Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Совершенствование и стандартизация методов оценки специфической активности противосинегнойных иммунопрепаратов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование и стандартизация методов оценки специфической активности противосинегнойных иммунопрепаратов"

о

На правах рукописи

'-и

Садыкова Алъфия Файзльяновна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ОЦЕНКИ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРОТИВОСИНЕГНОЙНЫХ ИММУНОПРЕПАРАТОВ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа 1997

Работа выполнена в Уфимском научно-исследовательском институт вакцин и сывороток имени И.И.Мечникова ГУП «Иммунопрепарат)

Научные руководители:

доктор медицинских наук Н.А.Михайлова доктор медицинских наук, профессор Ф.Ф.Резепов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Н. Н .В ор ошил ов а доктор медицинских наук, профессор З.Г.Габидуллин

Ведущая организация:

Научно-исследовательский ордена Трудового Красного Знамени институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи

/Jf fíP/cCl'^ :> /у СУ>

Защита диссертации состоится в/ часс

на заседании диссертацношюго Совета при Н4учно-исследовательско институте вакцин и сывороток имени И.И.Мечникова ГУ «Иммунопрепарат» по адресу: 450024, г.Уфа, ул.Новороссийская, 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научш исследовательского института вакцин и сывороток им. И.И.Мечииког ГУП «Иммунопрепарат».

Д „ U-С^Я/ ]0Ч7

Автореферат разослан '____ 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета

кандидат медицинских наук В.П.Головин

© ГУП «Иммунопрепарат», 1997

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Последние два десятилетия отмечается возрастание роли синегнойной палочки в возниковении гнойно-воспалительных заболеваний. в том числе внутрибольничных инфекций (Г.К.Бодрова и др.,1995,1997; д.Д. Меньшиков и др., 1S96; С.И.Пыла-ева и др.,1997; Яковлева В.П.,1997; Bert F. et al.,1994; Beghl G. et al.,1995; Rltter E. et al., 1595; Hldeo I. et at..1996; Ballestero S. et a].,1996; Dronda F. et al., 1996).

В связи с недостаточной эффективностью антибактериальных средств при лечении синегнойной инфекции особое значение приобретает терапия иммунными препаратами направленного действия.

3 настоящее время в практике здравоохранения используется анатоксин синегнойной палочки. Накоплен положительный опыт его применения для профилактики синегнойной инфекции в ожоговой, травматологической и кардиохирургкчоской клиниках, а также для получения лечебной антлсинегнойной антитоксической плазмы, эффективность которой подтверждена в клинических "испытаниях (Н.А. Михайлова и др., 1993, 1995; Г.Н. Бодрова и др., 1995, 1996, 1397).

. Производство иммунобиологических препаратов требует разработки надезных информативных и стандартных методов сценки их специфической активности.

По действушей нормативно-технической документации анатоксин синегнойной палочки контролируется в тесте выживаемости белых беспородных мышей и дозируется в мг белка в прививочной дозе. Поскольку по составу он представляет собой гетерогенную систему, поэтому дозирование в весовых единицах не учитывает истинное количество антигена экзотоксина Л в прививочной дозе. Методы количественной оценки его содержания в препарате в настоящее время не разработаны. Кроме того, определение имммуногенкости анатоксина по проценту выживаемости, основанное на принципе минимальных требований, позволяет судить лишь о соответствии препарата условно принятым лимитам, не давая возможности тонко дифференцировать высокоактивные серии от относительно низкоактивных. В этом плане тест определения антиток-синсвязкващей активности синегнойного анатоксина представляется более совершенным, так как позволяет определять точное количество

антигена экзотоксина А в препарате, выявлять различия в свойствах анатоксинов разных серий и обеспечивает возможность рациональной стандартизации анатоксина по количеству антигена в препарате (ЕС/мл).

При использовании анатоксина для получения лечебной антитоксической противосинегнойной плазмы важное значение имеют методы определения ее качества по наличию специфических антитоксических антител.

Наиболее надежно и достоверно измерить их уровень позволяет метод, основанный на использовании реакции нейтрализации специфическим антитоксином летального действия экзотоксина А - ведущего фактора патогенности синегнойной палочки.

Для решения широкого круга вопросов, связанных с разработкой и стандартизацией методов определения антитоксинсвязывающей активности анатоксина синегнойной палочки и антитоксической активности донорской противосинегнойной плазмы, проводимых in vivo, необходимо наличие тест-системы, включающей синегнойный токсин со стабильными свойствами и стандартный образец антитоксической противосинегнойной сыворотки, с точно охарактеризованной активностью.

Важной задачей является разработка адекватного серологического экспересс-метода выявления противосинегнойных антитоксических антител in vitro, способного заменить относительно сложный метод биологического теститрования. Многими исследователями показана пригодность РНГА с использованием диагностикумов на основе различных антигенов синегнойной палочки для оценки уровня специфических антител у больных и привитых синегнойными вакцинами доноров (И.А.Александрова и др.,1986; Л.Г.Подгорная, К.Ф.Дзюбан. 1986; С. А. Егизова и др., 1988, 1990; М. Polack, N.Taylor, 1977; K.Takeshi, J.Homma, 1978; M.Polack, L.Young, 1979). Создание коммерческого эритроцитарного диагностикума на основе анатоксина синегнойной палочки позволит стандартизовать условия проведения реакции, значительно упростить и ускорить лабораторные исследования при отборе иммунной противосинегнойной плазмы с токсиннейтрализующей активностью для чего, естественно, необходимо быть уверенным в том. что результаты, получаемые в РНГА, отражают истинное содержание антитоксина, выявляемое в опытах прямой нейтрализации токсина in vivo.

Цель и задачи исследования. Все вышеизложенное обуславливает актуальность исследований, имеющих целью совершенствование к стандартизацию методов оценки специфической активности анатоксина си-

негнойной палочки и антитоксической противосинегнойной плазмы. В задачи исследования входило:

- разработка эритроцитарного диагностикума на основе анатоксина си-негнойной палочки для выявления в РИГА антитоксических антител в -' сыворотках крови иммунизированных животных и людей;

- получение стабильной формы синегнойного токсина, изучение его свойств и возможности использования в серологических тест-системах;

- получение иммунной антисинегнойной антитоксической сыворотки и сертификация ее в качестве стандарта анатоксина синегнойной палочки;

- изучение возможности использования стандарта антитоксина синегнойной' палочки для количественной оценки специфической активности синегнойного анатоксина и донорской антисинегнойной плазмы в реакциях нейтрализации и антитоксинсвязывания;

- сравнительная оценка специфической активности донорских плазм в реакции нейтрализации и РИГА.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Впервые научно обоснованы методические подходй к оценке специфической активности противосинегнойных иммунопрепаратов в опытах in vivo с использованием серологической тест-системы, включающей тест-токсин и стандарт антитоксина, и in vitro - в реакции непрямой гемагглютинации. Установлена прямая корреляция между показателями гуморального иммунитета, выявляемыми в РИГА и в реакции нейтрализации в опытах на белых мышах. Полученные данные позволили рассматривать РИГА в качестве надежного серологического теста при оценки антитоксического противосинегнойного иммунитета у привитых. Установлен лимит антитоксической активности лечебной плазмы , определяемый в РИГА.

Сконструирован сухой стабильный, чувствительный, специфичный эритроцитарный диагностикум на основе анатоксина синегнойной палочки, использование которого позволило стандартизовать условия проведения РКГА. Налажен производственный выпуск препарата.

Получен сухой синегнойный токсин со стабильными свойствами. Показана возможность его использования, а также его глицериновых растворов в качестве тест-токсина в реакции нейтрализации.

Разработан стандарт синегнойного антитоксина с точно установ-

ленной активностью.

Впервые обоснована возможность количественной оценки антигенной активности анатоксина синегнойной палочки в единицах связывания (ЕС). Установлены пределы колебаний этого показателя для производственных серий препарата.

Разработанные диагностические тест-системы и методические приемы позволили стандартизовать условия проведения серологических реакций для оценки специфической активности анатоксина синегнойной палочки и донорской противосинегнойной плазмы.

Разработана и утверждена нормативно-техническая документация:

1. ВФС 42-361ВС-92. ВФС 42-2842-97 и ЭПР N 405-92. Диагностикум эритроцитарный синегнойный антигенный сухой. Инструкция по применению утверждена Минздравом РФ (1992).

2. ЭПР N 404-92. Анатоксин синегнойной палочки адсорбированный жидкий.

3. ВФС 42-362ВС-92. ФС 42-3366-97. Плазма антисинегнойная антитоксическая человека. Инструкция по применению утверждена Минздра-

. вом РФ (1992).

4. Стандартный образец предприятия (СОП) антитоксической противосинегнойной сыворотки. Утвержден Советом УфНИИВС им. И. И.Мечникова (1988 г., протокол N 11).

Работа выполнена в рамках Союзной программы С-23 "Разработать и внедрить в практику здравоохранения эффективные меры борьбы и профилактики внутрибольничных инфекций и сепсиса".

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на республиканской научной кон-ференции"Иммунитет и иммунобиологические препараты" (Уфа, 1991); научно-практической конференции"Диагностика, профилактика и лечение гнойно-септических заболеваний лекартсвенными препаратами, выпускаемыми ППО"Иммунопрепарат" (Уфа, 1993); международном симпозиуме, посвященном 150-летию со дня рождения И.И.Мечникова и 90-летш Уфимского НИИВС им. И. И. Мечникова НПО "Иммунопрепарат" (Уфа, 1995); межрегиональной научно-практической конференции "Госпитальная инфекция в реанимации и интенсивной терапии. Актуальные проблем! анестезиологии и реаниматологии" (Уфа, 1996); УП-ом съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов, паразитологов (М., 1997).

Структура и обьем диссертации

Диссертация состоит из введения, 3 глав обзора литературы, глав собственных исследований, заключения, выводов и списка лите-атуры. Материалы диссертации изложены на 143 страницах машинопис-ого текста. Список литературы включает 131 источник отечественной 89- иностранной литературы. Работа иллюстрирована 18 таблицами и рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалом исследований явились: кроличьи сыворотки, получение от животных иммунизированных синегнойным анатоксином; стандарт-ая антитоксическая сыворотка, представляющая собой пул высокотит-ажных кроличьих сывороток с наиболее полным набором антител ко сем антигенным компонентам синегнойного анатоксина; плазмы доно-ов, вакцинированных анатоксином синегнойной палочки адсорбирован ым жидким; синегнойный токсин сухой, полученный методом солевого саждения из культуральной жидкости; его глицериновый раствор, а акже коммерческие серии синегнойного анатоксина. ••'

Всего исследовано 160 сывороток, полученных от 40 кроликов и 14 образца сывороток крови, взятой от 46 доноров-добровольцев, 3 ерии сухого токсина, 6 серий синегнойного анатоксина.

В работе использованы: растворимый протейный антиген и цитоп-азматический антиген золотистого стафилококка, полученные в лабо-атории анатоксинов УфНИИВС им.И.И.Мечникова; анатоксин стафилокок-овый производства НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН; антигены экстрацеллю-ярной слизи из 5 штаммов Ps.aeruginosa сероваров 01, 02/05, 03, 3, 011, высокоочищенный экзотоксин A Ps.aeruginosa, моновалентная ыворотка к экзотоксину А и поливалентная сыворотка к нативному си-егнойному токсину, любезно предоставленные лабораторией ожоговых чфекций НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи.

Бактериальные штаммы. Токсигенные штаммы синегнойной палочки: еждународный штамм РА-103 из коллекции ГИСК им. J1.А. Тарасевича и гамм РА-7, полученный из НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи и выделенный из ожо-овой раны больного сотрудниками лаборатории ожоговых инфекций .С.Бродиновой и А.А.Аджиевой. Нетоксигенные штаммы, образующие лизь: РА-93 и РА-185.

В работе использованы коммерческие сыворотки: стандартная ан тистафилококковая (производства ГИСК им. Л.А.Тарасевича),противодиф терийная, противоботулинические типа в и Е, противостолбнячна (производства Уфимского НИИВС им.И.И. Мечникова),агглютинирующие ад сорбированные сыворотки к Shigella flexneri, агглютинирующая адсор бированная поливалентная салмонеллезная 0-сыворотка (производств Ташкентского НИИВС), агглютинирующие эшерихиозные поливалентные О сыворотки и иммуноглобулины (производства АО"Биомед"им.И.И.Мечнико ва), и экспериментальные сыворотки, полученные в лабораториях ан токсинов и АКДС вакцины УфНИИВС им. И. И. Мечникова : противомикробна сыворотка к Proteus vulgaris штамм N6, сыворотки к цитоплазматичес кому антигену и энтеротоксину типа A Staphylococcus aureus, рефе ренс сыворотка противококлюшных антитоксических антител.

Экспериментальные животные. Кролики породы Шиншилла массс 2, 5-3 кг и беспородные белые мыши массой 14-16 г.

Методы исследования

Физико-химические и биохимические методы.

Физические показатели лиофилизированного препарата антитоки ческой противосинегнойной сыворотки (точность розлива, остаточнг влажность) определяли в соответствии с методами, изложенными в Прх казе Минздрва СССР N 31 от 13.01.83, ФС 42- 344ВС-90.

Для изучения белкового состава выделенных препаратов сине! нойного токсина, а также для определения молекулярной массы бел; использовали метод диск-электрофореза в IIAAT в системе додецилсул} фата натрия по методу Laemmll (1970) с использованием стандартно] набора метчиков.

Содержание общего белка определяли по методу Loury (1951) реактивом Фолина.

Иммунохимические методы.

АКТИВНОСТЬ иммунных кроличьих сывороток И донорских плазм 0Ц| нивали по титру антител, определяемых в реакции непрямой гемаггл] тинации (РИГА) с эритроцитарным диагностикумом, сконструированы: на основе синегнойного анатоксина.

Специфичность диагностикума проверяли в РНГА с различными а тимикробными и антитоксическими сыворотками и в реакции торможен непрямой гемагглютинации (РТНГА) антигенами протея, стафилококка синегнойной палочки.

Иммунохимический спектр антисинегнойных антител в иммунных сы-оротках определяли в реакции двойной иммунодиффузии по Оухтерлони 1953).

Биологические методы.

Биологическую активность синегнойного токсина определяли в пытах на белых беспородных мышах массой 14-16 г, учитывая леталь-ость в течение 5 суток после внутрибрюшинного введения 0,5 мл ряда ерийных разведений исследуемого токсина. Токсичность выражали в Д50, которую рассчитывали по методу Кербера в модификации И.П. Аш-арина и A.A. Воробьева (1962).

Дермонекротическую активность синегнойного токсина изучали в ожной пробе на кроликах, определяя минимальную дермонекротизирую-ув дозу.

Протективные свойства иммунных сывороток изучали в тестах пас-ивной защиты мышей, в реакции нейтрализации летального и дермонек-отизирувщего действия синегнойного токсина. Рассчитывали ЛД50 за-ажающего штамма в опытных и контрольных группах, индекс эффектив-ости (ИЗ), определяемый как отношение ЛД50 в опыте к ЛД50 в конт-оле, а также РД50 вводимой сыворотки.

Для статистической обработки экспериментальный данных исполь-овали общепринятые методы -(И.П. Ашмарин, A.A. Воробьев, 1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Возможность применения РИГА для индикации и количественной цэнки уровня специфических противосинегнойных антител побудила нас ровести исследования по разработке коммерческого сухого эритроци-'арного антигенного синегнойного диагностикума.

В качестве носителя антигена использованы эритроциты овец, юрмалинизированные по методу Вейбах (1958), в качестве сенситина -чищенный концентрированный анатоксин синегнойной палочки. Изучена равнительная эффективность двух методов конъюгации с помощью тани-:а по S.V. Boyden (1951) и хлорного хрома по H.H. Fudenberg (1964).

Для приготовления диагностикума на основе 2%-ной взвеси тани-■ированных формалинизированных эритроцитов варьировали дозы анаток-ина от 0,04 до 10,0 мг/мл. При конъюгации анатоксина в тех же до-;ах с 20%-ными формалинизированными эритроцитами с помощью хлорного рома апробированы три его концентрации: 0,1; 0,3 и 0,5%. Чувс'тви-

тельность полученных диагностикумов зависила от дозы сенситина метода сенсибилизации.

Результаты исследований показали возможность получения равнь: по чувствительности диагностикумов при использовании обоих сшивак щих агентов. Максимальная чувствительность препаратов, приготовлен ных с применением танина, равная 9,8+0,3 log2 получена при дог сенситина 160 мкг. Коньюгация при помощи хлорного хрома обеспечивг ла высокую чувствительность равную 9,8+0,3 и 10,2+0,3 log2 при кое центрациях сшивающего агента 0,1 и_0,5 % и дозах сенситина- 0,16 5,0 мг соответственно (рис.1).

12,0

о. . *^Танин [

Д 4,0'' 1-^0,5% СгС13

1 0,3% CrCI3 t

|-о-0.1%СгС1з[

0,0

0,04

_1--—I-1-4--1--+.--1

0,08 0,16 0,31 0,62 1,25 2,50 5,00 10,00

Доза сенситина, мг/мл

Рис.1. Чувствительность РИГА в зависимости от метода сенсибилизации и дозы сенситина

Преимущество конъюгации с хлорным хромом заключались в наименьш затратах времени необходимого для приготовление диагностикума и большей устойчивости последних к лиофильному высушиванию. Оптимал

Таблица 1

Активность сухого синегнойного эритроцитарного антигенного диагностикума в зависимости от среды высушивания

Синегной- Титры антител в гипериммунной синегнойной сыворотке, выявляемые в РИГА с

ныи диаг- эритроцитарным синегноиным диагностикумом

ностикум жидким сухим

(серия Ы) состав криопротектора

сахарозо-желатиновая сахарозо-желатиновая сахарозо-желатиновая поливинилпир-

среда на дистиллиро- среда на ФСБР рН 6,4 среда на ФСБР рН 7,2 ролидон

ванной воде рН 7,0

1 1:1024 спонтанная агглютинация 1:1024 спонтанная агглютинация 1: 512

5 1:1024 спонтанная . агглютинация 1:1024 1:1024 1: 512

9 1: 512 1:256 1:512 1: 512 1:512

ными параметрами сенсибилизации с помощью хлорного хрома, позволяе шими достигнуть стабильность воспроизводимости результатов и четкость отрицательного контроля, явились: концентрация хлорного хрок - О,5 %, доза сенситина - 5 мг.

В дальнейших исследованиях выявлена видоспецифичность синег нойного диагностикума в РИГА с 15 коммерческими и экспериментальнь ми иммунными сыворотками различной специфичности и в РТНГА антиге нами синепюйной палочки, протея и стафилококка.

Изучена возможность стабилизации эритроцитарного синьтнойно1 диагностикума методом сублимационного высушивания с применение криопротекторов разного состава (табл.1). Оптимальной оказалась се харозо-желатиновая среда на фосфатно-солевом буфере рН 6,4. Вые; шенные с этим стабилизатором диагностикумы сохраняли свойства (ог сутствие спонтанной агглютинации, чувствительность, специфичное^ в течение 3-х лет (срок наблюдения).

Клиническая апробация диагностикума проведена на базе отде. консервации тканей и трансфузиологии НИИСП им.Н. В. Склифосовского Уфимской республиканской станции переливания крови при изучении а: тителогенеза у 46 доноров, троекратно иммунизированных синегнойн: анатоксином. Выявлено увеличение титров антител в сыворотках кров: превосходившее к концу курса иммунизации в 30-90 раз исходный ур вень.' Гинерпродукция специфических антител у вакцинированных сохр нялась в течение 5-8 месяцев.

В процессе исследований установлено, что сыворотки доноров содержанием антител в титре 1:128 и выше обладали протективны свойствами в тесте пассивной защиты мышей зараженных культурой то сигенного штамма синегнойной палочки РА-7 (рис.2). Степень выраже ности защитной активности сыворотки характеризовали путем вычисх ния средней летальной дозы (ЛД50) для животных, получавших до зажжения различные разведения иммунной сыворотки 'с исходным титром е тител 1:512. Сыворотка доноров, взятая до иммунизации служила королем. Определено, что если величина LDS0 заражающего штамма сс тавляла (8,01+0,36)х10бмикробных клеток, то для мышей, получиви контрольную сыворотку, LD50 достигала (54,19+1, 85)х106микроб1 клеток, а для иммунной сыворотки она соответствовг (110,95+6,45)х106микробных клеток. Индекс эффективности равня, 2,05 (Р<0,01). Протективный эффект сыворотки с титром антител р; ным разведению 1:128 оказался достоверно выше, чем с титром 1:3;

а о

0,0125

0,025

0,05 0,1 0,2*

Доза сыворотки, мл

К, - нормальная плазма. 0,2 мл К2 - LDf;0 культуры * - титр антител а РИГА 1:512

Рис. 2. Протективная активность сывороток доноров

при заражении культурой штамма Ps. aeruginosa РА-7

1:64. Она защищала 80-100% мышей от 4-8 LD50 вирулентной культуры синегнойной палочки РА-7.

Таким образом, проведенные исследования подтвердили целесообразность использования РИГА, проводимую со сконструированным диаг-иостикумом в качестве серологического теста для оценки специфической активности донорской противосинегнойной плазмы.

Представляло интерес экспериментально подтвердить, что результаты, получаемые в РИГА, отражают истинное содержание синегнойного антитоксина, выявляемое в опытах прямой нейтрализации токсина in •fivo. Для этого разработана серологическая тест-система, включающая зинегнойный токсин со стабильными свойствами и стандартный образец зинегнойного антитоксина с точно установленной активностью.

Стабильный экзотоксин А приготовлен методом осаждения сульфатом аммония при 60 % насыщении из культуральной жидкости, получен--юй при выращивании токсигенных штаммов синегнойной палочки РА-7 тли РА-ЮЗ в условиях оптимизированного периодического гомогенного

процесса культивирования в ферментере. Осадок отделяли центрифугированием, высушивали над хлористым кальцием и хранили запаенным в ампулах при температуре (5+3)0С. Полученн. три серии сухого токсина. О концентрировании и очистке целевого продукта от примесей свидетельствовало уменьшение количества электрофоретических фракций с 12 до 4 при исследовании методом электрофореза в ПААГе исходной культуральной жидкости и полученных токсинов, а также возрастание удельной активности токсинов в среднем в 3,5 раза и антигенной активности в 20 раз (табл.2). Минимальная смертельная доза (Dim) сухих токсинов при внутрибрвшинном введении белым мышам составляла 16,3+2,0 мкг белка, минимальная дермонекротическая доза (Dnm) - е среднем 8,0 мкг белка, минимальная преципитирующая доза токсина е реакции иммунодиффузии с моновалентной сывороткой, полученной к вы-сокоочищенному экзотоксину А - 0,33+0,02 мг/мл. Подекадная проверке ЛД50 показала, что сухие синегнойные токсины сохраняли свои свойства без изменений в течении трех лет хранения при температуре 4°( (срок наблюдения). Глицериновые растворы синегнойного токсина, приготовленные по общепринятой методике, содержавшие 1,5-2,5 мг cyxort вещества в мл и активность 100-200 LD60/ мл отличались стабильностью поскольку сохраняли свою исходную активность в течение 1! месяцев (срок-наблюдения).

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетель ствовали, что экзотоксин А, .полученный солевым осаждением с последующим высушиванием, является активным, специфичным и стабильны препаратом, что позволило рекомендовать использование сухого токсина и его концентрированных глицериновых растворов в качеств тест-токсинов в реакции нейтрализации для количественной оценк специфической активности синегнойного анатоксина и донорской анти синегнойной плазмы.

Исходным материалом для приготовления стандарта синегнойног антитоксина явились сыворотки кроликов, иммунизированных анатокси ном синегнойной палочки по трем схемам, различающимся дозами вводи мого антигена, интервалами времени и местом аппликации. Их актиЕ ность оценивали по титрам специфических антител, выявляемых в РИГА в реакции имммунодиффузии с анатоксином и высокоочищенным экзоток сином А. Оптимальной оказалась схема, предусматривавшая однократне введение препарата в дозе 400 мкг с последующей внутривенной реваь цинацией 100 мкг анатоксина с интервалом в 30'дней. Сыворотки, пс

Таблица 2

Характеристика синегнойного токсина, осажденного сульфатом аммония при 60% насыщения

Серия синегнойного токсина Безмикробный фильтрат Токсинсодержащий материал, полученный солевым осаждением

ЛД50 (мг белка) Удельная активность ЛДбо/мг белка Антигенная активность (min преципити-рующая доза мг/мл) ЛД50 Удельная активность ЛДбо/мг белка Антигенная активность (min преципити-рующая доза мг/мл)

(мг белка)

Серия 1 0,047 21,3 6.0 0,0142±0,002 70.9 0,29

Серия 2 0,07 14,3 6.5 0,0196±0,001 50.1 0,35

Серия 3 0,053 19,0 8.3 0,0152±0,002 65.8 0,35

М±т 0,056±0,007 18,1±1,9 6.9±0.7 0,0163±0,002 62.6±6.0 0,33±0,02

лученные по этой схеме, обладали наиболее высокими титрами антител в РИГА, достигавшими значений обратной величины 9,38+1,44 log£ и полным набором антител ко всем антигенам синегнойного анатоксина.

Пул высокоактивных кроличьих сывороток объемом 1100 мл разлили в ампулы по 1 мл и лиофильно высушили.

При контроле, качества предлагаемого стандарта антитоксина установлено, что он разлит с достаточной точностью (вес сухого вещества ампулы составлял 71, 31+1, 33 мг при коэффициенте вариации 2%), остаточная влажность составляла 1,41%. Иммунохимический спектр антител после высушивания.не изменился, титр антитоксических антител варьировал в -пределах разведения 1:1024-1:2048. В тесте пассивной защиты мь:шей выявлены его протективные свойства в отношении токсигенных штаммов Ps. aeruginosa РА-7 и РА-ЮЗ (рис.3).

I

I

: 1000I

900!

800

; "i 700'

! & боо

х

! J2 500 о

; х. 400

: с! 300 200 100 О

i

О - опытные мыши, получившие 0,5 мл антитоксической сыворотки; К, - контрольные мыши, получившие 0,5 мл нормальной сыворотки; К2 - контрольные мыши, получившие 0,5 мл физиологического раствора

Рис.3. Протективная активность стандарта антитоксина синегнойной палочки

Введение сыворотки за 2 часа до заражения животных повышало в 80-140 раз величину 1Л)50> при этом индекс эффективности составлял 15,6 и 9,2 соответственно. Протективный эффект оказался слабо выраженным при введении культуры нетоксигенных мукоидных штаммов РА-93 и РА-185 .

Для количественой оценки нейтрализующей активности проведено многократное титрование антитоксической сыворотки на белых беспородных мышах с тремя сериями синегнойного тест-токсина в дозах 5 и 10 ЬВ50. Установлено, что 1 мл ее нейтрализовал в среднем 150 ЬБ50 токсина. Для выражения активности сыворотки в антитоксических единицах условно приняли за 1 АЕ такое ее минимальное количество, которое в смеси с 10 ЛД50 токсина при внутрибрюшинном введении мышам, предотвращало от гибели 50 % животных в течение 5 суток наблюдения.

Таким образом, активность полученного сухого стандарта антитоксической антисинегнойной сыворотки декларирована как 15 антитоксических единиц (АЕ) в содержимом одной ампулы. В процессе хранения при температуре (5+1)°С препарат не изменял своих свойств в течение 3 лет наблюдения.

Получение синегнойного тест-токсина и стандарта антитоксина позволило определить методические подходы к оценке качества синегнойного анатоксина и донорской противосинегнойной плазмы в единицах активности предложенного стандарта в опытах на мышах.

В дальнейших экспериментах были определены уровни титрования, технические детали постановки опытов, принципы расчета активности испытуемых препаратов.

Для оценки уровня антитоксических антител в сыворотках крови доноров оказались оптимальными следующие условия постановки реакции нейтрализации: уровень титрования- 1/5 АЕ стандарта, соотношение инградиентов реакции - О, А мл испытуемой сыворотки и 0,1 мл тест-токсина, содержащий в этом обьеме опытную дозу, вытитрованную по отношению к 1/5 АЕ стандартной сыворотки. Минимальное количество антитоксина, выявляемое при этих условиях составляло 0,5 АЕ.

По разработанной методике и параллельно в РИГА проведено исследование сывороток крови 30 доноров, вакцинированных анатоксином синегнойной палочки. В 24 образцах содержание антитоксина оказалось в пределах 1,8 - 7,5 АЕ/мл, в 6 образцах <0,5 АЕ/мл. Установлена высокая степень корреляции (г=0,98) результатов, полученных в обеих реакциях (рис.4). В сыворотках с титром антител в РИГА 1:256 и выше

6,0 -г

5,0-

4,0 ••

С

2,0--

1,0

0,0

^ ^ 256 512 Ю24 2048 4096 Титр антител в РИГА (обратная величина)

Рис. 4. Содержание антитоксических антител (АЕ/мл) в сыворотках крови доноров в зависимости от титров антител в РИГА

уровень антитоксина составлял 2 и более АЕ/мл. Среди иммунных сывороток с титром антител в РИГА 1:64 и 1:128 содержание антитоксина < 0,5 АЕ/мл выявлено в 80% и в 40% образцов соответсвенно. По-видимому, правомерно признать титр антител, выявляемых в РИГА равный разведению сыворотки 1:256, как критерий для отбора плазм с токсин-нейтрализующей активностью.

Полученные результаты подтвердили, что оба теста являются надежными серологическими методами оценки антитоксической активности донорской антисинегнойной плазмы. Однако для скрининговых исследований предпочтительнее использование более простого и экономичного экспресс метода - РИГА вместо трудоемкого и дорогостоящего способа биологического тестирования токсиннейтрализующей активности.

При изучении антигенной активности анатоксина синегнойной па-

лочки в реакции антитоксинсвязывания в опытах на белых мышах исследованы 5 экспериментально-производственных серий концентрированных полуфабрикатов, полученных в соответствие с ЭПР N 404-92 и используемых для изготовления конечной сорбированной формы.

Постановку реакции осуществляли следующим образом: из натив-ного концентрированного анатоксина, предварительно разведенного в 10 раз готовили ряд кратных разведений с шагом 1,5. К 0, 2 мл разведенного анатоксина добавляли 2/5 АЕ стандартной антитоксической сыворотки, взятой в обьеме 0,2 мл. Для этого ее разводили в 7,5 раз до содержания 2 АЕ /мл. Смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего к ней добавляли в обьеме О,3 мл по одной рабочей дозе (1Ь+/5) синегнойного тест-токсина, предварительно подтитрованного к 1/5 АЕ сыворотки таким образом, чтобы смесь 1Ь+/5 токсина и 1/5 АЕ сыворотки вызывала гибель 50 % мышей на четвертые сутки. После повторного выдерживания при комнатной температуре е течение 1 часа по 0,7 мл смеси вводили 4 животным внутрибрюшинно. Наблюдали за гибелью мышей в течение четырех суток. Каждый опыт сопровождали развернутым контролем опытной дозы токсина (Ь+/5), с тем чтобы установить какой дозой стандартной сыворотки в АЕ нейтрализуется одна опытная доза токсина в данном конкретном опыте. Разведение анатоксина, при котором погибало 50 % животных, соответствовало дозе антигена, связывающей 1/5 АЕ стандартной сыворотки. Антитоксинсвязывающую активность синегнойного анатоксина выражали в единицах связывания - ЕС/мл.

Результаты исследования образцов свидетельствовали о возможности достаточно точной характеристики препаратов синегнойного анатоксина по содержанию в них антигена (табл.3). Его количество в 1мл концентратов разных серий составляло от 45 до 107 ЕС/мл, а содержание белка в них находилось в пределах от 3,5 до 8,2 кг/т. Однако показатели удельной активности препаратов, выражаемые количеством ЕС на 1 мг белка, варьировали в относительно узком диапозоне от 11,7 до 15,3 ЕС/мг белка, что свидетельствовало о стандартности серий по этому показателю. Следовательно, дозирование препарата осуществляемое в весовых единицах (15 мкг белка в прививочной дозе), гарантирует достаточно высокую стандартность его по -количеству антигена ( от 0,17 до 0, 22 ЕС) в прививочной дозе.

Все вышеизложенное дает основание считать оправданным, при данной технологии производства, дозирование препарата в весовых едини-

Таблица 3

Антитоксинсвязывающая активность анатоксина синегнойной палочки

1 I Серия ана- Количест- i i i i ¡Антигенная |ЕС/мг белка!ЕС/в приви-|

I токсина во белка 1 активность, | . |вочной дозе|

1 1 (мг/мл) I ЕС/мл (М+т)| I 1 1 1 i i

1 1 Серия 1 3,5 45.8+13,5 12,1 0,18 |

I Серия 2/96 5,0 58.8+11,6 11,7 0,17 |

1 Серия 3 7,0 107, 0+22, 9 15,3 0,22 |

1 Серия 23 8.2 106,2+17,7 12,9' 0,19 |

| Серия 25 1 5,4 79, 0±6,08 14,6 0,22 |

1 1 (М+т) | 5,8+0.8 79,4+12,3 13,3+0,7 0,19+0,01 | i

цах. Количественное определение антигена в препарате с помощью реакции антитоксинсвязывания следует рассматривать как вспомогательный дополнительный тест, подтверждающий стандартность каждой серии препарата по удельной активности концентрата. По нашим данным удельная активность концентрата должна быть в пределах 13,3+0,.7 ЕС/мг белка.

Таким образом, результаты проведенных исследований с использованием разработанной нами тест-системы, включающей синегнойный

тест-токсин и стандарт синегнойного антитоксина, а также предложенные методические приемы по постановке реакций позволяют более точно оценивать специфическую активность антитоксической плазмы и синегнойного анатоксина.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны серологические методы оценки специфической активности анатоксина и антитоксина синегнойной палочки.

2. Сконструирован чувствительный, специфичный и стабильный сухой эритроцитарный диагностикум на основе анатоксина синегнойной па. лочки. Разработана технология получения, утверждена нормативно-техническая документация, позволяющая осуществлять коммерческий выпуск препарата.

3. Для стандартизации метода биологического тестирования специфической активности противосинегнойных иммунопрепаратов разработана тест-система, включающая высокоактивный стабильный сухой си-негнойный токсин и стандарт антитоксической антисинегнойной сыворотки с активностью 15 АЕ.

4. Разработаны методические приемы постановки реакций нейтрализации и антитоксинсвязывания с использованием серологической тест-системы в опытах на мышах.

5. Выявлена высокая степень корреляции между результатами определения уровня синегнойного антитоксина в иммунной антитоксической антисинегнойной плазме, полученными в РИГА и в реакции прямой нейтрализации экзотоксина А, свидетельствующая, что РИГА является надежным серологическим тестом для оценки специфической активности донорской плазмы.

6. Проведена оценка антигенной активности коммерческих серий синегнойного анатоксина в реакции антитоксинсвязывания. Показана достаточно высокая стандартность коммерческих препаратов по показателям удельной активности, определены количественные характеристики препарата по этому показателю.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Садыкова А.Ф., Михайлова Н.А., Кунягина О.В. Получение гипериммунной антитоксической противосинегнойной- сыворотки и изучение ее свойств//Иммунитет и иммунобиологические препараты: Тез.докл. респ. науч.конф. -Уфа, 1991. -С. 9-11.

2. Изучение безвредности, реактогенностии антигенной активности анатоксина синегнойной палочки на добровольцах/ Н.А. Михайлова, О.В. Кунягина, Ф.А. Шаймухаметов, А.Ф. Садыкова. Р.Ш. Магазов, А. А. Михайлов, М.Л.Царев, А.С.Луканин, А.Н.Слепеньков, А.Ф.Рахимова// Иммунитет и иммунобиологические препараты: Тез.докл.респ. науч. конф. -Уфа, 1991. -С.6-9.

3. Садыкова А.Ф., Кунягина О.В., Михайлова Н.А. Изучение специфической активности донорских иммунных противосинегнойных плазм// Диагностика, профилактика и лечение гнойно-септических заболеваний лекарственными препаратами, выпускаемыми НПО " Иммунопрепа-рат ": Матер.научнопракт.конф. -Уфа, 1993. -С.105-109.

4. Разработка новых эритроцитарных диагностикумов/О.В. Кунягина, А.Ф. Садыкова, Ю.М. Грабарь, Г.П. Глухова, Н.А. Михайлова//Диаг-ностика, профилактика и лечение гнойно-септических заболеваний лекарственными препаратами, выпускаемыми НПО " Иммунопрепарат ": Матер, научнопракт.конф. -Уфа, 1993. -С.62-67.

5. Садыкова А.Ф., Кунягина О.В., Михайлова Н.А. Синегнойный анатоксин: характеристика протективных и антигенных свойств//Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине: Матер.меж-дунар. симпозиума, посвящ.150-летию со дня рожд. И.И.Мечникова и 90-летию УфНИИВС им.И.И. Мечникова НПО " Иммунопрепарат ". -Ч.1. -Уфа, 1995. -С.144-149.

6. Экспериментальное обоснование терапевтической эффективности антитоксической противосинегнойной плазмы/Г.Н. Бодрова, А.Ф. Садыкова, О.В. Кунягина, Н.А. Михайлова. В.Б. Хватов// Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине: Матер.междунар. симпозиума, посвящ.150-летию со дня рожд. И.И.Мечникова и 90-летаю УфНИИВС им.И.И. Мечникова НПО" Иммунопрепарат ". -Ч.1. -Уфа, 1995. -С.149-154.

7. Изучение безопасности.реактогенности и антигенной активности анатоксина Pseudomonas aeruginosa на добровольцах/Н.А. Михайлова О.В. Кунягина, Т.Н. Кузнецова, А.Ф. Садыкова, Н.С. Бродинова,

Г.Н. Бодрова// Ж.микробиол., 1995. -N3. -С.89-93.

. Использование антитоксической противосинегнойной плазмы для профилактики гнойных осложнений у больных с открытыми переломами/ Г.Н. Бодрова, И. Ю. Клюквин, E.H. Кобаева, В.Б. Хватов, H.A. Михайлова, А.Ф. Садыкова//Госпитальная инфекция в реанимации и интенсивной терапии. Актуальные проблемы анастезиологии и реаниматологии: Матер.межрегион.науч.-практ. конф. -Уфа, 1996. -С.59-60.

. Серологические критерии оценки антигенной активности анатоксина синегнойной палочки/А.Ф. Садыкова, 0.В. Кунягина, H.A. Михайлова, Ф.Ф. Резепов// Матер.VII сьезда эпидемиологов,микробиологов, паразитологов. -М., 1997. -С.234-235.

0.Antitoxic antipseudomonas plasma: production and applicati-on/N.A. Mlkhailova, O.V. Kunyagina, A.F. Sadykova, G.N. Bodrova //Abstracts of the Fourth International Symposium on Clinical Immunology. 19-22 June 1997, Amsterdam, The Netherlands. -P.60.