Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика биологических свойств бактериофагов холерных и парагемолитических вибрионов

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика биологических свойств бактериофагов холерных и парагемолитических вибрионов"

На правах рукописи

ГАЕВСКАЯ НАТАЛЬЯ ЕВГЕНЬЕВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИОФАГОВ ХОЛЕРНЫХ И ПАРАГЕМОЛИТИЧЕСКИХ ВИБРИОНОВ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 4 МАР 2013

Волгоград 2013

005050657

Работа выполнена в Федеральном казённом учреждении здравоохранения Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научный руководитель: доктор медицинских наук

Кудрякова Татьяна Александровна

(ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора, г. Ростов-на-Дону)

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Храпова Наталья Петровна

(ГБОУ ВПО «Волгоградский медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ, ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, г. Волгоград)

доктор медицинских наук Гальцева Галина Васильевна

(ФКУЗ «Причерноморская противочумная станция» Роспотребнадзора, г.Новороссийск)

Ведущая организация ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора

Защита состоится «26» марта 2013 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 208.008.06 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Волгоградском государственном медицинском университете по адресу: 400131,

г. Волгоград, пл. Павших борцов, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» (400131, г. Волгоград,

пл. Павших борцов, д. 1).

Автореферат разослан «оі ^ » OJL _ 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор социологических наук, кандидат медицинских наук, профессор1

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Продолжающаяся седьмая пандемия холеры привлекла пристальное внимание исследователей к проблеме патогенных для человека вибрионов. Вспышка холеры, обусловленная холерными вибрионами 0139 серо-группы, сходство этого возбудителя с вибрионами эльтор объясняют повышенное внимание исследователей к новому эпидемическому фактору холеры (Москвитина Э.А. с соавт. 2011; Иванова С.М. с соавт., 2011). Бактериофаги являются постоянным спутником патогенных вибрионов, а их присутствие в клетках бактерий приводит к появлению новых свойств (Остроумова Н.М. с соавт., 1971 а, б; Милютин В.Н. с соавт., 1980; Остроумова Н.М. с соавт., 1993 б; Смирнова Н.И. с соавт., 1999; Щелканова Е.Ю. с соавт., 2001; Ерошенко Г.А. с соавт., 2000, 2003; Ильина Т.С., 2003; Davis В.М. et al., 2003). Детальное изучение механизмов взаимоотношения бактериофагов с клеткой хозяина имеет не только теоретическое, но и важное практическое значение (Сомова А.Г., 1968; Дрожевкина М.С., 1974; Остроумова Н.М. с соавт., 1986 а, б; Кудрякова Т.А. с соавт., 2003 б, в; Faruque S.M. et al., 2003, 2005). Актуальность проблемы заключается в выявлении общих закономерностей строения биологических структур бактериофагов, которые затем используют для их определения и классификации.

Наиболее важным этапом в лабораторной диагностике патогенных вибрионов является их выделение и идентификация (Ломов Ю.М. и др., 1994 а; Данилкина Е.Б., 1995; Онищенко Г.Г. с соавт., 2000; МУК 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры»),

В настоящее время из фагов патогенных вибрионов наиболее изучены холерные бактериофаги, которые широко используются для диагностики и дифференциации возбудителя холеры (Быстрый Н.Ф., 1974; Дрожевкина М.С., Арутюнов Ю.И., 1979; Кудрякова Т.А. с соавт., 1999; Онищенко Г.Г. с соавт., 2000; Саяпина Л.В. с соавт., 2001; Безсмертный В.Е. с соавт., 2005; Ломов Ю.М. с соавт., 2008;).

Вместе с тем, сохраняет свою актуальность фагодиапюстика V. cholerae Ol39 серогруппы «Бенгал», так как диагностические фаги холерных вибрионов непригодны для идентификации этого вида возбудителя.

Кроме того, недостаточно разработано применение бактериофагов в лабораторной диагностике парагемолитических вибрионов. Крупные вспышки пищевых токсикоинфекций, вызванные этими вибрионами, были зарегистрированы в 19902000 годах в г. Владивостоке, в странах Юго-Восточной Азии, США, Канаде, Перу (Маслов Д.В., 1997; Wong Н.С. et al. 2000; Williams T.L. et al., 2004; Nair G.B. et al., 2007; Boyd F., Fidelma et al., 2008).

В последние годы накопились сведения о фагах парагемолитических и аль-гинолитических вибрионов ( Кудрякова Т.А. и др., 2002, 2003 a; Chang В. et. al., 1998, 2002; Nasu H. et al., 2000; Tetsuya I. et al., 2001). Создана схема фаготипиро-вания парагемолитических вибрионов (Кудрякова Т.А. и др., 1993 б; Хайтович А.Б. и др., 1997; Гальцева Г.В. и др., 1997). Однако фаготипирование парагемолитических вибрионов показало распространение вибрионов, дающих типы литических реакций, не укладывающихся в существующую схему фаготипирования, в связи с чем необходимо её совершенствование. Для первичной идентификации различных по морфологической структуре фагов необходимо иметь набор фагочувствитель-ных штаммов.

До настоящего времени остается нерешенной проблема идентификации и дифференциации большой группы бактериофагов патогенных для человека вибрионов ( V.. cholerae и V. parahaemolyticus). Вместе с тем, для исследовательских целей и решения прикладных задач важно учитывать признаки бактериофагов, позволяющие выявить сходство и различия между ними.

Наличие Центра по патогенным вибрионам ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора представителей различных видов вибрионов сделало реальным проведение среди них поиска продуцентов ранее неизвестных фагов.

Цель работы. Совершенствование идентификации бактериофагов и их применение для внутривидовой дифференциации холерных и парагемолитических вибрионов.

Задачи исследования 1. Выделение бактериофагов из лизогенных штаммов холерных и других патогенных вибрионов.

2. Расширение набора индикаторных штаммов патогенных вибрионов (холерных, парагемолитических) для обнаружения бактериофагов различных морфологических групп.

3. Характеристика биологических свойств бактериофагов патогенных видов вибрионов.

4. Дифференциация штаммов V. cholerae 0139 серогруппы фаговым методом.

5. Усовершенствование схемы фаготипирования V. parahaemolyticus.

6. Разработка схемы идентификации и дифференциации бактериофагов патогенных вибрионов.

Научная новизна работы. Выявлены умеренные фаги у различных видов патогенных вибрионов (К cholerae OI, 0139 серогрупп, V. parahaemolyticus, V. mimi-cus, V. alginolyticus), и было проведено сравнение биологических свойств, что позволило использовать их для научных исследований и в диагностике возбудителей ОКИ.

Впервые разработана внутривидовая дифференциация штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы путём прямого и непрямого фаготипирования. Получен патент на изобретение «Способ внутривидовой дифференциации Vibrio cholerae 0139» (№ 2268942 от 27.01.2006 г.). Использование предлагаемого способа позволяет с помощью индикаторных штаммов КМ-199 и КМ-152 проводить фаготи-пирование V. cholerae 0139 серогруппы, получая при этом дополнительные характеристики холерных вибрионов, выделяемых из клинического материала. Впервые обнаружены бактериофаги V. mimicus по биологическим свойствам сходные с холерными фагами. Фаги V. mimicus были депонированы в ФКУЗ Ростовском-на-Дону противочумном институте Роспотребиадзора под № ФК-85 и № ФК-98.

Усовершенствовала схема фаготипирования парагемолитических вибрионов, что позволило определить среди них 10 фаготипов вместо 4-х известных ранее, и повысить эффективность типирования штаммов с 48,4 % до 92,6 %.

Впервые разработан способ дифференциации бактериофагов парагемолитических вибрионов III, IV, V морфогрупп от бактериофагов I морфогруппы (Патент №2290445 от 27.12.2006 г.).

Впервые разработана общая схема идентификации, позволяющая выявить существенные различия между фагами некоторых видов патогенных вибрионов. Дополнена коллекция охарактеризованных фагов и индикаторных штаммов патогенных вибрионов. Составлен 4 выпуск «Каталога бактериофагов и тест-штаммов патогенных для человека вибрионов и иерсиний», который одобрен Ученым советом и утверждён директором ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора (01.03.11 г., протокол №1) и опубликован в виде реферата в Информационном выпуске №24 «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов-на-Дону, 2011). Получено свидетельство о регистрации в Реестре баз данных Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам базы данных «Коллекция бактериофагов и тест-штаммов патогенных для человека вибрионов» №2010620549 от 24.09.2010.

Теоретическая и практическая значимость. Новые сведения о свойствах большой группы бактериофагов различных видов патогенных вибрионов расширяют наши познания о биологическом разнообразии вирусов бактерий. Анализ полученных данных позволяет установить не только их общность как представителей единого семейства бактериофагов, но и различия, отражающие дивергенцию этих видов в процессе эволюции. Способность генетических элементов бактериофагов включаться в клетки бактерий делает их хорошей моделью для изучения геномной пластичности вибрионов. Диагностические бактериофаги пригодны для идентификации вибрионов, а также для изучения физиологических свойств и поверхностных структур фагочувствительных штаммов, установления биологической эффективности любого воздействия.

