Штаммы Vibrio cholerae с измененной экспрессией генов вирулентности

Заднова, Светлана Петровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Штаммы Vibrio cholerae с измененной экспрессией генов вирулентности
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Штаммы Vibrio cholerae с измененной экспрессией генов вирулентности"

0034Y3D Л На правах рукописи

ЗАДНОВА Светлана Петровна

ШТАММЫ VIBRIO CHOLERAE С ИЗМЕНЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНОВ ВИРУЛЕНТНОСТИ

03.00.07 - микробиология 03.00.04 - биохимия

- 8 ОПТ 2009

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

САРАТОВ - 2009

003479070

Работа выполнена в ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные консультанты:

член-корреспондент Российской Академии медицинских наук, доктор медицинских наук, профессор доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор доктор биологических наук, профессор

Кутырев Владимир Викторович Смирнова Нина Ивановна

Швиденко Инна Григорьевна Замараев Валерий Семенович Тараненко Татьяна Михайловна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН»

Защита состоится « £Q1» г. в /3 часов на заседании

iг

диссертационного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». Автореферат разослан «

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник

А. А. Слудский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Распространение холеры в странах Азии, Африки и Латинской Америки свидетельствует о том, что эта инфекция остается угрозой для многих стран, включая и Российскую Федерацию (Онищенко с соавт., 2005; Кутырев, 2008; Ломов с соавт., 2008). Важным и перспективным направлением в решении проблемы холеры является изучение генетических основ изменчивости вирулентных свойств возбудителя. О большой вариабельности генома этого патогена свидетельствует тот факт, что в процессе эволюции сформировано три эпидемически опасных варианта Vibrio cholerae: 01 серогруппы классического биовара, 01 серогруппы эльтор биовара и 0139 серогруппы (Бароян, 1971; Ломов, 2004; Смирнова, Кутырев, 2004; Finkelstein, 1973; Matson et al, 2007).

Очевидная необходимость проведения исследований по проблеме изменчивости V. cholerae определяется и тем, что в связи с изменяющимися экологическими условиями постоянно растет частота выделения природных атипичных штаммов возбудителя холеры. Особый интерес вызывает процесс образования природных штаммов с повышенной вирулентностью (Смирнова с соавт., 2008; Albert et al, 1993; Davis et al., 1999; Nair et al, 2002, 2006; Faruque et al, 2003, 2007; Safa et al, 2005, 2008; Raychoud-huri et al, 2009). Структурно-функциональный анализ таких изолятов может обеспечить получение фундаментальных знаний о новых механизмах формирования штаммов с ранее неизвестными свойствами. Более того, на их основе возможен поиск новых способов генодиагностики природных штаммов с измененной вирулентностью для осуществления адекватного мониторинга внешней среды с целью прогнозирования эпидемических ситуаций.

et al., 2004). Вместе с тем единичные сообщения на эту тему не дают полного представления об изменении экспрессии генов вирулентности при адаптации возбудителя холеры к меняющимся условиям окружающей среды. Отсутствуют данные о сигналах внешней среды, приводящие к репрессии факторов вирулентности при росте клеток в неблагоприятных условиях. Остается неясным, при каких условиях окружающей среды осуществляется переключение экспрессии генов патогенности V. cholerae, определяющее появление у возбудителя вирулентных свойств. Между тем выявление таких факторов, обеспечивающих индукцию экспрессии факторов вирулентности в природных популяциях, может внести существенный вклад в повышение эффективности мониторинга внешней среды.

Еще одной не менее важной является проблема экспрессии резидентных генов вирулентности в бактериальных клетках, получивших дополнительный генетический материал (плазмиды, транспозоны, бактериофаги). До недавнего времени считалось, что рекомбинантные плазмиды с клонированными генами различных факторов вирулентности при введении их в клетки реципиентных штаммов определяют повышенный уровень продукции белков, биосинтез которых кодируется этим дополнительным генетическим материалом. Проведение интенсивных исследований в этом направлении привело к созданию штаммов-продуцентов холерного токсина или СТ (от англ. -cholera toxin) и его В-субъединицы (Янишевский, 1986; Ильина с соавт., 1987; Филь-кова с соавт., 1988; Смирнова, 1989; Чеховская, Смирнова, 1994; Захарова, 1997; Еро-шенко, 2004). В тоже время сведения об изменении экспрессии хромосомных генов, определяющих продукцию других факторов вирулентности в клетках, содержащих плазмидный геном, практически отсутствуют. Геномный и протеомный анализ таких штаммов будет основой для понимания ранее неизвестных путей регуляции экспрессии важнейших генов вирулентности в новом генетическом окружении. Полученные фундаментальные знания открывают новые подходы для создания штаммов с повышенной продукцией одновременно нескольких протективных антигенов. Такие штаммы могут быть использованы для изготовления современных диагностических и профилактических препаратов.

Цель работы - молекулярно-генетический и биохимический анализ природных и генетически модифицированных штаммов V. cholerae с измененной экспрессией ге-

нов вирулентности и создание на их основе штаммов-продуцентов основных протек-тивных антигенов.

Задачи исследования:

1. Изучить популяционный состав природных штаммов V. cholerae эльтор и классического биоваров для выявления фенотипических вариантов с координировано измененным уровнем продукции факторов вирулентности и персистенции. Создать коллекцию изогенных штаммов с разным уровнем экспрессии ключевых генов вирулентности.

2. Провести сравнительный анализ фено- и генотипических свойств двух типов изогенных вариантов природных штаммов V. cholerae эльтор и классического биоваров, различающихся по продукции экзополисахарида (EPS), холерного токсина (Тох), растворимой гемагглютинин/протеазы (Нар) и подвижности (Mot). Выделить, очисть и изучить моносахаридный состав экзополисахарида модельного штамма V. cholerae Дакка 35 классического биовара.

3. Провести сравнительный анализ протеомов двух фенотипически разных вариантов (EPS++Tox+Hap++Mot++ и EPS+Tox++Hap+Mot+) модельного штамма V. cholerae Дакка 35. Выяснить роль отдельных белков и экзополисахарида в адаптации клеток к неблагоприятным условиям окружающей среды.

4. Выявить факторы внешней среды, вызывающие координированное переключение экспрессии различных генов вирулентности и персистенции в клетках V. cholerae классического биовара.

5. Изучить влияние рекомбинантной плазмиды pCT105::mini-kan с клонированными генами профагов вирулентности СТХ и RS1 на экспрессию хромосомных генов V. cholerae классического биовара, включая ключевые гены вирулентности и им-муногенности.

6. Сравнить протеомные профили исходного и содержащего рекомбинантную плазмиду pCT105::mini-kan модельного штамма V. cholerae классического биовара с целью выявления различий в содержании белков, являющихся факторами вирулентности или определяющими жизнеспособность клеток.

пилей адгезии или TCP (от англ. - toxin-coregulated pilus) и 01 антигена Определить оптимальные условия их глубинного культивирования для получения этих антигенов.

8. Создать экспериментальную многокомпонентную иммуноферментную диагностическую тест-систему для оценки экспрессии основных генов вирулентности у природных штаммов V. cholerae 01 серогруппы. Определить ее специфичность, эффективность и диагностическую ценность.

Научная новизна исследования:

Впервые при изучении популяционного состава природных штаммов холерного вибриона эльтор и классического биоваров выявлены штаммы, имеющие в популяции два типа клонов, различающихся одновременно несколькими фенотипическими свойствами: морфологией колоний, продукцией холерного токсина, растворимой гемагг-лютинин/протеазы, гемолизина, а также подвижностью. Впервые установлено, что экспрессия генов, определяющих разные фенотипы клеток, имеет координированный характер. Впервые на поверхности клеток классических холерных вибрионов обнаружен экзополисахаридный слой, определяющий морфологию колоний и содержащий рамнозу, глюкозу, галактозу и гексозамин. Установлена его функциональная роль, которая состоит в защите клеток при действии осмотического и оксидативного стрессов.

При проведении сравнительного протеомного анализа двух фенотипически разных вариантов модельного штамма V. cholerae Дакка 35 впервые вьивлено изменение содержания в клетках ферментов и белков внешней мембраны, играющих важную роль в метаболизме и выполняющих защитную функцию. Показано, что смена популяционного состава штамма по фенотипу либо повышает его устойчивость к воздействиям повреждающих факторов внешней среды, либо усиливает вирулентность.

Впервые выявлено, что одним из главных факторов, стимулирующих координированное переключение экспрессии генов экзополисахарида, холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы и подвижности в штаммах холерного вибриона классического биовара, является щелочная (рН 9,0) реакция среды.

В результате проведенных исследований впервые выявлена панель белков, кодируемых хромосомными генами (ctxAB, tcpA-F, ompU, hapA), повышение содержания которых характерно для штаммов, несущих рекомбинантную плазмиду pCT105::mini-kan с клонированными генами двух профагов вирулентности СТХ и RS1. Впервые установлено, что в присутствии указанной плазмиды в клетках токсигенных штаммов

классических вибрионов увеличение экспрессии хромосомных генов tcpA-F и ompU происходит за счет усиления активности глобального регуляторного гена toxR.

На основании сравнительного анализа протеомов впервые обнаружено, что введение в клетки штаммов V. cholerae классического биовара рекомбинантной плазмиды pCT105::mini-kan приводит к изменению экспрессии хромосомных генов, кодирующих белки внешней мембраны, участвующие в патогенезе, транспорте, цитокинезисе, энергетическом и метаболическом обменах.

Впервые получены содержащие плазмиду и бесплазмидные штаммы V. cholerae классического биовара сероваров Инаба (2415 и КМ207) и Огава (2414 и КМ206), отличающиеся от штаммов, используемых в производстве таблетированной холерной бивалентной химической вакцины (569В Инаба и М41 Огава), повышенной продукцией одновременно трех протективных антигенов - СТ, TCP и 01 антигена. Приоритетность работы в данном направлении подтверждена получением 4-х патентов РФ на изобретения: № 2169187 «Штамм бактерий Vibrio cholerae 2414 классического биовара серовара Огава — продуцент холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии»; № 2193598 «Штамм бактерий Vibrio cholerae КМ200 - продуцент холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии»; № 2222595 «Штамм бактерий Vibrio cholerae КМ206 классического биовара серовара Огава - продуцент протективных антигенов»; № 2222594 «Штамм бактерий Vibrio cholerae КМ207 классического биовара серовара Инаба - продуцент протективных антигенов».

Выявлены особенности экспрессии генов, кодирующих указанные протектив-ные антигены, при глубинном культивировании штаммов-продуцентов. Определены оптимальные условия продукции ими протективных антигенов и экспериментально доказана целесообразность использования сконструированных штаммов для получения протективных антигенов в условиях производства. Приоритетность работы по получению очищенных протективных антигенов подтверждена патентом РФ № 2324740 «Способ выделения белков токсин-корегулируемых пилей адгезии и OmpU холерного вибриона классического биовара».

Впервые создана эффективная и специфичная экспериментальная многокомпонентная иммуноферментная диагностическая тест-система, включающая четыре очищенных протективных антигена (СТ, TCP, 01 антиген Инаба и Огава) и четыре поли-клональные антисыворотки к ним, позволяющая оценивать экспрессию основных ге-

нов вирулентности в природных штаммах V. cholerae 01 серогруппы для уточнения их эпидемической значимости.

Практическая ценность и формы внедрения:

В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» депонировано 16 штаммов V. cholerae классического биовара сероваров Огава и Инаба, из которых 6 - продуценты СТ и TCP; 8 штаммов характеризуются координированным переключением экспрессии трех генов {mot, hap, vps), связанных с вирулентностью; 2 штамма -инсерционные мутанты, утратившие способность продуцировать СТ при внедрении транспозона TnphoA (Km1) в бактериальный геном.

Результаты исследований использованы в следующих документах:

- Методические указания МУК 4.2.2218—07 «Лабораторная диагностика холеры». - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2007. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 31 мая 2007 г. и введены в действие с 1 августа 2007 г. взамен методических указаний «Лабораторная диагностика холеры» МУ 4.2.1097—02.

- Практическое руководство «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней». Под ред. академика РАМН, профессора Г.Г. Онищенко, чл-корр. РАМН, профессора В.В. Кутырева. - М: ОАО Издательство «Медицина», Издательство «Шико», 2009.

- Методические рекомендации «Создание штаммов холерного вибриона классического биовара - продуцентов протективных антигенов», одобренные Ученым Советом (13.04.2004 г.) и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» (14.04.2004 г.).

- Методические рекомендации «Получение штаммов холерного вибриона классического биовара с координированным изменением экспрессии факторов патогенно-сти и персистенции», одобренные Ученым Советом (27.06.2006 г.) и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» (29.06.2006 г.).

- Методические рекомендации «Выделение токсин-корегулируемых пилей адгезии и белка внешней мембраны OmpU холерного вибриона классического биовара», одобренные Ученым Советом (27.06.2006 г.) и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» (29.06.2006 г.).

Сконструированные содержащие плазмиду и бесплазмидные штаммы-продуценты одновременно трех основных протективных антигенов холерного вибриона (В-субъединицы в составе СТ, TCP, 01 антигена серовара Огава или Инаба) используются в научных и производственных лабораториях ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» при проведении молекулярно-генетических исследований по изучению механизмов регуляции экспрессии генов вирулентности и иммуногенности холерного вибриона и при получении очищенных ключевых протективных антигенов.

Материалы диссертации включены в курс лекций по современной микробиологии холеры на курсах первичной специализации врачей по особо опасным инфекциям при ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб».

Положения, выносимые на защиту:

1. Популяция ряда природных штаммов V. cholerae эльтор и классического био-варов содержит два типа клонов, различающихся по морфологии колоний (прозрачные и мутные), продукции холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы, гемолизина, а также подвижности. Изменение морфологии колоний изогенных вариантов V. cholerae обоих биоваров связано с продукцией клетками экзополисахаридного слоя. Продуцирующие экзополисахарид холерные вибрионы эльтор биовара (EPS^) отличаются от изогенных (EPS4) вариантов меньшей подвижностью, повышенным уровнем биосинтеза холерного токсина, но сниженной продукцией растворимой гемагглютинин/протеазы. Для классических холерных вибрионов характерна обратная связь между экспрессией названных факторов вирулентности.

2. Присутствующий на поверхности клеток модельного штамма V. cholerae Дакка 35 классического биовара экзополисахаридный слой содержит рамнозу, глюкозу, галактозу и гексозамин. Экзополисахарид повышает устойчивость клеток к действию осмотического и оксидативного стрессов.

3. Два фенотипически разных варианта модельного штамма V. cholerae Дакка 35 имеют разные протеомы. Среди 841 выявленного белка идентифицировано 57 белков с повышенным или пониженным содержанием в клетках. В EPS++Tox+Hap++Mot++ вариантах репрессируется синтез 26 белков и индуцируется синтез 31. Для EPS+Tox++Hap+Mot+ клонов характерна обратная картина. Индукция в клетках EPS++Tox+Hap++Mot++ ряда мембранных и цитоплазматических белков с защитной

функцией указывает на их повышенную резистентность к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды.

4. Щелочная (рН 9,0) реакция среды является внешним сигналом, вызывающим координированное переключение экспрессии генов экзополисахарида, холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы и подвижности в штаммах холерного вибриона классического биовара. Переключение активности этих генов приводит к изменению вирулентности популяции и её резистентности к действию неблагоприятных факторов.

5. Геном рекомбинантной плазмиды pCT105::mini-kan, несущей клонированные гены двух профагов вирулентности СТХ и RS1, при введении его в клетки V. cholerae cholerae, согласно данным сравнительного протеомного анализа, изменяет экспрессию различных хромосомных генов, включая гены, кодирующие белки, участвующие в энергетическом обмене, процессах метаболизма, цитокинезиса, транспорта и входящих в состав внешней мембраны.

6. Получены содержащие плазмиду и бесплазмидные штаммы V. cholerae классического биовара с высоким уровнем продукции одновременно трех ключевых про-тективных антигенов - холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии и 01 антигена. Определены оптимальные параметры их выращивания для получения протективных антигенов в полупроизводственных условиях.

7. Создана экспериментальная многокомпонентная иммунодиагностическая тест-система, состоящая из 4-х очищенных протективных антигенов холерного вибриона (СТ, TCP, 01 антиген Инаба и Огава) и 4-х поликлональных антисывороток к ним. Указанная тест-система перспективна при оценки экспрессии основных генов вирулентности у природных штаммов V. cholerae 01 серогруппы.

Апробация работы.

клинической медицины» (Москва, 2004), I Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004), XIV Российском симпозиуме по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (Черноголовка, 2005), III Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), VII Межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств - участников Содружества Независимых Государств» (Оболенск, 2006), V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), а также на совещаниях проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (Ростов-на-Дону, 2005-2007) и ежегодных научных конференциях ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 1999-2009).

Публикации по теме исследования.

По теме диссертации опубликовано 46 научных работ, из них 18 статей в изданиях, рекомендованных ВАК, 4 статьи в зарубежных изданиях, 5 патентов на изобретения, 10 тезисов в сборниках международных и Российских конференций.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 238 листах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, семи глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 517 ссылок, из них 416 зарубежных и 101 отечественных авторов. Работа иллюстрирована 21 таблицей и 45 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы. В работе использовали 146 штаммов V. сЪокгае 01 се-рогруппы (эльтор и классического биоваров), 4 штамма 0139 серогруппы и 13 штаммов других бактерий, полученных из Государственной коллекции патогенных бактерий (г. Саратов), а также рекомбинантные плазмиды с клонированными генами вирулентности V. скокгае. Применяли традиционные и современные микробиологические, биохимические, генетические, молекулярно-биологические и электронно-микроскопические методы исследования. Культивирование бактерий и изучение их

фенотипических свойств проводили общепринятыми методами. Наличие TCP выявляли визуально при постановке реакции самоагглютинации бактерий (Chiang et al., 1995) и методом иммуноблоттинга (Towbin et al., 1979). Продукцию секретируемого CT определяли с помощью радиального пассивного иммунного гемолиза (РПИГ) на плотной среде (Шагинян, Маракуша, 1983; Bramucci, Holmes, 1978) и иммуноферментным методом GM! ELISA (Svennerholm, Wiklund, 1983). Биологическую активность CT оценивали в кожной пробе (Creig, 1965). Коньюгационные скрещивания проводили по методу D.E. Bradley et al. (1980). Плазмидный состав штаммов определяли по (Kado, Liu, 1981). Электрофоретическое разделение белков проводили по методу U.K. Laemmli et al. (1970). Присутствие полисахаридов выявляли окрашиванием поли-акриламидных гелей после проведения электрофореза ионами серебра. Выделение эк-зополисахаридного слоя с поверхности клеток осуществляли по методике, описанной L.R. Evans и A. Linker (1973). Количественное содержание полисахаридов определяли с помощью антронового реактива (Захарова, Косенко, 1982). Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили по стандартной методике (Захарова, Косенко, 1982). Изучение поверхностных структур клеток проводили методами растровой и трансмиссионной электронной микроскопии (Mudd, Anderson, 1942). При постановке двумерного фореза руководствовались методикой, описанной у Р.Н. O'Farrell (1975), идентификацию белков по наборам значений масс пептидов после трипсинолиза проводили с использованием программы «Mascot» (США), поиск идентичных последовательностей осуществляли по базе данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), работа проводилась совместно с сотрудниками протеомного центра при ГУ Научно-исследовательском институте Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН (г. Москва). Определение концентрации белка в образцах проводили по методу О.Н. Lowry et al. (1951). Выделение геномной ДНК, рестрикцию нуклеазами, ДНК-ДНК гибридизацию осуществляли в соответствии с описанными рекомендациями (Маниатис с соавт., 1984). Поли-меразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием специфических праймеров осуществляли по К. Hoshino et al. (1998). Секвенирование ДНК проводили по методу F. Sanger et al. (1977) с использованием прямых и обратных праймеров на соответствующие гены. Выравнивание и сравнение нуклеотидных последовательностей осуществляли в программе «MEGA v.3.1». Статистическую обработку данных проводили по рекомендациям H.A. Плохинского (1970).

Результаты исследований

1. Выявление и фенотипический анализ природных штаммов V. cholerae, содержащих в популяции клоны с координировано измененной экспрессией факторов вирулентности и персистенции.

В гетерогенной популяции холерных вибрионов большой интерес представляют варианты, отличающиеся от типичных форм одновременно по нескольким свойствам. Появление таких клонов может быть связано с согласованным изменением экспрессии ряда генов, что является одним из важных механизмов адаптации патогена к меняющимся условиям среды обитания. Для выявления штаммов, имеющих в популяции варианты с одновременным изменением продукции ряда факторов вирулентности и персистенции, был изучен популяционный состав 41 штамма V. cholerae биовара эльтор, выделенных в разное время и на различных территориях от больных людей и из внешней среды. В первую очередь проводилось изучение морфологии колоний, поскольку морфологические изменения могут сопровождаться изменением других признаков, включая свойства, определяющие вирулентность популяции (van der Woude, Baumler, 2004). В результате фенотипического анализа популяций было выявлено две группы штаммов. В первую входило 28 (70 %) штаммов, характеризующихся однородным по-пуляционным составом относительно морфологии колоний и состоящих из клеток, формирующих типичные прозрачные колонии. Вторая группа была представлена 12 штаммами (30 %), в популяции которых были обнаружены опалесцирующие (мутные) колонии, находящиеся в S форме. В отличие от раннее описанных гладких (S) и шероховатых (R) форм холерного вибриона прозрачные колонии, согласно данным литературы, были обозначены как Т (от англ. - translucent), а мутные как О (от англ. -opaque). Затем у Т и О вариантов была изучена продукция некоторых факторов вирулентности - СТ, Нар, гемолизина (Н1у), а также подвижность (Mot). В результате было выявлено 7 штаммов, у которых вариабельность морфологии колоний сопровождалась изменением синтеза 2-4-х факторов вирулентности. Наибольший интерес представляли популяции штаммов М-1085, С-418 и М-1326, содержащие колонии двух типов, которые одновременно отличались по четырем признакам: уровню продукции холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы, гемолизина, а также подвижности (таблица 1). О варианты данных штаммов синтезировали большее количество СТ, но меньше гемолизина, растворимой гемагглютинин/протеазы и были менее подвижны,

чем Т варианты, поэтому их фенотип был обозначен как О Тох++Н1у+Нар+Мо1+. В то же время для Т вариантов был характерен координированный альтернативный уровень экспрессии указанных факторов вирулентности - сниженная продукция СТ, увеличенный синтез Шу, Нар, а также повышенная подвижность. В этой связи фенотип данных вариантов был обозначен как Т Тох+Н1у++Нар++Мо1++ (таблица 1).

Таблица 1 - Фенотипические свойства двух морфологически различных вариантов V. сИо1егае 01 серогруппы эльтор и классического биоваров._

Штамм V. cholerae ФЕНОТИП

Синтез СТ (по данным GMi ELISA), мкг/мл Продукция гемолизина, мм* Подвижность, мм** Продукция Нар, мм*** Морфология колоний

Холерные вибрионы биовара эльтор

М-1085 0,01±0,006 3,0±0,4 5,0±0,5 5,0±0,5 Т

0,17±0,005 1,0±0,4 2,0±0,3 3,0±0,5 О

С-418 0,02±0,005 3,0±0,2 10,0±0,4 3,0±0,3 Т

0,06±0,02 1,0±0,5 1,0±0,3 2,0±0,4 О

М-1326 0,02±0,005 4,0±0,5 10,0±0,5 3,0±0,2 Т

1,1±0,05 2,0±0,5 1,0±0,3 2,0±0,6 О

Холерные вибрионы классического биовара

Дакка 35 13,0±1,0 0,0 2,0±0,2 2,0±0,5 Т

0,3±0,1 0,0 8,0±0,5 6,0±0,5 о

9361 2,8±0,5 0,0 5,0±0,3 1,0^Ю,6 т

0,0Ш,01 0,0 15,0±0,5 5,0±0,7 о

В-1307 3,0±0,5 0,0 3,0±0,2 3,0±0,5 т

0,02±0,01 0,0 10,0±0,5 6,0±0,4 о

49520 8,0±0,5 0,0 0,0 2,0±0,5 т

0,02±0,004 0,0 1,0±0,2 3,0±0,5 о

Примечания: * - в мм дана ширина зоны гемолиза; ** -радиусраспространения макроколонии в полужидком (0,3 %) агаре; * * * - в мм дана зона просветления на агаре с 10% молоком; Т- прозрачные, О - мутные колонии.

Полученные нами экспериментальные результаты относительно синтеза СТ и гемолизина у Т и О вариантов эльтор вибрионов согласуются с данными литературы (Fínkelstein et al., 1992; 1997). В тоже время сведения о разном уровне продукции Нар и подвижности у Т и О вариантов получены нами впервые.

На следующем этапе был изучен популяционный состав 105 природных штаммов холерного вибриона классического биовара. Среди них было выявлено 80 штаммов (76,2 %), содержащих только Т варианты, и 25 штаммов (23,8 %), в популяции ко-

торых наряду с Т присутствовали и О варианты. Среди штаммов второй группы было обнаружено 12 изолятов, морфология колоний которых коррелировала с изменением уровня продукции 2-3-х факторов вирулентности. Особое внимание привлекли штаммы V. сИокгае Дакка 35, 9361, В-1307, 49520, два типа колоний которых отличались по трем фенотипическим свойствам - продукции СТ, Нар, а также подвижности (таблица 1). Т клоны указанных штаммов были более токсигенны (по данным РПИГ), продуцировали незначительное количество Нар и были малоподвижными (таблица 1, рисунок 1), поэтому их фенотип был обозначен как Т Тох++Нар+Мо1+. Классические вибрионы не продуцируют гемолизин, поэтому изменений по данному признаку обнаружено не было.

А Б В

А - продукция CT (РПИГ); Б - подвижность; В - продущия Нар. Штамм V. cholerae 569В взят в качестве положительного контроля.

Рисунок 1 - Фенотипические свойства Т Tox++Hap4Mot+ и О Tox+Hap++Mot4+ клонов штамма V. cholerae Дакка 35.

Вместе с тем для О вариантов был характерен координированный альтернативный уровень продукции указанных факторов вирулентности — сниженный синтез CT, высокий уровень биосинтеза Нар и значительная подвижность (таблица 1, рисунок 1). Фенотип данных вариантов был обозначен как О Tox+Hap++Mot++. Использование более чувствительного иммуноферментного метода GM, ELISA полностью подтвердило выявленные методом РПИГ различия в продукции CT между О и Т клонами (таблица 1). Обнаруженная обратная связь между морфологией колоний и продукцией CT, Нар, а также подвижностью у классических и эльтор вибрионов, возможно, является следствием различной регуляции генов, кодирующих указанные факторы вирулентности у холерных вибрионов двух биоваров (Silva et al., 2008; Tamayo et al., 2008).

Поскольку различия между Т и О клонами по изученным свойствам были наиболее выражены у штамма V. cholerae Дакка 35 классического биовара (таблица 1, рисунок 1), то именно этот штамм был выбран в качестве модельного для последующих экспериментов.

Вследствие большого значения СТ в вирулентности холерных вибрионов, большой интерес представляло изучение механизма, определяющего различный уровень продукции этого белка у модельного штамма. В результате методами ПЦР и ДНК-ДНК гибридизации установлено, что сравниваемые Т Tox++Hap+Mot+ и О Tox+Hap++Mot++ варианты не отличались друг от друга по набору генов, расположенных как на мобильных генетических элементах (ctxA, zot, асе - профаг СТХ, toxT, tcpP, tcpH—VPI-I), так и в эволюционно древней части хромосомы (toxR, hapR, luxO), а также числу копий структурных (ctxAB) и регуляторных (toxR) генов, кодирующих и контролирующих синтез СТ. Однако при секвенировании промотора гена ctxA было обнаружено, что в отличие от многих природных штаммов, имеющих 1-3 копии тан-демных повторов (TTTTGAT), с которыми происходит связывание регуляторных белков ToxR или ТохТ при активации транскрипции оперона ctxAB и от копийности которых зависит уровень транскрипции данных генов (Miller, Mekalanos, 1988; Prouty et al., 2005), в промоторной области ctxA штамма Дакка 35, независимо от фенотипа, содержалось шесть таких повторов (рисунок 2).

1 (34) TATTACGAGGGAAACAAATTGTCTTTTATTAA£TAGTTTTGTTAATTTA

2 (34) TATTACGAGGGAAACAAATTGTCTTTTATTAAÇTAGTTTTGTTAATTTA

3 (34) TATTACGAGGGAAACAAATTGTCTTTTATTAACTAGTTTTGTTAATTTA

4 (34) TATTACGAGGGAMCAMTTGTCTTTTATTAAÇTAGTTTTGTTAATTTA

1 (-18) TTCATTTATTTAAACATAATAAACTTTAGTTTTGATTTTTGATTTTTGAT

2 (-16) TTCATTrATTTAAACATAATAAACTTTAGTTTTGATTTTTGATTTTTGAT

3 (-18) TTCATTTATTTAAACATAATAAACTTTAGTTTTGA111 11GATTTTTGAT

4 M 8) TrCATTTATTTAAACATAATAAACTTTAGTTrTGATTTTTGATTTTTGAT

I I I

1 (-68) TTTTGAT-TTTTGAI1111GATATTTTGATAAATCAG

2 (-68) TTTTGAT-TTTTGAI 11 11 GATATTTTGATAAATCAG

3 (-68) TTTTGATTTTTGATTrTTGATTTTTGATTTTTGATATTTTGATAAATCAG

4 (-68) TTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGATTTTTGATATTTTGATAAATCAG

I I I I I

Обозначения: I - T Tox** Hap* Mot* вариант Дакка 35; 2-0 Tox* Hap* Mot** вариант Дакка 35; 3 - 569В; 4 - N16961 (положительный контроль). Отсчет ведется от предполагаемой точки начала транскрипции.

Рисунок 2 - Секвенированная последовательность промоторной области гена ctxA штаммов V. cholerae.

Эти данные представляют значительный интерес, поскольку могут объяснить необычайно высокую экспрессию генов ctxAB у токсигенных клонов штамма Дакка 35, сопоставимую с таковой у известного штамма 569В, содержащего в промоторной области оперона ctxAB восемь копий названной последовательности (Miller, Mekalanos, 1984). Итак, отсутствие различий в составе изученных генов между изо-генными Т Tox++Hap+Mot+ и О Tox+Hap++Mot++ клонами модельного штамма позволяет полагать, что популяционная вариабельность экспрессии структурных генов ctxAB могла возникнуть в результате изменения регуляторного механизма транскрипции этого белка.

Таким образом, в результате анализа популяционного состава 146 природных штаммов V. cholerae 01 серогруппы обнаружены штаммы классического и эльтор био-варов особенность которых заключалась в формировании двух морфологически разных вариантов, отличающихся друг от друга координированным и альтернативным изменением уровня экспрессии таких важных факторов вирулентности и персистен-ции как СТ, Нар и подвижности.

2. Выявление у V. cholerae классического биовара экзополисахаридного слоя и его биохимический анализ.

Для установления причины изменения морфологии колоний в штаммах холерного вибриона было проведено электронно-микроскопическое изучение поверхности двух вариантов V. cholerae Дакка 35. В результате было выявлено, что О Tox+Hap++Mot++ клетки окружены рыхлым слоем, который отсутствует у Т Tox++I Iap+Mot+ клонов. Появление дополнительного слоя может быть связано с продукцией белков внешней мембраны или экзополисахарида (Finkelstein et al., 1992; Ali et al., 2000b; Yildiz et al., 2004). Однако при использовании электрофореза в полиакри-ламидном геле было выяснено, что белки внешней мембраны не участвуют в указанном событии. В тоже время было обнаружено, что мутные клоны как эльтор, так и классических вибрионов, в отличие от прозрачных, синтезируют большее количество экзополисахарида (рисунок 3).

Полученные данные позволили предположить, что изменение морфологии колоний у О вариантов связано с синтезом дополнительного экзополисахаридного слоя. Для подтверждения данной гипотезы бактерии штамма V. cholerae Дакка 35 были исследованы методом электронной микроскопии после их обработки красителем руте-

нием красным, применяемым для обнаружения экзополисахарида у грамотрицатель-ных бактерий (Johnson et al., 1992; Yildiz et al., 2001).

1 2 3 4 5 6 7

Обозначения: 1 - T Tox++Hap*Mot* вариант Дакка 35; 2 - О Tox+ Нар**Mot++ вариант Дакка 35; 3 - Т Тох**Нар*Mot* вариант 9361; 4 - О Тох*Нар**Mot** вариант 9361; 5 -Т Тох**Нар*Mot* вариант В-1307; 6 - О Тох*Нар**Mot** вариант В-1307; 7 - Т Тох**Нар*Mot' вариант 49520; 8 - О Тох*Нар**Mot* вариант 49520.

Рисунок 3 - Выявление экзополисахарида в изогенных вариантах V. cholerae классического биовара (окраска азотнокислым серебром, нанесено по 10 мкг белка).

При изучении ультратонких срезов в электронном микроскопе, было выявлено, что действительно О Тох+Нар" Mot" варианты Дакка 35 окружены электронноплот-ным слоем окрашенных экзополисахаридов, тогда как у T Tox+"Hap+Motf вариантов такой слой почти отсутствовал (рисунок 4).

Обозначения; А - макроколония Т Тох**Нар*Mot* варианта; Б — макроколония О Тох*Нар**Mot** варианта. Стрелкой отмечен экзополисахаридный слой. Увеличение хЗО ООО.

Рисунок 4 - Электронно-микроскопическая фотография двух фенотипически разных вариантов V. cholerae Дакка 35, окрашенных рутением красным.

Далее, экзополисахаридный слой был выделен с поверхности двух фенотипически разных вариантов штамма V. cholerae Дакка 35 с использованием этанола (Evans, Linker, 1973). В препарате, полученным из О Tox+Hap++Mot++ вариантов, содержание полисахаридов составило 70 мкг/мл, а из Т Tox++Hap+Mot+ - 40 мкг/мл. Присутствие полисахаридов в препарате, выделенным из О Tox^apTvIot44" варианта, было под-

тверждено методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Изучение моно-сахаридного состава выделенного экзополисахарида методом ТСХ показал наличие в нем рамнозы, глюкозы, галактозы, гексозамина. Сравнение состава EPS классических вибрионов с эльтор выявило, что в составе EPS ругозных колоний штаммов V. cholerae биовара эльтор входят также глюкозамин и манноза (Yildiz, Schoolnik, 1999), не обнаруженные в EPS классических вибрионов.

На основе полученных данных о выраженной продукции экзополисахарида О клонами классических и эльтор вибрионов их фенотип был обозначен как EPS++, а Т клонов - как EPS+.

Для выяснения функциональной роли экзополисахарида был проведен сравнительный анализ резистентности EPS++Tox+Hap++Mot++ и EPS+Tox++Hap+Mot+ клонов модельного штамма к действию неблагоприятных факторов внешней среды, в качестве которых использовались высокие концентрации соли (2,5 М раствор NaCl) и перекиси водорода (20 мМ). В результате было обнаружено, что EPS++Tox+Hap++Mot++ варианты V. cholerae Дакка 35 более устойчивы к действию осмотического и оксидатив-ного стрессов по сравнению с EPS+Tox++Hap+Motl . Полученные нами результаты согласуются с данными литературы и подтверждают, что синтез EPS на поверхности штаммов холерного вибриона способствует устойчивости клеток к действию этих факторов (Wai S.N. et al., 1998).

Таким образом, впервые обнаруженный на поверхности О вариантов классических вибрионов экзополисахаридный слой, определяющий морфологию колоний, образуется, видимо, в результате адаптации клеток к неблагоприятным воздействиям окружающей среды.

3. Сравнительный анализ протеомов фенотнпически разных вариантов V. cholerae классического биовара и выявление сигналов внешней среды, определяющих координированное изменение экспрессии генов вирулентности и перси-стенции.

Поскольку у холерных вибрионов координированная экспрессия факторов вирулентности и персистенции контролируется несколькими глобальными регулятор-ными системами, то изменение активности данных генов может сопровождаться изменением уровня экспрессии генов, кодирующих белки с другими функциями. В этой связи был проведен двумерный гель-электрофорез белковых экстрактов клеток двух

фенотипически разных вариантов V. сИокгае Дакка 35. Последующий компьютерный анализ протеомных карт выявил 841 белок. При сопоставлении протеомных профилей двух фенотипически разных вариантов было обнаружено 57 белков, экспрессия которых у ЕРв^ох^ар^о^ клонов была либо значительно выше, либо существенно ниже, чем у ЕР8++Тох+Нар++Мо1++ вариантов (рисунок 5, таблица 2).

рН

4,0

Обозначения: 62,63,65 - NADH-оксидаза; 125,127,130 - фосфоенолпируват карбокси-киназа; 273 - белок TolC; 280,288 — аланиндегидрогеназа; 500,541,566 - белок OmpU; 513, 517 - иммуногенный белок; 518 - белок ОтрТ; 658 - кислород-нечувствительная NAD(P)H нитроредуктаза; 709 — антиоксидант, семейства AhpC/Tsa; 709 — метил-трансфераза; 791 — фрагмент OmpU; 841 - не идентифицированный белок.

Рисунок 5 - Протеинограмма EPS+Tox++Hap+Mot+ (А) и ЕРЗ^Гох^ар^^ТМо^ (Б) вариантов V. cholerae Дакка 35 с идентифицированными белками.

№ белка на геле Название белка Молекулярный вес, Да Функция Изменение уровня экспрессии белка у EPS вариантов в сравнении с EPS+

62,63, 65 ЫАЭН-оксидаза 61874 Энергетический обмен + 5,7; + 8,9; + 32,6

125, 127, 130 Фосфоенолпиру-ват карбоксикина-за 59806 Энергетический обмен: гликолиз -7,5;-9,8; -14,8

273 Белок То1С 47722 Белок-порин внешней мембраны: секреция + 2,2

280,288 Аланин-дегидрогеназа 39814 Метаболизм и энергетический обмен -11,4;-5,6

500, 541, 566 Отри 36624 Белок-порин внешней мембраны: защитная + 13,2;+ 6,6;+ 2,8

513,517 Иммуногенный белок 35233 Белок внешней мембраны: другие -11,1; отсутствует у EPS^

518 ОтрТ 37145 Белок-порин внешней мембраны: секреция -4,8

658 Кислород-нечувствительная КАО(Р)Н нитро-редукгаза 24063 Клеточные процессы: детоксикация + 6,4

709 Антиоксидант, семейства АИрСЛ^а 22847 Клеточные процессы: защитная отсутствует у EPS+

709 Метшггрансфераза 23322 Белковый синтез отсутствует у EPS+

791 Фрагмент ОтрСГ 36624 Белок-порин внешней мембраны: защитная +3,4

841 Не идентифицированный белок 13127 Не установлена + 4,1

Примечание: «+ » - повышение уровня экспрессии белка в обозначенное количество раз, «-» - уменьшение.

Оказалось, что в клетках ЕР8'нТох+Нар++Мо1'н вариантов репрессировался синтез 26 белков и индуцировался синтез 31, тогда как в клетках ЕР8+Тох++Нар+Мо1+ наблюдалась обратная картина. Для идентификации было выбрано 19 белков, экспрессия которых между двумя вариантами отличалась в 3,0 и более раз. Среди белков, содержание которых было повышено в клетках ЕР8++Тох+Нар++Мо1++ вариантов, большой интерес представляли мембранные (Отри, То1С) и цитоплазматические (с нитроре-дуктазной и антиоксидантной функциями) белки, которые обеспечивают защиту кле-

ток от воздействия неблагоприятных факторов внешней среды (рисунок 5, таблица 2). Более того, повышение в EPS++Tox+Hap++Mot+ вариантах более чем в 13 раз концентрации белка OmpU, но снижение почти в 5 раз содержания белка ОшрТ, биосинтез которых непосредственно контролируется глобальным регуляторным геном toxR, служит в пользу предположения о возможном участии этого гена не только в координированном изменении уровня экспрессии генов вирулентности, но и других генов, обеспечивающих жизнеспособность клеток.

Таким образом, данные, полученные с помощью протеомного анализа, показали, что процессы клеточного метаболизма значительно различаются в изогенных клонах V. cholerae Дакка 35.

Следующий этап работы был посвящен выявлению сигналов внешней среды, вызывающих комплексные изменения в экспрессии факторов вирулентности и перси-стенции в штаммах холерного вибриона классического биовара. С этой целью было изучено влияние различных факторов, воздействующих на холерный вибрион как при его нахождении во внешней среде, так и в организме хозяина (изменение температуры, рН, осмолярности, наличие глюкозы, аминокислот, викасола, отсутствие питательных веществ). В результате установлено, что только при культивировании на средах с щелочной реакцией среды (рН 9,0) в популяции EPS+Tox++Hap+Mot+ вариантов штаммов V. cholerae Дакка 35, 9361, В-1307 и 49520 классического биовара с частотой 80-85 % происходило появление клонов с координированным альтернативным изменением уровня экспрессии генов, определяющих продукцию СТ, Нар, EPS, а также подвижность, что приводило к смене их фенотипа. Из этого следует, что рН окружающей среды является одним из сигналов, вызывающих переключение активности данных генов.

Смена популяционного состава штамма должна, видимо, привести к изменению уровня его вирулентности. Действительно, при изучении вирулентности двух изогенных клонов V. cholerae Дакка 35 было установлено, что EPS+Tox++Hap+Mot+ клоны -вирулентны, а "' авирулентны. Тем не менее, среди изолирован-

ных колоний EPS++Tox+Hap++Mot++ варианта, полученных после рассева содержимого кишечника на плотные среды, фенотип 6,0 % (от общего числа проверенных колоний) был сходен с таковым

EPS+Tox++Hap+Mot+ клонов, что свидетельствует о возможности реверсии нетоксигенного клона в токсигенный in vivo.

Таким образом, важным итогом проведенных исследований является получение новых данных о популяционной гетерогенности V. cholerae 01 серогруппы, что расширяет имеющиеся представления о диапазоне изменчивости возбудителя холеры. В пределах популяции штаммов эльтор и классического биоваров обнаружено два морфологически разных варианта, отличающихся друг от друга координированной экспрессией нескольких факторов вирулентности и персистенции. Учитывая процесс координированного переключения активности генов, можно сделать предположение, что у V. cholerae 01 серогруппы существует еще неизвестный регуляторный механизм, который в ответ на определенные сигналы внешней среды контролирует дифференциальную экспрессию соответствующих генов, что может лежать в основе формирования клонов с новым патогенным потенциалом.

4. Фенотипический и молекулярно-генетический анализ генетически модифицированных штаммов V. cholerae классического биовара с измененной продукцией факторов вирулентности.

В 1999 г. были получены данные о том, что мутации в промоторе структурных генов tcpA-F, контролирующих биосинтез пилей TCP, изменяют активность регуля-торного гена toxT, что приводит почти к 10-кратному понижению уровня продукции СТ (Yu, DiRita, 1999). Выявленный новый механизм координированного изменения экспрессии ключевых генов вирулентности и иммуногенности послужил основанием для предположения о том, что при повышении продукции СТ за счет введения в клетки холерного вибриона в составе рекомбинантной плазмиды дополнительных копий структурных генов ctxAB и гена антирепрессора rstC может произойти увеличение биосинтеза TCP и других факторов вирулентности.

В качестве модельных для данных экспериментов было отобрано две группы штаммов - с высокой (V. cholerae 569В, Дакка 35, КМ200) и умеренной продукцией СТ (У. cholerae М-19, В-1307, J-89). Методом конъюгации в клетки выбранных штаммов была введена рекомбинантная коинтегратная плазмида рС0Ю7-2 (ТсгКтг), включающая плазмиду р0Х38 - производную F-фактора, утратившего все известные IS-элементы, и pCT105::mini-kan (ТсгКтг) - производную pBR322. Последняя плазмида содержит ген устойчивости к тетрациклину, транспозон mini-kan и вставку ДНК штамма V. cholerae RV79 биовара эльтор размером 7,0 т.п.н. с клонированными генами профагов СТХ и RS1 (Гинцбург с соавт., 1984). Частота переноса плазмиды

рСО 107-2 в штаммы V. ско1егае классического биовара составляла 5x10"7. При введении плазмиды рСОЮ7-2 происходило разъединение коинтеграта, утрата рОХ38 и сохранение в клетках лишь плазмиды рСТ105::тни-кап (ТсгКтг).

Данные блот-гибридизации тотальной ДНК штаммов V. ско1егае, обработанной рестриктазой РэН, с СТ-зондом подтвердили присутствие в созданных штаммах 3-х копий генов с1хАВ, одна из которых (размером 7,0 т.п.н.) была локализована на плаз-мидном репликоне (рисунок 6, дорожки 3 и 5).

Обозначения: 1 - V. cholerae Дакка 35 (исходный); 2 - V. cholerae КМ206 KrríTc"; 3 -V. cholerae 2414 [Дакка 35 (рСТ 105::mini-kan)]; 4 - V. cholerae 569В (исходный); 5 -V. cholerae 2415 [569В (pCTl05::mini-kan)]; 6 - V. cholerae KM207 KmsTcs. Стрелками отмечены хромосомные(5,6 и 9,0 т.п.н.) и плазмидная (7,0 т.п.н.) копии структурных генов холерного токсина.

Рисунок 6 - Блот-гибридизация тотальной ДНК штаммов V. cholerae, обработанной рестриктазой Pstl, с СТ-зондом.

По данным иммуноферментного анализа GMi ELISA у штаммов, содержащих рекомбинантную плазмиду pCT105::mini-kan, продукция CT увеличилась в 2,6-4,3 раза по сравнению с исходными штаммами (таблица 3). Значительное повышение уровня биосинтеза CT было прогнозированным и обусловлено присутствием в штаммах дополнительных копий структурных генов ctxAB, которые находятся на плазмиде и эффективно экспрессируются. Более того, не исключено, что в присутствии гена rstC, входящего в состав профага RS1, которого лишены природные штаммы классических вибрионов, происходит повышение транскрипции их резидентных генов ctxAB, что полностью согласуется с недавно полученными сведениями (Davis et al., 2002).

Последующий анализ трансконьюгантов показал, что только у производных вы-сокотоксигенных штаммов V. cholerae 2414 [Дакка 35 (pCT105::mini-kan)], 2415 [569В (pCT105:.mini-kan)] и КМ220 [КМ200 (pCT105::mini-kan)] увеличилась и продукция TCP (таблица 3), что было подтверждено методами иммуноблоттинга и электронной микроскопии.

5,6 т.п.н.

7,0 т.п.н. 9,0 т.п.н.

1 2 3 4 5 6

Таблица 3 - Продукция факторов вирулентности природными и сконструированными штаммами V. ско!егае классического биовара._

Штамм V. cholerae Синтез СТ (по данным GMi ELISA), мкг/мл TCP** Белки внешней мембраны

OmpU OmpT

Дакка 35 13,0±1,0 - следы +

2414* [Дакка 35 (pCT105::mini-kan)] TcrKmr Тох^СР" 42,0±2,5 -н-н- + следы

КМ206 (бесплазмидный производный 2414) Km'Tc'Tox^TCP^ 40,0±0,2 III) + следы

569В 9,0±1,8 + следы +

2415 [569В (pCT105::mini-kan)] TcrKmr Тох^СР" 38,4±1,6 ++++ + -

КМ207 (бесплазмидный производный 2415) КтЧс'Тох^ТСР" 34,0±0,2 i i i i + -

КМ200 14,0±1,6 +++ + . +

КМ220 [КМ200 (pCT105::mini-kan)] TcrKmr Тох^СР^ 42,0±2,1 i i i i + +

J-89 2,0±0,5 - + +

J-89 (рСТ 105: :mini-kan) Tc'Km' Тох+ТСР" 6,2±1,2 - + +

М-19 4,2±2,0 - - +

М-19 (pCT105::mini-kan) Tc"Kmr Тох+ТСР" 12,5±2,3 - - +

В-1307 3,0±0,5 - + +

В-1307 (рСТ 105::mini-kan) Тс'Кш1 Тох+ТСР" 8,0±1,0 - + +

Дакка 35 (рСТД27) Тсг 48,0± 3,0 - следы +

569В(рСТД27) Тс' 45,0±2,0 - следы +

Примечание: * - штамм V. ско!егае 2414 депонирован е Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» под номером КМ197;

** - TCP определяли методом самоагглютинации, «-» - отсутствие признака; «+» - наличие признака, а количество + - степень выраженности признака: «+ » - мутный бульон, осадок незначительного числа клеток; «+++» - полупрозрачный бульон, значительное число клеток в осадке; «++ + + »- прозрачный бульон, осадок практически всех клеток.

Таким образом, основной итог экспериментальной работы - обнаружение ранее не известного влияния рекомбинантной плазмиды pCT105::mini-kan, содержащей клонированные гены профагов СТХ и RS1, на биосинтез TCP у изученных штаммов V. cholerae классического биовара. Из этого следует, что нами вьивлен достаточно простой способ создания штаммов холерного вибриона с высоким уровнем продукции СТ и TCP, состоящий во введение в клетки этого возбудителя указанной плазмиды.

Получение штаммов V. cholerae с повышенным биосинтезом одновременно двух белков, являющихся основными факторами вирулентности и иммуногенности и выполняющих ряд важнейших функций в клетках холерного вибриона, ставит вопрос, за счет какого механизма рекомбинантная плазмида, не имеющая клонированных генов tcpA-F, изменяет продукцию TCP? Поскольку экспрессия генов ctxAB и tcpA-F контролируется одним и тем же регуляторным геном toxR, мы предположили, что наблюдаемое увеличение продукции TCP у штаммов, содержащих плазмиду, могло быть связано с увеличением активности данного белка-регулятора. В этом случае содержащие плазмиду штаммы должны отличаться от исходных измененной продукцией белков внешней мембраны OmpU и OmpT, экспрессия которых непосредственно контролируется ToxR. При анализе полученных изогенных штаммов с помощью электрофореза в полиакриламидном геле было показано, что действительно в штаммах V. cholerae 2414 ТсгКшг и 2415 ТсгКтг продукция данных белков изменяется. Исходные штаммы Дакка 35 и 569В синтезируют белок OmpT, экспрессия генов которого негативно регулируется белком ToxR, и лишь следы OmpU, позитивно контролируемого этим белком. В то же время их содержащие плазмиду штаммы продуцируют значительное количество белка OmpU (таблица 3). Появление у содержащих плазмиду штаммов белка OmpU указывает на то, что в их клетках экспрессия регуляторного гена toxR действительно повысилась. Это обстоятельство, в свою очередь, обусловило, по-видимому, повышение продукции другого регуляторного белка - ТохТ, который на завершающей стадии каскадной регуляции увеличил активность генов tcpA-F, что привело к увеличению уровня биосинтеза TCP. Роль белка ToxR в повышении экспрессии генов ctxAB и tcpA-F в экспериментальных штаммах была подтверждена также при их культивировании в непермиссивных для экспрессии гена toxR условиях.

Далее, для дальнейшего подтверждения участия гена toxR в изменении уровня биосинтеза TCP в содержащих плазмиду штаммах в эксперименты был взят штамм V. cholerae RV31, имеющий делецию в гене loxR. Введение в клетки этого штамма плазмиды pCT105::mini-kan и последующее определение у полученных трансконью-гантов продукции TCP и OmpU показало отсутствие у них указанных белков. Эти данные указывают на справедливость нашего утверждения относительно усиления транскрипции гена toxR в штаммах, содержащих рекомбинантную плазмиду и имеющих полноценный ген toxR.

Таким образом, у возбудителя холеры классического биовара обнаружен новый механизм регуляции генной активности, основанный на влиянии плазмидного генома, содержащего клонированные гены двух профагов вирулентности на экспрессию хромосомных генов. Показано, что в присутствии рекомбинантной плазмиды pCT105::mini-kan в токсигенных штаммах V. cholerae классического биовара повышается экспрессия хромосомных генов tcpA-Fn ompU, кодирующих соответственно биосинтез TCP и OmpU, в результате усиления активности регуляторного гена toxR.

Возникает вопрос о том, какие гены клонированного фрагмента рекомбинантной плазмиды могут изменять экспрессию хромосомного гена tod?? Одно из возможных предположений состояло в том, что в таких событиях может играть большую роль второй профаг - RS1, входящий в состав pCT105::mini-kan. Правомерность такого предположения обусловлено тем, что в состав профага RS1 входит ген rstC. Этот ген является антирепрессором rstR профага СТХ, усиливая экспрессию генов ctxAB. Геном природных классических вибрионов содержит по одной копии профага СТХ на каждой хромосоме, но лишен профага RS1 и, следовательно, гена-антирепрессора rstC. Внесение в клетки классических вибрионов ДНК профага RS1 в составе рекомбинантной плазмиды могло привести к индукции в чужом хозяине экспрессии гена toxR. Данные, позволившие подтвердить это предположение, были получены в экспериментах при использовании другой рекомбинантной плазмиды рСТД27 (Тсг), являющейся также производной pBR322, но лишенной в отличие от плазмиды pCT105::mini-kan профага RSI и несущей делецию протяженностью 250 п.н. в гене ctxA (Ильина с со-авт., 1987). Оказалось, что введение указанной плазмиды в клетки штаммов V. cholerae 569В и Дакка 35 не приводит к изменению у трансконьюгантов продукции TCP. Более того, у штаммов V. cholerae Дакка 35 (рСТД27) и 569В (рСТД27) было выявлено отсутствие по сравнению с исходными штаммами каких-либо изменений в биосинтезе белков OmpU и OmpT. Повысилась лишь в 2-3 раза продукция В-субъединицы СТ за счет наличия в клетках дополнительных структурных генов ctxB (таблица 3). Таким образом, эти эксперименты, во-первых, подтвердили данные других авторов (Fando et al., 1997; Provenzano et a!., 2001; Wibbenmeyer et al., 2002) об отсутствии влияния плазмиды pBR322 на активность гена toxR, во-вторых, свидетельствуют о том, что отсутствие описанных выше различий в продукции TCP и белков внешней мембраны (OmpU и OmpT) между исходными и содержащими плазмиду штаммами V. cholerae

Дакка 35 (рСТД27) и 569В (рСТД27) может быть обусловлено тем, что рекомбинант-ная плазмида рСТД27 лишена профага RS1. Из этих данных следует, что этот профаг, возможно, несет ответственность за повышение экспрессии гена toxR. В качестве одного из первых претендентов на участие в этом событии следует рассматривать ген rstC, локализованный в составе RS1. Однако для окончательного заключения о роли данного гена-антирепрессора в изменении экспрессии хромосомных генов, необходимы дальнейшие исследования.

Итак, нами обнаружено, что при введении в клетки возбудителя холеры классического биовара плазмидного генома с клонированными генами двух профагов вирулентности может включаться дополнительный механизм регуляции хромосомных генов, кодирующих ключевые факторы вирулентности и иммуногенности. Перспективность продолжения работы в этом направлении определяется не только получением новых фундаментальных знаний о регуляции экспрессии различных генов патогенно-сти возбудителя холеры, но и ее непосредственной практической ценностью. Во-первых, на основании полученных данных показана возможность использования принципиально нового подхода для создания штаммов холерного вибриона с высоким уровнем продукции одновременно трех важнейших белков - СТ, TCP и белка OmpU. Во-вторых, созданные штаммы могут быть использованы для совершенствования выпускаемой в России таблетированной холерной бивалентной химической вакцины, а также для выделения очищенных антигенов, необходимых для конструирования диагностических тест — систем.

5. Сравнительный протеомный анализ исходного и содержащего плазмиду pCT105::mini-kan штаммов V. cholerae классического биовара.

Вполне очевидно, что при введении плазмиды pCT105::mini-kan в штаммы V. cholerae, наряду с повышенной активностью регуляторного гена toxR, может происходить изменение экспрессии и других хромосомных генов, кодирующих белки с различной функцией. Так, в 2003 г J. Bina et al. показали, что белок ToxR оказывает значительное влияние на метаболизм клетки. При мутации в toxR происходит изменение экспрессии 154 генов, из которых 60 индуцируется, а 94 репрессируется. Обнаружено изменение экспрессии генов, кодирующих белки внешней мембраны, участвующих в транспортных и энергетических процессах, метаболизме железа, подвижности, а также с неустановленной функцией. Эти данные позволили предположить, что в клетках

сконструированных нами штаммах, содержащих плазмиду рСТ105::гтш-кап, также может изменяться экспрессия ряда хромосомных генов. В этой связи был проведен сравнительный анализ протеомов исходного штамма V. сИокгае 569В и его производного V. сИокгае 2415 (рСТ105::гшш-кап) ТсгКшг. При сопоставлении протеомных профилей сравниваемых штаммов было выявлено 783 белка и обнаружено изменение содержания 61 белка (рисунок 7, таблица 4).

Обозначения: 209 - белок МзИЬ; 444 - белок ОтрТ; 495 - белок цитоплазматической мембраны 583 и 585 - С4-дикарбоксилат связывающий периплазматический белок; 369 - триптофаназа; 401 - ацетаткиназа; 650 и 694 —А субъединица СТ.

Рисунок 7 - Протеинограмма исходного штамма V. сИо1егае 569В (А) и его производного V. сИокгае 2415 (рСТ105::ггпш-кап) Тс'Ктг (Б) с идентифицированными белками.

Таблица 4 - Идентифицированные белки в изогенных штаммах V. cholerae 569В и 2415 (рСТ 105::mini-kan) TcrKmr._

№ белка на геле Название белка Молекулярный вес, Да Функция Изменение уровня экспрессии белка в штамме 241S по сравнению с 569В

209 MshL 60098 Белок внешней мембраны: секреция + 8,0

369 Триптофаназа 52887 Метаболизм -5,6

401 Ацетат киназа 42816 Энергетический обмен: ферментация + 8,0

444 OmpT 37145 Белок-порин внешней мембраны: секреция - 12,0

495 FtsZ 41502 Цитокинезис + 5,6

583, 585 С4-дикарбокси- лат-связывающий белок 37072 Транспорт белков, кислот, углеводов - 10,0-15,0

650, 694 А субъединица СТ 29317 Патогенез + 11,9;+ 19,8

Примечания: «+ » - повышение уровня экспрессии белка в обозначенное число раз, «-» -уменьшение.

Большинство из идентифицированных белков, так или иначе, связано с метаболизмом клетки (триптофаназа), ее энергетическим обменом (ацетат киназа), а также транспортными (С4-дикарбоксилат-связывающий белок) и секреторными (MshL, OmpT) функциями (рисунок 7, таблица 4). Наибольший интерес вызывает существенное повышение (в 11,9-19,8 раз) в клетках штамма V. cholerae 2415 (pCT105::mini-kan) Тс'Кшг белка патогенности - А субъединицы СТ. По данным иммуноферментного анализа уровень продукции секретируемого СТ, в состав которого входит А субъединица, в штамме V. cholerae 2415 (pCT105::mini-kan) Tc'Km' по сравнению с V. cholerae 569В увеличился лишь 4,3 раза (таблица 3). Одно из возможных объяснений различий между секретируемой и общей продукцией СТ при введении плазмиды рСТ 105: mini-kan в клетки холерного вибриона может состоять в отсутствии перестройки в работе системы секреции II типа, через которую происходит транспорт СТ из клетки.

Полученные нами при протеомном анализе результаты согласуются с данными J. Bina et al. (2003), относительно изменения продукции ацетаткиназы, транспортных и белков внешней мембраны при изменении активности toxR, и подтверждают выявлен-

ную нами роль глобального регуляторного белка ToxR в изменении экспрессии хромосомных генов в штаммах, содержащих рекомбинантную плазмиду.

Таким образом, присутствие плазмиды pCT105::mini-kan с клонированными генами профагов СТХ и RS1 в высокотоксигенном штамме V. cholerae 569В в результате повышения активности toxR привело не только к увеличению продукции факторов вирулентности СТ и TCP, но и значительно повлияло на метаболизм клетки, что выразилось в изменении содержания более 60 белков, участвующих в энергетическом обмене, процессах метаболизма, делении клеток, транспорте, а также входящих в состав внешней мембраны.

5. Создание экспериментальной многокомпонентной иммуноферментной диагностической тест-системы.

Сконструированные штаммы V. cholerae 2414 [Дакка 35 (pCT105::mini-kan)] и 2415 [569В (pCT105::mini-kan)] с высоким уровнем продукции одновременно трех факторов вирулентности холерного вибриона — СТ, TCP и OmpU, являющихся и основными протективными антигенами, могут быть использованы в производстве диагностических и вакцинных препаратов. Однако в условиях производства необходима селекция клонов, сохранивших рекомбинантную плазмиду pCT105::mini-kan, что требует добавление антибиотиков в среду выращивания. Такие условия культивирования нежелательны при изготовлении вакцинных препаратов. В этой связи, на первом этапе работы из сконструированных штаммов были получены бесплазмидные штаммы, сохранившие повышенный уровень продукции протективных антигенов. При выращивании штаммов V. cholerae 2414 (pCT105::mini-kan) и 2415 (pCT105::mini-kan) при температуре 4 °С (благоприятные условия для элиминации плазмиды) с частотой 14-16 % были получены KmsTcs клоны. Утрата плазмиды в 98 % сопровождалась потерей гиперпродукции СТ и TCP. Вместе с тем среди изученных бесплазмидных клонов было обнаружено по два клона (или 2 %), у которых потеря автономной плазмиды не сопровождалась понижением продукции TCP и СТ (фенотип KmsTcs Тох^ТСР^. Более того, бесплазмидные Тох^СР^ клоны не отличались от содержащих плазмиду штаммов по уровню биосинтеза белка OmpU, что указывает на сохранение эффективной экспрессии в них регуляторного гена toxR. Для дальнейшего изучения этого явления было отобрано по одному KmTV Тох^ТСР4^ клону, обозначенными как V. cholerae КМ206 [производный штамма 2414 (pCT105::mini-kan) Тох^СР44] и V. cholerae

КМ207 [производный штамма 2415 (pCT105::mini-kan) Тох++ТСР++] (таблица 3). Такой фенотип штаммов, лишенных указанной плазмиды, дает основание предполагать, что сохранение высокой активности гена toxR в бесплазмидных штаммах могло произойти в результате внедрения профага RS1 или утратившей все маркеры резистентности плазмиды рСТ105 с клонированным опероном ctxAB в хромосому. Однако опыты по блот-гибридизации хромосомной ДНК бесплазмидных штаммов с RS1- и СТ-зондами показали отсутствие в их бактериальных геномах профага RS1 и дополнительных копий оперона ctxAB (рисунок 6, дорожки 2 и 6). Мы пока не располагаем сведениями, объясняющими повышенный уровень экспрессии глобального гена toxR, который сохранился в бесплазмидных штаммах после утраты плазмиды. Тем не менее, полученные бесплазмидные штаммы являются весьма перспективными для применения их в производстве. Так как, при сравнительном анализе продукции ряда протективных антигенов сконструированными штаммами в сравнении с производственными V. cholerae 569В серовара Инаба и М-41 серовара Огава, используемыми для изготовления таблетированной холерной бивалентной химической вакцины (ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб», г. Саратов), было обнаружено что полученные нами штаммы сероваров Инаба и Огава отличаются от производственных штаммов повышенной продукцией не только СТ, TCP, белка OmpU, но и ферментов протеазы и фосфолипазы, а также 01 антигена указанных сероваров, которые также участвуют в образовании защитных антител при холере (таблица 5). Эти данные позволяют считать, что полученные бесплазмидные штаммы, имеющие высокий уровень продукции 6-ти протективных антигенов по сравнению с производственными штаммами, могут найти применение для приготовления более эффективной химической холерной вакцины.

Для выяснения времени культивирования, необходимого для достижения начала стационарного развития популяции, а также оптимальных производственных сред, в которых штаммы-продуценты образуют достаточное количество биомассы и антигенов, было проведено их выращивание в условиях малообъемного культивирования. Установлено, что для получения значительного количества СТ, TCP и 01 антигена сероваров Инаба и Огава культивирование сконструированных штаммов-продуцентов необходимо проводить не более 12 ч в бульоне Хотгингера (рН 8,0) или казеиновом бульоне (рН 7,6) без добавления пептона и глюкозы.

Таблица 5 - Сравнительный анализ продукции протективных антигенов сконструированными и производственными штаммами V. сИокгае 569В и М-41._

Штамм V. cholerae Синтез CT (no данным GM! ELISA), мкг/мл TCP* Синтез Нар, мм** Продукция фосфо-липазы, мм*** Титр реакции агглютинации с антисыворотками

О Огава Инаба

569В 9,0±2,0 + 2,0±0,1 2,0±0,2 1:1600 - 1 :400

М-41 2,8±0,7 - 1,5±0,5 2,5±0,5 1:3200 1: 800 -

2414 (pCT105::mini-kan) TcrKmr 42,0±2,5 ++++ 4,0±0,2 6,0±0,5 1:6400 1: 800 -

КМ206 TcsKms 40,0±0,4 llll 3,0±0,2 3,0±0,5 1 :6400 1: 800 -

2415 (pCT105::mini-kan) Tc'Km' 38,4±1,6 -H-H- 6,0±0,5 6,0±0,2 1:3200 - 1 :400

KM207 TcW 34,0±0,2 II 1 1 6,0±0,5 6,0±0,2 1:3200 - 1 :400

Примечания: *- TCP определяли методом самоагглютинации, «-» - отсутствие признака; «+» - наличие признака, а количество + - степень выраженности признака: «+» - мутный бульон, осадок незначительного числа клеток; «++++» -прозрачный бульон, осадок практически всех клеток;

** - величина зоны просветления на агаре, содержащем 10 % молока; *** - величина зоны просветления на агаре с2% эмульсией яичного желтка.

На следующем этапе работы была модифицирована методика D. Sun et al. (1990) по получению TCP и выделен белковый препарат, содержащий токсин-корегулируемые пили адгезии холерного вибриона. Модификации касались способа отделения TCP от поверхности клеток. Для этих целей использовали не шприц с толстой иглой (Sun et al., 1990), а обработку культуры в течение 2 мин на вортексе «Bio Vortex VI» (Россия) при орбитальном движении центрифужных пробирок (со скоростью 2300 об/мин). Полученные белковые препараты, содержащие TCP и значительное количество белков внешней мембраны, солюбилизировали в 125 мМ этаноламине (pH 10,5) для удаления белков внешней мембраны, диализовали и концентрировали. Содержание белка в полученных белковых препаратах (БП) составляло 240-300 мкг/мл. По данным электрофореза в БП, кроме TCP, содержался белок внешней мембраны OmpU. Присутствие белка TCP в выделенных препаратах было подтверждено методами электронной микроскопии и иммуноблотгинга с анти-ТСР сывороткой, предоставленной R.K. Taylor (США).

Для получения поликлональных антисывороток была отработана методика иммунизации животных (кролики) БП, выделенным из штамма V. cholerae КМ206

TcsKms, а также бактериями штамма V. cholerae 2414 (pCT105::mini-kan) ТегКгаг. В результате проведенной работы получены антисыворотки с помощью которых возможно изучение синтеза TCP природными и экспериментальными штаммами V. cholerae методами иммуноблоттинга и иммуноэлектронной микроскопии. С помощью меченных коллоидным золотом иммуноглобулинов, выделенных из экспериментальных сывороток, в штамме V. cholerae 2414 (pCT105::mini-kan) ТсгКтг было выявлено значительное количество TCP, в тоже время у исходного штамма V. cholerae Дакка 35 обнаруживались единичные пучки пилей (рисунок 8).

Примечания: Стрелками отмечены пучки токсин-корегулируемых пилей адгезии. Инструментальное увеличение х 17 ООО.

Рисунок 8 - Иммуноэлектронная микрофотография бактерий исходного штамма V. cholerae Дакка 35 (А) и его производного V. cholerae 2414 (pCT105::mini-kan) TcrKmr (Б) при использовании коньюгата иммуноглобулинов, приготовленных из антисыворотки к TCP, и коллоидного золота.

Таким образом, в результате проведенной работы получены нетоксичные препараты, содержащие неденатурированный белок токсин-корегулируемых пилей адгезии холерного вибриона, и специфические поликлональные антисыворотки, содержащие в высоком титре антитела к TCP холерного вибриона.

Заключительный этап работы был посвящен созданию многокомпонентной экспериментальной иммуноферментной диагностической тест-системы, необходимой для изучения экспрессии основных генов вирулентности в штаммах V. cholerae, выделяемых из различных объектов внешней среды при выяснении их эпидзначимости. В настоящее время разработан ряд отечественных иммуноферментных тест-систем на основе использования поли- и моноклональных антител для контроля синтеза лишь отдельных антигенов холерного вибриона (Федорова с соавт, 2000; Алексеева с соавт., 2002; Сырова с соавт., 2003; Чемисова с соавт., 2003; Шеклакова с соавт., 2005). Одна-

ко при проведении мониторинговых исследованиях предпочтительны многокомпонентные тест-системы, позволяющие одновременно определять экспрессию диагностически значимых генов и генов вирулентности. Для решения поставленной задачи использовали четыре очищенных ключевых антигена холерного вибриона (TCP, СТ, 01 антиген Огава и Инаба) и четыре поликлональные антисыворотки к ним. В качестве метода был выбран дот-иммуноанализ (ДИА), отличающийся высокой чувствительностью и позволяющий проводить исследования значительного количества образцов. Тест-система обладала высокой специфичностью, поскольку выявляла антигены только в штаммах V. cholerae соответствующей серогруппы и серовара, и чувствительностью (TCP определялись при концентрации бактерий 3,0х106 м.к./мл., СТ и 01 антиген соответственно в концентрации 0,3 и 0,14-0,16 мкг/мл).

С помощью созданной тест-системы был проведен анализ 19 природных штаммов V. cholerae, выделенных на территории России и других стран от больных и из внешней среды, и эпидемическая значимость которых подтверждена ранее при использовании ПЦР (таблица 6). Все клинические штаммы, содержащие структурные гены 01 антигена серовара Инаба или Огава, TCP и СТ, продуцировали контролируемые ими факторы вирулентности и иммуногенности. Данные, полученные при определении синтеза СТ, были сопоставимы с данными иммуноферментного анализа GM! ELISA. При изучении продукции TCP было выявлено три штамма (М-999, М-998, С-197), у которых отсутствовал ген tcpA, но результаты ДИА были положительными (таблица 6). Согласно данным литературы tcpA' холерные вибрионы могут синтезировать пили, подобные TCP и относящиеся к пилям IV типа (Fullner, Mekalanos, 1999), которые имеют консервативную аминотерминальную последовательность. Поскольку антисыворотка была получена на полную последовательность белка TCP, то можно полагать, что данные штаммы синтезируют пили, подобные TCP. Эти данные расширяют наши представления о дополнительных факторах патогенности холерного вибриона и указывают на возможность использования созданной тест-системы при анализе атипичных штаммов.

Таблица 6 - Определение синтеза 01 антигена, токсин-корегулируемых пилей адгезии и холерного токсина в природных штаммах V. сИокгае с помощью многокомпонентной диагностической тест-системы._

Штамм V. cholerae* Продукция Синтез CT

01 антигена Инаба Ol аитигеиа Огава TCP

мкг/мл | ДИА

Вирулентные штаммы (ctxA+, tcpÄ

569В (контроль) + - + 9,0±2,0 +

Р-3644 + - + 0,23±0,1 +

34 Филип. - + + 0,45±0,25 +

М-1260 - + + 0,25±0,1 +

Р-16064 - - + 0,5±0,14 +

М-1429 + - - 0,0 -

М-1430 - + + 0,0 -

М-964 + - + 0,0 -

МО-45 - - + 0,0 -

Нетоксигенные штаммы (ctxÄ, tcpA*), содержащие гены, кодирующие TCP

18797 - + + 0,0 -

18796 - + + 0,0 -

Авирулентные штаммы {ctxÄ, tcpÄ)

М-1420 + - - 0,0 -

1132 - + - 0,0

Р-18751 - + - 0,0

М-885 - + - 0,0

М-998 - + + 0,0

М-999 - + + 0,0

С-197 - - + 0,0

230 - - - 0,0

КМ115 - - - 0,0

Примечание: *- по данным ПЦР и реакции агглютинации с диагностическими холерными О-сыворотками тестируемые штаммы относятся к следующим серогруппам и сероварам: 569В, Р-3644, М-1429, М-964, М-1420 - Ol серогруппа серовар Инаба; 34 Филип., М-1260, М-1430, 18797, 18796, 1132, Р-18751, М-885, М-998, М-999-01 серогруппа серовар Огава; Р-16064, МО-45, 230, КМ115 - 0139 серогруппа; С-197 -не01/не0139 серогруппа.

Итак, диагностическая ценность предлагаемой тест-системы заключается в следующем. Во-первых, обнаружение продукции О антигена позволяет судить о выделении штамма холерного вибриона 01 серогруппы. Во-вторых, на основе изучения экспрессии CT и TCP возможна оценка вирулентности выделенных штаммов. В-третьих, созданная тест-система может быть использована при анализе атипичных штаммов V. cholerae, синтезирующих TCP-подобные пили и способных вызывать вспышки и спорадические случаи холеры.

В заключении подведены итоги работы и определены перспективы дальнейших исследований. Отмечено, что полученные новые сведения, о существовании в популяции ряда штаммов возбудителя холеры двух типов клонов, различающихся уровнем экспрессии одновременно нескольких генов вирулентности и персистенции, и о роли отдельных факторов внешней среды в переключении активности этих генов, могут внести существенный вклад в понимание природы адаптационной изменчивости V. cholerae, поскольку данное направление является одним из перспективных в дальнейших исследованиях по проблеме холера и позволит прогнозировать развитие эпидемической ситуации. Не менее важны приоритетные данные о влиянии рекомби-нантной плазмиды pCT105::mini-kan, несущей клонированные гены двух профагов вирулентности СТХ и RS1, на экспрессию хромосомных генов, кодирующих ключевые факторы вирулентности и иммуногенности, а также контролирующих процессы метаболизма, энергетического обмена, транспорта, цитокинезиса и продукцию белков внешней мембраны, путем изменения активности глобального регуляторного гена toxR. Полученные результаты свидетельствуют о существовании ранее неизвестного механизма координированного изменения активности различных генов и указывают на перспективы продолжения исследований, направленных на получение новых фундаментальных знаний о роли чужеродного генетического материала в изменении экспрессии резидентных генов возбудителя холеры.

Наряду с фундаментальным аспектом, работа имеет и важное практическое значение. Сконструированные бесплазмидные и содержащие плазмиду pCT105::mini-kan штаммы V. cholerae классического биовара с повышенной продукцией ряда факторов вирулентности и иммуногенности холерного вибриона (холерный токсин, токсин-корегулируемые пили адгезии, белок внешней мембраны, ферменты патогенности, 01 антиген) могут быть использованы в производстве более эффективных профилактических и диагностических препаратов. Созданная многокомпонентная иммунофермент-ная диагностическая тест-система будет востребована при проведении мониторинговых исследований и уточнения эпидемической значимости выделяемых из внешней среды штаммов холерного вибриона.

выводы

1. При комплексном фенотипическом анализе 146 клинических штаммов V. cholerae классического и эльтор биоваров обнаружены штаммы, гетерогенность популяции которых определяется присутствием двух типов клонов, различающихся по морфологии колоний (мутные и прозрачные), продукции холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы, гемолизина, а также подвижности. Впервые установлено, что экспрессия генов, контролирующих указанные фенотипические свойства, имеет координированный характер.

2. Морфология колоний штаммов V. cholerae классического и эльтор биоваров определяется биосинтезом экзополисахарида. Впервые обнаружено, что классические и эльтор вибрионы, продуцирующие экзополисахарид, различаются по характеру координированной экспрессии генов холерного токсина (ctxAB'), растворимой гемагглютинин/протеазы (hapA) и подвижности (mot). У эльтор вибрионов повышение экспрессии генов экзополисахарида (vps) сопровождается увеличением активности генов ctxAB, но снижением экспрессии генов hapA и mot. У классических вибрионов существует обратная связь между экспрессией указанных генов.

3. Впервые показано, что в состав экзополисахарида V. cholerae классического биовара входят рамноза, глюкоза, галактоза и гексозамин. Выявлена адаптивная функция экзополисахарида, заключающаяся в повышении устойчивости клеток к действию осмотического и оксидативного стрессов.

4. Проведенный сравнительный анализ протеомов двух фенотипически разных вариантов V. cholerae Дакка 35 классического биовара выявил присутствие 841 белка. В клетках EPS++Tox+Hap++MotH~ репрессируется синтез 26 белков и индуцируется синтез 31. Для клеток EPS+Tox++Hap+Mot+ характерна обратная картина. Индукция в клетках EPS++Tox+Hap++Mot++ ряда мембранных и цитоплазматических белков с защитной функцией указывает на их повышенную резистентность к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды.

5. Сигналом внешней среды, вызывающим координированное переключение синтеза экзополисахарида, холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы и подвижности у холерных вибрионов классического биовара, является щелочная реакция среды (рН 9,0). Переключение активности этих генов приводит к изменению

вирулентности популяции и её устойчивости к действию неблагоприятных факторов внешней среды.

6. Введение рекомбинантной плазмиды pCT105::mini-kan с клонированными генами профагов вирулентности СТХ и RS1 в клетки высокотоксигенных штаммов V. cholerae классического биовара приводит к выраженному изменению экспрессии хромосомных генов, кодирующих ключевые факторы вирулентности и иммуногенно-сти, - токсин-корегулируемые пили адгезии и белок OmpU. Изменение экспрессии хромосомных генов обусловлено повышенной активностью глобального регуляторно-го гена toxR.

7. При сравнительном анализе протеомов исходного и содержащего плазмиду pCT105::mini-kan штаммов V. cholerae впервые выявлены различия в их белковых профилях. В штамме, содержащем рекомбинантную плазмиду, обнаружено 33 гена с пониженной и 28 генов с повышенной экспрессией, кодирующих белки, являющиеся важными факторами вирулентности и иммуногенности, а также участвующие в энергетическом обмене, процессах метаболизма, транспорте, цитокинезисе и входящих в состав внешней мембраны.

8. Сконструированы содержащие плазмиду и бесплазмидные штаммы V. cholerae классического биовара с высоким уровнем продукции одновременно трех ключевых протективных антигенов - холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии и 01 антигена, ответственных за формирование при холере антитоксического, антиколонизирующего и антибактериального иммунитета. Определены оптимальные условия их культивирования (фаза роста, температура, состав и рН среды, время выращивания) для получения протективных антигенов при малообъемном культивировании в производственных условиях.

9. На основе сконструированных штаммов создана экспериментальная многокомпонентная иммунодиагностическая тест-система, включающая набор из 4-х очищенных протективных антигенов (холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии, OI антигена сероваров Инаба и Огава) и 4-х поликлональных антисывороток к ним. Экспериментально доказана специфичность, эффективность и диагностическая ценность тест-системы при определении экспрессии основных генов вирулентности и иммуногенности у природных штаммов V. cholerae с различной эпидемической значимостью.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Заднова С.П., Топорков A.B., Смирнова Н.И. Сравнительный анализ факторов патогенное™ у токсигенных и нетоксигенных клонов штаммов Vibrio cholerae Дакка 35 Огава // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 1999. - Вып. 79. - С. 153-159.

2. Чеховская Г.В., Заднова С.П., Ливанова Л.Ф., Лазовский Ю.В., Смирнова Н.И. Новый высокотоксигенный штамм Vibrio cholerae Дакка 35: морфология, продукция холерного токсина и белковый спектр // Centre for Control and Research of natural infectious diseases. Scientific Journal. - Ulaanbaatar, 1999. - N 7. - P. 282-283.

3. Konnov N.P., Baibyrin V.B., Zadnova S.P., Volkov Y.P. Comparative microscopy study of Vibrio cholera flagella // International Symposium. Biomedical Optic, Spie Proceedings. - San Jose, 1999. - Vol. 3607. - P - 25. - S. 30-31.

4. Топорков A.B., Заднова С.П., Смирнова Н.И. Штаммы холерного вибриона с повышенной продукцией токсин-корегулируемых пилей адгезии: выявление и феноти-пический анализ // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2000. - Вып. 80. - С. 88-93.

5. Топорков A.B., Заднова С.П., Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И. ToxR-регулируемые гены и их экспрессия в штаммах Vibrio cholerae Ol (pCT105::mini-kan) II Холера и патогенные для человека вибрионы. Информация проблемной комиссии (46.04) межведомственного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (46.00). - Ростов-на-Дону, 2000. - Вып. 13. - С. 59-61.

6. Смирнова Н.И., Челдышова Н.Б., Заднова С.П., Кутырев В.В. Молекулярно-генетические особенности штаммов Vibrio cholerae classica, вызвавших эпидемию азиатской холеры в России в 1942 году // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. -2001.-№ 4. -С. 12-16.

7. Заднова С.П., Топорков A.B., Смирнова Н.И. Получение и фенотипический анализ штаммов холерного вибриона с повышенной продукцией основных протективных антигенов // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2001. - № 2. - С. 3-6.

8. Заднова С.П., Топорков A.B., Новикова О.В., Коннов Н.П., Смирнова Н.И. Получение и изучение антител против токсин-корегулируемых пилей адгезии холерного вибриона Ol серогруппы // Пробл. Особо опасных инф. - Саратов, 2001. - Вып. 1(81). -С. 131-136.

9. Заднова С.П., Топорков A.B., Новикова О.В., Коннов Н.П., Смирнова Н.И. Изучение продукции токсин-корегулируемых пилей адгезии у штаммов холерного вибриона

классического биовара // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане. Сб. тез. Международной научно-практической конференции. - Алматы, 2001. - Вып. 3. — С. 143-147.

10. Заднова С.П., Топорков A.B., Челдышова Н.Б., Смирнова Н.И. Продукция ток-син-корегулируемых пилей адгезии природными штаммами холерного вибриона // Холера и патогенные для человека вибрионы. Материалы проблемной комиссии межведомственного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Ростов-на-Дону, 2001. - Вып. 14. - С. 36-38.

11. Заднова С.П., Топорков A.B., Челдышова Н.Б., Коннов Н.П., Смирнова Н.И. Конструирование штаммов-суперпродуцентов токсин-корегулируемых пилей адгезии — основного фактора колонизации холерного вибриона // Биотехнология. — 2002. - № 2. -С. 3-11.

12. Коннов Н.П., Заднова С.П., Новикова О.В., Топорков A.B., Смирнова Н.И. Изучение токсин-корегулируемых пилей адгезии холерного вибриона методом иммуно-электронной микроскопии // ЭМ2002. Тез. докл. XIX Российской конференции по электронной микроскопии. - Черноголовка, 2002. — С. 229.

13. Заднова С.П., Топорков A.B., Новикова О.В., Смирнова Н.И. Получение и использование антител на токсин-корегулируемые пили адгезии холерного вибриона // Биотехнология. - 2003. - № 1. - С. 79-84.

14. Топорков A.B., Заднова С.П., Смирнова Н.И. Генетический контроль регуляции экспрессии основных генов патогенности у возбудителя холеры // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2003. - Вып. 85. - С. 113-121.

15. Заднова С.П., Еремин С.А., Авдеева Н.Г., Волох O.A. Изучение роста штаммов холерного вибриона - продуцентов протективных антигенов в условиях глубинного культивирования и выделение белка токсин-корегулируемых пилей адгезии // Холера. Материалы Российской научно-практической конференции. — Ростов-на-Дону, 2003. — С. 236-238.

16. Заднова С.П., Топорков A.B., Захарова Т.Л., Коннов Н.П., Смирнова Н.И. Колониальные вариации штамма Vibrio cholerae Дакка 35 Огава // Холера. Материалы Российской научно-практической конференции. - Ростов-на-Дону, 2003. - С. 140-143.

17. Smimova N.I., Cheldyshova N.B., Zadnova S.P., Kutyrev V.V. Molecular-genetic peculiarities of classical biotype Vibrio cholerae, the etiological agent of the last outbreak Asiatic cholera in Russia // Microb. Pathog. - 2004. - Vol. 36, N 3. - P. 131-136.

18. Заднова С.П., Еремин C.A., Авдеева Н.Г., Волох O.A. Изучение динамики роста штаммов Vibrio с/го/егае-продуцентов протективных антигенов в условиях глубинного культивирования и выделение токсин-корегулируемых пилей адгезии // Биотехнология. - 2004. - № 3. - С. 43-48.

19. Заднова С.П., Топорков A.B., Исаев Н.Д. Фенотипический анализ штамма Vibrio cholerae Дакка 35 Огава, имеющего гетерогенную популяцию // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. — 2004. — № 3. — С. 86-88.

20. Заднова С.П. Функциональная роль ToxR-регулируемых белков Vibrio cholerae H Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2004. -Вып. 1(87). -С. 9-13.

21. Заднова С.П., Исаев Н.Д., Коннов Н.П., Захарова Т.Д., Смирнова Н.И. Биохимический анализ двух фенотипически различных клонов штамма Vibrio cholerae Дакка 35 01// Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2004. - Вып. 1(87). - С. 42-45.

22. Заднова С.П., Исаев Н.Д., Смирнова Н.И. Сравнительное изучение белкового состава у токсигенных и нетоксигенных клонов штамма Vibrio cholerae Дакка 35 // Молекулярная медицина и биобезопасность. Сб. тез. I Международной конференции. -М., 2004.-С. 80-81.

23. Заднова С.П., Исаев Н.Д., Смирнова Н.И. Вариабельность биохимических и генетических свойств штамма Vibrio cholerae Дакка 35 // Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития. Сб. тез. III съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров России. - М., 2004. - Т.1. - С. 381.

24. Топорков A.B., Заднова С.П., Смирнова Н.И. Повышение продукции основных протективных антигенов Vibrio cholerae Ole помощью рекомбинантной плазмиды с клонированными генами холерного токсина // Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины. Сб. тез. III конференции молодых ученых с международным участием. - М., 2004. - С. 160-161.

25. Смирнова Н.И., Заднова С.П., Топорков A.B. Влияние рекомбинантной плазмиды, несущей клонированные гены холерных профагов СТХ и RS 1, на экспрессию генов вирулентности и иммуногенности у возбудителя холеры II Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. — 2005. -№ 3. — С. 3-8.

26. Топорков A.B., Заднова С.П., Смирнова Н.И. Сравнительный анализ продукции протективных антигенов у рекомбинантных и производственных штаммов Vibrio cholerae классического биовара // Жури, микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. — 2005. — №1.-С. 53-57.

27. Исаев Н.Д., Лозовский Ю.В., Заднова С.П., Смирнова Н.И. Популяционная неоднородность природных штаммов Vibrio cholerae классического биовара: координированное изменение морфологии колоний, подвижности, токсигенности и ферментативных свойств // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2005. - Вып. 1(89). - С. 43^16.

28. Заднова С.П., Лозовский Ю.В. Механизмы секреции грамотрицательных бактерий // Пробл. особо опасных инф. — Саратов, 2005. - Вып. 2(90). - С. 11-16.

29. Смирнова Н.И., Заднова С.П., Топорков A.B., Кутырев В.В. Конструирование штаммов-продуцентов основных протективных антигенов холерного вибриона с помощью изменения экспрессии глобального регуляторного гена toxR// Биотехнология: состояние и перспективы развития. Материалы III Международного конгресса. - М., 2005. -Ч.1.-С. 82.

30. Кузнецов О.С., Заднова С.П., Исаев Н.Д., Смирнова Н.И., Коннов Н.П. Изучение морфологии колоний Vibrio cholerae Дакка 35 методами растровой и трансмиссионной электронной микроскопии // XIV Российский симпозиум по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел. Тез. докл. — Черноголовка, 2005. - С. 261.

31. Заднова С.П., Исаев Н.Д., Смирнова Н.И. Экзополисахаридный слой холерных вибрионов классического биовара: обнаружение, биохимический анализ и функциональная значимость // Холера и патогенные для человека вибрионы. Сборник материалов проблемной комиссии Научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Ростов-на-Дону, 2005. - Вып. 18. - С. 92-94.

32. Smimova N.I., Zadnova S.P., Toporkov A.V., Kutyrev V.V. Construction of strains producing the main protective antigens of Vibrio cholerae based on altered expression of the global regulatory gene toxR II New Research on Biotechnology and Medicine / Edit. A.M. Egorov, G.E. Zaikov. New York, 2006. - P. 177-188.

33. Заднова С.П., Исаев Н.Д., Кутейкин-Тепляков К.Б., Тихонова О.В., Торопы-гин И.Ю., Арчаков А.И., Смирнова Н.И. Протеомный анализ двух изогенных вариан-

tob Vibrio cholerae классического биовара с альтернативной экспрессией генов вирулентности // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2006. - № 3. - С. 11-16.

34. Исаев Н.Д., Заднова С.П., Смирнова Н.И. Влияние условий среды на координированное переключение генов патогенности и персистенции у холерного вибриона // Холера и патогенные для человека вибрионы. Сборник материалов проблемной комиссии Научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Ростов-на-Дону, 2006. - Вып. 19. - С. 69-71.

35. Заднова С.П., Еремин С.А., Волох O.A., Смирнова Н.И. Выделение токсин-корегулируемых пилей адгезии и белка внешней мембраны OmpU из штамма холерного вибриона классического биовара // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств - участников Содружества Независимых Государств. Материалы VII Межгосударственной научно-практической конференции. - Оболенск, 2006. - С. 105-106.

36. Заднова С.П., Волох O.A., Крепостнова И.М., Щелканова Е.Ю., Ливанова Л.Ф., Захарова Т.Л., Шепелев И.А., Еремин С.А., Смирнова Н.И. Изучение продукции основных факторов патогенности и иммуногенности различными штаммами Vibrio cholerae при их культивировании в производственных условиях // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2007.-Вып. 1(95) - С. 51-55.

37. Zadnova S.P., Isayev N.D., Smirnova N.I. Studying Vibrio cholerae isogenic variants of classical biovar by means of proteomic analysis // Natural infectious and emerging and reemerging diseases. Scientific Journal. - Улаанбаатар, 2007. - № 15. - С. 253-258.

38. Заднова С.П., Исаев Н.Д., Лозовский Ю.В., Смирнова Н.И. Изменение свойств штаммов холерного вибриона классического биовара под действием факторов внешней среды и мобильных генетических элементов // Холера и патогенные для человека вибрионы. Сборник материалов проблемной комиссии Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Ростов-на-Дону, 2007. - Вып. 20. - С. 102-105.

39. Захарова Т.Л., Заднова С.П., Ливанова Л.Ф., Крепостнова И.М., Киреев М.Н., Смирнова Н.И. Создание многокомпонентной диагностической иммуноферментной тест-системы для оценки экспрессии основных генов вирулентности у холерных вибрионов // Биотехнология. - 2008. - № 1. — С. 88-96.

40. Волох O.A., Шепелев И.А., Заднова С.П., Крепостнова И.М., Еремин С.А. Изучение физиологических процессов, происходящих в популяции штаммов холерного вибриона продуцентов протективных антигенов, в процессе производственного культивирования // Пробл. особо опасных инф. — Саратов, 2008. - Вып. 1(95). - С. 52-55.

41. Захарова T.J1., Заднова С.П., Ливанова Л.Ф., Киреев М.Н., Смирнова Н.И. Конструирование рекомбинантных штаммов для одновременного получения нескольких очищенных основных протективных антигенов холерного вибриона // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2009. - Вып. 2(100). - С. 68-71.

Патенты Российской Федерации на изобретения.

42. Штамм бактерий Vibrio cholerae 2414 классического биовара серовара Огава -продуцент холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии: пат RU 2169187 С1 / Смирнова Н.И., Заднова С.П., Топорков A.B.; заявитель и патентообладатель ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб». - № 2169187 С1; заявл. 26.04.2000; опубл. 20.06.2001, Бюл. № 17.-6 с.

43. Штамм бактерий Vibrio cholerae КМ200-продуцент холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии: пат. RU 2193598 С1 / Смирнова Н.И., Заднова С.П., Топорков A.B., Челдышова Н.Б.; заявитель и патентообладатель ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб». - № 2193598, заявл. 26.07.2001, опубл. 27.11.2002. Бюл. № 33. - 6 с.

44. Штамм бактерий Vibrio cholerae КМ206 классического биовара серовара Огава -продуцент протективных антигенов: пат. RU 2222594 С1 / Топорков A.B., Заднова С.П., Смирнова Н.И., Кутырев В.В.; заявитель и патентообладатель ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб». - № 2222594, заявл. 15.07.2002, опубл. 27.01.2004, Бюл. №3.-8 с.

45. Штамм бактерий Vibrio cholerae КМ207 классического биовара серовара Инаба -продуцент протективных антигенов: пат. RU 2222595 С1 / Заднова С.П., Топорков A.B., Смирнова Н.И., Кутырев В.В.; заявитель и патентообладатель ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб». - № 2222595, заявл. 15.07.2002; опубл. 27.01.2004, Бюл. № 3. - Юс.

46. Способ выделения белков токсин-корегулируемых пилей адгезии и OmpU холерного вибриона классического биовара: пат. RU 2324740 С2 У Заднова С.П., Еремин С.А., Авдеева Н.Г., Волох O.A., Самохвалова Ю.И., Смирнова Н.И.; заявитель и патентообладатель ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб». - № 2324740; заявл. 11.07.2006; опубл. 20.05.2008, Бюл. № 14. - 7 е.: ил.

Подписано к печати 08.08.2009 г. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Гарнитура «Тайме». Усл.-печ.л. 1. Тираж 100. Заказ № 403.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Заднова, Светлана Петровна

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ 6-

ГЛАВА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ИЗМЕНЧИВОСТИ

ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА 19

1.1. Организация генома возбудителя холеры 20

1.2. Мобильные генетические элементы V. cholerae, содержащие основные гены вирулентности, и их роль в образовании штаммов 28-43 с новыми свойствами

1.3. Участие внеклеточного экзополисахарида в формировании фе- 43-53 нотипически измененных форм V. cholerae

1.4. Координированная регуляция экспрессии генов вирулентности и персистенции у холерного вибриона 53-

ГЛАВА

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в работе 67

2.2. Питательные среды и реактивы

2.3. Методы

2.3.1. Культивирование штаммов

2.3.2. Определение продукции растворимой гемагглютинин/протеазы, фосфолипазы, гемолизина и подвижности 71

2.3.3. Изучение синтеза 01 антигена, чувствительности к полимиксину, холерным диагностическим бактериофагам, способности образовывать ацетилметилкарбинол 72

2.3.4. Реакция самоагглютинации бактерий

2.3.5. Иммуноблоттинг

2.3.6. Определение продукции холерного токсина и гемолизина 73

2.3.7. Определение вирулентности

2.3.8. Коньюгациопные скрещивания

2.3.9. Анализ плазмидного состава штаммов

2.3.10. Электрофоретическое изучение белкового состава клеток

2.3.11. Выделение экзополисахарида и количественное определение его содержания 76

2.3.12. Тонкослойная и высокоэффективная жидкостная хроматография

2.3.13. Электронно-микроскопический анализ холерных вибрионов 77

2.3.14. Двумерный форез, изофокусироваиие, трипсинолиз белков 79

2.3.15. Масс-спектрометрпя и идентификация белков

2.3.16. Определение концентрации белка

2.3.17. Выделение иммуноглобулинов

2.3.18. Выделение ДНК, ДНК-ДНК гибридизация

2.3.19. ПЦР-тестирование и секвенирование 81

2.3.20. Методы статистической обработки

ГЛАВА

ВЫЯВЛЕНИЕ И ФЕНОТИПИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРИРОДНЫХ ШТАММОВ V. CHOLERAE, СОДЕРЖАЩИХ В ПОПУЛЯЦИИ КЛОНЫ

С КООРДИНИРОВАНО ИЗМЕНЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ФАКТОРОВ ВИРУЛЕНТНОСТИ И ПЕРСИСТЕНЦИИ

3.1. Выявление в природных популяциях V. cholerae эльтор биовара вариантов с различной экспрессией нескольких факторов вирулентности и персистенции 84

3.2. Исследование популяционного состава природных штаммов К cholerae классического бновара и фенотипический^ анализ вариантов с различной экспрессией^ нескольких факторов вирулентно стн и персистенции 89

3.3. Сравнительное изучение генетической организации изогенных вариантов модельного штамма V. cholerae Дакка 35 с различными фенотипическими свойствами 92

ГЛАВА

ВЫЯВЛЕНИЕ У V. CHOLERAE КЛАССИЧЕСКОГО БИОВАРА ЭКЗО-ПОЛИСАХАРИДНОГО СЛОЯ И ЕГО БИОХР1МИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

4.1. Обнаружение на поверхности клеток V. cholerae экзополисаха-рндного слоя 96

4.2. Определение углеводного состава экзополисахаридного слоя и изучение его функциональной роли у модельного штамма V. cholerae Дакка 35 101

ГЛАВА

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПРОТЕОМОВ ФЕНОТИПИЧЕСКИ РАЗНЫХ ВАРИАНТОВ V. CHOLERAE КЛАССИЧЕСКОГО БИОВАРА И ВЫЯВЛЕНИЕ СИГНАЛОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ КООРДИНИРОВАННОЕ ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ВИРУЛЕНТНОСТИ И ПЕРСИСТЕНЦИИ

5.1. Протеомный анализ изогенных EPS+Tox++Hap+Mot+ и EPS Тох Нар Mot вариантов V. cholerae Дакка 35 классического биовара 107

5.2. Выявление сигналов внешней среды, вызывающих координированное переключение синтеза факторов вирулентности и персистенции 112

5.3. Популяционная изменчивость изогенных EPS+Tox++Hap+Mot+ и EPS++Tox+Hap++IVlot++ вариантов штамма Дакка 35 в условиях in vitro и in vivo 114

ГЛАВА

ФЕНОТИПИЧЕСКИЙ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ШТАММОВ V. CHOLERAE КЛАССИЧЕСКОГО БИОВАРА С ИЗМЕНЕННОЙ ПРОДУКЦИЕЙ ФАКТОРОВ ВИРУЛЕНТНОСТИ 120

6.1. Получение штаммов холерного вибриона, содержащих рекомби-нантную плазмиду с клонированными генами профагов СТХ и

RS1 121

6.2. Оценка роли глобального регуляторного гена toxR в повышении экспрессии генов, контролирующих биосинтез TCP, у штаммов, содержащих рекомбинантную плазмиду pCT105::mini-kan 128

6.3. Влияние профага RS1, входящего в состав рекомбинантной плазмиды, на экспрессию гена toxR 133

ГЛАВА

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИЗ ИСХОДНОГО И СОДЕРЖАЩЕГО ПЛАЗМИДУ рСТ 105: :mini-kan ШТАММОВ V.

CHOLERAE КЛАССИЧЕСКОГО БИОВАРА 137-

ГЛАВА

СОЗДАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МНОГОКОМПОНЕНТНОЙ

ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ

8.1. Получение бесплазмидных штаммов-продуцентов протективных антигенов 142

8.2. Изучение продукции протективных антигенов штаммами-продуцентами V. cholerae при малообъемном культивировании 147

8.3. Получение белкового препарата, содержащего токсин-корегулируемые пили адгезии, и изучение его биохимических свойств 153

8.4. Получение полнклональных антисывороток, содержащих антитела к токсин-корегулируемым пилям адгезии, и определение их антигенного состава 159

8.5. Создание лабораторного образца многокомпонентной диагностической иммуноферментной тест-системы 164

Введение Диссертация по биологии, на тему "Штаммы Vibrio cholerae с измененной экспрессией генов вирулентности"

Актуальность проблемы. Распространение холеры в странах Азии, Африки, Латинской Америки свидетельствует о том, что эта инфекция остается угрозой для многих стран, включая и Российскую Федерацию (Онищенко Г.Г. с соавт., 2005; Кутырев В.В., 2008; Ломов Ю.М. с соавт., 2008). Важным и перспективным направлением в решении проблемы холеры является изучение генетических основ изменчивости вирулентных свойств возбудителя. О большой вариабельности генома этого патогена свидетельствует тот факт, что в процессе эволюции сформировано три эпидемически опасных варианта Vibrio cholerae: 01 серогруппы классического биовара, 01 серогруппы эльтор биовара и 0139 серогруппы (Бароян О.В., 1971; Ломов Ю.М., 2004; Смирнова Н.И., Кутырев В.В., 2004; Finkelstein R.A., 1973; Matson J.S. et al., 2007).

Очевидная необходимость проведения исследований по проблеме изменчивости V. cholerae определяется и тем, что в связи с изменяющимися экологическими условиями постоянно растет частота выделения природных атипичных штаммов возбудителя холеры. Особый интерес вызывает процесс образования природных штаммов с повышенной вирулентностью (Смирнова Н.И. с соавт., 2008; Albert M.J. et al., 1993; Davis B.M. et al., 1999; Nair G.B. et al., 2002, 2006; Faruque S.M. et al., 2003, 2007; Safa A. et al., 2005, 2008; Raychoudhuri A. et al., 2009). Структурно-функциональный анализ таких изолятов может обеспечить получение фундаментальных знаний о новых механизмах формирования штаммов с ранее неизвестными свойствами. Более того, на их основе возможен поиск новых способов генодиагностики природных штаммов с измененной вирулентностью для осуществления адекватного мониторинга внешней среды с целью прогнозирования эпидемических ситуаций.

Поскольку возбудитель холеры может существовать как в инфицированном макроорганизме (человек), так и в природных экосистемах, то другая важная проблема состоит в изучении взаимосвязи между синтезом факторов вирулентности и персистенции V. cholerae, так как этот вопрос остается малоизученным. Так, в последние годы интенсивно изучается механизм обратимых фазовых вариаций, которые выражаются в переключении биосинтеза экзополисахарида или EPS (от англ. -exopolysaccharide), обеспечивающего выживаемость клеток во внешней среде в составе биопленки (Yildiz F.H. et al., 2001; Ali A. et al., 2002). При этом у клонов, продуцирующих экзополисахарид, снижается уровень биосинтеза ряда факторов вирулентности (Yildiz F.H. et al., 2004). Вместе с тем единичные сообщения на эту тему не дают полного представления об изменении экспрессии генов вирулентности при адаптации возбудителя холеры к меняющимся условиям окружающей среды. Отсутствуют данные о сигналах внешней среды, приводящие к репрессии факторов вирулентности при росте клеток в неблагоприятных условиях. Остается неясным, при каких условиях окружающей среды осуществляется переключение экспрессии генов патогенности V. cholerae, определяющее появление у возбудителя вирулентных свойств. Между тем выявление таких факторов, обеспечивающих индукцию экспрессии факторов вирулентности в природных популяциях, может внести существенный вклад в повышение эффективности мониторинга внешней среды.

Еще одной не менее важной является проблема экспрессии резидентных генов вирулентности в бактериальных клетках, получивших дополнительный генетический материал (плазмиды, транспозоны, бактериофаги). До недавнего времени считалось, что рекомбинантные плазмиды с клонированными генами различных факторов вирулентности при введении их в клетки реципиентных штаммов определяют повышенный уровень продукции белков, биосинтез которых кодируется этим дополнительным генетическим материалом. Проведение интенсивных исследований в этом направлении привело к созданию штаммов-продуцентов холерного токсина, или СТ (от англ. - cholera toxin), и его В-субъединицы (Янишевский Н.В., 1986; Ильина Т.С. с соавт., 1987; Филькова СЛ. с соавт., 1988; Смирнова Н.И. с со-авт., 1993; Чеховская Г.В., Смирнова Н.И., 1994; Захарова Т.Д., 1997; Ерошенко Г.А., 2004). В то же время сведения об изменении экспрессии хромосомных генов, определяющих продукцию других факторов вирулентности в клетках, содержащих плазмидный геном, практически отсутствуют. Геномный и протеомный анализ таких штаммов будет основой для понимания ранее неизвестных путей регуляции экспрессии важнейших генов вирулентности в новом генетическом окружении. Полученные фундаментальные знания открывают новые подходы для создания штаммов с повышенной продукцией одновременно нескольких протективных антигенов. Такие штаммы могут быть использованы для изготовления современных диагностических и профилактических препаратов.

Цель работы — молекулярно-генетический и биохимический анализ природных и генетически модифицированных штаммов V. cholerae с измененной экспрессией генов вирулентности и создание на их основе штаммов-продуцентов основных протективных антигенов.

Задачи исследования:

1. Изучить поиуляционный состав природных штаммов V. cholerae эльтор и классического биоваров для выявления фенотипических вариантов с координировано измененным уровнем продукции факторов вирулентности и персистенции. Создать коллекцию изогенных штаммов с разным уровнем экспрессии ключевых генов вирулентности.

3. Провести сравнительный анализ протеомов двух фенотипически разных вариантов (ЕР S+t Tox+Hap++Mot++ и EPS+Tox++Hap+Mot+) модельного штамма V. cholerae Дакка 35. Выяснить роль отдельных белков и экзополисахарида в адаптации клеток к неблагоприятным условиям окружающей среды.

6. Сравнить протеомные профили исходного и содержащего рекомбинант-ную плазмиду pCT105::mini-kan модельного штамма V. cholerae классического биовара с целью выявления различий в содержании белков, являющихся факторами вирулентности или определяющими жизнеспособность клеток.

7. Сконструировать содержащие плазмиду и бесплазмидные штаммы V. cholerae классического биовара с повышенной продукцией одновременно трех основных антигенов, обладающих протективными свойствами - СТ, токсин-корегулируемых пилей адгезии или TCP (от англ. - toxin-coregulated pilus) и 01 антигена. Определить оптимальные условия их глубинного культивирования для получения этих антигенов.

Научная новизна исследования:

Впервые при изучении популяционного состава природных штаммов холерного вибриона эльтор и классического биоваров выявлены штаммы, имеющие в популяции два типа клонов, различающихся одновременно несколькими феноти-пическими свойствами: морфологией колоний, продукцией холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы, гемолизина, а также подвижностью. Впервые установлено, что экспрессия генов, определяющих разные фенотипы клеток, имеет координированный характер. Впервые на поверхности клеток классических холерных вибрионов обнаружен экзополисахаридный слой, определяющий морфологию колоний и содержащий рамнозу, глюкозу, галактозу и гексозамин. Установлена его функциональная роль, которая состоит в защите клеток при действии осмотического и оксидативного стрессов.

При проведении сравнительного протеомного анализа двух фенотипнчески разных вариантов модельного штамма V. cholerae Дакка 35 впервые выявлено изменение содержания в клетках ферментов и белков внешней мембраны, играющих важную роль в их метаболизме и выполняющих защитную функцию. Показано, что смена популяционного состава штамма по фенотипу либо повышает его устойчивость к воздействиям повреждающих факторов внешней среды, либо усиливает вирулентность.

В результате проведенных исследований впервые выявлена панель белков, кодируемых хромосомными генами (ctxAB, tcpA-F, ompU, hap А), повышение содержания которых характерно для штаммов, несущих рекомбинантную плазмиду pCT105::mini-kan с клонированными генами двух профагов вирулентности СТХ и RS1. Впервые установлено, что в присутствии указанной плазмиды в клетках ток-сигенных штаммов классических вибрионов увеличение экспрессии хромосомных генов tcpA-F и ompU происходит за счет усиления активности глобального регулятор ного гена toxR.

Впервые получены содержащие плазмиду и бесплазмидные штаммы V cholerae классического биовара сероваров Инаба (2415 и КМ207) и Огава (2414 и КМ206), отличающиеся от штаммов, используемых в производстве таблетирован-ной холерной бивалентной химической вакцины (569В Инаба и М41 Огава), повышенной продукцией одновременно трех протективных антигенов - СТ, TCP и Ol антигена. Приоритетность работы в данном направлении подтверждена получением 4-х патентов РФ на изобретения: № 2169187 (приоритет от 26.04.2000 г.) «Штамм бактерий Vibrio cholerae 2414 классического биовара серовара Огава -продуцент холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии»; № 2193598 (приоритет от 26.07.2001 г.) «Штамм бактерий Vibrio cholerae КМ200-продуцент холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии»; № 2222595 (приоритет от 15.07.2002 г.) «Штамм бактерий Vibrio cholerae КМ206 классического биовара серовара Огава - продуцент протективных антигенов»; № 2222594 (приоритет от 15.07.2002 г.) «Штамм бактерий Vibrio cholerae КМ207 классического биовара серовара Инаба - продуцент протективных антигенов».

Выявлены особенности экспрессии генов, кодирующих указанные протек-тивные антигены, при глубинном культивировании штаммов-продуцентов. Определены оптимальные условия продукции ими протективных антигенов и экспериментально доказана целесообразность использования сконструированных штаммов для получения протективных антигенов в условиях производства. Приоритетность работы по получению очищенных протективных антигенов подтверждена патентом РФ № 2324740 (приоритет от 11.07.2006 г.) на способ выделения белков токсин-корегулируемых пилей адгезии и OmpU холерного вибриона классического биовара.

Впервые создана эффективная и специфичная экспериментальная многокомпонентная иммуноферментная диагностическая тест-система, включающая четыре очищенных протективных антигена (СТ, TCP, Ol антиген Инаба и Огава) и четыре поликлональные антисыворотки к ним, позволяющая оценивать экспрессию основных генов вирулентности в природных штаммах V. cholerae 01 серогруппы для уточнения их эпидемической значимости.

Практическая ценность и формы внедрения:

В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» депонировано 16 штаммов V. cholerae классического биовара сероваров Огава и Инаба, из которых 6 - продуценты СТ и TCP; 8 штаммов характеризуются координированным переключением экспрессии трех генов {mot, hap, vps), связанных с вирулентностью; 2 штамма - инсерционные мутанты, утратившие способность продуцировать СТ при внедрении транспозона TnphoA (Кшг) в бактериальный геном.

Результаты исследований использованы в следующих документах:

- Методические указания МУК 4.2.2218—07 «Лабораторная диагностика холеры», утвержденные Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 31 мая 2007 г. и введенные в действие с 1 августа 2007 г. взамен методических указаний «Лабораторная диагностика холеры» МУ 4.2.1097—02.

- Практическое руководство «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней». Под ред. академика РАМН, профессора Г.Г. Онищенко, чл-корр.

РАМН, профессора В.В. Кутырева. - М: ОАО Издательство «Медицина», Издательство «Шико», 2009.

- Методические рекомендации «Создание штаммов холерного вибриона классического биовара — продуцентов протективных антигенов», одобренные Ученым Советом (протокол № 4 от 13.04.2004 г.) и утвержденные директором Рос-НИПЧИ «Микроб» (14.04.2004 г.).

- Методические рекомендации «Получение штаммов холерного вибриона классического биовара с координированным изменением экспрессии факторов па-тогенности и персистенции», одобренные Ученым Советом (протокол № 7 от 27.06.2006 г.) и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» (29.06.2006 г.).

- Методические рекомендации «Выделение токсин-корегулируемых пилей адгезии и белка внешней мембраны OmpU холерного вибриона классического биовара», одобренные Ученым Советом (протокол № 7 от 27.06.2006 г.) и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» (29.06.2006 г.).

Сконструированные содержащие плазмиду и бесплазмидные штаммы-продуценты одновременно трех основных протективных антигенов холерного вибриона (В-субъединицы в составе СТ, TCP, 01 антигена серовара Огава или Инаба) используются в научных и производственных лабораториях ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» при проведении молекулярно-генетических исследований по изучению механизмов регуляции.экспрессии генов вирулентности и иммуногенности холерного вибриона и при получении очищенных ключевых протективных антигенов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Популяция ряда природных штаммов V. cholerae эльтор и классического биоваров содержит два типа клонов, различающихся по морфологии колоний (прозрачные и мутные), продукции холерного токсина, растворимой гемагглюти-нин/протеазы, гемолизина, а также подвижности. Изменение морфологии колоний изогенных вариантов V. cholerae обоих биоваров связано с продукцией клетками экзополисахаридного слоя. Продуцирующие экзополисахарид холерные вибрионы эльтор биовара (EPS44") отличаются от изогенных (EPS+) вариантов меньшей подвижностью, повышенным уровнем биосинтеза холерного токсина, но сниженной продукцией растворимой гемагглютинин/протеазы. Для классических холерных вибрионов характерна обратная связь между экспрессией названных факторов вирулентности.

3. Два фенотипически разных варианта модельного штамма V. cholerae Дакка 35 имеют разные протеомы. Среди 841 выявленного белка идентифицировано 57 белков с повышенным или пониженным содержанием в клетках. В gpg++Y0X+fjap++]vi0t++ вариантах репрессируется синтез 26 белков и индуцируется синтез 31. Для EPS+Tox++Hap"bMot+ клонов характерна обратная картина. Индукция в клетках EPS++Tox+Hap'HMot++ ряда мембранных и цитоплазматических белков с защитной функцией указывает на их повышенную резистентность к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды.

6. Получены содержащие плазмиду и бесплазмидные штаммы V. cholerae классического биовара с высоким уровнем продукции одновременно трех ключевых протективных антигенов - холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии и 01 антигена. Определены оптимальные параметры их выращивания для получения протективных антигенов в полупроизводственных условиях.

Апробация работы.

Материалы диссертации представлены на интернациональном симпозиуме «Биомедицинская оптика» (Сан-Хосе, США, 1999), XIX Российской конференции по электронной микроскопии «ЭМ'2002» (Черноголовка, 2002), 8 Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера» (Ростов-на-Дону, 2003), III съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров России «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004), III конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004), I Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004), XIV Российском симпозиуме по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (Черноголовка, 2005), III Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва,

2005), VII Межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств - участников Содружества Независимых Государств» (Оболенск,

2006), V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), а также на совещаниях проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (Ростов-на-Дону, 2005-2007) и ежегодных научных конференциях ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 1999-2009).

Публикации по теме исследования.

Структура и объем диссертации.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Заднова, Светлана Петровна

выводы

2. Морфология колоний штаммов V. cholerae классического и эльтор биоваров определяется биосинтезом экзополисахарида. Впервые обнаружено, что классические и эльтор вибрионы, продуцирующие экзополисахарид, различаются по характеру координированной экспрессии генов холерного токсина (ctxAB% растворимой гемагглютинин/протеазы (hapА) и подвижности (mot). У эльтор вибрионов повышение экспрессии генов экзополисахарида (vps) сопровождается увеличением активности генов ctxAB, но снижением экспрессии генов hapA и mot. У классических вибрионов существует обратная связь между экспрессией указанных генов.

4. Проведенный сравнительный анализ протеомов двух фенотипически разных вариантов V. cholerae Дакка 35 классического биовара выявил присутствие 841 белка. В клетках ЕРS++Tox+Hap+4Mot++ репрессируется синтез 26 белков и индуцируется синтез 31. Для клеток EPS+Tox++Hap+Mot+ характерна обратная картина. Индукция в клетках EPS++Tox+Hap++Mot++ ряда мембранных и цитоплазматических белков с защитной функцией указывает на их повышенную резистентность к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды.

5. Сигналом внешней среды, вызывающим координированное переключение синтеза экзополисахарида, холерного токсина, растворимой гемагглюти-нин/протеазы и подвижности у холерных вибрионов классического биовара, является щелочная реакция среды (рН 9,0). Переключение активности этих генов приводит к изменению вирулентности популяции и её устойчивости к действию неблагоприятных факторов внешней среды.

6. Введение рекомбинантной плазмиды pCT105::mini-kan с клонированными генами профагов вирулентности СТХ и RS1 в клетки высокотоксигенных штаммов V. cholerae классического биовара приводит к выраженному изменению экспрессии хромосомных генов, кодирующих ключевые факторы вирулентности и иммуно-генности, - токсин-корегулируемые пили адгезии и белок OmpU. Изменение экспрессии хромосомных генов обусловлено повышенной активностью глобального регуляторного гена toxR.

