Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фенотипический и молекулярно-генетический анализ измененных вариантов Vibrio cholerae биовара эльтор

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Фенотипический и молекулярно-генетический анализ измененных вариантов Vibrio cholerae биовара эльтор"

На правах рукописи

Шашкова Алена Владимировна

ФЕНОТИПИЧЕСКИЙ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ИЗМЕНЕННЫХ ВАРИАНТОВ VIBRIO CHOLERAE БИОВАРА ЭЛЬТОР

03.02.03 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 8 НОЯ 2012

Саратов-2012

005054464

Работа выполнена в Федеральном казенном учреждении Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

доктор биологических наук Заднова Светлана Петровна

Официальные оппоненты:

Тараненко Татьяна Михайловна, доктор биологических наук, профессор ФК «Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микро£ Роспотребнадзора, ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии протеомики

Швиденко Инна Григорьевна, доктор медицинских наук, профессор ГБОУ В1 «Саратовский государственный медицинский университет I В.И. Разумовского» Минздравсоцразвития Российской Федерации, професс кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии

Ведущая организация:

Федеральное казенное учреждение «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится А' ИХ^и 2012 г. в Л' _часов на заседании совета Д 208.078.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"».

Автореферат разослан $ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного пппртя доктор биологических наук,

старший научный сотрудник

Слудский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность ' проблемы. Холера - особо'опасная инфекционная болезнь с диарейным синдромом, вызываемая токсигенными штаммами Vibrio cholerae. По данным Всемирной Организации Здравоохранения в последние годы в мире ежегодно регистрируется 3,0-5,0 млн. случаев холеры и более 100-120 тыс. человек умирает (Информационный бюллетень ВОЗ, N107, 2011). Современный период характеризуется наличием стойких очагов холеры в Юго-Восточной Азии и Африке. Крупные эпидемии и вспышки холеры на эндемичной территории, занос инфекции из эндемичных очагов практически на все континенты и тенденция к росту мировой заболеваемости определяют неблагоприятный прогноз по холере (Оншценко Г.Г. с соавт., 2005; Москвитйна Э.А. с соавт, 2011, 2012). Возникновение эпидемических осложнений по холере в России связано с реальной возможностью ее завоза из зарубежных стран, неблагополучных по этой инфекции. Так, с 2005 г. по 2010 г. в России было зарегистрировано 8 случаев завоза холеры из Индии и Таджикистана (Москвитина Э.А. с соавт, 2011).

К настоящему времени известно о семи пандемиях холеры, среди которых первые шесть (1817-1923 гг.) предположительно были вызваны V. cholerae 01 классического биовара (Бароян О.В., 1971). Одной из характерных особенностей этого возбудителя является его высокая патогенность, обусловленная эффективной продукцией основных факторов вирулентности - токсин-корегулируемых пилей адгезии (ТИТА) и холерного токсина (ХТ), которые соответственно определяют развитие двух ключевых этапов инфекционного процесса - колонизацию холерными вибрионами тонкого кишечника и развитие профузной диареи (Kaper J.B. et al., 1995; De Haan L.et al., 2004). Однако к началу прошлого столетия на эндемичных по холере территориях эти вибрионы были постепенно вытеснены V. cholerae 01 серогруппы, но другого биовара — эльтор. Вследствие этого события возбудителем текущей,' 7-ой, пандемии холеры (с 1961 г. по настоящее время) стали токсигенные штаммы V. cholerae OI биовара эльтор, отличающиеся от классических вибрионов по ряду фенотипических и генетических свойств (Бароян О.В., 1971; Wáldor М.К. et al., 1996; Dziejman М. et al., 2002). К одним из основных генетических различий классического и эльтор биоваров относят отличия в нуклеотидных последовательностях двух генов, входящих в состав профага СТХф - гена ctxB из оперона cíxAB, кодирующего биосинтез ХТ, и гена-репрессора rsíR. Вследствие этого аллели указанных генов у классических вибрионов обозначены как

ctxBClass (или с(хВ1^

и rstR ass, у

вибрионов эльтор - ctxBE"or (или ctxB3) и rstRE!lor. Разная нуклеотидная последовательность генов ctxBl и ctxB3 обуславливает различия в аминокислотной последовательности В-субъединицы их токсинов, поэтому различают ХТ 1-го типа, продуцируемый классическими вибрионами, и ХТ 2-го типа, характерный для вибрионов эльтор (Olsvik О. et al., 1993; Waldor М.К. et al., 1996, 1997).

В течение 7-ой пандемии холеры геном ее возбудителя претерпел различные изменения. Одно из важнейших событий в эволюции этого возбудителя в современный период - возникновение новых генетически измененных вариантов (геновариантов) с повышенной вирулентностью, в геноме профага СТХ<р которых содержится аллель ctxBl (Nair G.B. et al., 2002; Monta M. et al., 2008; Safa A. et al., 2010; Borkakoty B. et al., 2012). К настоящему времени эти геноварианты стали не только доминировать во многих странах Азии и Африки, но и проникать на новые территории (Гаити, Доминиканская Республика, Венесуэла) (Москвитина Э.А. с соавт., 2012; Nair G.B. et al., 2006; Grim CJ. et al., 2010; Safa A. et al., 2010; Tappero J.W. et al. 2011). В Российской Федерации, согласно последним данным, эпидемические вспышки и единичные случаи холеры во время седьмой пандемии были вызваны как типичными штаммами, так и измененными вариантами V. cholerae биовара эльтор, завезенными из различных стран Азии (Миронова JI.B. с соавт., 2010; Савельев В.Н. с соавт., 2010; Смирнова Н.И. с соавт., 2010). Однако в нашей стране отсутствуют комплексные диагностические тест-системы, позволяющие одновременно проводить идентификацию штаммов холерного вибриона 01 серогруппы, определять их биовар и дифференцировать типичные и генетически измененные варианты V. cholerae биовара эльтор. Несмотря на то, что геноварианты биовара эльтор уже обнаружены на территории России и стран ближнего зарубежья, все еще остаются неизученными их фенотипические свойства, не исследована вирулентность и устойчивость к антибиотикам. Недостаточно сведений о структуре профага СТХ<р и острова патогенности VPI-1, несущих основные гены вирулентности ctxAB и tcpA-F, кодирующие продукцию XT и ТКПА. Вместе с тем, изучение структуры генома и экспрессии генов вирулентности и жизнеобеспечения измененных вариантов эльтор необходимо для оценки их генетического разнообразия и выяснения механизма образования.

Все вышеперечисленное определяет актуальность диссертационной работы, целью которой является проведение сравнительного анализа фенотипических и молекулярно-генетических свойств типичных штаммов и измененных вариантов V. cholerae 01 серогруппы биовара эльтор, выделенных на территории Российской Федерации и сопредельных государств.

Задачи исследования:

1. Разработать мультиплексную ПЦР тест-систему для идентификации токсигенных штаммов V. cholerae 01 классического и эльтор биоваров с одновременной дифференциацией типичных штаммов и измененных вариантов эльтор вибрионов. С помощью разработанной тест-системы провести анализ клинических штаммов, завезенных на территорию Российской Федерации и стран ближнего зарубежья, и выявить измененные варианты возбудителя холеры эльтор.

2. Провести сравнительный анализ фенотипических свойств типичных штаммов и измененных вариантов V. cholerae 01 биовара эльтор. Определить уровень продукции холерного токсина и оценить вирулентные свойства геновариантов.

3. Изучить структуру профага СТХ<р, кодирующего биосинтез холерного токсина, у измененных эльтор вариантов, завезенных в Российскую Федерацию в современный период. Определить генотипы исследованных штаммов.

4. Определить количество копий профага СТХср в геноме измененных вариантов холерных вибрионов биовара эльтор.

5. Выявить наличие островов патогенности VPI-1 и VPI-2 у геновариантов V. cholerae биовара эльтор и провести сравнительный анализ нуклеотидной последовательности гена tcpA.

Научная новизна работы

Впервые проведен комплексный фенотипический и молекулярно-генетический анализ 60 штаммов V. cholerae 01 серогруппы биовара эльтор, выделенных в Российской Федерации и странах ближнего зарубежья с 1970 по 2010 гг. Установлено, что, начиная с 1993 г., причиной эпидемических осложнений на территории Российской Федерации были измененные варианты, содержащие в геноме профага СТХ(р ген ctxB классического типа.

Впервые проведен сравнительный анализ продукции основных и дополнительных факторов патогенности у типичных штаммов и измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор, выделенных на территории России и сопредельных государств. При определении экспрессии холерного токсина выявлено, что генетически измененные варианты в условиях in vitro синтезируют в 2-10 раз больше холерного токсина по сравнению с типичными клиническими штаммами V. cholerae биовара эльтор. Установлено, что геноварианты не отличаются от типичных штаммов по продукции гемолизина, но обладают повышенной подвижностью. На модели лабораторных животных подтверждена высокая токсигенность и вирулентность геновариантов по сравнению с типичными эльтор вибрионами.

Получены новые сведения о вариабельности профага СТХср измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор, выделенных на территории Российской Федерации и стран ближнего зарубежья, выражающейся в присутствии в его геноме разных аллелей гена ctxB (ctxBl или ctxBT), rstR (rstRclass и/или rstRF"or), а также разного числа тандемных гептаповторов в промоторной области оперона ctxAB (trp3, trp4, trp5). Полученные данные позволили отнести все изученные штаммы к 4-м генотипам: ctxBl, rstREl,or, trp3; ctxBl, rstRE"or, trp4; ctxBl, rstRE"or/rstRclas\ trp4; ctxBl, rstRE"or/rstRclass, trp5;

Впервые определено количество копий оперона ctxAB у геновариантов, выделенных на территории России и сопредельных государств. Установлено,

что в хромосоме большинства изученных штаммов (90 %) присутствует две кошта оперона ctxAB, что свидетельствует о наличии в геноме двух копий профага СТХф.

При определении нуклеотидной последовательности гена tcpA, кодирующего основную субъединицу токсин-корегулируемых пилей адгезии и входящего в состав острова патогенности VPI-1, впервые установлено, что штаммы геновариантов, завезенные в Россию после 2006 г., имеют отличную как от классических, так и от типичных эльтор вибрионов нуклеотидную последовательность гена tcpA.

Приоритетность выполненных исследований подтверждена получением патента РФ на изобретение (патент № 2458141 от 05.03.2012г.).

Практическая значимость работы

Предложен способ идентификации токсигенных штаммов V. cholerae 01 серогруппы, определения их биовара (классический или эльтор) и дифференциации типичных и генетически измененных холерных вибрионов биовара эльтор. На основе разработанного способа сконструирован «Набор реагентов для идентификации токсигенных штаммов Vibrio cholerae OI классического и эльтор биоваров и дифференциации эльтор вибрионов на типичные и измененные методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с электрофоретическим учетом результатов (Ген Vibrio cholerae вариант с&Б-РЭФ)», зарегистрированный в Федеральной службе по надзору в сфере здравоохранения и социального развития (РУ № ФСР 2012/ 13427 от 21.05.2012 г.) и рекомендованный для применения в Российской Федерации.

По результатам работы составлены методические рекомендации «Мультиплексный ПЦР-анализ для выявления измененных штаммов Vibrio cholerae OI биовара эльтор, несущих профаг вирулентности СТХср с генами классических вибрионов», одобренные Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол №6 от 13.10.2010 г.) и утвержденные директором.

В Государственной коллекции патогенных бактерий депонированы:

- три штамма (К cholerae OI серогруппы классического биовара, V. cholerae OI серогруппы эльтор биовара и V. cholerae 0139 серогруппы) с изученными молекулярно-генетическими характеристиками, используемых в качестве референс-пггаммов при проведении геномной паспортизации штаммов возбудителя холеры (КМ259, КМ260, КМ261);

— коллекция из б штаммов в качестве генетически измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор с известным генотипом для внутривидовой дифференциации холерных вибрионов (КМ265, КМ266, КМ267, КМ268, КМ269, КМ270).

Полученные в ходе выполнения данные по изучению генетической организации измененных вариантов V. cholerae OI биовара эльтор используются при чтении лекций «Микробиология и генетика возбудителя холеры» на курсах первичной специализации по особо опасным инфекциям

при и курсах повышения квалификации по программе усовершенствования врачей по специальности «бактериология» при РосНИПЧИ «Микроб».

Положения, выносимые на защиту:

1. Сконструированная мультиплексная ПЦР тест-система, в состав которой входят праймеры на гены rjbOl, cas3, ctxlflass, rtxC и cíxBE"or, позволяет идентифицировать токсигенные штаммы холерного вибриона 01 серогруппы, определять принадлежность к классическому или эльтор биовару и проводить дифференциацию штаммов V. cholerae биовара эльтор на типичные изоляты и генетически измененные варианты.

2. На территории России вспышки и спорадические случаи заболевания холерой, начиная с 1993 года, были вызваны измененными вариантами холерных вибрионов биовара эльтор. Геноварианты V. cholerae биовара эльтор в отличие от типичных эльтор вибрионов в условиях in vitro синтезируют больше холерного токсина и являются более вирулентными для лабораторных животных — крольчат-сосунков.

3. Измененные варианты V. cholerae биовара эльтор, выделенные с 1993 по 2010 гг. на территории Российской Федерации при эпидемических вспышках и единичных случаях холеры, отличаются между собой по структуре профага СТХср, содержащего разные аллеи генов ctxB, rstR и разное количество тандемных повторов TTTTGAT в промоторной области оперона ctxAB. В геноме большинства изученных штаммов геновариантов профаг СТХср присутствует в количестве 2 копий. Штаммы измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор несут полный набор генов островов патогенности VPI-1 и VPI-2. В составе VPI-1 геновариантов, выделенных после 2006 г., содержится аллель tcpKfIRS.

Апробация работы.

Материалы диссертации представлены на VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Молекулярная диагностика - 2010» (Москва, 2010), на III научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Протвино, 2011), на совещании специалистов Роспотребнадзора по вопросам совершенствования эпидемиологического надзора за холерой (Ростов-на-Дону, 2011), проблемной комиссии (48.04) «Холера и патогенные для человека вибрионы» Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (Ростов-на-Дону, 2012), на X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2012), на IV Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2012), ежегодных научно-практических конференциях «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2010-2012).

Работа выполнена в рамках плановой НИР 37-4-09 «Изучение природных и генетически измененных штаммов холерного вибриона и установление связи между вариабельностью генома и патогенными свойствами V. cholerae»; Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009 - 2013 годы) в рамках государственных контрактов № 70-Д от

25.07.2011 г., лот 12, тема «Оценка изменчивости фенотипических и генетических свойств вирулентных штаммов возбудителей инфекционных болезней при смене ими экологических ниш обитания» и № 53-Д от

04.06.2012 г., лот 12, тема «Молекулярно-генетические особенности генетически измененных штаммов возбудителей опасных инфекционных болезней и их значимость в изменении вирулентных свойств и адаптации патогенов к меняющимся условиям окружающей среды».

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 10 работ, из которых 5 статей в рекомендованных ВАК изданиях и один патент.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 197 цитируемых работ, из них 35 отечественных и 162 зарубежных Общий объем диссертации составляет 131 страницу. Текст иллюстрирован 16 таблицами и 12 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. В работе было использовано 60 штаммов V. cholerae OI серогруппы эльтор биовара, 14 штаммов V. cholerae 01 серогруппы классического биовара, 3 штамма V. cholerae 0139 серогруппы, а также 15 штаммов V. cholerae других серогрупп и 12 штаммов гетерологичных бактерий. Культивирование штаммов осуществляли на агаре LB, бульоне AKI или LB при температуре 30 и 37 °С с аэрацией и без аэрации. Питательные потребности определяли в соответствии с методикой, описанной в «Справочнике по микробиологическим и вирусологическим методам исследования» (1982 г). Гемолитическую активность изучали на плотной среде по методу D.V. Sigh с соавт. (2001). Способность к продукции растворимой гемагглютинин/протеазы (РГА/П) изучали по методу R.A. Finkelstein с соавт. (1992), фосфолипазы - по N.H. Tan, C.S. Tan (1988). Подвижность холерных вибрионов определяли на 0,3-0,4 % LB-arape. Биосинтез холерного токсина оценивали с помощью иммуноферментного метода GMiELISA по A.M. Svennerholm с соавт. (1983). Продукцию ТКПА определяли визуально методом самоагглютинации при выращивании бактерий на круговой качалке в LB бульоне (Chiang S.L. et al., 1995). Определение устойчивости к антибактериальным препаратам проводили при

выращивании штаммов на плотных средах, содержащих различные антибиотики (Нефедов К.С., 2008). Токсигенность и вирулентность штаммов оценивали соответственно по S.N. De с соавт. (1953) и N.K. Dutta, М.К. Habbu (1955). Подготовку образцов для ПЦР проводили в соответствии с МУК 4.22218-07 «Лабораторная диагностика холеры» и МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Выделение ДНК осуществляли фенол-хлороформным методом (Маниатис Т. с соавт., 1984) и с использованием коммерческих наборов - для выделения ДНК в присутствии гуанидинтиоцианата. ПЦР с использованием специфических праймеров проводили на термоциклере «Терцик» (ДНК-технология, Россия). ДНК-ДНК гибридизацию по Саузерну осуществляли согласно методике, описанной в руководстве (Маниатис Т. с соавт., 1984). Секвенирование генов проводили на приборе «CEQ8000» (Beckman Coulter, США). Анализ последовательностей ДНК осуществляли с использованием программ «Genetic Analysis System Software Version 9.0» «Mega4» и «BioEdit 7.1.3». Для сравнения использовали нуклеотидные последовательности изучаемых генов штаммов V. cholerae N16961 биовара эльтор и V cholerae 0395 классического биовара, представленные в GenBank. Для расчета праймеров использовали программу «Oligo 6.0».

1. Конструирование и апробация тест-системы для идентификации токсигенных штаммов Vibrio cholerae OI классического и эльтор биоваров, дифференциации эльтор вибрионов на типичные и измененные методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с электрофоретическим учетом результатов

В настоящее время разработано значительное количество экспресс-методов и тест-систем для индикации и идентификации возбудителя холеры, определения серогруппы, биовара, токсигенности (вирулентности) и эпидемической значимости выделенных штаммов. Однако все они предназначены исключительно для детекции типичных штаммов холерного вибриона биовара эльтор и не способны выявлять токсигенные измененные варианты с повышенной вирулентностью. С целью определения таких штаммов необходимо создание комплексных ПЦР тест-систем, позволяющих быстро и достоверно проводить идентификацию токсигенных штаммов V. cholerae 01 серогруппы, определять биовар и дифференцировать типичные штаммы и генетически измененные варианты эльтор вибрионов. В качестве генетических маркеров для выявления серогруппы исследуемого штамма V. cholerae были использованы фрагменты генов перозаминсинтазы (VC0244) и rjbG (VC0245), входящие в состав локуса rfbO и кодирующего биосинтез OI антигена (Kumar Р. et al., 2009). Определение биовара основывалось на использование праймеров на ген rtxC, который присутствует только в штаммах V. cholerae эльтор биовара (GoelA.K. et al., 2007), и ген cas3,

характерный для холерных вибрионов классического биовара. Олигонуклеотидные праймеры на ген cas3 рассчитывали с помощью программы «Oligo 6.0». Специфичность сконструированных праймеров была подтверждена с использованием 64 штаммов V. cholerae. При этом фрагмент, соответствующий гену cas3, был выявлен только у штаммов V. cholerae классического биовара. Для определения аллеля гена ctxB нами была использована методика МАМА ПЦР (Mismatch Amplification Mutation Assay PCR), разработанная M. Monta с соавт. в 2008 г. и основанная на использовании праймеров, несущих на одном конце специфический для каждого аллеля нуклеотид. Это обстоятельство обусловило необходимость в постановке двух отдельных реакций. В связи с этим мультиплексную ПЦР проводили в один прием, но в двух реакционных смесях. Первая реакционная смесь (ПЦР-class) включала праймеры для выявления штаммов холерного вибриона 01 серогруппы классического биовара (rjbO, cas3, ctxBFCass), а вторая (ПЦР-eltor) - праймеры для выявления V. cholerae 01 серогруппы эльтор биовара (rfbO, rtxC, ctxlfUor). Измененные варианты V. cholerae 01 серогруппы эльтор биовара определяли по наличию специфических ампликонов с праймерами к rfbO, rtxC и ctxBc,ass. В качестве положительных контрольных образцов (ПКО) использовали ДНК штаммов холерного вибриона 01 серогруппы - V. cholerae 569В классического биовара (ПКО-Class) и V. cholerae М818 эльтор биовара (ПКО-Eltor), фенотип и генотип которых хорошо изучен.

Для проведения мультиплексной ПЦР ДНК штаммов выделяли из микробной взвеси концентрацией 1х109, на конечном этапе полученную ДНК разводили в 50 раз. Дополнительно к исследуемым образцам готовили отрицательный контроль выделения (ОКВ). С целью оптимизации условий, при которых обе реакции имели бы высокую эффективность и специфичность, были подобраны температура отжига праймеров и концентрация компонентов реакционной смеси. Образование четких ампликонов происходило при температуре 58 °С. Для ПЦР-class соотношение праймеров на гены ф01, cas3, ctxBF составило соответственно 8, 10 и 10 пмоль/мкл, а для ПЦР-eltor, содержащей праймеры к rfbOl, rtxC, ctxBE"or, соответственно 10, 8 и 15 пмоль/мкл. Концентрация ионов магния в реакционной смеси составляла 25 ммоль/мкл, а Taq-полимеразы -0,06 ед/мкл. Помимо ионов магния и Taq-полимеразы общая реакционная смесь включала 2,5 мкл стандартного 10-кратного буфера для Taq-полимеразы, 2,5 мкл смеси дНТФ и деионизованную воду до объема 15 мкл. В реакционную смесь добавляли 10 мкл раствора ДНК. Для получения специфичных и четких ампликонов на термоциклере «Терцик» (ДНК-Технология, Россия) был выбран «Быстрый» (Fast) режим амплификации с использованием следующей программы: предварительная денатурация при температуре 96 °С в течение 2 мин, далее 25 циклов, включающих денатурацию при температуре 96 °С в течение 10 с, отжиг праймеров при

температуре 58 °С в течение 10 с, синтез комплементарной цепи при температуре 72 "С в течение 30 с. Заключительным этапом амплификации являлась достройка цепи при температуре 72 °С в течение 5 мин. Для регистрации результатов ПЦР использовали метод электрофореза в 2 % агарозном геле. Учет результатов проводили по схеме, представленной в таблице 1.

Таблица 1 - Учет результатов ПЦР-анализа, полученных с использованием мультиплексной ПЦР тест-системы

Пробы Реакционная смесь Реакционная №1 смесь №2 Результаты

cas3 ctxBUass г/ЬО rtxC ctx&ltor

415 п.н. 189 П.Н. 638 П.Н. 265 П.Н. 189 п.н.

ОКВ,К- - - - - - Результаты анализа подлежат учету. Контаминация реактивов положительно реагирующей ДНК или ампликонами отсутствует

наличие хотя бы одного ампликона Результаты анализа не подлежат учету.

ПКО-Class 1ІШ - - Результаты анализа подлежат учету.

ПКО—Eltor - - ^.ШШШ-у, Результаты анализа подлежат учету.

Исследуемые пробы +/- +/- - +/- +/- Штамм не относится к V. ско1егае 01 серогруппы

.Ш ЇІ£: і.!.;: - - Токсигенный штамм V. с1го1егае 01 классического биовара

- - Токсигенный штамм V. ско1егае 01 эльтор биовара

- + - Токсигенный измененный вариант V. ско1егае 01 эльтор биовара

В итоге нами разработан набор реагентов для идентификации токсигенных штаммов Vibrio cholerae OI классического и эльтор биоваров и дифференциации эльтор вибрионов на типичные и измененные методом

мультилокусной полимеразной цепной реакции с электрофоретическим учетом результатов, обозначенный как «Ген Vibrio cholerae вариант ctxB-РЭФ».

Специфичность сконструированного набора подтверждена с использованием 9 штаммов близкородственных видов и 4 штаммов энтеробактерий. Результаты ПЦР тестирования указанных штаммов были отрицательными. При анализе 18 штаммов V. cholerae 0139 и не01/не0139 серогрупп было показано отсутствие фрагмента, соответствующего локусу rjbOl (638 п.н.). При этом было выявлено, что некоторые штаммы рода Vibrio, а также V. cholerae не01/не0139 серогруппы содержат гены ctxÉClass или rtxC, что соответствует данным литературы (Dalsgaard A. et al., 2001). Анализ трех штаммов V. cholerae OI серогруппы с известным генотипом (ДаккаЗЗ фО\ cas3+, ctxlf,ass\ rtxC, ctxBEbor-, M1013 rfbO+, cas?, ctxE?,ass-, rtxC+, cíxBE"or\ MAK757 rfbO+, cas?, ctxBclms\ rtxC+, ctxtf1""") подтвердил диагностическую ценность набора.

Таким образом, сконструированный набор реагентов «Ген Vibrio cholerae вариант ctxB-РЭФ» позволяет идентифицировать токсигенные штаммы холерного вибриона OI и не OI серогрупп в чистой культуре, определять биовар и дифференцировать типичные штаммы и измененные варианты холерных вибрионов биовара эльтор.

2. Выявление генетически измененных вариантов возбудителя холеры среди клинических штаммов, выделенных на территории России и стран ближнего зарубежья, с помощью разработанного набора

Далее с помощью разработанного набора «Ген Vibrio cholerae вариант сйсД-РЭФ» нами были исследованы 59 клинических штаммов холерных вибрионов биовара эльтор, выделенных с 1970 по 2010 гг. на территории России и стран СНГ. Все штаммы обладали фенотипическими свойствами, характерными для вибрионов биовара эльтор.

При изучении взятых для анализа штаммов во всех ПЦР-образцах были выявлены ампликоны, указывающие на их принадлежность к холерным вибрионам OI серогруппы эльтор биовара - фрагмент размером 638 п.н. (фО) и фрагмент размером 265 п.н. (ген rtxC) (рисунок 1). При этом штаммы, выделенные в Российской Федерации с 1970 по 1991 гг., содержали в своем геноме ген ctxBE"or, что говорит об их принадлежности к типичным эльтор изолятам. В то же время, у клинических штаммов, изолированных после 1993 г. во время эпидемических вспышек в Краснодаре (1993 г.), Дагестане (1993-1994 гг., 1998 г.), Ачинске (1997 г.), Казани (2001 г.) и при заносных случаях в Башкирии (2004 г.), Твери (2005 г.), Мурманске (2006 г.), Москве (2010 г.) ампликон размером 189 п.н. образовывался в реакционной смеси №1, что указывает на присутствие в профаге СТХ гена ctxEFa" (или ctxBl).

Что касается штаммов, выделенных на территории стран ближнего зарубежья, то среди исследованных штаммов выявлено 5 изолятов

(Узбекистан, 1988 г.; Украина 1991 г.), которые также относились к измененным вариантам. Особый интерес вызывает обнаружение геновариантов в 1988 г. на территории Узбекистана, что указывает на их возникновение значительно раньше, чем предполагается (1991 г.) (Ыагг О.В. е1 а!., 2002).

12345678

rfbO cas3

ctxBclass

rfbO -►

rtxC _w

ctxBF,,or

- — ^ - — —

:

123456 7 89 10111213141!

A - Реакционная смесь №1, Б - реакционная смесь №2.

Типичные штаммы V. cholerae биовара эльтор: 1 - М1013, 2 - С-402, 3 - М1259; Измененные варианты V. cholerae биовара эльтор: 4 - М1293, 5 - М1295, 6 - Р15384, 7 - Р17644, 8 - М1344, 9 - М1429, 10 - М1430, 11 - Р18899, 12 - Л3226; Контроля: 13 - ПКО-Class, 14 - ПКО-Eltor, 15 - отрицательный контроль.

Рисунок 1 - Электрофореграмма ампликонов, полученных при исследовании штаммов V. cholerae биовара эльтор с помощью набора «Ген Vibrio cholerae вариант с/хб-РЭФ».

Таким образом, с помощью разработанного набора «Ген Vibrio cholerae вариант ctxB-РЭФ» было выяснено, что, начиная с 1993 г., все локальные вспышки и спорадические случаи заболевания холерой на территории России были вызваны измененными вариантами холерных вибрионов биовара эльтор.

3. Сравнительный фенотипический анализ вирулентных штаммов V. cholerae биовара эльтор

На следующем этапе работы был проведен сравнительный анализ продукции основных и дополнительных факторов патогенности у типичных штаммов и измененных вариантов эльтор вибрионов. В первую очередь была изучена способность к продукции холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии. Известно, что оптимальные условия для продукции ХТ штаммами двух биоваров неодинаковы, что определяется различиями в регуляторных системах, контролирующих экспрессию структурных генов ХТ классических и эльтор вибрионов. Разница заключается в том, что хотя холерные вибрионы обоих биоваров при культивировании в LB-бульоне при 30 °С образуют одинаковое количество регуляторного белка ToxR,

непосредственно участвующего в активации транскрипции генов ctxAB, но только у классических вибрионов в этих условиях происходит синтез второго регуляторного белка ТохТ, являющегося транскрипционным регулятором многих генов, в том числе и генов холерного токсина (DiRita V.J. et al., 1996). Вследствие этого исследуемые штаммы выращивали в двух разных условиях: а) оптимальных для биосинтеза XT у V. cholerae классического биовара (LB-бульон, рН 6,8; 30 °С, 18 ч с аэрацией) и б) оптимальных для продукции этого белка у V. cholerae биовара эльтор (AKI бульон, рН 7,6, 37 °С, 4 ч. без аэрации, 16 ч. с аэрацией). Оказалось, что 97 % изученных штаммов измененных вариантов, выделенных в разные годы и на разных территориях, продуцировали значительно больше XT (0,1-0,9 мкг/мл) по сравнению с типичными штаммами (0,01-0,03 мкг/мл). При этом установлено, что 17 изолятов из 32 изученных (или 53 %) синтезировали больше XT в LB бульоне при 30 °С, т.е. в условиях оптимальных для продукции этого белка классическими штаммами (таблица 2). Можно предположить, что у измененных вариантов эльтор вибрионов появилась способность образовывать в стандартных лабораторных условиях белок ТохТ, независимо от экспрессии белка ToxR. Вместе с тем был обнаружен ряд штаммов, продукция XT у которых не зависела от среды выращивания (Р15653, М1272, М1298, М1270, М1271, М1295, М1269, М1328, JI4150) или была в 4-10 раз больше при культивировании в среде AKI (М1275, М1299, М1268, JI3225, JI3226) (таблица 2). Полученные нами экспериментальные данные при изучении измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор, изолированных на территории России и сопредельных государств, подтверждают данные литературы о повышенном биосинтезе XT геновариантами (Ghosh-Baneijee J. et al., 2010; Son M.S. et al., 2011).

Поскольку биосинтез ТКПА, также как и XT, регулируется вирулентным каскадом, включающим белки-регуляторы ToxR/ToxT, то мы предположили, что повышение продукции XT у штаммов измененных вариантов будет сопровождаться и усилением биосинтеза ТКПА. Однако при изучении биосинтеза ТКПА методом самоагглютинации нами не было обнаружено различий между типичными изолятами и генетически измененными вариантами.

Далее были проведены исследования по сравнительному изучению токсигенности и вирулентности типичных штаммов и измененных вариантов холерных вибрионов биовара эльтор на модели лабораторных животных. Исследования были проведены на 2-х типичных штаммах и 3-х штаммах измененных вариантов. Токсигенность штаммов оценивали в изолированной петле взрослого кролика (De S.N. et al., 1953). В концентрации 1,0х107 КОЕ индекс наполнения у всех штаммов был высокий и составлял от 0,7 до 1,4 мл на сантиметр кишечника. При снижении концентрации холерных вибрионов у типичных штаммов наблюдалось и заметное снижение индекса наполнения. Для измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор было характерно сохранение данного показателя на высоком уровне.

Таблица 2 - Продукция холерного токсина изученными типичными штаммами и измененными вариантами холерных вибрионов биовара эльтор.

Штамм V. cholerae Место и год выделения Аллель гена ctxB Количество XT*, мкг/мл при выращивании в

АКІ-бульоне, при 37°С LB-бульоне, при 30°С

измененные варианты

Р15653 Украина, 1991 ctxBl 0,23 0,42

М1264 Украина, 1991 ctxBl 0,03 0,60

М1272 Краснодар, 1993 ctxBl 0,20 0,30

М1299 Краснодар, 1993 ctxBl 0,10 0,01

М1270 Татарстан, 1993 ctxBl 0,06 0,05

М1275 Дагестан, 1993 ctxBl 0,10 0,01

М1297 Дагестан, 1993 ctxBl 0,01 0,40

М1295 Дагестан, 1994 ctxBl 0,20 0,10

М1266 Пермь, 1994 ctxBl 0,03 0,50

М1268 Магнитогорск, 1994 ctxBl 0,04 0,01

Р17644 Ачинск, 1997 ctxBl 0,03 0,40

М1328 Дагестан, 1998 ctxBl 0,30 0,40

М1326 Дагестан, 1998 ctxBl 0,04 0,80

М1344 Казань, 2001 ctxBl 0,10 0,80

М1430 Тверь, 2005 ctxBl 0,09 0,70

JI3226 Москва, 2010 ctxB 7 0,40 0,10

JI4150 Москва, 2010 ctxB 7 0,41 0,30

типичные штаммы

М295 Туркменистан, 1965 ctxB3 0,01 0,01

М818 Саратов, 1970 ctxB3 0,03 0,02

М713 Москва, 1970 ctxB3 0,03 0,01

М738 Пермь, 1970 ctxB3 0,03 0,03

М888 Астрахань, 1970 ctxB3 0,01 0,01

М1013 Башкирия, 1972 ctxB3 0,02 0,02

С402 Ставрополь, 1990 ctxB3 0,03 0,01

Примечания: * - приведены средние значения трех опытов.

Вирулентность штаммов определяли на модели кроликов-сосунков по методу N.K. Dutta и М.К. Habbu (1955). Было установлено, что при заражении в дозе 105 и 103 КОЕ все животные погибали в течение суток. При вскрытии наблюдалась выраженная холерогенная реакция. Заражение животных типичными штаммами V. cholerae биовара эльтор в дозе ю2кое не вызывало гибели животных и изменения внутренних органов. В то же время при заражении такой же дозой измененных вариантов холерных вибрионов биовара

эльтор холерогенный синдром у крольчат-сосунков развивался в полной мере, что может указывать на повышенную вирулентность геновариантов.

Далее был проведен сравнительный анализ продукции дополнительных факторов, связанных с вирулентностью. При изучении питательных потребностей, гемолитической активности, способности к продукции растворимой гемагглютинин/протеазы и фосфолипазы, а также подвижности у типичных штаммов и измененных вариантов холерных вибрионов биовара эльтор было показано, что исследованные штаммы геновариантов были прототрофами и не отличались от типичных изолятов по продукции термолабильного гемолизина. Однако были обнаружены незначительные отличия по экспрессии ферментов патогенности. В тоже время нами установлено, что измененные варианты V.cholerae эльтор биовара в отличие от типичных штаммов являются более подвижными. Так средний радиус зоны распространения колонии на полужидком агаре у измененных вариантов холерных вибрионов биовара эльтор был в среднем в 1,5-2 раза больше, чем у типичных штаммов.

Учитывая, что лекарственная устойчивость штаммов V. cholerae эльтор биовара представляет большую проблему для здравоохранения нами был проведен сравнительный анализ антибиотикоустойчивости штаммов холерных вибрионов, выделенных на территории России и сопредельных государств с 1970 по 2010 гг. Для исследования были использованы следующие антибиотики - ампициллин, спектиномицин, стрептомицин, рифампицин, канамицин, тетрациклин, хлорамфеникол и тр им его прим. В результате было показано, что типичные штаммы, выделенные в начале седьмой пандемии, были устойчивы лишь к 1-2 антибактериальным препаратам, в то время как исследованные штаммы измененных вариантов обладали устойчивостью к 3-5 антибиотикам. Полученные нами результаты согласуются с данными зарубежных исследователей о том, что характерной особенностью штаммов эльтор вибрионов, выделяемых в последние годы, является множественная лекарственная устойчивость, выражающаяся в резистентности к противомикробным препаратам разных групп (Tran H.D. et al., 2012).

Таким образом, проведенный сравнительный анализ фенотипических свойств типичных изолятов и измененных вариантов холерных вибрионов биовара эльтор, выделенных на территории России и сопредельных государств, показал, что геноварианты экспрессируют в 2-10 раз больше ХТ, чем типичные эльтор вибрионы, и являются более вирулентными. Все исследованные штаммы геновариантов не отличались от типичных изолятов по продукции термолабильного гемолизина, но были более подвижными.

4. Молекулярно-генетические особенности измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор

При фенотипическом анализе измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор было установлено, что геноварианты в отличие от типичных эльтор вибрионов продуцируют больше ХТ. Учитывая, что гены ctxAB,

кодирующие продукцию ХТ входят в состав профага СТХср, нами была исследована структура данного мобильного генетического элемента. В результате ПЦР-тестирования 6 генов коровой части и 3 генов К82-области установлено, что все геноварианты содержат полноценный профаг СТХф.

Для определения нуклеотидной последовательности гена ctxB у измененных вариантов, изолированных в разные годы на территории России, было проведено секвенирование этого гена у 12 типичных штаммов и 27 измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор. Полученные последовательности сравнивали с последовательностями гена ctxB штаммов V. cholerae 569В классического биовара и V. cholerae N16961 биовара эльтор, депонированных в GenBank. В результате было показано, что штаммы, выделенные с 1970 по 1990 гг. содержали ген ctxB3, идентичный гену ctxB референс-штамма N16961. В то же время в последовательности гена ctxB 24 штаммов измененных вариантов обнаружены две нуклеотидные замены (тимина на цитозин) в положениях 115 и 203. Нуклеотидная последовательность данных штаммов полностью совпала с последовательностью гена ctxB штамма V. cholerae 569В (рисунок 2).

из го sa «о xv» xzo гой zxq 35s з«5 з?$ ____,____t____i____i- ... I____1____i.....1____I----i.......«----f--------*----*----'----1

Hi6561 ATGATÏAAATTAAAATTÏG«? ... CAÏATGCACATCi ... CAAATATATACSCV ... TOCAATÎTTÏCAAG ... вСС«ТСААТ!ГАвТАТ8<ЗС-ААЛТ!?АА

M8A8 .................................... ...................................«..........................

736 ......................................................................................»« ........

К10Х1 ..................................................................................................

«¿0*3 .................................................................................................

С402 ..................................................................................................

С447 ..................................................................................................

М12.М .............................................С...............С....................................

«¿£66 .............................................С...............С........ >.« .........................

.............................................с...............С....................................

9Х16Ч .............................................С...............С....................................

Н12РЗ .............................................с...............с....................................

№34* .............................................С...............С....................................

Н13«3 .....................................................с...............с....................................

Н1349 .............................................с...............с....................................

р1$в99 .................................... .........С...............С....................................

ИД.429 .............................................с...............с................-...................

НИЗО .............................................С...............С....................................

л4150 ................................*............с.............--с....................................

Л3226 ................................А............С...............С....................................

Л3£22 .........................................с...............с......-.............................

2£9в .............................................с...............с....................................

С3?5 АТ<УАТ?АААТТААААТТ'Г<^УР - - . САТАТ«САеАСГ« .. . САААТЛСАТАСвС? . . . Т«ОЛАСТГ**САА» . . . ОССа|ГуААТТАСТАТ<гОСАААТ?АА

ахв-р <**в-к

Штаммы V. сЫегае: М818, М736, М738, М1011, М1013, С402, С447 -типичные штаммы, М1264, М1266, Р17644, Р17647, М1293, М1344, М1345, М1349, Р18899, М1429, М1430 - измененные варианты, несущие ген сЬсВ1\ Л3226, Л3225, Л4150 - измененные варианты, несущие ген сЬсВ7, 569В -штамм холерных вибрионов классического биовара; 0395 и N16961 -референс-штаммы V. ско1егае соответственно классического и эльтор биоваров, нуклеотидные последовательности гена ОхВ которых представлены в ОепВапк. Идентичные нуклеотиды обозначены точками. Жирным шрифтом обозначены нуклеотидные замены в гене с(хВ измененных вариантов. Стрелками указано положение прямого и обратного праймеров.

Рисунок 2 - Расположение однонуклеотидных замен в гене ах В штаммов холерных вибрионов биовара эльтор.

Полученные результаты указывают на присутствие в геноме исследованных измененных вариантов аллеля ctxBl, характерного для штаммов классического биовара. Кроме того, в последовательности гена ctxB штаммов, выделенных в Москве в 2010 г. (F. cholerae J13225, JT3226, Л4150), помимо двух указанных выше несинонимичных замен была выявлена дополнительная мутация, а именно в положении 58 цитозин был заменен на аденин (рисунок 2). Такой аллель ctxB был впервые обнаружен в штаммах V. cholerae биовара эльтор, выделенных в Индии в 2004 г., и обозначен как ctxB7 (Goel А.К. et al., 2008, Lee J.H. et al., 2009, Safa A. et al., 2010).

Измененные варианты помимо разной последовательности гена ctxB могут содержать и различные аллели гена rstR. С целью определения аллеля этого гена все штаммы были исследованы с помощью аллель-специфичной ГГЦР (Bhattacharya Т. et al., 2006). В результате было установлено, что типичные эльтор вибрионы содержали только ген rstRE"or, что подтверждает присутствие в их геноме профага СТХф эльтор типа. В тоже время измененные варианты содержали разные аллели rstR. Среди 32 изученных нами изолятов только один штамм (V. cholerae Р15384), имел rstRclass, что указывает на присутствие в хромосоме данного штамма профага классического типа (ctxBl, rstRclüSS). Девять изолятов (28,1 %) несли только ген rstREUor, что свидетельствует о наличии в их хромосоме гибридного профага СТХф (ctxBl, rstR' ). Наибольшее количество штаммов (68,9 %) содержали два аллеля гена rstR - классический и эльтор. Полученные данные указывают на присутствие в хромосоме данных штаммов двух профагов СТХф - классического и гибридного. Результаты секвенирования генов rstR подтвердили данные, полученные с помощью ПЦР. Полученные нами результаты при анализе последовательностей генов ctxB и rstR согласуются с данными других исследователей о циркуляции атипичных эльтор вибрионов, содержащих ctxB классического типа и разных аллелей rstR на территории Кавказа, Сибири и Дальнего Востока (Савельев В.Н. с соавт., 2010; 2011; Миронова JI.B. с соавт., 2010, 2011).

На следующем этапе была определена копийность профага СТХф у 10 штаммов измененных вариантов холерных вибрионов биовара эльтор. Количество копий оперона ctxAB определяли с помощью ДНК-ДНК-гибридизации по Саузерну с использованием СТ-зонда, созданного на основе амплифицированного фрагмента гена ctxA. Хромосома исследованных штаммов фрагментировалась с помощью эндонуклеазы рестрикции PstI. Результаты гибридизации показали, что 9 штаммов содержали в геноме две копии оперона ctxAB, расположенные в рестрикционных фрагментах разной длины, и лишь один штамм имел одну копию (рисунок 3).

Далее было проведено секвенирование промоторной области оперона ctxAB 7 типичных и 14 измененных вариантов холерных вибрионов биовара эльтор, выделенных на территории России и сопредельных государств. В результате анализа установлено, что типичные штаммы, как и

референс-штамм V. ско1егае N16961 биовара эльтор, содержали по 4 повтора ТТТТОАТ (обозначенных как йр). Такое же количество гептаповторов обнаружено у 9 (64,3 %) из 14 исследованных измененных вариантов V. сИо1егае эльтор. В тоже время 2 штамма, выделенные в Ачинске в 1997 г. (V. ско1егае Р17644, Р17647), содержали в промоторной области оперона ОхАВ лишь три гептаповтора, а 3 штамма, завезенные в 2010 г. в Москву, напротив, имели 5 копий.

23,67-*

9,46 б,66 -*

4,26

2,30 — 1,96 —

М

М - НшсИП - рестрикты ДНК фага X, взятые в качестве маркеров. Контроли: 1 - V. ско1егае 569В классического биовара; 8 - V. скокгае М818 эльтор биовара. Измененные варианты V. с!ю1егае: 2 - М1272; 3 - Л4150; 4 -М1270; 5 - М1429; 6 - М1268; 7 - Л3226; 9 - М1345; 10 - М1430; 11 - М1293; 12 — Р18899.

Рисунок 3 - Блот-гибридизация хромосомной ДНК генетически измененных вариантов V. ско!егае биовара эльтор с СТ-зондом и рестриктазой РбП.

Таким образом, при изучении структуры профага СТХф измененных вариантов холерных вибрионов биовара эльтор установлена его вариабельность, что отличает их от типичных изолятов, имеющих однородную структуру данного мобильного элемента. При этом вариабельность профага СТХф выражалась в наличии разных аллелей сехВ (с1хВ1 или с1хВ7), гена («т'Лс'аи и/или гх(Яп"0Г) и разного числа тандемных повторов ТТТТОАТ в промоторной области оперона с!хАВ ОгрЗ, Щ)4, йр5). При этом на территорию России и сопредельных государств были завезены штаммы измененных вариантов V. сИо1егае биовара эльтор, относящиеся к четырем генотипам: сгхВ1, п1ЛЕ"0Г, йрЗ/ ах.В], тВЕ"0Г, йр4/ ОхВ1, гз1ВЕЬог/гзЖс,а85, 1гр4; ОхВ7, тВ?"0Пр5, среди которых наиболее

распространенными были штаммы с генотипом ctxBl, rstRE"°7rsiRC!ass, trp4, содержащие две разные копии профага СТХф — классическую и гибридную.

Учитывая, что в вирулентности холерных вибрионов важную роль играют также белки, кодируемые генами, расположенными на острове патогенности VPI-1, нами был изучен его генный состав. При ПЦР тестировании было показано, что по составу генов VPI-1 измененные варианты не отличаются от типичных штаммов биовара эльтор. Сходные данные были получены и при изучении второго острова патогенности - VPI-2, что говорит о стабильности генного состава этих мобильных генетических элементов. Поскольку последовательность гена tcpA, входящего в состав VPI-1 и кодирующего основную субъединицу токсин-корегулируемых пилей адгезии, отличается у классических и эльтор вибрионов, нами было проведено секвенирование данного гена у пяти произвольно взятых штаммов измененных вариантов, выделенных на территории России. В результате было выявлено, что только штамм V. cholerae PI7644 (Ачинск, 1997) имел последовательность гена tcpA идентичную таковой эльтор вибрионам, в тоже время у остальных штаммов - V. cholerae PI8899 (Мурманск, 2006), V. cholerae JI3225, JI3226, JI4150 (Москва, 2010) была выявлена одно ну клеотидная замена в положении 266 от начала гена. Данные штаммы несли в геноме острова патогенности VPI-1 специфичную нуклеотидную последовательность гена tcpA, отличную как от классических, так и эльтор вибрионов, и обозначенную как tcpET€1RS. Данный алель характерен для штаммов, выделяемых в настоящее время на эндемичных по холере территориях (Reimer A.R. et al., 2011; Talkington D. et al., 2011).

Таким образом, сконструированный нами «Набор реагентов для идентификации токсигенных штаммов V. cholerae Ol классического и эльтор биоваров и дифференциации эльтор вибрионов на типичные и измененные методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с электрофоретическим учетом результатов (Ген Vibrio cholerae вариант ctxB— РЭФ)» позволяет выявлять измененные варианты холерного вибриона биовара эльтор. Впервые проведенный комплексный фенотипический и молекулярно-генетический анализ измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор показал, что геноварианты синтезируют больше холерного токсина, чем типичные клинические штаммы V. cholerae биовара эльтор, что может быть одной из причин их повышенной вирулентности. При этом повышение вирулентности может быть обусловлено несколькими различными механизмами, так как изученные нами геноварианты отличались по структуре генома. Выявлена вариабельность профага вирулентности СТХср, выражающаяся в наличии разных аллелей гена ctxB, rsíR и разном числе тандемных гептаповторов в промоторной области оперона ctxAB. При этом большинство изученных штаммов содержали две копии профага СТХср (классическую и гибридную). Установлено, что штаммы геновариантов, завезенные в Россию после 2006 г., специфичную нуклеотидную

последовательность гена tcpA, обозначенную как tcpEf2'114 и характерную для штаммов, выделяемых в настоящее время на эндемичных по холере территориях. Дальнейшее изучение структуры и функции генома измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор будет способствовать выявлению генетического разнообразия штаммов возбудителя холеры с повышенной вирулентностью, а также созданию новых диагностических тест-систем.

ВЫВОДЫ

1. Разработан способ идентификации токсигенных штаммов V. cholerae 01, определения их биовара и дифференциации холерных вибрионов биовара эльтор на типичные и измененные методом мультиплексной полимеразной цепной реакции.

2. Установлено, что причиной эпидемических вспышек и спорадических случаев заболевания холерой на территории России, начиная с 1993 г., являются измененные варианты холерных вибрионов биовара эльтор, несущие аллель ctxBl (классического типа).

3. При фенотипическом анализе показано, что изученные штаммы геновариантов V. cholerae OI биовара эльтор продуцируют in vitro в 2-10 раз больше холерного токсина, чем типичные эльтор вибрионы, а также отличаются повышенной токсигенностью и вирулентностью для лабораторных животных.

4. Методом ПЦР и секвенирования выявлены значительные различия в структуре профага СТХср геновариантов V. cholerae биовара эльтор. Вариабельность профага выражается в присутствии разных аллелей гена ctxB (ctxBl, ctxB7), rstR (rstRE , rstlflass) и разного количества тандемных повторов (trp) в промоторной области оперона ctxAB. Полученные данные позволяют отнести все изученные штаммы к четырем генотипам: ctxBl, rstRE"or, trp3; ctxBl, rstRE!lor, trp4; ctxBl, rstRE"or/rstRc'ass, trp4; ctxB7, rstRE /rstRcla", trp5. При этом в большинстве случаев эпидемические вспышки и спорадические случаи заболевания холерой на территории России с 1993 по 2010 гг. были вызваны штаммами с генотипом ctxBl, rstRE"or/rstRc'a", trp4.

5. Установлено, что среди изученных с помощью блот-гибридизации штаммов измененных вариантов большинство изолятов содержат две копии профага СТХф.

6. Все исследованные штаммы измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор содержат полный набор генов островов патогенности VPI-1 и VPI-2. При этом геноварианты, завезенные на территории России в 20062010 гг., содержат аллель tcpE?:IRS, который характерен для изолятов, выделяемых в настоящее время на эндемичных по холере территориях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Горяев A.A., Шубина A.B., Смирнова H.H. Молекулярная диагностика измененных клинических штаммов возбудителя холеры эльтор // Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Молекулярная диагностика - 2010», М. - 2010. -С. 379-381.

2. Горяев A.A., Заднова С.П., Шубина A.B., Краснов Я.М., Смирнова Н.И. Измененные варианты возбудителя холеры, выделенные на территории Российской Федерации // Проблемы особо опасных инф. -2011. - Вып. 1(107). - С. 49-52. (журнал из перечня ВАК)

3. Шашкова A.B., Горяев A.A., Смирнова Н.И. Строение и функциональная роль CRISPR-системы бактерий // Проблемы особо опасных инф. - 2011. - Вып. 2(108). - С. 49-52. (журнал из перечня ВАК)

4. Шашкова A.B., Горяев A.A., Заднова С.П., Краснов Я.М., Смирнова Н.И. , Кутырев В.В. Конструирование ПЦР тест-системы для идентификации токсигенных штаммов Vibrio cholerae Ol, определения их биовара и дифференциации штаммов эльтор вибрионов на типичные и измененные // Проблемы особо опасных инф. - 2011. - Вып. 4(110). -С. 49-52. (журнал из перечня ВАК)

5. Смирнова Н.И, Заднова С.П., Шашкова A.B., Кутырев В.В. Вариабельность генома измененных вариантов Vibrio cholerae биовара Эль Тор, завезенных на территорию России в современный период // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. - 2011. - №4. - С. 11-18. (журнал из перечня ВАК)

6. Шашкова A.B., Краснов Я.М. Генотипы измененных вариантов Vibrio cholerae биовара Эль Тор, выделенных на территории России // Материалы III научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора. — Протвино: A-ПРИНТ ЗАО, 2011. - С. 145-147.

7. Заднова С.П., Шашкова A.B., Смирнова Н.И., Кутырев В.В. «Молекулярно-генетический анализ измененных вариантов Vibrio cholerae биовара эльтор, завезенных в Российскую Федерацию, и способ их обнаружения» // Материалы совещания специалистов Роспотребнадзора по вопросам совершенствования эпидемиологического надзора за холерой и материалы проблемной комиссии (48.04) «Холера и патогенные для человека вибрионы». - Ростов-на-Дону, 2011. - Вып. 24. - С. 93-96.

8. Шашкова A.B., Кулыпань Т.А., Заднова С.П., Смирнова Н.И. Молекулярно-генетический анализ и изучение генетического родства измененных вариантов холерного вибриона биовара Эль Тор, выделенных в Российской Федерации / Материалы X съезда ВНПОЭМП (Москва) // Инфекция и иммунитет. - 2012. — Т. 2, №1-2. — С.344.

9. Заднова С.П., Шашкова A.B., Краснов Я.М., Смирнова Н.И. Фенотипический и генетический анализ измененных вариантов Vibrio cholerae биовара эльтор И Проблемы особо опасных инф. — 2012. — Вып. 1(111).-С. 57-62.

Ю.Смирнова Н.И., Горяев A.A., Шубина A.B., Заднова С.П., Кутырев В.В. Способ идентификации токсигенных штаммов V. cholerae Ol, определения их биовара и дифференциации штаммов биовара эльтор на типичные и измененные методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления. Патент № 2458141 от 05.03.2012г.

Подписано к печати 2.10.2012 Формат 60x84 1/16 Печать лазерная Бумага офисная Объем 1,0 усл. п. л. Тираж 100 экз. Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучи

человека

410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шашкова, Алена Владимировна

СПИСОК ПРИНЯТЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Фенотипические и генетические особенности измененных вирулентных вариантов V. ско1егае биовара эльтор

1.1.1 Фенотипические особенности вирулентных геновариантов V. ско1егае биовара эльтор

1.1.2 Генетические особенности строения профага СТХф измененных вирулентных вариантов V. ско1егае биовара эльтор

1.1.3 Генетические особенности структуры локусов хромосомы измененных вариантов V. ско1егае биовара эльтор, связанных с вирулентностью и пандемичностью

1.2. Механизмы возникновения измененных вариантов холерных эльтор вибрионов СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Бактериальные штаммы

2.2. Питательные среды и реактивы

2.3. Методы

2.3.1 Культивирование штаммов

2.3.2 Определение питательных потребностей, гемолитической активности, продукции растворимой гемагглютинин/протеазы, 43 фосфолипазы и подвижности

2.3.3 Изучение продукции холерного токсина и токсинкорегулируемых пилей адгезии

2.3.4 Определение чувствительности к антибактериальным препаратам

2.3.5 Изучение вирулентности и токсигенности штаммов V. cholerae

2.3.6 ПЦР-анализ

2.3.7 ДНК-ДНК гибридизация по Саузерну

2.3.8 Секвенирование

ГЛАВА 3. КОНСТРУИРОВАНИЕ И АПРОБАЦИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ

ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ТОКСИГЕННЫХ ШТАММОВ VIBRIO CHOLERAE OI КЛАССИЧЕСКОГО И ЭЛЬТОР БИОВАРОВ, ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЭЛЬТОР ВИБРИОНОВ НА ТИПИЧНЫЕ И ИЗМЕНЕННЫЕ МЕТОДОМ МУЛЬТИЛОКУСНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИМ УЧЕТОМ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1. Выбор ДНК-мишеней, подбор праймеров

3.2. Оптимизация параметров мультиплексной ПЦР

3.3. Оптимизация схемы пробоподготовки и разработка набора реагентов для идентификации токсигенных штаммов Vibrio cholerae 01 классического и эльтор биоваров и дифференциации эльтор вибрионов на типичные и измененные методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с электрофоретическим учетом результатов

3.4. Изучение специфичности созданной мультиплексной ПЦР тест-системы «Ген Vibrio cholerae вариант сЬс5-РЭФ»

3.5. Выявление генетически измененных вариантов возбудителя холеры среди клинических штаммов, выделенных на территории России и стран ближнего зарубежья, с помощью разработанного набора

ГЛАВА 4. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ФЕНОТИПИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВИРУЛЕНТНЫХ ШТАММОВ V. СНОЬЕМЕ БИОВАРА ЭЛЬТОР

4.1. Продукция холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии у типичных и измененных клинических штаммов V. ско1егае биовара эльтор

4.2. Питательные потребности, гемолитическая, ферментативная активность и подвижность типичных штаммов и измененных вариантов V. ско1егае

4.3. Антибиотикоустойчивость типичных штаммов и измененных вариантов холерных вибрионов биовара эльтор

ГЛАВА 5. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИЗМЕНЕННЫХ ВАРИАНТОВ V. СНОЬЕЯАЕ БИОВАРА ЭЛЬТОР

5.1. Изучение структуры генома профага СТХср измененных вариантов V. ско1егае биовара эльтор

5.1.1 Определение аллелей генов сЬсВ и ШЯ

5.1.2 Определение числа копий профага СТХф у измененных вариантов

5.1.3 Структура промоторной области оперона с£хАВ

5.2. Анализ структуры островов патогенности УР1-1 и УР1-2 у измененных вариантов V. ско1егае биовара эльтор методом ПЦР-анализа и секвенирования

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фенотипический и молекулярно-генетический анализ измененных вариантов Vibrio cholerae биовара эльтор"

Актуальность проблемы. Холера - особо опасная инфекционная болезнь с диарейным синдромом, вызываемая токсигенными штаммами Vibrio cholerae. По данным Всемирной Организации Здравоохранения в последние годы в мире ежегодно регистрируется 3,0-5,0 млн. случаев холеры и более 100-120 тыс. человек умирает (Информационный бюллетень ВОЗ, N107, 2011). Современный период характеризуется наличием стойких очагов холеры в Юго-Восточной Азии и Африке. Крупные эпидемии и вспышки холеры на эндемичной территории, занос инфекции из эндемичных очагов практически на все континенты и тенденция к росту мировой заболеваемости определяют неблагоприятный прогноз по холере (Онищенко Г.Г. с соавт., 2005; Москвитина Э.А. с соавт, 2011, 2012). Возникновение эпидемических осложнений по холере в России связано с реальной возможностью ее завоза из зарубежных стран, неблагополучных по этой инфекции. Так, с 2005 г. по 2010 г. в России было зарегистрировано 8 случаев завоза холеры из Индии и Таджикистана (Москвитина Э.А. с соавт, 2011).

К настоящему времени известно о семи пандемиях холеры, среди которых первые шесть (1817-1923 гг.) предположительно были вызваны V. cholerae Ol классического биовара (Бароян О.В., 1971). Одной из характерных особенностей этого возбудителя является его высокая патогенность, обусловленная эффективной продукцией основных факторов вирулентности - токсин-корегулируемых пилей адгезии (ТКПА) и холерного токсина (ХТ), которые соответственно определяют развитие двух ключевых этапов инфекционного процесса - колонизацию холерными вибрионами тонкого кишечника и развитие профузной диареи (Kaper J.B. et al., 1995; De Haan L.et al., 2004). Однако к началу прошлого столетия на эндемичных по холере территориях эти вибрионы были постепенно вытеснены V. cholerae Ol серогруппы, но другого биовара - эльтор. Вследствие этого события возбудителем текущей, 7-ой, пандемии холеры (с 1961 г. по настоящее время) 6 стали токсигенные штаммы V. cholerae Ol биовара эльтор, отличающиеся от классических вибрионов по ряду фенотипических и генетических свойств (Бароян О.В., 1971; Waldor М.К. et al., 1996; Dziejman М. et al., 2002). К одним из основных генетических различий классического и эльтор биоваров относят отличия в нуклеотидных последовательностях двух генов, входящих в состав профага СТХф - гена ctxB из оперона ctxAB, кодирующего биосинтез XT, и гена-репрессора rstR. Вследствие этого аллели указанных генов у классических вибрионов обозначены как ctxBclass (или ctxBl) и rstRclass, у вибрионов эльтор -ctxBE"01 ' (или ctxB3) и rstREltor. Разная нуклеотидная последовательность генов ctxBl и ctxB3 обуславливает различия в аминокислотной последовательности В-субъединицы их токсинов, поэтому различают XT 1-го типа, продуцируемый классическими вибрионами, и XT 2-го типа, характерный для вибрионов эльтор (Olsvik О. et al., 1993; Waldor М.К. et al., 1996, 1997).

В течение 7-ой пандемии холеры геном ее возбудителя претерпел различные изменения. Одно из важнейших событий в эволюции этого возбудителя в современный период - возникновение новых генетически измененных вариантов (геновариантов) с повышенной вирулентностью, в геноме профага СТХф которых содержится аллель ctxBl (Nair G.B. et al., 2002; MoritaM. et al., 2008; Safa A. et al., 2010; Borkakoty B. et al., 2012). К настоящему времени эти геноварианты стали не только доминировать во многих странах Азии и Африки, но и проникать на новые территории (Гаити, Доминиканская Республика, Венесуэла) (Москвитина Э.А. с соавт., 2012; Nair G.B. et al., 2006; Grim C.J. et al., 2010; Safa A. et al., 2010; Tappero J.W. et al. 2011). В Российской Федерации, согласно последним данным, эпидемические вспышки и единичные случаи холеры во время седьмой пандемии были вызваны как типичными штаммами, так и измененными вариантами V. cholerae биовара эльтор, завезенными из различных стран Азии (Миронова Л.В. с соавт., 2010; Савельев В.Н. с соавт., 2010; Смирнова Н.И. с соавт., 2010). Однако в нашей стране отсутствуют комплексные диагностические тест-системы, 7 позволяющие одновременно проводить идентификацию штаммов холерного вибриона 01 серогруппы, определять их биовар и дифференцировать типичные и генетически измененные варианты V. ско1егае биовара эльтор. Несмотря на то, что геноварианты биовара эльтор уже обнаружены на территории России и стран ближнего зарубежья, все еще остаются неизученными их фенотипические свойства, не исследована вирулентность и устойчивость к антибиотикам. Недостаточно сведений о структуре профага СТХф и острова патогенности УР1-1, несущих основные гены вирулентности с£сАВ и КрА-Е, кодирующие продукцию ХТ и ТКПА. Вместе с тем, изучение структуры генома и экспрессии генов вирулентности и жизнеобеспечения измененных вариантов эльтор необходимо для оценки их генетического разнообразия и выяснения механизма образования.

Все вышеперечисленное определяет актуальность диссертационной работы, целью которой является проведение сравнительного анализа фенотипических и молекулярно-генетических свойств типичных штаммов и измененных вариантов V. ско1егае 01 серогруппы биовара эльтор, выделенных на территории Российской Федерации и сопредельных государств.

Задачи исследования:

1. Разработать мультиплексную ПЦР тест-систему для идентификации токсигенных штаммов V. ско1егае 01 классического и эльтор биоваров с одновременной дифференциацией типичных штаммов и измененных вариантов эльтор вибрионов. С помощью разработанной тест-системы провести анализ клинических штаммов, завезенных на территорию Российской Федерации и стран ближнего зарубежья, и выявить измененные варианты возбудителя холеры эльтор.

2. Провести сравнительный анализ фенотипических свойств типичных штаммов и измененных вариантов V. ско1егае 01 биовара эльтор. Определить уровень продукции холерного токсина и оценить вирулентные свойства геновариантов.

3. Изучить структуру профага СТХ(р, кодирующего биосинтез холерного токсина, у измененных эльтор вариантов, завезенных в Российскую Федерацию в современный период. Определить генотипы исследованных штаммов.

4. Определить количество копий профага СТХф в геноме измененных вариантов холерных вибрионов биовара эльтор.

5. Выявить наличие островов патогенности VPI-1 и VPI-2 у геноваринтов V. cholerae биовара эльтор и провести сравнительный анализ нуклеотидной последовательности гена tcpA.

Научная новизна работы

Впервые проведен комплексный фенотипический и молекулярно-генетический анализ 60 штаммов V. cholerae Ol серогруппы биовара эльтор, выделенных в Российской Федерации и странах ближнего зарубежья с 1970 по 2010 гг. Установлено, что, начиная с 1993 г., причиной эпидемических осложнений на территории Российской Федерации были измененные варианты, содержащие в геноме профага СТХф ген ctxB классического типа.

Впервые проведен сравнительный анализ продукции основных и дополнительных факторов патогенности у типичных штаммов и измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор, выделенных на территории России и сопредельных государств с 1993 по 2010 гг. При определении экспрессии холерного токсина выявлено, что генетически измененные варианты в условиях in vitro синтезируют в 2-10 раз больше холерного токсина по сравнению с типичными клиническими штаммами V. cholerae биовара эльтор. Установлено, что геноварианты не отличаются от типичных штаммов по продукции гемолизина, но обладают повышенной подвижностью. На модели лабораторных животных подтверждена высокая токсигенность и вирулентность геновариантов по сравнению с типичными эльтор вибрионами.

Получены новые сведения о вариабельности профага СТХф измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор, выделенных на территории Российской 9

Федерации и стран ближнего зарубежья, выражающейся в присутствии в его геноме разных аллелей гена ctxB (ctxBl или ctxBT), rstR (rstRclass и/или rstREltor), а также разного числа тандемных гептаповторов в промоторной области оперона ctxAB (trp3, trp4, trp5). Полученные данные позволили отнести все изученные штаммы к 4-м генотипам: ctxB 1, rstREltor, trp3; ctxBl, rstRElt0\ trp4; cíxBl, rstRElíor/rstRclass, trp4; ctxBl, rstREltorlrstRclass, trp5.

Впервые определено количество копий оперона ctxAB у геновариантов, выделенных на территории России и сопредельных государств. Установлено, что в хромосоме большинства изученных штаммов (90 %) присутствует две копии оперона ctxAB, что свидетельствует о наличии в геноме двух копий профага СТХф.

При определении нуклеотидной последовательности гена tcpA, кодирующего основную субъединицу токсин-корегулируемых пилей адгезии и входящего в состав острова патогенности VPI-1, впервые установлено, что штаммы геновариантов, завезенные в Россию после 2006 г., имеют отличную как от классических, так и от типичных эльтор вибрионов нуклеотидную последовательность гена tcpA.

Приоритетность выполненных исследований подтверждена получением патента РФ на изобретение (патент № 2458141 от 05.03.2012г).

Практическая значимость работы

Предложен способ идентификации токсигенных штаммов V. cholerae OI серогруппы, определения их биовара (классический или эльтор) и дифференциации типичных и генетически измененных холерных вибрионов биовара эльтор. На основе разработанного способа сконструирован «Набор реагентов для идентификации токсигенных штаммов Vibrio cholerae OI классического и эльтор биоваров и дифференциации эльтор вибрионов на типичные и измененные методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с электрофоретическим учетом результатов (Ген Vibrio cholerae вариант с/х#-РЭФ)», зарегистрированный в Федеральной службе по надзору в

10 сфере здравоохранения и социального развития (РУ № ФСР 2012/ 13427 от 21.05.2012 г.) и рекомендованный для применения в Российской Федерации.

По результатам работы составлены методические рекомендации «Мультиплексный ПЦР-анализ для выявления измененных штаммов Vibrio cholerae 01 биовара эльтор, несущих профаг вирулентности СТХср с генами классических вибрионов», одобренные Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол №6 от 13.10.2010 г.) и утвержденные директором.

В Государственной коллекции патогенных бактерий депонированы:

- три штамма (V. cholerae OI серогруппы классического биовара, V. cholerae 01 серогруппы эльтор биовара и V. cholerae 0139 серогруппы) с изученными молекулярно-генетическими характеристиками, используемых в качестве референс-штаммов при проведении геномной паспортизации штаммов возбудителя холеры (КМ259, КМ260, КМ261);

- коллекция из 6 штаммов генетически измененных вариантов с изученным генотипом в качестве штаммов, несущих разный набор генов вирулентности (КМ265, КМ266, КМ267, КМ268, КМ269, КМ270).

Полученные в ходе выполнения данные по изучению генетической организации измененных вариантов V. cholerae OI биовара эльтор используются при чтении лекций «Микробиология и генетика возбудителя холеры» на курсах первичной специализации по особо опасным инфекциям при РосНИПЧИ «Микроб» и курсах повышения квалификации по программе усовершенствования врачей по специальности «бактериология» при РосНИПЧИ «Микроб».

Положения, выносимые на защиту: 1. Сконструированная мультиплексная ПЦР тест-система позволяет идентифицировать токсигенные штаммы холерного вибриона 01 серогруппы, определять принадлежность к классическому или эльтор биовару и проводить дифференциацию штаммов V. cholerae биовара эльтор на типичные изоляты и генетически измененные варианты.

2. На территории России вспышки и спорадические случаи заболевания холерой, начиная с 1993 года, были вызваны измененными вариантами холерных вибрионов биовара эльтор. Геноварианты V. cholerae биовара эльтор в отличие от типичных эльтор вибрионов в условиях in vitro синтезируют больше холерного токсина и являются более вирулентными для лабораторных животных - крольчат-сосунков.

3. Измененные варианты V. cholerae биовара эльтор, выделенные с 1993 по 2010 гг. на территории Российской Федерации при эпидемических вспышках и единичных случаях холеры, отличаются между собой по структуре профага СТХф, содержащего разные аллеи генов ctxB, rstR и разное количество тандемных повторов TTTTGAT в промоторной области оперона ctxAB. В геноме большинства изученных штаммов геновариантов профаг СТХф присутствует в количестве 2 копий. Штаммы измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор несут полный набор генов островов патогенности VPI-1 и VPI-2. В составе VPI-1 геновариантов, выделенных после 2006 г., содержится аллель tcpETCIRS.

Апробация работы.

Материалы диссертации представлены на VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Молекулярная диагностика - 2010» (Москва, 2010), на III научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Протвино, 2011), на совещании специалистов Роспотребнадзора по вопросам совершенствования эпидемиологического надзора за холерой (Ростов-на-Дону, 2011), проблемной комиссии (48.04) «Холера и патогенные для человека вибрионы» Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской

12

Федерации (Ростов-на-Дону, 2012), на X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2012), на IV Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2012), ежегодных научно-практических конференциях «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2010-2012).

Работа выполнена в рамках плановой НИР 37-4-09 «Изучение природных и генетически измененных штаммов холерного вибриона и установление связи между вариабельностью генома и патогенными свойствами V. ско1егае»; Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009 - 2013 годы) в рамках государственных контрактов № 70-Д от 25.07.2011 г., лот 12, тема «Оценка изменчивости фенотипических и генетических свойств вирулентных штаммов возбудителей инфекционных болезней при смене ими экологических ниш обитания» и № 53-Д от 04.06.2012 г., лот 12, тема «Молекулярно-генетические особенности генетически измененных штаммов возбудителей опасных инфекционных болезней и их значимость в изменении вирулентных свойств и адаптации патогенов к меняющимся условиям окружающей среды».

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 10 работ, из которых 5 статей в рекомендованных ВАК изданиях и один патент.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 197 цитируемых работ, из них 35 отечественных и 162 зарубежных. Общий объем диссертации составляет 131 страницу. Текст иллюстрирован 16 таблицами и 12 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Шашкова, Алена Владимировна

выводы

1. Разработан способ идентификации токсигенных штаммов V. cholerae Ol, определения их биовара и дифференциации холерных вибрионов биовара эльтор на типичные и измененные методом мультиплексной полимеразной цепной реакции.

2. Установлено, что причиной эпидемических вспышек и спорадических случаев заболевания холерой на территории России, начиная с 1993 г., являются измененные варианты холерных вибрионов биовара эльтор, несущие аллель ctxBl (классического типа).

3. При фенотипическом анализе показано, что изученные штаммы геновариантов V. cholerae Ol биовара эльтор продуцируют in vitro в 2-10 раз больше холерного токсина, чем типичные эльтор вибрионы, а также отличаются повышенной токсигенностью и вирулентностью для лабораторных животных.

4. Методом ПЦР и секвенирования выявлены значительные различия в структуре профага СТХср геновариантов V. cholerae биовара эльтор. Вариабельность профага выражается в присутствии разных аллелей гена ctxB (ctxBl, ctxB 7), rstR (rstREltor, rstRclass) и разного количества тандемных повторов (trp) в промоторной области оперона ctxAB. Полученные данные позволяют отнести все изученные штаммы к четырем генотипам: ctxBl, rstREltor, trp3; ctxBl, rstRmt0\ trp4; ctxBl, rstREhorlrstRclas\ trp4; ctxB7, rstREltor/rstRclass, trp5. При этом в большинстве случаев эпидемические вспышки и спорадические случаи заболевания холерой на территории России с 1993 по 2010 гг. были вызваны штаммами с генотипом ctxBl, rstRE"°7rstRclass, trp4.

5. Установлено, что среди изученных с помощью блот-гибридизации штаммов измененных вариантов большинство изолятов содержат две копии профага СТХф.

6. Все исследованные штаммы измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор содержат полный набор генов островов патогенности VPI-1 и VPI-2. При этом геноварианты, завезенные на территории России в 20062010 гг., содержат аллель tcpElrCIRS, который характерен для изолятов, выделяемых в настоящее время на эндемичных по холере территориях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В 2011 г. на Всемирной Ассамблее Здравоохранения холера была признана серьезной проблемой для всех стран мирового сообщества. Особое внимание привлекает к себе эпидемия в республике Гаити, начавшаяся в 2010 г. и продолжающаяся до настоящего времени, где выявлено более 500 тыс. больных, из которых свыше 6 тыс. умерло. Наличие стойких эндемичных очагов в ряде стран Азии и Африки с сезонными подъемами заболеваемости увеличивает вероятность заноса возбудителя холеры на неэндемичные территории, в том числе и в развитые страны. Так, с 2002 по 2011 гг. было зарегистрировано 1173 импортированных случаев инфекции в США, Канаду, Испанию. Тенденция роста заболеваемости выявлена и при эпидемическом анализе заболеваемости в России и СНГ в последние годы (2002-2011 гг.) (Москвитина Э.А. с соавт., 2012).

На современном этапе седьмой пандемии холеры основным возбудителем являются холерные вибрионы 01 серогруппы биовара эльтор, несущие в своем геноме классический аллель гена ctxB. Данные геноварианты или измененные варианты), имея характерные признаки эльтор вибрионов, продуцируют XT первого (классического) типа и являются более вирулентными, вызывая тяжелые случаи заболевания с высокой летальностью.

В связи с этими обстоятельствами очевидной является необходимость разработки быстрых и специфичных методов выявления измененных вариантов

V. cholerae биовара эльтор. Нами впервые на основе мультиплексной ПЦР разработан способ и набор для одновременной идентификации токсигенных штаммов V. cholerae 01 серогруппы, определения биовара исследуемого штамма и дифференциации эльтор вибрионов на типичные изоляты и измененные варианты. При этом ПЦР проводят в один прием в двух реакционных смесях, каждая из которых содержит праймеры к генам rfbOl, cas3, ctxBclass в первой, и rfbOl, rtxC, ctxBEltor во второй. В ходе экспериментов подобрано оптимальное сочетание компонентов реакционной смеси, а также

102 режим амплификации, позволяющий получать достоверные и легко интерпретируемые результаты. Набор содержит все необходимые реагенты для проведения полимеразной цепной реакции и анализа полученных ампликонов. Токсигенные штаммы V. cholerae 01 серогруппы классического биовара идентифицируют по наличию ампликонов к генам rfbOl, cas3, ctxBclass. Типичные токсигенные штаммы эльтор вибрионов образуют ампликоны к генам rJbOl, rtxC, ctxBEltor. Для измененных вариантов эльтор вибрионов наряду с генами rfbOl и rtxC характерно наличие ампликона к гену ctxBclass. Специфичность сконструированного набора подтверждена с использованием штаммов гетерологичных бактерий и холерных вибрионов 0139 и не01/не0139 серогрупп. Набор реагентов для идентификации токсигенных штаммов Vibrio cholerae OI классического и эльтор биоваров и дифференциации эльтор вибрионов на типичные и измененные методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с электрофоретическим учетом результатов (Ген Vibrio cholerae вариант с/х8-РЭФ) прошел государственную регистрацию (РУ № ФСР 2012/ 13427 от 21.05.2012 г.) и рекомендован для применения в Российской Федерации.

С помощью сконструированного набора реагентов нами было изучено 58 штаммов холерных вибрионов биовара эльтор, выделенных на территории Российской Федерации и стран ближнего зарубежья с 1970 по 2010 гг. В результате установлено, что, начиная с 1993 г., эпидемические осложнения и единичные случаи заболевания холерой на территории России были вызваны измененными вариантами холерных вибрионов биовара эльтор, содержащими ген ctxBl (классического типа).

На следующем этапе работы был проведен фенотипический и молекулярно-генетический анализ выявленных измененных вариантов

V. cholerae биовара эльтор. При изучении продукции холерного токсина установлено, что геноварианты синтезируют в 2-10 раз больше холерного токсина, чем типичные изоляты этого биовара. При этом часть штаммов измененных вариантов синтезировали повышенное количество ХТ в условиях

103 оптимальных для продукции данного антигена классическими вибрионами. Эксперименты на лабораторных животных подтвердили высокую токсигенность и вирулентность измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор.

Все исследованные штаммы геновариантов были прототрофами и не отличались от типичных изолятов по продукции термолабильного гемолизина, но имели незначительные отличия по экспрессии ферментов патогенности. В то же время установлено, что измененные варианты V. cholerae эльтор биовара в отличие от типичных штаммов являются более подвижными. При этом повышение продукции XT и подвижности можно рассматривать как один из механизмов, обеспечивающих повышенный уровень патогенности измененных вариантов по сравнению с типичными изолятами.

Учитывая, что множественная антибиотикоустойчивость циркулирующих в настоящее время штаммов холерного вибриона представляет большую проблему для здравоохранения стран Азии и Африки нами был проведен сравнительный анализ антибиотикоустойчивости штаммов V. cholerae эльтор биовара, выделенных на территории России и сопредельных государств с 1970 по 2010 гг. В результате установлено, что типичные штаммы, выделенные в начале седьмой пандемии, были устойчивы к 1-2 антибактериальным препаратам, в то время как исследованные штаммы измененных вариантов обладали устойчивостью уже к 3-5 антибиотикам. Полученные нами результаты подтверждают данные зарубежных исследователей, что характерной особенностью штаммов, выделяемых в последние годы, является множественная лекарственная устойчивость, выражающаяся в резистентности к противомикробным препаратам разных групп, в том числе и часто используемым для лечения холеры (Tran H.D. et al., 2012).

При молекулярно-генетическом исследовании измененных вариантов

V. cholerae биовара эльтор особое внимание было уделено изучению структуры мобильных генетических элементов, содержащих основные гены

104 вирулентности - профага СТХф и острова патогенности VPI-1, несущих соответственно гены ctxAB, кодирующие биосинтез холерного токсина, и tcpA-F, ответственные за продукцию токсин-корегулируемых пилей адгезии. ПЦР-анализ структуры профага вирулентности СТХф и фланкирующей его последовательности RS1 показал, что измененные варианты, как и типичные токсигенные штаммы, содержат все гены, входящие в состав данных мобильных элементов. Учитывая, что основные различия типичных штаммов и измененных вариантов заключаются в структуре генов cíxB и rtsR, нами было проведено их секвенирование. При этом были подтверждены данные ПЦР и показано, что действительно штаммы, выделенные на территории России и стран ближнего зарубежья до 1991 г., содержали в геноме профага СТХф эльтор аллель ctxB3, а изолированные с 1991 по 2006 г., имели аллель ctxBl, характерный для классических вибрионов. При секвенировании нами было обнаружено три штамма, завезенных в 2010 г. (Москва), которые имели новый аллель - ctxBl. При изучении наличия гена rstR с помощью аллель-специфической ПЦР и секвенирования было показано, что все типичные штаммы содержали эльтор аллель этого гена. Среди изученных 32 измененных вариантов большинство штаммов (68,9 %) содержали два аллеля гена rstR -классический и эльтор, что наряду с наличием генов ctxBl или ctxB7 указывает на присутствие двух профагов СТХф - классического (\ctxBllctxB7 и rstRclass) и гибридного (ctxBl/ctxB7 и rstREltor). Менее распространенными (9 или 28,1 %) были изоляты, которые несли только ген rstREltor, что свидетельствует о наличии в их хромосоме только гибридного профага СТХф. Среди исследованных нами штаммов обнаружен один штамм - V. cholerae PI5384, выделенный на Украине в 1991 г., который имел аллель rstRclass, т.е. содержал профаг СТХф классического типа.

При определении числа копий профага СТХф у 10 штаммов холерных вибрионов биовара эльтор методом ДНК-ДНК гибридизации по Саузерну с использованием СТ-зонда, созданного на основе амплифицированного фрагмента гена ctxA, было показано, что только штамм V. cholerae PI8899,

105 завезенный в 2006 г. в Мурманск, содержал одну копию профага, соответствующую по размеру типичным штаммам холерного вибриона биовара эльтор. В то же время 9 штаммов имели две копии профага СТХф. При этом было обнаружено две группы штаммов, различающихся величиной РбИ-фрагментов, гибридизующихся с СТ-зондом. Первая группа включала 4 штамма - М1272, М1270, М1268, М1293, выделенных в 1993-1994 гг., которые содержали два фрагмента размером 7,0 и 9,0 т.п.н. Во вторую группу вошли 5 штаммов - М1345, М1429, М1430, Л3226, Л4150, изолированные в 20012010 гг. имеющих две копии профага СТХф размером 5,4 и 7,0 т.п.н. Учитывая данные зарубежных исследователей, показавших, что размер гибризационных фрагментов четко коррелирует с локализацией профагов СТХф на хромосомах (ВакЬвЫ В. е! а1., 2008), нами было высказано предположение о локализации профагов у изученных штаммов. У штаммов первой группы две копии локализованы в тандемном порядке на малой хромосоме, а у второй группы -также как утипичных холерных вибрионов эльтор в тандемном порядке на большой хромосоме. При этом локализация профага СТХф на малой хромосоме была подтверждена в дальнейшем с помощью ПЦР.

Исследование структуры промоторной области оперона с£кАВ показало, что большая часть геновариантов, как и типичные штаммы содержали по 4 копии гептаповтора ТТТГСАТ (1гр4), являющиеся сайтами связывания регуляторного белка ТохЫ при активации тарнскрипции оперона сЬсАВ. В то же время штаммы, выделенные в Ачинске и Иркутске в 1997 г., содержали по 3 копии ^грЗ), а штаммы, выделенные в Москве в 2010 г., имели 5 копий гептаповторов (Ър5).

Таким образом, при исследовании структуры профага СТХф измененных вариантов холерных вибрионов биовара эльтор установлена его вариабельность, что отличает их типичных изолятов, имеющих однородную структуру данного мобильного элемента. При этом вариабельность профага СТХф выражалась в наличии разных аллелей с1хВ (сЬс51 или с£хВ7), и/или Г81ЯШ10Г) и разного числа тандемных повторов ТТТГСАТ в

106 промоторной области оперона ctxAB. На территорию России и сопредельных государств были завезены штаммы измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор, относящиеся к четырем генотипам: ctxBX, rstREltor, trp3; ctxBX, rstREItor, trp4; ctxBX, rstREltor/rstRclass, trp4; ctxBl, rstREltorlrstRclas\ trp5. Среди которых наиболее распространенными были штаммы с генотипом ctxBX, rstREltorlrstRclass, trp4, содержащие две разные копии профага СТХф - классическую и гибридную.

Поскольку в вирулентности холерных вибрионов важную роль играют также антигены, кодируемые генами, расположенными на островах патогенности VPI-1 и VPI-2, в дальнейшем был изучен их генный состав. При ПЦР тестировании было показано, что измененные варианты содержат полноценные последовательности VPI-1 и VPI-2, что говорит о стабильности этих мобильных генетических элементов и их важной роли в реализации патогенеза. Поскольку последовательность гена tcpA, входящего в состав VPI-1 и кодирующего основную субъединицу токсин-корегулируемых пилей адгезии, отличается у классических и эльтор вибрионов, что имеет существенные значение для проявления вирулентности, нами было проведено секвенирование данного гена у пяти произвольно взятых штаммов измененных вариантов, выделенных на территории России. В результате было выявлено, что только последовательность гена tcpA штамма V. cholerae PI7644 (Ачинск, 1997) была идентична эльтор вибрионам. В то же время другие изученные штаммы -PI8899 (Мурманск, 2006), Л3225, Л3226, JI4150 (Москва, 2010) содержали однонуклеотидную замену в положении 266 от начала гена. Сравнение полученных последовательностей с последовательностями гена tcpA, приведенными в GenBank, показало, что данные штаммы несут аллель tcpEIrCIRS, характерный для штаммов, выделяемых в настоящее время на эндемичных по холере территориях (Reimer A.R. et al., 2011; Talkington D. et al., 2011).

Итак, подводя итоги проведенной работе можно заключить, что сконструированный «Набор реагентов для идентификации токсигенных

107 штаммов V. cholerae OI классического и эльтор биоваров и дифференциации эльтор вибрионов на типичные и измененные методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с электрофоретическим учетом результатов (Ген Vibrio cholerae вариант cíxfí-РЭФ)» позволяет выявлять измененные варианты холерного вибриона биовара эльтор. Впервые проведенный комплексный фенотипический и молекулярно-генетический анализ измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор, завезенных на территории Россию с 1993 по 2010 гг., показал, что геноварианты в отличие от типичных клинических штаммов V. cholerae биовара эльтор являются более вирулентными. При этом повышение вирулентности может быть обусловлено несколькими различными механизмами, так как изученные нами геноварианты отличались по структуре генома. Выявлена вариабельность двух мобильных генетических элементов -профага вирулентности СТХср и острова патогенности VPI-1, кодирующих продукцию основных факторов патогенности - холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии. Дальнейшее изучение структуры и функции генома измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор будет способствовать выявлению генетического разнообразия штаммов возбудителя холеры с повышенной вирулентностью, а также созданию новых диагностических тест-систем.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шашкова, Алена Владимировна, Саратов

1. Бароян О.В. Холера Эль-Тор. Текст. М., Медицина, 1971.

2. Гинцбург А.Л., Янишевский Н.В., Мотин В.Л. с соавт. Организация и клонирование структурных генов энтеротоксина Vibrio cholerae eltor RV79 Текст. // Мол. генет., микробиол. и вирусол. 1984. - № 9. - С. 12-18;

3. Заднова С.П., Ливанова Л.Ф., Крепостнова И.М. с соавт. Комплексная гено-и иммунодиагностическая тест-система для идентификации холерных вибрионов Ol и Ol39 серогруппы и оценки их вирулентности. Текст. Патент РФ № 2404257, опубликован 20.11.10 г.

4. Информационный бюллетень ВОЗ, 2011. N107.

5. Исаев Н.Д. Фенотипический и генетический анализ изогенных вариантов холерного вибриона с альтернативным уровнем экспрессии факторов патогенности и персистенции Текст.: диссертация. кандидата биологических наук: 03.00.07, 03.00.04. Саратов, 2007. 149с.

6. Кузьмиченко И.А., Громова О.В., Джапаридзе М.Н. с соавт. Тест среды для определения активности твиназы, протеазы и фосфолипазы в холерной химической вакцины и её компонентах Текст. // Пробл. особо опасных инф. 2002. - Вып. 83. - С. 148-152.

7. Лабораторная диагностика холеры. Методические указания МУ 4.2.2218-07. Текст. Москва. 2007.

8. Ю.Ломов Ю.М. Эволюция возбудителя холеры и прогноз по этой инфекции на ближайшее будущее Текст. // Эпидемиология и инфекционные болезни. -2004.-№ 1.р. 7-12.

9. П.Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование Текст. М., 1984.-480с.

10. Миронова Л.В., Балахонов C.B., Урбанович Л .Я. с соавт. Обнаружение «гибридных» штаммов Vibrio cholerae Eltor при эпидемических осложнениях в Сибири и на Дальнем Востоке Тескт. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. — 2011. — N5. — С. 12-18.

11. Монахова Е.В., Ломов Ю.М., Михась Н.К., Писанов Р.В. Структура и изменчивость неполного СТХ-элемента холерных вибрионов Текст. // Пробл. особо опасных инф. 2007. - Вып. 93. - С. 58-61.

12. Москвитина Э.А., Мазрухо А.Б., Адаменко О.Л., Кругликов В.Д. Холера в начале XXI века. Прогноз на глобальном уровне Текст. // Пробл. особо опасных инф.-2012.-Вып. 111.-С. 11-16.

13. Нефедов К.С. Сравнительный анализ фенотипических и молекулярно-генетических свойств холерных вибрионов эльтор, выделенных до начала и в период седьмой пандемии холеры Текст.: диссертация. кандидата медицинских наук: 03.00.07, Саратов, 2009. 153с.

14. Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности МУ 1.3.2569 -09 Текст. М. 2009.

15. Осин A.B., Нефедов К.С., Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И. Сравнительный анализ геномов холерных вибрионов эльтор, выделенных до начала и в разные периоды седьмой пандемии холеры Текст. // Генетика. 2005. - Т.41, №1. - С.1-10.

16. Осина H.A., Бугоркова Т.В., Коннова С.С. с соавт. Способ детекции и определения биотипа, серогруппы и токсигенности возбудителя холеры и набор для его осуществления Текст. Патент РФ №2360972, опубликован 10.07.10 г.

17. Подосинникова JI. С. Холерные вибрионы, выделенные на территории СССР в период седьмой пандемии Текст.: автореф. диссертации. доктора медицинских наук. Саратов, 1993. - 44с.

18. Смирнова Н.И. Генетический контроль патогенности Vibrio cholerae: умеренный нитевидный фаг СТХ, кодирующий холерный токсин, и остров «патогенности» Текст. // Мол. генет., микробиол. и вирусол. 1999. - №4. -С. 3-10.

19. Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Эволюция возбудителя холеры Текст. // Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2004. - № 4. - С. 3-13.

20. Смирнова Н.И., Горяев A.A., Кутырев В.В. Эволюция генома возбудителя холеры в современный период Текст. // Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2010. -№4. - С.11-19.

21. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования Текст. М., Медицина. 1982. С. 463.

22. Телесманич Н.Р., Непомнящая Н.Б., Винокур Н.И. Гемолизины холерных вибрионов как липопротеиновые полиферментные комплексы Текст. // Сборник материалов проблемной комиссии «Холера и патогенные вибрионы». Ростов-на-Дону, 2001. Вып. 14. - С. 52-55.

23. Телесманич Н.Р., Мишанькин М.Б. Биологическая роль гемоцитолизина холерных вибрионов Текст. // Сборник материалов проблемной комиссии «Холера и патогенные вибрионы». Ростов-на-Дону, 2002. Вып. 15. - С. 4649.

24. Тудор В., Страти И. Оспа. Холера. Текст. Бухарест. -1981. 360с.

25. Урбанович Л.Я., Марамович A.C., Балахонов C.B. с соавт. Ускоренные методы лабораторной диагностики в системе эпиднадзора за холерой Текст. //113

26. Сборник материалов проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону. - 2007. - Вып. 20. - С. 43-46.

27. Челдышова Н.Б. Дифференциация штаммов Vibrio cholerae Ol с различной эпидемической значимостью на основании четырех генов вирулентности: ctxA, tcpA, toxR и hapA Текст.: диссертация. кандидата медицинских наук. -Саратов,-2002.- 173с.

28. Щелканова Е.Ю., Горяев A.A., Смирнова Н.И. Изменение генома профага СТХф Vibrio cholerae биовара эльтор, вызываемое транспозоном Tn5-Mob Текст. // Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2008. - №3. - С. 11-17.

29. Alam М., Nusrin S., Islam А. et al. Cholera between 1991 and 1997 in Mexico was associated with Infection by Classical, El Tor, and El Tor Variants of Vibrio cholerae Text. 11 J. Clin. Microbiol. 2010. - Vol. 48, N10. - P. 3666-3674.

30. Albert M.J., Bhuiyan N.A., Talukder K.A. et al. Phenotypic and genotypic changes in Vibrio cholerae 0139 Bengal Text. // J. Clin. Microbiol. 1997. -Vol. 35, N10.-P. 2588-2592.

31. Ang G.Y., Yu C.Y., Balqis K. et al. Molecular evidence of cholera outbreak caused by a toxigenic Vibrio cholerae Ol El tor variant strain in Kelantan, Malaysia Text. 11 J. Clin. Microbiol. 2010. - Vol. 48, N11. - P. 3963-3969.

32. Bakhshi В., Pourshafie M.R., Navabakbar F., Tavakoli A. Genomic organization of the CTX element among toxigenic Vibrio cholerae isolates Text. // Clin. Microbiol. Infect. 2008. - Vol. 14. - P. 562-568.

33. Beck N.A., Krukonis E.S., DiRita V.J. TcpH influences virulence gene expression in Vibrio cholerae by inhibiting degradation of the transcription activator TcpP Text. //J. Bacteriol. 2004. - Vol. 186, N24. - P. 8309-8316.

34. Bhaskaran K., Rowley D. Nutritional studies on Vibrio cholerae Text. // J. Gen. Microbiol. 1956. - Vol. 15, N2. - P. All All.

35. Bhuiyan N.A., Nusrin S., Alam M. et al. Changing genotypes of cholera toxin (CT) of Vibrio cholerae 0139 in Bangladesh and description of three new CT genotypes Text. //FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2009. - Vol. 57, N2. -P.136-41.

36. Blokesch M., Schoolnik G.K. Serogroup conversion of Vibrio cholerae in aquatic reservoirs Text. // PLoS Pathog. 2007. - Vol. 3, N6. - e81.

37. Booth B.A., Boesman-Finkelstein M., Finkelstein R.A. Vibrio cholerae hemagglutinin/protease nicks cholera enterotoxin Text. // Infect. Immun. 1984. -Vol. 45, N3.-P. 558-560.

38. Borkakoty B., Biswas D., Devi U. et al. Emergence of classical ctxB genotype 1 and tetracycline resistant strains of Vibrio cholerae 01 El Tor in Assam, India 11 Tropical Med. Hyg. 2012. - Vol. 106. - P. 382-386.

39. Carroll P.A., Tashima K.T., Rogers M.B. et al. Phase variation in tcpH modulates expression of the ToxR regulon in Vibrio cholerae Text. // Mol. Microbiol. -1997.-Vol. 25, N6.-P. 1099-1111.

40. Chatterjee S., Patra T., Ghosh K. et al. Vibrio cholerae 01 clinical strains isolated in 1992 in Kolkata with progenitor traits of the 2004 Mozambique variant Text. //J. Med. Microbiol. 2009. - Vol. 58. - P. 239-247.

41. Chiang S.L., Taylor R.K., Koomey M., Mekalanos J.J. Single amino acid substitutions in the N-terminus of Vibrio cholerae TcpA affect colonization, autoagglutination, and serum resistance Text. // Mol Microbiol. 1995. -Vol. 17, N6.-P. 1133-1142.

42. Chin C.S., Sorenson J., Harris J.B. et al. Origin of the Haitian cholera outbreak strain Text. // N. Engl. J. Med. 2011. - Vol. 364, N1. - P. 33-42.

43. Choi S.Y., Lee J.H., Jeon Y.S. et al. Multilocus variable-number tandem repeat analysis of Vibrio cholerae Ol El Tor strains harbouring classical toxin В Text. // J. Med. Microbiol. 2010. - Vol. 59. - P. 763-769.

44. Chow K.H., Ng J.T.K., Yuen K.Y., Yami W.C. Detection of RTX toxin gene in Vibrio cholerae by PCR Text. I I J.Clin.Microbiol. 2001. - Vol. 30. - P. 25942597.

45. Chun J., Grim C.J., Hasan N.A. et al. Comparative genomics reveals mechanism for short-term and long-term clonal transitions in pandemic Vibrio cholerae Text. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2009. - Vol. 106, N36. - P. 15442-15447.

46. Cook W.L., Wachsmuth K., Johnson S.R. et al. Persistence of plasmids, cholera toxin genes, and prophage DNA in classical Vibrio cholerae Ol Text. 11 Infect. Immun. 1984.-Vol. 45, N1.-P. 222-226.

47. Das В., Halder К., Pal P., Bhadra R.K. Small chromosomal integration site of classical CTX prophage in Mozambique Vibrio cholerae Ol biotype El Tor strain Text. // Arch. Microbiol. 2007. - Vol. 188, N6. - P. 677-683.

48. Davis B.M., Kimsey H.H., Kane A.V., Waldor M.K. A satellite phage-encoded antirepressor induces repressor aggregation and cholera toxin gene transfer Text. // EMBO J. 2002. - Vol. 21. - P. 4240-4249.

49. De Haan L., Hirst T.R. Cholera toxin: a paradigm for multi-functional engagement of cellular mechanisms Text. // Mol. Membr. Biol. 2004. - Vol. 21, N2. - P.77-92.

50. De S.N., Chatterjee D.N. Experimental study of mechanism of action of Vibrio cholerae on intestional mucous membrane Text. // J. Path. Bacteriol. 1953. -Vol. 66.-P. 559-562.

51. Dubey R.S., Lindblad M., Holmgren J. Purification of El Tor cholera enterotoxins and comparisons with classical toxin Text. // J. General Microbiol. 1990. - Vol. 136. - P.1839-1847.

52. Dutta N.K., Habbu M.K. Experimental cholera in infant rabbits: a method for chemotherapeutic investigation Text. // Br. J. Pharmacol. Chemother. 1955. -Vol. 10,N2. -P.153-159.

53. Dziejman M., Balon E., Boyd D. et al. Comparative genomic analysis of Vibrio cholerae: genes that correlate with cholera endemic and pandemic disease Text. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - Vol. 99, N3. - P. 1556-1561.

54. Dziejman M., Serruto D., Tam V.C. et al. Genomic characterization of non-Ol, non-0139 Vibrio cholerae reveals genes for a type III secretion Text. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - Vol. 102, N9. - P. 3465-3470.

55. Edwards M.C., Gibbs R.A. Multiplex PCR: adwantages, development and applications Text. // PCR Methods and Applications. 1994. - Vol.3. - P. 65-75.

56. Epstein P.R., Ford T.E., Colwell R.R. Health and climate change: Marine ecosystems Text. // Lancet. 1993. - Vol. 342. - P. 1216-1219.

57. Faruque S.M., Alim A.R., Rahman M.M. et al. Clonal relationships among classical Vibrio cholerae 01 strains isolated between 1961 and 1992 in Bangladesh Text. //J. Clin. Microbiol. 1993. - Vol. 31, N9. - P. 2513-2516.

58. Faruque S.M., Nair G.B. Vibrio cholerae: Genomics and Molecular Biology. Text. Caister Academic Press. Eds. 2008.

59. Faruque S.M., Zhu J., Asadulghani et al. Examination of diverse toxin-coregulated pilus-positive Vibrio cholerae strains fails to demonstrate evidence for Vibrio pathogenicity island phage Text. // Infect. Immun. 2003. - Vol. 71, N6. -P. 2993-2999.

60. Faruque S.M.A., Kamruzzaman M., Nandi R.K., Ghosh A.N. et al. RSI of polymerase chain reaction-generated amplicons to identify three types of cholera toxin subunit B in Vibrio cholerae Ol strains Text. // J. Clin. Microbiol. 2002. -Vol. 31.-P. 22-25.

61. Faruque S.M.A., Tarn V.C., Chowdhury N. et al. Genomic analysis of the Mozambique strain of Vibrio cholerae Ol reveals the origin of El Tor strains carrying classical CTX prophage Text. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2007. -Vol. 104.-P. 5151-5156.

62. Fasano A., Baudry B., Pumplin D.W. et al. Vibrio cholerae produces a second en-terotoxin, which affects intestinal tight junctions Text. // Proc. Natl. Acad. Sei. -1991.-Vol. 88.-P. 5242-5246.

63. Fields P.I., Popovic T., Wachsmuth K., Olsvik O.Use of polymerase chain reaction for detection of toxigenic Vibrio cholerae Ol strains from the Latin American cholera epidemic Text. // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30, N8. - P. 21182121.

64. Finkelstein R.A., Atthasampunna P., Chulasamaya M., Charunmethee P. Pathogenesis of experimental cholera: biologic activities of purified procholeragen a Text. // J. Immunol. 1966. - Vol. 96, N3. - P. 440-449.

65. Finkelstein RA., Boesman-Finkelstein M., Chang Y., Hase С. Vibrio cholerae hemagglutinin/protease, colonial variation, virulence and detachment // Infect. Immun. 1992. - Vol. 60. - P. 472-478.

66. Galen J.E., Ketley J.M., Fasano A. et al. Role of Vibrio cholerae neuraminidase in the function of cholera toxin Text. // Infect. Immun. 1992. - Vol. 60, N2. -P. 406-415.

67. Ghosh-Banerjee J., Senoh M., Takahashi T. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae 01 compared to prototype El Tor and classical biotypes Text. // J. Clin. Microbiol. 2010. - Vol. 48, N 11. - P. 4283-4286.

68. Goel A.K., Jain M., Kumar P. et al. A new variant of Vibrio cholerae Ol El Tor causing cholera in India // J. Infect. 2008. - Vol. 57. - P. 280-281.

69. Goel A.K., Ponmariappan, S., Kamboj, D.V., Singh, L. Single multiplex polymerase chain reaction for environmental surveillance of toxigenic-pathogenic Ol and non-Ol Vibrio choleras Text. // Folia Microbiol. 2007. - Vol. 52. - P. 81-85.

70. Grim C.J., Choi J., Chun J. et al. Occurrence of the Vibrio cholerae seventh pandemic VSP-I island and a new variant Text. //OMICS. 2010. - Vol. 14, N1. -P. 1-7.

71. Grissa I., Vergnaud G., Pourcel C. The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats. BMC Bioinformatics 2007; 8:172. электронный ресурс . http://crispr.u-psud.fr/crispr/CRISPRHomePage.php.

72. Halder K., Das B., Nair G.B., Bhadra R.K. Molecular evidence favouring stepwise evolution of Mozambique Vibrio cholerae Ol El Tor hybrid strain Text. // Microbiology. 2010. - Vol. 156. - P. 99-107.

73. Haralalka S., Nandi S., Bhadra R.K. Mutation in the relA gene of Vibrio cholerae affects in vitro and in vivo expression of virulence factors Text. // J. Bacteriol. -2003. Vol. 185, N16. - P. 4672-4682.

74. Häse C.C., Finkelstein R.A. Cloning and nucleotide sequence of the Vibrio cholerae hemagglutinin/protease (HA/protease) gene and construction of an HA/protease-negative strain Text. // J. Bacteriol. 1991. - Vol. 173, N 11. -P. 3311-3317.

75. Hassan F., Kamruzzaman M., Mekalanos J.J., Faruque S.M. Satellite phage TLCcp enables toxigenic conversion by CTX phage through dif site alteration Text. // Nature.-2010.-Vol. 467, N7318.-P. 982-985.

76. Heidelberg J.F., Eisen J.A., Nelson W.C. et al. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae Text. // Nature. 2000. -Vol. 406.-P. 477-483.

77. Heilpern A. J., Waldor M. K. pIIICTX, a predicted CTXcp minor coat protein, can expand the host range of coliphage fd to include Vibrio cholerae Text. // J. Bacteriol.-2003.-Vol. 185.-P. 1037-1044.

78. Hendriksen R.S., Price L.B., Schupp J.M. et al. Population genetics of Vibrio cholerae from Nepal in 2010: evidence on the origin of the Haitian outbreak Text. // MBio. 2011. - Vol. 2, N4. - eOO 157-11.

79. Iredell J.R., Manning P.A. Biotype-specific tcpA genes in Vibrio cholerae Text. // FEMS Microbiol. Lett. 1994. - Vol. 121. - P. 47-54.

80. Iwanaga M., Yamamoto K., Higa N. et al. Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae 01 El Tor Text. // Microbiol. Immunol. 1986.-Vol. 30, N11.-P. 1075-1083.

81. Jermyn W.S., Boyd E.F. Characterization of a novel Vibrio pathogenicity island (VPI-2) encoding neuraminidase (nanH) among toxigenic Vibrio cholerae isolates Text. // Microbiology. 2002. - Vol. 148. - P. 3681-3693.

82. Jermyn W.S., Boyd E.F. Molecular evolution of Vibrio pathogenicity island-2 (VPI-2): mosaic structure among Vibrio cholerae and Vibrio mimicus natural isolates Text. //Microbiology.-2005.-Vol. 151.-P. 311-322.

83. Jonson G., Holmgren J., Svennerholm A. M. Identification of a mannose-binding pilus on Vibrio cholerae El Tor Text. // Microb. Pathog. 1991. -Vol. 11.-P. 433-441.

84. Jonson G., Holmgren J., Svennerholm A.-M. Epitope differences in toxin-coregulated pili produced by classical and El Tor Vibrio cholerae 01 Text. // Microbial Pathogenesis. 1991.-Vol. 11.-P. 179-188.

85. Joshi R.M., Albert M.J. Hybrid El Tor Vibrio cholerae Ol, Kuwait Text. // Emerg. Infect. Dis. 2009. - Vol. 15, N11.-P. 1879-1880.

86. Kaper J.B., Morris J.G., Levine M.M. Cholera Text. // Clin. Microbiol. Rev. -1995.-Vol. 8.-P. 48-86.

87. Karaolis D.K., Kaper J.B. Vibrio cholerae TCP: a trifunctional virulence factor? Response Text. // Trends Microbiol. 1999. - Vol. 7. - P. 393.

88. Karaolis D.K., Johnson J.A., Bailey C.C. et al. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains Text. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95, N6. - P. 3134-3139.

89. Karaolis D.K., Lan R., Reeves P.R. Molecular evolution of the sevenih-pandemic clone of Vibrio cholerae and its relationship to other pandemic and epidemic V cholerae isolates Text. // J. Bacteriol. 1994. - Vol. 176, N20. -P.6199-6206.

90. Kato J., Zhu J., Liu C., Moss J. Enhanced sensivity to cholera toxin in ADPribosylarginine hydrolase-deficient mice Text. // Mol. Cell. Biol. 2007. - Vol.12127, N 15.-P. 5534-5543.

91. Keasler S.P., Hall R.H. Detecting and biotyping Vibrio cholerae 01 with multiplex polymerase chain reaction Text. // Lancet. 1993. - Vol.341. - P. 1661.

92. Kimsey H.H., Waldor M.K. The CTXphi repressor RstR binds DNA cooperatively to form tetrameric repressor-operator complexes Text. // J. Biol. Chem. -2004. Vol. 279, N4. - P. 2640-2647.

93. Kimsey H.H., Waldor M.K., CTXcp immunity: application in the development of cholera vaccines Text. // Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 1998. - Vol. 95. -P.7035-7039.

94. Kirn T.J., Jude B.A., Taylor R.K. A colonization factor links Vibrio cholerae environmental survival and human infection Text. // Nature. 2005. - Vol. 438. -P. 863-866.

95. Kitaoka M., Miyata S.T., Unterweger D., Pukatzki S. Antibiotic resistance mechanisms of Vibrio cholerae Text. // J. Med. Microbiol. 2011. - Vol. 60. -P. 397-407.

96. Krukonis E.S., Yu R.R., Dirita V.J. The Vibrio cholerae ToxR/TcpP/ToxT virulence cascade: distinct roles for two membrane-localized transcriptional activators on a single promoter Text. // Mol Microbiol. 2000. - Vol. 38, N1. - P. 6784.

97. Kumar P., Jain M., Goel A.K. et al. A large cholera outbreak due to a new cholera toxin variant of the Vibrio cholerae Ol El Tor biotype in Orissa, Eastern India // J. Med. Microbiol. 2009. - Vol. 58. - P. 234-238.

98. Kumar P., Jain M., Goel A.K. et al. Rapid detection of virulence-associated genes in environmental strains of Vibrio cholerae by multiplex PCR Text. // Curr. Microbiol. 2010. - Vol. 60. - P. 199-202.

99. Lee J.H., Choi S.Y., Jeon Y.S. et al. Classification of hybrid and altered Vibrio cholerae strains by CTX prophage and RSI element structure Text. // J. Microbiol. 2009. - Vol. 47, N6. - P.783-788.

100. Lin W., Fullner K.J., Clayton R. et al. Identification of a Vibrio cholerae RTX toxin gene cluster that is tightly linked to the cholera toxin prophage Text. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1999. - Vol. 96, N3. - P. 1071-1076.

101. Longini I.M. Jr., Yunus M., Zaman K. et al. Epidemic and endemic cholera trends over a 33-year period in Bangladesh Text. // J. Infect. Dis. 2002. - Vol. 186, N2.-P. 246-251.

102. Mahon B.E., Mintz E.D., Greene K.D. et al. Reported cholera in the United States, 1992-1994: a reflection of global changes in cholera epidemiology Text. // JAMA. 1996. - Vol. 276, N4. - P. 307-312.

103. Maiti D., Das B., Saha A. et al. Genetic organization of pre-CTX and CTX prophages in the genome of an environmental Vibrio cholerae non-Ol, non-0139 strain Text. //Microbiology. 2006. - Vol. 152, Pt.12. - P. 3633-3641.

104. McLeod S.M., Kimsey H.H., Davis B.M., Waldor M.K. CTXphi and Vibrio cholerae: exploring a newly recognized type of phage-host cell relationship Text. // Mol. Microbiol. 2005. - Vol.57, N2. - P.347-356.

105. McLeod S.M., Waldor M.K. Characterization of XerC- and XerD-dependent CTX phage integration in Vibrio cholerae Text. // Mol. Microbiol. 2004. - Vol. 54, N4.-P. 935-947.

106. Meibom K.L., Blokesch M., Dolganov N.A. et al. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae Text. // Science. 2005. - Vol. 310, N5755. -P. 1824-1827.

107. Mekalanos J.J. Duplication and amplification of toxin genes in Vibrio cholerae Text. // Cell. 1983. - Vol. 35, N 1. - P. 253-263.

108. Miller V.L., Mekalanos J.J. Synthesis of cholera toxin is positively regulated at the transcrip-tional level by toxR Text. // Proc. Notl. Acad. Sei. USA. 1984. -Vol.81.-P. 3471-3475.

109. Mojica F. J., Diez-Villasenor C., Garcia-Martinez J., Soria E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements Text. // J. Mol. Evol. 2005. - Vol. 60. - P. 174-182.

110. Mojica F. J., Diez-Villasenor C., Soria E., Juez G. Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria Text. // Mol. Microbiol. 2000. - Vol. 36. - P. 244-246.

111. Morita M., Ohnishi M., Arakawa E. et al. Emergence and genetic diversity of El Tor Vibrio cholerae 01 that possess classical biotype ctxB among travel-associated cases of cholera in Japan Text. // J. Med. Microbiol. 2010. - Vol.59.- P.708-12.

112. Mukhopadhyay A.K., Garg S., Saha P.K. et al. Comparative analysis of factors promoting optimal production of cholera toxin by Vibrio cholerae 01 (classical and El Tor biotypes) and 0139 // Indian J. Med. Res. 1996. - Vol. 104. - P. 129133.

113. Murley Y.M., Carroll P.A., Skorupski K. et al. Differential transcription of the tcpPH operon confers biotype-specific control of the Vibrio cholerae ToxR virulence regulon Text.//Infect. Immun. 1999. -Vol. 67, N10.-p. 5117-5123.

114. Murphy R.A., Boyd E.F. Three pathogenicity islands of Vibrio cholerae can excise from the chromosome and form circular intermediates Text. // J. Bacteriol.- 2008. Vol. 190, N2. - P. 636-647.

115. Nair G. B., Qadri F., Holmgren J. et al. Cholera due to altered El Tor strains of Vibrio cholerae 01 in Bangladesh Text. // J. Clin. Microbiol. 2006. - Vol.44. -P.4211-4213.

116. Na-Ubol M., Srimanote P., Chongsa-nguan M. et al. Hybrid & El Tor variant biotypes of Vibrio cholerae 01 in Thailand Text. // Indian. J. Med. Res. 2011. -Vol.133, N4.-P.387-394.

117. Nguyen B.M., Lee J.H., Cuong N.T. et al. Cholera outbreaks caused by an altered Vibrio cholerae Ol El Tor biotype strain producing classical cholera toxin B in Vietnam in 2007 to 2008 // J. Clin. Microbiol. 2009. - Vol.47. - P. 1568-1571.

118. Okada K., Chantaroj S., Roobthaisong A. et al. A cholera outbreak of the Vibrio cholerae Ol El Tor variant carrying classical ctxB in Northeastern Thailand in 2007 Text. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2010. - Vol.82, N5. - P.875-878.

119. O'Shea Y.A., Boyd E.F. Mobilization of the Vibrio pathogenicity island between Vibrio cholerae isolates mediated by CP-T1 generalized transduction Text. // FEMS Microbiol. Lett. 2002. - Vol. 214, N2. - P. 153-157.

120. O'Shea Y.A., Reen F.J., Quirke A.M., Boyd E.F. Evolutionary genetic analysis of the emergence of epidemic Vibrio cholerae isolates on the basis of comparative nucleotide sequence analysis and multilocus virulence gene profiles Text. // J

121. Clin Microbiol. 2004. - Vol. 42, N10. - P. 4657-4671.125

122. Panda S.K., Patra A.K., Kar R.N. Monitoring of multiple drug-resistant pathogens in a selected stretch of Bay of Bengal, India Text. // Environ. Monit. Assess. -2012.-Vol. 184, N1. P.193-200.

123. Parsot C., Mekalanos J.J. Expression of the Vibrio cholerae gene encoding aldehyde dehydrogenase is under control of ToxR, the cholera toxin transcriptional activator Text. //J. Bacteriol. 1991. - Vol. 173, N9. - P. 2842-2851.

124. Patra T., Chatterjee S., Raychoudhuri A. et al. Emergence and progression of Vibrio cholerae 01 El Tor variants and progenitor strains of Mozambique variants in Kolkata, India Text. // Int. J. Med. Microbiol. 2011. - Vol. 301, N4. - P. 310-317.

125. Pearson G.D.N., Woods A., Chiang S.L., Mekalanos J.J. CTX genetic element encodes a site specific recombination system and an intestinal colonization factor Text. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993. - Vol.90. - P.3750-3754.

126. Piarroux R., Barrais R., Faucher B. et al. Understanding the cholera epidemic, Haiti Text.//Emerg. Infect Dis.-2011.-Vol. 17, N7.-P. 1161-1168.

127. Popovic T., Fields P.I., Olsvik O. Detection of cholera toxin genes / Vibrio cholerae and cholera: molecular to global perspectives. Ed. I.K. Wachsmuth, P.A. Blake, O. Olsvik. Washington. DC: American Society for Microbiology. 1994. -P. 1-52.

128. Prouty M.G., Osorio C.R., Klose K.E. Characterization of functional domains of the Vibrio cholerae virulence regulator ToxT Text. 11 Mol. Microbiol. 2005. -Vol. 58, N4.-P. 1143-1156.

129. Prouty M.G., Osorio C.R., Klose K.E.Characterization of functional domains of the Vibrio cholerae virulence regulator ToxT Text. // Mol. Microbiol. 2005. -Vol. 58, N4.-P. 1143-1156.

130. Quilici M.L., Massenet D., Gake B. et al. Vibrio cholerae 01 variant with reduced susceptibility to ciprofloxacin, Western Africa Text. // Emerg .Infect. Dis. -2010.-Vol. 16,N11.-P. 1804-1805.

131. Raychoudhuri A., Mukhopadhyay A.K., Ramamurthy T. Biotyping of Vibrio cholerae Ol: time to redefine the scheme Text. // Indian. J. Med. Res. 2008. -Vol. 128, N6.-P. 695-698.

132. Reguera G., Kolter R. Virulence and the Environment: a Novel Role for Vibrio cholerae toxin-coregulated pili in biofilm formation on chitin Text. // J. Bacterid.-2005.- Vol. 187, N10.-P. 3551-3555.

133. Reidl J., Klose K.E. Vibrio cholerae and cholera: out of the water and into the host Text. // FEMS Microbiol. Rev. 2002. - Vol. 26, N2. - P. 125-139.

134. Reimer A.R., Van Domselaar G., Stroika S. et al. Comparative genomics of Vibrio cholerae from Haiti, Asia, and Africa Text. // Emerg. Infect. Dis. 2011 -Vol. 17,N11.-P. 2113-2121.

135. Rhine J.A., Taylor R.K. TcpA pilin sequences and colonization requirements for Ol and 0139 Vibrio cholerae Text. // Mol.Microbiol. 1994. - Vol. 13. -P.1013-1020.

136. Rolfs A., Shuller I., Finkch U., Weber-Rolfs I. PCR: clinical diagnostics and research Text. Springer-Verlag KG, Berlin. 1992. P. 74-77.

137. Rollenhagen A., Lübke J.H. The morphology of excitatory central synapses: from structure to function Text. // Cell Tis. Res. 2006. - Vol.326, N2. - P.221-237.

138. Rubin E.J., Lin W., Mekalanos J J., Waldor M.K. Replication and integration of a Vibrio cholerae cryptic plasmid linked to the CTX prophage Text. // Mol. Microbiol. 1998.-Vol. 28, N6.-P. 1247-1254.

139. Safa A., Bhuyian N.A., Nusrin S. et al. Genetic characteristics of Matlab variants of Vibrio cholerae 01 that are hybrids between classical and El Tor biotypes Text. // J. Med. Microbiol. 2006. - Vol. 55. - P. 1563-1569.

140. Safa A., Nair G.B., Kong R.Y.C. Evolution of new variants of Vibrio cholerae 01 Text. // Trends Microbiol. 2010. - Vol.18. - P.46-54.

141. Safa A., Sultana J., Cam P.D. et al. Vibrio cholerae Ol hybrid El Tor strains in Asia and Africa Text. // Emerg. Infect. Dis. 2008. - Vol.14. - P.987-988.

142. Salles C.A., Momen H., Vicente A.C., Coelho A. Vibrio cholerae in South America: polymerase chain reaction and zymovar analysis Text. // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1993. - Vol. 87, N3. - P. 272.

143. Samadi A.R., Chowdhury M.K., Huq M.I., Khan M.U. Seasonality of classical and El Tor cholera in Dhaka, Bangladesh: 17-year trends Text. // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1983. -Vol.77, N6. - P.853-856.

144. Sanchez J., Holmgren J. Cholera toxin a foe & a friend Text. // Indian J. Med. Res.-2011.-Vol. 133.-P. 153-163.

145. Sandkvist M, Bagdasarian M, Howard S.P. Characterization of the multimeric Eps complex required for cholera toxin secretion Text. // J. Med. Microbiol. -2000. Vol. 290, N4-5. - P. 345-50.

146. Schneider D.R., Parker C.D. Isolation and characterization of protcasc-deficient mutants of Vibrio cholerae Text. // J. Infect. Dis. 1978. - Vol. 138, N2. -P.143-151.

147. Siddique A.K. Nair G.B., Alam M. et al. El Tor cholera with severe disease: a new threat to Asia and beyond Text. // Epidemiol. Infect. 2010. - Vol. 138, N3. - P.347-352.

148. Siddique A.K., Baqui A.H., Eusof A., Zaman K. 1988 floods in Bangladesh: pattern of illness and causes of death Text. // J. Diarrhoeal Dis. Res. 1991. -Vol. 9, N4.-P. 310-314.

149. Siddique A.K., Zaman K., Akram K. et al. Emergence of a new epidemic strain of Vibrio cholerae in Bangladesh. An epidemiological study Text. // Trop. Geogr. Med. 1994.-Vol. 46,N3.-P. 147-150.

150. Singh D.V., Matte M.H., Matte G.R. et al. Molecular analysis of Vibrio cholerae 01, 0139, non-Ol, and non-0139 strains: clonal relationships between clinical and environmental isolates Text. // Appl. Environ. Microbiol. 2001. -Vol. 67,N2.-P. 910-921.

151. Sinha V.B., Srivastava B.S. Plasmid-induced loss of virulence in Vibrio cholerae Text. // Nature. 1978. - Vol. 276, N5689. - P.708-709.

152. Sporecke I., Castro D., Mekalanos J.J. Genetic mapping of Vibrio cholerae en-terotoxin structural genes Text. // J. Bacteriol. 1984. - Vol. 157, N1. - P. 253261.

153. Svennerholm A.M., Strömberg G.J., Holmgren J. Purification of Vibrio cholerae soluble hemagglutinin and development of enzyme-linked immunosorbent assays for antigen and antibody quantitations Text. // Infect. Immun. 1983. - Vol. 41, N1. - P. 237-243.

154. Talkington D., Bopp C., Tarr C. et al. Characterization of toxigenic Vibrio cholerae from Haiti, 2010-2011 Text. // Emerg. Infect. Dis. 2011. - Vol. 17, N11.-P. 2122-2129.

155. Tan N.H., Tan C.S. Acidimetric assay for phospholipase A using egg yolk suspension as substrate Text. // Anal. Biochem. 1988. - Vol. 170, N2. - P. 282288.

156. Taneja N., Mishra A., Sangar G., Singh G., Sharma M. Outbreaks caused by new variants of Vibrio cholerae Ol El Tor, India Text. // Emerg. Infect. Dis. -2009. Vol. 15, N 2. - P. 352-354.

157. Tappero J.W., Tauxe R.V. Lessons learned during public health response to cholera epidemic in Haiti and the Dominican Republic Text. // Emerg. Infect. Dis. 2011. - Vol. 17, N11. - P. 2087-2093.

158. Taviani E., Grim C.J., Choi J. et al. Discovery of novel Vibrio cholerae VSP-II genomic islands using comparative genomic analysis Text. // FEMS Microbiol Lett. 2010. - Vol. 308, N2. - P. 130-137.

159. Taylor R.K., Miller V.L., Furlong D.B., Mekalanos J.J. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin Text. // PNAS. 1987. - Vol. 84, N9. - P. 2833-2837.

160. Tischler A.D., Camilli A. Cyclic diguanylate (c-di-GMP) regulates Vibrio cholerae biofilm formation Text. // Mol. Microbiol. 2004. - Vol. 53, N3. -P. 857-869.

161. Tran H.D., Alam M., Trung N.V. et al. Multi-drug resistant Vibrio cholerae Ol variant El Tor isolated in northern Vietnam between 2007 and 2010 Text. // J. Med. Microbiol. 2012. - Vol. 61. - P. 431-437.

162. Trucksis M., Galen J.E., Michalski J., Fasano A., Kaper J.B. Accessory cholera enterotoxin (Ace), the third toxin of a Vibrio cholerae virulence cassette Text. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1993.-Vol. 90, N11.-P. 5267-5271.

163. Voss E., Stephen R. In vitro production of toxin-coregulated pili by Vibrio cholerae El Tor Text. // Attridge Microbial Pathogenesis. 1993. - Vol. 15. - P. 255-268.

164. Waldor M.K., Mekalanos J.J. Lysogenic conversion by a filamentous bacteriophage encoding cholera toxin Text. // Science. 1996. - Vol. 272. - P. 1910-1914.

165. Waldor M.K., Rubin E.J., Pearson G.D.N, et al. Regulation, replication, and integration functions of the Vibrio cholerae CTX(p are encoded by region RS2 Text. // Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 24, N 5. - P. 917-926.

166. Withey J.H., Dirita V.J. Vibrio cholerae ToxT independently activates the divergently transcribed aldA and tagA genes Text. // J. Bacteriol. 2005. - Vol. 187,N23.-P. 7890-7900.

167. Yu R.R., DiRita V.J. Regulation of gene expression in Vibrio cholerae by ToxT involves both antirepression and RNA polymerase stimulation Text. // Mol. Microbiol. -2002. Vol. 43, N1. - P. 119-134.