Так как своевременное определение вида бактериофага крайне важно при его выделении из материала от людей больных холерой, острыми токсикоинфекциями, гастроэнтеритами или из объектов окружающей среды, проведение исследования осуществляется с соблюдением следующих этапов:

- использование специфических индикаторных штаммов холерных вибрионов, пригодных для выделения холерных бактериофагов (К еЫог КМ-199, V. сИокгае 0139 КМ-152);

- использование системы индикаторных штаммов, позволяет проводить первичную идентификацию холерных бактериофагов;

- использование депонированных тест-штаммов V. рагаИаето1уИси$ КМ-97, КМ-184 для первичной дифференциации бактериофагов парагемолитических вибрионов III, IV, V морфогрупп от филаментозных бактериофагов I морфогрулпы;

- использование единой комплексной схемы анализа биологических свойств вибриофагов.

Определён комплекс идентификационных и дифференцирующих признаков бактериофагов у следующих вибрионов - V. скокгае, V. рагакаето!уИсш, V. тМ-сия, V. те1зсИткоуи. Отмеченные чёткие таксономические показатели, полученные при сравнительном изучении бактериофагов патогенных вибрионов, легли в разработанную нами схему идентификации и дифференциации, включающую признаки их отличия: а) характерная морфология бактериофагов в электронном микроскопе - определение морфогрулпы; б) специфичность литического действия, подтверждаемая на соответствующих видах микроорганизмов, применение тест-штаммов вибрионов; в) отсутствие антигенного родства с бактериофагами других видов; г) устойчивость, либо чувствительность к хлороформу и повышенной температуре.

Предложенный набор фагочувствительных штаммов V. сИокгае 01 («х+1ср+, с1хЧср+), V. с!ю1егаг 0139 серогруппы (с1х*1ср^) для выделения холерных фагов при мониторинге окружающей среды на вибриофлору позволяет обнаруживать бактериофаги. Морфо- и серогруппы изолированных холерных фагов коррелируют с обнаруженными фагами в лизогенных штаммах холерных вибрионов эльтор, циркулирующими в реках в эпидемический сезон.

Впервые установлена особенность взаимодействия выделенных фагов V. тш-¡тсш с гетерологичным хозяином V. скокгае, проявляющаяся в литической реакции со штаммом V. сИокгае 037 серогруппы. Разработан способ дифференциации фагов V. тткш от холерных с помощью индикаторного штамма V. скокгае 13022-69 037 серогруппы, что используется для их отличия от холерных фагов при исследовании проб воды на вибриофаги.

Предложен способ для внутривидовой дифференциации штаммов V. скокгае 0139 серогруппы с применением фаговых методов.

Депонированы в ГКПБ ФКУЗ Российский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора штамм-продуцент фага V. parahaemolyticus, индикаторный штамм V. parahaemolyticus. Депонированы в ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора фаги: Phagum parahaemolyticus ФК-90 (67) - I морфогруппы, использующийся для дифференциации индикаторных штаммов Vibrio parahaemolyticus КМ-184 и КМ-97; Phagum parahaemolyticus ФК-104, выделенный из штамма серогруппы 05:К15 и Phagum parahaemolyticus ФК-105, выделенный из штамма серогруппы 03:К6, которые могут использоваться в генетических исследованиях.

Полученные результаты нашли отражение в «Методических рекомендациях по идентификации и дифференциации бактериофагов патогенных вибрионов», одобренных Ученым советом и утвержденные директором ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора (23.03.04 г., протокол № 4) и опубликованных в виде реферата в Информационном выпуске №17 «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов-на-Дону, 2004).

Материалы по фаговым методам лабораторной диагностики заболеваний, обусловленных V. cholerae OI и не 01 серогрупп, V. parahaemolyticus, представлены на курсах профессиональной переподготовки врачей и биологов по специальности «бактериология» и на курсах повышения квалификации. Внедрён в лабораторную практику метод дифференциации штаммов и бактериофагов парагемолитиче-ских вибрионов (ФКУЗ «Северо-Кавказская противочумная станция» Роспотребнадзора, акт внедрения от 12.01.2011 г.). Результаты фаговых методов идентификации музейных и свежевыделенных штаммов холерных и парагемолитических вибрионов используются для паспортизации штаммов холерных и парагемолитических вибрионов, хранящихся в Музее живых культур ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора (акт внедрения от 19.10.11 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Система индикаторных штаммов (холерных и парагемолитических) позволяет осуществлять первичную идентификацию фагов патогенных вибрионов.

2. Усовершенствование схемы фаготипирования расширяет возможности фаго-типирования парагемолитических вибрионов.

3. Применение бактериофагов, выделенных из штаммов V. cholerae 0139 серо-группы «Бенгал», позволяет проводить внутривидовую дифференциацию штаммов V. cholerae 0139 серогруппы.

4. Использование схемы идентификации для фагов патогенных вибрионов обеспечивает сравнительную оценку сходства и различий между фагами (К cholerae, V. parahaemolyticus, V. mimicus).

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на 15 научных конференциях: Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы», (Ростов-на-Дону, 2003-2005, 2008, 2010, 2011, 2012); IX Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников СНГ», (Волгоград, 2008 г.); X Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ», (Ставрополь, 2010 г.); IX и X Межвузовские конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении», (Ростов-на-Дону, 2010, 2011 гг.); Научно-практическая школа-конференция молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2010, 2011 гг.); IV Ежегодный Всероссийский Конгресс по инфекционным болезням (Москва, 2012); Научно-практическая конференция Роспотребнадзора «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения» (Нижний Новгород, 2012).

Диссертационная работа выполнена в рамках завершенной государственной темы № 050-4-04 «Идентификация и дифференциация бактериофагов патогенных вибрионов» и темы № 103-4-08 «Фено- и генотипическая характеристика параге-молитических вибрионов по признакам, связанным с проявлением вирулентности».

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена самостоятельно.

Публикации результатов исследований. По теме диссертационного исследования опубликовано 27 работ, в том числе 3 из них в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени, получено 2 патента на изобретение, получено свидетельство о государственной регистрации базы данных «Коллекция бактериофагов и тест-штаммов патогенных для человека вибрионов».

План диссертационной работы утверждён на заседании Ученого совета ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора (протокол №3 от 01.04.2005).

Структура работы. Диссертация изложена на 155 странице и состоит из введения, главы обзора литературы, пяти глав результатов собственных исследований (в том числе, одной главы с описанием материалов и методов), заключения, выводов. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 10 рисунками. Библиографический указатель содержит 313 источников, из которых 185 - отечественных, 128 -иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы.

Бактериальные штаммы: в работе были использованы штаммы из коллекции музея живых культур ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт: Vibrio cholerae choie rae — 65 штаммов, V. cholerae eltor - 252, V. cholerae 0139 ce-рогруппы — 51, V. cholerae non OI/non OI39 - 220, V. alginolyticus - 80, V. parahae-molyticus - 370, V. mimicus - 6, V. metschnikovii -11. Размножение холерных фагов осуществляли на индикаторных культурах V. cholerae cholerae 145 (etк* tep), V. cholerae eltor 75M (ctx* tep*), KM-199 (P-13169) (ctx' tep*), V. cholerae 0139 cepo-группы - KM-152 (P-16373) (ctx* tep*). Для дифференциации фага V. mimicus от холерного фага ФБ был отобран штамм V. cholerae 037 серогруппы 1322-69 (ctx tep*). Предложенные нами в качестве индикаторных штаммов V. parahaemolyticus

КМ-97 и КМ-184 применяли для размножения бактериофагов парагемолитических вибрионов. Специфичность бактериофагов испытывали на 133 штаммах бактерий близкородственных родов и семейств {УгЪпопасеае, Р$ечс1отопас1асеае, Еп1егоЬас-/епасеае).

Бактериофаги: для изучения использовали 84 бактериофага различных видов патогенных вибрионов, выделенных в ходе выполнения научных исследований и отобранных из коллекции лаборатории бактериофагов ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института: фаги V. сИокгае сИокгае - 16, V. сИокгае еког -32, V. сЪокгае 0139 - 8 фагов, V. рагакаето1уИсш - 19, V. а^то1уйсив - 4, V. тЫ-сия - 2, V те^скткоуп - 3. ), причём 6 фагов холерных и парагемолитических вибрионов были обнаружены лишь после индукции штаммов ультрафиолетовым излучением.

Питательные среды: работу проводили на 0,7%, 1,5% агаре и бульоне Мартена, рН 7,6-7,8. Для экспериментов с галофильными вибрионами использовали те же среды с добавлением 1,5% или 3% №С1.

Обнаружение, выделение и размножение фага из лизогенных штаммов патогенных вибрионов проводили общепринятыми методами (Адаме М., 1961), адаптированным к работе с фагами патогенных вибрионов. Для повышения эффективности выделения бактериофагов из лизогенных культур проводилось их облучение ультрафиолетовыми лучами с помощью лампы ПРК-2 (Адаме М., 1961).

Антифаговые сыворотки получали путем внутривенной иммунизации кроликов по методу Ю.Н. Марьиной (1941), соответствующими фагами.

Серологическую идентификацию осуществляли двумя методами: качественной реакцией и количественной по методу АдамсаМ. (1961).

Строение корпускул фагов патогенных вибрионов изучали по методике изложенной в методических указаниях по применению прямого фаготипирования возбудителя холеры Эль-Тор (1983).

Диапазон литической активности и специфичности фагов изучали путем постановки прямой пробы с фагами (титр 10б-1010 БОЕ/мл). Результат учитывали через 18 часов культивирования при 37 °С.

При изучении одиночного цикла размножения была использована методика Эллиса и Дельбрюка (1939).

Устойчивость фагов к действию концентрированных растворов мочевины, цитрата натрия изучали по методике Burnet F (1933). Термоустойчивость фагов определяли методом Friedman и Cowles (1953). Хлороформ добавляли к фа-голизату в количестве 10 % объема среды. Содержание активных частиц фага определяли при помощи двухслойного метода, о результатах судили по сопоставлению данных опытного и контрольного высевов.

Статистическую обработку результатов проводили по общепринятым методам, описанным Ашмариным И.П. и Воробьевым A.A. (1962), Ворошиловой М.Н. с соавторами (1964), Лакиным П.Ф. (1968). Все работы со штаммами V. chole-гае проводили в соответствии с «Санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.1285-03».

Результаты исследований и их обсуждение

В соответствии с целью и задачами исследования были выделены и изучены 84 бактериофага различных видов патогенных вибрионов, из которых 67 фагов выделены нами в процессе работы. В качестве сравнения использовались фаги V. а\-ginolyticus, V. mimicus, V. metschnikovii.

Сравнительное изучение биологических свойств бактериофагов, выделенных из токсигенных и атоксигенных штаммов холерных вибрионов Ol се-рогруппы. Поиск штаммов-продуцентов фагов среди холерных вибрионов и характеристика продуцируемых бактериофагов В начале исследований мы изучали 22 бактериофага, выделенных из 64 штаммов V. cholerae cholerae. Негативные колонии выделенных фагов имели округлую форму, полупрозрачный центр, диаметр 0,3-1 мм. При электронно-микроскопическом изучении все фаги относились по морфологии корпускул к V морфогруппе (Тихоненко A.C., 1968) и типу AI (Ackermann H.W., 1987). Умеренные фаги были серологически родственными и относились ко II серологическому типу холерных фагов. Фаги холерных вибрионов в одиночном цикле развития характеризовались общезакономерными для вирусов бактерий стадиями — адсорбцией, началом инфекции, латентным периодом, определенной урожайностью. Полученные в работе умеренные холерные фаги имели латентный период, равный 60-72 минутам. Средний урожай на одну микробную клетку составлял 8,11-10,53 корпускул. Фаги V. cholerae cholerae чувствительны к

повышенной температуре, при t= 65°С отмечалась полная инактивация при экспозиции 30 мин. К действию хлороформа все фаги были устойчивы. Фаги не проявили чувствительности к 3% раствору цитрата натрия, выживаемость сохранялась в пределах 92,3-100% при экспозиции 18-20 часов. Пребывание фагов в растворе 30% мочевины, приводило к снижению активности фагов V. cholerae cholerae, выживаемость сохранялась в пределах 12,5-25,7% Литическая активность холерных фагов в отношении холерных вибрионов Ol серогруппы была в пределах 3-25% и не распространялась на 133 штамма бактерий, относящихся к семействам Vibriona-сеае, Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae.

Умеренные фаги, выделенные из атоксигенных штаммов холерных вибрионов эльтор, изолированных от людей. Изученные нами на лизогению 23 штамма атоксигенных холерных вибрионов эльтор, имеющие различные генетические маркеры: первая группа - ctxARzoface'tcpA'rstA'rstCtoxR*rtxA*rtxC*hap*, вторая группа - ctxAB"zot'ace"tcpA* rstA'rstCtoxR* rtxA* rtxC* hap*, третья группа -ctxA Kzol * асе* tcpA 'rstA' rstC*toxR" rtxA*rtxC* hap* , обладали различной чувствительностью к диагностическим холерным фагам eltor II, ctx*, ctx~, ФБ. Из 6 штаммов были выделены умеренные фаги, относящиеся к I морфогруппе XII серотипу, а у 5 штаммов - к V морфогруппе II серотипу (таб.1). Все фаги I морфогруппы идентифицировали по литической реакции на индикаторном штамме V. cholerae 0139 серогруппы КМ-152, фаги V морфогруппы не лизировали холерный вибрион 0139 серогруппы. Фаги V. cholerae eltor V морфогруппы инактивировались при температуре 65 °С в течении 30 мин, в то время как фаги I морфогруппы теряли активность при температуре 75 °С. К действию хлороформа фаги V морфогруппы устойчивы, а фаги I морфогруппы инактивируются под его действием, что использовалось нами для их дифференциации. Остальные биологические свойства (влияние цитрата натрия, концентрированных растворов мочевины, специфическое взаимоотношение с клетками холерного вибриона) были сходными с ранее перечисленными свойствами фагов классических холерных вибрионов.

Таблица 1. Характеристика полученных из атоксигенных штаммов V. cholerae eltor умеренных фагов

Холерные фаги Серо-логи-чес-кий тип фага Морфология корпускул фага Характер негативных колоний Титр фага БОН/ мл п* Литиче-ская активность % Некоторые данные одиночного цикла развития фагов Специфичность Устойчивость к

по A.C. Тихо-ненко, 1968 по Ас- ker- шап, 1987 Продолжительность латентного периода (в мин) средний урожай на одну микробную клетку температуре. Полная инактивация °С хлоро- ро-форму моче че-вине 30% Цитрату натрия 3%

Количество активных корпускул фага (%)

2105 11 V AI Округлой формы, полупрозрачные, диаметр 0,4-1 мм 10я 4 63-65 10,80±2,16 + 60-65 98,5 13,5 97,2

4161 ' I FI Округлой формы, полупрозрачные,/" : диаметр 0,3-0,5 мм 17 65-67 7,53*0.78 : / ;"+/// 70-75 - 0 19,6 7100:;/

5244 //XII • I KI ■ Округлой формы,: полупрозрачные, диаметр 0,3-0,5 мм :.7-7/!/ Ші 68-70 /8,35*0,59/ + /.' 70-75 0 16.3 93,5

,5245/ Округлой формы, полупрозрачные, ; / диаметр 0,3-0,5 мм 'Mo*/ ./■'Г:/- / /70-72 8,60.10,49 /./+'/;/ 70-75 0 21,6 100

■:5277':: <7FI7 Округлой формы, полупрозрачные,. //. - диаметр 0.3-0,5 мм {/"27' і: 62-65 9,11 ±0,60/ -:>70г75'::Г 0 '''А®./ ЙІ0077

5766 и V AI Округлой формы, полупрозрачные, диаметр 0,4-1 мм 10' 8 67-70 15,46±0,59 + 60-65 100 15,6 98,4

6119 и V AI Округлой формы, полупрозрачные, диаметр 0,4-1 мм ю8 11 65-67 17,51±0,68 + 65 100 21,3 100

7930 11 V AI Округлой формы, полупрозрачные, диаметр 0,4-1 мм 108 3 60-63 8,80±1,17 + 60-65 99,2 15,7 92,4

9082 11 V AI Округлой формы, полупрозрачные, диаметр 0,4-1 мм 10" 13 65-67 10,53±0,88 + 60-65 100 20,3 97,9

989S XII і : Округлой формы, полупрозрачные, .':/ диаметр 0,3-0,5 мм 'Жм ;r/4v/Z 70-72 ;9,46±Q,49/' .:, Л. 70-75 16,8 95,6

9967 XII ' Vv-EIlV: Округлой формы, полупрозрачный,; диаметр 0,3-0.5 мм ■>;''"■ лш /rS/'/: і / 65«70:;.;: 8,5(U0,59 70-75 */?<Ш/ /:Ї7,4І' 10(1

Примечание: + наличие признака

Выделенный фаг V. mimicus проявлял логическую реакцию на двух индикаторных штаммах V. cholerae 01 серогруппы КМ-199 и V. cholerae 13022-69 037 серо-группы. На втором из них отсутствовала репродуктивная способность у холерных фагов. Это отличие использовалось нами для дифференциации фагов V. mimicus от холерных при исследовании проб воды на вибриофаги.

Применение набора индикаторных штаммов для выделения бактериофагов холерных вибрионов из водных объектов окружающей среды города Ростова-на-Дону. Подобрана специфическая тест-система холерных вибрионов для обнаружения холерных фагов различных морфогрупп. На этой основе осуществлен способ дифференциации холерных фагов I и V морфогрупп (штаммы V. eltor КМ-199 и V. cholerae 0139 КМ-152). Так, если применение штамма V. cholerae 0139 КМ-152 приводит к размножению изолированного на V. eltor КМ-199 фага, то можно с уверенностью утверждать, что данный фаг является филаментозным холерным фагом. Напротив, если в.подобных условиях фаг размножается на V. eltor КМ-199 и подавляется на V. cholerae 0139 КМ-152, то мы имеем дело с холерными фагами других морфогрупп. Такая предварительная характеристика позволяет использовать для серологической идентификации фага не 12 антифаговых холерных сывороток, а только одну определённого серотила.

Созданный нами набор индикаторных штаммов для холерных фагов используется при плановом обследовании на вибриофлору проб воды поверхностных водоёмов и стоков канализационных вод г. Ростова-на-Дону. В период с 2000 по 2007 годы из исследованных 1382 проб воды было выделено 67 холерных фагов. Благодаря тест-системе получены результаты, что очевидно доминирующим типом холерных фагов в период с 2000 по 2007 годы был фаг 12 серотипа I морфогруппы. Штамм V. cholerae eltor 18963, выделенный из проб речной воды в этот же период, был носителем этого типа фага. В данной ситуации контаминация поверхностных водоемов фагами 12 серотипа I морфогруппы сочеталась с циркуляцией неэпидемических фаго-чувствительных и лизогенных штаммов.

Бактериофаги Vibrio cholerae 0139 серогруппы. При изучении 51 штамма холерных вибрионов 0139 серогруппы «Бенгал» на лизогению установили, что продуцируемые ими 40 фагов различаются по морфологии и антигенным свойствам. У

штаммов новой серогруппы встречается носительство фагов двух морфогрупп I и V, либо только I, либо только V. Все исследуемые культуры были условно разделены на 4 группы (таб. 2): в 1-ю группу вошли лизогенные штаммы, фаги которых проявлялись на трёх штаммах (К скокгае еНог 75М, КМ-199, V. скокгае 0139 КМ-152), во 2-ю - штаммы, у которых продукция фагов выявлялась на двух штаммах, кроме V. ско-кгае еНог 75М; 3-ю группу составили штаммы, фаги которых лизировали V. скокгае еЫог 75М и КМ-199 и не лизировали V. скокгае 0139 КМ-152; в 4-ой группе - фаги не были обнаружены.

Таблица 2. Результаты изучения лизогении V. сіюіегае 0139 сербгруппы

Группы штаммов Число штаммов Продукция фагов на штаммах V. скокгае Морфогруппа фагов (по Аскегтап, 1987)

ЄІІОГ 0139 А1 И

75М КМ-199 КМ-152

1 13 + + + + +

2 8 - + + - +

3 6 + + - + -

4 24 - - - - -

Примечание: + наличие признака, - отсутствие признака.

В результате изучения процесса взаимодействия холерных вибрионов «Бенгал» с 25 холерными фагами из коллекции лаборатории был выбран филаментозный холерный фаг с условным названием ФБ («Фаг Бенгал»), который лизировал 13 из 25 музейных токсигенных штаммов V. скокгае 0139 серогруппы. Фаг был выделен из лизогенного штамма холерных вибрионов 0139 - Р-16488.

При использовании фаговых методов (прямого и непрямого фаготипирования) разработан способ внутривидовой дифференциации штаммов V. скокгае 0139. Одновременное применение серотипирования и фаготипирования даст возможность дополнительной характеристики холерных вибрионов 0139 серогруппы «Бенгал», выделяемых из клинического материала.

Биологическая характеристика бактериофагов парагемолитических вибрионов. Из 184 лизогенных штаммов парагемолитических вибрионов были выделены 19 фагов I, III, IV, V морфогрупп. Негативные колонии фагов парагемолитических вибрионов были округлой формы, мутные с плотным центром, диаметром 0,5-0,7 мм или полупрозрачные с ровными краями и имели диаметр 0,5-2 мм. По серологическим свойствам фаги отнесены к I, III, IV, V, VI, VIII и XI серогруппам (таб.3). Фаги были специфичными, они не лизировали представителей микроорганизмов семейств Vibrionaceae, Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae. Фаги парагемолитических вибрионов III-V морфогрупп при температуре 70°С инактивируются в течении 30 мин, в то время как фаги I морфогруппы теряют активность при температуре 80°С. К действию хлороформа фаги III-V морфогрупп устойчивы, в то время как фаги I морфогруппы инактивируются. В 3% растворе цитрата натрия выживаемость фагов наблюдалась в пределах 27,2-98,9% при экспозиции 18-20 часов. Пребывание фагов в растворе 30% мочевины приводило к снижению числа фаговых корпускул до 0,01-2,6%. Диапазон литической активности фагов на штаммах парагемолитических вибрионов варьировал и у различных фагов составлял 0,8-82,6%.

В результате исследования для первичной характеристики и дифференциации свежевыделенных фагов парагемолитических вибрионов предложены два индикаторных штамма. Штамм V. parahaemofyticus КМ-184 лизировался фагами четырёх морфогрупп в отличие от штамма V. parahaemofyticus КМ-97, который проявлял чувствительность к фагам трёх морфогрупп, исключая фаги I морфогруппы. Впервые разработан способ дифференциации бактериофагов парагемолитических вибрионов III, IV, V морфогрупп от бактериофагов I морфогруппы.

Усовершенствование схемы фаготипирования V. parahaemofyticus. Пересмотрена схема фаготипирования парагемолитических вибрионов (таб.4).

Таблица 3. Характеристика биологических свойств фагов парагемолитических вибрионов

№ фагов Морфология корпускул фага Серологический тип фага Специфичность Устойчивость к Литичес-кая активность % Некоторые данные одиночного цикла развития фагов

температуре. Полная инактивация °С Хлороформу Мочевине 30% Цитрату натрия 3% Продолжительность латентного периода (в мин) средний урожай на одну микробную клетку

По A.C. Тихо-нен-ко, 1968 По Ack-er-mann, 1987 Количество активных корпускул фага (%)

ЖЬ^ъ: ^FTU'- 75-80 0 Д'.одідд. ЖШЇ і?,-; 70-75 1,98±1.16

240 ЇЙ?-' Ь' 70-75?, ОДІ .Vi 70-75 * 1,77x2.06

75-S0 Д 0,35 76.3 ■ '0,8: -s^l 70-75 2.08*2.16

75-8Ü -.■so.-:; '■■■.■■■ 0,06 1,65±0,88

FI Ж-'.-/, v!Ї-0' 0,15 :^.;78,5; Д . Д vi. І70-75 -''¿sv 1,55±0,78

616 Ill С III + 65-70 100 0,81 64,7 23,5 68-70 2,23±0,49

1154 ill С III + 65-70 98,7 1,6 97,1 81,7 68-70 2,33±0,57

109 IV Bl IV + 60-65 99,4 0,87 76,8 69,4 65-70 1,86±0,59

3256 IV ВІ IV + 60-65 100 0,37 98,9 49,6 68-70 1,68±0,48

155 IV ВІ IV + 65-70 97,6 2,6 96,7 80,3 62-67 2,15±0,69

2996 IV ВІ IV + 60-65 100 0,12 98,7 37,6 60-65 2,61±0,60

7 V А V + 65-70 100 0,04 44,3 48,8 65-70 2,04±1,58

23 V А V + 65-70 100 0,01 57,7 35,7 67-70 2,14±0,59

101 V А V + 65-70 99,3 1,3 77,4 48,3 68-70 2,34±0,47

3600 V А VI + 60-65 97,7 0,07 98,3 28,6 65-67 2,51±0,68

824 V А VI + 65-70 98,5 0,67 88,6 31,7 .60-65 1,98±2,26

227 V А VIII + 65-70 100 0,45 94,2 20 65-67 2,53±0,58

507 III С XI + 65-70 100 0,08 56,7 38,8 65-70 2,35±0,69

536 III С XI + 60-65 100 0,31 98,8 82,6 65-70 1 2,55±0,59

Примечание: + наличие признака

Таблица 4. Схема фаготипнрования парагемолитических вибрионов

Фаготип Типирующие фаги Количество штаммов данного фаготипа

А(1154) В (507) С (536) О (3256)

1 (АВСО) + + + + 17/14,0

2 (ВСБ) - + + + 3/2,5

3(ВС) - + + - 3/2,5

4 (С) - - + - 15/12,4

5 (АВС) + + + - 11/9,1

6 (АС) + - + - 36/29,8

7 (АСЭ) + - + + 13/10,7

8 (АВИ) + + - + 4/3,3

9 (АО) + - - + 2/1,7

10 (В) - + - - 8/6,6

Не типир. - - - - 9/7,4

Примечаиие:«+» наличие признака, «-» отсутствие признака.

Числитель - количество лизирующихся культур в абсолютных цифрах, знаменатель - %.

Установлено, что в процессе хранения титр типирующего фага 109 снижался с 109 БОЕ/мл до 105 БОЕ/мл (через 6 месяцев хранения). Поэтому при определении фа-готипа парагемолитических вибрионов фаг 109 был заменён более стабильным фагом 1154. Благодаря введению в схему типировапия нового фага 1154 регистрировались дополнительные шесть вариантов литических реакций, что свидетельствовало о целесообразности замены одного фага другим. Анализ встречаемости фаготипов среди парагемолитических вибрионов различных серогрупп не выявил корреляции.

В итоге проделанной работы усовершенствована схема фаготипнрования парагемолитических вибрионов. Расширение её с четырёх до десяти фаготипов повысило типируемость вибрионов с 48,4 % до 92,6 %. Схема нашла применение при изучении 148 штаммов парагемолитических вибрионов, полученных из г. Бердянска (1984-1987 гг.). Установлено, что 92 штамма (62,1%) тшшровались фагами и относились к 1 фа-готипу. При изучении 38 штаммов, полученных из г. Владивостока (1997 г.) было показано, что типировалось 14 штаммов (36,8 %). При этом типирующиеся штаммы представлены 1, 4, 5, 7, 10 фаготипами.

Таблица 5. Идентификация и дифференциация бактериофагов патогенных бактерий

Вид бактериофага Идентификация Дифференциация

Индикаторные штаммы Мор-фогруп-па Серог-руппа Чувстви-тель-ность групп фагов

V. сИокгае еНог 75М V. сИокгае еНог КМ-199 V. сИокгае 0139 КМ-152 V. сИокгае сИокгае 145 V. сИокгае 037 1322-69 V. рагаЬаето1уИ-сив V. теИсИ-ткохИ КМ-185

КМ-184 КМ-97 Хлороформ {=7 0° С

V. сИокгае 01 + + + + - - - - I XII + -

+ + - + - - - - И-У 1-Х1 - +

V. сИокгае ОВ9 + + + + - - - - I XII + -

+ + - + - - - - V II - +

V. рагаИаето1у-И-сиз - - - - - + - - I I + -

- - - - - + + - III, IV, V Ш-Х1 - +

V. а1$по1уИси5 - - - - - + + - III, IV, V IV, VI, VIII, XI - +

V. те1$скткоуИ - - - - - - - + IV I - +

V. титсиз - + - - + - - - I XII + -

Примечание: + наличие признака, - отсутствие признака

Разработка схемы идентификации и дифференциации бактериофагов холерных н парагемолитических вибрионов. Отмеченные чёткие таксономические показатели, полученные при сравнительном изучении бактериофагов патогенных вибрионов, легли в разработанную нами схему идентификации и дифференциации, включающую признаки их отличия (таб.5): а) специфичность литического действия, подтверждаемая на соответствующих видах микроорганизмов, применение тест-штаммов вибрионов; б) характерная морфология бактериофагов в электронном микроскопе - определение морфогруппы; в) отсутствие антигенного родства с бактериофагами других видов; г) устойчивость, либо чувствительность к хлороформу и повышенной температуре. Представленные приемы позволяют характеризовать свежевы-деленные фаги и обеспечат пополнение Базы данных «Коллекция бактериофагов и тест-штаммов патогенных для человека вибрионов» новыми бактериальными вирусами.

Знание биологических особенностей фагов патогенных вибрионов имеет не только теоретическое, но и важное практическое значение, так как способствует созданию диагностических, лечебных и профилактических препаратов, изучению вопросов генетики возбудителей холеры и пищевых токсикоинфекций.

выводы

1. Биологические свойства бактериофагов холерных и парагемолитических вибрионов характеризуются видовыми различиями. При этом общей биологической особенностью у них является литическая специфичность при взаимодействии с клетками хозяев, которая является важной составляющей препаратов фага для лабораторной диагностики возбудителей холеры и пищевых токсикоинфекций, вызванных парагемолитическими вибрионами.

2. Холерные бактериофаги, выделенные из атоксигенных лизогенных штаммов с различными гено- и фенотипическими свойствами, представлены двумя самостоятельными морфогруппами (I, V) и серотипами (II, XII), различающимися устойчивостью к повышенной температуре, хлороформу и спектром литической активности.

3. Прямое и непрямое фаготипирование токсигенных штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы, сходных по биологическим признакам, позволяет проводить их внутривидовую дифференциацию.

4. Разработана тест-система индикаторных штаммов для морфологической идентификации бактериофагов парагемолитических вибрионов.

5. Усовершенствована схема фаготипирования парагемолитических вибрионов, которая позволяет дифференцировать 10 фаготипов у 92,6% штаммов.

6. Предложенный набор фагочувствительных штаммов V. cholerae Ol (ctx+tcp+, ctx" tcp*), V. cholerae 0139 серогруппы (ctx+tcp*) для выделения холерных фагов при мониторинге окружающей среды на вибриофлору позволяет обнаруживать бактериофаги. Морфо- и серогруппы изолированных холерных фагов коррелируют с обнаруженными фагами в лизогенных штаммах холерных вибрионов эльтор, циркулирующих в реках в эпидемический сезон.

7. Обнаружена репродуктивная способность фагов V. mimicus на фагочувствительном штамме холерных вибрионов V.cholerae 13022-69 037 серогруппы, что используется для их отличия от холерных фагов при исследовании проб воды на вибриофаги.

8. Для исследовательских целей и решения прикладных задач составлена унифицированная схема идентификации и дифференциации бактериофагов патогенных вибрионов, что повышает возможность определения видовой принадлежности фагов и сравнения с фагами, зарегистрированными в Базе данных «Коллекция бактериофагов и тест-штаммов патогенных для человека вибрионов».

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кудрякова, Т.А. Совершенствование схемы фаготипирования парагемолитических вибрионов/ Т.А. Кудрякова, Л.Д. Македонова, Г.В. Качкина, С.Р. Саямов, Н.Е. Гаевская, A.A. Алиева// «Холера»: Матер. VIII Рос. науч.-практ. конф. по пробл. - Ростов н/Д, 2003. - Вып. №16. - С.206-207.

2. Кудрякова, Т.А. Бактериофаги патогенных вибрионов и их применение/ Т.А. Кудрякова, Ю.М. Ломов, Б.Н. Мишанькин, Л.Д. Македонова, Г.В. Качкина, Л.В. Романова, С.Р. Саямов, Н.Е. Гаевская // «Холера»: Матер. VIII Рос. науч.-практ. конф. по пробл. - Ростов н/Д, 2003. - Вып. №16. - С.208-210.

3. Безсмертный, В.Е. Характеристика культур холерных вибрионов 01 и 0139, изолированных из объектов окружающей среды на территории Российской Федерации в 2003 году/ В.Е. Безсмертный, С.М. Иванова, Г.В. Титов, JI.C. Подосиннико-ва, Б.Л. Мазрухо, Т.А. Кудрякова, И.С. Шестиалтынова, В.Д. Кругликов, В.В. Лобанов, Л.М. Смоликова, Н.Е. Гаевская // «Холера и патогенные для человека вибрионы»: Матер, пробл. комиссии. - Ростов н/Д, 2004. - Вып. №17. - С.27-31.

4. Смоликова, JI.M. Характеристика атоксигенных вибрионов эльтор, выделенных от людей на территории России и стран Ближнего зарубежья/ Л.М. Смоликова, Е.В. Монахова, Т.А. Кудрякова, Л.С. Подосинникова, Р.В. Писанов, Н.В. Божко, Н.К. Михась, E.H. Голенищева, Е.М. Санамянц, Л.Д. Македонова, Г.В. Качкина, Н.Г. Пузанова, Н.Е. Гаевская // «Холера и патогенные для человека вибрионы»: Матер, пробл. комиссии. - Ростов н/Д, 2004. - Вып. №17. - С.65-67.

5. Кудрякова, Т.А. Бактериофаги патогенных вибрионов: идентификация и дифференциация/ Т.А. Кудрякова, Ю.М. Ломов, Н.Е. Гаевская, Л.Д. Македонова, Г.В. Качкина, Л.В. Романова, С.Р. Саямов, A.A. Алиева// «Холера и патогенные для человека вибрионы»: Матер, пробл. комиссии. - Ростов н/Д, 2004. - Вып. №17. -С.73-75.

6. Гаевская, Н.Е. Характеристика холерных бактериофагов in vivo/ Н.Е. Гаевская, Т.А. Кудрякова, Л.Д. Македонова, Г.В. Качкина, A.A. Алиева// Фундаментальные исследования. - 2004. - № 1. - С.44-45.

7. Гаевская, Н.Е. Отбор бактериофагов для лечения экспериментальной холеры, вызванной классическими холерными вибрионами/ Н.Е. Гаевская, Т.А. Кудрякова, Л.Д. Македонова, Г.В. Качкина, A.A. Алиева, С.Р. Саямов// Современные наукоемкие технологии. - 2004. - № 3. - С. 11-15.

8. Гаевская, U.E. Характеристика умеренных фагов, выделенных из атоксигенных штаммов холерных вибрионов эльтор, изолированных от людей/ Н.Е. Гаевская// Особо опасные инфекции - 2005.-№90 - С.40-43. (Из перечня ВАК)

9. Гаевская, Н.Е. Выявление и первичная идентификация парагемолитических фагов по морфологическому признаку/ Н.Е. Гаевская, Т.А. Кудрякова, Л.Д. Македонова, Г.В. Качкина, A.A. Алиева// «Холера и патогенные для человека вибрионы»: Матер. пробл. комиссии. - Ростов н/Д, 2005. - Вып. №18. - С.104-107.

10. Гаевская, Н.Е.Индикаторные штаммы Vibrio parahaemolyticus для обнаружения и первичной идентификации парагемолитических фагов/ Н.Е. Гаевская, Т.А. Кудрякова, Л.Д. Македонова, Г.В. Качкииа, A.A. Алиева, С.Р. Саямов // Клиническая лабораторная диагностика. - 2006. - № 1. - С.39-40. (Из перечня ВАК)

11. Патент на изобретение № 2268942 РФ Способ внутривидовой дифференциации Vibrio cholerae 0139 / Т.А. Кудрякова, Н.Е. Гаевская, Л.Д. Македонова, Г.В. Кач-кина. - Опуб. 27.01.2006. - Бюл. №03

12. Патент на изобретение № 2290445 РФ Способ дифференциации бактериофагов парагемолитических вибрионов III, IV, V морфогрупп от филаментозных бактериофагов I морфогруппы / Т.А. Кудрякова, Н.Е. Гаевская, Л.Д. Македонова, Г.В. Качкина, С.Р. Саямов. - Опуб. 27.12.2006. - Бюл. №36

13. Ломов, Ю.М. Применение набора индикаторных штаммов для выделения бактериофагов холерных вибрионов из водных объектов окружающей среды г. Ростова-на-Дону/ Ю.М. Ломов, Т.А. Кудрякова, Л.Д. Македонова, Г.В. Качкина, С.Р. Саямов, Н.Е. Гаевская // «Холера и патогенные для человека вибрионы»: Матер, пробл. комиссии. - Ростов н/Д, 2008. - Вып. №21,- С.91-93.

14. Ломов, Ю.М. Дифференциация бактериофагов патогенных вибрионов/ Ю.М. Ломов, Т.А. Кудрякова, Л.В. Романова, Л.Д. Македонова, Г.В. Качкина, С.Р. Саямов, Н.Е. Гаевская // Соврем, технологии в реализ. глобал. стратегии борьбы с инф. болезнями на территории госуд.-участн. Содружества Независимых Государств: Матер. IX Межгос. науч.-практ. конф. госуд.-участн. СНГ - Волгоград, 2008.-С.109.

15. Гаевская, Н.Е. Чувствительность парагемолитических бактериофагов к действию физических и химических факторов/ Н.Е. Гаевская, Т.А. Кудрякова, Г.В. Качкина, Л.Д. Македонова // Обмен веществ при адаптации и повреждении (дни мед. лаб. диагностики): Матер. IX Межвуз. конф. с междунар. участ. - Ростов н/Д, 2010. -С.31-32.

16. Гаевская, Н.Е. Влияние физических и биологических агентов на лизогенные штаммы холерных вибрионов 0139 серогруппы/ Н.Е. Гаевская// Современные технологии обеспечения биол. безопасности: Матер, науч.-практ. школы-конф.

молод, ученых и специалистов науч.-исслед. организаций Роспотребнадзора -Оболенск, 2010 - С.235-237.

17. Романова, JI.B. RAPD-анализ ДНК-содержащих бактериофагов патогенных вибрионов/ JI.B. Романова, Т.А. Кудрякова, Т.Н. Бородина, Л.Д. Македонова, Г.В. Качкина, Н.Е. Гаевская, Б.Н. Мишанькин// «Холера и патогенные для человека вибрионы»: Матер, пробл. комиссии. - Ростов н/Д, 2010. - Вып. №23. - С.64-66.

18. Голенищева, E.H. Оценка чувствительности генетически охарактеризованных штаммов парагемолитических вибрионов к гомологичным бактериофагам / E.H. Голенищева, Л.М. Смоликова, Т.А. Кудрякова, А.Е. Либинзон, Н.В Божко, O.A. Шалу, Е.В. Монахова, Г.В. Качкина, О.С. Чемисова, Е.М. Санамянц, Н.Е. Гаевская, O.A. Рыковская, М.М. Сагакянц, Л.Д. Македонова// «Холера и патогенные для человека вибрионы»: Матер, пробл. комиссии. - Ростов н/Д, 2010. - Вып. №23. - С.70-73.

19. Гаевская, Н.Е. Характеристика ранее неизвестных бактериофагов Vibrio metschni-kovii/ Н.Е. Гаевская, Т.А. Кудрякова, Л.Д. Македонова, Г.В. Качкина, Л.В. Романова// Обмен веществ при адаптации и повреждении (дни мед. лаб. диагностики): Матер. IX Межвуз. конф. с междунар. участ. - Ростов н/Д, 2011. - С.37-39.

20. Гаевская, Н.Е. Биологические свойства и диагностическое применение холерных и парагемолитических бактериофагов/ Н.Е. Гаевская// Современные технологии обеспечения биол. безопасности: Матер, науч.-практич. школы-конф. молод, ученых и специалистов науч.-исслед. организаций Роспотребнадзора - Оболенск, 2011 -С.169-172.

21. Гаевская, Н.Е. Умеренные бактериофаги парагемолитических вибрионов: специфичность и литическая активность/ Н.Е. Гаевская, Т.А. Кудрякова, Л.Д. Македонова, Г.В. Качкина, Л.М. Смоликова, О.С. Чемисова, E.H. Голенищева // «Холера и патогенные для человека вибрионы»: Матер, пробл. комиссии. - Ростов н/Д, 2011. - Вып. №24. - С. 136-138.

22. Гаевская, Н.Е. Идентификация бактериофагов Vibrio mimicus/ Н.Е. Гаевская, Т.А. Кудрякова, Е.П. Авдеева, Л.Д. Македонова, Г.В. Качкииа// Клиническая лабораторная диагностика. -2011. -№ 3. - С.50-52. (Из перечня ВАК)

23. Гаевская, Н.Е. Применение фагов парагемолитических вибрионов в лабораторной диагностике заболеваний, вызванных галофильными вибрионами / Н.Е. Гаевская,

Т.А. Кудрякова, Л.Д. Македонова, Г.В. Качкина // Матер. IV Ежегодного Всерос. Конгресса по инфекционным болезням. - Москва, 2012. - Том 10, приложение №1. - стр. 92.

24. Гаевская, Н.Е. Внутривидовая дифференциация холерных вибрионов 0139 серо-группы фаговыми методами /Н.Е. Гаевская, Т.А. Кудрякова, Л.Д. Македонова, Г.В. Качкина // Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения: Матер, науч.-практ. конф. Роспотребнадзора - Нижний Новгород, 2012. - стр. 5761.

25. Гаевская, Н.Е. Диагностические бактериофаги парагемолитических вибрионов / Н.Е. Гаевская, Т.А. Кудрякова, Л.Д. Македонова, Г.В. Качкина // Отечественная эпидемиология в XXI веке: приоритетные направления развития и новые технологии в диагностике и профилактике болезней человека: Труды Юбилейной Всерос. науч. конф. - Санкт-Петербург, 2012. - С. 140.

26. Гаевская, Н.Е. Комплекс биологических признаков для идентификации и дифференциации бактериофагов патогенных для человека вибрионов / Н.Е. Гаевская, Т.А. Кудрякова, Л.Д. Македонова, Г.В. Качкина // Актуальные проблемы болезней общих для человека и животных - Ставрополь, 2012. - С. 118-119.

27. Кудрякова, Т.А. Характеристика коллекции бактериофагов парагемолитических вибрионов / Т.А. Кудрякова, Н.Е. Гаевская, Л.Д. Македонова, Г.В. Качкина // «Холера и патогенные для человека вибрионы»: Матер, пробл. комиссии. - Ростов н/Д, 2012. - Вып. №25. - С.140-142.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ

СТХф - умеренный нитевидный фаг, кодирующий холерный токсин и «остров пато-генности»

УРЬр - умеренный нитевидный фаг, кодирующий биосинтез токсинкорегулируемых

пилей адгезии с1хАВ - ген, кодирующий биосинтез холерного токсина

/ср А - ген, кодирующий биосинтез основной субъединицы токсинкорегуруемых пи-

лей адгезии СУФ - спонтанно умеренные фаги ДЦФ - дифференциально-диагностический фаг

ДГФ - «диагностические галофильные фаги» - специфический диагностический фаг

для идентификации галофильных вибрионов ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ГКПБ «М» - Государственная коллекция патогенных бактерий ФКУЗ Российский

научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

«Микроб», г. Саратов БОЕ/мл - бляшкообразующие единицы фага в 1 мл м.к. — микробные клетки ф.к. — фаговые корпускулы н/т — не типируется штамм ф/р — фагорезистентный штамм м/гр - морфологическая группа ОКИ - острые кишечные инфекции ООС - объекты окружающей среды ОЖКЗ - острые желудочно-кишечные заболевания МЧС - противочумная станция ФБ — фаг «Бенгал»

ДРТ - дифференциальный рабочий титр

й/й - прямой термостабильный гемолизин

/гй - родственный прямому термостабильному гемолизину

Кр — феномен Канагава: термостабильный прямой гемолизин обуславливает лизис

эритороцитов человека и кролика на среде Вагатцума иге — уреазная активность

ГАЕВСКАЯ НАТАЛЬЯ ЕВГЕНЬЕВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИОФАГОВ ХОЛЕРНЫХ И ПАРАГЕМОЛИТИЧЕСКИХ

ВИБРИОНОВ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано к печати 20.02.13. Формат 60x84/16. Печать офс. Бум.офс. Гарнитура Times. Усл.-юд. л. 1,7.Усл.-печ. л. 1,6. Тираж 100 экз. Захаз 7iQ

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательства ВГСПУ «Перемена» 400131, Волгоград, пр. им. Ленина, 27

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Гаевская, Наталья Евгеньевна, Волгоград

Федеральное казённое учреждение здравоохранения «Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

На правах рукописи

ГАЕВСКАЯ НАТАЛЬЯ ЕВГЕНЬЕВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИОФАГОВ ХОЛЕРНЫХ И ПАРАГЕМОЛИТИЧЕСКИХ

ВИБРИОНОВ

03.02.03 - микробиология

СО

СО ДИССЕРТАЦИЯ

см

на соискание ученой степени Ю ТГ кандидата медицинских наук

со 8

ч- Ю

О Я

см £

Научный руководитель:

О

доктор медицинских наук, Т.А. Кудрякова

Ростов-на-Дону 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................................................7

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................................16

1.1. Бактериофаги патогенных вибрионов и их применение................................................................................................................16

1.1.1. Бактериофаги холерных вибрионов............................................21

1.1.2. Бактериофаги Vibrio parahaemolyticus и Vibrio algi-nolyticus........................................................................................................33

1.1.3. Бактериофаги других видов вибрионов (Vibrio mimicus, Vibrio vulnificus, Vibrio fluvialis, Vibrio metschnikovii)....................................................................................................39

ГЛАВА! МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ......................................................................................42

2.1 Материалы......................................................................................................42

2.1.1. Бактериальные штаммы..........................................................................42

2.1.2. Бактериофаги....................................................................................................45

2.1.3. Сыворотки............................................................................................................48

2.1.4. Питательные среды....................................................................................48

2.2. Методы................................................................................................................48

2.2.1. Методы выделения фагов из культур патогенных вибрионов............................................................................................................48

2.2.2. Метод выделения фагов из проб воды поверхностных водоёмов и сточных вод............................................................49

2.2.3. Метод размножения бактериофагов............................................49

2.2.4. Метод получения антифаговой сыворотки..........................50

2.2.5. Метод изучения серологических свойств бактериофагов............................................................................................................50

2.2.6. Изучение морфологии негативных колоний............ 51

2.2.7.. Изучение строения корпускул фага...................... 51

2.2.8. Метод изучения диапазона литической активности и 51

специфичности фагов........................................

2.2.9. Метод изучения одиночного цикла развития фага.... 51

2.2.10. Методы определения устойчивости фагов патогенных бактерий к воздействию различных факторов............................................................... 51

2.2.11. Метод фаготипирования холерных и парагемолити-ческих вибрионов............................................ 52

2.2.12. Методы статистической обработки результатов........ 53

ГЛАВАЗ. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ

СВОЙСТВ БАКТЕРИОФАГОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ

ТОКСИГЕННЫХ И АТОКСИГЕННЫХ ШТАММОВ

ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ OI СЕРОГРУППЫ........... 54

3.1. Поиск штаммов-продуцентов фагов среди холерных вибрионов классического биовара и характеристика продуцируемых бактериофагов........................... 54

3.2. Умеренные фаги, выделенные из атоксигенных штаммов холерных вибрионов биовара эльтор, изолированных от людей........................................ 65

3.3. Литическая активность холерных бактериофагов эльтор в отношении холерных вибрионов OI и 0139 серогрупп....................................................... 73

3.3.1. Сравнение свойств холерных бактериофагов с фагами Vibrio mimicus.............................................. 78

3.4 Применение набора индикаторных штаммов для выделения бактериофагов холерных вибрионов из водных объектов города Ростова-на-Дону................... 81

ГЛАВА4. БАКТЕРИОФАГИ VIBRIO CHOLERAE OI39 СЕРОГРУППЫ............................................................... 85

4.1. Выявление спонтанной фагопродукции у штаммов V. cholerae OI39 на новых индикаторных штаммах OI и 0139 серогрупп........................................ 85

4.2. Внутривидовая дифференциация штаммов V. ско1егае 0139 серогруппы фаговыми методами.................................................................................. 87

ГЛАВА 5. БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИОФАГОВ ПАРАГЕМОЛИТИЧЕСКИХ ВИБРИОНОВ..................................................................... 92

5.1. Изучение биологических свойств фагов парагемоли-тических вибрионов различного происхождения...... 92

5.2. Способ дифференциации бактериофагов парагемо-литических вибрионов различных морфогрупп...... 96

5.3. Усовершенствование схемы фаготипирование V. рагакаето1уйст.............................................. 98

ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА СХЕМЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ БАКТЕРИОФАГОВ ХОЛЕРНЫХ И

ПАРАГЕМОЛИТИЧЕСКИХ ВИБРИОНОВ................. 107

6.1. Критерии первичной характеристики бактериофагов

при их идентификации...................................... 107

6.2. Дифференциация бактериофагов холерных и па-рагемолитических вибрионов..................................................................109

ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................... 113

ВЫВОДЫ........................................................................... 120

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ...................... 122

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ

СТХф — умеренный нитевидный фаг, кодирующий холерный токсин и «остров патогенности»

УР1(р - умеренный нитевидный фаг, кодирующий биосинтез токсинкорегу-

лируемых пилей адгезии с1х АВ - ген, кодирующий биосинтез холерного токсина

Iср А - ген, кодирующий биосинтез основной субъединицы токсинкорегуру-

емых пилей адгезии СУФ - спонтанно умеренные фаги ДЦФ - дифференциально-диагностический фаг

ДГФ - «диагностические галофильные фаги» - специфический диагностический фаг для идентификации галофильных вибрионов ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ГКПБ «М» - Государственная коллекция патогенных бактерий ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт Роспо-требнадзора «Микроб», г. Саратов БОЕ/мл - бляшкообразующие единицы фага в 1 мл м.к. - микробные клетки ф.к. - фаговые корпускулы н/т - не типируется штамм ф/р - фагорезистентный штамм м/гр - морфологическая группа ОКИ - острые кишечные инфекции ООС - объекты окружающей среды ОЖКЗ - острые желудочно-кишечные заболевания ПЧС - противочумная станция ФБ - фаг «Бенгал»

ДРТ - дифференциальный рабочий титр

1(111 - прямой термостабильный гемолизин

Кк - родственный прямому термостабильному гемолизину

Кр - феномен Канагава: термостабильный прямой гемолизин обуславливает

лизис эритороцитов человека и кролика на среде Вагатцума иге - уреазная активность

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Продолжающаяся седьмая пандемия холеры привлекла пристальное внимание исследователей к проблеме патогенных для человека вибрионов. Вспышка холеры, обусловленная холерными вибрионами 0139 серогруппы, сходство этого возбудителя с вибрионами эльтор объясняют повышенное внимание исследователей к новому эпидемическому фактору холеры (Моск-витина Э.А. с соавт. 2011; Иванова С.М. с соавт., 2011). Бактериофаги являются постоянным спутником патогенных вибрионов, а их присутствие в клетках бактерий приводит к появлению новых свойств (Остроумова Н.М. с соавт., 1971 а, б; Милютин В.Н. с соавт., 1980; Остроумова Н.М. с соавт., 1993 б; Смирнова Н.И. с соавт., 1999; Щелканова Е.Ю. с соавт., 2001; Еро-шенко Г.А. с соавт., 2000, 2003; Ильина Т.С., 2003; Davis В.М. et al., 2003). Детальное изучение механизмов взаимоотношения бактериофагов с клеткой хозяина имеет не только теоретическое, но и важное практическое значение (Сомова А.Г., 1968; Дрожевкина М.С., 1974; Остроумова Н.М. с соавт., 1986 а, б; Кудрякова Т.А. с соавт., 2003 б, в; Faruque S.M. et al., 2003, 2005). Актуальность проблемы заключается в выявлении общих закономерностей строения биологических структур бактериофагов, которые затем используют для их определения и классификации.

Наиболее важным этапом в лабораторной диагностике патогенных вибрионов является их выделение и идентификация (Ломов Ю.М. и др., 1994 а; Данилкина Е.Б., 1995; Онищенко Г.Г. с соавт., 2000; МУК 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры»).

В настоящее время из фагов патогенных вибрионов наиболее изучены холерные бактериофаги, которые широко используются для диагностики и дифференциации возбудителя холеры (Быстрый Н.Ф., 1974; Дрожевкина М.С., Арутюнов Ю.И., 1979; Кудрякова Т.А. с соавт., 1999; Онищенко Г.Г. с соавт., 2000; Саяпина Л.В. с соавт., 2001; Безсмертный В.Е. с соавт., 2005; Ломов Ю.М. с соавт., 2008;).

Вместе с тем, сохраняет свою актуальность фагодиагностика V. cholerae 0139 серогруппы «Бенгал», так как диагностические фаги холерных вибрионов непригодны для идентификации этого вида возбудителя.

Кроме того, недостаточно разработано применение бактериофагов в лабораторной диагностике парагемолитических вибрионов. Крупные вспышки пищевых токсикоинфекций, вызванные этими вибрионами, были зарегистрированы в 1990-2000 годах в г. Владивостоке, в странах Юго-Восточной Азии, США, Канаде, Перу (Маслов Д.В., 1997; Wong Н.С. et al. 2000; Williams T.L. et al., 2004; Nair G.B. et al., 2007; Boyd F., Fidelma et al., 2008).

В последние годы накопились сведения о фагах парагемолитических и альгинолитических вибрионов ( Кудрякова Т.А. и др., 2002, 2003 a; Chang В. et. al., 1998, 2002; Nasu H. et al., 2000; Tetsuya I. et al., 2001). Создана схема фаготипирования парагемолитических вибрионов (Кудрякова Т.А. и др., 1993 б; Хайтович А.Б. и др., 1997; Гальцева Г.В. и др., 1997). Однако фаготипиро-вание парагемолитических вибрионов показало распространение вибрионов, дающих типы литических реакций, не укладывающихся в существующую схему фаготипирования, в связи с чем необходимо её совершенствование. Для первичной идентификации различных по морфологической структуре фагов необходимо иметь набор фагочувствительных штаммов.

До настоящего времени остается нерешенной проблема идентификации и дифференциации большой группы бактериофагов патогенных для человека вибрионов (V. cholerae и V. parahemolyticus). Вместе с тем, для исследовательских целей и решения прикладных задач важно учитывать признаки бактериофагов, позволяющие выявить сходство и различия между ними.

Наличие Центра по патогенным вибрионам ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора представителей различных видов вибрионов сделало реальным проведение среди них поиска продуцентов ранее неизвестных фагов.

Цель работы

Совершенствование идентификации бактериофагов и их применение для внутривидовой дифференциации холерных и парагемолитических вибрионов.

Задачи исследования

1. Выделение бактериофагов из лизогенных штаммов холерных и других патогенных вибрионов.

2. Расширение набора индикаторных штаммов патогенных вибрионов (холерных, парагемолитических) для обнаружения бактериофагов различных морфологических групп.

3. Характеристика биологических свойств бактериофагов патогенных видов вибрионов.

4. Дифференциация штаммов V. cholerae 0139 серогруппы фаговым методом.

5. Усовершенствоние схемы фаготипирования V. parahaemolyticus.

6. Разработка схемы идентификации и дифференциации бактериофагов патогенных вибрионов.

Научная новизна работы

Выявлены умеренные фаги у различных видов патогенных вибрионов (V. cholerae 01, 0139 серогрупп, V. parahaemolyticus, V. mimicus, V. alginolyti-cus), и было проведенно сравнение биологических свойств, позволило использовать их для научных исследований и в диагностике возбудителей ОКИ.

Впервые разработана внутривидовая дифференциация штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы путём прямого и непрямого фаготипирования. Получен патент на изобретение «Способ внутривидовой дифференциации Vibrio cholerae 0139» (№ 2268942 от 27.01.2006 г.). Использование предлагаемого способа позволяет с помощью индикаторных штаммов КМ-199 и

КМ-152 проводить фаготипирование V. cholerae 0139 серогруппы, получая при этом дополнительные характеристики холерных вибрионов, выделяемых из клинического материала. Впервые обнаружены бактериофаги V. mimicus по биологическим свойствам сходные с холерными фагами. Фаги V. mimicus были депонированы в ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора под № ФК-85 и № ФК-98.

Усовершенствована схема фаготипирования парагемолитических вибрионов, что позволило определить среди них 10 фаготипов вместо 4-х известных ранее, и повысить эффективность типирования штаммов с 48,4 % до 92,6 %.

Впервые разработан способ дифференциации бактериофагов парагемолитических вибрионов III, IV, V морфогрупп от бактериофагов I морфогруп-пы (Патент №2290445 от 27.12.2006 г.).

Впервые разработана общая схема идентификации, позволяющая выявить существенные различия между фагами некоторых видов патогенных вибрионов. Дополнена коллекция охарактеризованных фагов и индикаторных штаммов патогенных вибрионов. Составлен 4 выпуск Каталога бактериофагов и тест-штаммов патогенных для человека вибрионов и иерсиний, который одобрен Ученым советом и утверждён директором ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора (01.03.11 г., протокол №1) и опубликован в виде реферата в Информационном выпуске №24 «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов-на-Дону, 2011). Получено свидетельство о регистрации в Реестре баз данных Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам базы данных «Коллекция бактериофагов и тест-штаммов патогенных для человека вибрионов» №2010620549 от 24.09.2010.

Теоретическая и практическая значимость

Новые сведения о свойствах большой группы бактериофагов различных видов патогенных вибрионов расширяют наши познания о биологическом разнообразии вирусов бактерий. Анализ полученных данных позволяет установить не только их общность как представителей единого семейства бактериофагов, но и различия, отражающие дивергенцию этих видов в процессе эволюции. Способность генетических элементов бактериофагов включаться в клетки бактерий, делает их хорошей моделью для изучения геномной пластичности вибрионов. Диагностические бактериофаги пригодны для идентификации вибрионов, а также для изучения физиологических свойств и поверхностных структур фагочувствительных штаммов, установления биологической эффективности любого воздействия.

Так как своевременное определение вида бактериофага крайне важно при его выделении из материала от людей больных холерой, острыми токси-коинфекциями, гастроэнтеритами или из объектов окружающей среды, проведение исследования осуществляется с соблюдением следующих этапов:

- использование специфических индикаторных штаммов холерных вибрионов, пригодных для выделения холерных бактериофагов (V. еЬог КМ-199, V. Мегае 0139 КМ-152);

- использование системы индикаторных штаммов, позволяющей проводить первичную идентификацию холерных бактериофагов;

- использование депонированных тест-штаммов V. рагакаето1уИсиз КМ-97, КМ-184 для первичной дифференциации бактериофагов парагемолитиче-ских вибрионов III, IV, V морфогрупп от филаментозных бактериофагов I морфогруппы.

- использование единой комплексной схемы анализа биологических свойств вибриофагов.

Определён комплекс идентификационных и дифференцирующих признаков бактериофагов у следующих вибрионов - V. ско1егае, V. рагакаето1у1-

V. ттгсш, V. тегБсЪпгкош. Отмеченные чёткие таксономические пока-

затели, полученные при сравнительном изучении бактериофагов патогенных вибрионов, легли в разработанную нами схему идентификации и дифференциации, включающую признаки их отличия:

а) характерная морфология бактериофагов в электронном микроскопе -определение морфогруппы;

б) специфичность литического действия, подтверждаемая на соответствующих видах микроорганизмов, применение тест-штаммов вибрионов;

в) отсутствие антигенного родства с бактериофагами других видов;

г) устойчивость, либо чувствительность к хлороформу и повышенной температуре.

Предложенный набор фагочувствительных штаммов V. ско1егае 01 (с1х+1:ср+, ^хЧср*), V. ско1егае 0139 серогруппы (с£х+Гср+) для выделения холерных фагов при мониторинге окружающей среды на вибриофлору позволяет обнаруживать бактериофаги. Морфогруппы и серотипы изолированных холерных фагов коррелируют с обнаруженными фагами в лизогенных штаммах холерных вибрионов эльтор, циркулирующими в реках в эпидемический сезон.

Впервые установлена особенность взаимодействия выделенных фагов V. ттгсш с гетерологичным хозяином V. ско1егае, проявляющаяся в литиче-ской реакции со штаммом V. ско1егае 037 серогруппы. Разработан способ дифференциации фагов V. ттгсш от холерных с помощью индикаторного штамма V. ско1егае 13022-69 037 серогруппы, что используется для их отличия от холерных фагов при исследовании проб воды на вибриофаги.

Предложен способ для внутривидовой дифференциации штаммов V. ско1егае 0139 серогруппы с применением фаговых методов.

Депонированы в ГКПБ ФКУЗ Российский противочумный институт "Микроб" штамм-продуцент фага V. рагакаето^сия, индикаторный штамм V. рагакаето1уИст. Депонированы в ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора фаги: РЪа^ит рагаНаето1уИс№ ФК-90 (67) - I морфогруппы, использующийся для дифференциации индикаторных

штаммов Vibrio parahaemolyticus KM-184 и KM-97; Phagum parahaemolyticus ФК-104, выделенный из штамма серотипа 05:К15 и Phagum parahaemolyticus ФК-105, вы