Получение рекомбинантных атоксичных форм экзотоксина A Pseudomonas aeruginosa и изучение их иммунобиологических свойств

Исаков, Михаил Андреевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение рекомбинантных атоксичных форм экзотоксина A Pseudomonas aeruginosa и изучение их иммунобиологических свойств
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Получение рекомбинантных атоксичных форм экзотоксина A Pseudomonas aeruginosa и изучение их иммунобиологических свойств"

00468524

На правах рукописи

ИСАКОВ Михаил Андреевич

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ АТОКСИЧНЫХ ФОРМ ЭКЗОТОКСИНА А PSEUDOMONAS AERUGINOSA И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 КЮН 2010

Москва - 2010

004605241

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация:

НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАМН

Защита диссертации состоится « 2010 г. в /¿.часов

на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 в НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН.

Автореферат разослан «/&» 2010 г.

Михайлова Наталья Александровна

Коровкин Сергей Анатольевич Шемякин Игорь Георгиевич

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Яковлева И.В.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Несмотря на значительные успехи в различных областях медицины, проблема нозокомиальных инфекций, вызываемых P. aeruginosa, ещё далека от разрешения. В настоящее время этот возбудитель способен быстро вырабатывать мультиустойчивость к антибиотикам самых различных классов, в связи с чем обычная терапия часто не приводит к положительным результатам (Strateva Т. and Yordanov D., 2009).

В России и зарубежом отсутствуют иммунопрепараты для предупреждения и лечения инфекций, вызываемых P. aeruginosa. В то же время множество экспериментальных вакцин и моноклональных антител протестированы в доклинических испытаниях, а часть из них достигла клинической фазы исследований. В литературе имеется незначительное количество сообщений о рандомизированных контролируемых испытаниях по оценке эффективности вакцин против синегнойной инфекции у пациентов с кистозным фиброзом или пациентов из группы риска, однако ни одна из вакцин не получила разрешения на использование в практике здравоохранения (Döring G. and Pier G.B., 2008; Johansen H.K. and Gotzsche P.C., 2008).

По данным литературы, перспективными для разработки являются поликомпонентные конъюгированные генно-инженерные вакцины (Döring G. et ah, 2007), при создании которых используют наиболее иммуногенные антигены P. aeruginosa.

Синегнойная палочка обладает многочисленными факторами

патогенности, такими как гемолизин, лецитиназа, протеаза, эластаза,

экзотоксин S, экзотоксин А и другими. Существенную роль в поражении

организма хозяина при развитии синегнойной инфекции играет именно

экзотоксин А, ингибирующий синтез клеточных белков и вызывающий

летальный эффект у экспериментальных животных (Liu, P.V., 1973).

Установлено, что экзотоксин А продуцируют более 90% клинических штаммов

P. aeruginosa (Вертиев Ю.В. и др., 1982). Экзотоксин А синтезируется в виде

одной полипептидной цепи. Анализ кристаллической структуры показал, что его молекула состоит из трёх доменов: домен I (с 1 по 252 аминокислотные остатки), необходимый для связывания с рецептором на клетках-мишенях, домен II (с 253 по 404 аминокислотные остатки), осуществляющий трансмембранный перенос токсина в клетку, и домен III (с 405 по 613 аминокислотные остатки), обладающий токсической активностью (Allured, V.S. et al. 1986). Именно домен III инактивирует эукариотический фактор элонгации 2 при помощи АДФ-рибозилирования, ингибируя белковый синтез в клетках и апоптоз. Изменение аминокислотной последовательности домена III в ряде случаев приводит к снижению токсичности экзотоксина А (Douglas, С.М. and R.J. Collier, 1987).

Целесообразность включения экзотоксина А в вакцину против синегнойной инфекции не вызывает сомнений, однако иммунобиологические свойства его доменов практически не изучены, что затрудняет выбор наиболее иммуногенной и безопасной атоксичной формы экзотоксина А.

Цель и задачи исследования

Целью данного исследования является получение рекомбинантных атоксичных форм экзотоксина А P. aeruginosa и изучение их иммунобиологических свойств.

Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи:

1. Создать генно-инженерные конструкции на основе плазмиды рЕТ28, несущие: а) последовательность гена экзотоксина А, кодирующую полную рамку считывания гена экзотоксина А (ТохА), используя в качестве матрицы ДНК, выделенную из P. aeruginosa; б) последовательность гена экзотоксина А, кодирующую только домен I (aToxl); в) последовательность гена экзотоксина А, кодирующую только домены I и II (aToxl,2); г) последовательность гена экзотоксина А, кодирующую домены I, II и часть домена III (aToxl,2,ДЗ).

2. Получить бактериальные (Е. coli) продуценты рекомбинантных белков aToxl, aToxl,2, аТох1,2,ДЗ и ТохА и оценить степень их экспрессии.

3. Получить очищенные рекомбинантные белки aToxl, aToxl,2, aToxl,2,A3 и ТохА.

4. Оценить токсичность полученных белковых препаратов для животных.

5. Изучить иммуногенные свойства рекомбинантных белков aToxl, aToxl,2 и aToxl,2,A3 на экспериментальных животных.

6. Изучить протективные свойства полученных белковых препаратов aToxl, aToxl,2 и aToxl,2,A3.

7. Получить специфические иммунные сыворотки к рекомбинантным белкам aToxl, aToxl,2 и aToxl,2,ДЗ и оценить их защитные свойства.

Научная новизна

Впервые сконструированы штаммы-продуценты (Е. coli) рекомбинантного экзотоксина А Р. aeruginosa - ТохА и его атоксичных форм: aToxl, aToxl,2 и aToxl,2,A3. Доказана идентичность токсических свойств рекомбинантного ТохА и нативного экзотоксина А. Впервые полученные делеционные рекомбинантные белки aToxl, aToxl,2 и aToxl,2,ДЗ оказались нетоксичными для животных. Выявлены иммуногенные свойства рекомбинантных белков - aToxl,2 и aToxl,2,A3; трехкратное их введение мышам индуцировало увеличение титра специфических антител в 8000 раз. Максимальную протективную активность проявлял рекомбинантный белок aToxl,2,ДЗ с индексом эффективности 8,9. Иммунные сыворотки крови кроликов к рекомбинантному белку aToxl,2,ДЗ (титр 1:420000) обладали протективными свойствами (индекс эффективности 7,3).

Практическая значимость

На основе очищенного рекомбинантного белка аТох1,2,ДЗ может быть сконструирован новый иммунобиологический препарат для иммунизации доноров с целью получения антитоксической плазмы, а так же возможно его использование в качестве компонента комплексной противосинегнойной вакцины.

Рекомбинантный экзотоксин А целесообразно использовать при разработке тест-систем, предназначенных для оценки антитоксической активности специфических иммунобиологических препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Сконструированные штаммы-продуценты (Е. coli) pET28-aToxl, pET28-aToxl,2, рЕТ28-аТох1,2,ДЗ и рЕТ28-ТохА характеризуются высоким выходом целевых продуктов (на уровне 40 - 70 %). Технологические приёмы получения и очистки рекомбинантных белков позволяют наработать их в количествах, достаточных для биологического тестирования.

2. Полученный очищенный рекомбинантный белок ТохА (73,8 кДа) идентичен по токсическим свойствам нативному экзотоксину А. Очищенные рекомбинантные белки aToxl (38,6 кДа), aToxl,2 (49,0 кДа), аТох1,2,ДЗ (65,8 кДа) атоксичны, а варианты aToxl,2 и aToxl,2,A3 обладают иммуногенными и протективными свойствами.

3. Иммунная сыворотка к рекомбинантному белку aToxl,2, ДЗ способна защищать животных от введения экзотоксина А.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы доложены на: итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2007);

Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008); XII Всероссийском форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2008); XIII Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009); XII международной пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008); научно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008); IX межгосударственной научно-практической конференции государств - участников СНГ (Волгоград, 2008); II съезде микологов России (Москва, 2008); научно-практической конференции молодых ученых и специалистов НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, 2009).

Апробация диссертации состоялась на конференции отдела микробиологии НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН 2 апреля 2010 года.

По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из которых 2 -статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает 223 источника, из которых 31 отечественные.

Работа изложена на 140 страницах машинописного текста, иллюстрированного 15 рисунками и 7 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы Объекты исследования

Материалом исследований явились:

штамм Е. coli DH5ct (F-, end Al, glnV44, thi-1, recAl, relAl, gyrA96, deoR, nupG, <D80dIacZAM15, A(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK- mK+), X-) (Invitrogen); штамм E. coli BL21(DE3) (F-, ompT, gal, dem, Ion, hsdSB(rB- mB-), A(DE3 [lacl lacUV5-T7 gene 1 indl sam7 nin5]) (Novagen); токсигенный штамм синегнойной палочки РА103;

плазмиды pBluescr¡pt-KS(+) (Stratagene) и pET28b(+) (Novagen);

очищенные препараты экзотоксина А P. aeruginosa (Уфимский НИИВС им. И.И. Мечникова и фирмы Sigma);

рекомбинантные белки aToxl, aToxl,2, аТох1,2,ДЗ и ТохА;

кроличья сыворотка к анатоксину P. aeruginosa (Уфимский НИИВС им. И.И. Мечникова); мышиные и кроличьи сыворотки к рекомбинантным белкам aToxl, aToxl,2, aToxl,2,A3, а также сыворотки крови интактных животных. Всего исследовано 350 сывороток животных.

Эксперименты проводили на животных из филиала «Андреевка» ГУ НЦБМТ РАМН.

Методы исследования

Для получения геномной ДНК P. aeruginosa использовали Wizard® Genomic DNA Purification Kit Al 120 фирмы Promega. Процедуру проводили согласно рекомендациям производителя. Для выделения плазмидной ДНК использовали наборы фирмы Sigma "GenElute Plasmid miniprep kit (#PLN350) или "GeneElute high performance plasmid maxiprep kit" (#NA0310). Все генно-инженерные манипуляции (ПЦР, рестрикция, хлороформная очистка ДНК, лигирование, приготовление и трансформация компетентных клеток, сайт-направленный мутагенез) проводили в соответствии с общепринятыми

методиками (Sambrook J. and Russell D., 2001). Для получения бактериальных продуцентов рекомбинантных белков использовали штамм Е. coli BL21(DE3) (Novagen). Первичный отбор клонов осуществляли рестрикционным анализом. Окончательный отбор проводили секвенированием на приборе ABI Prism 3100 согласно рекомендациям производителя.

Рекомбинантные белки aToxl, aToxl,2, аТох1,2ДЗ и ТохА получали при выращивании соответствующего бактериального продуцента в среде Luria-Bertani с канамицином и добавлением индуктора изопропил-бета-d-тиогалактопиранозида в ферментёре Анкум 2М (Россия). Электрофорез белковых продуктов проводили в полиакриламидном геле по методу Лэммли (Sambrook J. and Russell D., 2001). Хроматографическую очистку рекомбинантных белков осуществляли методом аффинной хроматографии с использованием Ni-сефарозы High Performance (GE healthcare) в денатурирующих условиях (в присутствии 8 М мочевины) в соответствии с протоколом QIAGEN (Qiaqen. The QIAexpressionist, 2001). Концентрацию белка определяли на спектрофотометре Pharmacia LKB/Ultraspec II при длине волны 280 нм, используя коэффициенты экстинкции, равные 0,7 для aToxl, 0,77 для aToxl,2, 0,73 для aToxl,2,ДЗ и 0,8 для ТохА, рассчитанные в программе Vector NTI Advance 10. Диализ очищенных рекомбинантных белков проводили в Tris-НС1 буфере (pH 9,0) в течение 18-24 ч при температуре 4 °С.

Иммуноблоттинг осуществляли по общепринятой методике (Sambrook J. and Russell D., 2001), используя для анализа специфичности сыворотку крови кролика, иммунизированного синегнойным анатоксином. Для удаления неспецифического взаимодействия в сыворотку добавляли клеточный лизат Е. coli штамма BL21(DE3). В качестве хромогена использовали диаминобензидин.

Для проведения ИФА полученный белок разводили в 10 мМ карбонатно-бикарбонатном буфере pH 9,4 до концентрации 10 мкг/мл и сорбировали в течение суток при температуре 4 °С в 96 луночных планшетах. При постановке ИФА в качестве конъюгатов использовали меченые пероксидазой хрена

антитела против IgG кролика и против IgG мыши. Для визуализации применяли раствор хромогена тетраметилбензидина. Оптическую плотность измеряли в приборе "Labsystems Multiskan Plus" при длине волны 450 нм. За титр принимали разведение сыворотки, при котором значение оптической плотности было в два раза выше, чем в лунке с буфером разведения.

Для оценки токсичности рекомбинантного белка ТохА использовали белых беспородных мышей массой 18-20 г. Препарат вводили внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл. ЛД50 вычисляли по формуле Кербера в модификации Ашмарина-Воробьёва(Ашмарин И.П. и Воробьев A.A., 1962).

Для иммунизации животных препараты рекомбинантных белков, растворенные в Tris-HCl буфере, сорбировали на геле гидроксида алюминия (А1(ОН)3) (ФГУП «НПО «Микроген» в г. Уфе «Иммунопрепарат») в течение суток при температуре 4 °С из расчета 1 мг белка на 3 мг гидрооксида алюминия. В работе использовали мышей массой 16-18 г и кроликов массой 22,5 кг. Мышам препараты вводили внутрибрюшинно в дозах от 6,25 до 100 мкг белка в объеме 0,5 мл. При иммунизации кроликов препараты вводили подкожно в дозе 100 мкг в объеме 0,5 мл.

При анализе протективных свойств рекомбинантных белков aToxl, aToxl,2 и aToxl,2,A3 интактным и иммунизированным мышам внутрибрюшинно вводили различные дозы рекомбинантного ТохА в объеме 0,5 мл. Учет Погибших животных проводили в течение пяти дней.

Для оценки превентивной активности иммунных сывороток крови кроликов мышам внутрибрюшинно вводили 0,5 мл сыворотки крови кроликов, иммунизированных рекомбинантной формой aToxl,2,A3 или 0,5 мл сыворотки интактных кроликов. Через 2 ч всем мышам инъецировали рекомбинантный экзотоксин А в различных дозах в объёме 0,5 мл. Наблюдение осуществляли в течение пяти дней, регистрируя гибель животных.

Статистическую обработку результатов проводили по общепринятым методикам (Ашмарин И.П. и Воробьев A.A., 1962).

Результаты исследования и их обсуждение

На первом этапе исследования с помощью полимеразной цепной реакции амплифицировали ген (охА Р. aeruginosa, несущий открытую рамку считывания экзотоксина А. В качестве матрицы использовали геномную ДНК штамма РА103 Р. aeruginosa, характеризующегося высоким уровнем синтеза экзотоксина А. Амплификат встраивали в полилинкер плазмиды рВ luescript-KS(+) (Stratagene).

Сравнение нуклеотидной последовательности, полученной путём амплификации гена toxA из штамма РА103, с уже известной в базе данных GenBank (accession number К01397.1) доказало их идентичность, за исключением двух синонимичных нуклеотидных замен: аденина в позиции 648 на цитозин и цитозина в позиции 1092 на тимин, которые не привели к изменению аминокислотной последовательности белка ТохА.

Степень гомологичности аминокислотных последовательностей белка ТохА P. aeruginosa, имеющихся в базе данных GenBank , составляла не менее 98%. Таким образом, высокая консервативность экзотоксина А позволяет предположить, что препараты на его основе будут вызывать иммунный ответ с нейтрализующей активностью против большинства вариантов экзотоксина А, в том числе синтезируемых внутрибольничными штаммами P. aeruginosa.

С целью исследования какие антигенные детерминанты экзотоксина А обладают протективным эффектом, получены делеционные варианты, исходя из трехдоменной структуры белка. При помощи генно-инженерных манипуляций последовательность гена toxA переносили в систему экспрессии рекомбинантных белков на основе плазмиды pET28(+)b (Novagen). При этом были созданы четыре продуцента (Е. coli штамм BL21(DE3)) рекомбинантных белков: рЕТ28-ТохА - экспрессирующий экзотоксин А (М.м. 73,4 кДа); рЕТ28-aToxl - экспрессирующий домен I экзотоксина А (М.м. 38,6 кДа); рЕТ28-aToxl,2 - экспрессирующий вариант, состоящий из доменов I и II (М.м. 49,0 кДа); и рЕТ28-аТох1,2,ДЗ - экспрессирующий вариант, состоящий из

доменов I, II и части домена III (М.м. 65,8 кДа).

Молекулярная масса рекомбинантных белков, синтезирующихся после индукции, определённая электрофоретически в 12% ПААГ по Лэммли, соответствовала теоретически рассчитанной (рис 1). Уровень индукции рекомбинантных белков среди общего количества бактериальных белков составлял от 10 % до 34 % в зависимости от штамма-продуцента. Полученные рекомбинантные белки - ТохА, aToxl, aToxl,2 и аТох1,2,ДЗ, имели на N-конце дополнительную аминокислотную последовательность из шести гистидинов, что позволило провести их очистку методом ионно-аффинной хроматографии, используя в качестве сорбента Ni-сефарозу High Performance (GE healthcare). Выход препаратов составил от 38,8 % до 71,4 %, а степень чистоты была не менее 66 % (табл. 1).

Рис. 1. Анализ белковых продуктов, полученных в результате экспрессии рекомбинантных белков и после их хроматографической очистки. Дорожки 1,4,7,11 - белки, полученные при выращивании биомассы продуцента без индуктора; дорожки 2,5,8,12 - белки, полученные при выращивании биомассы продуцента с индуктором; 3,6,9,13 - хроматографически очищенный препарат; дорожки 10,14 - маркер молекулярной массы. Рекомбинантные белки отмечены стрелкой.

Таблица 1

Результаты хроматографической очистки рекомбинантных белков.

Наименование рекомбинантного белка Содержание от общего клеточного белка после индукции, % Количество белка (мг) Чистота препарата после очистки, % Итоговый выход рекомбинантного белка, %

до очистки после очистки

ТохА 10±1,7 7,5±],3 1,8±0,3 бб±П,2 38,8±6,5

aToxl,2,ЛЗ 34±5,8 24,5±4,2 14,4±2,4 76±12,9 58,8±10

aToxl,2 14±2,4 10,1±1,7 7,2±1,2 71±12,1 71,4±12Д

aToxl 12±2 8,6±1,5 3,б±0,6 84±14,3 41,7±7,1

Исследование биологических свойств полученного рекомбинантного экзотоксина А (ТохА) выявило наличие выраженной токсической активности -ЛД50 для белых беспородных мышей составила 2,53±0,73 мкг. ЛД50 высокоочищенного нативного экзотоксина А Р. aeruginosa (Sigma) соответствовала 0,5±0,12мкг, а для нативного экзотоксина Р. aeruginosa (Уфимский НИИВС им. И.И. Мечникова), полученного высаливанием культуральной жидкости концентрированным раствором сульфата аммония -16,3±2,7 мкг на мышь.

Проведённые токсикологические исследования рекомбинантных делеционных форм aToxl, aToxl,2 и аТох1,2,ДЗ для оценки влияния препаратов на организм экспериментальных животных (мыши и крысы) показали, что введение белков, сорбированных на геле гидрооксида алюминия, не вызывало изменений в поведении животных в течение всего срока наблюдения. Незначительное снижение темпов роста массы отмечено только при введении высоких доз рекомбинантного белка aToxl,2,A3 белым мышам (рис. 2), что, вероятно, связано с воспалительной реакцией, а не с токсичностью препарата.

Рис. 2. Оценка токсичности рекомбинантной формы экзотоксина А аТох1,2,ЛЗ для мышей.

Таким образом, рекомбинантные белки с делецией С-концевой области экзотоксина A (aToxl, aToxl,2 и аТох1,2,ДЗ) оказались безопасными и нетоксичными для исследованных групп животных.

С помощью ИФА и иммуноблоттинга установлено, что белки aToxl,2, aToxl,2,A3 и ТохА специфично реагировали с антителами сыворотки крови кроликов, иммунизированных анатоксином P. aeruginosa (рис. 3). Очистка рекомбинантных белков ионообменной хроматографией на Ni-сефарозе не влияла на специфичность их связывания с антителами к анатоксину. Вариант aToxl, не взаимодействовал с иммунной сывороткой к анатоксину P. aeruginosa, что вероятно связано с отсутствием антигенных детерминант на его поверхности.

На следующем этапе роботы изучены протективные свойства рекомбинантных белков аТох1, аТох1,2 и аТох1,2,ДЗ в опытах активной защиты животных. Белых беспородных мышей массой 16±1 г дважды с двухнедельным интервалом внутрибрюшинно иммунизировали рекомбинантными атоксичными формами экзотоксина А в дозах 25 и 50 мкг белка, сорбированного на гидрооксиде алюминия, на животное. В качестве контроля использовали неиммунизированных мышей той же партии. Через две недели после последнего введения исследуемых образцов мышам внутрибрюшинно вводили рекомбинантный ТохА (табл. 2). Препараты аТох1,2 и аТох1,2,ДЗ обладали дозозависимым протективным эффектом: индексы

аТох! аТох1,2 агГох1,2,ЛЗ ТохА

Рис. 3. Анализ в иммуноблоттинге белковых продуктов, полученных в результате экспрессии рекомбинантных белков и после их хроматографической очистки. Дорожка 1 - маркер молекулярной массы; 2 -белки, полученные при выращивании штамма ВЬ21 (БЕЗ); 3,5,7,9 - белки, полученные при выращивании продуцента с индуктором; 4,6,8,10 - хроматографически очищенный препарат. В качестве первичных антител использовали сыворотку крови кроликов против синегнойного анатоксина, а вторичных - козьи антитела, меченные пероксидазой хрена.

Таблица 2

Протективиая активность рекомбинантных делеционных вариантов

экзотоксина А P. aeruginosa.

Препарат Доза введения рекомбинант-ного токсина, мкг Количество мышей павших/выживших ЛДад, МКГ Х±а Индекс эффективности

аТох1 25 мкг 100 10/0 5Д±1,2 (Р>0,1)* 0x0,01)" 0,8

S0 10/0

25 10/0

12,5 9/1

6,25 7/3

аТох1 50 мкг 100 10/0 6,6±1,3 (Р>0,1)' (р<0,01)" 1,1

50 10/0

25 10/0

12,5 8/2

6,25 6/4

аТох1,2 25 мкг 100 10/0 24,0±4,8 (Р<О,О1)* 0x0,01)" 3,9

50 9/1

25 5/5

12,5 1/9

6,25 0/10

аТох1,2 50 мкг 100 6/4 51,4±10,3 0x0,01)* (р>0,1)" 8,3

50 5/5

25 3/7

12,5 0/10

6,25 ОНО

аТох1,2,АЗ 25 мкг 100 9/1 31,6±б,3 (р<0,01)' 0x0,05)" 5,1

50 6/4

25 4/6

12,5 2/8

6,25 0/10

аТох1,2,ДЗ 50 мкг 100 6/4 55,0±10,3 0X0,01)* 8,9

50 4/6

25 2/8

12,5 1/9

6,25 0/10

Контроль (интактные мыши) 25 0/10 6,2±1,2 -

12,5 9/1

6,25 6/4

3,125 1/9

1,0625 0/10

* - при сравнении значений опытных групп с контролем ** - при сравнении значений опытных групп с аТох1,2,ДЗ в дозе 50 мкг

эффективности 8,3 и 8,9 определены для групп животных, получивших препарат aToxl,2 или aToxl,2,ДЗ в дозе 50 мкг. В дозе 25 мкг индексы эффективности для этих же делеционных вариантов составили 3,9 и 5,1, соответственно. Вариант aToxl в исследованных дозах не защищал мышей от введения рекомбинантного ТохА.

Полученные результаты позволяют предположить, что подавление транслокационной и ферментативной функций токсина, а так же инактивация его повреждающего воздействия на организм животного происходит за счёт специфического взаимодействия антител с эпитопами, расположенными на доменах II и III экзотоксина А. Отсутствие протективных свойств рекомбинантного белка aToxl, вероятно, связано с рядом причин: низкой иммуногенностью вследствие небольшого размера (М.м. менее 40 кДа); или наличием слабо иммуногенных эпитопов. Кроме того, можно предположить, что антитела против домена I не способны инактивировать рецепторную функцию нативного экзотоксина А, вследствие низкой аффинности или отсутствия направлености на участок, ответственный за узнавание экзотоксином А рецептора клеток-мишеней.

Так как полученный белок aToxl не проявил протективных свойств, его дальнейшее исследование не представлялось целесообразным.

Для оценки способности рекомбинантных белков aToxl,2 и аТох1,2,ДЗ стимулировать образование специфичных антител белых мышей иммунизировали трехкратно, внутрибрюшинно с интервалом в две недели, дозами 100, 50, 25, 12,5 и 6,25 мкг белка, сорбированного на гидроксиде алюминия. Через две недели после каждого введения пять мышей из каждой группы использовали для получения сыворотки крови. Контролем служили сыворотки интактных животных той же партии. Пулы полученных сывороток протестировали в ИФА с сорбированным на планшетах рекомбинантным экзотоксином А.

Изучение иммуногенных свойств позволило установить, что атоксичные

варианты aToxl,2 и aToxl,2,ДЗ стимулировали в организме животных синтез

. 15

антител, специфичных к рекомбинантному экзотоксину А, при этом прослеживалась прямая зависимость между титром антител, дозой вводимого препарата и количеством проведённых иммунизаций (рис. 3).

Н X

а. ь я Н

2000000 1750000 1500000 1250000 1000000 750000 500000 250000 0

■ 6

■ .

112 «

1325

850

«100

Количество иммунизаций

2000000 ----------------------

1750000 1500000 1250000 1000000

I" 750000 Н 500000 250000 0

' - . - - ■ .

___________

-г Н

1 2 3

Количество иммунизаций_

Рис. 3. Титр антител в ИФА к рекомбинантным белкам аТох1,2,ДЗ (А) и аТох1,2 (Б), в зависимости от дозы и количества иммунизаций.

Изучение динамики накопления специфических IgG антител в ответ на введение препарата aToxl,2 выявило, что значительное повышение титров происходило при двукратной иммунизации дозой 100 мкг (титр 1:920000) и трехкратных иммунизациях дозами 25, 50 и 100 мкг (титры 1:737000, 1:763000 и 1:1584000, соответственно). Однократное введение любой используемой дозы вызывало слабую выработку антител (максимальный титр 1:12000 в дозе 100 мкг). Рекомбинантный белок аТох1,2,ДЗ обладал схожими иммуногенными свойствами. Максимальные значения титра специфических IgG антител к аТох1,2,ДЗ выявлены после трехкратной иммунизации дозами 50 и 100 мкг белка (титры 1:953000 и 1:1638000). Однократная иммунизация не стимулировала заметного накопления антител во всех исследуемых дозах.

Препарат аТох1,2,ДЗ оказался более иммуногенным по сравнению с aToxl,2, что наиболее заметно проявилось при введении низких доз (6 и 12 мкг). Оптимальная схема иммунизации состояла из двукратного введения aToxl,2 или аТох1,2,ДЗ в дозе 100 и 50 мкг, соответственно.

В результате проведённых исследований, установлено, что препараты aToxl,2 и аТох1,2,ДЗ обладали антигенными, иммуногенными и протективными свойствами. Поскольку вариант аТох1,2,ДЗ имеет в своём составе часть домена III, на котором могут присутствовать дополнительные антигенные детерминанты, о чём свидетельствуют данные по оценке иммуногенных и протективных свойств, в дальнейших экспериментах по изучению длительности иммунного ответа и протективных свойств иммунных сывороток использовали делеционный вариант белка аТох1,2,ДЗ.

При изучении длительности иммунного ответа на рекомбинантный белок аТох1,2,ДЗ белых беспородных мышей трёхкратно с двухнедельным интервалом иммунизировали в дозе 25 мкг белка, сорбированного на А1(ОН)3. С интервалом в три недели собирали тотальную кровь от пяти мышей и определяли титр специфических антител в сыворотках методом ИФА. Максимальный уровень антител был достигнут после третьей иммунизации (титр 1:590000). Однако уже через 3 недели после последней иммунизации

происходило значительное снижение титра антител, которое продолжалось в течение 6 недель и далее не изменялось, находясь в пределах 1:60000-1:80000 (срок наблюдения - 15 недель после последней иммунизации).

При изучении иммунного ответа у кроликов на введение aToxl,2,A3 в дозе 100 мкг белка, сорбированного на А1(ОН)3, установлено, что после третьей иммунизации титр антител достигал уровня 1:460000 и до 9-й инъекции определялся в пределах от 1:250000 до 1:420000, после 10-й иммунизации происходил рост титра до максимальных значений (титр 1:750000). В последующие месяцы наблюдали постепенное снижение титров антител в сыворотках, однако даже через шесть месяцев после последней инъекции уровень антител (титр 1:45000) оставался значимо выше (более чем в 25 раз) в сравнении с сыворотками интактных кроликов (титр 1:1600). По истечении 6 месяцев после первого цикла иммунизаций дополнительное введение препарата аТох1,2,ДЗ в дозе 100 мкг индуцировало мощный (более чем в 15 раз) синтез специфичных антител против экзотоксина А.

Результаты изучения динамики титров антител на двух видах животных подтвердили иммуногенные свойства рекомбинантной атоксичной формы аТох1,2,ДЗ. Кроме того, выявлено, что иммунизация препаратом приводила к образованию антиген-специфических клеток памяти. Однако, следует отметить, что иммунный ответ оказался недостаточно стойким.

Для повышения иммуногенных свойств атоксичной рекомбинантной формы аТох 1,2,ДЗ экзотоксина А Р. aeruginosa провели сравнительное тестирование трёх адъювантов: А1(ОН)3, хитозана и очищенной ДНК Е. coli. Мышей двукратно с двухнедельными интервалами иммунизировали в дозе 50 мкг белка. Первая группа животных получала только рекомбинантный белок, вторая - аТох1,2,ДЗ, сорбированный на А1(ОН)3. Животные третьей группы дополнительно с сорбированным белком получали очищенную ДНК Е. coli в дозе 25 мкг на особь. Четвертую группу мышей иммунизировали белком аТох1,2,ДЗ с добавлением хитозана до конечной концентрации 0,5%. Животных контрольной группы не иммунизировали. По истечении двух недель

после последней иммунизации мышам вводили очищенный рекомбинантный экзотоксин А (табл. 3). Полученные результаты показали, что препарат аТох 1,2,ДЗ обладал слабыми иммуногенными свойствами. При использовании адъюванта А1(ОН)з иммуногенность препарата выросла в 4 раза, а в сочетании с ДНК Е. coli эффект усилился в 9 раз. Применение хитозана для повышения иммуногенности препарата аТох 1,2,ДЗ оказалось менее эффективным, по сравнению с А1(ОН)3.

Таблица 3

Влияние адъювантов на протективные свойства атоксичной рекомбинантной формы аТох1,2,ДЗ в дозе 50 мкг на мышь.

Препарат Доза введения рекомбинантного токсина, мкг Количество мышей павших/выживших ЛД50, мкг Х±о Индекс эффективности

Тох1,2,ДЗ 40 10/0 5±1 (р<0,05)* 2

20 10/0

10 9/1

5 6/4

Тох1,2, ДЗ +А1(ОН)3 40 6/4 20±4 (р<0,01)* (р<0,01)" 8

20 5/5

10 3/7

5 1/9

Тох1,2, Д 3 +А1(ОН)3 +ДНК E.coli 40 1/7 45,1±9 (р<0,01)' (Р<0,01)" 18,04

20 1/9

10 1/9

5 0/10

Тох1,2, Д 3 +хитозан 40 6/1 15,6±3,1 (р<0,01)* (р<0,01)" 6,24

20 7/3

10 3/7

5 0/10

Контроль (интактные мыши) 10 10/0 2,5±0,4 -

5 10/2

2,5 8/4

1,25 0/12

* - при сравнении значений опытных групп с контролем ** - при сравнении значений опытных групп с аТох1,2,ДЗ

При изучении протективной активности антител, полученных к белку

аТох 1,2,ДЗ (табл. 4), установлено, что сыворотки обладали защитными свойствами, нейтрализуя летальное действие рекомбинантного полноразмерного экзотоксина А. Индекс эффективности защитных свойств иммунной сыворотки оказался равным 7,3, что почти в четыре раза выше по сравнению с сывороткой крови интактных кроликов. Выявление протективного эффекта иммунных сывороток еще раз подтвердило, что полученная делеционная форма аТох1,2,АЗ обладает иммуногенными свойствами.

Таблица 4

Протективные свойства сывороток крови кроликов, содержащих антитела к аТох1,2,ДЗ, в опытах пассивной защиты белых мышей.

Сыворотка Доза введения токсина, мкг Количество мышей павших/выживших ЛДо, мкг Х±<з Индекс эффективности

Против Toxi,2,A3 (титр 1:420000) 25 10/0 11,1±2,2 0X0,01)* 7,3

10 4/6

5 2/8

2,5 2/8

1,25 0/10

Интактных кроликов (титр 1:1600) 5 10/0 2,9±0,6 1,9

2,5 5/5

1,25 3/7

0,625 0/10

Контроль (интактные мыши) 5 10/0 1,5±0,3 -

2,5 8/2

1,25 2/8

0,625 1/9

0,313 0/10

* - при сравнении значений опытных групп с контролем и сывороткой интактных кроликов

Таким образом, результаты изучения сконструированных рекомбинантных белков - атоксичных форм экзотоксина А P. aeruginosa дают основание предположить, что на их основе могут быть разработаны иммунобиологические препараты для диагностики, профилактики и лечения заболеваний, вызываемых синегнойной палочкой, хотя для окончательных выводов нужны дополнительные исследования.

выводы

1. Созданы четыре штамма-продуцента (Е. coli) рекомбинантных белков: рЕТ28-ТохА - экспрессирующий экзотоксин A; pET28-aToxl -синтезирующий домен I экзотоксина A; pET28-aToxl,2 - синтезирующий вариант, состоящий из доменов I и II, и рЕТ28-аТох1,2,ДЗ -экспрессирующий вариант, состоящий из доменов I, II и части домена III.

2. Выявлены антигенные свойства очищенных рекомбинантных белков ТохА, aToxl,2 и аТох1,2,ДЗ.

3. Доказана идентичность токсических свойств рекомбинантного и нативного экзотоксина А P. aeruginosa.

4. Установлена атоксичность для животных рекомбинантных делеционных вариантов белков - aToxl, aToxl,2 и аТох1,2,ДЗ.

5. Полученные рекомбинантные белки aToxl,2 и аТох1,2,ДЗ, обладали протективной активностью против рекомбинантного ТохА (индекс эффективности соответствовал 8,9) и иммуногенными свойствами, о чём свидетельствовала динамика накопления антител у иммунизированных мышей (титр возрастал от 1:200 до 1:1640000).

6. Иммунные сыворотки крови кролика против атоксичной формы aToxl,2,ДЗ (титр 1:420000) защищали мышей от введения 7,3 ЛД50 рекомбинантного экзотоксина А.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Михайлова H.A. Исследование протективных свойств рекомбинантной атоксичной формы экзотоксина А и рекомбинантного белка F наружной мембраны Pseudomonas aeruginosa. / Вертиев Ю.В., Калошин A.A. и Исаков М.А. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2010. - №2. - С. 39-44.

2. Исаков М.А. Получение рекомбинантного экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa. / Калошин A.A. и Михайлова H.A. // Биотехнология. - 2009. - №3. - С. 29-33.

3. Исаков М.А. Изучение влияния различных иммуномодуляторов и адъювантов на протективные свойства рекомбинантной формы экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa. / Калошин A.A., Кривцов Г.Г., Михайлова H.A., Зверев В.В. // Медицинская иммунология. Материалы XIII Всероссийского научного форума с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» 8-11 июня 2009 г. - Т. 11. №4-5. - С. 317-318.

4. Исаков М.А. Получение рекомбинантных атоксичных форм экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa. / Вертиев Ю.В., Калошин A.A. и Михайлова H.A. // Санкт-Петербург. 17-18 апреля 2008г. Тезисы всероссийской научной конференции. Вестник российской военно-медицинской академии. -2008. -№2(22). - Стр. 470-471.

5. Михайлова H.A. Исследование иммуногенных свойств рекомбинантных белков Pseudomonas aeruginosa. / Калошин A.A., Злыгостев С.А., Исаков М.А., Гатыпова Е.В. // Сборник тезисов XII Всероссийского форума «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге». Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т. 2 (11). - №2-3. - С.338.

6. Калошин A.A. Получение рекомбинантной анаформы экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa и исследование его защитных свойств. / Вертиев Ю.В., Исаков М.А., Михайлова H.A. // Москва 11-12 ноября 2008 г. Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». - Москва. - 2008. - С. 60.

7. Михайлова H.A. Поликомпонентная вакцина для профилактики и иммунотерапии инфекций, вызываемых оппортунистическими бактериями и грибами. / Блинкова Л.П., Батуро А.П., Калошин A.A., Романенко Э.Е., Злыгостев С.А., Горбатко Е.С., Исаков М.А.,

Гатыпова Е.В., Леонова А.Ю. // В сборнике «Современная микология России». Тезисы докладов 2-го съезда микологов России. - Москва. - Т. 2. - С. 494.

8. Михайлова Н.А. Разработка поликомпонентной вакцины против оппортунистических инфекций. / Блинкова Л.П., Батуро А.П., Ястребова Н.Е., Ванеева Н.П., Калошин А.А., Романенко Э.Е., Злыгостев С.А., Горбатко Е.С., Исаков М.А., Гатыпова Е.В., Леонова А.Ю. // В сб. «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств — участников содружества независимых государств». Материалы IX Межгосударственной научно-практической конференции государств - участников СНГ. - Волгоград. - 2008. -С. 114.

9. Михайлова Н.А. Экспериментальная разработка поликомпонентной вакцины против оппортунистических инфекций. / Зверев В.В., Семенов Б.Ф., Блинкова Л.П., Батуро А.П., Ястребова Н.Е., Ванеева Н.П., Калошин А.А., Романенко Э.Е., Злыгостев С.А., Горбатко Е.С., Исаков М.А., Сидорович Е.В., Леонова А.Ю. // Материалы научно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». — Москва. -2008. - С. 81.

10. Исаков М.А. Получение и исследование рекомбинантных атоксичных форм экзотоксина A Pseudomonas aeruginosa. / Калошин А.А. // Сборник тезисов. Биология - наука XXI века. 12-ая международная пущинская школа-конференция молодых ученых. - 10-14 ноября 2008. -С. 239.

11. Михайлова Н.А. Разработка поликомпонентной вакцины для профилактики и иммунотерапии инфекций, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами. / Зверев В.В., Семенов Б.Ф., Блинкова Л.П., Батуро А.П., Калошин А.А., Дорофеева Е.С., Исаков М.А., Гатыпова Е.В. // Сборник тезисов итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления "Живые системы" ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы". - Москва. -2007.-С. 210-211.

Подписано в печать: 16.05.10

Объем: 1,5 усл.печ.л. Тираж:100 экз. Заказ № 256 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г.Москва, пр-т Вернадского, 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Исаков, Михаил Андреевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Экзотоксин А.

1.2. Современное состояние проблемы по созданию вакцин против P. aeruginosa.

1.2.1. Цельноклеточные вакцины.

1.2.2. Липополисахаридные, полисахаридные и полисахарид-конъюгированные вакцины.

1.2.3. Вакцины на основе белков жгутиков.

1.2.4. Вакцины на основе белков наружной мембраны.

1.2.5. Вакцины на основе пилей и системы секреции III типа.

1.2.6. ДНК- и вирус-векторные вакцины.

1.2.7. Вакцины на основе экзотоксина А.

1.2.8. Пассивная иммунотерапия инфекций, вызываемых P. aeruginosa.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение рекомбинантных атоксичных форм экзотоксина A Pseudomonas aeruginosa и изучение их иммунобиологических свойств"

Условно-патогенный микроорганизм Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) является главной причиной инфекций у иммунокомпрометированных больных, например, перенёсших ожоги различной степени тяжести или находящихся под иммуносупрессивной и цитостатической терапией злокачественных новообразований, а также получающих её с целью предотвращения отторжения трансплантатов [135, 165]. По данным Национальной системы по надзору за нозокомиальными инфекциями в США (NNIS), синегнойная палочка занимает четвёртое место среди госпитальных возбудителей. Она является основной причиной пневмонии, третьей по частоте случаев инфекций мочевыводящих путей, пятой при раневых инфекциях и восьмой - среди инфекций кровотока. В отделениях интенсивной терапии P. aeruginosa вызывает 12,4 % всех инфекционных осложнений, в том числе занимает первое место среди инфекций нижних дыхательных путей (17,5 %), четвёртое место среди мочевых инфекций (12,1 %), третье - среди раневых инфекций (10,9 %) и шестое - среди инфекций кровотока [25]. Ежегодно только в США регистрируется примерно 2 млн. случаев нозокомиальной инфекции, которые в 5 % случаев заканчиваются смертью больного. Летальность от бактериемий и пневмоний, вызываемых P. aeruginosa, может превышать 50 %.

Трудность борьбы с синегнойной инфекцией во многом обусловлена тем, что возбудитель обладает выраженной природной полирезистентностью, а также способен быстро вырабатывать устойчивость к антибиотикам. У этого микроорганизма имеется несколько механизмов противоантибиотиковой устойчивости, включающих в себя ферментативную модификацию лекарств, сайт-направленные изменения, индуцируемые препаратами, систему выкачивания антибиотиков, а также довольно низкую проницаемость внешней мембраны, что часто приводит к развитию множественной устойчивости к широкому спектру антибиотиков

36, 76, 198]. Поэтому необходимо создание эффективных препаратов для иммунопрофилактики и иммунотерапии заболеваний или осложнений, вызванных синегнойной палочкой.

В последние десятилетия создано несколько вариантов различных вакцин против патогена P. aeruginosa. Исследованы такие антигены как липополисахарид, поверхностные полисахариды, полисахарид-белковые конъюгаты, белки жгутика, белки наружной мембраны [23, 43, 104, 169], слитые белки [137] и синтетические пептиды, несущие протективные эпитопы [83], пили, целые формалин-убитые P. aeruginosa клетки [1, 17, 23, 56], экстракты белков клеточной стенки [14], живые аттенуированные клетки P. aeruginosa [171], а также последовательности ДНК, экспрессирующие антигены P. aeruginosa [195]. Активно проводятся разработки препаратов для пассивной иммунотерапии синегнойных инфекций: создание генно-инженерных иммуноглобулинов против альгинатов [163], липополисахаридов [161], ЭТА [73], синтезируемых P. aeruginosa. Несмотря на то, что эти экспериментальные вакцины и моноклональные антитела протестированы в предклинических исследованиях, лишь некоторые из них достигли клинической фазы, и ни одна из них не получила коммерческого подтверждения.

Одним из широко изученных антигенов является ЭТА. Давно установлено, что значительная часть нейтрализующих антител против синегнойной инфекции вырабатывается именно на ЭТА, который продуцируют около 90% клинических штаммов P. aeruginosa [167]. При токсических формах заболеваний он является одним из главных патогенетических факторов P. aeruginosa, обладая примерно в 10000 раз большей токсичностью, чем липополисахарид [102, 131, 133]. Данный белок обладает НАД^-дифтамид-АДФ-рибозил-трансферазной активностью и принадлежит к семейству секретируемых бактериальных токсинов, ковалентно модифицирующих специфические белки внутри эукариотических клеток. В это семейство также входят экзотоксины

Corynebacterium diphtheriae (дифтерийный токсин), Vibrio cholerae (холерный токсин), Escherichia coli (термолабильный токсин), Shigella dysenteria (шига токсин) и Bacillus anthracis (токсины сибирской язвы). Несмотря на разнообразие по размерам, субъединичному составу, клеточной специфичности и ферментативной активности, эти токсины имеют схожий многошаговый механизм действия, при котором сначала они связываются с поверхностью мембраны целевой клетки, затем каталитический домен транслоцируется в цитоплазму, и наконец, каталитическая субъединица модифицирует целевой субстрат [37].

ЭТА P. aeruginosa продуцируется в виде одной полипептидной цепи. Анализ его кристаллической структуры показал, что молекула состоит из трёх доменов: домен I (с 1 по 252 аминокислотные остатки), необходимый для связывания с рецептором на целевых клетках, домен II (с 253 по 404 аминокислотные остатки), осуществляющий трансмембранный перенос токсина в клетку, и домен III (с 405 по 613 аминокислотные остатки), обладающий токсической активностью [35]. Именно домен III инактивирует эукариотический фактор элонгации 2 (eEF-2) при помощи АДФ-рибозилирования, что приводит к ингибированию белкового синтеза и апоптозу [37]. Изменение аминокислотной последовательности домена III в ряде случаев приводит к снижению токсичности ЭТА [70].

К настоящему времени разработаны различные варианты вакцин на основе ЭТА, в том числе с использованием генно-инженерных методов, а именно: обезвреженная культуральная токсинсодержащая жидкость [16, 19]; ЭТА, несущий точечную мутацию в активном центре домена III [70, 136]; фрагменты ЭТА [73]; плазмида, экспрессирующая рекомбинантную форму токсина в клетках млекопитающих [188]. Тем не менее, до сих пор в России не зарегистрировано лекарственных средств для предупреждения и лечения инфекций, вызываемых P. aeruginosa.

Учитывая широкое распространение синегнойных инфекций в клинической практике и высокую летальность при токсических формах заболеваний, связанную с особой повреждающей способностью экзотоксина А P. aeruginosa, создание иммунобиологического препарата на его основе представляется актуальным исследованием.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для решения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Создать генно-инженерные конструкции на основе плазмиды рЕТ28, несущие: 1) последовательность гена экзотоксина А, кодирующую полную рамку считывания гена экзотоксина А (ТохА), используя в качестве матрицы ДНК, выделенную из P. aeruginosa; 2) последовательность гена экзотоксина А, кодирующую только домен I (aToxl); 3) последовательность гена экзотоксина А, кодирующую только домены I и II (aToxl,2); 4) последовательность гена экзотоксина А, кодирующую домены I, II и часть домена III (aToxl,2,ДЗ).

2. Получить бактериальные (Е. coli) продуценты рекомбинантных белков aToxl, aToxl,2, aToxl,2,ДЗ и ТохА и оценить степень их экспрессии.

3. Получить очищенные рекомбинантные белки aToxl, aToxl,2, aToxl,2,A3 и ТохА.

4. Оценить токсичность полученных белковых препаратов для животных.

5. Изучить иммуногенные свойства рекомбинантных белков aToxl, aToxl,2 и aToxl,2,ДЗ на экспериментальных животных.

6. Изучить протективные свойства полученных белковых препаратов aToxl, aToxl,2 и аТох1,2,ДЗ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые сконструированы штаммы-продуценты (Е. coli) рекомбинантного экзотоксина А P. aeruginosa - ТохА и его атоксичных форм: aToxl, aToxl,2 и aToxl,2,A3. Доказана идентичность токсических свойств рекомбинантного ТохА и нативного экзотоксина А. Впервые полученные делеционные рекомбинантные белки aToxl, aToxl,2 и aToxl,2, A3 оказались нетоксичными для животных. Выявлены иммуногенные свойства рекомбинантных белков - aToxl,2 и aToxl,2,A3; трехкратное их введение мышам индуцировало увеличение титра специфических антител в 8000 раз. Максимальную протективную активность проявлял рекомбинантный белок aToxl,2,A3 с индексом эффективности 8,9. Иммунные сыворотки крови кроликов к рекомбинантному белку aToxl,2, A3 (титр 1:420000) обладали протективными свойствами (индекс эффективности 7,3).

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

На основе очищенного рекомбинантного белка aToxl,2,A3 может быть сконструирован новый иммунобиологический препарат для иммунизации доноров с целью получения антитоксической плазмы, а так же возможно его использование в качестве компонента комплексной противосинегнойной вакцины.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Сконструированные штаммы-продуценты (Е. coli) рЕТ28-aToxl, pET28-aToxl,2, рЕТ28-аТох1,2,ДЗ и рЕТ28-ТохА характеризуются высоким выходом целевых продуктов (на уровне 40 - 70 %). Технологические приёмы получения и очистки рекомбинантных белков позволяют наработать их в количествах, достаточных для биологического тестирования.

2. Полученный очищенный рекомбинантный белок ТохА (73,8 кДа) идентичен по токсическим свойствам нативному экзотоксину А. Очищенные рекомбинантные белки aToxl (38,6 кДа), aToxl,2 (49,0 кДа), aToxl,2,A3 (65,8 кДа) атоксичны, а варианты aToxl,2 и aToxl,2,A3 обладают иммуногенными и протективными свойствами.

3. Иммунная сыворотка к рекомбинантному белку aToxl,2,A3 способна защищать животных от введения экзотоксина А.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Исаков, Михаил Андреевич

выводы

2. Выявлены антигенные свойства очищенных рекомбинантных белков ТохА, aToxl,2 и aToxl,2,A3.

3. Доказана идентичность токсических свойств рекомбинантного и нативного экзотоксина А P. aeruginosa.

4. Установлена атоксичность для животных рекомбинантных делеционных вариантов белков - aToxl, aToxl,2 и aToxl,2,A3.

5. Полученные рекомбинантные белки aToxl,2 и aToxl,2,A3, обладали протективной активностью против рекомбинантного ТохА (индекс эффективности соответствовал 8,9) и иммуногенными свойствами, о чём свидетельствовала динамика накопления антител у иммунизированных мышей (титр возрастал от 1:200 до 1:1640000).

6. Иммунные сыворотки крови кролика против атоксичной формы aToxl,2,A3 (титр 1:420000) защищали мышей от введения 7,3 ЛД50 рекомбинантного экзотоксина А.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По данным литературы, перспективными для разработки являются поликомпонентные конъюгированные генно-инженерные вакцины, при создании которых используют наиболее иммуногенные антигены P. aeruginosa.

Для получения атоксичных вариантов белков на основе ЭТА с помощью полимеразной цепной реакции амплифицировали ген toxA P. aeruginosa, несущий открытую рамку считывания экзотоксина А. В качестве матрицы при этом использовали геномную ДНК штамма РА103

P. aeruginosa, который характеризуется высоким уровнем синтеза экзотоксина А.

При помощи генно-инженерных манипуляций последовательность гена toxA переносили в систему экспрессии рекомбинантных белков на основе плазмиды pET28(+)b (Novagen). При этом были созданы четыре продуцента (Е. coli штамм BL21(DE3)) рекомбинантных белков: рЕТ28-ТохА - экспрессирующий экзотоксин А (М.м. 73,4 кДа); pET28-aToxl -экспрессирующий домен I экзотоксина А (М.м. 38,6 кДа); pET28-aToxl,2 -экспрессирующий вариант, состоящий из доменов I и II (М.м. 49,0 кДа); и рЕТ28-аТох1,2,ДЗ - экспрессирующий вариант, состоящий из доменов I, II и части домена III (М.м. 65,8 кДа).

Молекулярная масса рекомбинантных белков, синтезирующихся после индукции, определённая электрофоретически в ПААГ по Лэммли, соответствовала теоретически рассчитанной. Уровень индукции рекомбинантных белков среди общего количества бактериальных белков составлял от 10 % до 34 % в зависимости от штамма-продуцента. Полученные рекомбинантные белки - ТохА, aToxl, aToxl,2 и aToxl,2,ДЗ, имели на N-конце дополнительную аминокислотную последовательность из шести гистидинов, что позволило провести их очистку методом ионно-аффинной хроматографии, используя в качестве сорбента Ni-сефарозу High Performance (GE healthcare). Выход препаратов составил от 38,8 % до 71,4 %, а степень чистоты была не менее 66 %.

Исследования биологических свойств полученного рекомбинантного экзотоксина А - ТохА, выявило наличие выраженной токсической активности для животных (ЛД50 для белых беспородных мышей составила 2,53±0,73 мкг), сопоставимой нативному токсину P. aeruginosa. Использование стандартной технологии получения очищенного рекомбинантного белка позволяло исключить примеси других токсичных компонентов, продуцируемых P. aeruginosa.

Проведённые токсикологические исследования рекомбинантных делеционных форм aToxl, aToxl,2 и aToxl,2,A3 для оценки влияния препаратов на организм экспериментальных животных (мыши и крысы) показали, что введение белков, сорбированных на геле гидроксида алюминия, не вызывало изменений в поведении животных в течение всего срока наблюдения. Незначительное снижение темпов роста массы отмечено только при введении высоких доз рекомбинантного белка aToxl,2,A3 белым мышам, что, вероятно, связано с воспалительной реакцией, а не с токсичностью препарата. Таким образом, рекомбинантные белки с делецией С-концевой области экзотоксина A (aToxl, aToxl,2 и aToxl,2,A3), оказались безопасными и нетоксичными для исследованных групп животных.

С помощью ИФА и иммуноблоттинга установлено, что белки aToxl,2, aToxl,2,A3 и ToxA специфично реагировали с антителами сыворотки крови кроликов, иммунизированных анатоксином P. aeruginosa. Очистка рекомбинантных белков ионообменной хроматографией на Ni-сефарозе не влияла на специфичность их связывания с антителами к анатоксину. Вариант aToxl, не взаимодействовал с иммунной сывороткой к анатоксину P. aeruginosa, что вероятно связано с отсутствием антигенных детерминант на его поверхности.

При изучении протективных эффектов атоксичных форм после введения рекомбинантного экзотоксина А установлено, препараты aToxl,2 и aToxl,2,A3 обладали дозозависимым протективным эффектом: индексы эффективности 8,3 и 8,9 определены для групп животных, получивших препарат aToxl,2 или aToxl,2,A3 в дозе 50 мкг. В дозе 25 мкг индексы эффективности для этих же делеционных вариантов составили 3,9 и 5,1, соответственно. Вариант aToxl в исследованных дозах не защищал мышей от введения рекомбинантного ТохА.

Полученные результаты позволяют предположить, что подавление транслокационной и ферментативной функций токсина, а так же инактивация его повреждающего воздействия на организм животного происходит за счёт специфического взаимодействия антител с эпитопами, расположенными на доменах II и III экзотоксина А. Отсутствие протективных свойств рекомбинантного белка aToxl, вероятно, связано с рядом причин: низкой иммуногенностью вследствие небольшого размера (М.м. менее 40 кДа); или наличием слабо иммуногенных эпитопов. Кроме того, можно предположить, что антитела против домена I не способны инактивировать рецепторную функцию нативного экзотоксина А, вследствие низкой аффинности или отсутствия направленности на участок, ответственный за узнавание экзотоксином А рецептора клеток-мишеней.

Изучение иммуногенных свойств позволило установить, что атоксичные варианты aToxl,2 и aToxl,2,A3 стимулировали в организме животных синтез антител, специфичных к рекомбинантному экзотоксину А, при этом прослеживалась прямая зависимость между титром антител, дозой вводимого препарата и количеством проведённых иммунизаций. Максимальные титры специфических антител достигались в результате трехкратной иммунизации дозой 100 мкг и составляли для белка aToxl,2 - 1:1584000, а в случае с белком aToxl,2,A3 -1:1638000.

Изучение динамики титров антител на двух видах животных также подтвердило иммуногенные свойства рекомбинантной атоксичной формы aToxl,2,ДЗ. Показано, что иммунизация препаратом приводила к образованию антиген-специфических клеток памяти. Однако, следует отметить, что антительный ответ оказался недостаточно стойким.

Для повышения иммуногенных свойств атоксичной рекомбинантной формы аТох 1,2,ДЗ экзотоксина А P. aeruginosa провели сравнительное тестирование трёх адъювантов: А1(ОН)3, хитозана и очищенной ДНК Е. coli. Полученные результаты показали, что препарат аТох 1,2,A3 обладал слабыми иммуногенными свойствами. При использовании адъюванта А1(ОН)з иммуногенность препарата выросла в 4 раза, а в сочетании с ДНК Е. coli эффект усилился в 9 раз. Применение хитозана для повышения иммуногенности препарата аТох 1,2,ДЗ оказалось менее эффективным, по сравнению с А1(ОН)3.

При изучении протективной активности антител, полученных к белку аТох 1,2,ДЗ, установлено, что сыворотки обладали защитными свойствами, нейтрализуя летальное действие рекомбинантного полноразмерного экзотоксина А. Индекс эффективности защитных свойств иммунной сыворотки оказался равным 7,3, что почти в четыре раза выше по сравнению с сывороткой крови интактных кроликов. Выявление протективного эффекта иммунных сывороток еще раз подтвердило, что полученная делеционная форма aToxl,2,ДЗ обладает иммуногенными свойствами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Исаков, Михаил Андреевич, Москва

1. Бандман OA., Станиславский Е.С., Холодкова Е.В., Иванова Т.В. и Салов В.Ф. Вакцинопрофилактика синегнойного ожогового сепсиса в эксперименте. //Журн. микробиол., 1989(7): р. 59-62.

2. Бродинова Н.С., Баскакова Н.В., Мороз А.Ф., и Мокриевич Н.М. Продукция экзотоксина А при культивировании Pseudomonas aeruginosa РА-7 на бульоне Мартена. //Журн. микробиол., 1984(4): р. 22-26.

3. Ванеева Н.П., Янишевская М.Н., Александрова Т.Н. и Яншина H.JI. Определение специфических антитоксинов Pseudomonas aeruginosa в коммерческих препаратах иммуноглобулина человека. // Журн. микробиол., 1995(1): р. 59-61.

4. Вертиев Ю.В., Бродвинова Н.С. и Мороз А.Ф. Экзотоксин А Pseudomonas aeruginosa и его роль в патогенезе синегнойной инфекции//Журн. микробиол., 1981(2): р. 13-19.

5. Гатыпова Е.В., Злыгостев С.А., Калошин А.А. и Михайлова Н.А. Получение рекомбинантного белка I наружной мембраны (OprI) Pseudomonas aeruginosa и исследование его антигенных свойств. // Журн. микробиол., 2008(6): р. 50-53.

6. Гатыпова Е.В., Злыгостев С.А., Калошин А.А. и Михайлова НА. Исследование иммуногенных свойств рекомбинантных белков Pseudomonas aeruginosa. // Вестник Рос. акад. мед. наук., 2009(4): р. 25-28.

7. Дзюбан Н.Ф. и Подгорная Л.Г. Протективные свойства анатоксина синегнойной палочки. //Журн. микробиол., 1985. 47(2): р. 83-86.

8. Едвабная Л.С., Зайднер И.Г., Макаренко Т.А., Букл В.Ф. и Жванетская М.И. Белковые протективные антигены P. aeruginosa // Журн. микробиол., 1985(11): р. 18-23.

9. Злыгостев С.А., Гатауллин А.Г., Калошин А.А., Михайлова Н.А. и Зверев В.В. Исследование защитных свойств рекомбинантного белка

10. F наружной мембраны (OprF) Pseudomonas aeruginosa. // Журн. микробиол., 2006(7): p. 43-47.

11. Калошин A.A., Злыгостев С.А., Гатыпова Е.В. и Михайлова Н.А. Иммуногенные свойства рекомбинантных белков F и L наружной мембраны Pseudomonas aeruginosa. // Журн. микробиол., 2008(5): р. 76-79.

12. Калошин А.А., Злыгостев С.А., Торопчина Ю.Н., Курбатова Е.А., Зверев В.В. и Михайлова Н.А. Получение рекомбинантного белка F наружной мембраны (OprF) Pseudomonas aeruginosa и изучение его антигенных свойств. //Журн. микробиол., 2005(5): р. 50-53.

13. Кузнецова Т.Н., Михайлова Н.А. и Баснакян И.А. Оптимизация периодического процесса культивирования Pseudomonas aeruginosa с целью получения экзотоксина А. //Журн. микробиол., 1991(6): р. 2225.

14. Кулыпин В.А., Анциферова Н.Г., Мороз А.Ф. и Дмитриев Б.А. Протективные искусственные полисахарид-белковые антигены из О-специфических полисахаридов бактерии Pseudomonas aeruginosa иммунотипов 1, 2 и 7. //Журн. микробиол., 1988(11): р. 69-71.

15. Макаренко Т.А. и Станиславский Е.С. Иммунологическое изучение белков клеточной стенки Pseudomonas aeruginosa. // Журн. микробиол., 1996(2): р. 7-9.

16. Михайлова Н.А., Кунягина О.В., Кузнецова Т.Н., Садыкова А.Ф., Бродвинова Н.С. и Бодрова Т.Н. Изучение безопасности, реактогенности и антигенности анатоксина Pseudomonas aeruginosa на добровольцах.//Журн. микробиол., 1995(3): р. 89-92.

17. Подгорная Л.Г. и Дзюбан Н.Ф. Получение анатоксина при выращивании Pseudomonas aeruginosa на казеиновой питательной среде. //Журн. микробиол., 1985. 47(6): р. 40-43.

18. Подгорная Л.Г. и Дзюбан Н.Ф. Антигенные свойства анатоксина синегнойной палочки и протективное действие антитоксической антисинегнойной сыворотки.//Журн. микробиол., 1986(6): р. 67-69.

19. Подгорная Л.Г., Дзюбан Н.Ф., Калиниченко Н.Ф. и Исаева С. Превентивные свойства комплекса анатоксинов синегнойной и столбнячной палочек в эксперименте. // Журн. микробиол., 1987. 49(5): р. 55-58.

20. Станиславский Е.С., loo I., Северцова М.К., Машилова Г.М. и Boltutsii L.G. Иммунологическая эффективность и безвредность в эксперименте пиоиммуногена-вакцины против инфекции Pseudomonas aeruginosa. //Журн. микробиол., 1982(5): р. 70-75.

21. Станиславский Е.С., Joo I., Булк В.Ф., Жванецкая М.И. и Машилова Г.М. Бесклеточная псевдомонас-вакцина. Сообщение IV. Лабораторные испытания эффективности экспериментальных псевдомонас-вакцин.//Журн. микробиол., 1982(10): р. 25-29.

22. Страчунский Л.С., Белоусова Ю.Б. и Козлова С.Н. Нозокомиальные инфекции. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии. //2002: р. 350.

23. Харитонова A.M., Григорьева Л.В., Анциферова Н.Г., Радкевич С.А. и Веткова Л.Г. Безвредность, сенсибилизирующие свойства поливалентной корпускулярной синегнойной вакцины и её влияние на гематологические показатели. //Журн. микробиол., 1986(2): р. 1419.

24. Шинкаренко А.А., Подгорная Л.Г., Щетинина В.Н., Дьяченко В.Ф. и Дзюбан Н.Ф. Некоторые физико-химические характеристики анатоксина синегнойной палочки. //Журн. микробиол., 1986. 48(6): р. 29-31.

25. Янишевская М.Н. Токсоид Pseudomonas aeruginosa // Журн. микробиол., 1985(2): р. 27-32.

26. Янишевская М.Н., Кузьмина Н.С. и Голшмид В.К. Экзотоксин Pseudomonas aeruginosa. //Журн. микробиол., 1982(10): р. 33-37.

27. Янишевская М.Н., Кузьмина Н.С., Кутимова Л.Р., Лентц М.Н. и Минакова Л.В. Антитела к токсину Pseudomonas aeruginosa в препаратах нормального иммуноглобулина человека. // Журн. микробиол., 1983(6): р. 100-103.

28. Adamo R., Sokol S., Soong G., Gomez M.I., and Prince A. Pseudomonas aeruginosa flagella activate airway epithelial cells through asialoGMl and toll-like receptor 2 as well as toll-like receptor 5 // Am J Respir Cell Mol Biol, 2004. 30(5): p. 627-634.

29. Agnihotri N., Gupta V., and Joshi R.M. Aerobic bacterial isolates from burn wound infections and their antibiograms~a five-year study // Burns, 2004. 30(3): p. 241-243.

30. Allison J.S., Dawson M., Drake D., and Montie T.C. Electrophoretic separation and molecular weight characterization of Pseudomonas aeruginosa H-antigen flagellins//Infect Immun, 1985. 49(3): p. 770-774.

31. Allured V.S., Collier R.J., Carroll S.F., and McKay D.B. Structure of exotoxin A of Pseudomonas aeruginosa at 3.0-Angstrom resolution // Proc Natl Acad Sci USA, 1986. 83(5): p. 1320-1324.

32. Aloush V., Navon-Venezia S., Seigman-Igra Y., Cabili S., and Carmeli Y. Multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa: risk factors and clinical impact //Antimicrob Agents Chemother, 2006. 50(1): p. 43-48.

33. Armstrong S., Yates S.P., and Merrill A.R. Insight into the catalytic mechanism of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Studies of toxin interaction with eukaryotic elongation factor-2 // J Biol Chem, 2002. 277(48): p. 46669-46675.

34. Audette G.F., Irvin R.T., and Hazes B. Crystallographic analysis of the Pseudomonas aeruginosa strain K122-4 monomeric pilin reveals a conserved receptor-binding architecture //Biochemistry, 2004. 43(36): p. 11427-11435.

35. Bard F., Mazelin L., Pechoux-Longin C., Malhotra V., and Jurdic P. Src regulates Golgi structure and KDEL receptor-dependent retrograde transport to the endoplasmic reticulum //J Biol Chem, 2003. 278(47): p. 46601-46606.

36. Baumann U., Mansouri E., and von Specht B.U. Recombinant OprF-OprI as a vaccine against Pseudomonas aeruginosa infections // Vaccine, 2004. 22(7): p. 840-847.

37. Beattie B.K., Prentice G.A., and Merrill A.R. Investigation into the catalytic role for the tryptophan residues within domain III of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A // Biochemistry, 1996. 35(48): p. 15134-15142.

38. Bendig J.W., Kyle P.W., Giangrande P.L., Samson D.M., and Azadian B.S. Two neutropenic patients with multiple resistant Pseudomonas aeruginosa septicaemia treated with ciprofloxacin // J R Soc Med, 1987. 80(5): p. 316-317.

39. Bennett-Guerrero E., Mcintosh T.J., Barclay G.R., Snyder D.S., Gibbs R.J., Mythen M.G., and Poxton I.R. Preparation and preclinical evaluation of a novel liposomal complete-core lipopolysaccharide vaccine // Infect Immun, 2000. 68(11): p. 6202-6208.

40. Bitter W. Secretins of Pseudomonas aeruginosa: large holes in the outer membrane//Arch Microbiol, 2003. 179(5): p. 307-314.

41. Chang J.H. and Kwon H.Y. Expression of 14-3-3delta, cdc2 and cyclin В proteins related to exotoxin A-induced apoptosis in HeLa S3 cells // Int Immunopharmacol, 2007. 7(9): p. 1185-1191.

42. Chaudhary V.K., Jinno Y., FitzGerald D., and Pastan I. Pseudomonas exotoxin contains a specific sequence at the carboxyl terminus that is required for cytotoxicity//Proc Natl Acad Sci USA, 1990. 87(1): p. 308312.

43. Chen T.Y., Shang H.F., Chen T.L., Lin C.P., Hui C.F., and Hwang J. Recombinant protein composed of Pseudomonas exotoxin A, outer membrane proteins I and F as vaccine against P. aeruginosa infection // Appl Microbiol Biotechnol, 1999. 52(4): p. 524-533.

44. Cheng K., Smyth R.L., Govan J.R., Doherty C., Winstanley C., Denning N., Heaf D.P., van Saene H., and Hart C.A. Spread of beta-lactam-resistant Pseudomonas aeruginosa in a cystic fibrosis clinic // Lancet, 1996. 348(9028): p. 639-642.

45. Collins M.S. and Roby R.E. Protective activity of an intravenous immune globulin (human) enriched in antibody against lipopolysaccharide antigens of Pseudomonas aeruginosa//Am J Med, 1984. 76(3A): p. 168174.

46. Cornelis P. Pseudomonas: Genomics and Molecular Biology // Caister Academic Press, 2008: p. 244.

47. Cryz S.J., Jr., Furer E., and Que J.U. Synthesis and characterization of a Pseudomonas aeruginosa alginate-toxin A conjugate vaccine // Infect Immun, 1991. 59(1): p. 45-50.

48. Cryz S.J., Jr., Sadoff J.C., Cross A.S., and Furer E. Safety and immunogenicity of a polyvalent Pseudomonas aeruginosa O-polysaccharide-toxin A vaccine in humans // Antibiot Chemother, 1989. 42: p. 177-183.

49. Cryz S.J., Jr., Wedgwood J., Lang A.B., Ruedeberg A., Que J.U., Furer E., and Schaad U.B. Immunization of noncolonized cystic fibrosis patients against Pseudomonas aeruginosa//J Infect Dis, 1994. 169(5): p. 1159-1162.

50. Dasgupta N., Wolfgang M.C., Goodman A.L., Arora S.K., Jyot J., Lory S., and Ramphal R. A four-tiered transcriptional regulatory circuit controls flagellar biogenesis in Pseudomonas aeruginosa // Mol Microbiol, 2003. 50(3): p. 809-824.

51. Denis-Mize K.S., Price B.M., Baker N.R., and Galloway D.R. Analysis of immunization with DNA encoding Pseudomonas aeruginosa exotoxin A // FEMS Immunol Med Microbiol, 2000. 27(2): p. 147-154.

52. Domenighini M. and Rappuoli R. Three conserved consensus sequences identify the NAD-binding site of ADP-ribosylating enzymes, expressed by eukaryotes, bacteria and T-even bacteriophages // Mol Microbiol, 1996.21(4): p. 667-674.

53. Donnelly J.J., Ulmer J.B., Shiver J.W., and Liu M.A. DNA vaccines // Annu Rev Immunol, 1997. 15: p. 617-648.

54. Doring G., Meisner C., and Stern M. A double-blind randomized placebo-controlled phase III study of a Pseudomonas aeruginosa flagella vaccine in cystic fibrosis patients //Proc Natl Acad Sci USA, 2007. 104(26): p. 11020-11025.

55. Doring G. and Pier G.B. Vaccines and immunotherapy against Pseudomonas aeruginosa//Vaccine, 2008. 26(8): p. 1011-1024.

56. Douglas C.M. and Collier R.J. Exotoxin A of Pseudomonas aeruginosa: substitution of glutamic acid 553 with aspartic acid drastically reduces toxicity and enzymatic activity // J Bacteriol, 1987. 169(11): p. 49674971.

57. Driscoll J.A., Brody S.L., and Kollef M.H. The epidemiology, pathogenesis and treatment of Pseudomonas aeruginosa infections // Drugs, 2007. 67(3): p. 351-368.

58. Duchene M., Barron C., Schweizer A., von Specht B.U., and Domdey H. Pseudomonas aeruginosa outer membrane lipoprotein I gene: molecular cloning, sequence, and expression in Escherichia coli //J Bacteriol, 1989. 171(8): p. 4130-4137.

59. Elzaim H.S., Chopra A.K., Peterson J.W., Goodheart R., and Heggers J.P. Generation of neutralizing antipeptide antibodies to the enzymatic domain of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A //Infect Immun, 1998. 66(5): p. 2170-2179.

60. Erol S., Altoparlak U., Akcay M.N., Celebi F., and Parlak M. Changes of microbial flora and wound colonization in burned patients // Burns, 2004. 30(4): p. 357-361.

61. Erridge C., Stewart J., Bennett-Guerrero E., Mcintosh T.J., and Poxton I.R. The biological activity of a liposomal complete core lipopolysaccharide vaccine // J Endotoxin Res, 2002. 8(1): p. 39-46.

62. Falagas M.E., Koletsi P.K., and Bliziotis I.A. The diversity of definitions of multidrug-resistant (MDR) and pandrug-resistant (PDR) Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa // J Med Microbiol, 2006. 55(Pt 12): p. 1619-1629.

63. Feldman M., Bryan R., Rajan S., Scheffler L., Brunnert S., Tang H., and Prince A. Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection//Infect Immun, 1998. 66(1): p. 43-51.

64. Feuillet V., Medjane S., Mondor I., Demaria O., Pagni P.P., Galan J.E., Flavell R.A., and Alexopoulou L. Involvement of Toll-like receptor 5 inthe recognition of flagellated bacteria // Proc Natl Acad Sci USA, 2006. 103(33): p. 12487-12492.

65. Ghendon Y., Markushin S., Krivtsov G., and Akopova I. Chitosan as an adjuvant for parenterally administered inactivated influenza vaccines // Arch Virol, 2008. 153(5): p. 831-837.

66. Gilleland H.E., Gilleland L.B., and Fowler M.R. Vaccine efficacies of elastase, exotoxin A, and outer-membrane protein F in preventing chronic pulmonary infection by Pseudomonas aeruginosa in a rat model // J Med Microbiol, 1993. 38(2): p. 79-86.

67. Gomez M.I. and Prince A. Opportunistic infections in lung disease: Pseudomonas infections in cystic fibrosis // Curr Opin Pharmacol, 2007. 7(3): p. 244-251.

68. Gordon V.M. and Leppla S.H. Proteolytic activation of bacterial toxins: role of bacterial and host cell proteases // Infect Immun, 1994. 62(2): p. 333-340.

69. Hafkemeyer P., Brinkmann U., Gottesman M.M., and Pastan I. Apoptosis induced by Pseudomonas exotoxin: a sensitive and rapid marker for gene delivery in vivo//Hum Gene Ther, 1999. 10(6): p. 923-934.

70. Hansen J.K. and Forest K.T. Type IV pilin structures: insights on shared architecture, fiber assembly, receptor binding and type II secretion // J Mol Microbiol Biotechnol, 2006. 11(3-5): p. 192-207.

71. Hazes B. and Read R.J. Accumulating evidence suggests that several AB-toxins subvert the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter target cells // Biochemistry, 1997. 36(37): p. 1105111054.

72. Hazes В., Sastry P.A., Hayakawa K., Read R.J., and Irvin R.T. Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa РАК pilin suggests a main-chain-dominated mode of receptor binding //J Mol Biol, 2000. 299(4): p. 10051017.

73. Hertle R., Mrsny R., and Fitzgerald D.J. Dual-function vaccine for Pseudomonas aeruginosa: characterization of chimeric exotoxin A-pilin protein //Infect Immun, 2001. 69(11): p. 6962-6969.

74. Hessler J.L. and Kreitman R.J. An early step in Pseudomonas exotoxin action is removal of the terminal lysine residue, which allows binding to theKDEL receptor//Biochemistry, 1997. 36(47): p. 14577-14582.

75. Holder I.A. and Naglich J.G. Experimental studies of the pathogenesis of infections due to Pseudomonas aeruginosa: immunization using divalent flagella preparations//J Trauma, 1986. 26(2): p. 118-122.

76. Holder I.A., Neely A.N., and Frank D.W. PcrV immunization enhances survival of burned Pseudomonas aeruginosa-infected mice // Infect Immun, 2001. 69(9): p. 5908-5910.

77. Horzempa J., Dean C.R., Goldberg J.B., and Castric P. Pseudomonas aeruginosa 1244 pilin glycosylation: glycan substrate recognition // J Bacterid, 2006. 188(12): p. 4244-4252.

78. Hunt J.L. and Purdue G.F. A clinical trial of i.v. tetravalent hyperimmune Pseudomonas globulin G in burned patients //J Trauma, 1988. 28(2): p. 146-151.

79. Hwang J., Fitzgerald D.J., Adhya S., and Pastan I. Functional domains of Pseudomonas exotoxin identified by deletion analysis of the gene expressed inE. coli//Cell, 1987. 48(1): p. 129-136.

80. Iglewski B.H. and Kabat D. NAD-dependent inhibition of protein synthesis by Pseudomonas aeruginosa toxin // Proc Natl Acad Sci USA, 1975. 72(6): p. 2284-2288.

81. Iglewski B.H., Liu P.V., and Kabat D. Mechanism of action of Pseudomonas aeruginosa exotoxin Aiadenosine diphosphate-ribosylationof mammalian elongation factor 2 in vitro and in vivo // Infect Immun, 1977. 15(1): p. 138-144.

82. Jenkins C.E., Swiatoniowski A., Issekutz A.C., and Lin T.J. Pseudomonas aeruginosa exotoxin A induces human mast cell apoptosis by a caspase-8 and -3-dependent mechanism // J Biol Chem, 2004. 279(35): p. 3720137207.

83. Johansen H.K. and Gotzsche P.C. Vaccines for preventing infection with Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis // Cochrane Database Syst Rev, 2008(4): p. CD001399.

84. Jones R.J., Roe E.A., and Gupta J.L. Controlled trial of Pseudomonas immunoglobulin and vaccine in burn patients //Lancet, 1980. 2(8207): p. 1263-1265.

85. Jorgensen R., Merrill A.R., Yates S.P., Marquez V.E., Schwan A.L., Boesen Т., and Andersen G.R. Exotoxin A-eEF2 complex structure indicates ADP ribosylation by ribosome mimicry // Nature, 2005. 436(7053): p. 979-984.

86. Kashef N., Behzadian-Nejad Q., Najar-Peerayeh S., Mousavi-Hosseini K., Moazzeni M., and Djavid G.E. Synthesis and characterization of Pseudomonas aeruginosa alginate-tetanus toxoid conjugate // J Med Microbiol, 2006. 55(Pt 10): p. 1441-1446.

87. Kielhofner M., Atmar R.L., Hamill R.J., and Musher D.M. Life-threatening Pseudomonas aeruginosa infections in patients with human immunodeficiency virus infection // Clin Infect Dis, 1992. 14(2): p. 403411.

88. Kim D.K., Kim J.J., Kim J.H., Woo Y.M., Kim S., Yoon D.W., Choi

89. C.S., Kim I., Park W.J., Lee N., Jung S.B., Ahn B.Y., Nam S.W., Yoon S.M., and Choi W.J. Comparison of two immunization schedules for a Pseudomonas aeruginosa outer membrane proteins vaccine in burn patients//Vaccine, 2000. 19(9-10): p. 1274-1283.

90. Klinman D.M., Currie D., Gursel I., and Verthelyi D. Use of CpG oligodeoxynucleotides as immune adjuvants //Immunol Rev, 2004. 199: p. 201-216.

91. Knapp В., Hundt E., Lenz U., Hungerer K.D., Gabelsberger J., Domdey H., Mansouri E., Li Y., and von Specht B.U. A recombinant hybrid outer membrane protein for vaccination against Pseudomonas aeruginosa // Vaccine, 1999. 17(13-14): p. 1663-1666.

92. Komatsu N., Oda Т., and Muramatsu T. Involvement of both caspase-like proteases and serine proteases in apoptotic cell death induced by ricin, modeccin, diphtheria toxin, and pseudomonas toxin //J Biochem, 1998. 124(5): p. 1038-1044.

93. Kounnas M.Z., Morris R.E., Thompson M.R., FitzGerald D.J., Strickland

94. D.K., and Saelinger C.B. The alpha 2-macroglobulin receptor/low density lipoprotein receptor-related protein binds and internalizes Pseudomonas exotoxin A//J Biol Chem, 1992. 267(18): p. 12420-12423.

95. Kreitman R.J. and Pastan I. Importance of the glutamate residue of KDEL in increasing the cytotoxicity of Pseudomonas exotoxin derivatives andfor increased binding to the KDEL receptor//Biochem J, 1995. 307 ( Pt 1): p. 29-37.

96. Kus J.V., Tullis E., Cvitkovitch D.G., and Burrows L.L. Significant differences in type IV pilin allele distribution among Pseudomonas aeruginosa isolates from cystic fibrosis (CF) versus non-CF patients // Microbiology, 2004. 150(Pt 5): p. 1315-1326.

97. Laing R.B. Nosocomial infections in patients with HIV disease // J Hosp Infect, 1999. 43(3): p. 179-185.

98. Lang A.B., Horn M.P., Imboden M.A., and Zuercher A.W. Prophylaxis and therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis and immunocompromised patients//Vaccine, 2004. 22 Suppl 1: p. S44-48.

99. Langford D.T. and Hiller J. Prospective, controlled study of a polyvalent pseudomonas vaccine in cystic fibrosis—three year results // Arch Dis Child, 1984. 59(12): p. 1131-1134.

100. Lechtzin N., John M., Irizarry R., Merlo C., Diette G.B., and Boyle M.P. Outcomes of adults with cystic fibrosis infected with antibiotic-resistant Pseudomonas aeruginosa//Respiration, 2006. 73(1): p. 27-33.

101. Lee J., Boyapati G., Song K., Rhee S., and Kim C. Cloning and sequence analysis of the estA gene encoding enzyme for producing (R)-beta-acetylmercaptoisobutyric acid from Pseudomonas aeruginosa 1001 //J Biosci Bioeng, 2000. 90(6): p. 684-687.

102. Liu P.V. Exotoxins of Pseudomonas aeruginosa. I. Factors that influence the production of exotoxin A//J Infect Dis, 1973. 128(4): p. 506-513.

103. Liu P.V. Extracellular toxins of Pseudomonas aeruginosa //J Infect Dis, 1974. 130 Suppl(O): p. S94-99.

104. Liu P.V., Yoshii S., and Hsieh H. Exotoxins of Pseudomonas aeruginosa. II. Concentration, purification, and characterization of exotoxin A // J Infect Dis, 1973. 128(4): p. 514-519.

105. Lombardi D., Soldati Т., Riederer M.A., Goda Y., Zerial M., and Pfeffer S.R. Rab9 functions in transport between late endosomes and the trans Golgi network //EMBO J, 1993. 12(2): p. 677-682.

106. Lukac M., Pier G.B., and Collier R.J. Toxoid of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A generated by deletion of an active-site residue // Infect Immun, 1988. 56(12): p. 3095-3098.

107. Maschmeyer G. and Braveny I. Review of the incidence and prognosis of Pseudomonas aeruginosa infections in cancer patients in the 1990s //Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2000. 19(12): p. 915-925.

108. Matsumoto Т., Tateda K., Miyazaki S., Furuya N., Ohno A., Ishii Y., Hirakata Y., and Yamaguchi K. Effect of antiflagellar human monoclonal antibody on gut-derived Pseudomonas aeruginosa sepsis in mice // Clin Diagn Lab Immunol, 1999. 6(4): p. 537-541.

109. McCallum S.J., Gallagher M.J., Corkill J.E., Hart C.A., Ledson M.J., and Walshaw M.J. Spread of an epidemic Pseudomonas aeruginosa strain from a patient with cystic fibrosis (CF) to non-CF relatives // Thorax, 2002. 57(6): p. 559-560.

110. McKee M.L. and FitzGerald D.J. Reduction of furin-nicked Pseudomonas exotoxin A: an unfolding story //Biochemistry, 1999. 38(50): p. 1650716513.

111. Miesenbock G. and Rothman J.E. The capacity to retrieve escaped ER proteins extends to the trans-most cisterna of the Golgi stack // J Cell Biol, 1995. 129(2): p. 309-319.

112. Mrsny R.J., Daugherty A.L., McKee M.L., and FitzGerald D.J. Bacterial toxins as tools for mucosal vaccination//Drug Discov Today, 2002. 7(4): p. 247-258.

113. Mutharia L.M., Nicas T.I., and Hancock R.E. Outer membrane proteins of Pseudomonas aeruginosa serotype strains //J Infect Dis, 1982. 146(6): p. 770-779.

114. Nakayama K. Furin: a mammalian subtilisin/Kex2p-like endoprotease involved in processing of a wide variety of precursor proteins // Biochem J, 1997. 327 ( Pt 3): p. 625-635.

115. Neely A.N., Holder I.A., Wiener-Kronish J.P., and Sawa T. Passive anti-PcrV treatment protects burned mice against Pseudomonas aeruginosa challenge//Burns, 2005. 31(2): p. 153-158.

116. Ogata M., Fryling C.M., Pastan I., and FitzGerald D.J. Cell-mediated cleavage of Pseudomonas exotoxin between Arg279 and Gly280 generates the enzymatically active fragment which translocates to the cytosol//J Biol Chem, 1992. 267(35): p. 25396-25401.

117. Ortiz P.A. and Kinzy T.G. Dominant-negative mutant phenotypes and the regulation of translation elongation factor 2 levels in yeast // Nucleic Acids Res, 2005. 33(18): p. 5740-5748.

118. Parad R.B., Gerard C.J., Zurakowski D., Nichols D.P., and Pier G.B. Pulmonary outcome in cystic fibrosis is influenced primarily by mucoid

119. Pseudomonas aeruginosa infection and immune status and only modestly by genotype //Infect Immun, 1999. 67(9): p. 4744-4750.

120. Pastan I. Immunotoxins containing Pseudomonas exotoxin A: a short history//Cancer Immunol Immunother, 2003. 52(5): p. 338-341.

121. Pedersen S.S., Koch C., Hoiby N., and Rosendal K. An epidemic spread of multiresistant Pseudomonas aeruginosa in a cystic fibrosis centre // J Antimicrob Chemother, 1986. 17(4): p. 505-516.

122. Pelham H.R., Roberts L.M., and Lord J.M. Toxin entry: how reversible is the secretory pathway? //Trends Cell Biol, 1992. 2(7): p. 183-185.

123. Pennington J.E., Reynolds H.Y., Wood R.E., Robinson R.A., and Levine A.S. Use of a Pseudomonas Aeruginosa vaccine in pateints with acute leukemia and cystic fibrosis //Am J Med, 1975. 58(5): p. 629-636.

124. Pennington J.E., Small G.J., Lostrom M.E., and Pier G.B. Polyclonal and monoclonal antibody therapy for experimental Pseudomonas aeruginosa pneumonia//Infect Immun, 1986. 54(1): p. 239-244.

125. Pier G.B. Promises and pitfalls of Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide as a vaccine antigen //Carbohydr Res, 2003. 338(23): p. 2549-2556.

126. Pinna A., Usai D., Sechi L.A., Zanetti S., Jesudasan N.C., Thomas P.A., and Kaliamurthy J. An Outbreak of Post-Cataract Surgery

127. Endophthalmitis Caused by Pseudomonas aeruginosa // Ophthalmology, 2009.

128. Polk H.C., Jr., Borden S., and Aldrete J.A. Prevention of pseudomonas respiratory infection in a surgical intensive care unit // Ann Surg, 1973. 177(5): p. 607-615.

129. Pollack M., Taylor N.S., and Callahan L.T., 3rd Exotoxin production by clinical isolates of pseudomonas aeruginosa//Infect Immun, 1977. 15(3): p. 776-780.

130. Priebe G.P., Meluleni G.J., Coleman F.T., Goldberg J.B., and Pier G.B. Protection against fatal Pseudomonas aeruginosa pneumonia in mice after nasal immunization with a live, attenuated aroA deletion mutant // Infect Immun, 2003. 71(3): p. 1453-1461.

131. Prince A. Flagellar activation of epithelial signaling // Am J Respir Cell Mol Biol, 2006. 34(5): p. 548-551.

132. Proud C.G. Peptide-chain elongation in eukaryotes //Mol Biol Rep, 1994. 19(3): p. 161-170.

133. Ramphal R., Guay C., and Pier G.B. Pseudomonas aeruginosa adhesins for tracheobronchial mucin//Infect Immun, 1987. 55(3): p. 600-603.

134. Ratjen F., Doring G., and Nikolaizik W.H. Effect of inhaled tobramycin on early Pseudomonas aeruginosa colonisation in patients with cystic fibrosis//Lancet, 2001. 358(9286): p. 983-984.

135. Ratjen F.A. Cystic fibrosis: pathogenesis and future treatment strategies // Respir Care, 2009. 54(5): p. 595-605.

136. Robinson H.L. and Torres C.A. DNA vaccines // Semin Immunol, 1997. 9(5): p. 271-283.

137. Rodeberg D.A., Bass R.C., Alexander J.W., Warden G.D., and Babcock G.F. Neutrophils from burn patients are unable to increase the expression of CD lib/CD 18 in response to inflammatory stimuli // J Leukoc Biol, 1997. 61(5): p. 575-582.

138. Rowe S.M., Miller S., and Sorscher E.J. Cystic fibrosis //N Engl J Med, 2005. 352(19): p. 1992-2001.

139. Rudner X.L., Hazlett L.D., and Berk R.S. Systemic and topical protection studies using Pseudomonas aeruginosa flagella in an ocular model of infection//Curr Eye Res, 1992. 11(8): p. 727-738.

140. Sawa Т., Yahr T.L., Ohara M., Kurahashi K., Gropper M.A., Wiener-Kronish J.P., and Frank D.W. Active and passive immunization with the Pseudomonas V antigen protects against type III intoxication and lung injury//Nat Med, 1999. 5(4): p. 392-398.

141. Schaad U.B., Lang A.B., Wedgwood J., Ruedeberg A., Que J.U., Furer E., and Cryz S.J., Jr. Safety and immunogenicity of Pseudomonas aeruginosa conjugate A vaccine in cystic fibrosis // Lancet, 1991. 338(8777): p. 1236-1237.

142. Schmitt C.K., Meysick K.C., and O'Brien A.D. Bacterial toxins: friends or foes? //Emerg Infect Dis, 1999. 5(2): p. 224-234.

143. Siegall C.B., Chaudhary V.K., FitzGerald D.J., and Pastan I. Functional analysis of domains II, lb, and III of Pseudomonas exotoxin // J Biol Chem, 1989. 264(24): p. 14256-14261.

144. Skjak-Braek G., Grasdalen H., and Larsen B. Monomer sequence and acetylation pattern in some bacterial alginates // Carbohydr Res, 1986. 154: p. 239-250.

145. Smith D.C., Spooner R.A., Watson P.D., Murray J.L., Hodge T.W., Amessou M., Johannes L., Lord J.M., and Roberts L.M. Internalized Pseudomonas exotoxin A can exploit multiple pathways to reach the endoplasmic reticulum//Traffic, 2006. 7(4): p. 379-393.

146. Spangenberg C., Heuer Т., Burger C., and Tummler B. Genetic diversity of flagellins of Pseudomonas aeruginosa//FEB S Lett, 1996. 396(2-3): p. 213-217.

147. Staczek J., Gilleland L.B., van der Heyde H.C., and Gilleland H.E. DNA vaccines against chronic lung infections by Pseudomonas aeruginosa // FEMS Immunol Med Microbiol, 2003. 37(2-3): p. 147-153.

148. Steinstraesser L., Oezdogan Y., Wang S.C., and Steinau H.U. Host defense peptides in burns//Burns, 2004. 30(7): p. 619-627.

149. Stocker B.A. Auxotrophic Salmonella typhi as live vaccine // Vaccine, 1988. 6(2): p. 141-145.

150. Strateva T. and Yordanov D. Pseudomonas aeruginosa a phenomenon of bacterial resistance //J Med Microbiol, 2009. 58(Pt 9): p. 1133-1148.

151. Taccetti G., Campana S., Festini F., Mascherini M., and Doring G. Early eradication therapy against Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis patients//Eur Respir J, 2005. 26(3): p. 458-461.

152. Taccetti G., Repetto Т., Procopio E., Farina S., and Campana S. Early Pseudomonas aeruginosa colonisation in cystic fibrosis patients // Lancet, 2002. 359(9306): p. 625-626.

153. Tart A.H., Blanks M.J., and Wozniak D.J. The AlgT-dependent transcriptional regulator AmrZ (AlgZ) inhibits flagellum biosynthesis in mucoid, nonmotile Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates // J Bacteriol, 2006. 188(18): p. 6483-6489.

154. TheQIAexpressionist. A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins //june 2003.

155. Theuer C., Kasturi S., and Pastan I. Domain II of Pseudomonas exotoxin A arrests the transfer of translocating nascent chains into mammalian microsomes//Biochemistry, 1994. 33(19): p. 5894-5900.

156. Thomas L.D., Kyd J.M., Bastin D.A., Dunkley M.L., and Cripps A.W. Immunisation with non-integral OMPs promotes pulmonary clearance of Pseudomonas aeruginosa//FEMS Immunol Med Microbiol, 2003. 37(2-3): p. 155-160.

157. Tsen S.W., Paik A.H., Hung C.F., and Wu T.C. Enhancing DNA vaccine potency by modifying the properties of antigen-presenting cells // Expert Rev Vaccines, 2007. 6(2): p. 227-239.

158. White J., Johannes L., Mallard F., Girod A., Grill S., Reinsch S., Keller P., Tzschaschel В., Echard A., Goud В., and Stelzer E.H. Rab6 coordinates a novel Golgi to ER retrograde transport pathway in live cells //J Cell Biol, 1999. 147(4): p. 743-760.

159. Wiesemann H.G., Steinkamp G., Ratjen F., Bauernfeind A., Przyklenk В., Doring G., and von der Hardt H. Placebo-controlled, double-blind, randomized study of aerosolized tobramycin for early treatment of

160. Pseudomonas aeruginosa colonization in cystic fibrosis // Pediatr Pulmonol, 1998. 25(2): p. 88-92.

161. Wilson D.W., Lewis M.J., and Pelham H.R. pH-dependent binding of KDEL to its receptor in vitro //J Biol Chem, 1993. 268(10): p. 74657468.

162. Wolf P. and Elsasser-Beile U. Pseudomonas exotoxin A: from virulence factor to anti-cancer agent // Int J Med Microbiol, 2009. 299(3): p. 161176.

163. Yates S.P. and Merrill A.R. Elucidation of eukaryotic elongation factor-2 contact sites within the catalytic domain of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A//Biochem J, 2004. 379(Pt 3): p. 563-572.

164. Young L.S., Meyer R.D., and Armstrong D. Pseudomonas aeruginosa vaccine in cancer patients //Ann Intern Med, 1973. 79(4): p. 518-527.

165. Zaidi T.S., Priebe G.P., and Pier G.B. A live-attenuated Pseudomonas aeruginosa vaccine elicits outer membrane protein-specific active and passive protection against corneal infection // Infect Immun, 2006. 74(2): p. 975-983.

Информация о работе

Исаков, Михаил Андреевич
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Получение рекомбинантных атоксичных форм экзотоксина A Pseudomonas aeruginosa и изучение их иммунобиологических свойств - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Получение рекомбинантных атоксичных форм экзотоксина A Pseudomonas aeruginosa и изучение их иммунобиологических свойств - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы