Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение рекомбинантного белка внешней мембраны OprF Pseudomonas Aeruginosa и изучение его иммунобиологических свойств

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Получение рекомбинантного белка внешней мембраны OprF Pseudomonas Aeruginosa и изучение его иммунобиологических свойств"

На правах рукописи

ЗЛЫГОСТЕВ Сергей Александрович

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ OprF PSEUDOMONAS AERUGINOSA И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

03.00.07 -микробиология 03.00 15. - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

---iOb!37

Москва-2008

003168137

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, г. Москва

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор кандидат биологических наук Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Михайлова Наталья Александровна Калошин Алексей Алексеевич

Вертиев Юрий Викторович Щипков Валерий Петрович

Ведущая организация:

Московская медицинская академия имени И М Сеченова

Защита диссертации состоится _2008 г. в "*^асов

на заседании диссертационного совета Д.212.203 05 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» (117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8)

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» (117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6).

Автореферат разослан ¿¡»/Р&сф 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент

О Б. Гигани

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa) продолжает оставаться одним из основных возбудителей гнойно-септических заболеваний и осложнений, возникающих после термических поражений, хирургических вмешательств, родов и других состояний, сопровождающихся снижением иммунологической резистентности

Гнойно-воспалительные заболевания, вызываемые синегнойной палочкой, характеризуются тяжелым течением, интоксикацией, развитием септического шока, высокой летальностью, трудно поддаются терапии антибиотиками, поэтому исследования по разработке иммунобиологических средств направленного действия против Р aeruginosa актуальны и социально-экономически обоснованы

По разным причинам в настоящее время для использования в клинической практике не зарегистрировано ни одного лекарственного средства, предназначенного для иммунопрофилактики и иммунотерапии синегнойной инфекции.

Трудности создания эффективных вакцин против синегнойной инфекции заключаются в том, что патогенез заболевания обусловлен воздействием целого ряда факторов патогенности, среди которых выделить наиболее значимый для разработки вакцинных препаратов представляется сложной задачей.

Цели и задачи исследования.

Целью нашей работы было получение рекомбинантного белка F внешней мембраны (OprF) Р aeruginosa vi изучение его иммунобиологических свойств.

В задачи исследования входило.

1. Выделить геномную ДНК Р aeruginosa, амплифицировать ген белка OprF с помощью ПЦР, встроить его в вектор, предназначенный для экспрессии в клетках Е coli и получить бактериальный продуцент рекомбинантного белка.

2. Наработать и хроматографически очисшть рекомбинантный белок OprF

3. Изучить иммунобиологические свойства рекомбинантного белка OprF P.aeruginosa

4 Получить иммунные сыворотки и изучить их превентивные свойства.

Научная новизна работы.

Получен непатогенный бактериальный продуценг Ecoh, характеризующийся гиперэкспрессией рекомбинантного белка F наружной мембраны P.aeruginosa (около 30% от содержания общего клеточного белка)

Аминокислотная последовательность рекомбинантного белка OprF содержала дополнительные 6 гистидиновых оснований, необходимых для ионно-афинной хроматографии на Ni-агарозном сорбенте, что позволило выделить высокоочищенный нетоксичный препарат.

Очищенный рекомбинантный белок OprF в реакции ИФА специфически взаимодействовал с иммунными сыворотками, содержащими антитела к различным серовариантам штаммов Р aeruginosa по классификации Fisher-Devlm.

Иммунизация животных полученным препаратом стимулировала выработку специфических антител, а иммунные кроличьи сыворотки обладали протективными свойствами

Выявлена перекрестная активность иммунных кроличьих сывороток к рекомбинантному белку OprF на моделях торможения роста культур Р aeruginosa различных серовариантов но классификации Habs

Практическая значимость.

Созданный штамм-продуцент Е coli может быть использован в качестве производственного в технологии получения рекомбинантного белка F наружной мембраны Р aeruginosa при разработке вакцины против синегнойной инфекции

Отсутствие патогенных свойств у полученного штамма, а также простота методики выделения белкового продукта гарантируют безопасность и технологичность производственного процесса

Основные положения выносимые на защиту.

1. Сконструированный штамм-продуцент Ecoli Ml5 pQE-30/oprF характеризуется высоким выходом целевого продукта (30% от содержания общего клеточного белка), а разработанные технологические приемы получения и очистки рекомбинантного белка позволяют нарабатывай, его в количествах, требуемых для биологического тестирования

2. Полученный рекомбинантный белок OprF внешней мембраны P.aeruginosa нетоксичен, обладает антигенными и протективными свойствами

3. Присутствие антител к рекомбинантному белку OprF в сыворотках кроликов после иммунизации культурами штаммов Р aeruginosa, относящихся к различным серовариантам, подтверждает его специфичность для рода Pseudomonas

Апробация работы.

Материалы доложены на 8-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино 2004); на 9-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино 2005); на конкурсе молодых специалистов Института иммунологии на лучшую научную работу 2005-го

года (Москва 2005), на 11-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино 2007)

Апробация диссертации состоялась на научной конференции отдела микробиологии НИИВС им. И.И Мечникова РАМН (Москва, декабрь 2007 г)

Объем и структура диссертационной работы

Диссертация изложена на 116 страницах. Она состоит из введения, обзора литературы (3 главы), собственных результатов (4 главы), заключения и выводов. Список литературы включает 19В источников (99 отечественных и 99 зарубежных) Работа содержит ¡5 рисунков и 10 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследований

Объекты исследований

Материалами исследований явились.

Рекомбинантный белок OprF внешней мембраны Р aeruginosa

Мышиные и кроличьи сыворотки к рекомбинантному белку. Всего исследовано 30 образцов кроличьих и 325 мышиных сывороток Общая численность мышей, использованных в экспериментах, составила 1500 голов Для получения сывороток в работе использовали 5 кроликов.

Кроличьи антисыворотки от животных, иммунизированных убитыми культурами Р aeruginosa, которые относились к серовариантам по Fisher-Devlm (FD) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, а также 170002, 170005, РА868; К.рпеитопюе, S aureus, Р vulgaris и £ coli.

Методы исследований

Для получения геномной ДНК Р aeruginosa использовали штамм РА 103 Бактериальную биомассу обрабатывали протеиназой К и экстрагировали с использованием фенол/хлороформного метода с последующим осаждением этанолом

Последовательность, содержащая ген oprF, амплифицирована с использованием ПЦР Праймеры для ПЦР содержали на 5-кондах последовательности сайтов рестрикции BamH 1 и Hind HI Соответственно, последовательность гена oprF встроили в плазмиду pQE-30 (QIAGEN) по сайтам рестрикции BamH I й Hmd III. Данная плазмида имела регуляторные участки для экспрессии рекомбинантных генов в клетках Е coli с использованием изопропил-бета-сЗ-тиогалактопиранозида (ИПТГ) Все генно-инженерные манипуляции проводили в соответствии с общепринятыми методиками. Для трансформации использовали штамм Е coli Ml 5 (QIAGEN), с плазмидой pREP-4, кодирующей репрессор лактозного оперона. Первичный отбор клонов проводили с использованием рестрикционного анализа Окончательно отбор проводили секвенированием с использованием набора Promega Q4110 в соответствии с прилагаемым протоколом

Рекомбинантный белок OprF получали при выращивании бактериального продуцента (Е coli Ml 5 pQE-30/oprF) в LB среде с добавлением ШПТ. Электрофорез получаемых белковых продуктов проводили в 12% полиакриламидном геле (ПААГ) по методу Лэммли

Хроматографическую очистку осуществляли методом ионно-аффинной хроматографии с использованием Ni-агарозы в денатурирующих условиях (в присутствии 8 M мочевины) в соответствии с протоколом QIAGEN Концентрацию белка определяли на спектрофотометре Pharmacia LKB/Ultraspec II при 280 нм, используя коэффициент экстинкции, равный 0,7, который рассчитывали в программе OMIGA. Очищенный рекомбинантный белок растворяли при диализе в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) pH 7,5, который проводили в течение 14-18 часов при температуре 4°С

Иммуноблотт с использованием сыворотки кролика, иммунизированного убитой культурой Р aeruginosa (шт РА868), проводили по общепринятой методике В качестве субстрата использовали диаминобензидин (ДАБ) Для удаления неспецифического взаимодействия

полюслональной сыворотки с белками Е coli, ее обрабатывали бактериальным лизатом в течение 15 минут непосредственно перед экспериментом.

Для проведения ИФА полученный белок разводили в 10 мМ карбонатно-бикарбонатном буфере (КББ) pH 9,4 до концентрации 5-10 мкг в мл и сорбировали в течение суток при температуре 4°С в 96 луночных планшетах (ВНИИмедполимер). При постановке ИФА в качестве конъюгатов использовали меченые пероксидазой хрена антитела против IgG кролика и против IgG мыши. Для визуализации применяли раствор на основе тетра-метил-бензидина Оптическую плотность измеряли в приборе "Labsystems Multiskan Plus" при длине волны 450 нм.

Для иммунизации животных препарат рекомбинантного белка, растворенного в ФСБ, сорбировали на геле гидроокиси алюминия (ГУП "Иммунопрепарат") в течение суток при температуре 4°С, из расчета 1 мг белка на 3 мг гидроокиси алюминия.

Антибактериальную активность иммунных сывороток проверяли in vitro на моделях торможения роста культуры Р aeruginosa, используя микробиологический анализатор (планшетный фотометр «Myltiskan Ascent» (Thermo Labsystems), компьютер, программу «Микроб-автомат»).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе работы амплифицирована с помощью полимфразной цепной реакции (ПЦР) нуклеотидная последовательность, кодирующая ген белка OprF. В качестве матрицы использована геномная ДНК Р aeruginosa (штамм РА103)

Для получения препаративных количеств ДНК при ПЦР-амплификации с использованием базы данных GenBank подобраны праймеры Они были специфичны к концевым нуклеотидам гена oprF и имели на 5'-койцах дополнительные участки узнавания рестриктаз ВашН I и Hind III, необходимые для встраивания в полилинкер плазмиды pQE-30 (QIAGEN).

Используемая плазмида имела регуляторные участки для экспрессии клонированного гена в клетках E.coli.

При анализе амплификатов в агарозном геле идентифицирован ПЦР-продукт, имеющий размер 1 kb, совпадающий по массе с геном, кодирующим полную последовательность белка OprF (Рис. I).

12 3 4

Рисунок 1. Результаты ПЦР-амплификации последовательности нуклеотидов, кодирующих белок OprF, и рестрикционный анализ генно-инженерной конструкции pQE-30/oprF в 1% агарозном геле. Треки: 1 -плазмидный вектор pQE-30, обработанный рестриктазами ВатН 1 и Hind III; 2 - генно-инженерная конструкция для получения рекомбинантного белка OprF в клетках Е. coli (pQE-30/oprF), обработанная рестриктазами ВатН 1 и Hind III; 3 — результат ПЦР-амплификации гена oprF; 4 - ДНК-маркер молекулярной массы (GeneRuler I kb DNA Ladder, Fermentas). Стрелкой отмечены фрагменты размерами 1 kb и 3,5 kb.

Синтезированный ПЦР-амшшфикат обрабатывали ферментами рестрикции BamH I и Hind III. Встраивание рестрикта проводили в полилинкер плазмиды pQE-30 (QIAGEN) по тем же сайтам рестрикции.

Как показали данные секвенирования клонированного рекомбинантного гена, кодируемая им аминокислотная последовательность

совпадала с референс-последоватедьностыо из базы данных GenBank (Accession Number АЕ004091). Произошедшая замена одного нуклеотида в гене синтезированного рекомбинантного продукта не повлияла на аминокислотный состав, поскольку изменившийся триплет кодировал аналогичную аминокислоту. Важной особенностью полученного рекомбинантного белка являлось наличие на N-конце дополнительной аминокислотной последовательности, необходимой для последующей очистки получаемого продукта (Met-Arg-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His).

При культивировании сконструированного генно-инженерного штамма, в результате индуцированной экспрессии гена, в лизате продуцента наблюдали присутствие белкового продукта, размер которого по данным электрофореза соответствовал 40 кДа, что совпадало с расчетной величиной нативного белка OprF (37,6 кДа) При этом его выход составил около 30% от общего клеточного белка

Используя в качестве сорбента Ni-NTA-агарозу, проведена очистка рекомбинантного белка методом ионно-афинной хроматографии. Для плавного понижения кислотности суспензии использовали четыре элюирующих раствора с разными значениями рН (буфер В - 8,0; буфер С -6,3; буфер D - 5,9; буфер Б - 4,5). В процессе очистки получали фракции, содержащие белок OprF, который определяли электрофоретическим анализом (Рис. 2).

Специфичность рекомбинантного белка OprF анализировали в иммуноблотганге с использованием сыворотки кролика, иммунизированного цельноклеточной культурой P.aeruginosa (шт. РА868). Полученный белковый продукт специфично реагировал с иммунной сывороткой, как до очистки, так и после нее (Рис. 2).,

А в

1 2 3 4 5 12 3 4

Ш . <4

** те щт В X т «а* т

Ж* *

Ш ш ** , Ш ш *

Рисунок 2. Анализ белковых продуктов, полученных в результате экспрессии гена oprF, клонированного в плазмиде pQE-ЗО, и очистки рекомбинантного белка OprF: А - ПААГ окрашенный Кумасси R-250: 1 -белки продуцента, полученные npv выращивании биомассы без индукции; 2 -белки продуцента, полученные при выращивании биомассы с индукцией; 3 -маркер белковой массы (размер белков маркера: 116, 66.2, 45, 35, 25, 18-4, 14.4 кДа); 4 - хроматографически очищенный рекомбинантный белок OprF (растворенный в 8 Ммочевине); 5 - рекомбинантный белок OprF, очищенный и растворенный в буфере ФСБ. В - Нитроцеллюлозная мембрана после иммуноблоттинга: 1 — биомасса, полученная из исходных нетрансформированных клеток штамма E.coli Ml 5; 2 - неочищенный рекомбинантный белок, полученный из индуцированных клеток продуцента; 3 - хроматографически очищенный рекомбинантный белок OprF (растворенный в 8 Ммочевине); 4 - рекомбинантный белок OprF, очищенный и растворенный в буфере ФСБ.

Видоспецифичность полученного рекомбинантного белка OprF анализировали в ИФА с сыворотками кроликов, иммунизированных цельноклеточными культурами штаммов P.aeruginosa, относящихся к различным серовариантам: РА868, 170002,170005 и по классификации Fisher-Devlin (FD) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7. Во всех сыворотках, независимо от

серопринадлежности использованного для вакцинации штамма, в значительных количествах присутствовали антитела к OprF. Их не удалось выявить в сыворотках животных, иммунизированных цельноклеточными культурами других условно патогенных возбудителей (К.pneumoniae, S.aureus, P.vulgaris) и E.coli (Рис. 3).

О АУ 4

И* <г

штаммы бактерий

Рисунок 3. Анализ видоспецифичности подученного белка ОргР

Полученные результаты свидетельствовали о видовой специфичное™ полученного рекомбинантного белка ОргГ. Разработанная технология его получения позволила синтезировать продукт в количествах, достаточных для проведения экспериментов на животных с целью дальнейшего изучения иммунобиологических свойств.

Для оценки безопасности, установления характера и выраженности повреждающего действия на организм экспериментальных животных провели исследования острой токсичности двух вариантов рекомбинантного белка ОргР Р.аепщто$а, растворенного в ФСБ или Тле-НС! буфере.

Белых беспородных мышей взвешивали непосредственно перед экспериментом и каждый день в течение недели после введения препаратов. В течение 14 дней фиксировали общее состояние мышей, особенности их

поведения, интенсивность и характер двигательной активности, состояние волосяного покрова, потребление корма и воды.

Исходя из полученных результатов установили, что однократное введение препарата и вспомогательных веществ (гидроокиси алюминия и физраствора) не вызывало изменений в здоровье животных, в поведенческих реакциях, внешнем виде, не приводило к гибели и заболеваниям в течение всего времени наблюдения. Некоторое токсическое действие препарата отмечено только в одной группе животных, получавших 100 мкг рекомбинанткого белка, растворенного в буферном растворе ТШ8-НС1 (Рис.

4).

□ Изменение массы (%)

Доза (мкг) вводимого препарата

Рисунок 4. Изменение массы тела мышей (%) при оценке токсичности различных доз двух вариантов препаратов рекомбинанткого белка Оргр Р.аегщ>то$а.

На основании полученных результатов, в дальнейших исследованиях использовали препарат, растворенный в фосфатно-солевом буфере, рН 6,5 и сорбированный на гидроокиси алюминия (в соотношении 1:3).

Для введения животным готовили ряд серийных разведений. Дозы для однократного введения мышам в объеме 0,5 мл соответствовали 33, 6,6 и 1,32 мкг. Антигенные свойства белка тестировали в двух реакциях: в иммуноблоттинге и ИФА.

Сыворотки, полученные от иммунизированных мышей, в иммуноблоттинге четко реагировали с хроматографически очищенным рекомбинантным белком ОргР. Прослеживалась зависимость интенсивности окраски нитроцеллюлозной мембраны со связанным с ней бел ком ОргР от дозы введенного препарата и количества иммунизации. Сыворотки неиммунизированных животных не реагировали с рекомбинантным белком ОргР (Рис. 5).

~Т"^ 5 4 5 б 7 8 10

Рис. 5. Анализ в иммуноблоттинге наличия специфично реагирующих антител с рекомбинантным белком ОргР: I - сыворотки мышей, иммунизированных однократно дозой 33 мкг; 2 — сыворотки мыгией, иммунизированных однократно дозой 6,6 мкг; 3 — сыворотки мышей, иммунизированных однократно дозой 1,32 мкг; 4 — сыворотки мышей, иммунизированных двукратно дозой 6,6 мкг; 5 - сыворотки мыгией, иммунизированных двукратно дозой 33 мкг; 6 - сыворотки мышей, иммунизированных двукратно дозой 1,32 мкг; 7 - сыворотки мышей, иммунизированных трехкратно дозой 33 мкг; 8 — сыворотки мышей, иммунизированных трехкратно дозой 6,6 мкг; 9 - сыворотки мышей, иммунизированных трехкратно дозой 1,32 мкг; 10 - сыворотки неиммунизированных мышей.

Однократное введение любой используемой дозировки не вызывало значимой продукции антител. Их синтез происходил при иммунизации двукратно дозой 33 мкг и трехкратно - 6,6 мкг. Третья иммунизация препаратом в дозе 33 мкг не имела существенного преимущества по

сравнению со вторым введением той же дозы или использования препарата в дозе 6,6 мкг. Доза в 1,32 мкг оказалась неэффективной. Полученные в ИФА данные динамики накопления специфических антител свидетельствовали о статистически значимой зависимости уровня иммунного ответа у мышей от дозы вводимого антигена и кратности инъекций (Рис. 6).

250000

X

О ! 5 200000

а.

8

32 3 150000

О

©

I ■ 1 Ч 100000

® ш г» 50000

а.

Ш мыши получавшие дозу 33 мкг

' Ш мыши получавшие дозу '

6,6 мкг О мыши получавшие дозу ! 1,32 мкг

1 2 3

Кратность иммунизации

Рис. 6. Динамика накопления специфических антител в организме мышей (ИФА).

Для исследования антигенных свойств и продолжительности создаваемого иммунного ответа проводили длительную иммунизацию (десять инъекций) кроликов рекомбинантным белком ОргР. Двум кроликам вводили подкожно препарат в дозе 330 мкг и двум - 70 мкг. Интервал между иммунизациями составлял одну неделю. Через четыре, восемь, двенадцать, шестнадцать и двадцать недель после начала иммунизации проводили пробные кровопускания и исследовали пулы сывороток в ИФА.

По результатам исследования, установлено увеличение концентраций специфичных ^О антител в пробах от всех иммунизированных кроликов. Статистическая обработка данных показала, что дозы, содержащие рекомбинантный белок в количестве 330 мкг, стимулировали более быструю

выработку антител. Однако после десяти иммунизаций существенного превышения количества антител у животных, иммунизированных дозами в 330 мкг, над животными, получавшими по 70 мкг, не наблюдали. Через 2,5 месяца после вакцинации титр антител примерно выравнивался у всех животных (Рис. 7).

16000

te О к 14000

о а 12000

о

а 3 10000

о ж 8000

S X 6000

& S 4000

со п п 2000

о. 0

J?' jp-fc ъ

и Разовая иммунизационная доза , 330 миг

;в Разовая | иммунизаци-: онная доза | 70 мкг

сроки заборов крови

Рис. 7. Динамика накопления специфических IgG антител в крови иммунизированных кроликов.

В опытах по изучению активной защиты рекомбинантным белком OprF белых беспородных мышей, массой 15±1 г, проводили двукратную (с двухнедельным интервалом) внутрибрюшинную иммунизацию этим рекомбинантным белком. Через две недели животных опытной и контрольной групп заражали внутрибрюшинно живой вирулентной культурой P.aeruginosa в разных дозах (100, 200, 400, 800 и 1600x106 микробных клеток).

Установлено, что двукратная иммунизация препаратом в дозе 50 мкг приводила к увеличению приблизительно в 4 раза выживаемости мышей, по сравнению с контрольными неиммунизированными животными. LD30 для

животных опытной группы оказалась в 3,7 раза больше, чем для интактных. Полученные данные свидетельствовали о протективных свойствах изучаемого препарата рекомбияантного белка ОргР (Табл. 1).

Таблица 1.

Результаты опыта активной защиты мышей рекомбинантным белком ОргР.

Доза заражения (х106мк) Количество мышей (пало/заражено) LDio, (м к) Х±т Р<0,05

Двукратная иммунизация рекомбинантным белком ОргР 1600 45/45 153±38хЮ6

800 45/45.

400 38/45

200 33/45

100 14/45

Двукратное введение 0,9% раствора натрия хлорида (контроль) 400 45/45 41±6х106

200 45/45

100 43/45

50 32/45

25 5/45

12,5 0/45

На основании полученных данных о накоплении специфических антител к рекомбинантному белку OprF Р aeruginosa в сыворотках иммунизированных кроликов, представляло интерес оценить их превентивную активность в опытах пассивной защиты мышей

В экспериментах исследовали групповые пулы кроличьих сывороток, которые вводили мышам внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл за 2 часа до заражения различными дозами живой вирулентной культуры Р aeruginosa, штамм 170015. Контрольной группе мышей вводили 0,5 мл сыворотки интактных кроликов Подсчет павших животных проводили в течение пяти дней после заражения

Анализ полученных результатов выявил достоверные различия в величине LDj0 заражающего штамма синегнойной палочки для опытных и контрольных животных Введение иммунных сывороток перед

инфицированием повышало устойчивость мышей к гибели. Индексы эффективности пулов иммунных кроличьих сывороток по сравнению с пулом фоновых составили: для сывороток животных, получавших препарат в дозе 330 мкг - 7,4; для сывороток кроликов, получавших препарат в дозе 70 мкг -2,3 Следует заметить, что введение мышам пула сывороток неиммунизированных кроликов так же сопровождалось защитным эффектом и)5о составляла 151±37х10б и в 3,3 раза превышала ЬО50 для неиммунизированных животных (табл 2).

Таблица 2.

Оценка защитных свойств иммунных кроличьих сывороток к рекомбинантному белку ОргБ Р.аеп^тоэа.

Группа мышей Доза заражения (х106мк) Количество мышей (нало/заражено) ьо50. {мк) Х±т Р<0,05 Индекс эффективности (ЬОадВ опыте/И>5о в контроле)

Введен пул сывороток кроликов, иммунизированных дозой 330 мкг 1600 27/40 113Ш24х!0б 7,4 1

800 9/40

400 3/40

200 1/40

100 0/40

Введен пул сывороток кроликов, иммунизированных дозой 70 мкг 1600 40/40 348±64хЮ6 2,3

800 40/40

400 21/40

200 7/40

100 0/40

Введен пул фоновых сывороток (контроль) 400 39/40 151±37*106

200 21/40

100 11/40

50 5/40

25 0/40

Интактные мыши (контроль культуры) 200 20/20 46±б,4х106 -----

100 18/20

50 11/20

25 3/20

12,5 0/20

Таким образом, в опытах пассивной защиты выявлены протективные

свойства иммунных сывороток, величина активности которых зависела от дозы взятого для иммунизации кроликов препарата.

Дня дополнительного подтверждения антипсевдомонадной активности полученных кроличьих сывороток проведено тестирование пяти индивидуальных образцов на моделях торможения роста культур Р.аеги£спойа (Рис. 8А и 8Б).

Рисунок 8. Динамика измерения моделей роста культуры Р.аегщтот (штамм 170015) при исследовании антибактериальных свойств сывороток: А - с посевной дозой 1О8 КОЕ/мл, Б - с посевной дозой Ю7 КОЕ/мл.

В результате добавления сывороток кроликов №2, №3 и №4 в бактериальную культуру, содержащую Ю8 КОЕ/мл, рост микроорганизма снижался по сравнению с контролем до 78%, 65% и 77%, соответственно При использовании концентрации 107 КОЕ/мл снижение роста составило 99% с сыворотками № 2 и №4 и 88% с сывороткой №3. Сыворотка №1 не обладала существенными бактериостатическими свойствами- при концентрации I08 КОЕ подавление роста составило лишь 20%, а при 107 КОЕ/мл - 26%. Сыворотка интактного кролика (№5) не обладала антибактериальной активностью (6% торможение роста при 1 О8 КОЕ/мл)

Учитывая данные литературы о консервативности структуры лоринового белка F наружной мембраны Pseudomonas spp, на следующем этапе работы представляло интерес оценить способность иммунной сыворотки тормозить рост культур Р aeruginosa разных серовариантов по классификации Habs. Проведено 6 опытов с наиболее активной сывороткой от кролика №4 и выведены средние значения процентов подавления роста микроорганизмов при концентрации 10s КОЕ/мл: на 51,6% торможение роста для сыворотки кролика №4 и на 27,3% для пула фоновых По данным исследований антибактериальная активность в отношении серотипов различалась (Табл. 3).

Таблица 3.

Подавление роста культур P.aeruginosa, относящихся к разным серовариантам штаммов, по классификации Habs

Серовариант штамма по классификации Habs № штамма Подавление роста штаммов (%)

Сыворотка кролика №4 Пул фоновых

1 170025 62 34

2 170026 37 12

3 170027 70 51

4 170028 58 42

5 170029 22 16,5

6 170030 44 Нет подавления роста

7 170031 50 21

8 170032 74 44,5

9 170033 48,5 Нет подавления роста

10 170034 43 25

и 170035 53 37,5

12 170036 58 44,5

Общее значение 51,6 27,3

На наш взгляд, возможно, это обусловлено процентным содержанием белка OprF в клеточной стенке различных штаммов.

Основываясь на полученных результатах, правомерно утверждать, что полученный препарат рекомбинантного белка F (OprF) наружной мембраны Р aeruginosa нетоксичен, обладал видовой специфичностью, иммуногенными свойствами, проявляя антигенную и протективную активности, и предупреждал развитие инфекции, вызываемой Р aeruginosa

выводы

1 Получен бактериальный продуцент (Е coli) рекомбинантного белка F наружной мембраны (OprF) Р aeruginosa, характеризующийся высоким выходом продукта (30%). Разработаны методические приемы получения очищенного рекомбинантного белка с молекулярной массой 40 кДа и доказана его специфичность

2 Установлено, что рекомбинантный белок OprF нетоксичен, обладает антигенной активностью, о чем свидетельствовала динамика накопления антител в процессе иммунизации мышей и кроликов Доказана его протективная активность на модельной синегнойной инфекции.

3. Полученные кроличьи иммунные сыворотки к рекомбинантному белку OprF, обладали видовой специфичностью, антибактериальной активностью и обеспечивали защиту белых мышей от экспериментальной синегнойной инфекции

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Никонова А А., Злыгостев С.А., Калошин А А. Клонирование и экспрессия генов белков внешней мембраны ряда условно патогенных микроорганизмов 8-ая международная школа-конференция молодых ученых - "Биология наука XXI века", Пущино Май 2004.

2. Злыгостев С.А., Калошин А А, Гатауллин А.Г Изучение антигенных свойств рекомбинантного белка F наружной мембраны (OprF) Pseudomonas aeruginosa 9-ая международная школа-конференция молодых ученых - "Биология наука XXI века", Пущино Апрель 2005.

3. Калошин А.А., Злыгостев С.А., Торпчина Ю Н, Курбатова Е А, Зверев В.В., Михайлова Н А. Получение рекомбинангнош белка F наружной мембраны (OprF) Pseudomonas aeruginosa и изучение его антигенных свойств // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии -2005 -№5.-С 50-53

4 Злыгостев С.А, Торпчина Ю Н., Калошин А.А., Зверев В В, Михайлова Н.А. Получение и характеристика рекомбинантного белка F наружной мембраны (OprF) Pseudomonas aeruginosa. Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке- разработка, производство и применение Материалы Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной 100-летию основания филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «МИКРОГЕН» МЗ и CP РФ, 7-9 июня 2005 года

5. Семенов Б Ф., Зверев В.В., Михайлова Н.А, Злыгостев С.А., Торпчина Ю Н, Калошин А.А., Ярулин В.Р, Курбатова Е.А, Егорова Н.Б Разработка генно-инженерных вакцин против условно патогенных микроорганизмов. // Физиология и патология иммунной системы. -2005. - № 9 - С. 32-37

6 Злыгостев С А, Гатауллии А Г, Калошин А.А., Михайлова Н.А., Зверев В.В. Исследование защитных свойств рекомбинантного белка F

наружной мембраны (OprF) Pseudomonas aeruginosa Н Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии - 2006 - Ж7 - С 43-47.

7 Калошин A.A., Злыгостев С.А., Гатауллин А Г., Михайлова НА., Зверев В.В. Исследование антигенных свойств рекомбинантного белка F наружной мембраны (OprF) Pseudomonas aeruginosa. П Биопрепараты -март 2007. - №1 (25). - С. 2-5.

8 Зверев В.В., Михайлова Н А, Калошин А А., Злыгостев С А, Гатауллин А.Г. Исследование иммунопенных свойств рекомбинантных белков F и L наружной мембраны Pseudomonas aeruginosa. Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва, апрель 2007 С 67

Злыгостев Сергей Александрович (Россия)

«Получение рекомбинантного белка внешней мембраны OprF Pseudomonas aeruginosa и изучение его иммунобиологических свойств»

В Escherichia coli М 15 клонирован ген белка F наружной мембраны (OprF) Pseudomonas aeruginosa Хроматографически очищенный на Ni-агарозе рекомбинантный белок F специфически peaz ирует с иммунной к Р aeruginosa кроличьей сывороткой, а у мышей, которым вводили этот белок, синтезируются специфические IgG антитела Подобраны оптимальные концентрации белка F Р aeruginosa для дальнейшей проверки его защитных свойств от инфекции, вызываемой Р aeruginosa Выявлено, что в организме кроликов, иммунизированных рекомбинантным белком F, синтезируются специфические антитела, которые тормозят ш vitro рост Р aeruginosa В опытах in vivo показано, что кроличьи иммунные сыворотки и препарат рекомбинантного белка OprF способны защищать мышей от внутрибрюшинной инфекции, вызываемой Р aeruginosa

Zlygostev Sergey AJexandrovich (Russia) Obtaining Pseudomonas aeruginosa recombinant outer membrane protein F and the study of its immunoblologycal properties.

In Escherichia coli M 15, the gene of Pseudomonas aeruginosa recombinant outer membrane protein F (OprF) was cloned OprF, chromatographically purified on Ni-agarose was obtained. The purified OprF specifically reacted with rabbit serum, immune to P aeruginosa, and m the mice injected with this protein specific IgG antibodies were synthesized The optimum concentrations of P aeruginosa OprF were selected for furthei tests of its protective properties from infection induced by Paeruginosa Studi showed that synthesis of specific IgG occurs in rrabbits immunized with recombinant outer membrane protein F (OprF) of P.aerugmosa and that these antibodies inhibit grow of P aeruginosa in vitro. In vtvo studies on mice showed that rabbit immune sera and recombinant OprF are both able to protect animals from intraperitoneal challenge with P aeruginosa.

У ui 111,4 л 1 5 Тираж 1(Ю Заказ 23/04-0RT

Подписан« в печать 23 04 OS Формат бумаги 60/84/16 Бумага офсетная №1 Ch печатано в типографии «Opivcpum.-2WQ» (15419 | Моеква.уя Орджоникидзе 3

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Злыгостев, Сергей Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Роль P.aeruginosa в инфекционной патологии человека.

Глава 2. Основные факторы патогенности и антигенные структуры синегнойной палочки.

Глава 3. Перспективы разработки генно-инженерных вакцин против бактериальных инфекций.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 4. Материалы и методы.

4.1. Материалы.

4.1.1. Использованные штаммы.

4.1.2. Экспериментальные животные.

4.1.3. Протеины и сыворотки.

4.1.4. Оборудование.

4.1.5. Реактивы.

4.2. Методы.

4.2.1. Выделение геномной ДНК P.aeruginosa.

4.2.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

4.2.3. Трансформация клеток E.coli.

4.2.4. Выделение плазмидной ДНК (микровариант).

4.2.5. Определение нуклеотидной последовательности.

4.2.6. Электрофорез белков в полиакриламидном геле по Лэммли.

4.2.7. Иммуноблоттинг.i.

4.2.8. Иммуноферментный анализ (ИФА).

4.2.9. Получение иммунных сывороток.

4.2.10. Статистические методы.

Глава 5. Получение рекомбинантного белка наружной мембраны OprF P.aeruginosa.

5.1. Клонирование гена рекомбинантного белка OprF.

5.2. Получение рекомбинантного белка OprF.

5.3. Характеристика специфичности полученного рекомбинантного белка OprF.

Глава 6. Изучение иммунобиологических свойств рекомбинантного белка OprF.

6.1. Изучение антигенных свойств рекомбинантного белка OprF.

6.2. Изучение токсичности рекомбинантного белка OprF.

6.3. Изучение протективных свойств рекомбинантного белка OprF.

Глава 7. Изучение свойств иммунных кроличьих сывороток к рекомбинантному белку OprF P.aeruginosa.

7.1. Исследование превентивных свойств иммунных кроличьих сывороток к рекомбинантному белку OprF.

7.2. Изучение антибактериальных свойств иммунных сывороток к рекомбинантному белку OprF.

7.3. Оценка внутривидовой специфичности полученных иммунных сывороток к рекомбинантному белку OprF.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение рекомбинантного белка внешней мембраны OprF Pseudomonas Aeruginosa и изучение его иммунобиологических свойств"

Актуальность проблемы. Синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa) в настоящее время продолжает оставаться одним из основных возбудителей гнойно-септических заболеваний и осложнений в условиях стационара. В России она занимает второе место после кишечной палочки среди микроорганизмов, вызывающих госпитальные инфекции в отделениях интенсивной терапии и реанимации [27, 35, 50, 66]. Р,aeruginosa также является причиной развития пневмоний, поражений мочеполовой системы у урологических больных, часто встречается у больных с ожогами, вызывает 20-25% гнойных хирургических инфекций и первичных грамотрицательных бактериемий [8, 14, 36, 41].

С одной стороны, частота развития синегнойной инфекции связана с увеличением количества больных с признаками вторичных иммунодефицитов, развивающихся в результате экологического S неблагополучия, хирургических вмешательств, диагностических манипуляций, обширных термических и лучевых поражений, травм, онкологических процессов, родов, а также нерационального использования антибиотиков [27, 35]. С другой стороны, синегнойная палочка отличается высоким уровнем передающейся с плазмидами резистентности к антибактериальным и химиотерапевтическим препаратам, антисептикам и дезинфектантам. Эти обстоятельства обуславливают актуальность разработок препаратов для иммунопрофилактики и иммунотерапии заболеваний, вызываемых P.aeruginosa [50, 66].

Активная иммунизация может быть одним из эффективных средств защиты против условно патогенных микроорганизмов и, в частности, P.aeruginosa. Для индукции противосинегнойного иммунитета в нашей стране разрабатывались препараты на основе инактивированных бактерий, их компонентов и экзопродуктов: поливалентная синегнойная корпускулярная вакцина [45, 47], пиоиммуноген [55, 58], псевдомонасвакцина [6, 17, 18, 19, 58, 59, 61, 70], а также препараты на основе экзотоксина А P.aeruginosa - анатоксин синегнойной палочки [25, 28, 33, 34]. По разным причинам в настоящее время для использования в клинической практике не зарегистрировано ни одного препарата, предназначенного для иммунопрофилактики и иммунотерапии синегнойных инфекций.

Трудности создания эффективных иммунопрепаратов против синегнойной палочки заключаются в том, что патогенез развивающихся с ее участием инфекций обусловлен воздействием целого ряда факторов патогенности, среди которых выделить наиболее значимый для разработки вакцинных препаратов представляется сложной задачей.

Известно, что на первом этапе инфекционного процесса, когда происходит инвазия возбудителя в ткани хозяина, важную патогенетическую роль играют поверхностные антигены бактериальной клетки, имеющие исключительное значение в стимуляции врожденного и адаптивного иммунитета [59, 82].

Современные лабораторные методики позволяют выделить и исследовать иммунобиологические свойства большого спектра антигенов имеющихся в структуре P.aeruginosa. При том, особое внимание уделяется поверхностным антигенам и экзотоксинам. В настоящее время зарубежными и российскими исследователями иммунологически охарактеризовано большинство белковых компонентов клеточной стенки Р.aeruginosa [59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 98, 107, 108].

Установлено, что некоторые из них индуцировали иммунный ответ и обладали протективной активностью против бактериемии, вызываемой P.aeruginosa у пациентов ожоговых стационаров [122, 132, 133, 134].

Особый интерес представляет белок F наружной мембраны (OprF -outer membrane protein F), участвующий в формировании пор микроорганизма. Его аминокислотная последовательность является высококонсервативной для представителей рода Pseudomonas (P.fluorescens,

P.alcaligenes, P.putida и др.). Это обстоятельство обуславливает целесообразность изучения иммунобиологических свойств белка OprF для создания вакцины широкого спектра действия против различных видов Pseudomonas [59, 60, 63, 157].

При использовании традиционных методов, когда для создания вакцин из бактериальной клетки необходимо выделить протективные антигены, возникает ряд проблем. Во-первых, процентное отношение протективных антигенов в составе клетки микроорганизма незначительно, и поэтому при культивировании необходимы большие объемы биомассы, а также необходимы многостадийные методики очистки и концентрирования, что обуславливает высокие производственные затраты. Во-вторых, не гарантировано полное отсутствие примесей обеспечивающих неблагоприятные реакции организма.

В последнее время при создании вакцинных препаратов все большое внимание уделяется использованию генно-инженерных методов, суть которых заключается во встраивании генов, отвечающих за синтез протективных антигенов в возбудителях, в геном непатогенной бактерии (например, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae и др.) [154]. Во время культивирования полученных продуцентов, в большом количестве синтезируется протективный антиген, который подвергается простой очистке и может использоваться для приготовления вакцины. Такая стратегия позволяет вычленить и использовать наиболее иммуногенные компоненты бактерии, а при производстве вакцин исключает контакт сотрудников с культурами патогенных микроорганизмов, что является существенным технологическим преимуществом, обеспечивающим безопасность персонала.

Впервые возможность стимуляции иммунных реакций у животных с использованием отдельных генно-инженерных белковых доменов поверхностного белка VP1 вируса ящура была продемонстрирована в 1982 году [91], затем в 1984 году описана индукция защитных реакций в организме мышей при использовании рекомбинантного полноразмерного белка gD вируса простого герпеса [130]. В последние годы для вакцинации населения против вирусного гепатита В применяются препараты на основе дрожжевых рекомбинантных белков (например «Энджерикс В») [162, 147].

При создании генно-инженерных вакцин обязательным условием является наличие достоверной информации об иммуногенности определенных белков и кодирующих их нуклеотидных последовательностях [106]. Как уже отмечено выше, были исследованы иммунобиологические свойства большого спектра выделенных антигенов, имеющихся в структуре P.aeruginosa. Кроме того, геном (6,26 млн. нуклеотидных пар) данного микроорганизма (штамм РА01) полностью отсеквенирован и представлен в базе данных GenBank (Accession Number АЕ004091). Поэтому в настоящее время зарубежными исследователями проводятся работы по созданию вакцин с использованием генов белков наружной мембраны P.aeruginosa. Изучение таких препаратов показало их высокую иммуногенность и безвредность [98, 129, 137]. При этом, используют как полные аминокислотные последовательности, так и отдельные пептиды.

Цель работы: Получение рекомбинантного белка, F наружной мембраны (OprF) P.aeruginosa и изучение его иммунобиологических свойств.

Задачи исследования:

1. Выделить геномную ДНК P.aeruginosa, амплифицировать ген белка OprF с помощью ПЦР, встроить его в вектор, предназначенный для экспрессии в клетках E.coli и получить бактериальный продуцент рекомбинантного белка.

2. Наработать и хроматографически очистить рекомбинантный белок OprF. s

3. Изучить иммунобиологические свойства рекомбинантного белка OprF P.aeruginosa.

4. Получить иммунные сыворотки и изучить их превентивные свойства.

Научная новизна и теоретическая значимость

• Получен непатогенный бактериальный продуцент E.coli, характеризующийся гиперэкспрессией рекомбинантного белка F наружной мембраны P.aeruginosa (около 30% от содержания общего клеточного белка).

Аминокислотная последовательность рекомбинантного белка OprF • содержала дополнительных 6 гистидиновых оснований, необходимых для ионно-афинной хроматографии на Ni-агарозном сорбенте, что позволило выделить высокоочищенный препарат.

Очищенный рекомбинантный белок OprF в реакции ИФА проявлял высокое специфическое взаимодействие с различными иммунными сыворотками, содержащими антитела к штаммам P.aeruginosa по классификации Fisher-Devlin.

Иммунизация очищенным рекомбинантным белком OprF стимулировала у животных выработку специфических антител, а полученные к нему иммунные кроличьи сыворотки обладали протективными свойствами.

Выявлена перекрестная активность иммунных кроличьих сывороток к рекомбинантному белку OprF на моделях торможения роста культур P.aeruginosa различных серовариантов по классификации Habs.

Практическая значимость

Созданный штамм-продуцент E.coli может быть использован в качестве производственного в технологии получения рекомбинантного белка F наружной мембраны P.aeruginosa при разработке вакцины против синегнойной инфекции.

Отсутствие патогенных свойств у полученного штамма, а также простота методики выделения белкового продукта гарантируют безопасность и технологичность производственного процесса.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Сконструированный штамм-продуцент E.coli Ml5 pQE-30/oprF характеризуется высоким выходом целевого продукта (30% от содержания общего клеточного белка), а разработанные технологические приемы получения и очистки рекомбинантного белка позволяют нарабатывать его в количествах, требуемых для биологического тестирования.

2. Полученный рекомбинантный белок OprF внешней мембраны P.aeruginosa нетоксичен, обладает антигенными и протективными свойствами.

3. Присутствие антител к рекомбинантному белку OprF в сыворотках кроликов после иммунизации культурами штаммов P. aeruginosa, относящихся к различным серовариантам, подтверждает его специфичность для рода Pseudomonas.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Злыгостев, Сергей Александрович

ВЫВОДЫ

1. Получен бактериальный (E.coli) продуцент рекомбинантного белка F наружной мембраны (OprF) P.aeruginosa характеризующийся высоким выходом продукта (30%). Разработаны методические приемы получения очищенного рекомбинантного белка с молекулярной массой 40 кДа и доказана его специфичность.

2. Установлено, что рекомбинантный белок OprF нетоксичен, обладает антигенной активностью, о чем свидетельствовала динамика накопления антител в процессе иммунизации мышей и кроликов. Доказана его протективная активность на модельной синегнойной инфекции.

3. Полученные кроличьи иммунные сыворотки к рекомбинантному белку OprF, обладали видовой специфичностью, антибактериальной активностью и обеспечивали защиту белых мышей от экспериментальной синегнойной инфекции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Pseudomonas aeruginosa продолжает оставаться одним из основных возбудителей гнойно-септических заболеваний и осложнений, возникающих после термических поражений, хирургических вмешательств, родов и других состояний, сопровождающихся снижением иммунологической резистентности. P.aeruginosa также является причиной развития пневмоний и поражений мочеполовой системы у урологических больных. В России этот условно патогенный возбудитель занимает второе место после E.coli среди микроорганизмов, вызывающих госпитальные инфекции в отделениях интенсивной терапии и реанимации [30, 38, 53, 70].

Гнойно-воспалительные заболевания, вызываемые синегнойной палочкой, характеризуются тяжелым течением, интоксикацией, развитием септического шока, высокой летальностью, трудно поддаются терапии антибиотиками, поэтому исследования по разработке иммунобиологических средств направленного действия против P.aeruginosa актуальны и социально-экономически обоснованы.

Для формирования иммунитета к P.aeruginosa в нашей стране разрабатывались препараты на основе инактивированных бактерий, их компонентов и экзопродуктов: поливалентная синегнойная корпускулярная вакцина, пиоиммуноген, псевдомонас-вакцина, а также препараты на основе экзотоксина А от P.aeruginosa - анатоксин синегнойной палочки [6, 11, 12, 23, 24, 25, 68, 69, 70, 79, 87]. По разным причинам в настоящее время для использования в клинической практике не зарегистрировано ни одного лекарственного средства, предназначенного для иммунопрофилактики и иммунотерапии синегнойных инфекций.

Трудности создания эффективных вакцин против синегнойной инфекции заключаются в том, что патогенез заболевания обусловлен воздействием целого ряда факторов патогенности. Однако известно, что на первом этапе инфекционного процесса, когда происходит инвазия возбудителя в ткани хозяина, важную роль играют поверхностные антигены бактериальной клетки — белки с молекулярной массой в пределах от 9 до 55 кД, имеющие исключительное значение в стимуляции врожденного и адаптивного иммунитета [161, 162, 163]. Анализируя данные электрофоретического изучения белковых препаратов, исследователи определили присутствие иммунологически активных белков F, Н, L, I и др. [23].

Белок. F наружной мембраны участвует в формировании пор микроорганизма. Согласно данным Hancock et al. [118, 119], его аминокислотная последовательность является высококонсервативной для представителей рода Pseudomonas {P.fluorescens, P.alcaligenes, P.putida и др.). Это обстоятельство указывает на необходимость детального изучения его иммунобиологических свойств, что является обязательным условием при разработке вакцины против Pseudomonas.

На первом этапе работы амплифицирована с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) нуклеотидная последовательность, кодирующая ген белка OprF. В качестве матрицы использована геномная ДНК P.aeruginosa (штамм РА103).

Для получения препаративных количеств ДНК при ПЦР- ■ амплификации с использованием базы данных GenBank подобрали праймеры. Они были специфичны к концевым нуклеотидам гена oprF и имели на 5'-концах дополнительные участки узнавания рестриктаз BamH I и Hind III, необходимые для встраивания в полилинкер плазмиды pQE-30 (QIAGEN). Используемая плазмида имела регуляторные участки для экспрессии клонированного гена в клетках E.coli.

При анализе амплификатов в агарозном геле идентифицирован ПЦР-продукт, имеющий размер 1 kb, совпадающий по массе с геном, кодирующим полную последовательность белка OprF.

Синтезированный ПЦР-амплификат обрабатывали ферментами о рестрикции BamH I и Hind III. Встраивание рестрикта проводили в полилинкер плазмиды pQE-30 (QIAGEN) по тем же сайтам рестрикции.

Как показали данные секвенирования клонированного рекомбинантного гена, кодируемая им аминокислотная последовательность совпадала с референс-последовательностыо из базы данных GenBank (Accession Number АЕ004091). Произошедшая замена одного нуклеотида в гене синтезированного рекомбинантного продукта не повлияла на аминокислотный состав, поскольку изменившийся триплет кодировал аналогичную аминокислоту. Важной особенностью полученного рекомбинантного белка являлось наличие на N-конце дополнительной аминокислотной последовательности, необходимой для последующей очистки получаемого продукта (Met-Arg-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His).

При культивировании сконструированного генно-инженерного штамма, в результате индуцированной экспрессии гена, в лизате продуцента наблюдалось присутствие белкового продукта, размер которого по данным электрофореза соответствовал 40 кДа, что совпадало с расчетной величиной нативного белка OprF (37,6 кДа). При этом его выход составил около 30% от общего клеточного белка.

Используя в качестве сорбента Ni-NTA-агарозу, проведена очистка рекомбинантного белка методом ионно-афинной хроматографии. Для плавного понижения кислотности суспензии использовали четыре элюирующих раствора с разными значениями рН (буфер В - 8,0; буфер С — 6,3; буфер D - 5,9; буфер Е - 4,5). В процессе очистки получали фракции, содержащие белок OprF, определяемый электрофоретическим анализом.

Специфичность рекомбинантного белка OprF анализировали в иммуноблоттинге с использованием сыворотки кролика, иммунизированного цельной культурой P.aeruginosa (шт. РА868). Полученный белковый продукт высокоспецифично реагировал с иммунной сывороткой, как до очистки, так и после нее.

Видоспецифичность полученного рекомбинантного белка OprF анализировали в ИФА с сыворотками кроликов, иммунизированных цельными культурами штаммов P.aeruginosa, относящихся к различным серовариантам: РА868, 170002, 170005, по классификации Fisher-Devlin (FD) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7. Во всех сыворотках, независимо от серопринадлежности использованного для вакцинации штамма, в значительных количествах присутствовали антитела к OprF. Их не удалось выявить в сыворотках животных, иммунизированных цельными культурами других условно патогенных возбудителей (K.pneumoniae 8126, S.aureus, P.vulgaris 111) и E.coli (F147).

Полученные результаты свидетельствовали о видовой специфичности полученного рекомбинантного белка OprF. Разработанная технология его г получения позволила синтезировать продукт в количествах, достаточных для проведения экспериментов на животных с целью дальнейшего изучения иммунобиологических свойств.

Для оценки безопасности, установления характера и выраженности повреждающего действия на организм экспериментальных животных провели токсикологические исследования двух вариантов рекомбинантного белка OprF P.aeruginosa: растворенного в ФСБ и Tris-HCl буфере.

Белых беспородных мышей взвешивали непосредственно перед экспериментом и каждый день в течение недели после введения препаратов. В течение 14 дней фиксировали общее состояние мышей, особенности их поведения, интенсивность и характер двигательной активности, состояние волосяного покрова, потребление корма и воды.

Исходя из полученных результатов установили, что однократное введение препарата и вспомогательных веществ (гидроокиси алюминия и физраствора) не вызывало изменений в здоровье животных, в поведенческих реакциях, внешнем виде, не выявлено гибели и заболеваний в течение всего времени наблюдения. Некоторое токсическое действие препарата отмечено только в одной группе животных, получавших 100 мкг рекомбинантного белка растворенного в буферном растворе TRIS-HC1.

На основании полученных результатов, в дальнейших исследованиях использовали препарат, растворенный в фосфатно-солевом буфере рН=6,5 и сорбированный на гидроокиси алюминия (в соотношении 1:3).

Для введения животным готовили ряд серийных разведений. Дозы для однократного введения мышам соответствовали 33, 6,6 и 1,32 мкг в объеме 0,5 мл. Антигенные свойства белка тестировали в двух реакциях: в иммуноблоттинге и ИФА.

Сыворотки, полученные от иммунизированных мышей, в иммуноблоттинге четко реагировали с хроматографически очищенным рекомбинантным белком OprF. Прослеживалась зависимость интенсивности окраски нитроцеллюлозной мембраны со связанным с ней белком OprF от дозы введенного препарата и количества иммунизаций. Сыворотки неиммунизированных животных не реагировали с рекомбинантным белком OprF.

Однократное введение любой используемой дозировки не вызывало значимой продукции антител. Значительное накопление специфичных IgG антител происходило при иммунизации двукратно дозой 33 мкг и трехкратно - 6,6 мкг. Третья иммунизация препаратом в дозе 33 мкг не имела существенного преимущества по сравнению со вторым введением той же дозы или использования препарата в дозе 6,6 мкг. Доза в 1,32 мкг оказалась неэффективной. Полученные в ИФА данные динамики накопления специфических антител свидетельствовали о статистически значимой зависимости уровня иммунного ответа у мышей от дозы вводимого антигена и кратности инъекций.

Для исследования антигенных свойств и продолжительности создаваемого иммунного ответа проводили длительную иммунизацию (десять инъекций) кроликов рекомбинантным белком OprF. Четырем кроликам вводили подкожно препарат в дозе 330 мкг и четырем - 70 мкг. Интервал между иммунизациями составлял одну неделю.

Для изучения динамики накопления антител проводили пробные кровопускания через четыре, восемь, двенадцать, шестнадцать и двадцать недель после начала иммунизации и исследовали пулы сывороток в ИФА.

У животных обеих групп наблюдали схожую между собой статистически значимую тенденцию изменения количества антител во времени. На протяжении всего цикла иммунизаций уровни специфических антител возрастали, но с прекращением введения препарата в течение двух недель снижались до исходных значений.

В опытах по изучению активной защиты рекомбинантного белка OprF белым беспородным мышам массой 15±1 г проводили двукратную' (с двухнедельным интервалом) внутрибрюшинную иммунизацию рекомбинантным белком OprF. Через две недели животных опытной w контрольной групп заражали внутрибрюшинно живой вирулентной культурой P.aeruginosa в разных дозах (100, 200, 400, 800 и 1600x106 микробных клеток).

Установлено, что двукратная иммунизация препаратом в дозе 50 мкг приводила к увеличению приблизительно в 4 раза выживаемости мышей, по сравнению с контрольными неиммунизированными животными. LD50 для животных опытной группы оказалась в 3,7 раза больше, чем для интактных. Полученные данные свидетельствовали о протективных свойствах изучаемого препарата.

Для получения иммунных кроличьих сывороток проводили длительную иммунизацию животных рекомбинантным белком OprF подкожно. При этом использовали дозы для однократного введения 330 и 70 мкг.

По результатам исследования сывороток с помощью ИФА, установлено-появление высоких концентраций специфичных IgG антител в пробах от всех иммунизированных кроликов: Статистическая обработка данных показала, что дозы, содержащие рекомбинантный белок в количестве 330 мкг, стимулировали более быструю выработку антител. Однако после десяти иммунизаций существенного превышения количества антител у животных, иммунизированных дозами в 330 мкг, над животными; получавшими по 70 мкг, не наблюдалось. Через 2,5 месяца после вакцинации титр антител примерно выравнивался у всех животных.

На основании полученных данных o^ накоплении, специфических антител к рекомбинантному белку OprF P.aeruginosa в сыворотках иммунизированных кроликов, представляло интерес оценить, их

I • превентивную активность в опытах пассивной защиты мышей.

В- экспериментах исследовали* групповые пулы, кроличьих сывороток, которые-вводили мышам внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл за 2 часа до-заражения различными дозами живой вирулентной культуры P.aeruginosa, штамм 170015! Контрольной группе мышей вводили 0,5 мл интактной сыворотки. Подсчет павших животных вели в течение пяти дней после заражения.

Анализ полученных результатов выявил достоверные различия в величине LD50 заражающего штамма синегнойной палочки'для, опытных и контрольных животных. Введение^ иммунных сывороток перед заражением повышало устойчивость мышей к гибели. Индексы эффективности иммунных кроличьих сывороток по сравнению с пулом фоновых составили: для сывороток животных, получавших препарат в дозе 330 мкг - 7,4; для сывороток кроликов получавших препарат в дозе 70 мкг - -2,3. Следует заметить, что введение мышам пула сывороток неиммунизированных кроликов так же сопровождалось защитным эффектом: LD50 равнялась 151±37х106 и в 3,3 раза превышала LD5o для неиммунизированных животных.

Таким образом, в опытах пассивной защиты* выявлены протективные свойства иммунных сывороток, величина активности которых зависела от дозы взятого для иммунизации препарата.

Для дополнительного подтверждения антипсевдомонадной активности полученных кроличьих сывороток проведено тестирование пяти индивидуальных образцов на моделях торможения роста культур P.aeruginosa.

В результате добавления иммунных сывороток в бактериальную о культуру, содержащую 10 КОЕ/мл, рост микроорганизма снижался по у сравнению с контролем до 65—77%. При использовании концентрации 10 КОЕ/мл торможение роста составило 88-99%. Сыворотка интактного кролика, как и'. следовало ожидать, не обладала антибактериальной о ч активностью (6% торможение роста при 10 КОЕ/мл и

9% при 10 КОЕ/мл).

Учитывая данные литературы [118, 119] о консервативности поринового белка F наружной мембраны Pseudomonas spp., на следующем этапе работы представляло интерес оценить способность иммунной сыворотки тормозить рост культур P.aeruginosa разных серовариантов по классификации Habs. Проведено 6 опытов с наиболее активной сывороткой от кролика №4 и выведены средние значения процентов подавления роста микроорганизмов (51,6% торможение роста при 105 КОЕ/мл для сыворотки кролика №4 и 27,3% для пула фоновых). По данным исследований антибактериальная активность в отношении серотипов различалась. На наш взгляд, возможно, это обусловлено процентным содержанием белка OprF в клеточной стенке различных штаммов.

Основываясь на полученных результатах, правомерно утверждать, что препарат рекомбинантного белка OprF обладает иммуногенными свойствами, проявляя антигенную и протективную активности, и предотвращает развитие инфекции, вызываемой Р.aeruginosa.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Злыгостев, Сергей Александрович, Москва

1. Ашмарин И.П., Воробьев А. А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. // Ленинград 1962.

2. Асланов Б.И., Антибиотикорезистентность грамотрицательных микроорганизмов возбудителей внутрибольничных инфекций в стационарах: Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук, С-Пб 2001. — 24 с.

3. Ахметова Л.И., Бейкин Я.Б., Розанова С.М., Руднов В.А. Резистентность возбудителей внутригоспитальных инфекций // Материалы IV Российского национального конгресса «Человек и лекарство» Москва, — 1997.-С. 11.

4. Ахметова Л.И., Розанова С.М., Руднов В.А. Возбудители госпитальной инфекции // Материалы VI Российского национального конгресса «Человек и лекарство» Москва, - 1999. — С. 273.

5. Бандман О.А., Едвабная Л.С., Булк В.Ф. и др. Бесклеточная вакцина псевдомонас: иммунохимическая характеристика и иммуногенность // Журн. микробиол. 1987. - № 11. - С. 44-47.

6. Беляков В.Д., Ряпис Л.А., Илюхин В.И. Псевдомонады и псевдомонозы//Москва, «Медицина»,- 1990.

7. Блинкова Л.П. Получение Томицида — нового препарата и изучение его биологической активности: Автореферат диссертации на соискание доктора биологических наук, Москва — 1986 г.

8. Брискин Б.С., Хачатрян Н.Н. Внутрибольничные инфекции и их профилактика: взгляд хирурга // Consilium medicum. — 2001. №6. — С. 309312.

9. Брусина Е.Б. Эпидемиология синегнойной инфекции и задачи сестринского персонала по ее профилактике в стационарах // Главная медсестра. 2002. - №10. - С. 114-116.

10. Госпитальная инфекция и лекарственная устойчивость микроорганизмов. // Под ред. В.И. Покровского М 1992.

11. Грязнова Н.С, Субботина Н.А. // Антибиотики и химиотерапия — 1989. Т. 34. № 12.

12. Едвабная JI.C., Зайднер И.Г., Макаренко Т.А. и др. Белковые протективные антигены P.aeruginosa // Журн. микробиол. 1985. — № 11. — С. 18-23.

13. Едвабная Л.С., Шаханина К. Л., Дибейская З.А. и др. // Журн. микробиол.- 1983.-№ 1.-С. 36-39.

14. Илюхин В.И. Псевдомонадные инфекции в патологии человека. // Журн. микробиол. 1985. - № 2. - С. 110-114.

15. Исхакова Х.И. Синегнойная палочка и другие грамотрицательные условно патогенные бактерии как возбудители госпитальных инфекций: Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук, 1988. 30 с.

16. Ковалева Е.П., Семина Н.А. Профилактика внутрибольничных инфекций. М.: ТОО «Рарочь». - 1993.

17. Котлукова Т.В. Лечение синегнойной инфекции у взрослых и детей. // Журн. Фарматека 2005 - №17(94).

18. Контроль внутрибольничных инфекций // Под ред. Н.И. Брико. -М.: Изд. дом "Русский врач", 2002. - 96 с.

19. Коршунова Г.С. Эпидемиологическая ситуация по внутрибольничным инфекциям в российской федерации в 1997-2001 гг.доклад на 8-м съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов) // Эпидемиология и инфекционные болезни. — 2002. №6. — С. 22-24

20. Коршунова Г.С., Садовникова В.Н. Состояние заболеваемости внутрибольничными инфекциями в Российской Федерации // Внутрибольничные инфекции — проблемы эпидемиологии, клиники диагностики, лечения и профилактики. — Москва, 1999, — С. 124-125.

21. Макаренко Т.А. Белковые протективные антигены P.aeruginosa: Автореферат диссертации на соискание кандидата биологических наук — 1994, 24 с.

22. Макаренко Т. А., Балаян С.С., Сергиенко А.И. и- др. Иммунологический ответ у доноров-добровольцев, иммунизированных вакциной псевдомонас //Журн. микробиол. 1991. —№ 11. — С. 39-41.

23. Макаренко Т. А., Станиславский Е.С. Иммунологическое изучение белков клеточной стенки Pseudomonas aeruginosa II Журн. микробиол. 1996. - № 2. - С. 7-9.

24. Маниатис Т., Френч Э., Сэмбрук Дж. Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование. — Москва, «Мир», — 1984.

25. Мороз А.Ф. Применение поливалентной вакцины с защитным эффектом против Pseudomonas aeruginosa II I Всесоюзная конференция по ранам и раневой инфекции. М., — 1977, — С. 73-74.

26. Медицинская микробиология // Под ред. В.И. Покровского, М.: Гэотармед, 1999.

27. Никонова А.А., Калошин А.А. Клонирование и экспрессия генов белков внешней мембраны ряда условно патогенных микроорганизмов // Тезисы 8-ой международной школы-конференции молодых ученых — "Биология наука XXI века", Пущино. Май 2004.

28. Новикова О. Д. Автореферат диссертации на соискание кандидата биологических наук.— Владивосток. — 1986.

29. Нозокомиальные инфекции. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии // Под ред. JI.C. Страчунского, Ю.Б. Белоусова, С.Н. Козлова, — 2002.

30. Онищенко, Г.Г. Борьба с инфекционными заболеваниями в России: состояние проблемы на современном этапе // Здравоохранение. — 2002. №7. - С. 14-26.

31. Основы инфекционного контроля. Руководство для практических врачей // 2-е авторское издание. American International Health Aliance, 1997.

32. О состоянии заболеваемости внутрибольничными инфекционными болезнями и мерах по их предупреждению: Решение коллегии Минздрава России от 26.11.02 №16 // Врачебная газета 2003. — №5.-С. 13.

33. О состоянии заболеваемости внутрибольничными инфекционными болезнями и мерах по их предупреждению: Протокол решения Коллегии Минздрава Российской Федерации от 26.02 №16 // Дезинфекц. дело. 2003. - №1. - С. 63-65.

34. Остерман Л.Д. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. 1981.

35. Пат. 1410527 С СССР, С12Р1/04. Способ получения экзотоксина А синегнойной палочки // Н.А. Михайлова, Т.Н. Кузнецова, Ф.А. Шаймухаметов, А.Ф. Мороз, И.А. Баснакьян. Заявл. 10.09.86; Опубл. 09.06.95 //БИПМ.-1995,

36. Пат. 1481962 С СССР, А61К35/74. Способ обезвреживания очищенного экзотоксина А синегнойной палочки // Н.А. Михайлова, Ф.А. Шаймухаметов, Т.Н. Кузнецова, А.Ф. Мороз. — Заявл. 15.07.87; Опубл. 09.06.95//БИПМ.-1995.

37. Покровский В.И. Внутрибольничные инфекции // Тер. арх., 1998, Т.60, — №11, — С. 3-6.

38. Покровский В.И. Проблема внутрибольничных инфекций // Эпидемиология и инфекционные болезни, 1996, №2, - С. 4-9.

39. Покровский В.И., Семина Н.А. Внутрибольничные инфекции — проблемы и пути решения. // Эпидемиология и инфекционные болезни. — 2000. № 5 - С. 12-24.'

40. Профилактика внутрибольничных инфекций в стационарах и охрана труда среднего медицинского работника // Вып.1. М.: ООО Изд. дом "Медицинский вестник", 2001. - 96 с. - (Тематическое приложение к журналу "Сестринское дело").

41. Радкевич С.А., Мороз А.Ф., Чантурия Ц.К. и др. Иммунопрофилактика инфекций, обусловленных Pseudomonas aeruginosa у обожженных // Современная госпитальная инфекция. Тезисы докладов. Л., -1980,-С. 103.

42. Рейзис А.Р. Госпитальная инфекция в современной медицине // Справочно-практические клинические очерки, С-Пб, «Руди-Барс», 1993, -С. 283-285.

43. Розанова С.М. P.aeruginosa как представитель госпитальной флоры. // Успехи современного естествознания. 2003. — № 11. - С. 85-86.

44. Розанова С.М. Резистентность к антибактериальным препаратам грамотрицательной флоры палат интенсивной терапии: Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук, — 2004.

45. Руднов В.А. Современное клиническое значение синегнойной инфекции и возможности ее терапии у пациентов отделений реанимации // Инфекции и антимикробная терапия. 2002. — №6. - С. 170-176.

46. Савенко С.А. Как решить проблему внутрибольничной инфекции // Врач, 1998, - №3, - С. 34-35.

47. Семина Н.А., Ковалева Е.В. Справочник госпитального эпидемиолога. // М., — 1999.

48. Семина Н.А., Ковалева Е.В. Этиология ВБИ в детских стационарах // Problemele actuale ale epidemiologiei, microbiologiei §i parazitologie contemporane, Chi§inau, — 1992, — p. 189-190.

49. Семина H.A., Ковалева E., Галкин B.B. Актуальные вопросы ВБИ // Материалы конференции Внутрибольничные инфекции, Москва, — 2002, — С. 53-58.

50. Семина Н.А., Ковалева Е.В, Генчиков JI.A. Эпидемиология и профилактика внутрибольничных инфекций. // Новое в профилактике госпитальной инфекции, Москва, — 1997, — С. 3-9.

51. Семина Н.А., Ковалева Е.Н. Состояние эпидемиологического надзора за нозокомиальными инфекциями в России // Материалы международной конференции Нозокомиальные инфекции в отделениях интенсивной терапии. М., — 1998.

52. Септелиев Д.В. Статистические методы в научных медицинских исследованиях. // «Медицина», — 1968, 414 с.

53. Сидоренко С.В. Госпитальные инфекции вызванные синегнойной палочкой. Значение для интенсивной терапии. // Анестизиология и реаниматология, 1999, - №3, - С. 48-54.

54. Сидоренко С.В., Резван С.П., Стерхова Г.А., Грудинина С.А. Госпитальные инфекции, вызванные Pseudomonas aeruginosa. Распространение и клиническое значение антибиотикорезистентности // Антибиотики и химиотерапия, 1999, - Т.44, - №3, - С. 25-33.

55. Синегнойная инфекция // Под ред. А.Ф. Мороз. — Москва, Медицина, 1988.

56. Скала JI.3., Нехорошева А.Г., Лукин И.Н. Профилактика внутрибольничных инфекций // Эпидемиология и инфекционные болезни — 2000,-№5,-С. 12-14.

57. Соколовский В.Т., Семина Н.А. Внутрибольничные инфекции -проблемы эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики //

58. Тезисы докладов 2-й Российской Научно-практической конференции с международным участием 7-9 дек. 1999г. М., - 1999, — С. 225.

59. Состояние резистентности к антиинфекционным химиопрепаратам в России // Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии под редакцией JI.C. Страчунского, Ю.Б. Белоусова, С.Н. Козлова, 2002.

60. Станиславский Е.С. Бактериальные структуры и их антигенность //М.,- 1971.

61. Станиславский Е.С., Болтуцкий Л.Г., Ландсман Н.М. и др. // Rev. Instit. Pasteur. 1983 - Vol. 16. - P. 217-234.

62. Станиславский Е.С., Дмитриев Б.А., Lanyi В., Joo I. // Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 1985. - Vol. 32. - P. 3-37.

63. Станиславский E.C., Колкер И.И. Синегнойная инфекция // М.,1978.

64. Станиславский Е.С., Joo I. Вакцины против Pseudomonas aeruginosa инфекции: итоги и перспективы исследований // Бактериальные антигены, Сборник трудов Москва, - 1982. - С. 3-14.

65. Станиславский Е.С., Joo I. Иммунопрофилактика и иммунотерапия инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa: итоги и перспективы // Журн. микробиол. 1983. - №7. -С. 22-31

66. Станиславский Е.С., Joo I., Северцева М.К. и др. Иммунологическая эффективность и безвредность в эксперименте пиоиммуногена-вакцины против инфекции Pseudomonas aeruginosa II Журн. микробиол. 1982. - №5. - С. 70-75

67. Станиславский Е.С., Жванецкая Е.В., Машилова Г.М. и др. Бесклеточная вакцина № 1 // Журн. микробиол. 1980. — № 8. — С. 66-71.

68. Станиславский Е.С., Палкина Н.А., Булк В.Ф. и др. Бесклеточная вакцина № 2 // Журн. микробиол. 1981. - № 8. - С. 37-40.

69. Станиславский Е.С., Joo I., Булк В.Ф. и др. Бесклеточная вакцина № 4 // Журн. микробиол. 1982. - № 10. - С. 25-29.

70. Строганов В.П. Особенности эпидемиологии и микробиологии госпитальных инфекций. // Consilium Medicum. Инфекции и антимикробная терапия, 2000, - Том 2, - №3, - С. 45-69.

71. Титова Т.И., Сидорова Т.Н., Радкевич С.А. и др. Получение и изучение свойств поливалентной корпускулярной синегнойной вакцины // Журн. микробиол. 1985. - №8. -С. 80-84

72. Тихонов С,М. Госпитальный эпидемиолог (обоснование, функциональная модель, эффективность) // Журн. микробиол. 1984, - №3, -С. 73-78.

73. Торопчина Ю.Н., Калошин А. А. Разработка ДНК-вакцины против Pseudomonas aeruginosa II Тезисы 8-ой международной школы-конференции молодых ученых "Биология наука XXI века", Пущино. Май 2004.

74. Фролочкина Т.И., Коршунова Г.С., Садовникова В.Н. Состояние заболеваемости ВБИ в Российской Федерации в 1997-2001 гг. // Внутрибольничные инфекции. Москва, - 2002, - С. 19-23.

75. Храпунова И. А. Санитарно-эпидемиологический надзор за внутрибольничными инфекциями в условиях крупного города: Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук — М., 1999.

76. Чекан JI.B., Станиславский Е.С., Палкина Н.А. Бесклеточная вакцина № 3 // Журн. микробиол. 1983. - № 2. - С. 92-97.

77. Черноказинский А.А., Гусакова JI.B., Бачурин В.И. К профилактике гнойно-восполительными инфекций в урологическом стационаре // Проблемы эпидемиологии, микробиологии и паразитологии. — Кишинев, 1987, - С. 71-72.

78. Шкарин В.В., Давыдова Н.А., Ковалишина О.В. и др. Перспективное наблюдение в системе эпидемиологического надзора за госпитальными гнойно-септическими инфекциями // Журн. микробиол. —2000,-№6,-С. 30-34.

79. Шкарин В.В., Давыдова Н.А., Ковалишина О.В. Эпидемиологический надзор за госпитальными гнойно-септическими инфекциями // Вестн. Российской АН., 2002, - №2, - С. 6-11.

80. Шкарин В.В., Давыдова Н.А., Ковалишина О.В. и др. Эпидемиологические особенности госпитальной гнойно-септическойинфекции в кардиохирургическом стационаре // Журн. микробиол. — 1998, — №5, С. 43-47.

81. Шкарин В.В. Методические подходы к эпидемиологическому надзору за госпитальными инфекциями // Материалы конференции Внутрибольничные инфекции — проблемы эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики, М., 1999, - С. 120.

82. Юшкова В.И., Станиславский Е. С., Ландсман Г.И. Экспериментальное изучение динамики АТ-образования к антигенам слизи P.aeruginosa II Журн. микробиол. 1983. - № 3. - С. 78.

83. Ющук Н.Д., Жогова М.А., Бушуева В.В., Колесова В.Н. Внутрибольничные инфекции // Эпидемиология, М., «Медицина», 1993, — С. 280-296.

84. Яковлев С. Современный взгляд на применение антибиотиков в стационаре // Врач, 2001, - №6, - С. 10-13.

85. Яковлев С.В. // Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова, Consilium Medicum, Том 3 - N 2 - 2001.

86. Яфаев Р.Х., Зуева Л.П. Эпидемиология внутрибольничной инфекции // JI.-«Медицина», 1989, - 168 с.

87. Al-Mariri A., Tibor A., Lestrate P., et al. Yersinia enterocolitica as a vehicle for a naked DNA vaccine encoding Brucella abortus bacterioferritin or P39 antigen // Infect. Immun. 2002 Apr; - №70(4): - P. 1915-23.

88. Battershill, J.L., Speert D.P., Hancock R.E.W. Use of monoclonal antibodies to protein F of Pseudomonas aeruginosa as opsonins for phagocytosis by macrophages//Infect. Immun. 1987. -№55: - P. 2531-2533.

89. Baumann U., E. Mansouri, B.-U. von Specht. Recombinant OprF-Oprl as a vaccine against Pseudomonas aeruginosa infections // Vaccine 2004 №22 P. 840-847.

90. Bittle J., Chow M., Yabrov R. et al. Syntetic peptides from four separate regions of the poliovirus type 1 capsid protein PVP1 induce neutralizing antibodies//Proc. Natn. Acad. Sci. U.S.A. 1985. - P. 910-914.

91. Boyle J.S., Brady J.L., Koniaras C., Lew A.M. Inhibitory effect of lipopolysaccharide on immune response after DNA immunization is route dependent // DNA Cell Biol 1998 Apr; - №17(4): P. 343-348.

92. Brouillette E., Lacasse P., Shkreta L., Belanger J., Grondin G., Diarra M.S., Fournier S., Talbot B.G. DNA immunization against the clumping factor A (ClfA) of Staphylococcus aureus II Vaccine 2002 May 22; - №20(17-18):P. 2348-2357.

93. Cassisi N., Cohn A., Davidson Т., et al. Diffuse otitis externa: Clinical and microbiological findings in the course of a multicenter study on a new otic solution // Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 1977; - Suppl. №86: - P. 1-16.

94. Centers for Disease Control and Prevention. Public health focus: surveillance, prevention and control of nosocomial infections // MMWR 1992; №41:-P. 783-787.

95. Chastre J., Trouillet J.L. Problem pathogens (Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter) // Semin. Respir. Infect. — 2000; №15: - P. 287298.

96. Cripps A.W., Dunkley M.L., Taylor D.C., Cousins S., Clancy R.L. Immunity to Pseudomonas aeruginosa induced by OprF following intestinal immunization // Adv. Exp. Med. Biol. 1995; -№371B: - P. 761-763.

97. Denis-Mize K.S., Price B.M., Baker N.R., Galloway D.R. Analysis of immunization with DNA encoding Pseudomonas aeruginosa exotoxin A // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000 Feb; - №27(2): - P. 147-154.

98. Diaz-Montero C.M., Feng H.M., Crocquet-Valdes P.A., Walker D.H. Identification of protective components of two major outer membrane proteins of spotted fever group Rickettsiae // Am J. Trop Med. Hyg. 2001 Oct; - №65(4): P. 371-378.

99. Editorial. Meeting summary Possibilities for active and passive vaccination against opportunistic infections // Vaccine 2004 - №22, P. 801-804.

100. Rawling E.G., Brinkman F.S.L., Hancock R.E.W. // Journal of Bacteriology, 1998 Jul. - Vol 180, -№14, P. 3556-3562.

101. Franzetti F., Cernuschi M., Esposito R., et al. Pseudomonas infections in patients with AIDS and AIDS-related complex // J. Int. Med. 1992; - №231: -P. 437-43

102. Gabelsberger J., Knapp В., Bauersachs S., Enz U.I., von Specht B.U., Domdey H.A. Hybrid outer membrane protein antigen for vaccination against Pseudomonas aeruginosa II Behring Inst. Mitt. 1997 Feb; - №98: - P. 302-14.

103. Gentschev I., Dietrich G., Spreng S., Pilgrim S., Stritzker J., Kolb-Maurer A., Goebel W. Delivery of protein antigens and DNA by attenuated intracellular bacteria II J. Int. Med. Microbiol. 2002 Feb; - №291(6-7): - P. 577582.

104. Gilleland H.E.Jr., Parker M.G., Matthews-Greer J.M., Berg R.D. Use of purified outer membrane protein F (porin) preparation of Pseudomonas aeruginosa as a protective vaccine in mice // Infection and Immunity, 1984 Apr. Vol 44, №1-P. 49-54.

105. Govan J.R.W., Glass S. The microbiology and therapy of cystic fibrosis lung infections // Rev. Med. Microbiol. 1990; - №1: p. 19-28.

106. Hancock R.E.W., Dead G.M., Nikaido H. //Biochim., biophys. Acta. 1979. Vol. 136.1.-P. 381-390.

107. Hancock R.E.W., Sinhnel R., Martin N. Outer membrane protein of Pseudomonas II Mol. Microbiol. 1990, - №4: - P. 1069-1075.

108. Hancock R.E., Wong R. Potential of protein OprF of Pseudomonas in bivalent vaccines // Review Behring Inst. Mitt. 1997 Feb; - №98: - P. 283-290.

109. Hansen E.J., Frisch C.K., McDade J.R. et al. Identification of immunogenic outer membrane proteins of Haemophilus influenzae type b in the infant rat model system // Infect, and Immun. 1981. Vol. 32. - № 3. - P. 10841092.

110. Heckels J.E. et al. The class 1 outer membrane protein of Neisseria meningitides: gene sequence and structural and immunological similarities to gonococcal porins // J. Gen. Microbiol. 1989. — P. 131-139.

111. Hedstrom R.C., Pavlovskis O.R., Galloway D.R. Antibody Response of Infected Mice to Outer Membrane Proteins of Pseudomonas aeruginosa II Infection and Immunity 1984 Jan. Vol 43, - № 1, - P. 49-53.

112. Huygen K., Content J., Denis O., Montgomery D.L., Yawman A.M., Deck R.R., DeWitt C.M., et al. Immunogenicity and protective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine // Nat. Med. 1996 Aug; - №2(8): - P. 893-898.

113. Jackson G.G. Infective endocarditis caused by Pseudomonas aeruginosa, in Baltch AL, Smith RP (eds) // Pseudomonas aeruginosa Infection and Treatment. New York, Marcel Dekker 1994, - P. 129-158.

114. Jang, I.J. et al., Human immune response to a Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein vaccine // Vaccine — 1999- №17 P. 158-168.

115. Kim J.W., Hung C-F., Juang J., He L., Woo Kim Т., Armstrong D.K., Pai S.I., et al. Comparison of HPV DNA vaccines employing intracellular targeting strategies // Gene Therapy 2004 - №11, - P. 1011-1018.

116. Kim Y., Dale A. Webster & Benjamin C. Stark. Evidence for stable transformation of Pseudomonas aeruginosa with a pUC-based plasmid // Biotechnology Letters 2003 - №25: - P. 959-962.

117. Kovacs K., Paterson D.L., Yu V.L. Antimicrobial Therapy for Pseudomonas aeruginosa: Therapeutic Issues; Resistance; Pneumonia; Endocarditis; and Infections of the GI Tract, Bone and Joint, and Urinary Tract // Infect. Med. 1998; - №15: - P. 385-394.

118. Kovacs K., Paterson D.L., Yu V.L. Antimicrobial Therapy for Pseudomonas aeruginosa: Skin and Soft Tissue, Ear, and Eye Infections; Meningitis; and Clinical Syndromes of Febrile Neutropenic and HIV Patients // Infect. Med. 1998; -№15: - P. 464-478.

119. Kusne S., Eibling D.E., Yu V.L., et al. Gangrenous cellulitis associated with gram-negative bacilli in pancytopenic patients: Dilemma with respect to effective therapy 11 Am. J. Med. 1988; - №85: - P. 490-494.

120. Lasky Т., Terracciano G.j., Madger L., Koski C.L., Ballesteros M., Nash D., et al. The Guillain-Barre syndrome and the 1992-1993 and 1993-1994 influenza vaccines // N. Engl. J. Med. 1998; - №339: - P. 1797-1802.

121. Lee N.G. et al., Human anti-Pseudomonas aeruginosa outer membrane proteins IgG cross-protective against infection with heterologous immunotype strains of P.aeruginosa II FEMS Immun. and Med. Microbiology — 1999-№25-P. 339-347.

122. Lee N.G. et al. Immunization of burn-patients with a Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein vaccine elicits antibodies with protective efficacy // Vaccine 2000- № 18 - P. 1952-1961.

123. Lee N.G. et al. Protection of mice against P.aeruginosa infections by large-scale affinity-purified human IgG specific to P.aeruginosa outer membrane proteins // Vaccine 2000- №18 - P. 665-674.

124. Lee N.G. et al. Conformation-dependent antibody response to Pseudomonas aeruginosa outer membrane proteins induced by immunization in humans // FEMS Immun. and Med. Microbiology 2000- №27 - P. 79-85.

125. Lieberman D, Lieberman D. Pseudomonas infections in patients with COPD: epidemiology and management // Am. J. Respir. Med. — 2003; №2: — P. 459-68.

126. Lillehoj E.P., Kim B.T., Kim K.C. Identification of Pseudomonas aeruginosa flagellin as an adhesin for Mucl mucin // Am. J. Lung Cell Mol. Physiol. 2002 - №282: - P. 751-756.

127. Lowrie D.B., Tascon R.E., Colston M.J., Silva C.L. Towards a DNA vaccine against tuberculosis // Vaccine 1994 Dec; - №12(16): - P. 1537-1540.

128. Luke C.J., Carner K., Liang X., Barbour A.G. An OspA-based DNA vaccine protects mice against infection with Borrelia burgdorferi II J. Infect. Dis. — 1997 Jan;-№175(1):-P. 91-97.

129. Matthews-Greer, J.M., Gilleland H.E.Jr. Outer membrane protein F (porin) preparation of Pseudomonas aeruginosa as a protective vaccine against heterologous immunotype strains in a burned mouse model // J. Infect. Dis. 1987 -№155: P. 1282-1291.

130. Mizuno T. Outer membrane proteins of Pseudomonas aeruginosa II J. Biochem. 1982. - P. 179-191.

131. Mutharia L.M., Nicas T.I., Hancock R.E.W. Outer membrane proteins of Pseudomonas aeruginosa serotype strains // J. Infect. Dis. — 1982, — № 146: — P. 770-779.

132. Newell F.W. Ophthalmology // Mosby Year-Book 1992, - P. 234238.

133. Nikado H., Hancock R.E.W. Outer membrane permeability of Pseudomonas aeruginosa II In Ж Sokatch and LN Ornston (ed.), The bacteria, The biology of Pseudomonas Academic Press, Inc. Orlando, Fla. 1986, vol. 10, — P. 145-193.

134. Ono Y. Pseudomonas aeruginosa II Nippon Rinsho — 2002; — №60: — P. 2150-2155.

135. Parker M.G., Matlens J.M. et al. // Infect, and Immun. 1984. Vol. 44. -№1. - P. 49-54.

136. Price B.M., Liner A.L., Park S., Leppla S.H., Mateczun A., Galloway D.R. Protection against anthrax lethal toxin challenge by genetic immunization with a plasmid encoding the lethal factor protein // Infect. Immun. 2001 Jul; -№69(7):-P. 4509-4515.

137. Promega. Fmol. Technical manual. DNA cycle sequencing system.2001

138. Protocols and applications, Promega, 1989/90

139. Qiaqen. The QIAexpressionist // A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins. — 2001.

140. Rawling E.G., Martin N.L., Hancock R.E. Epitope mapping of the Pseudomonas aeruginosa major outer membrane porin protein OprF // Infect Immun. 1995 Jan; -№63(1): - P. 38-42.

141. Saikh K.U., Sesno J., Brandler P., Ulrich R.G. Are DNA-based vaccines useful for protection against secreted bacterial toxins? Tetanus toxin test case//Vaccine 1998 May-Jun;-№16(9-10):-P. 1029-1038.

142. Sizemore D.R., Branstrom A.A., Sadoff J.C. Attenuated bacteria as a DNA delivery vehicle for DNA-mediated immunization // Vaccine 1997 Jun; -№15(8):-P. 804-807.

143. Staczek J., Gilleland L.B., van der Heyde H.C., Gilleland H.E. DNA vaccines against chronic lung infections by Pseudomonas aeruginosa II FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2003 Jul 15; - №37(2-3): - P. 147-153.

144. Stanislavsky E.S, Edvabnaya L.S., Bandman O.A. et al. Experimental studies on the protective efficacy of a Pseudomonas aeruginosa II Vaccine — 1989. Vol. 7,- №6. -P. 562-566.

145. Stanislavsky E.S., Kim H.S., Park W.J., Ahn D.H., Nishino Т., Chang W.H., Paik W.H. Pseudomonas aeruginosa II HANRIMWON PUBLISHING COMPANY, Seoul, Korea, 1998.

146. Stanislavsky E.S, Lam J.S. Pseudomonas aeruginosa antigens as potential vaccines // Review, 1997 Nov; - №21(3): - P. 243-277.

147. Stover C.K., Brinkman F.S.L., Kowalik D.J., Larbig K., Spencer D., Hancock R.E.W., et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAOl, an opportunistic pathogen // NATURE 2000 Aug, VOL 406, 31.

148. Woodruff W.A., Hancock R.E.W., et al. Expression in Escherichia Coli and function of porin protein F of Pseudomonas aeruginosa И J. Bacterid. -1986.-№167:-P. 473-479.

149. Wright D.N., Alexander J.M. Effect of water on the bacterial flora of swimmers' ears // Arch. Otolaryngol. 1974; - №99: - P. 15-18.