7. При сравнительном анализе протеомов исходного и содержащего плазмиду pCT105::mini-kan штаммов V. cholerae впервые выявлены различия в их белковых профилях. В штамме, содержащем рекомбинантную плазмиду, обнаружено 33 гена с пониженной и 28 генов с повышенной экспрессией, кодирующих белки, являющиеся важными факторами вирулентности и иммуногенности, а также участвующими в энергетическом обмене, процессах метаболизма, транспорте, цитокине-зисе и входящих в состав внешней мембраны.

9. На основе сконструированных штаммов создана экспериментальная многокомпонентная иммунодиагностическая тест-система, включающая набор из 4-х очищенных протективных антигенов (холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии, 01 антигена сероваров Инаба и Огава) и 4-х поликлональных антисывороток к ним. Экспериментально доказана специфичность, эффективность и диагностическая ценность тест-системы при определении экспрессии основных генов вирулентности и иммуногенности у природных штаммов V. cholerae с различной эпидемической значимостью.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение морфологии колоний, серологических и биохимических свойств фенотипически измененных форм холерного вибриона, выделяемых из внешней среды и от людей, а также эксперименты по созданию штаммов-продуцентов холерного токсина (или В-субъединицы) при введении рекомбипантных плазмид с клонированными генами различных факторов вирулентности V. cholerae проводятся исследователями давно, но ответы на ряд вопросов до сих пор не получены. Отсутствуют сведения об обнаружении в популяции природных штаммов холерного вибриона клонов с одновременным изменением уровня экспрессии нескольких генов вирулентности и персистенции, не выявлены факторы внешней среды, способствующие появлению таких клонов, не изучено строение их генома и белковый состав. Нет данных, показывающих изменяется ли экспрессия резидентных хромосомных генов V. cholerae cholerae при введении плазмиды с клонированными генами двух профагов вирулентности (СТХ и RS1) эльтор вибрионов, и, наконец, отсутствуют штаммы V. cholerae, продуцирующие в значительном количестве одновременно несколько факторов вирулентности, являющихся и основными протекти-выми антигенами. Изучение структуры и функции генома природных и генетически модифицированных штаммов V. cholerae с измененной экспрессией генов вирулентности с использованием современных молекулярно-генетических и биохимических методов может значительно расширить сведения о механизмах изменения его диагностически значимых и вирулентных свойств. Получение таких данных будет способствовать разработке более совершенных средств специфической профилактики этой инфекции и проведению более рациональных противоэпидемических мер.

В результате комплексного фенотипического анализа 146 природных штаммов V. cholerae 01 серогруппы получены новые данные о популяционной гетерогенности этого патогена. В пределах популяции ряда штаммов выявлены морфологически разные варианты - прозрачные, или Т, и мутные, или О, отличающиеся координированным и альтернативным изменением уровня экспрессии таких важных факторов вирулентности и персистенции как СТ, Нар, Н1у, а также подвижности. Т варианты эльтор вибрионов синтезировали меньшее количество СТ, но больше Н1у, Нар и были более подвижны, чем О варианты, которые имели повышенный синтез СТ, сниженную продукцию гемолизина, Нар и меньшую подвижность. Фенотип Т клонов был обозначен как Т Tox+Hly++Hap++Mot++, а О как - О Tox++Hly+Hap+Mot+. В то же время типичные Т варианты классических вибрионов в отличие от эльтор вибрионов были более токсигенны, продуцировали незначительное количество Нар и были малоподвижными в отличие от О вариантов, которые имели сниженный синтез СТ, высокий уровень биосинтеза Нар и значительную подвижность. Фенотип изогенных клонов V. cholerae классического биовара был обозначен как Т Tox+4Hap+Mot+ и О Tox+Hap++Mot++. Обнаруженный обратный характер связи между морфологией колоний и продукцией СТ, Нар, а также подвижностью у холерных вибрионов двух биоваров, возможно, является следствием различной регуляции экспрессии данных факторов вирулентности у V. cholerae cholerae и V. cholerae eltor. Поскольку различия между колониями по изученным свойствам были наиболее выражены у штамма V. cholerae Дакка 35 классического биовара, то именно этот штамм был выбран в качестве модельного для последующих экспериментов.

Молекулярно-генетический анализ изогенных вариантов V. cholerae Дакка 35 не выявил различий по набору генов, расположенных как на мобильных генетических элементах (ctxA, zot, асе - профаг СТХ, toxT, tcpP, tcpH- VPI-I), так и в эво-люцнонно древней части хромосомы (toxR, hapR, luxO), а также по числу копий структурных (ctxAB) и регуляторпых (toxR) генов, кодирующих и контролирующих синтез СТ. Однако при секвенировании промоторной области гспа ctxA было выявлено повышенное (до 6) содержание повторяющейся гептапептидной последовательности, участвующей в регуляторных процессах токсинообразования, что, возможно, является одной из причин повышенной экспрессии генов ctxAB у Т Тох Нар Mot клонов данного штамма. Полученные данные позволяют предположить, что популяционная вариабельность экспрессии структурных генов ctxAB в штамме V. cholerae Дакка 35 могла возникнуть в результате изменения регулятор-ного механизма их транскрипции.

При установлении поверхностных структур, ответственных за изменение морфологии колоний в штаммах V. cholerae 01 серогруппы, было выявлено, что непрозрачная морфология колоний является следствием синтеза О вариантами дополнительного экзополисахаридного слоя на поверхности клеток. При этом экзо-полисахаридный слой на поверхности клеток классических вибрионов, состоящий из рамнозы, глюкозы, галактозы, гексозамина, был обнаружен впервые. Сравнение состава EPS классических вибрионов с EPS ругозных колоний штаммов V. cholerae биовара эльтор выявило отсутствие в нем глюкозамина и маннозы.

На основе полученных данных о выраженной продукции экзополисахарида О-вариантами разных штаммов холерного вибриона фенотип О-клонов был обозначен как EPS44", а Т-клонов как EPS+.

Согласно данным литературы, дополнительный экзополисахаридный слой, присутствующий на поверхности штаммов эльтор вибрионов, способствует устойчивости клеток к действию осмотического и оксидативного стрессов (Wai S.M. et al., 1998). При изучении влияния данных факторов на изогенные варианты штамма V. cholerae Дакка 35 было установлено, что ЕР S++Tox+Hap++Mot+4 клоны действительно более устойчивы к действию высоких концентраций соли и перекиси водорода по сравнению с EPS^Tox^Hap^TVIot* клонами. Полученные данные позволяют предположить, что продукция экзополисахарида холерными вибрионами классического биовара происходит, видимо, в результате их адаптации к неблагоприятным воздействиям окружающей среды.

Поскольку у холерных вибрионов координированная экспрессия генов в зависимости от условий окружающей среды контролируется несколькими глобальными регуляторными системами, которые «включают» или «выключают» биосинтез различных белков, то изменение активности генов вирулентности и персистен-ции может сопровождаться изменением уровня экспрессии генов, кодирующих белки с другими функциями. При протеомном анализе изогенных клонов штамма V. cholerae Дакка 35 было обнаружено, что в EPS++Tox+Hap++Mot++ вариантах биосинтез 26 белков репрессировался, а 31 белка индуцировался, тогда как в клетках EPS+Tox++Hap+Mot+ вариантов наблюдалась обратная картина. При последующей идентификации 19 белков было установлено, что изогенные клоны V. cholerae Дакка 35 значительно различаются по экспрессии белков, участвующих в энергетическом обмене и метаболизме клеток. При этом в EPS++Tox+Hap++Mot++ вариантах установлена повышенная экспрессия генов, связанных с синтезом мембранных (OmpU и TolC) и цитоплазматических (с метилтрансферазной и антиоксидантными функциями) белков, обеспечивающих защиту клетки от воздействия неблагоприятных факторов внешней среды.

Для выявления сигналов внешней среды, вызывающих комплексные изменения в экспрессии факторов вирулентности и персистенции в штаммах холерного вибриона классического биовара, было изучено влияние различных факторов, воздействующих на холерный вибрион как при нахождении во внешней среде, так и в организме хозяина (различной температуры, рН, осмолярности, отсутствия питательных веществ, наличие глюкозы, аминокислот, викасола). В результате обнаружено, что одним из внешних сигналов, вызывающих переключение активности генов, кодирующих экзополисахарид, холерный токсин, растворимую гемагглютн-нин/протеазу, а также подвижность является щелочная (9,0) реакция среды. При культивировании на средах с рН 9,0 в популяции EPS+Tox++Hap+Mot+ вариантов штаммов V. cholerae Дакка 35, 9361, 49520 и В-1307 с частотой 80-85 % появлялись EPS wТох 'Hap^Mot** клоны. При этом смена популяционного состава штамма приводила к изменению уровня его вирулентности: EPS+Tox++Hap+Mot+ клоны были вирулентны, в то время как EPS++Tox+Hap++Mot+4 - авирулентны. Необходимо отметить, что выявленные в популяции классических вибрионов EPS'HTox+Hap++Mot++ клоны, не продуцирующие СТ, но имеющие высокий уровень биосинтеза EPS и Нар, содержали в хромосоме весь набор ключевых генов вирулентности, включая ctxAB, т.е. по своему генотипу они не отличались от эпидемически опасных штаммов. Обнаружение таких штаммов в окружающей среде может служить указанием на возможность эпидемических осложнений, поскольку при их попадании в организм человека состав популяций может достаточно быстро измениться вследствие селективного отбора в макроорганизме клонов, продуцирующих основные факторы вирулентности. Это предположение подтверждается тем, что в организме модельных животных в 6 % случаях в популяции авирулентных

EPS++Tox4Hap++Mot++ вариантов действительно появлялись клоны с альтернативным фенотипом, соответствующим фенотипу типичных вирулентных штаммов.

Биологическая функция выявленного одновременного изменения нескольких свойств холерного вибриона заключается, по-видимому, в том, что благодаря работе переключающего механизма популяция штаммов холерного вибриона классического биовара получает возможность сохраняться при смене среды обитания.

Таким образом, важным итогом проведенных исследований природных штаммов V. cholerae Ol серогруппы классического и эльтор биовара является получение новых данных о популяционной гетерогенности этого патогена. В пределах популяции обнаружено два морфологически разных варианта, отличающихся друг от друга экспрессией нескольких факторов вирулентности и персистенции, что расширяет имеющиеся представления о диапазоне изменчивости возбудителя холеры. Учитывая процесс координированного переключения активности генов, можно сделать предположение, что у V. cholerae 01 серогруппы существует еще неизвестный регуляторный механизм, который контролирует дифференциальную экспрессию соответствующих генов, который может лежать в основе формирования клонов с новым патогенным потенциалом.

Следующий раздел работы был посвящен изучению влияния рекомбинант-ной плазмиды рСОЮ7-2 (TcrKmr), включающей плазмиду pCT105::mini-kan (ТсгКтг) — производную pBR322, содержащую вставку ДНК штамма V. cholerae RV79 биовара эльтор с клонированными генами профагов СТХ и RS1 (Гинцбург A.JL с соавт., 1984), на экспрессию хромосомных генов V. cholerae классического бповара, и получению штаммов с высоким уровнем продукции нескольких ключевых протективных антигенов.

В качестве модельных было использовано две группы штаммов - с высокой (V. cholerae 569В, Дакка 35, КМ200) и умеренной (V. cholerae B-1307, J-89, М-19) продукцией СТ. Присутствие плазмиды pCT105::mini-kan (TcrKmr) в клетках всех взятых штаммов привело к увеличению продукции СТ в 2,6-4,3 раза по сравнению с исходными. Кроме того, только у производных высокотоксигенных штаммов - V. cholerae 2415 [569В (pCT105::mini-kan)], 2414 [Дакка 35 (pCT105::mini-kan)] и КМ220 [КМ200 (pCT105::mini-kan)] увеличилась и продукция TCP. Повышение синтеза TCP у данных штаммов, было подтверждено с помощью реакции самоагглютинации бактерий, а также методами иммуноблоттинга и электронной микроскопии.

Выявленная нами способность рекомбинантной плазмиды рСТ105 повышать продукцию не только СТ, но и TCP у холерных вибрионов классического биовара, открывает новый путь для получения штаммов-продуцентов данных белков. Вместе с тем возникает вопрос, за счет какого механизма рекомбинантная плазмида, не имеющая клонированных генов tcp, изменяет продукцию TCP? Поскольку экспрессия генов ctxAB и tcpA-F регулируется одним и тем же регуляторным геном toxR, мы предположили, что наблюдаемое нами повышение продукции TCP у содержащих плазмиду штаммов могло быть связано с увеличением активности этого регу-ляторного гена, возможно, в результате каких-то пока не известных плазмидно-хромосомных взаимодействий. Действительно, в результате комплекса экспериментов (определение продукции белков внешней мембраны OmpU и OmpT, биосинтез которых непосредственно регулирует глобальный регуляторный ген toxR; изучение уровня биосинтеза TCP при выращивании штаммов в непермиссивных для экспрессии гена toxR условиях; введение плазмиды pCT105::mini-kan в клетки штамма RV31, имеющего делецию в гене toxR и определение у содержащих плазмиду клопов продукции TCP, OmpU и СТ) были получены новые данные, свидетельствующие о том, что при введении плазмиды pCT105::mini-kan в клетки токси-генных штаммов V. cholerae повышается экспрессия хромосомных генов tcpA-F и ompU, кодирующих соответственно биосинтез TCP и OmpU, в результате усиления активности регуляторного гена toxR. Пока нет данных о том, какие именно события, происходящие в клетке, обеспечивают усиление его транскрипции. В качестве одного из первых претендентов на участие в этом событии следует рассматривать ген rstC, локализованный в составе RS1. Однако для окончательного заключения о роли гена-антирепрессора rstC в изменении экспрессии хромосомных генов, необходимы дальнейшие исследования.

Очевидно, что, наряду с повышенной активностью регуляторного гена toxR, может происходить изменение экспрессии и других хромосомных генов, кодирующих белки с различной функцией. Проведенный нами протеомный анализ V. cholerae 569В и его производного 2415 (pCT105::mini-kan) выявил, что присутствие плазмиды привело не только к увеличению продукции СТ и TCP, но и значительно повлияло на метаболизм клетки, что выразилось в изменении содержания более 60 белков, участвующих в энергетическом обмене, метаболизме, делении клеток, транспорте, а также входящих в состав внешней мембраны. Полученные нами результаты, во-первых, согласуются с данными J. Bina et al. (2003), относительно изменения продукции ацетаткиназы, транспортных и белков внешней мембраны при изменении активности toxR, во-вторых, подтверждают выявленную нами роль глобального регуляторного белка ToxR в изменении экспрессии хромосомных генов в штаммах, содержащих рекомбинатную плазмиду.

Итак, полученные нами экспериментальные данные, во-первых, представляют интерес в плане прогнозирования появления природных штаммов V. cholerae с новыми свойствами. Во-вторых, наши исследования показали, что у возбудителя холеры классического биовара имеется новый механизм регуляции генной активности, который основан па влиянии плазмидного генома, содержащего клонированные гены профагов СТХ и RS1, па экспрессию резидентных хромосомных генов. Перспективность продолжения работы в этом направлении определяется решением фундаментальных задач - изучением особенностей регуляции экспрессии генов, кодирующих биосинтез ключевых факторов вирулентности, в рамках уникальных плазмидно-хромосомных взаимоотношений. Для выяснения особенностей, лежащих в основе этого явления, необходимо создание плазмид с клонированными структурными и регуляторнымп генами вирулентности холерного вибриона. В дальнейшем эти исследования могли бы стать фундаментальной основой, позволяющей на уровне тонкой регуляции добиваться экспрессии необходимых генов. Подобная технология могла бы стать весьма эффективной и доступной для решения производственных задач, при которых необходим высокий уровень продукции протективных антигенов. В-третьих, показана возможность использования принципиально нового подхода для создания штаммов холерного вибриона с высоким уровнем продукции одновременно трех важнейших белков - СТ, TCP и белка внешней мембраны OmpU, которые являются не только важными факторами вирулентности, но и входят в состав основных протективных антигенов.

Заключительный этап работы посвящен изучению практического использования сконструированных штаммов-продуцентов V. cholerae в производстве вакцинных и диагностических препаратов. Так как для селекции клонов, содержащих рекомбинантную плазмиду pCT105::mini-kan, требуется добавление антибиотиков в среду выращивания, что нежелательно при изготовлении вакцинных препаратов, то на первом этапе работы были получены бесплазмидные штаммы, сохранившие повышенный уровень продукции протективных антигенов. Элиминация плазмиды из штаммов V. cholerae 2414 (pCT105::mini-kan) и 2415 (pCT105::mini-kan) в 98 % случаев сопровождалась потерей гиперпродукции СТ и TCP. Вместе с тем среди изученных бесплазмидных клонов было обнаружено по два клона (или 2 %), которые сохранили повышенный уровень продукции TCP и СТ (фенотип KmsTcs Тох^ТСР44}. Более того, бесплазмидные Тох^ТСР"1-1" клоны не отличались от содержащих плазмиду штаммов по уровню биосинтеза белка OmpU, что указывает на сохранение эффективной экспрессии в них регуляторного гена toxR. Пока мы не располагаем сведениями, объясняющими повышенный уровень экспрессии глобального гена toxR, который сохранился после утраты плазмиды. Так как последующий проведенный молекулярно-генетический анализ показал отсутствие в бактериальном геноме бесплазмидных штаммов профага RS1 и дополнительных копий оперона ctxAB. Тем не менее, полученные бесплазмидные штаммы холерного вибриона классического биовара сероваров Инаба и Огава, отличающиеся от производственных штаммов повышенной продукцией шести протективных антигенов -СТ, TCP, 01-антиген, белок OmpU, ферменты протеаза и фосфолипаза, которые также участвуют в образовании защитных антител при холере, являются перспективными для применения их в производстве вакцинных препаратов.

На следующее этапе были отработаны условия глубинного культивирования содержащих плазмиду и бесплазмидных штаммов и установлено, что для получения максимального количества бактериальной массы и протективных антигенов выращивание штаммов-продуцентов необходимо проводить не более 12 ч в бульоне Хоттингера (рН 8,0) или казеиновом бульоне (рН 7,6) без добавления пептона и глюкозы. Далее, используя модифицированный метод D. Sun et al (1990), были выделены нетоксичные белковые препараты, содержащие белок TCP холерного вибрион. Модификации касались способа отделения TCP от поверхности клеток. Для этих целей использовали не шприц с толстой иглой, а обработку культуры в течение 2 мин на вортексе «Bio Vortex VI» (Россия) при орбитальном движеиии центрифужных пробирок (со скоростью 2300 об/мин). Для получения поликло-нальных антисывороток была отработана методика иммунизации животных (кролики) сначала бактериями штамма V. cholerae 2414 (pCT105::mini-kan) TcrKmr, а затем выделенным белковым препаратом. В результате проведенной работы получены специфические антисыворотки, содержащие в высоком титре анти тела к TCP, с помощью которых возможно изучение синтеза данного антигена природными и экспериментальными штаммами V. cholerae методами иммуноблоттинга и иммуно-электронной микроскопии. И, наконец, используя любезно предоставленные сотрудниками РосНИПЧИ «Микроб» очищенные антигены и поликлональные антисыворотки к ним, а также полученные в данном исследовании препараты и антисыворотки, была создана экспериментальная многокомпонентная иммуноферментная диагностическая тест-система. Для конструирования данной тест-системы были использованы четыре очищенных антигена белковой (TCP, СТ) и липополисаха-ридной природы (01 антиген Огава, 01 антиген Инаба) и четыре поликлональные антисыворотки к ним. В качестве метода анализа был выбран дот-иммуноанализ, отличающийся высокой чувствительностью и позволяющий проводить исследования значительного количества образцов. Сконструированная тест-система обладала высокой чувствительностью, сопоставимой с другими иммуноферментиыми тест-системами, разработанными па отдельные антигены холерного вибриона, а также специфичностью, поскольку выявляла антигены только в штаммах V. cholerae соответствующей серогруппы и серовара. Эффективность созданной тест-системы была доказана при анализе 19 природных произвольно выбранных штаммов V. cholerae с известной эпидемической значимостью. При этом установлено, что все клинические штаммы, содержащие структурные гены 01 антигена серовара Инаба или Огава, TCP и СТ, продуцировали контролируемые ими факторы вирулентности и иммуногенности. Так же было показано, что созданная тест-система может быть использована и при анализе атипичных штаммов V. cholerae, способных вызывать вспышки и спорадические случаи холеры.

Таким образом, полученные в данной работе новые сведения являются существенным вкладом в изучение природы адаптационной изменчивости холерного вибриона. Установление механизма и факторов, индуцирующих координированное переключение экспрессии генов вирулентности и персистенции в природных штаммах V. cholerae Ol серогруппы, а также изучение механизма изменения активности регуляторных генов V. cholerae в результате приобретения чужеродного генетического материала являются перспективными направлениями дальнейших фундаментальных исследований по проблеме холера. Сконструированные бес-плазмидные и содержащие плазмиду pCT105::mini-kan штаммы К cholerae классического биовара, продуцирующие в значительном количестве основные факторы вирулентности холерного вибриона (СТ, TCP, 01 антиген), являющиеся и важными протективными антигенами, предлагаются для использования в производстве более эффективных профилактических и диагностических препаратов. Созданная многокомпонентная иммуноферментная диагностическая тест-система может быть использована для определения экспрессии диагностически значимых (01 антиген) и генов вирулентности (СТ и TCP) в природных штаммах холерного вибриона, выделенных при мониторинговых исследованиях, для уточнения их эпидемической значимости.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Заднова, Светлана Петровна, Саратов

1. Адамов А.К., Наумшина М.С. Холерные вибрионы. Саратов: Издательство Саратовского университета, 1984. - 328 с.

2. Алексеева Л.П., Сальникова О.И., Мазрухо Б.Л., Маркина О.В., Чемисова О.С., Лобанов В.В. Моноклональные антитела к липополисахариду Vibrio cholerae 0139 // Биотехнология. 2002. - № 2. - С. 79-84.

3. Андрусенко И.Т., Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Подосинникова Л.С., Иванова С.М. Холерные вибрионы 01 и 0139 серогрупп: чувствительность к антибиотикам в период седьмой пандемии // Журн. микробиол., эпидемиол. и имму-нобиол. -2008. -№ 3. С. 107-114.

4. Бароян О.В. Холера Эль-Тор. 2-е изд. перераб. и доп. М.: Медицина, 1971. -256 с.

5. Беляков В.Д., Голубев Д.Б., Каминский Г.Д., Тец В.В. Саморегуляция паразитарных систем (молекулярно-генетические механизмы). Л.: Медицина, 1987. — 240 с.

6. Бугоркова Т.В., Шмеркевич Д.Л., Наумшина М.С. Характеристика штаммов холерных вибрионов биовара эльтор по протеолитической и лецитиназной активности // Биохимия, патофизиология и микробиология особо опасных инф., Саратов. 1983. - С. 76-82.

7. Бухарин О.В., Гинцбург A.JL, Романова Ю.М., Эль-Регистан Г.И. Механизмы выживания бактерий. М.: Медицина, 2005. - 367 с.

8. Ю.Вейде А.А., Марамович А.С., Ганин B.C., Сардар Е.А., Воронова Г.А., Феоктистова А.З., Налетова Л.Е., Даниленко А.Ф. Характеристика холерных вибрионов, выделенных в Астраханской области в 1970 г // Пробл. особо опасных инф.- 1975.-Вып. 2(45).-С. 81-85.

9. П.Вельков В.В. Нестабильность рекомбинантных молекул // Генетика. 1983. — Вып. 4.-С. 140-145.

10. Вертиев Ю.В., Шагинян И.А., Степанова М.В., Езепчук Ю.В. Определение ток-сигенности штаммов кишечной палочки и холерного вибриона радиоиммунологическим методом // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1985. - № 3. -С. 38-40.

11. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. Под ред. Березина И.В. Пер с англ. М.: Мир. - 1988. - 687 с.

12. Гинцбург А.Л., Янишевский Н.В., Мотин В.Л., Шагинян И.А., Вертиев Ю.В., Смирнов Г.Б. Организация и клонирование структурных генов энтеротоксина Vibrio cholerae eltor RV79 // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1984 -№9.-С. 12-18.

13. Голубев Б.П. Экологические аспекты распространения вибрионов эльтор в объектах окружающей среды: автореф. дис. канд. мед. наук / Голубев Борис Павлович. Саратов, 1993. - 20 с.

14. Гончарова Н.С., Карасева З.Н. Особенности бактериоциногении у холерного вибриона // Пробл. особо опасных инф. 1970. - Вып. 2(12). - С. 24-26.

15. Грижебовский Г.М. Холера на Кавказе (теоретические и прикладные вопросы эпидемиологии): автореф. дис. в форме науч. докл. . докт. мед. наук. / Гриже-бовский Георгий Михайлович. Ставрополь, 1997. — 78 с.

16. Дрожевкина М.С., Либинзон А.Е., Харитонова Т.И., Черкасова Л.Р., Киселева В.И., Гольдберг A.M. Применение комплексного метода для определения вирулентности вибрионов Эль-Тор // Пробл. особо опасных инф. 1978. - Вып.4(62). С. 39-42.

17. Ерошенко Г.А. Молекулярно-генетический анализ штаммов Vibrio cholerae 0139: дис. . док. биол. наук / Ерошенко Галина Александровна. Саратов, 2004. - 298 с.

18. Жуков-Вережников Н.Н., Мусабаев И.К., Завьялова Н.К. Клиника, лечение и профилактика холеры. Ташкент: Медицина УзССР, 1966. - 440 с.

19. Захарова И.Я., Косенко JI.B. Методы изучения микробных полисахаридов. Акад. наук Украинской ССР, ин-т микробиологии и вирусологии им. Д.М. За-болотного. Киев: Наукова Думка, 1982. - 192 с.

20. Захарова T.JI. Создание и свойства штаммов холерного вибриона с повышенной продукцией протективных антигенов: автореф. дис. . канд. биол. наук / Захарова Татьяна Львовна.- Саратов, 1997. 20 с.

21. Ильина Т.С. Механизмы горизонтального переноса генов: роль бактериофагов и интегронов в эволюции патогенных бактерий // Молекул, генетика, микро-биол. и вирусол. 2003. - № 4. - С. 3-10.

22. Ильина Т.С. Суперинтегроны бактерий источники новых генов с адаптивными функциями // Генетика. - 2006. - Т. 42, № 11. - С. 1536-1546.

23. Иммунологические методы. Под ред. Г. Фримеля. Перевод с нем. к.б.н. А.П. Тарасова. М.: Медицина, 1987. - 472 с.

24. Исаева Г.П., Кожухов И.Г., Асылбекова Н.Н. Об особенности морфологии колоний холерных вибрионов Эль Тор // Пробл. особо опасных инф. 1979. - № 3. - С. 66-67.

25. Коробкова Е.И. Микробиология и эпидемиология холеры. 2-е изд. доп. и пе-рераб. - М.: Медгиз, 1959. - 303 с.

26. Кутырев В.В., Филиппов А.А., Проценко О.А. Изучение плазмиды F' lac как вектора транспозонов для чумного микроба // Молекул, биол. и генетика возбудителей особо опасных инф., Саратов. 1982. - Ч. 1. — С. 40-42.

27. Кутырев В.В. Актуальные проблемы особо опасных инфекционных болезней и санитарная охрана территорий в современных условиях // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2008. - № 1. - С. 17—23.

28. Литвин В.Ю., Гинцбург AJL, Пушкарева В.И., Романова Ю.М., Баев Б.В. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. М.: Фармарус-Принт, 1998.256 с.

29. Литвин В.Ю., Марамович А.С., Гинцбург А.Л. Стратегия адаптивной изменчивости холерных вибрионов в природных водоемах // Вестник РАМН. 2001. -№ 11.-С. 20-24.

30. Ломов Ю.М. Эволюция возбудителя холеры и прогноз по этой инфекции на ближайшее будущее // Эпидемиол. и инфекц. болезни — 2004, № 1. С. 7-12.

31. Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Безсмертный В.Е., Федоров Ю.М., Гавринева

32. A.В., Иванова С.М., Панасенко А.Б., Голубев Б.П., Смоликова Л.М., Кругликов

33. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Перевод с анг. под редакцией А.А. Баева и К.Г. Скрябина. М.: Мир, 1984. - 480 с.

34. Марамович А.С., Вейде А.А., Урбанович Л.Я., Ганин B.C. Холерогенность вибрионов Эль Тор, выделенных в очаге холеры // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1975. - № 7. - С. 134-135.

35. Марамович А.С., Урбанович Л.Я., Миронова Л.В., Куликалова Е.С. Эволюция эпидемиологии холеры // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2006. - № 6. - С. 63-71.

36. Мецлер Д. Биохимия: в 3 т. Пер с анг. под ред. А.Е. Браунштейна, Л.М. Гипод-мана, Е.С. Северина и др.. -М.: Мир, 1980.

37. Милютин В.Н., Дрожевкина М.С., Ломов Ю.М., Уралева B.C., Либинзон А.Е., Подоеинникова Л.С. Механизмы и диапазон изменчивости холерных вибрионов. — Ростов-на-Дону: Ростовское книжное издательство, 1981. 176 с.

38. Монахова Е.В., Писанов Р.В. Токсины холерных вибрионов // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 2005. - № 1. - С. 7-18.

39. Монахова Е.В., Ломов Ю.М., Михась Н.К., Писанов Р.В. Структура и изменчивость неполного СТХ-элемента холерных вибрионов // Пробл. особо опасных инф. 2007. - № 1. - С. 58-61.

40. Москвитина Э.А. Современные тенденции в развитии седьмой пандемии холеры // Проблемы особо опасных инфекций. — 2008. Вып. 95. - С. 22-26.

41. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Федоров Ю.М., Подосинникова Л.С., Горобец А.В. Холера в начале XXI века, прогноз // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2005. - № 3. - С. 44-48.

42. Осин А.В., Нефедов К.С., Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И. Сравнительный анализ геномов холерных вибрионов эльтор, выделенных до начала и в разные периоды седьмой пандемии холеры // Генетика. 2005. - Т. 41, № 1. - С. 1-10.

43. Плохинский Н.А. Биометрия. 2-е изд. М.: Издательство Московского университета, 1970. - 367 с.

44. Погорелов В.И. Оценка экологических факторов, влияющих на циркуляцию вибрионов эльтор в поверхностных водоемах Сибири и Дальнего Востока: ав-тореф. дис. канд. мед. наук / Погорелов Владимир Иванович. Саратов, 1997. -18 с.

45. Подосинникова Л.С., Домарадский М.В., Либинзон А.Е., Лебедева С.А., Богданова М.И. Множественная устойчивость холерных вибрионов к антибиотикам // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1973. -№ 4. — С. 9-13.

46. Прозоров А.А. Рекомбинантные перестройки генома бактерий и адаптация к среде обитания // Микробиология. 2001. - Т. 70, № 5. - С. 581 - 594.

47. Регламент производства №47-87. Вакцина холерная (холероген-анатоксин + О-антиген). Саратов, 1987. - 207 с.

48. Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Участие мобильных элементов в формировании свойств патогенных бактерий // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. -1999.-№2.-С. 22-29.

49. Романова Ю.М., Ильина Т.С., Гинцбург А.Л. Мобильные генетические элементы и их роль в эволюции патогенных бактерий // Вестн. РАМН. 2001. - № 11. -С. 15-20.

50. Санитарно-эпидемиологические правила. СП 1.3.1285-03. «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)». — М., 2003. 81с.

51. Смирнов Г.Б. Генетический контроль систем поглощения железа у бактериальных клеток; механизмы процесса и его роль в патогенности // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1986. - № 7. - С. 3-14.

52. Смирнова Н.И., Ливанова Л.Ф., Давыдова Н.И., Гинцбург А.Л., Илюхин Т.С. Получение штаммов Vibrio с/го/егае-продуцентов холерного токсина и В-субъединицы холерного токсина // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммуноби-ол. 1993. - № 3. - С. 30-35.

53. Смирнова Н.И. Адгезины Vibrio cholerae: фенотипический анализ и генетический контроль синтеза // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1995. - № З.-С. 18-26.

54. Смирнова Н.И. Генетический контроль патогенности Vibrio cholerae: умеренный нитевидный фаг СТХ, кодирующий холерный токсин и остров патогенности // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1999. - № 4. - С. 1-15.

55. Смирнова Н.И. Возбудитель холеры новой 0139-серогруппы: молекулярно-генетические особенности и происхождение // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 2002. - № 3. - С. 23-33.

56. Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Эволюция возбудителя холеры // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 2004. - № 4. - С. 3-13.

57. Смирнова Н.И., Челдышова Н.Б., Горяев А.А., Лозовский Ю.В., Кутырев В.В. Эволюция генома Vibrio cholerae: пути формирования атипичных штаммов // Пробл. особо опасных инф. 2008. - № 3 (397). - С. 5-11.

58. Современная микробиология. Прокариоты: в 2 т. Под ред. Й. Ленгелер, Г. Древе, Г. Шлегель. Пер. с англ. И.А. Бер, И.В. Алферова и др.. М.: Мир, 2005. 1152 с.

59. Сомова А.Г., Лобанова Л.Н., Бадалова И.М. Изучение состава популяции вибрионов Эль Тор по агглютинабельности типоспецифическими сыворотками //

60. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1978. -№ 10. — С. 82-85.

61. Телесманич Н.Р. Механизмы гемолитической активности холерных вибрионов: дис. док. биол. наук / Телесманич Наталья Робертовна. Ростов-на-Дону, 2005.-256 с.

62. Тимофеев-Ресовский Н.В., Яблоков Н.В., Глотов Н.В. Очерк учения о популяции. -М.: Наука, 1973. -280 с.

63. Третьякова Л.В., Мухарская Л.М., Капитанова И.Н., Присяжнюк И.В., Лауген

64. Урюпина Н.В., Щуркина И.И., Петрова Л.С., Князева В.А. Исследование антигенного комплекса вибрионов Эль Тор водного происхождения // Пробл. особо опасных инф. 1971. - Вып. 4(20). - С. 121-127.

65. Фармакопейная статья на вакцину холерную (холероген-анатоксин+О-антиген) ФС42-3676-98. 1999. - 13 с.

66. Хайтович А.Б., Подосинникова Л.С., Ильичев Ю.А., Власов В.П., Кудрякова Т.А., Монахова Е.В., Михась Н.К. Оценка вирулентных свойств Vibrio cholerae с помощью методов in vitro II Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1997.-№3.-С. 7-10.

67. Челдышова Н.Б. Дифференциация штаммов Vibrio cholerae 01 с различной эпидемической значимостью на основании четырех генов вирулентности: ctxA, tcpA, toxR и hapA: дис. . канд. мед. наук. / Челдышова Надежда Борисовна. -Саратов, 2002. 173 с.

68. Чеховская Г.В., Смирнова Н.И. Создание и свойства штаммов Vibrio cholerae серовара 0139 с повышенной продукцией холерного токсина // Генетика. -1994.-Т. 30.-С. 177-178.

69. Шеклакова Л.А., Рубцов И.В., Белая Ю.А., Петрухин В.Г., Белый Ю.Ф. Получение рекомбинантной В-субъединицы холерного энтеротоксина и разработкаиммуносерологической тест-системы для его определения // Клин. лаб. диагностика. 2005. - № 9. - С. 40.

70. Янишевский Н.В. Опероны термолабильных энтеротоксинов Escherichia coli и Vibrio cholerae, их клонирование, структура и экспрессия в составе рекомби-натных плазмид: автореф. дис. . канд. биол. наук. / Янишевский Николай Витальевич. М., 1986. - 24 с.

71. Ali A., Mahmud Z.H., Morris J.G., Sozhamannan S., Johnson J.A. Sequence analysis of TnphoA insertion sites in Vibrio cholerae mutants defective in rugose polysaccharide production // Infect. Immun. 2000b. - Vol. 68, N 12. - P. 6857-6864.

72. Ali A., Rashid M.H., Karaolis D.K.R. High-frequency rugose exopolysaccharide production by Vibrio cholerae II Appl. Environ. Microbiol. 2002. - Vol. 68, N 1. - P. 5773-5778.

73. Ali A., Morris J.G., Johnson J.A. Sugars inhibit expression of the rugose phenotype of Vibrio cholerae II J. Clinical Microbiol. 2005. - Vol. 43, N 3. - P. 1426-1429.

74. Aim R.A., Mattick J.S. Genes involved in the biogenesis and function of type-4 fimbriae in Pseudomonas aeruginosa I I Gene. 1997. — Vol. 192, N 1. - P. 89-98.

75. Attridge S.R., Manning P.A., Holmgren J., Jonson G. Relative significance of man-nose-sensitive hemagglutinin and toxin-coregulated pili in colonization of infant mice by Vibrio cholerae El Tor // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64, N 8. - P. 3369-3373.

76. Barre F.X., Soballe В., Michel В., Aroyo M., Robertson M., Sherratt D. Circles: the replication-recombination-chromosome segregation connection // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - Vol. 98, N 15. - P. 8189-8198.

77. Barua D. History of cholera. In Cholera. Eds. D. Barua, W.B. Greenough. Plenum Medical Book Publishing Corporation. New York, London, 1992. P. 1-36.

78. Bassler B.L., Wright M., Silverman M.R. Multiple signalling systems controlling expression of luminescence in Vibrio harveyi: sequence and function of genes encoding a second sensory pathway // Mol. Microbiol. 1994. - Vol. 13, N 2. - P. 273-286.

79. Beck N.A., Krukonis E.S., DiRita V.J. TcpH influences virulence gene expression in Vibrio cholerae by inhibiting degradation of the transcription activator TcpP // J. Bacterid.-2004.-Vol. 186,N24.-P. 8309-8316.

80. Behari J., Stagon L., Calderwood S.B. pepA, a gene mediating pH regulation of virulence genes in Vibrio cholerae //J. Bacteriol. 2001. - Vol. 183, N 1. -P. 178-188.

81. Benitez J.A., Silva A.J., Finkelstein R.A. Environmental signals controlling production of hemagglutinin/protease in Vibrio cholerae II Infect. Immun. 2001. - Vol. 69, N 10. - P.6549-6553.

82. Berche P., Poyart C., Abachin E., Lelievre H., Vandepitte J., Dodin A., Fournier J.M. The novel epidemic strain 0139 is closely related to the pandemic strain 01 of Vibrio cholerae И J. Infect. Dis. 1994. - Vol. 170, N 3. - P. 701-704.

83. Beutin L., Bode L., Richter Т.Н., Peltre G., Stephan R. Rapid visual detection of E. coli and Vibrio cholerae heat-labile enterotoxins by nitrocellulose enzyme-linked immunosorbent assay // J. Clin. Microbiol. 1984. - Vol. 19, N 3. - P. 371-375.

84. Beyhan S., Tischler A.D., Camilli A., Yildiz F.H. Differences in gene expression between the classical and El Tor biotypes of Vibrio cholerae Ol // Infect. Immun. -2006. Vol. 74, N 6. - P. 3633 - 3642a.

85. Beyhan S., Tischler A.D., Camilli A., Yildiz F.H. Transcriptome and phenotypic responses of Vibrio cholerae to increased cyclic di-GMP level // J. Bacteriol. 2006. -Vol. 188,N 10.-P. 3600-3613b.

86. Beyhan S., Yildiz F.H. Smooth to rugose phase variation in Vibrio cholerae can be mediated by a single nucleotide change that targets c-di-GMP signaling pathway // Mol. Microbiol. 2007. - Vol. 63, N 4. - P. 995-1007.

87. Bhaskaran K., Rowley D. Nutritional studies on Vibrio cholerae // Gen. Microbiol. -1956.-Vol. 15,N2.-P. 417-422.

88. Bi E.F., Lutkenhaus J. FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli II Nature. 1991. - Vol. 354, N 6349. - P. 161-164.

89. Bik E.M., Bunschoten A.E., Gouw R.D., Mooi F.R. Genesis of the novel epidemic Vibrio cholerae 0139 strain: evidence for horizontal transfer of genes involved in polysaccharide synthesis // EMBO J. 1995. - Vol. 14, N 2. - P. 209-216.

90. Bina J.E., Mekalanos J.J. Vibrio cholerae tolC is required for bile resistance and colonization // Infect. Immun. 2001. - Vol. 69, N 7. - P. 4681-4685.

91. Bina J., Zhu J., Dziejman M., Faruque S., Calderwood S., Mekalanos J.J. ToxR regu-lon of Vibrio cholerae and its expression in vibrios shed by cholera patients // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - Vol. 100, N 5. - P. 2801-2806.

92. Blakely G.W., Davidson A.O., Sherratt D.J., Binding and cleavage of nicked substrates by site-specific recombinases XerC and XerD // J. Mol. Biol. — 1997. Vol. 265, N 1.-P. 30-39.

93. Bomchil N., Watnick P., Kolter R. Identification and characterization of a Vibrio cholerae gene, mbaA, involved in maintenance of biofilm architecture I I J. Bacteriol. -2003.-Vol. 185, N4.-P. 1384-1390.

94. Booth B.A., Boesman-Finkelstein M., Finkelstein R.A. Vibrio cholerae hemaggluti-nin/protease nicks cholera enterotoxin // Infect. Immun. 1984. - Vol. 45, N 3. - P. 558-560.

95. Bose N., Payne S.M., Taylor R.K. Type 4 pilus biogenesis and type II-mediated protein secretion by Vibrio cholerae occur independently of the TonB-facilitated protonmotive force // J. Bacteriol. 2002. - Vol. 184, N 8. - P. 2305-2309.

96. Bose N., Taylor R.K. Identification of a TcpC-TcpQ outer membrane complex involved in the biogenesis of the toxin-coregulated pilus of Vibrio cholerae II J. Bacteriol. 2005. - Vol. 187, N 7. - P. 2225-2232.

97. Botsford J.L., Harman J.G. Cyclic AMP in prokaryotes // Microbiol. Rev. 1992. -Vol. 56, N 1. - P. 100-122.

98. Bouffartigues E., Buckle M., Badaut C., Travers A., Rimsky S. H-NS cooperative binding to high-affinity sites in a regulatory element results in transcription silencing //Nat. Struct. Mol. Biol. -2007. Vol. 14, N 5. - P. 441-448.

99. Boyd E.F., Waldor M.K. Alternative mechanism of cholera toxin acquisition by Vibrio cholerae: generalized transduction of СТХф by bacteriophage CP-T1 // Infect. Immun. 1999. - Vol. 67, N 11. - P. 5898-5905.

100. Boyd E.F., Heilpern A.J., Waldor M.K. Molecular analyses of a putative СТХф precursor and evidence for independent acquisition of distinct СТХф by toxigenic Vibrio cholerae II J. Bacteriol. 2000. - Vol. 182, N 19. - P. 5530-5538.

101. Boyd E.F., Heilpern A. J., Waldor M.K. Evolutionary and functional analyses of variants of the toxin-coregulated pilus protein TcpA from toxigenic Vibrio cholerae non-01-non-0139 serogroup isolates // Microbiol. 2002. - Vol. 148, N 6. - P. 16551666.

102. Bradley D.E., Taylor D.E., Cohen D.R. Specification of surface mating system among conjugative drug resistance plasmids in Escherichia coli K12 // J. Bacteriol. — 1980.-Vol. 143, N3.-P. 1466-1470.

103. Bramucci M.G., Holmes R.K. Radial passive immune hemolysis assay for detection of heat-labile enterotoxin produced by individual colonies of Escherichia coli or Vibrio cholerae II J. Clin. Microbiol. 1978. - Vol. 8, N 2. - P. 252-255.

104. Brown R.C., Taylor R.K. Organization of the tcp, acf, and toxT genes within a ToxT-dependent operon // Mol. Microbiol. 1995. - Vol. 16, N 3. - P. 425-439.

105. Byun R., Elbourne L.D.H., Lan R., Reeves P.R. Evolutionary relationships of pathogenic clones of Vibrio cholerae by sequence analysis of four housekeeping genes // Infect. Immun. 1999. - Vol. 67, N 3. - P. 1116-1124.

106. Campbell A.M. Chromosomal insertion sites for phages and plasmids // J. Bacteriol. 1992. - Vol. 174, N 23. - P. 7495-7499.

107. Campos J., Fando R., Silva A., Rodriguez B.L., Benitez J.A. Replication function of the RSI element associated with Vibrio cholerae CTXcp prophage // FEMS Microbiol. Lett. 1998.-Vol. 164, N 1.-P. 141-147.

108. Carroll P.A., Tashima K.T., Rogers M.B., DiRita V.J., Calderwood S.B. Phase variation in tcpH modulates expression of the ToxR regulon in Vibrio cholerae II Mol. Microbiol. 1997.-Vol. 25, N6.-P. 1099-1111.

109. Casper-Lindley C., Yildiz F.H. VpsT is a transcriptional regulator required for expression of vps biosynthesis genes and the development of rugose colonial morphology in Vibrio cholerae 01 El Tor // J. Bacteriol. 2004. - Vol. 186, N 5. - P. 15741578.

110. Chakrabarti A.K., Chaudhuri K., Sen K., Das J. Porins of Vibrio cholerae: purification and characterization of OmpU // J. Bacteriol. 1996. - Vol. 17, N 2. - P.524-30.

111. Chatterjee S.N., Chaudhuri K. Lipopolysaccharides of Vibrio cholerae. I. Physical and chemical characterization // Biochim. Biophys. Acta. 2003. - Vol. 1639, N 2. -P. 65-79.

112. Chattopadhyaya R., Ghose A.C. Model of Vibrio cholerae toxin coregulated pilin capable of filament formation // Protein. Eng. 2002. - Vol. 15, N 4. - P. 297-304.

113. Chattopadhyay R., Banerjee K.K. Unfolding of Vibrio cholerae hemolysin inducesoligomerization of the toxin monomer // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278, N 40. - P. 38470-38475.

114. Chatzidaki-Livanis M., Jones M.K., Wright A.C. Genetic variation in the Vibrio vulnificus group 1 capsular polysaccharide operon // J. Bacteriol. 2006. - Vol. 188, N 5.-P. 1987-1998.

115. Chen X., Schauder S., Potier N., Dorsselaer A.V., Pelczer I., Bassler B.L., Hughson F.M. Structural identification of a bacterial quorum-sensing signal containing boron // Nature. 2002. - Vol. 415, N 6871. - P. 545-549.

116. Chiang S.L., Taylor R.K., Koomey M., Mekalanos J.J. Single amino acid substitutions in the N-terminus of Vibrio cholerae TcpA affect colonization, autoagglutina-tion, and serum resistance // Mol. Microbiol. 1995. - Vol. 17, N 6. - P. 1133-1142.

117. Chiang S.L., Mekalanos JJ. Use of signature-tagged transposon mutagenesis to identify Vibrio cholerae genes critical for colonization // Mol. Microbiol. 1998. - Vol. 27,N4.-P. 797-805.

118. Chiavelli D.A., Marsh J.W., Taylor R.K. The mannose-sensitive hemagglutinin of Vibrio cholerae promotes adherence to zooplankton // Appl. Environ. Microbiol. -2001. Vol. 67, N 7. - P. 3220-3225.

119. Christen M., Christen В., Folcher M., Schauerte A., Jenal U. Identification and characterization of a cyclic di-GMP-specific phosphodiesterase and its allosteric control by GTP // J. Biol. Chem. 2005. - Vol. 280, N 35. - P. 30829-30837.

120. Codeco C.T. Endemic and epidemics dynamics of cholera: the role of the aquatic reservoir//BMC Infec. Dis.-2001.-Vol. l.-P. 1471-2334.

121. Coelho A., Santos E.O., Faria M.L., Carvalho D.P., Soares M.R., Kruger W.M., Bisch P.M. A proteome reference map for Vibrio cholerae El Tor // Proteomics. -2004.-Vol. 4,N5.-P. 1491-1504.

122. Colwell R.R., W. M. Spira W.M. The ecology of Vibrio cholerae. In Cholera. Eds. D. Barua, W.B. Greenough. Plenum Medical Book Publishing Corporation. New York, London, 1992.-P. 107-127.

123. Colwell R.R. Global climate and infectious disease: the cholera paradigm // Science. 1996. - Vol. 274, N 5295. - P. 2025-2031.

124. Comstock L.E., Maneval D., Paningrahi P. The capsule and O-antigen in Vibrio cholerae 0139 Bengal are associated with a genetic region not present in Vibrio cholerae 01 // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63, N 1. - P. 317-323.

125. Craig J.P. A permeability factor (toxin) found in choler stools and culture filtrates and its neutralization by convalescent cholera sera // Nature. 1965. - Vol. 207, N 4997. -P. 614-616.

126. Crawford J.A., Kaper J.B., DiRita VJ. Analysis of ToxR-dependent transcription activation of ompU, the gene encoding a major envelope protein in Vibrio cholerae II Mol. Microbiol. 1998. - Vol. 29, N 1. - P. 235-246.

127. Crawford J.A., Krukonis E.S., DiRita V.J. Membrane localization of the ToxR winged-helix domain is required for TcpP-mediated virulence gene activation in Vibrio cholerae II Mol. Microbiol. 2003. - Vol. 47, N 5. - P. 1459-1473.

128. Crutchley M.J. Rugose forms of an El Tor vibrio // J. Gen. Microbiol. 1968. - Vol. 50, N3.-P. 7.

129. Dalsgaard A., Forslund A., Serichantalergs O., Sandvang D. Distribution and content of class 1 integrons in different Vibrio cholerae O-serotype strains isolated in Thai, land // Antimicrob. Agents Chemother. 2000. - Vol. 44, N 5. - P. 1315-1321.

130. Das В., Haider K., Pal P., Bhadra R.K. Small chromosomal integration site of classical CTX prophage in Mozambique Vibrio cholerae Ol biotype El Tor strain // Arch Microbiol. 2007. - Vol. 188, N 6. - P. 677-683.

131. Davis B.M., Kimsey H.H., Chang W., Waldor M.K. The Vibrio cholerae 0139 Calcutta bacteriophage СТХф is infectious and encodes a novel repressor // J. Bacteriol. -1999.-Vol. 181,N2.-P. 6779-6787.

132. Davis B.M., Lawson E.H., Sandkvist M., Ali A., Sozhamannan S., Waldor M.K. Convergence of the secretory pathways for cholera toxin and the filamentous phage, СТХф // Science. 2000a. - Vol. 288, N 5464. - P. 333-335.

133. Davis B.M., Moyer K.E., Boyd E.F., Waldor M.K. CTX prophages in classical biotype Vibrio cholerae: functional phage genes but dysfunctional phage genomes // J.

134. Bacteriol. 2000b. - Vol. 182, N 24. - P. 6992-6998.

135. Davis B.M., Waldor M.K. СТХф contains a hybrid genome derived from tandemly integrated elements // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97, N 15. - P. 8572-8577.

136. Davis B.M., Kimsey H.H., Kane A.V., Waldor M.K. A satellite phage-encoded an-tirepressor induces repressor aggregation and cholera toxin gene transfer // J. EMBO. 2002. - Vol. 21, N 16. - P. 4240—4249.

137. Davis B.M., Waldor M.K. Filamentous phages linked to virulence of Vibrio cholerae II Curr. Opinion in Microbiol. 2003. - Vol. 6, N 1. - P. 35-42.

138. De S.N., Chatterje D.N. An experimental study of the mechanism of action of Vibrio cholerae on the intestinal mucous membrane // J. Path. Bacteriol. 1953. - Vol. 66, N2.-P. 559-562.

139. De Silva R.S., Kovacikova G., Lin W., Taylor R.K., Skorupski K., Kull F.J. Crystal structure of the Vibrio cholerae quorum sensing regulatory protein // J. Bacteriol. -2007.-Vol. 189, N5.-P. 5683-5691.

140. Ding Y., Davis B.M., Waldor M.K. Hfq is essential for Vibrio cholerae virulence and downregulates cE expression // Mol. Microbiol. 2004. - Vol. 53, N 1. - P. 345-354.

141. DiRita V.J., Parsot C., Jander G., Mekalanos J.J. Regulatory cascade controls virulence in Vibrio cholerae // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - Vol. 8, N 12. - P. 5403-5407.

142. DiRita V.J., Mekalanos J.J. Periplasmic interaction between two membrane regulatory proteins, ToxR and ToxS, results in signal transduction and transcriptional activation // Cell. 1991. - Vol. 64, N 1. - P. 29-37.

143. Dorman C.J., Deighan P. Regulation of gene expression by histone-like proteins in bacteria // Curr. Opin. Genet. Dev. 2003. - Vol. 13, N 2. - P. 179-184.

144. Dorman C.J. H-NS, the genome sentinel // Nat. Rev. Microbiol. 2007. - Vol. 5, N 2.-P. 157-161.

145. Dziejman M., Mekalanos J.J. Analyses of membrane protein interaction: ToxR can dimerize the amino terminus of phage lambda repressor // Mol. Microbiol. 1994. -Vol. 1,N3.- P. 485-494.

146. Dziejman M., Kolmar H., Fritz H.J., Mekalanos J.J. ToxR co-operative interactions are not modulated by environmental conditions or periplasmic domain conformation //Mol. Microbiol. 1999. - Vol. 31, N 1. - P. 305-317.

147. Dutta N.K., Habbu M.K. Experimental cholera in infant rabbits: a method for chemo-therapeutic investigation // Brit. J. Pharmacol. 1955. - Vol. 256, N 23. - P. 1225212256.

148. Eko F.O., Mayr U.B., Attridge S.R., Lubitz W. Characterization and immunogenicity of Vibrio cholerae ghosts expressing toxin-coregulated pili // J. Biotechnol. 2000. -Vol. 83,N 1-2.-P. 115-123.

149. Enos-BerIage J.L., McCarter L.L. Relation of capsular polysaccharide production and colonial cell organization to colony morphology in Vibrio parahaemolyticus II J. Bacterid. 2000. - Vol. 182, N 19.-P. 5513-5520.

150. Epstein P.R., Ford Т.Е., Colwell R.R. Marine ecosystems // Lancet. 1993. - Vol. 342, N8881.-P. 1216-1219.

151. Espeland E.M., Lipp E.K., Hug A., Colwell R.R. Polylysogeny and prophage induction by secondary infection in Vibrio cholerae II Environ. Microbiol. 2004. - Vol.6,N7.-P. 760-763.

152. Evans L.R., Linker A. Production and characterization of the slime polysaccharide of Pseudomonas aeruginosa II J. Bacteriol. 1973. - Vol. 116, N 2. - P. 915-924.

153. Fando R., Perez J.L., Roodriguez B.L., Campos J., Robert A., Garcia L., Silva A., Benitez J.A. Promoter activities in Vibrio cholerae СТХф prophage // Infect. Immun. -1997.-Vol. 65, N4.-P. 1561-1565.

154. Faruque S.M., Albert M.J., Mekalanos J.J. Epidemiology, genetics and ecology of toxigenic Vibrio cholerae II Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998a. - Vol. 62, N 4. - P. 1301-1314.

155. Faruque S.M., Rahman M.M., Asadulghani, Islam K.M., Mekalanos J.J. Lysogenic conversion of enviromental Vibrio mimicus strains by СТХФ // Infect. Immun. -1999. Vol. 67, N 11. - P. 5723-5729.

156. Faruque S.M., Asadulghani, Rahman M.M., Waldor M.K., Sack D.A. Sunlight-induced propagation of the lysogenic phage encoding cholera toxin // Infect. Immun. 2000. - Vol. 68, N 8. - P. 4795-4801.

157. Faruque S.M., Nair G.B. Molecular ecology of toxigenic Vibrio cholerae II Microbiol. Immunol. 2002. - Vol. 46, N 2. - P. 59-66.

158. Faruque S.M., Mekalanos J J. Pathogenicity island and phages in Vibrio cholerae evolution//Trends Microdiol.-2003.-Vol. 11, N 11.-P.505-510.

159. Faruque S.M., Kamruzzaman M., Asadulghani, Sack D.A., Mekalanos J J., Nair G.B. CTXcp-independent production of the RS1 satellite phage by Vibrio cholerae II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003a. - Vol. 10, N 3. - P. 1280-1285.

160. Faruque S.M., Sack D.A., Sack R.B., Colwell R.R., Takeda Y., Nair G.B. Emergence and evolution of Vibrio cholerae 0139 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003b. - Vol. 110, N 3. -P. 1304-1309.

161. Faruque S.M., Nair G.B., Mekalanos J J. Genetics of stress adaptation and virulence in toxigenic Vibrio cholerae II DNA Cell. Biol. 2004. - Vol. 23, N 11. - P. 723741.

162. Faruque S.M., Nair G.B. Vibrio cholerae genomics and molecular biology. Caister Academic Press, Norfolk, UK. - 2008. - 218 p.

163. Fasano A., Baudry В., Pumplin D.W., Wasserman S.S., Tall B.D., Ketley J.N., Kaper J.B. Vibrio cholerae produces a second enterotoxin which affects intestinal tight junctions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - Vol. 88, N 12. - P. 5242-5246.

164. Feeley J.C. Classification of Vibrio cholerae (Vibrio comma), including El Tor vibrios, by infrasubspecific characteristics // J. Bacteriol. 1965. - Vol. 89. - P. 665678.

165. Fields P.I., Popovic Т., Wachsmuth K., Olsvik O. Use of polymerase chain reaction for detection of toxigenic Vibrio cholerae 01 strains from the Latin American cholera epidemic // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30, N 8. - P. 2118-2121.

166. Finkelstein R.A., Muckerjee S. Hemagglutination: a rapid method for differentiating Vibrio cholerae and El Tor vibrios // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1963. - Vol. 112. -P. 335-339.

167. FinkelsteinR.A. Cholera// Crit. Rev. Microbiol. 1973. - Vol. 3. - P. 552-623.

168. Finkelstein R.A., Boesman-Finkelstein M., Holt P. Vibrio cholerae hemaggluti-nin/lectin/protease hydrolyzes fibronectin and ovomucin: F.M. Burnet revisited // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. - Vol. 80, N 4. - P. 1092-1095.

169. Finkelstein R.A., Boesman-Finkelstein M., Chang Y., Hase C.C. Vibrio cholerae he-magglutinin/protease, colonial variation, virulence and detachment // Infect. Immun. 1992. - Vol. 60, N 2. - P. 472-478.

170. Finkelstein R.A., Boesman-Finkelstein M., Sengupta D.K., Page W.J., Stranley C.M., Phillips Т.Е. Colonial opacity variations among the choleragenic vibrios // Microbiology. 1997. - Vol. 143 (Pt 1). - P. 23-34.

171. Fong J.C.N., Yildiz F.H. The rbmBCDEF gene cluster modulates development of rugose colony morphology and biofilm formation in Vibrio cholerae II J. Bacteriol. —2007.-Vol. 189, N6.-P. 2319-2330.

172. Freeman J.A., Bassler B.I. A genetic analysis of the function of LuxO, a two-component response regulator involved in quorum sensing in Vibrio harveyi II Mol. Microbiol. 1999. - Vol. 31, N 2. - P. 665-677.

173. Frens G. Controlled nucleation for the particle size in monodisperse gold suspensions //Nature Phys. Sci. 1973. - Vol. 241. - P. 20-22.

174. Fullner K.J., Mekalanos J.J. Genetic characterization of a new type IV-a pilus gene cluster found in both classical and El Tor biotypes of Vibrio cholerae II Infect. Immun. 1999. - Vol. 67, N 3. - P. 1393-1404.

175. Fuqua C., Parsek M.R., Greenberg E.P. Regulation of gene expression by cell-to-cell communication: acyl-homoserine lactone quorum sensing // Annu. Rev. Microbiol. -2001.-Vol. 35.-P. 439-468.

176. Galen J.E., Ketley J.M., Fasano A., Richardson S.H., Wasserman S.S., Kaper J.B. Role of Vibrio cholerae neuraminidase in the function of cholera toxin I I Infect. Immun. 1992.-Vol. 60, N2.-P. 406-415.

177. Galperin M.Y., Nikolskaya A.N., Koonin E.V. Novel domains of the prokaryotic two-component signal transduction systems // FEMS Microbiol. Lett. 2001. - Vol. 203, N1.-P. 11-21.

178. Galperin M.Y. Bacterial signal transduction network in a genomic perspective // Environ. Microbiol. 2004. - Vol. 6. - P. 552-567.

179. Gardel C.L., Mekalanos J.J. Alterations in Vibrio cholerae motility phenotypes correlate with changes in virulence factor expression // Infect. Immun. 1996. -Vol. 64, N 6.-P. 2246-2255.

180. Ghosh A., Paul K., Chowdhury R. Role of the histone-like nucleoid structuring protein in colonization, motility, and bile-dependent repression of virulence gene expression in Vibrio cholerae II Infect. Immun. 2006. - Vol. 74, N 5. - P. 3060-3064.

181. Gill D.M., Meren R. ADP-ribosylation of membrane proteins catalyzed by cholera toxin: basis of the activation of adenylate cyclase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1978. Vol. 75, N 7. - P. 3050-3054.

182. Gupta S., Chowdhury R. Bile affects production of virulence factors and motility Vibrio cholerae II Infect. Immun. 1997. - Vol. 65, N 3. - P. 1131-1134.

183. Guvener Z.T., McCarter L.L. Multiple regulators control capsular polysaccharide production in Vibrio parahaemolyticus II J. Bacteriol. 2003. - Vol. 185, N 18. -P. 5431-5441.

184. Hacker J., Blum-Oehler G., Muhldorfer I., Tschape H. Pathogenicity islands of virulent bacteria: structure, function and impact on microbial evolution // Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 23, N 6. - P. 1089-1097.

185. Hacker J., Kaper J.B. Pathogenicity islands and the evolution of microbes // Annu. Rev. Microbiol. 2000. - Vol. 54. - P. 641-679.

186. Hammer B.K., Bassler B.L. Quorum sensing controls biofilm formation in Vibrio cholerae II Mol. Microbiol. 2003. - Vol. 50, N 1. - P. 101-104.

187. Hammer B.K., Bassler B.L. Distinct sensory pathways in Vibrio cholerae El Tor and classical biotypes modulate cyclic dimeric GMP levels to control biofilm formation // J. Bacteriol.-2009.-Vol. 191, N l.-P. 169-177.

188. Hanne L.P., Finkelstein R.A. Characterization and distribution of the hemagglutinins produced by Vibrio cholerae II Infect. Immun. 1982. - Vol. 36, N 1. - P. 209-214.

189. Haralalka S., Nandi S., Bhadra R.K. Mutation in the relA gene of Vibrio cholerae affects in vitro and in vivo expression of virulence factors // J. Bacteriol. 2003. - Vol. 185, N 16.-P. 4672-4682.

190. Harkey C.W., Everiss K.D., Peterson K.M. Vibrio cholerae toxin-coregulated-pilus gene tcpl encodes a homolog of methyl-accepting chemotaxis proteins // Infect. Immun. 1994. - Vol. 62, N 7. - P. 2669-2678.

191. Hase C.C., Finkelstein R.A. Cloning and nucleotide sequence of the Vibrio cholerae hemagglutinin/protease (HA/protease) gene and construction of an HA/protease-negative strain // J. Bacteriol. 1991. - Vol. 173, N 11. - P. 3311-3317.

192. Hase C.C., Mekalanos J.J. TcpP protein is a positive regulator of virulence gene expression in Vibrio cholerae II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95, N 2. -P. 730-734.

193. Hase C.C., Mekalanos J.J. Effects of changes in membrane sodium flux on virulence gene expression in Vibrio cholerae II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96, N6.-P. 3183-3187.

194. Hase C.C., Barquera B. Role of sodium bioenergetics in Vibrio cholerae I I Biochim. Biophys. Acta.-2001.-Vol. 1505, N1.-P. 169-178.

195. Haugo A.J., Watnick P.I. Vibrio cholerae CytR is a repressor of biofilm development //Mol. Microbiol. 2002. - Vol. 45, N 2. - P. 471-483.

196. Hava D.L., Camilli A. Isolation and characterization of a temperature-sensitive generalized transducting bacteriophages for Vibrio cholerae II J. Microbiol. Methods. -2001. Vol. 46, N 3. - P. 217-225.

197. Havlis J., Thomas H., Sebela M., Shevchenko A. Fast-response proteomics by accelerated in-gel digestion of proteins // Anal. Chem. 2003. - Vol. 75, N 6. - P. 13001306.

198. Heilpern A.J., Waldor M.K. СТХф infection of Vibrio cholerae requires the tolQRA gene products //J. Bacteriol. 2000. - Vol. 182, N 6. - P. 1739 - 1747.

199. Heilpern A.J., Waldor M.K. pIIICTX, a predicted СТХф minor coat protein, can expand the host range of coliphage fd to include Vibrio cholerae II J. Bacteriol. 2003. -Vol. 185, N3.-P. 1037-1044.

200. Heithoff D.M., Mahan M.M. Vibrio cholerae biofilms: stuck between a rock and a hard place // J. Bacteriol. 2004. - Vol. 186, N 15. - P. 4835-4837.

201. Hengge-Aronis R. Recent insights into the general stress response regulatory network in Escherichia coli II J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2002. - Vol. 4, N 3. - P. 341346.

202. Herrington D.A., Hall R.H., Losonsky G.A., Mekalanos J.J., Taylor R.K., Levine M.M. Toxin, toxin-coregulated pili, and the toxR regulon are essential for Vibrio cholerae pathogenesis in humans // J. Exp. Med. 1988. - Vol. 168, N 4. - P. 14871492.

203. Higgins D.E., DiRita V.J. Transcriptional control of toxT, a regulatory gene in the ToxR regulon of Vibrio cholerae II Mol. Microbiol. 1994. - Vol. 14, N 1. - P. 1729.

204. Higgins D.E., DiRita V.J. Genetic analysis of the interaction between Vibrio cholerae transcription activator ToxR and toxT promoter DNA // J. Bacteriol. 1996. -Vol.178, N4.-P. 1080-1087.

205. Hilton Т., Rosche Т., Froelich В., Smith В., Olive J. Capsular polysaccharide phase variation in Vibrio vulnificus II Appl. Environ. Microbiol. 2006. - Vol. 72, N 11.— P.6986-6993.

206. Hitchcock P.J., Brown T.M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels // J. Bacteriol. -1983.-Vol. 154, N 1. P. 269-277.

207. Hommais F., Laurent-Winter C., Labas V., Krin E., Tendeng C., Soutourina O., Dan-chin A., Bertin P. Effect of mild acid pH on the functioning of bacterial membranes in Vibrio cholerae II Proteomics. 2002. - Vol. 2, N 5. - P. 571-579.

208. Hoyer L.L., Hamilton А.С., Steenbergen S.M., Vimr E.R. Cloning, sequencing and distribution of the Salmonella typhimurium LT2 sialidase gene, nanH, provides evidence for interspecies gene transfer 11 Mol. Microbiol. 1992. - Vol. 6, N 7. - P. 873-884.

209. Huber K.E., Waldor M.K. Filamentous phage integration requires the host recombi-nases XerC and XerD // Nature. 2002. - Vol. 417, N 6889. - P. 656-659.

210. Hug D.T., Mekalanos J.J. Bile acids induce cholera toxin expression in Vibrio cholerae in a ToxT-independent manner // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - Vol. 102, N8.-P. 3028-3033.

211. Iredell J.R., Manning P.A. The toxin-co-regulated pilus of Vibrio cholerae 01: a model for type IV pilus biogenesis? // Trends Microbiol. 1994. - Vol. 2, N 6. - P. 187-192.

212. Iredell J.R., Manning P.A. Translocation failure of a type 4 pilin: rjb and tcpT mutants in Vibrio cholerae II Gene. 1997. - Vol. 192, N 1. - P. 71-77.

213. Islam M.S., Drasar B.S., Bradley D.J. Attachment of toxigenic Vibrio cholerae 01 to various freshwater plants and survival with filamentous green algae Rhizoclonium fontanum II J. Trop. Med. Hyg. 1989. - Vol. 92, N 6. - P. 396-401.

214. Islam M.S., Drasar B.S., Bradley D.J. Long-term persistence of toxigenic V. cholerae 01 in the mucilaginous sheath of a blue-green algae, Anabaena variabilis II J. Trop. Med. Hyg. 1990. - Vol. 93, N 2. - P. 133-139.

215. Jacobson G.R., Rosenbusch J.P. Abundance and membrane association of elongation factor Tu in E. coli II Nature 1976. - Vol. 261, N 5555. - P. 23-26.

216. Janssori P.E., Kenne L., Lindberg B. Structure of extracellular polysaccharide from

217. Xanthomonas campestris II Carbohydr. Res. 1975. - Vol. 45. - P. 275-282.i

218. Jermyn W.S., Boyd E.F. Characterization of novel Vibrio pathogenicity island (VPI-2) encoding neuraminidase (nanH) among toxigenic Vibrio cholerae isolates // Microbiology. -2002. Vol. 148 (Pt 11). - P. 3681-3693.

219. Jobling M.G., Holmes R.K. Characterization of hapR, a positive regulator of Vibrio cholerae HA/protease gene hap, and its identification as a functional homologue of the Vibrio harveyi luxR gene // Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 26, N 5. - P. 10231034.

220. Joelsson A., Kan В., Zhu J. Quorum sensing enhances the stress response in Vibrio cholerae И Appl. Environ. Microbiol. 2007. - Vol. 73, N 11. - P. 3742-3746.

221. Johnson J.A., Panigrahi P., Morris J.G. Non-Ol Vibrio cholerae NRT36S produces a polysaccharide capsule that determines colony morphology, serum resistance, and virulence in mice // Infect. Immun. 1992. - Vol. 60, N 3. - P. 864-869.

222. Johnson J.A., Salles C.A., Panigrahi P., Albert M.J. Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal is closely related to Vibrio cholerae Eltor but has important differences // Infect. Immun. 1994. - Vol. 62, N 5. - P. 2108-2110.

223. Kabir S. Cholera vaccines: the current status and problems // J. Med. Microbiol. -2005.-Vol. 16.-P. 101-116.

224. Kado C.I., Liu S.T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids // J. Bacteriol. 1981.-Vol. 145, N3.-P. 1365-1373.

225. Kann В., Habibi H., Schmid M., Liang W., Wang R., Wang D., Jungblut P.R. Pro-teome comparison of Vibrio cholerae cultured in aerobic and anaerobic conditions // Proteomics. 2004. - Vol. 4. - P. 3061-3067.

226. Kaper J.B., Morris J., Levin M. Cholera // Clin. Microbiol. Rev. 1995. - Vol. 8, N1. -P. 48-89.

227. Kaper J.B., Sperandio V. Bacterial cell-to-cell signaling in the gastrointestinal tract //1.fect. Immun. 2005. - Vol. 73, N 6. - P. 3197-3209.

228. Karaolis D.K., Lan R., Reeves P.R. Molecular evolution of the seventh-pandemic clone of Vibrio cholerae and its relationship to other pandemic and epidemic V. cholerae isolates // J. Bacteriol. 1994. - Vol. 176, N 20. - P. 6199-6206.

229. Karaolis D.K.R., Johnson J.A., Bailey C.C., Boedeker E.C., Kaper J.B., Reeves P.R. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95, N 6. - P. 3134-3139.

230. Karaolis D.K.R., Somara S., Maneval D.R.J., Johnson J.A., Kaper J.B. A bacteriophage encoding a pathogenicity island, a type-IV pilus and a phage receptor in cholera bacteria // Nature. 1999. - Vol. 399, N 6734. - P. 375-379.

231. Karaolis D.K.R., Lan R., Kaper J.B., Reeves P.R. Comparison of Vibrio cholerae pathogenicity islands in sixth seventh pandemic strains // Infect. Immun. 2001. -Vol. 69, N3.-P. 1947-1952.

232. Kaufman M.R., Seyer J.M., Taylor R.K. Processing of TCP pilin by TcpJ typifies a common step intrinsic to a newly recognized pathway of extracellular protein secretion by gram-negative bacteria // Genes Dev. 1991. - Vol. 5, N 10. - P. 1834-1846.

233. Kaufman M.R., Shaw C.E., Jones I.D., Taylor R.K. Biogenesis and regulation of the Vibrio cholerae toxin-coregulated pilus: analogies to other virulence factor secretory systems // Gene. 1993. - Vol. 126, N 1. - P. 43-49.

234. Keymer D.P., Miller M.C., Schoolnik G.K., Boehm A.B. Genomic and phenotypic diversity of coastal Vibrio cholerae strain is linked to environmental factors // Appl. Environ. Microbiol. 2007. - Vol. 73, N 11. - P. 3705-3714.

235. Kirn T.J., Lafferty M.J., Sandoe C.M., Taylor R.K. Delineation of pilin domains required for bacterial association into microcolonies and intestinal colonization by Vibrio cholerae II Mol. Microbiol. 2000. - Vol. 35, N 4. - P. 896-910.

236. Kimsey H.H., Waldor M.K. Vibrio cholerae hemagglutinin/protease inactivates СТХф // Infect. Immun. 1998a. - Vol. 66, N 9. - P. 4025-4029.

237. Kimsey H.H., Waldor M.K. СТХф immunity: application in the development of cholera vaccines // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998b. - Vol. 95, N 12. - P. 70357039.

238. Kimsey H.H., Nair G.B., Ghosh A., Waldor M.K. Diverse СТХф and evolution ofnew pathogenic Vibrio cholerae II Lancet. 1998c. - Vol. 352, N 9126. - P. 457458.

239. Kimsey H.H., Waldor M.K. The СТХф repressor RstR binds DNA cooperatively to form tetrameric repressor-operator complexes // J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279, N 4.-P. 2640-2647.

240. Kirn T.J., Bose N., Taylor R.K. Secretion of a soluble colonization factor by the TCP type 4 pilus biogenesis pathway in Vibrio cholerae II Mol. Microbiol. 2003. - Vol. 49, N 1. — P. 81-92.

241. Kirn T.J., Taylor R.K. TcpF is a soluble colonization factor and protective antigen secreted by El Tor and classical 01 and 0139 Vibrio cholerae serogroups // Infect. Immun. 2005. - Vol. 73, N 8. - P. 4461-4470.

242. Kirn T.J., Jude B.A., Taylor R.K. A colonization factor links Vibrio cholerae environmental survival and human infection // Nature. 2005. - Vol. 438, N 8. - P. 863866.

243. Klose K.E., Mekalanos J.J. Distinct roles of an alternative sigma factor during both free-swimming and colonizing phases of the Vibrio cholerae pathogenic cycle // Mol. Microbiol. -1998. Vol. 28, N 3. - P. 501-52.

244. Klose K.E., Novik V., Mekalanos JJ. Identification of multiple sigma54-dependent transcriptional activators in Vibrio cholerae II J. Bacteriol. 1998. - Vol. 180, N 19. -P. 5256-5259.

245. Kovach M.E., Shaffer D., Peterson K.M. A putative integrase gene defines the distal end of a large cluster of ToxR-regulated colonization genes in Vibrio cholerae II Microbiology. 1996. - Vol. 142 (Pt 8). - P. 2165-2174.

246. Kovacikova G.A., Skorupski K. Vibrio cholerae LysR homolog, AphA, cooperates with AphA at the tcpPH promoter to activate expression of the ToxR virulence cascade//J. Bacteriol. 1999. - Vol. 181, N 14. - P. 4250-4256.

247. Kovacikova G., Skorupski K. Differential activation of the tcpPH promoter by AphB determines biotype specificity of virulence gene expression in Vibrio cholerae II J. Bacteriol. — 2000. Vol. 182, N 11.-P. 3228-3238.

248. Kovacikova G., Skorupski K. Overlapping binding sites for the virulence gene regulators AphA, AphB, and cAMP-CRP at the Vibrio cholerae tcpPH promoter // Mol.

249. Microbiol. 2001. - Vol. 41, N 2. - P. 393-407.

250. Kovacikova G., Skorupski K. Regulation of virulence gene expression in Vibrio cholerae by quorum sensing: HapR functions at the aphA promoter // Mol. Microbiol. -2002a.-Vol. 46, N4.-P. 1135-1147.

251. Kovacikova G., Skorupski K. Alternative sigma factor sigma (E) plays an important role in intestinal survival and virulence in Vibrio cholerae II Infect. Immun. 2002b. - Vol. 70, N 10. - P. 5355-5362.

252. Krukonis E.S., Yu R.R., DiRita J.J. The Vibrio cholerae ToxR/TcpP/ToxT virulence cascade: distinct roles for two membrane-localized transcriptional activators on a single promoter // Mol. Microbiol. 2000. - Vol. 38, N 1. - P. 67-84.

253. Krukonis E.S., DiRita J.J. From motility to virulence: sensing and responding to environmental signals in Vibrio cholerae II Curr. Opin. Microbiol. 2003. - Vol. 6, N 2. -P. 186-190.

254. Kumar S., Ray P., Singh H., Ganguly N.K. Immunogenicity and protective role of an IgA reactive 31-kDa antigen of Vibrio cholerae 0139 // J. Med. Microbiol. 2001. -Vol. 50, N 6. - P. 489-498.

255. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T // Nature. 1970. - Vol. 227, N 5259. - P. 680-685.

256. Lankford C.E. Factors of virulence of Vibrio cholerae И Ann. N. Y. Acad. Sci.1960.-Vol. 88.-P. 1203-1212.

257. LaRocque R.C., Krastins В., Harris J.B., Lebrun L.M., Parker K.C., Chase M., Ryan E.T., Qadri F., Sarracino D., Calderwood S.B. Proteomic analysis of Vibrio cholerae in human stool // Infect. Immun. 2009. - Vol. 76, N 9. - P. 4145-4151.

258. Lauriano C.M., Ghosh C., Correa N.E., Klose K.E. The sodium-driven flagellar motor controls exopolysaccharide expression in Vibrio cholerae II J. Bacteriol. 2004. -Vol. 186, N 15. - P. 4864-4874.

259. Lazar S., Waldor M.K. ToxR-independent expression of cholera toxin from the repli-cative form of СТХф // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66, N 1. - P. 394-397.

260. Lee S.H., Hava D.L., Waldor M.K., Camilli A. Regulation and temporal expression patterns of Vibrio cholerae virulence genes during infection // Cell. 1999. - Vol. 99,N6.-P. 625-634.

261. Lee S.H., Butler S.M., Camilli A. Selection for in vivo regulators of bacterial virulence // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - Vol. 98, N 12. - P. 6889-6894.

262. Lenz D.H., Мок K.C., Lilley B.N., Kulkarni V.R., Bassler B.L. The small RNA chaperone Hfq and multiple small RNAs control quorum sensing in Vibrio harveyi and Vibrio cholerae II Cell. 2004. - Vol. 118, N 1. - P. 69-82

263. Lenz D.H., Miller M.B., Zhu J., Kulkarni V.R., Bassler B.L. CsrA and three redundant small RNAs regulate quorum sensing in Vibrio cholerae II Mol. Microbiol. -2005. Vol. 58, N 4. - P. 1186-1202.

264. Lenz D.H., Bassler B.L. The small nucleoid protein Fis is involved in Vibrio cholerae quorum sensing // Mol. Microbiol. 2007. - Vol. 63, N 3. - P. 859-871.

265. Li C.C., Merrell D.S., Camilli A., Kaper J.B. ToxR interferes with CRP-dependent transcriptional activation of ompT in Vibrio cholerae II Mol. Microbiol. 2002. -Vol. 43, N6.-P. 1577-1589.

266. Liang W., Pascual-Montano A., Silva A.J., Benitez J.A. The cyclic AMP receptorprotein modulates quorum sensing motility, and multiple genes that affect intestinal colonization in Vibrio cholerae H Microbiology. 2007a. - Vol. 153 (Pt 9). — P.2964-2975.

267. Liang W., Silva A.J., Benitez J.A. The cyclic AMP receptor protein modulates colonial morphology in Vibrio cholerae II Appl. Environ. Microbiol. 2007b. - Vol. 73, N22.-P. 7482-7487.

268. Lilley B.N., Bassler B.L. Regulation of quorum sensing in Vibrio harveyi by LuxO and sigma-54 // Mol. Microbiol. 2000. - Vol. 36, N 4. - P. 940-954.

269. Lim В., Beyhan S., Meir J., Yildiz F.H. Cyclic-diGMP signal transduction systems in Vibrio cholerae: modulation of rugosity and biofilm formation I I Mol. Microbiol. — 2006. Vol. 60, N 2. - P. 331-348.

270. Lim В., Beyhan S., Yildiz F.H. Regulation of Vibrio polysaccharide synthesis and virulence factor production by CdgC, a GGDEF-EAL domain protein, in Vibrio cholerae I I J. Bacteriol. 2007. - Vol. 189, N 3. - P. 717-729.

271. Linkous D.A., Oliver J.D. Pathogenesis of Vibrio vulnificus I I FEMS Microbiol. Lett.- 1999. Vol. 174, N 2. - P. 207-214.

272. Lipp E.K., Huq A., Colwell R.R. Effects of global climate on infectious disease: the cholera model // Clin. Microbiol. Rev. 2002. - Vol. 15, N 4. - P. 757-770.

273. Little J.W. LexA cleavage and other self-processing reactions // J. Bacteriol. 1993.- Vol. 175, N 16. P. 4943-4950.

274. Liu G.W., Yan M.Y., Qi G.M., Liu Y., Gao S., Kan B. Study on infection of different strains of Vibrio cholerae 01 by El Tor CTXq> // Wei Sheng Wu Xue Bao. 2005. -Vol. 45, N5.-P. 757-762.

275. Liu Z., Hsiao A., Joelsson A., Zhu J. Transcriptional regulator VqmA increases expression of the quorum-sensing activator HapR in Vibrio cholerae И J. Bacteriol. -2006. Vol. 188, N 7. - P. 2446-2453.

276. Litwin C.M., Calderwood S.B. Role of iron in regulation of virulence genes // Clin.

277. Microbiol. Rev. 1993. - Vol. 6, N 2. - P.137-149.

278. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folinphenol reagent//J. Biol. Chem. 1951. - Vol. 193, N 1. -P. 265-275.

279. Manning P.A. The tcp gene cluster of Vibrio cholerae II Gene. 1997. - Vol. 192, N l.-P. 63-70.

280. Mathur J., Davis B.M., Waldor M.K. Antimicrobial peptides activate the Vibrio cholerae a54 regulon through an OmpU-dependent signaling pathway I I Mol. Microbiol. — 2007. Vol. 63, N 3. - P. 848-858.

281. Marsh J.W., Taylor R.K. Genetic and transcriptional analyses of the Vibrio cholerae mannose-sensitive hemagglutinin type 4 pilus gene locus // J. Bacteriol. 1999. -Vol.181, N4.-P. 1110-1117.

282. Matson J.S., DiRita V.J. Degradation of the membrane localized virulence activator TcpP by the Yael protease in Vibrio cholerae II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. -Vol. 102, N45.-P. 16403-16408.

283. Matson J.S., Withey J.H., DiRita V.J. Regulatory networks controlling Vibrio cholerae virulence gene expression I I Infect. Immun. 2007. - Vol. 75, N 12. - P. 55425549.

284. Matz C., McDougald D., Moreno A.M., Yung P.Y., Yildiz F.H., Kjelleberg S. Biofilm formation and phenotypic variation enhance predation-driven persistence of Vibrio cholerae II Proc Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - Vol. 102, N 46. - P. 1681916824.

285. Mazel D., Dychinco В., Webb V.A., Davies J.A. A distinctive class of integrons in the Vibrio cholerae genome // Science. 1998. - Vol. 280, N 5363. - P. 605-608.

286. McCarter L.L. OpaR, a homolog of Vibrio harveyi LuxR, controls opacity of Vibrio parahemolyticus II J. Bacteriol. 1998.-Vol.180, N 12.-P. 3166-3173.

287. McCarter L.L. The multiple identities of Vibrio parahaemolyticus II J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 1999. - Vol. 1, N 1. - P. 51-57.

288. McCarter L.L. Polar flagellar motility of the Vibrionaceae II Microbiol. Mol. Biology Rev. 2001. - Vol. 65, N 3 - P. 445-462.

289. McDougald D., Matz C., Yildiz F., Kjelleberg S. Adaptive responses of Vibrios // The conference «Vibrio», November 6-8, 2005, Ghent, Belgium. Abstract book. Eds. D. Gevers, P. Dawyndt. Belgium, 2005. - P. 29-30.

290. McLeod S.M., Waldor M.K. Characterization of XerC- and XerD-dependent CTX phage integration in Vibrio cholerae II Mol. Microbiol. 2004. - Vol. 54, N 4. - P. 935-947.

291. McLeod S.M., Kimsey H.H., Davis B.M., Waldor M.K. СТХф and Vibrio cholerae: exploring a newly recognized type of phage-host cell relationship I I Mol. Microbiol. -2005. Vol. 57, N 2. - P. 347-356.

292. Meibom K.L., Blokesch M., Dolganov N.A., Wu C.Y., Schoolnik G.K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae II Science. 2005. - Vol. 310, N 5755. -P. 1824-1827.

293. Mekalanos J.J. Duplication and amplification of toxin genes in Vibrio cholerae И Cell. 1983. - Vol. 35, N 1. - P. 253-263.

294. Meno Y., Waldor M.K., Mekalanos J.J., Amako K. Morphological and physical characterization of the capsular layer of Vibrio cholerae 0139 // Arch. Microbiol. 1998. -Vol. 170, N5.-P. 339-344.

295. Merrell D.S., Camilli A. Regulation of Vibrio cholerae genes required for acid tolerance by a member of the "ToxR-like" family of transcriptional regulators // J. Bacterid. 2000. - Vol. 182, N 19. - P. 5342-5350.

296. Merrell D.S., Tischler A.D., Lee S.H., Camilli A. Vibrio cholerae requires rpos for efficient intestinal colonization // Infect. Immun. 2000. - Vol. 68, N 12. - P. 66916696.

297. Miller V.L., Mekalanos J.J. Synthesis of cholera toxin is positively regulated at the transcriptional level by toxR II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. - Vol. 81, N 11. -P. 3471-3475.

298. Miller V.L., Taylor R.K., Mekalanos J.J. Cholera toxin transcriptional activator ToxR is a transmembrane DNA binding protein // Cell. 1987. - Vol. 48, N 2. - P. 271279.

299. Miller V.L., DiRita V.J., Mekalanos J.J. Identification of toxS, a regulatory gene whose product enhances foxi?-mediated activation of the cholera toxin promoter // J. Bacteriol. 1989. - Vol. 171, N3.-P. 1288-1293.

300. Miller M.B., Bassler B.L. Quorum sensing in bacteria // Annu. Rev. Microbiol. -2001.-Vol. 55.-P. 165-199.

301. Miller M.B., Skorupski K., Lenz D.H., Taylor R.K., Bassler B.L. Parallel quorum sensing systems converge to regulate virulence in Vibrio cholerae II Cell 2002. — Vol. 110, N3-P. 303-314.

302. Miller M.C., Keymer D.P., Avelar A., Boehm A.B., Schoolnik G.K. Detection and transformation of genome segments that differ within a coastal population of Vibrio cholerae strains // Appl. Environ. Microbiol. 2007. - Vol. 73, N 11. - P. 36953704.

303. Mishra A., Srivastava R., Pruzzo C., Srivastava B.S. Mutation in tcpR gene (Vc0832) causes loss of tolerance to high osmolarity and affects colonization and virulence in infant mice // J. Med. Microbiol. 2003. - Vol. 52, N 11. - P. 933-939.

304. Mitra S.N., Mukhopadhyay R., Ghosh A.N., Ghosh R.K. Conversion of Vibrio eltor MAK757 to classical biotype: role of phage PS 166 // Virology. 2000. - Vol. 273, N l.-P. 36-43.

305. Mizunoe Y., Wai S.N., Takade A., Yoshida S.I. Isolation and characterization of rugose form of Vibrio cholerae 0139 strain МОЮ // Infect. Immun. 1999. - Vol.67, N. 2. -P.958-963.

306. Montilla R., Chowdhury A., Hug A., Xu В., Colwell R.R. Serogroup conversion of Vibrio cholerae non-Ol to Vibrio cholerae 01: effect of growth state of cells, temperature and salinity // Can. J. Microbiol. 1996. - Vol. 42, N 1. - P. 87-93.

307. Moorthy S., Watnick P. Genetic evidence that the Vibrio cholerae monolayer is a distinct stage in biofilm development // Mol. Microbiol. 2004. - Vol. 52, N 2. - P. 571-587.

308. Moyer K.E., Kimsey H.H., Waldor M.K. Evidence for a rolling-circle mechanism of phage DNA synthesis from both replicative and integrated forms of СТХф // Mol. Microbiol. 2001. - Vol. 41, N 2. - P. 311-323.

309. Muanprasat C., Kaewmokul S., Chatsudthipong V. Identification of new small molecule inhibitors of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein: in vitro and in vivo studies // Biol. Pharm. Bull. 2007. - Vol. 30, N 3. - P. 502-507.

310. Mudd S., Anderson T.F. Selective "staining" for electron microscopy. The effect of heavy metal salts on individual bacterial cells // J. Exp. Med. 1982. - Vol. 76. - P. 103-107.

311. Mukhopadhyay A.K., Chakraborty S., Takeda Y., Nair G.B., Berg D.E. Characterization of VPI pathogenicity island and СТХф prophage in environmental strains of Vibrio cholerae //J. Bacteriol. -2001. Vol. 183, N 16. -P. 4737-4746.

312. Murphy R., Boyd F. Three pathogenicity island of Vibrio cholerae can excise from the chromosome and form circular intermediates // J. Bacteriol. 2008. - Vol. 190, N 2.-P. 636-647.

313. Nair G.B., Qadri F., Holmgren J., Svennerholm A.M., Safa A., Bhuiyan N.A., Ahmad O.S., Faruque S.M., Faruque A.S.G., Takeda Y.D., Sack D.A. Cholera due to altered El Tor strains of Vibrio cholerae 01 in Bangladesh // J. Clin. Microbiol. 2006.

314. Vol. 44, N 11.-P. 4211-4213.

315. Nakhamchik A., Wilde C., Rowe-Magnus D.A. Cyclic-di-GMP regulates extracellular polysaccharide production, biofilm formation, and rugose colony development by Vibrio vulnificus И Appl. Environ. Microbiol. 2008. - Vol. 74, N 13. - P. 41994209.

316. Nandi S., Maiti D., Saha A., Bhadra R.K. Genesis of variants of Vibrio cholerae 01 biotype El Tor: role of the СТХф array and its position in the genome // Mol. Microbiol.-2003.-Vol. 149, N 1. P. 89-97.

317. Nanninga N. Cytokinesis in prokaryotes and eukaryotes: common principles and different solutions // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2001. - Vol. 65, N 2. - P. 319-333.

318. Nielsen A.T., Dolganov N.A., Otto G., Miller M.C., Wu C.Y., Schoolnik G.K. RpoS controls the Vibrio cholerae mucosal escape response // PloS. Pathogens. 2006. -Vol. 2,N 10.-P. 0933-0948.

319. North A.K., Weiss D.S., Suzuki H., Flashner Y., Kustu S. Repressor forms of the enhancer-binding protein NrtC: some fail in coupling ATP hydrolysis to open complex formation by sigma 54-holoenzyme // J. Mol. Biol. 1996. - Vol. 260, N 3. - P. 317331.

320. Nye M.B., Pfau J.D., Skorupski K., Taylor R.K. Vibrio cholerae H-NS silences virulence gene expression at multiple steps in the ToxR regulatory cascade // J. Bacteriol.-2000.-Vol. 182, N 15.-P. 4295-4303.

321. Nye M.B., Taylor R.K. Vibrio cholerae H-NS domain structure and function with respect to transcriptional repression of ToxR regulon genes reveals differences among H-NS family members // Mol. Microbiol. 2003. - Vol. 50, N 2. - P. 427-444.

322. Ogierman M.A., Manning P.A. TCP pilus biosynthesis in Vibrio cholerae 01: gene sequence of tcpC encoding an outer membrane lipoprotein // FEMS. Microbiol. Lett. -1992.-Vol. 76, N 1-2.-P. 179-184.

323. Ogierman M.A., Zabihi S., Mourtzios L., Manning P.A. Genetic organization and sequence of the promoter-distal region of the tcp gene cluster of Vibrio cholerae II Gene.-1993.-Vol. 126, N 1,- P. 51-60.

324. Parsot C., Taxman E., Mekalanos J.J. ToxR regulates the production of lipoproteins and the serum resistance in Vibrio cholerae II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991.

325. Vol. 88, N5.-P. 1641-1645.

326. Pearson G.D., Woods A., Chiang S.L., Mekalanos J.J. CTX genetic element encodes a site-specific recombination system and an intestinal colonization factor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol. 90, N 8. - P. 3750-3754.

327. Peek J.A., Taylor R.K. Characterization of a periplasmic thiol:disulfide interchange protein required for the functional maturation of secreted virulence factors of Vibrio cholerae II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - Vol. 89, N 13. - P. 6210-6214.

328. Peterson K.M., Mekalanos J.J. Characterization of the Vibrio cholerae ToxR regulon: identification of novel genes involved in the intestinal colonization // Infect. Immun. 1988. - Vol. 56, N 11. - P. 2822-2829.

329. Pfau J.D., Taylor R.K. Genetic foot-print on the ToxR-binding site in the promoter for cholera toxin // Mol. Microbiol. 1996. - Vol. 20, N 1. - P. 213-222.

330. Pfau J.D., Taylor R.K. Mutations in toxR and toxS that separate transcriptional activation from DNA binding at the cholera toxin gene promoter // J. Bacteriol. 1998. -Vol. 180, N17.-P. 4724-4733.

331. Pirce N.F., Cray W.C., Kaper J.B., Mekalanos J.J. Determinants of immunogenicity and mechanisms of protection у virulent and mutant Vibrio cholerae 01 in rabbits // Infect. Immun. 1988. - Vol. 56, N 1. - P. 142-148.

332. Popovic Т., Fields P.I., Olsvik O. Detection of cholera toxin genes. In Vibrio cholerae and cholera: molecular to global perspectives. Eds. I.K. Wachsmuth, O. Olsvik. ASM Press, Washington DC. 1994. - P. 41-52.

333. Prouty M.G., Correa N.E., Klose K.E. The novel s54- and s28-dependent flagellar gene transcription hierarchy of Vibrio cholerae II Mol. Microbiol. 2001. - Vol. 39, N6.-P. 1595-1609.

334. Prouty M.G., Osorio C.R., Klose K.E. Characterization of functional domains of the Vibrio cholerae virulence regulator ToxT // Mol. Microbiol. — 2005. Vol. 58, N 4. -P. 1143-1156.

335. QingHua Z., XiaoMei Y., BoQing L., Xun Z., Jun Z., Zhong Z.J. Proteome analysis of sorbitol fermentation specific protein in Vibrio cholerae by 2-DE and MS // Pro-teomics. 2006. - Vol. 6.-P. 1848-1855.

336. Qu M., Xu J., Ding Y., Wang R., Liu P., Kan В., Qi G., Liu Y., Gao S. Molecular epidemiology of Vibrio cholerae 0139 in China: polymorphism of ribotypes and CTX elements // J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol. 41, N 6. - P. 2306-2310.

337. Quinones M., Kimsey H.H., Waldor M.K. LexA cleavage is required for CTX prophage induction // Mol. Cell. 2005. - Vol.17, N 2. - P. 291-300.

338. Rajanna C., Wang J., Zhang D., Xu Z., Ali A., Hou Y.M., Karaolis D.K.R. The Vibrio pathogenicity island of epidemic Vibrio cholerae forms precise extrachromo-somal circular excision products // J. Bacteriol. 2003. - Vol. 185, N 23. - P. 68936901.

339. Rashid M.H., Rajanna C., Ali A., Karaolis D.K. Identification of genes involved in the switch between the smooth and rugose phenotypes of Vibrio cholerae // FEMS Microbiol. Lett.-2003.-Vol. 227, N 1.-P. 113-119.

340. Ratledge C., Dover L.G. Iron metabolism in pathogenic bacteria // Annu. Rev. Microbiol. 2000. - Vol. 54.-P. 881-941.

341. Rau J., Stolz A. Oxygen-insensitive nitroreductases NfsA and NfsB of Escherichia coli function under anaerobic conditions as lawsone-dependent azo reductases // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - Vol. 69, N 6. - P. 3448-3455.

342. Raychoudhuri A., Patra Т., Ghosh K., Ramamurthy Т., Nandy R.K., Takeda Y., Nair G.B., Mukhopadhyay A.K. Classical ctxB in Vibrio cholerae 01, Kolkata, India // Emerg. Infect. Dis.-2009.-Vol. 15, N l.-P. 131-132.

343. Reguera G., Kolter R. Virulence and the environment: a novel role for Vibrio cholerae toxin-coregulated pili in biofilm formation on chitin // J. Bacteriol. 2005 -Vol. 187, N 10. - P. 3551-3555.

344. Reidl J., Klose K.E. Vibrio cholerae and cholera: out of the water and into the host // FEMS Microbiol. Rev. 2002. - Vol. 26, N 2. - P. 125-139.

345. Rhine J.A., Taylor R.K. TcpA pilin sequences and colonization requirements for 01 and 0139 Vibrio cholerae // Mol. Microbiol. 1994. - Vol. 13, N 6. - P. 1013-1020.

346. Rice E.W., Johnson C.H., Clark R.M., Fox K.R., Reasoner D.J., Dunnigan M.E., Panigrahi P., Johnson J.A., Morris J.S. Chlorine and survival of "rugose" Vibrio cholerae И Lancet 1992. - Vol. 340, N 8821. - P. 740.

347. Roggentin P., Schauer R., Hoyer L.L., Vimr E.R. The sialidase superfamily and its spread by horizontal gene transfer // Mol. Microbiol. 1993. - Vol. 9, N 5. - P. 915921.

348. Romling U., Gomelsky M., Galperin M.Y. C-di-GMP: the drawing of a novel bacterial signaling system // Mol. Microbiol. 2005. - Vol. 57, N 3. - P. 629-639.

349. Rowe-Magnus D.A., Guerout A.M., Mazel D. Bacterial resistance evolution by recruitment of super-integron gene cassettes // Mol. Microbiol. 2002. - Vol. 43, N 6. -P. 1657-1669.

350. Rubin E.J., Lin W., Mekalanos J.J., Waldor M.K. Replication and integration of a Vibrio cholerae cryptic plasmid linked to the CTX prophage // Mol. Microbiol. 1998. - Vol. 28, N 6. - P. 1247-1254.

351. Russel M. Moving through the membrane with filamentous phages // Trends Microbiol. 1995. - Vol. 3, N 6. - P. 223-228.

352. Ryjenkov D.A., Tarutina M., Moskvin O.V., Gomelsky M. Cyclic diguanylate is a ubiquitous signaling molecule in bacteria: insights into biochemistry of the GGDEF protein domain//J. Bacteriol. -2005. Vol. 187, N 5. - P. 1792-1798.

353. Safa A., Sultana J., Cam P.D., Mwansa J.C., Kong R.Y.C. Vibrio cholerae 01 hybrid El Tor strains, Asia and Africa // Emerg. Infect. Dis. 2008. - Vol. 14, N 6. - P. 987988.

354. Salles C.A., Momen H., Vicente A.C.P., Coelho A. Vibrio cholerae in South America: polymerase chain reaction and zymovar analysis // Trans R. Soc. Trop. Med. Hyg.- 1993.-Vol. 8, N 3. -P. 272.

355. Sanchez J., Holmgren J. Cholera toxin structure, gene regulation and pathophysiological and immunological aspects // Cell. Mol. Life Sci. 2008. - Vol. 65, N 9. -P. 1347-1360.

356. Sandkvist M. Biology of type II secretion // Mol. Microbiol. 2001. - Vol. 40, N 2. -P. 271-283.

357. Sanger F., Niclein S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - Vol. 74, N 12. - P. 5463-5467.

358. Sasmal D., Guhathakurta В., Ghosh A.N., Pal C.R., Datta A. Purification of a man-nose/glucose-specific hemagglutinin/lectin from a Vibrio cholerae 01 strain// FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1999. - Vol. 23. - P. 221-227.

359. Sauvonnet N., Vignon G., Pugsley A.P., Gounon P. Pilus formation and protein secretion by the same machinery in Escherichia coli II EMBO J. 2000. - Vol. 19, N 10. - P. 2221-2228.

360. Schauder S., Shokat K., Surette M.G., Bassler B.L. The LuxS family of bacterial autoinducers: biosynthesis of a novel quorum-sensing signal molecule // Mol. Microbiol. 2001. - Vol. 41, N 2. - P. 463-476.

361. Schmidt A J., Ryjenkov D.A., Gomelsky M. The ubiquitous protein domain EAL is a cyclic diguanylate-specific phosphodiesterase: enzymatically active and inactive EAL domains // J. Bacteriol. 2005. - Vol. 187, N 14. - P. 4774-4781.

362. Segall A.M., Craig N.L. New wrinkles and folds in site-specific recombination // Mol. Cell. 2005. - Vol. 19, N 4. - P. 559-566.

363. Seliger S.S., Mey A.R., Valle A.M., Payne S.M. The two TonB systems of Vibrio cholerae-. redundant and specific functions 11 Mol. Microbiol. 2001. - Vol. 39, N 3. -P. 801-812.

364. Sengupta D.K., Sengupta Т.К., Ghose A.C. Antibodies to outer membrane proteins of Vibrio cholerae induce protection by inhibition of intestinal colonization of vibrios // FEMS Microbiol. Immunol. 1992a. - Vol. 4, N 5. - P. 261-266.

365. Sengupta D.K., Sengupta Т.К., Ghose A.C. Major outer membrane proteins of Vibrio cholerae and their role in induction of protective immunity through inhibition of intestinal colonization // Infect. Immun. 1992b. - Vol. 60, N 11. - P. 4848^1855.

366. Sengupta N., Paul K., Chowdhury R. The global regulator ArcA modulates expression of virulence factors in Vibrio cholerae I I Infect. Immun. — 2003. Vol. 71, N 10. -P. 5583-5589.

367. Silva A .J., Pham K., Benitez J.A. Hemagglutinin/protease expression and mucin gel penetration in El Tor biotype Vibrio cholerae II Microbiology. — 2003. Vol. 149 (Pt 7).-P. 1883-1891.

368. Silva A.J., Benitez J.A. Transcriptional regulation of Vibrio cholerae hemaggluti-nin/protease by the cyclic AMP receptor protein and RpoS // J. Bacteriol. 2004. — Vol. 186, N 19-P. 6374-6382.

369. Silva A.J., Sultan S.Z., Liang W., Benitez J.A. Role of the histone-like nucleoid structuring protein (H-NS) in the regulation of RpoS and RpoS-dependent genes in Vibrio cholerae II J. Bacteriol. 2008. - Vol. 190, N 22. - P. 7335-7345

370. Simpson L.M., White V.K., Zane S.F., Oliver J.D. Correlation between virulence and colony morphology in Vibrio vulnificus II Infect. Immun. 1987. - Vol. 55, N 1. - P. 269-272.

371. Sinha V.B., Srivastava B.S. Plasmid associated suppression of pathogenicity of wild-type strains of Vibrio cholerae from cholera patients // Indian. J. Med. Res. 1983. -Vol. 77.-P. 1-4.

372. Skorupski K., Taylor R.K. Cyclic AMP and its receptor protein negatively regulate the coordinate expression of cholera toxin and toxin-coregulated pilus in Vibrio cholerae II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - Vol. 94, N 1. - P. 265-273.

373. Sperandio V., Bailey C., Giron J.A., DiRita V.J., Silveira W.D., Vettore A.D., Kaper J.B. Cloning and characterization of the gene encoding the OmpU outer membrane protein of Vibrio cholerae II Infect. Immun. 1996. - Vol. 64, N 12. - P. 5406-5409.

374. Stonehouse E., Kovacikova G., Taylor R.K., Skorupski K. Integration host factor positively regulates virulence gene expression in Vibrio cholerae II J. Bacteriol. -2008. Vol. 190, N 13. - P. 4736-4748.

375. Sun D., Mekalanos J.J., Taylor R.K. Antibodies directed against the toxin-coregulated pilus isolated from Vibrio cholerae provide protection of the infant mouse experimental cholera model // J. Infect. Dis. 1990. - Vol. 161, N 6. - P. 12311236.

376. Sun D., Lafferty M.J., Peek J.A., Taylor R.K. Domains within the Vibrio cholerae toxin-coregulated pilin subunit that mediate bacterial colonization // Gene. — 1997. —1. Vol. 192, N 1.-P. 79-85.

377. Svennerholm A.M., Wiklund G. Rapid GMi-enzyme-linked immunosorbent assay with visual reading for identification of Escherichia coli heat-labile enterotoxin // J. Clin. Microbiol. 1983. - Vol. 17, N 4. - P. 596-600.

378. Swanson J. Studies on gonococcus infection. XIV. Cell wall protein differences among color/opacity variants of Neisseria gonorrhoeae II Infect. Immun. 1978. -Vol. 21, N l.-P. 292-302.

379. Tacket C.O., Sack D.A. Cholera vaccines. In Vaccines. Eds. S.A. Plotkin, W.A. Orenstein, P.A. Offit. 5th Edit. - Madrid: Elsevier, 2008. - P. 127-138.

380. Talledo M., Rivera I.N.G., Lipp E.K., Neale A., Karaolis D., Huq A., Colwel R.R. Characterization of Vibrio cholerae phage isolated from a Peruvian coastal environment // Environ. Microbiol. 2003. - Vol. 5, N 5. - P. 350-354.

381. Tamayo R, Schild S., Pratt J.T., Camilli A. Role of cyclic di-GMP during El Tor bio-type Vibrio cholerae infection: characterization of the in vivo-induced cyclic di-GMP phosphodiesterase CdpA // Infect. Immun. 2008. - Vol. 76, N 4. - P. 1617-1627.

382. Tan N.H., Tan L.S. Acidimetric assay for phospholipase A using egg yolk suspension as substrate // Anal. Biochem. 1988. - Vol. 170, N 2. - P. 282-288.

383. Taylor R.K., Miller V.L., Furlong D.B., Mekalanos JJ. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - Vol. 84, N 9. - P. 2833-2837.

384. Taylor R.K., Kirn T.J., Bose N., Stonehouse E., Tripathi S.A., Kovac P., Wade W.F. Progress towards development of a cholera subunit vaccine // Chem. Biodivers. -2004.-Vol. 1, N 7. P. 1036-1057.

385. Tendeng C., Badaut C., Krin E., Gounon P., Ngo S., Danchin A., Rimsky S., Bertin P. Isolation and characterization of vicH, encoding a new pleiotropic regulator in Vibrio cholerae И J. Bacteriol. 2000. - Vol. 182, N 7. - P. 2026-2032.

386. Thelin K.H., Taylor R.K. Toxin-coregulated pilus, but not mannose-sensitive hemagglutinin, is required for colonization by Vibrio cholerae 01 El Tor biotype and 0139 strains // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64, N 7. - P. 2853-2856.

387. Tischler A.D., Lee S.IT., Camilli A. The Vibrio cholerae vieSAB locus encodes a pathway contributing to cholera toxin production // J. Bacteriol. 2002. - Vol. 184,1. N 15.-P. 4104-4113.

388. Tischler A.D., Camilli A. Cyclic diguanylate (c-di-GMP) regulates Vibrio cholerae biofilm formation // Mol. Microbiol. 2004. - Vol. 53, N 3. - P. 857-869.

389. Tischler A.D., Camilli A. Cyclic diguanylate regulates Vibrio cholerae virulence gene expression // Infect. Immun. 2005. - Vol. 73, N 9. - P. 5873-5882.

390. Toma C., Kuroki H., Nakasone N., Ehara M., Iwanaga M. Minor pilin subunits are conserved in Vibrio cholerae type IV pili // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2002. -Vol. 33, N1.-P. 35-40.

391. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from poly-acrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - Vol. 76, N 9. - P. 4350-4354.

392. Tripathi S.A., Taylor R.K. Membrane association and multimerization of TcpT, the cognate ATPase ortholog of the Vibrio cholerae toxin-coregulated-pilus biogenesis apparatus // J. Bacteriol. 2007. - Vol. 189, N 12. - P. 4401^1409.

393. Trucksis M., Galen J.E., Michalski J., Fasano A., Kaper J.B. Accessory cholera en-terotoxin (Ace), the third toxin of a Vibrio cholerae virulence cassette // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol. 90, N 11. - P. 5267-5271.

394. Trucksis M., Michalski J., Deng Y.K., Kaper J.B. The Vibrio cholerae genome contains two unique circular chromosomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95, N24.-P. 14464-14469.

395. Vance R.E., Zhu J., Mekalanos J.J. A constitutively active variant of the quorum-sensing regulator LuxO affects protease production and biofilm formation in Vibriocholerae И Infect. Immun. 2003. - Vol. 71, N 5. - P. 2571-2576.

396. Voss E., Manning P.A., Attridge S.R. The toxin-coregulated pilus is a colonization factor and protective antigen of Vibrio cholerae El Tor // Microb. Pathog. 1996. -Vol. 20, N3.-P. 141-53.

397. Wagner P.L, Waldor M.K. Bacteriophage control of bacterial virulence // Infect. Immun. 2002. - Vol. 70, N 8. - P. 3985-3993.

398. Waldor M.K., Colwell R., Mekalanos J.J. The Vibrio cholerae 0139 serogroup antigen includes an О antigen capsule and lipopolysaccharide virulence determinants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 91, N 24. - P. 11388-11392.

399. Waldor M.K., Mekalanos J.J. ToxR regulates virulence gene expression in non-Ol strains of Vibrio cholerae that cause epidemic cholera // Infect. Immun. 1994. -Vol. 62, N 1.-P. 2853-2856.

400. Waldor M.K., Mekalanos J.J. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin// Science. 1996. - Vol. 272, N 5270. - P. 1910-1914.

401. Waldor M.K., Rubin E.J., Pearson G.D.N., Kimsey H., Mekalanos J.J. Regulation, replication, and integration functions of the Vibrio cholerae CTXcp are encoded by region RS2 // Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 24, N 5. - P. 917-926.

402. Waldor M.K., Lazar S., Kimsey H., Williams J., Mekalanos J.J. СТХф: a novel filamentous phage encoding cholera toxin. In Bacterial protein, toxins. Eds. J. Hacker et al. Jena, 1998. - P. 363-371.

403. Waters C.M., Lu W., Rabiinowitz J.D., Bassler B.L. Quorum sensing controls biofilm formation in Vibrio cholerae through modulation of cyclic di-GMP levels and repression of vpsTII J. Bacteriol. 2008. - Vol. 190, N 7. - P. 2527-2536.

404. Watnick P.I., Fullner K.J., Kolter R. A role for the mannose-sensitive hemagglutinin in biofilm formation by Vibrio cholerae El Tor // J. Bacteriol. 1999. - Vol. 181, N 11.-P. 3606-3609

405. Watnick P.I., Kolter R. Steps in the development of a Vibrio cholerae El Tor biofilm // Mol. Microbiol. 1999. - Vol. 34, N 3. - P. 586-595.

406. Watnick P.I., Lauriano C.M., Klose K.E., Croal L., Kolter R. The absence of a flagel-lum leads to altered colony morphology, biofilm development and virulence in Vibrio cholerae 0139 // Mol. Microbiol. 2001. - Vol. 39, N 2. - P. 223-235.

407. White B.P. The rugose variant of Vibrios И J. Pathol. 1938. - Vol. 46. - P. 1-6.

408. Wibbenmeyer J.A., Provensano D., Landry C.F., Klose K.E., Delcour A.H. Vibrio cholerae OmpU and OmpT porins are differentially affected by bile // Infect. Immun. -2002.-Vol. 70, N 1. P. 121-126.

409. Withey J.H., DiRita V.J. Activation of both acfA and acfD transcription by Vibrio cholerae ToxT requires binding to two centrally located DNA sites in an inverted repeat conformation // Mol. Microbiol. 2005. - Vol. 56, N 4. - P. 1062-1077.

410. Withey J.H., DiRita V.J. The toxbox: specific DNA sequence requirements for activation of Vibrio cholerae virulence genes by ToxT // Mol. Microbiol. 2006. - Vol. 59, N6.-P. 1779-1789.

411. Weintraub A., Widmalm G., Jansson P.E., Jansson M., Hultenby K., Albert M.J. Vibrio cholerae 0139 Bengal possesses a capsular polysaccharide which may confer increased virulence // Microb. Pathog. 1994. - Vol. 16, N 3. - P. 235-241.

412. Wommack K.E., Colwell R.R. Virioplankton: viruses in aquatic environments // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. - Vol. 64, N 1. - P. 69-114.

413. Wright L., Simpson L.M., Oliver J.D., Morris J.G. Relation of capsular materials and colony opacity to virulence of Vibrio vulnificus II Infect. Immun. 1990. - Vol. 58, N6.-P. 1769-1773.

414. Wu J.Y., Wade W.F., Taylor R.K. Evaluation of cholera vaccines formulated with toxin-coregulated pilin peptide plus polymer adjuvant in mice // Infect. Immun.2001. Vol. 69, N 12. - P. 7695-7702.

415. Yildiz F.H., Schoolnik G.K. Role of rpoS in stress survival and virulence of Vibrio cholerae II J. Bacteriol. 1998. - Vol. 180, N 4. - P. 773-784.

416. Yildiz F.H., Lie X.S., Heydorn A., Schoolnik G.K. Molecular analysis of rugosity in a Vibrio cholerae Ol El Tor phase variant // Mol. Microbiol. 2004. - Vol. 53, N 2. -P. 497-515.

417. Yoon S.S., Mekalanos JJ. 2,3-butanediol synthesis and the emergence of the Vibrio cholerae El Tor biotype // Infect. Immun. 2006. - Vol. 74, N 12. - P. 6547-6556.

418. Yoon S.S., Mekalanos J.J. Decreased potency of the Vibrio cholerae sheathed flagel-lum to trigger host innate immunity//Infect. Immun. 2008. - Vol. 76, N3. -P. 1282-1288.

419. Yu R.R., DiRita V.J. Analysis autoregulatory loop controlling ToxT, cholera toxin, and toxin-coregulated pilus production in Vibrio cholerae II J. Bacteriol. 1999. -Vol. 181, N 8. - P. 2584-2592.

420. Yu R.R., DiRita V.J. Regulation of gene expression in Vibrio cholerae by ToxT involves both antirepression and RNA polymerase stimulation // Mol. Microbiol.2002.-Vol. 43, N 1. -P. 119-134.

421. Zhang D., Xu Z., Sun W., Karaolis D.K.R. The Vibrio pathogenicity island-encoded Mop protein modulates the pathogenesis and reactogenicity of epidemic Vibrio cholerae II Infect. Immun. 2003. - Vol. 71, N 1. - P. 510-515.

422. Zhu J., Miller M.B., Vance R.E., Dziejman M., Bassler B.L., Mekalanos J.J. Quorum-sensing regulators control virulence gene expression in Vibrio cholerae II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - Vol. 99, N 5. - P. 3129-3134.

423. Zhu J., Mekalanos J.J. Quorum sensing-dependent biofllms enhance colonization in Vibrio cholerae II Dev. Cell. 2003. - Vol. 5, N 4. - P. 647-656.

424. Zo Y.G., Chokesajjawatee N., Arakawa E., Watanabe H., Huq A., Colwell R.R. Co-variability of Vibrio cholerae microdiversity and environmental parameters // Appl. Environ. Microbiol. 2008. - Vol. 74, N 9. - P. 2915-2920.

Информация о работе

Заднова, Светлана Петровна
доктора биологических наук
Саратов, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Штаммы Vibrio cholerae с измененной экспрессией генов вирулентности - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Штаммы Vibrio cholerae с измененной экспрессией генов вирулентности ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Штаммы Vibrio cholerae с измененной экспрессией генов вирулентности"

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Заднова, Светлана Петровна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Штаммы Vibrio cholerae с измененной экспрессией генов вирулентности"

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Заднова, Светлана Петровна

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Заднова, Светлана Петровна, Саратов

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Штаммы Vibrio cholerae с измененной экспрессией генов вирулентности
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология