Annu. Rev. Microbiol. 2000. - Vol. 54. - P. 519-565.

67. Crawford J.A., Kaper J.B., DiRita V.J. Analysis of ToxR-dependent transcription activation of ompU, the gene encoding a major envelope protein in Vibrio cholerae II Mol. Microbiol. 1998. - Vol. 29. - P. 235 - 246.

68. Dalsgaard A., Forslund A., Tam N.V., Vinh D.X., Cam P.D. Cholera in

69. Vietnam: changes in genotypes- and emergence of class Is integrons containing aminoglycoside resistance gene cassettes in Vibrio cholerae 01- strains isolated from 1979 to 1996// J. Clinical Microbiol. 1999. -Vol. 37, N 3. - P. 734-741.

70. Dalsgaard A., Forslund A., Serichantalergs O., Sandvang D. Distribution and' content of class 1 integrons in different- Vibrio cholerae O-serotype strains isolated in Thailand;// AAC. 2000. — Vol. 44, N 5. — P. 1315-132L

71. Davis B.M., Lawson E.H., Sandkvist M., Ali A., Sozhamannan S., Waldor M:K. Convergence of the secretory pathways for cholera toxin and< the filamentousiphage, CTXcp // Science. 2000. - Vol. 288. - P: 333-335.

72. Davis B.M., Kimsey H.Hi, Kane A.V., Waldor M.K. A satellite phage-encoded antirepressor induces repressor aggregation and cholera, toxin, gene transfer // The EMBO Journal. 2002. - Vol. 21; N 16. - P. 4240-4249.

73. Davis B.M., Waldor M.K. Filamentous phages linked to virulence of' Vibrio cholerae // Current Opinion in Microbiol: 2003. - Voir 6. - P. 35-42.

74. Dutta N.K., Habbu M.K. Experimental'cholera in infant rabbits: a method4 for chemotherapeutic investigation // Brit. J. Pharmacol. 1955. — Vol. 256, N 23. -P. 12252 - 12256.

75. Dziejman M., Balon E., Boyd D.- Fraser C.M., Heidelberg J.F., Mekalanos J.J: Comparative genomic analysis of Vibrio cholerae: Genes that correlate with cholera endemic and pandemic disease // Proc. Natl. Acad. Sci. 2002. - Vol. 99.-P. 1556-1561'.

76. Farfan M., Minana-Galbis D., Fuste M.C., Loren J.G. Allelic diversity and population structure in Vibrio cholerae 0139 Bengal based' on nucleotidesequence analysis//J. Bacteriol. 2002. - Vol. 184, N5.-P. 1304-1313.

77. Faruque S.M., Albert M.J., Mekalanos J.J. Epidemiology, genetics, and ecology of toxigenic Vibrio cholerae H Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998a. - Vol. 62, N. 4.-P. 1304-1314.

78. Faruque S.M., Asadulghani, Rahman M.M., Waldor M.K., Sack D.A. Sunlight-induced propagation of the lysogenic phage encoding cholera toxin // Infect. Immun. 2000. - Vol. 68, N 8. - P. 4795-4801.

79. Faruque S.M., Biswas K., Udden S.M.N, Ahmad Q.S., Sack D.A., Nair G.B., Mekalanos J.J. Transmissibility of cholera: In vivo-formed biofilms and their relationship to infectivity and persistence in the environment // Proc. Natl. Acad.

80. Sci. USA. 2006. - Vol. 103, N. 16. - P. 6350-6355.

81. Faruque S.F., Nair G.B. Vibrio cholerae Genomics and Molecular Biology. -Norfolk, UK 2008. - 218 p.

82. Figueroa-Arredondo P., Heuser J.E., Akopyants N.S., Morisaki J.H., Giono-Cerezo S., Enriquez-Rincon F., Berg D.E. Cell vacuolation caused by Vibrio cholerae hemolysin // Infect. Immun. 2001. - Vol. 69, N 3. - P. 1613-1624.

83. Fields P. I., Popovic Т., Wachsmuth K., Olsvik O. Use of polymerase chain reaction for detection of toxigenic Vibrio cholerae Ol strains from the Latin American cholera epidemic // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30. - P. 2118— 2121.

84. Fiore A.E., Michalski J.M., Russell R.G., Sears C.L., Kaper J.B. Cloning, characterization, and chromosomal mapping of a phospholipase (lecithinase) produced by Vibrio cholerae II Infect. Immun. 1997. - Vol. 65, N 8. - P. 31123117.

85. Flemming H.C., Neu T.R., Woznaik D.J. The EPS matrix: the "house of biofilm cells" // J. Bacteriol. 2007. - Vol. 189, N 22. - P. 7945-7947.

86. Fluit A.C., Schmitz F.J. Resistance integrons and super-integrons // Clin. Microbiol. Infect. 2004. - Vol. 10. - P. 272-288.

87. Fogel M.A., Waldor M.K. Distinct segregation dynamics of the two Vibrio cholerae chromosomes // Mol. Microbiol. 2005. - Vol. 55. - P. 125-136.

88. Franzon V.L., Barker A., Manning P.A. Nucleotide sequence encoding the mannose-fucose-resistant hemagglutinin of Vibrio cholerae О1 and construction of a mutant //Infect. Immun. 1993. - Vol. 61, N 7. - P. 3032-3037.

89. Freter R., O'Brien P.C., Macsai M.S. Role of ehemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies // Infect. Immun. — 1981. — Vol. 34.-P. 234-240.

90. Galen J.E., Ketley J.M., Fasano A., Richardson S.H., Wasserman S.S., Kaper J.B. Role of Vibrio cholerae neuraminidase in the function of cholera toxin // Infect. Immun. 1992. - Vol. 60, N 2. - P. 406-415.

91. Gardel C.L., Mekalanos J.J. Alterations in Vibrio cholerae motility phenotypes correlate with changes in virulence factor expression // Infect. Immun. 1996. -Vol. 64, N6.-P. 2246-2255.

92. Garg P., Aydanian A., Smith D., Morris G., Nair G.B., Stine O.C. Molecular epidemiology of 0139 Vibrio cholerae: mutation, lateral gene transfer, and founder flush II Emerging Infectious Diseases. 2003. - Vol. 9, N 7. - P. 810814.

93. Guidolin A., Manning P.A. Genetics of Vibrio cholerae and its bacteriophages I I Microbiol. Rev. 1987. - Vol. 51, N 2. - P. 285-298.

94. Hacker J., Blum-Oehler G., Miihldorfer I., Tschape H. Pathogenicity islands of virulent bacteria: structure, function and impact on microbial evolution // Mol. Microbiol. 1996. - Vol. 23, N 6. - P. 1089-1097.

95. Hacker J., Kaper J.B. Pathogenicity islands and the evolution of microbes // Annu. Rev. Microbiol. 2000. - Vol. 54. - P. 641-679.

96. Hall R.M., Stokes H.W. Integrons: novel DNA elements which capture genes by site-specific recombination // Genetica. 1993. - Vol. 90. - P. 115-132.

97. Hammer B.K., Bassler B.L. Quorum sensing controls biofilm formation in Vibrio cholerae // Mol. Microbiol.-2003. Vol. 50. № l.-P. 101-114.

98. Hanne L.P., Finkelstein R.A. Characterization' and distribution of the hemagglutinins production by Vibrio cholerae II Infect. Immun. 1982. - Vol. 36. - P. 209-214.

99. Hartley D.M., Morris Jr. J.G., Smith D.L. Hyperinfectivity: a critical element in the ability of V. cholerae to cause'epidemics?'// PLoS Medicine. 2006. - Vol. 3.-P. 0063-0069.

100. Hase C.C., Finkelstein R.A. Cloning and' nucleotide sequence of the Vibrio cholerae hemagglutinin/protease (HA/protease) gene and construction of an HA/protease-negative strain // J. Bacteriol. 1991. - Vol. 173. - P. 3311 - 3317.

101. Heilpern A.J., Waldor M.K. pIIICTX, a predicted СТХф minor coat protein, can expand the host range of coliphage fd to include Vibrio cholerae // J. Bacteriol. -2003.-Vol. 185, N3.-P. 1037-1044.

102. Hitchcock P.J., Brown T.M.1 Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels // J. Bacteriol.- 1983.-Vol. 154, N l.-P. 269-277.

103. Holmgren J. Action of cholerae toxin and the prevention and treatment of cholerae. //Nature 1981. - Vol. 292, N 5822. - P. 413-417.

104. Jermyn W.S., Boyd E.F. Characterization of-a noveb Vibrio pathogenicity island (VPI-2) encoding neuraminidase (nanH) among toxigenic Vibrio cholerae isolates //Microbiol. 2002. - Vol. 148. - P. 3681-3693.

105. Jermyn W.S., Boyd E.F. Molecular evolution of Vibrio pathogenicity island-2 (VPI-2): mosaic structure among Vibrio cholerae and Vibrio mimicus naturalisolates//Microbiol. 2005. - Vol. 151.-P. 311-322.

106. Johnson S.R., Liu B.C., Romig W.R. Auxotrophic mutations induced by Vibrio cholerae mutator phaga VcAl // FEMS Microbiol. Lett. 1981. - Vol. 11, N 1. -P. 13-16.

107. Johnson G., Holmgren J., Svennerholm A. Analysis of expression of toxin-coregulated pili in classical and El Tor Vibrio cholerae 01 in vitro and in vivo II Infect. Immun. 1992. - Vol. 60, N 10. - P. 4278-4284.

108. Johnson J.A., Morris J.G., Kaper J.B. Gene encoding zonula occludens toxin (zot) does not occur independently from cholera enterotoxin genes (ctx) in Vibrio cholerae // J. Clinical Microbiol. 1993. - Vol. 31, N 3. -P. 732-733.

109. Karaolis D.K., Johnson J.A., Bailey C.C., Boedeker E.C., Kaper J.B., Reeves P.R. A Vibrio cholerae' pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains // Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. - Vol. 95. - P. 3134-3139.

110. Kato J., Zhu J., Liu C., Moss J. Enhanced Sensivity to Cholera Toxin in ADP-Ribosylarginine Hydrolase-Deficient Mice // Mol. Cell. Biol. 2007. - Vol. 27, N 15.-P. 5534-5543.

111. Keasler S. P., Hall R.N. Detecting and biotyping V. cholerae 01 with multiplex polimerase chain reaction //Lancet. 1993 - Vol. 341. - P. 1661.

112. Keymer D.P., Miller M.C., Schoolnik G.K., Boelim A.B. Genomic and phenotypic diversity of coastal Vibrio cholerae strains is linked to environmental factors I I Appl. and Envir. Microbiol. 2007. - Vol. 73, N 11. - P. 3705-3714.

113. Kirn Т.J., Jude В.A., Taylor R.K. A colonization factor links Vibrio cholerae environmental survival and human infection // Nature. 2005. - Vol. 438. - P. 863-866.

114. Kirn T.J., Taylor R.K. TcpF is a soluble colonization factor and protective antigen secreted by El Tor and classical 01 and 0139 Vibrio cholerae serogroups // Infect. Immun. 2005. - Vol. 73, N 8. - P. 4461-4470.

115. Krishnan H.H., Ghosh A., Paul K. Chowdhury R. Effect of anaerobiosis on expression of virulence factors in Vibrio cholerae II Infect. Immun. — 2004. — Vol. 72, N7.-P. 3961-3967.

116. Krukonis E.S., Yu R.R., DiRita V.J. The Vibrio cholerae ToxR/TcpP/ToxT virulence cascade: distinct roles for two membrane-localized transcriptional activators on a single promoter // Mol. Microbiol. 2000. - Vol. 38, N 1. - P. 67-84.

117. Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genctics Analysis and sequence alignment // Briefings in Bioinformatics. 2004. - Vol. 5. - P. 150-163.

118. Labbate M., Boucher Y„ Joss M.J., Michael C.A., Gillings M.R., Stokes H.W. Use of chromosomal integrons arrays as a phylogenetic typing system for Vibrio cholerae pandemic strains // Microbiol. 2007. - Vol. 153. - P. 1488-1498.

119. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T // Nature. 1970. - Vol. 227. - P. 680 - 685.

120. Lan R., Reeves P.R. Pandemic spread of cholera: genetic diversity andrelationships within the seventh pandemic clone of Vibrio cholerae determined by amplified fragment length polymorphism // J. Clinical Microbiol. 2002. -Vol. 40, N 1.-P. 172-181.

121. Lazar S., Waldor M.K. ToxR-independent expression of cholera toxin from die replicative form of СТХф // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66, N 1. - P. 394-397.

122. Li C.C., Merrell D.S., Camilli A., Kaper J.B. ToxR interferes with CRP-dependent transcriptional activation of ompT in Vibrio cholerae II Mol. Microbiol. 2002. - Vol. 43, N 6. - P. 1577 - 1589.

123. Liu Z., Stirling F.R., Zhu J. Temporal Quorum-Sensing Induction RegulatesI

124. Vibrio cholerae Biofilm Architecture // Infect. Immun. 2007. - Vol. 75, N 1. -P. 122-126.

125. Marsh J.W., Taylor R.K. Genetic and transcriptional analyses of the Vibrio cholerae mannose-sensitive hemagglutinin type 4 pilus gene locus // J. Bacteriol.- 1999. Vol.181, N 4. - P.l 110-1117.

126. Mazel D., Dychinco В., Webb V.A., Davies J. A distinctive class of integrons in the Vibrio cholerae genome // Science. 1998. - Vol. 187, N 5. - P. 1740-1750.

127. Mazel D. Integrons: agents of bacterial evolution // Nature Rev. Microbiol.2006.-Vol.4.-P. 608-620.

128. McLeod S.M., Waldor M.K. Characterization of XerC- and XerD-dependent CTX phage integration in Vibrio cholerae И Mol. Microbiol. 2004. - Vol. 54, N4.-P. 935-947.

129. McLeod S.M., Kimsey H.H., Davis B.M., Waldor M.K. СТХф and Vibrio cholerae: exploring a newly recognized type of phage-host cell relationship // Mol. Microbiol. 2005. - Vol. 57, N 2. - P. 347-356.

130. Mekalanos J.J., Moseley S.L., Murphy J.R., Falkow S. Isolation of enterotoxin structural gene deletion mutations in Vibrio cholerae induced by two mutagenic vibriophages I I Genetics. 1982. - Vol. 79. - P. 151-155.

131. Mekalanos J.J., Rubin E.J., Waldor M.K. Cholera: molecular basis for emergence and pathogenesis // FEMS Immun. Med. Microbiol. 1997. - Vol. 18.-P. 241-248.

132. Miller M.B., Skorupski K., Lenz D.H., Taylor R.K., Bassler B.L. Parallel quorum sensing systems converge to regulate virulence in Vibrio cholerae П Cell.-2002.-Vol. 110.-P. 303-314.

133. Mitra S.N., Mukhopadhyay R., Ghosh A.N., Ghosh R.K. Conversion of Vibrio eltor MAK757 to classical biotype: role of phage PS 166 // Virology. 2000. -Vol. 273.-P. 36-43.

134. Mooi F.R., Bik E.B. The evolution of epidemic Vibrio cholerae strains // Trends Microbiol. 1997. - Vol. 5, N 4. - P. 161-165.

135. Moorthy S., Watnick P.I. Genetic evidence that the Vibrio cholerae monolayer is a distinct stage in biofilm development // Mol. Microbiol. 2004. - Vol. 52. - P. 573-587.

136. Moshioni M., Tombola F., Bernard M., Coelho A., Zitzer A., Zoratti M., Montecucco C. The Vibrio cholerae haemolysin anion channel is required for cell vacuolation and death // Cell. Microbiol. 2002. - Vol. 4. - P. 397-409.

137. Murley Y.M., Carroll P.A., Skorupski K., Taylor R.K., Calderwood S.B. Differential transcription of the tcpPH operon confers biotype-specific control of the Vibrio cholerae ToxR virulence regulon // Infect. Immun. 1999. - Vol. 67, N 10.-P. 5117-5123.

138. Murphy R.A., Boyd E.F. Three pathogenicity islands of Vibrio cholerae canexcise from the chromosome and form circular intermediates // J. Bacteriol. -2008. Vol. 190, N 2. - P. 636-647.

139. Nandi В., Nandy R.K., Vicente A.C.P., Ghose A.C. Molecular characterization of a new variant of toxin-coregulated pilus protein (TcpA) in a toxigenic non-01/non-0139 strain of Vibrio cholerae // Infect. Immun. 2000. - Vol. 68, N 2. -P. 948-952.

140. Nye M.B., Taylor R.K. Vibrio cholerae H-NS domain structure and function with respect to transcriptional repression of ToxR regulon genes reveals differences among H-NS family members // Mol. Microbiol. 2003. - Vol. 50, N2.-P. 427-444.

141. O'Shea Y.A., Boyd E.F. Mobilization of the Vibrio pathogenicity island between Vibrio cholerae isolates mediated by CP-T1 generalized transduction // FEMS Microbiol. Letters.-2002.-Vol. 214.-P. 153-157.

142. Olson R., Gouaux E. Vibrio cholerae cytolysin is composed of an a-hemolysin-like core // Protein Science, 2003. - Vol. 12. - P. 379-383.

143. Ottemann K.M., Miller J.F. Roles for motility in bacterial-host interactions // Mol. Microbiol. 1997.-Vol. 24.-P. 1109-1117.

144. Parsot C., Mekalanos J.J. Expression of Vibrio cholerae gene encoding aldehyde dehydrogenase is under control of ToxR the cholera toxin transcriptional activator//J. Bacteriol. 1991.-Vol. 173, N. 9.-P. 2842-2851.

145. Prouty M.G., Osorio C.R., Klose K.E. Characterization of functional domains of the Vibrio cholerae virulence regulator ToxT // Mol. Microbiol. 2005. - Vol. 58, N 4. - P. 1143-1156.

146. Pruzzo C., Vezzulli L., Colwell R.R. Global impact of Vibrio cholerae interactions with chitin // Envir. Microbiol. 2008. - Vol. 10, N 6. - P. 14001410.

147. Quinones M., Kimsey H.H., Waldor M.K. LexA cleavage is required for CTX prophage induction // Mol. Cell. -2005. Vol. 17. - P. 291-300.

148. Reidl J., Klose K.E. Vibrio cholerae and cholera: out of the water and into the host // FEMS Microbiol. Rev. 2002. - Vol. 26. - P. 125-139.

149. Requera G., Kolter R. Virulence and the environment: a novel role for Vibrio cholerae toxin-coregulated pili in biofilm formation on chitin // J. Bacteriol. -2005.-Vol. 187, N 10.-P. 3551-3555.

150. Rollenhagen J.E., Kalsy A., Cerda F., John M., Harris J.B., LaRocque R.C., Qadri F., Calderwood S.B., Taylor R.K., Rayn E.T. Transcutaneous immunization with toxin-coregulated pilin a induces protective immunity against

151. Vibrio cholerae 01 El Tor challenge in mice // Infect. Immun. 2006. - Vol. 74, N 10.-P. 5834-5839.

152. Rowe-Magnus D.A., Guerout A.-M., Ploncard P., Dychinco В., Davies J., Mazel D. The evolutionary history of chromosomal super-integrons provides an ancestry for multiresistant integrons // Proc. Natl. Acad. Sci. 2001. - Vol. 98, N2.-P. 652-657.

153. Rowe-Magnus D.A., Guerout A.-M., Mazel D. Bacterial resistance evolution by recruitment of super-integron gene cassettes // Mol. Microbiol. 2002. - Vol. 43, N6.-P. 1657-1669.

154. Salles C. A., Momen H., Vicente A. C. P., Coelho A. Vibrio cholerae in South America: polymerase chain reaction and zymovar analysis // Trans R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1993. - Vol. 87. - P. 272.

155. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - Vol. 74 - N. 12. - P.5463-5467.

156. Silva A.J., Leitch G.J., Camilli A., Benitez J.A. Contribution of hemagglutinin/protease and motility the pathogenesis of El Tor biotype cholera // Infect. Immun. 2006. - Vol. 74, N 4. - P. 2072-2079.f I

157. Sinha S., Chakraborty R., De K., Khan A., Datta S., Ramamurthy Т., Bhattacharya S.K., Takeda Y., Nair G.B. Escalating association of Vibrio cholerae 0139 with cholera outbreaks in India // J. Clinical Microbiol. 2002. -Vol. 40, N 7. - P. 2635-2637.

158. Sperandio V., Bailey C., Giron J.A., DiRita V.J., Silveira W.D., Vettore A.L., ' Kaper J.B. Cloning and characterization of the gene encoding the OmpU outermembrane protein of Vibrio cholerae II Infect. Immun. 1996. - Vol. 64, N 12. - P. 5406 - 5409.

159. Svennerholm A.-M., Wiklund G. Rapid GMi-enzyme-linked immunosorbent assay with visual reading for identification of Escherichia coli heat-labile enterotoxin // J. Clin. Microbiol. 1983. - Vol. 17. - P. 262 - 270.

160. Tagami Y., Ikigai H., Oishi Y. AFM observations of (DMPC/cholesterol) mixed monolayer on agueous solution of Vibrio cholerae hemolysin // Physicochem. Eng. Aspects. 2006. - Vol. 284. - P. 475-479.

161. Tagomori K., Iida Т., Honda T. Comparison of genome structures of vibrios, bacteria possessing two chromosomes // J. Bacteriol. 2002. - Vol. 184, N 16. -P. 4351-4358.

162. Tamayo R., Schild S., Pratt J.T., Camilli A. Role of cyclic Di-GMP during El Tor biotype Vibrio cholerae infection: characterization of the in v/vo-induced cyclic Di-GMP phosphodiesterase CdpA // Infect.Immun. 2008. - Vol. 76, N 4.-P. 1617-1627.

163. Terashima H., Fukuoka H., Yakushi Т., Kojima S., Homma M. The Vibriomotor proteins, MotX and MotY, are associated with the basal body of Na+-driven flagella and required for stator formation // Mol. Microbiol. 2006. - P. 1-11.

164. Thelin K.H., Taylor R.K. Toxin-coregulated pilus, but not mannose-sensitive Hemagglutinin, is required for colonization by Vibrio cholerae 01 El Tor biotype and 0139 Strains // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64, N 7. - P. 28532856.

165. Trucksis M., Galen J.E., Mishalski J., Fasano A., Kaper. JB. Accessory cholera enterotoxin (Ace), the third toxin of a Vibrio cholerae virulence cassette // Proc. Notl. Acad. Sci. USA. 1993.-Vol. 90.-P. 5267-5271.

166. Vance R.E., Zhu J. Mekalanos J.J. A constitutively active variant of the quorum-sensing regulator LuxO affects protease production and biofilm formation in Vibrio cholerae II Infect. Immun. 2003. - Vol. 71, N 5. - P. 2571-2576.

167. Waldor M.K., Colwell R., Mekalanos J.J. The Vibrio cholerae 0139 serogroup antigen includes an O-antigen capsule and lipopolysaccharide virulence determinants//Microbiol. 1994.-Vol. 91.-P. 11388-11392.

168. Waldor M.K., Mekalanos J.J. Lysogenic Conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin // Science. 1996. - Vol. 272. - P. 1910-1914.

169. Waldor M.K., Tschape H., Mekalanos J.J. A new type of conjugative transposon encodes resistance to sulfamethoxazole, trimethoprim, and streptomycin in Vibrio cholerae 0139 // J. Bacteriology. 1996. - Vol. 178, N 14. - P. 41574165.

170. Waldor M.K., Rubin E.J., Pearson G.D.N., Kimsey H., Mekalanos J.J. Regulation, replication, and integration functions of the Vibrio cholerae CTXcp are encoded by region RS2 // Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 24, N 5. - P. 917926.

171. Waldor М.К., Lazar S., Kimsey H., Williams J., Mekalanos J.J. СТХф: a novel filamentous phage encoding cholera toxin // Bacterial Protein Toxins: Eighth European Workshop. 1998. - Vol. 29. - P. 363-371.

172. Watnick P.I., Kolter R. Steps in the development of a Vibrio cholerae El Tor biofilm // Mol. Microbiol. 1999. - Vol. 34. - P. 586-595.

173. Watnick P.I., Lauriano C.M., Klose K.E., Croal L., Kolter R. The absence of a flagellum leads to altered colony morphology, biofilm development and virulence in Vibrio cholerae 0139 // Mol Microbiol. 2001. - V. 39. - P. 223235.

174. Withey J.H., DiRita V.J. Activation of both acfA and acfD transcription by Vibrio cholerae ToxT requires binding to two centrally located DNA sites in an inverted repeat conformation // Mol. Microbiol. 2005. - Vol. 56, N 4. - P. 1061-1077.

175. Yamaichi Y., Fogel M.A., Waldor M.K. par genes and the pathology of chromosome loss in Vibrio cholerae // Proc. Natl. Acad. Sci. 2007. - Vol. 104, N2.-P. 630-635.

176. Yoon S.S., Mekalanos J.J. 2,3-butanediol synthesis and the emergence of the Vibrio cholerae El Tor biotype // Infect. Immun. 2006. - Vol. 74, N 12. - P. 6547-6556.

177. Yoon S.S., Mekalanos J.J. Decreased potency of the Vibrio cholerae sheathed flagellum to trigger host innate immunity // Infect. Immun. 2008. - Vol. 76, N 3.-P. 1282-1288.

Информация о работе

Нефедов, Константин Сергеевич
кандидата медицинских наук
Саратов, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Сравнительный анализ фенотипических и молекулярно-генетических свойств холерных вибрионов эльтор, выделенных до начала и в период седьмой пандемии холеры - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы