Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение рекомбинантных белков OprL и OprI наружной мембраны Pseudomonas aeruginosa и исследование их иммунобиологических свойств

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение рекомбинантных белков OprL и OprI наружной мембраны Pseudomonas aeruginosa и исследование их иммунобиологических свойств"

□034842Э7

И091127145559

икд

5013 Информационная карта диссертации

04 Кандидатская

05 Докторская

СУ) (Г'"у

54Т8'Исходящий номер, дата 5715 Язык диссертации 5436 Инвентарный номер

НЧ/12 27.11.2009 русский

5409 Дата защиты 6444 Шифр научной специальности 7425 На соискание степени

2009.11.26 03.00.07 канд. биол. наук

2061 Представлено к зашите: 61 Рукопись, в т.ч. научный доклад 52>Монография 43 Учебник 6147 Фамилия, имя, отчество соискателя

Гатыпова Екатерина Викторовна

Фамилия, инициалы

Ученая степень

Шифр научной специальности

6156 Научные руководители 6255 6453

1 Михайлова H.A. д-р мед. наук 03.00.07

2 Калошин A.A. канд. биол. наук 03.00.03

6165 Официальные оппоненты 4662 4626

1 Грубер И.М. д-р мед. наук 03.00.07

2 Лунин В.Г. j 4 канд. биол. наук 03.00.03

5733 Кол-во томов 1 Номер тома 1 2 3 5751 Приложений 0 5778 Таблиц 6

5742 Кол-во стр. 117 Кол-во стр. 117 0 0 5787 Источников 156 5760 Иллюстраций 19

Сведения об организации, в совете которой проходила защита

2457 Код ОКПО 2934 Телефон 2394 Телефакс 2754 Город

01897564

917-49-00

9174900

1332 Сокращенное название министерства (ведомства)

Москва

7452 Шифр совета

РАМН

Д 001.035.0!

2151 Полное наименование организации

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им.

И.И.Мечникова РАМН

2358 Сокращенное название организации 2403 Код ВНТИЦ

НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН 0102440780320

2655 Адрес организации (индекс, республика, область, город, улица, дом)

105064, Москва, Малый Казенный пер., 5а

Сведения об организации, в которой работает соискатель

2988 Телефон 3087 Телефакс 2781 Город

917-49-00

9174900

Москва

Ь

PO/J

2187 Наименование организации

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им.

И.И.Мечникова РАМН

2385 Сокращенное наименование организации 2682 Адрес организации (индекс, республика, область, город, улица, дом)

НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН

105064, Москва, Малый Казенный пер., 5а

003484297

9045 Наименование диссертации

Получение рекомбинантных белков OprL и OprI наружной мембраны Pseudomonas aeruginosa и исследование их иммунобиологических свойств

tt

9117 Реферат

Цель работы: получение рекомбинантных белков OprL и OprI наружной мембраны Pseudomonas aeruginosa и изучение их иммунобиологических свойств. Методы исследования: микробиологические, иммунохимические, генно-инженерные. Теоретические и практические результаты и их новизна: впервые в России сконструированы штаммы-продуценты E.coli рекомбинантных белков наружной мембраны Р. aeruginosa OprL и OprI. По результатам иммуноблоттинга и иммуноферментного анализа установлена специфичность очищенных рекомбинантных белков OprL и OprI при взаимодействии с иммунной кроличьей сывороткой против P. aeruginosa. Выявлены иммуногенные свойства полученных рекомбинантных белков. На модели синегнойной инфекции установлен протективный эффект белка OprL (индекс эффективности 3,0). В результате проведенных исследований получены кроличьи иммунные сыворотки к рекомбинантным белкам OprL и OprI и определены их антибактериальная активность и превентивные свойства. В зависимости от посевной дозы культуры P. aeruginosa подавление роста in vivo иммунными сыворотками к белку OprL составляло 66-87%, а иммунными сыворотками к белку OprI - 61-74,5%. Превышение защитных эффектов при введении иммунных сывороток, по сравнению с сыворотками интактных кроликов, составляло более чем в два раза. Область применения: материалы настоящего исследования свидетельствуют о перспективности использования рекомбинантных белков OprL и OprI для создания вакцины предназначенной для иммунотерапии и иммунопрофилактики синегнойной инфекции.

5436

М £

„ ч„. НАУК НА%

N.^, V4 ..uiii .■ fa ¿fa

Фамилия, инициалы Должность Уч. степенщ Одтщь МП

Руководитель организации 6111 ЗверевВ.В. 6311 Директор 6210 д-р | N®sr>S—у<

Руководитель диссертационного совета 6264 Зверев В.В. 6320 Директор 6462 д-р «т,^ 3 * > о J у? Vß

5634 Индексы УДК 7434 Дата 7506 Входящий номер

579.25

И091127145559

5616 Коды тематических рубрик

34.27.21 • 34.15.27 • 34.23.31 •

5643 Ключевое слово

рекомбинантный белок OprL рекомоинантный оелок upri Pseudomonas aeruginosa протективность

иммуногенность

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гатыпова, Екатерина Викторовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Синегнойная инфекция.

1.2. Поверхностные антигены синегнойной палочки.

1.3. Перспективы создания генно-инженерных вакцин против P. aeruginosa на основе белков наружной мембраны.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Использованные штаммы.

2.1.2. Исследуемые белки и сыворотки.

2.1.3. Экспериментальные животные.

2.2. Методы.

2.2.1. Культивирование штаммов P. aeruginosa.

2.2.2. Выделение геномной ДНК из P. aeruginosa.

2.2.3. ПЦР.

2.2.4. Рестрикция ДНК и выделение ДНК из агарозного геля.

2.2.5. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле.

2.2.6. Лигирование.

2.2.7. Приготовление компетентных клеток.

2.2.8. Трансформация компетентных клеток.

2.2.9. Выделение плазмидной ДНК.

2.2.10. Определение нуклеотидных последовательностей ДНК.

2.2.11. Экспрессия генов рекомбинантных белков.

2.2.12. Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) по

Лэммли.

2.2.13. Хроматографическая очистка рекомбинантных белков.

2.2.14. Иммуноблоттинг.

2.2.15. Приготовление лизата E.coli.

2.2.16. Иммуноферментный анализ (ИФА).

2.2.17. Приготовление препаратов для иммунизации.

2.2.18. Заражение животных культурой P. aeruginosa.

2.2.19. Получение иммунных сывороток.

2.2.20. Изучение антибактериальных свойств иммунных сывороток.

2.2.21. Статистические методы.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ OprL и OprI НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ P. AERUGINOSA.

3.1. Клонирование нуклеотидных последовательностей, кодирующих белки OprL и OprI.

3.2. Синтез, очистка и оценка специфичности рекомбинантных белков OprL и OprI.

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ OprL и OprI.

4.1. Изучение имуногенных свойств рекомбинантных белков OprL и OprI в сравнении с OprF.

4.2. Изучение протективных свойств рекомбинантного белка OprL в сравнении с белком OprF на экспериментальной модели синегнойной инфекции.

4.3. Изучение антибактериальных свойств мышиных сывороток к рекомбинантным белкам ОргЬ и ОргБ.

ГЛАВА 5. ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КРОЛИЧЬИХ СЫВОРОТОК К РЕКОМБИНАНТНЫМ БЕЛКАМ ОргЬ, Орг1 и ОргБ.

5.1. Получение кроличьих сывороток к рекомбинантным белкам ОргЬ, Орг1 и ОргБ.

5.2. Изучение антибактериальных свойств и оценка специфичности иммунных кроличьих сывороток.

5.3. Исследование превентивных свойств иммунных кроличьих сывороток к рекомбинантным белкам ОргЬ и ОргБ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение рекомбинантных белков OprL и OprI наружной мембраны Pseudomonas aeruginosa и исследование их иммунобиологических свойств"

Несмотря на достигнутые успехи в антибактериальной терапии гнойно-воспалительных заболеваний человека, синегнойная палочка занимает одно из лидирующих мест среди возбудителей, вызывающих нозокомиальные инфекции в условиях стационаров различного профиля. P. aeruginosa, как правило, является этиологическим агентом гнойно-септических осложнений, возникающих после ожоговых поражений, хирургических вмешательств, онкологических процессов, родов и других состояний, сопровождающихся снижением иммунного статуса организма [19].

Практически все штаммы синегнойной палочки резистентны к большинству применяемых в клинике антибиотиков и химиотерапевтических средств [30]. Это обстоятельство обусловливает актуальность разработки препаратов для иммунопрофилактики и иммунотерапии заболеваний, вызываемых этим микробом. j

Известно, что при инфицировании первичный иммунный ответ формируется на поверхностные антигены бактериальной клетки [35]. Поэтому изучение белковых компонентов наружной мембраны P. aeruginosa привлекало внимание многих исследователей. Установлено, что в клеточной стенке P. aeruginosa локализованы белки с молекулярной массой от 9 до 55 кДа, среди которых иммунологически активными являются преимущественно белки наружной мембраны (outer membrane protein - Opr) F, H, L (H2) и I [15, 81, 110].

Особый интерес по данным литературы представляет пориновый белок F (OprF) с молекулярной массой около 38 кДа, присутствие которого выявлено в клеточной стенке у представителей P. aeruginosa различных серотипов [13, 82]. Большинство возбудителей, относящихся к группе условно-патогенных, и в том числе синегнойная палочка, серологически неоднородны. Это обстоятельство на протяжении многих лет является главным препятствием для создания эффективных вакцин. Выделение, изучение и доказательство консервативности порообразующих поверхностных белков синегнойной палочки открыли перспективность создания вакцин на их основе.

Липопротеины также являются важной составной частью наружной мембраны грамотрицательных бактерий, обеспечивая целостность клетки. У синегнойной палочки выявлено два основных липопротеина, обладающие иммуногенными свойствами - белки наружной мембраны L и I (OprL и OprI), имеющие молекулярную массу около 19 и 10 кДа, соответственно [81].

В настоящее время накоплен опыт использования мембранных белков в качестве вакцинных препаратов. На их основе в НИИ вакцин и сывороток им. Мечникова разработана субъединичная псевдомонас-вакцина, обладающая протективными свойствами [14]. Основу данной вакцины, полученной классическими методами, составляли мембранные белки P. aeruginosa, максимально освобожденные от токсичных липополисахаридных комплексов. Позднее в Корее на ожоговых больных успешно испытана вакцина, полученная из очищенных белков наружной мембраны [89]. Поскольку белки наружной мембраны в бактериальной клетке содержатся в незначительном количестве, получение вакцин на их основе традиционными биотехнологическими приемами - дорогостоящий и трудоемкий процесс.

В настоящее время активно ведутся работы по созданию препаратов нового поколения с использованием генно-инженерных технологий. Расшифрованный геном синегнойной палочки [141] и накопившаяся информация об иммуногенной активности определенных поверхностных белков открывают перспективу подобных исследований. К настоящему моменту получены данные об успешном использовании препаратов, созданных на основе рекомбинантных белков, включающих аминокислотные последовательности белков OprF и OprI. Так, в Германии проведены клинические исследования на ожоговых больных рекомбинантного белка, включающего С-концевой фрагмент OprF (190-342 аминокислотные остатки) и OprI (21-83 аминокислотные остатки). Синтез данного гибридного белка происходил в клетках Е. coli, которые несли плазмидную конструкцию со встроенным рекомбинантным геном с регуляторными участками для его экспрессии [55]. Выявлена безопасность и отсутствие реактогенности полученного препарата при испытании на добровольцах [109]. На основе генов oprF и oprl ведутся разработки ДНК-вакцин на базе плазмидных векторов [131] и с использованием аденовирусов [154].

В НИИ вакцин и сывороток им. Мечникова РАМН клонирован в Е. coli ген OprF P. aeruginosa, получен и охарактеризован продуцент соответствующего рекомбинантного белка. Доказана высокая специфичность синтезируемого продукта, а также возможность его получения в очищенном виде с помощью ионно-афинной хроматографии на Ni-агарозе. Отработан метод детекции специфических антител, образующихся в организме иммунизированных животных. При исследовании полученного рекомбинантного белка OprF и иммунных кроличьих сывороток к нему выявлено, что они способны защищать мышей от экспериментальной синегнойной инфекции [9].

Однако, учитывая наличие ряда мембранных белков у P. aeruginosa, в частности OprL и Oprl, а также возможности генно-инженерных методов для получения последних в количествах, достаточных для биологического тестирования, представляется актуальным исследование их роли в формировании специфической защиты от синегнойной инфекции.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель работы - получение рекомбинантных белков наружной мембраны OprL и Oprl P. aeruginosa и изучение их иммунобиологических свойств.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Сконструировать бактериальные (Е. coli) продуценты рекомбинантных белков OprL и OprI P. aeruginosa.

2. Получить очищенные рекомбинантные белки OprL и OprI P. aeruginosa и определить их специфичность.

3. Провести сравнительное изучение иммуногенных свойств полученных белковых препаратов и поринового рекомбинантного белка OprF на экспериментальных животных.

4. Получить иммунные сыворотки к рекомбинантным белкам OprL, OprF и OprI P. aeruginosa и оценить их иммунобиологические свойства.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

С использованием генно-инженерных технологий сконструированы бактериальные (.Е. coli) продуценты рекомбинантных белков L и I наружной мембраны Р. aeruginosa.

Получены очищенные рекомбинантные белки OprL и OprI P. aeruginosa, установлена их специфичность и роль в формировании защиты за счет стимулирования у иммунизированных животных выработки специфических антител и усиления антибактериальной активности полученных сывороток.

Рекомбинантный белок OprL обладал протективными свойствами, сопоставимыми со свойствами поринового белка OprF. Выявлены превентивные свойства иммунных кроличьих сывороток к рекомбинантному белку OprL.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Сконструированные штаммы-продуценты Е. coli могут быть использованы при получении рекомбинантных белков OprL и OprI P. aeruginosa.

Данные об иммуногенных свойствах свидетельствуют о перспективности использования рекомбинантных белков OprF, OprL и OprI для создания химерной вакцины, предназначенной для профилактики синегнойной инфекции.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Сконструированы рекомбинантные штаммы-продуценты Е. coli pQE-30/oprL и pQE-30/oprI, определены методы получения и очистки рекомбинантных белков для биологического тестирования.

2. Полученные очищенные рекомбинантные белки OprL (19,2 кДа) и OprI (10,1 кДа) высокоспецифичны и иммуногенны, а белок OprL обладает протективными свойствами.

3. Антисыворотки к рекомбинантным белкам OprL и OprI обладают специфическими антибактериальными свойствами; а сыворотки к рекомбинантному белку OprL способны защищать животных от экспериментальной синегнойной инфекции. и

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Гатыпова, Екатерина Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Сконструированы штаммы-продуценты Е. coli рекомбинантных белков наружной мембраны P. aeruginosapQE-30/oprL иpQE-30/oprI.

2. Установлена специфичность полученных рекомбинантных белков OprL и OprI наружной мембраны P. aeruginosa по результатам иммуноблотинга и иммуноферментного анализа.

3. Выявлены иммуногенные свойства рекомбинантных белков OprL и OprI P. aeruginosa, характеризующиеся накоплением специфических антител в сыворотках животных. При двукратной иммунизации белком OprL в дозе 50 мкг титр достигал значения 1:100000 и при трехкратной иммунизации белком OprI в дозе 100 мкг - 1:50000.

4. На модели синегнойной инфекции установлен протективный эффект белка OprL (индекс эффективности 3,0), сравнимый с таковым у белка OprF (индекс эффективности 3,2).

5. Определена антибактериальная активность полученных кроличьих иммунных сывороток к рекомбинантным белкам OprL и OprI. Процент подавления роста культуры P. aeruginosa иммунными сыворотками к белку OprL составил 66 % при использовании посевной дозы культуры 105 КОЕ/мл и 87 % - при 104 КОЕ/мл, а к белку OprI - 61 % и 74,5 %, соответственно.

6. Выявлены превентивные свойства иммунных кроличьих сывороток к рекомбинантным белкам OprL (индекс эффективности 7,7) и OprF (индекс эффективности 6,0) при экспериментальной синегнойной инфекции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на достигнутые успехи антибактериальной терапии, в современном здравоохранении остро стоит проблема иммунопрофилактики и иммунотерапии нозокомиальных инфекций. В структуре возбудителей этих заболеваний P. aeruginosa занимает одну из лидирующих позиций. Синегнойная палочка, как правило, вызывает осложнения, возникающие после диагностических манипуляций, ожоговых поражений, хирургических вмешательств, родов, и других состояний, сопровождающихся снижением иммунного статуса больных [19].

Возбудитель широко распространен в окружающей среде, неприхотлив [3, 32], и практически все штаммы P. aeruginosa резистентны к большинству применяемых в клинике антибиотиков и химиотерапевтических средств [1, 5, 19, 26, 30, 34, 107]. Вышеперечисленные обстоятельства обусловливают интерес отечественных и зарубежных исследований к разработке эффективных препаратов для иммунопрофилактики и иммунотерапии заболеваний, вызываемых этим микробом.

В течение последних трех десятилетий активно велись разработки по созданию препаратов, обладающих протективными свойствами при инфекции, вызываемой синегнойной палочкой. Тем не менее, в настоящее время против данного возбудителя отсутствуют эффективные вакцины. [73]. Трудности создания эффективных иммунопрепаратов против P. aeruginosa заключаются в том, что патогенез заболевания обусловлен воздействием целого ряда факторов патогенности, среди которых выделить наиболее значимый представляется сложной задачей [32].

При инфицировании макроорганизма, когда происходит инвазия возбудителя, важную роль в инфекционном процессе играют поверхностные антигены бактериальной клетки [35]. Поэтому объектами настоящего исследования явились мембранные белки синегнойной палочки.

В клеточной стенке P. aeruginosa локализованы белки с молекулярной массой от 9 до 55 кДа, среди которых иммунологически активными являются преимущественно белки наружной мембраны (outer membrane protein — Opr) F, Н,Ь(Н2)и1 [13, 15,81, 110].

На основе этих белков Станиславским Е.С. с соавторами получена псевдомонас-вакцина, обладающая протективными свойствами [2, 48, 140]. В Корее на ожоговых больных успешно испытана вакцина, созданная из очищенных белков наружной мембраны [89, 101, 103]. Технология получения традиционных вакцин, включающая этапы культивирования производственных штаммов, выделения и очистки протективных субстанций, содержащихся в незначительных количествах в бактериальной клетке, и сопряженная с работой персонала с вирулентным материалом, представляет собой дорогостоящий и трудоемкий процесс.

В настоящее время активно ведутся исследования по разработке вакцинных препаратов против синегнойной инфекции генно-инженерными методами. Технология рекомбинантной ДНК позволяет получать в больших количествах ценные белковые макромолекулы, которые в естественных условиях синтезируются в небольших количествах [17].

В НИИВС им. Мечникова РАМН получен рекомбинантный белок OprF, ген которого был встроен в плазмидный вектор pQE-ЗО под контроль регуляторных участков для экспрессии в клетках Е. coli штамма Ml 5. Синтезированный рекомбинантный белок OprF был хроматографически очищен и доказана его специфичность и иммуногенность [5].

Однако, учитывая широкий спектр антигенных структур P. aeruginosa, представляется целесообразным исследование других мембранных белков (в частности OprL и OprI) для выяснения их роли в формировании специфической защиты от синегнойной инфекции. В связи с этим, целью нашего исследования явилось - получение рекомбинантных белков наружной мембраны OprL и OprI P. aeruginosa и изучение их иммунобиологических свойств.

Нуклеотидные последовательности, содержащие гены oprL и oprl, амплифицированы с помощью ПЦР на основе геномной ДНК P. aeruginosa, для получения которой использовали штамм РА 103, обладающий полным набором антигенных субстанций. Праймеры подбирали на основе информации о полноразмерной последовательности P. aeruginosa штамма РА 01, которая представлена в базе данных GenBank. В дальнейших исследованиях применялся нетоксигенный штамм РА 170015.

Основываясь на данных литературы о консервативности мембранных белков P. aeruginosa [81], использование разных штаммов при исследовании изучаемых белков представлялось нецелесообразным.

Полученные амплификаты анализировали методом электрофореза в агарозном геле. В результате были идентифицированы нуклеотидные последовательности, имеющие размеры около 0,5 (для OprL) и 0,25 kb (для Oprl), вычисленные при сравнении со стандартом молекулярных масс молекул ДНК (ДНК-маркеры GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus и GeneRuler 100 bp DNA Ladder).

Размеры синтезированных нуклеотидных последовательностей совпадали по молекулярной массе с генами изучаемых белков OprL и OprL При этом последовательность, кодирующая рекомбинантный белок OprL, включала 507 н.п., кодирующих 169 аминокислот и терминирующий ко дон ТАА, а размер гена Oprl - 252 н.п., кодирующих 84 аминокислоты и терминирующий кодон.

Ампплифицированные последовательности содержали на концах по 8 пар нуклеотидов, включающих сайты рестрикции. Эти нуклеотидные остатки были включены в состав праймеров для ПЦР. Таким образом, синтезированные последовательности фланкировались сайтами рестрикции ВатНI с 5' — конца и Hind III сУ — конца.

Введение этих сайтов рестрикции было необходимо для встраивания синтезированных нуклеотидных последовательностей в полилинкер плазмиды pQE-ЗО таким образом, чтобы они оказались под контролем модифицированного промотора бактериофага Т5. Он входил в состав плазмиды, а сайты рестрикции ВатН I и Hind III содержались в полилинкере плазмиды. В процессе генно-инженерных манипуляций последовательности генов oprL и oprl были встроены в плазмидные векторы, которые в свою очередь использовали для трансформации клеток Е. coli штамма M 15.

Первоначальный отбор клонов проводили с помощью рестрикционного анализа. В результате отобраны два рекомбинантных штамма Е. coli, содержащие конструкции pQE-30/oprL и pQE-30/oprI, у которых определяли встроенные нуклеотидные последовательности.

Данные секвенирования показали, что клонированные рекомбинантные гены совпадали с референс-последовательностями из базы данных GenBank (Accession Number АЕ004091). Произошедшие единичные замены нуклеотидов (две в случае гена белка OprL и одна в случае белка Oprl) в генах синтезированных рекомбинантных белков не повлияли на аминокислотный состав, поскольку изменившиеся триплеты кодировали те же аминокислоты.

При культивировании сконструированных генно-инженерных штаммов, в результате индуцированной экспрессии гена в бактериальном осадке синтезировались белковые продукты, размер которых, по данным электрофореза, соответствовал примерно 19 и 10 кДа, что совпадало с расчетными размерами: 19,2 кДа для белка OprL и 10,1 кДа для белка Oprl. Белковые продукты анализировали методом электрофореза по Лэммли в полиакриламидном геле с использованием белкового маркера в качестве стандарта молекулярного веса.

В созданной системе при культивировании с добавлением химического индуктора изопропил-Р-с1-тиогалактопиранозид (РШТГ), который добавляли в культуральную среду при достижении клетками фазы активного роста, специфично происходила гиперэкспрессия только рекомбинантного гена.

Экспрессия рекомбинантных белков находилась под контролем системы /ас-оперонов. При образовании комплекса РНК-полимеразы с промотором становится невозможной транскрипция рекомбинантной последовательности.

ИПТГ блокировал синтез белка-репрессора, последовательность которого закодирована в плазмиде pREP4 Е. coli штамма Ml5, и таким образом способствовал синтезу целевых рекомбинантных белков. Это доказано электрофоретическим анализом индуцированных и неиндуцированных продуцентов. После индукции экспрессии рекомбинантных генов белков OprL и OprI, выявлено наличие специфичных продуктов, которые отсутствовали в клетках тех же продуцентов, выращенных без добавления химического индуктора ИПТГ.

Важной особенностью полученных рекомбинантных белков являлось наличие на N-конце дополнительной гистидиновой последовательности, так называемого «гистидинового хвоста», который был необходим для последующей очистки получаемых продуктов на никель-активированном сорбенте (Ni-NTA-агарозе или Ni-NTA-сефарозе). Нуклеотидные последовательности «гистидинового хвоста» закодированы в плазмиде непосредственно перед полилинкером и позволяли получить очищенные белки в количествах, достаточных для изучения иммунобиологических свойств.

Рекомбинантные белковые продукты проявляли высокую специфичность в иммуноблоттинге при взаимодействии с иммунной кроличьей сывороткой против P. aeruginosa.

Антигенные свойства исследуемых белков изучены в сравнении с рекомбинантным белком OprF. В экспериментах использовали мышиную модель. Проведено 3 иммунизации животных различными дозами белков: 6,25, 12,5, 25, 50 и 100 мкг. В ответ на первую инъекцию не происходило накопления титров антител, что характерно для всех рекомбинантных белков,- Однако, после второй и третьей инъкций наблюдались выраженные иммунологические реакции. Показано, что белок OprL обладал антигенными свойствами сравнимыми с таковыми у белка OprF.

Белок OprI проявлял более низкие антигенные свойства, что возможно связано с его размером. Полученные результаты согласуются с данными литературы об использовании данного белка только в качестве дополнительного протективного компонента в слитом состоянии с другими антигенами синегнойной палочки [85, 108, 109, 150]. В связи с выявленной нестабильностью и низким выходом при очистке белка OprI изучение его протективных свойств не проводилось.

С целью сравнительного изучения протективных свойств рекомбинантных белков OprL и OprF животных иммунизировали двукратно с двухнедельным интервалом в дозах 6,25; 12,5; 25 и 50 мкг. Через две недели после последней инъекции мышам внутрибрюшинно вводили различные дозы живой вирулентной культуры P. aeruginosa: от 50 до 800 млн. живых микробных клеток (м/к). Контрольной группе (интактные мыши той же партии) вводили от 25 до 400 млн. м/к.

Индексы эффективности (ИЭ) защитных свойств рекомбинантного белка OprL для доз 6,25; 12,5; 25 и 50 мкг соответственно составили 2,0; 2,5; 3,0 и 2,7. ИЭ для белка OprF для доз 6,25; 12,5; 25 и 50 мкг соответствовали значениям: 1,6; 2,7; 3,2 и 2,5, соответственно. Полученные данные подтвердили сходство протективных свойств рекомбинантных белков OprL и OprF, а также определили эффективную дозу иммунизации, соответствующую 25 мкг.

С целью дополнительного подтверждения протективных свойств полученных белков были получены мышинные сыворотки к исследуемым белкам и изучена их антибактериальная активность. Установлено, что сыворотки, полученные после проведенной иммунизации мышей рекомбинантными белками в суммарной дозе 50 мкг, тормозили in vitro рост культуры P. aeruginosa: на 65 - 80 % при тестировании иммунных сывороток к рекомбинантному белку OprF и на 37 - 69 % при добавлении иммунных сывороток к рекомбинантному белку OprL. Сыворотка интактных животных той же партии, как и следовало ожидать, не обладала антибактериальной активностью.

Для дальнейшего исследования иммуногенности рекомбинантных белков получены сыворотки крови кроликов, иммунизированных белками OprL, OprF и OprL Титры специфических антител (по результатам ИФА) в исследованных образцах оказались сравнимыми с титрами антител, выявленных в сыворотках, полученных при иммунизации кроликов инактивированной культурой P. aeruginosa

Все полученные кроличьи сыворотки против рекомбинантных белков, были оценены по способности подавлять рост синегнойной палочки. Выявлено, что они специфично тормозили бактериальный рост, чего не наблюдалось при использовании сыворотки интактного кролика. Процент подавления роста иммунными сыворотками к белку OprL составил 66-87 %, к белку OprF - 6182 %, а к белку OprI - 61-74,5 %.

При исследовании превентивных свойств кроличьих сывороток к белкам OprL и OprF в опытах пассивной защиты мышей выявлены достоверные различия в величине ЛД50 заражающего штамма синегнойной палочки для опытных и контрольных животных. Результаты свидетельствовали о повышении устойчивости мышей к инфекции: индексы эффективности иммунных кроличьих сывороток по сравнению с пулом интактных сывороток составили: в случае OprL - 7,7; для OprF - 6,0 и 3,5 для неиммуной сыворотки.

Таким образом, в результате проведенных исследований получены очищенные рекомбинантные мембранные белки OprL и OprI P. aeruginosa и доказаны их иммуногенные свойства.

98

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гатыпова, Екатерина Викторовна, Москва

1. Ахметова Л.И., Бейкин Я.Б., Розанова С.М., Руднов В А. Резистентность возбудителей внутригоспитальных инфекций // Материалы IV Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Москва. — 1996. -С. 11.

2. Бандман O.A., Едвабная JI.C., Булк В.Ф. и др. Бесклеточная вакцина псевдомонас: иммунохимическая характеристика и иммуногенность // Журн. микробиол. 1987. - № 11. - С. 44-47.

3. Беляков В.Д., Ряпис JI.A., Илюхин В.И. Псевдомонады и псевдомонозы. М.: Медицина, 1990. 223 с.

4. Грязнова Н. С, Субботина« Н. А. Антибиотики и химиотерапия. М.: Медицина, 1989. С. 50-53.

5. Едвабная JI.C., Зайднер И.Г., Макаренко Т.А. и др. Белковые протективные антигены P. aeruginosa II Журн. микробиол. — 1985. — № 11. — С. 18-23.

6. Илюхин В.И. Псевдомонадные инфекции в патологии человека // Журн. микробиол. 1985. - № 2. - С. 110-114.

7. Исхакова Х.И. Синегнойная палочка и другие, грамотрицательные условно патогенные бактерии как возбудители госпитальных инфекций: Автореф. дисс. докт. мед. наук. Москва, 1988. -30 с.

8. Калошин A.A. Злыгостев С.А., Торопчина Ю.Н., и др. Получение рекомбинантного белка F наружной мембраны (OprF) Pseudomonas^aeruginosa и изучение его антигенных свойств //Журн. микробиол. 2005. - № 5. - С. 50-53.

9. Котлукова T.B. Лечение синегнойной инфекции у взрослых и детей // Журн. фармацевтика. — 2005. №17. — С. 93.

10. Макаренко Т.А. Белковые протективные антигены Р. aeruginosa: Автореф. дисс. канд. биол. наук. Москва, 1993. - 24 с.

11. Макаренко Т.А., Балаян С.С., Сергиенко А.И. и др. Иммунологический ответ у доноров-добровольцев, иммунизированных вакциной псевдомонас // Журн. микробиол. 1991. -№ 11. - С. 39-41.

12. Макаренко Т.А., Станиславский Е.С. Иммунологическое изучение белков клеточной стенки Pseudomonas aeruginosa II Журн. микробиол. 1996. — № 2. - С. 7-9.

13. Маниатис Т., Френч Э., Сэмбрук Дж. Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. М.: Мир, 1984. - 220 с.

14. Медуницын Н.В. Вакцинология. М: Триада Фарм, 2004. - 446 с.

15. Нозокомиальные инфекции. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии // Под ред. Л.С. Страчунского, Ю.Б. Белоусова, С.Н. Козлова.- 2002. С. 103.

16. Остерман Л.Д. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М: Наука, 1981. 285 с.

17. Покровский В.И;, Семина H.A. Внутриболышчные инфекции' — проблемьг и пути решения // Эпидемиол. и инфекцион. болезни. 2000. — № 5. — С. 12-24.

18. Радкевич С.А., Мороз; А.Ф., Чантурия ЦК. и др. Иммунопрофилактика; инфекций, обусловленных Pseudomonas aeruginosa у обожженных // Тезисы докладов. «Современная госпитальная- инфекция». Л. -1980.-С. 103.

19. Розанова С.М. Р. aeruginosa как представитель госпитальной флоры // Успехи современного естествознания. 2003. - № 1 Г. - С. 85-86.

20. Розанова; С.М. Резистентность к антибактериальным препаратам грамотрицательной флоры палат интенсивной; терапии: Автореф; дисс. канд. биол. наук. Москва, 2004. С. 4.

21. Семина H.A., Ковалева E.H. Состояние эпидемиологического надзора за нозокомиальными инфекциями в России // Материалы международной конференции «Нозокомиальные инфекции в отделениях интенсивной терапии». Москва. - 1998. - С. 103.

22. Сидоренко C.B., Резван С.П., Стерхова Г.А., Грудинина С.А. Госпитальные инфекции, вызванные Pseudomonas aeruginosa. Распространение и клиническое значение антибиотикорезистентности // Антибиотики и химиотерапия. 1999. - Т. 44, №3. - С. 25-33.

23. Сидоренко C.B. Яковлев C.B. Инфекции в интенсивной терапии, М: Бионика, 2000. 71 с.

24. Синегнойная инфекция. Под ред. А.Ф. Мороз. М: Медицина, 1988.-386 с.

25. Соколовский В.Т., Семина H.A. Внутрибольничные инфекции — проблемы эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики // Тезисы докладов 2-й Российской Научно-практической конференции с международным участием 7-9 дек. 1999г. М, 1999. - С. 225.

26. Состояние резистентности к антиинфекционным химиопрепаратам в России // Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии под редакцией JI.C. Страчунского, Ю.Б. Белоусова, С.Н. Козлова. 2002 - С. 15.

27. Станиславский Е.С. Бактериальные структуры и их антигенность. М: Медицина, 1961. 186 с.

28. Станиславский Е.С., Лани Б., Книрель Ю.А. и др. Хемотипы Р. aeruginosa II Журн. микробиол. -1988. -№ 5. С. 10-14.

29. Станиславский Е.С., Joo I. Вакцины против Pseudomonas aeruginosa инфекции: итоги и перспективы исследований // Сборник трудов «Бактериальные антигены». Москва, - 1982. - С. 3-14.

30. Станиславский Е.С., Joo I. Иммунопрофилактика и иммунотерапия инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa: итоги и перспективы // Журн. микробиол. 1983. - №7. - С. 22-31.

31. Станиславский Е.С., Joo I., Северцова М.К. и др. Иммунологическая эффективность и безвредность в эксперименте пиоиммуногена вакцины против инфекции Pseudomonas aeruginosa II Журн. микробиол. - 1982. - №5. - С. 70-75.

32. Статистическая обработка результатов, медико-биологических исследований. Иванов Ю.И., Погорелюк О.Н. -М.: Медицина, 1990. 185 с.

33. Строганов В.П. Особенности эпидемиологии и микробиологии госпитальных инфекций // Материалы конференции «Consilium Medicum. Инфекции и антимикробная терапия». 2000. - Том 2, №3. - С. 45-69.

34. Супотницкий М.В. Порообразующие белки иммуногенные компоненты ветеринарных вакцин // Ветеринария. - 1995. - № 4. - С. 19-24.

35. Титова Т.И., Сидорова Т.Н., Радкевич С.А. и др. Получение и изучение свойств поливалентной корпускулярной синегнойной вакцины // Журн. микробиол. 1985. - №8. - С. 80-84.

36. Чекан JI.B., Станиславский Е.С., Палкина H.A. Бесклеточная вакцина № 3. // Журн. микробиол. 1983. - № 2. - С. 92-96.

37. Черноказинский A.A., Гусакова JI.B., Бачурин В.И. К профилактике гнойно-воспалительных инфекций в урологическом стационаре // Материалы конференции «Проблемы эпидемиологии, микробиологии и паразитологии». — Кишинев. 1987. - С. 71-72.

38. Шкарин В.В., Давыдова H.A., Ковалишина О.В. Эпидемиологический надзор за госпитальными гнойно-септическими инфекциями // Вестн. Российской АН. 2002. — №2. - С. 6-11.

39. Ющук Н.Д., Жогова М.А., Бушуева В.В., Колесова В.Н. Внутрибольничные инфекции. Эпидемиология. М: Медицина, 1993. С. 280295.

40. Яфаев Р.Х., Асланов Б.И. Некоторые вопросы борьбы с синегнойной инфекцией в условиях стационаров // Материалы 2-й Российской научно-практической конференции с международным участием

41. Внутрибольничные инфекции — проблемы эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики». Москва. - 1999. - С. 285.

42. Arnold Н., Bumann D., Felies М. et al. Enhanced immunogenicity in the murine airway mucosa with an attenuated Salmonella live vaccine expressing OprF — OprI from Pseudomonas aeruginosaII Infect. Immun. 2004. — № 72. — P. 6546 -6553.

43. Baumann U., E. Mansouri, B.-U. von Specht. Recombinant OprF-OprI as a vaccine against Pseudomonas aeruginosa infections // Vaccine. 2004. - № 22 - P. 840 - 847.

44. Baumann U., Gocke K., Gewecke B. et al. Assessment of pulmonary antibodies with induced sputum and bronchoalveolar lavage induced by nasal vaccination against Pseudomonas aeruginosa: a clinical phase 1Я1 study. // Respir. Res. 2007. - № 5(8). - P. 57.

45. Brennan F.R., Jones T.D., Gilleland L.B. et al. Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein F epitopes are highly immunogenic in mice when expressed on a plant virus // J. Microbiology. 1999, - № 145, - P. 211 - 220.

46. Centers for Disease Control and Prevention. Public health focus: surveillance, prevention and control of nosocomial infections // MMWR 1992. -№41.-P. 783-787.

47. Chastre J., Trouillet J.L. Problem pathogens {Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter) II Semin. Respir. Infect. 2000. - № 15. - P. 287-298.

48. Chen T.Y., Shang H.F., Chen T.L. et al. Recombinant protein composed of Pseudomonas exotoxin A, outer membrane proteins I and F as vaccine against P. aeruginosa infection I I Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999 Oct. - №52 (4). - P. 524-533.

49. Cornelis P., Sierra J.C., Lim A.Jr. et al. Development of new cloning vectors for the production of immunogenic outer membrane fusion proteins in Escherichia coli //Biotechnology (N.Y.). 1995 Feb. - №14 (2). - P.203-208.

50. Cripps A.W., Dunkley M.L., Taylor D.C. et al. Immunity to Pseudomonas aeruginosa induced by OprF following intestinal immunization // Adv. Exp. Med. Biol. 1993. -№ 371B. - P. 761-763.

51. Cripps A.W., Peek K., Dunkley M. et al. Safety and immunogenicity of an oral inactivated whole-cell Pseudomonas aeruginosa vaccine administered to healthy human subjects // Infect. Immun. 2006. - № 74. - P. 958 - 74.

52. Driscoll J.A, Brody S.L., Kollef M.H. The epidemiology, pathogenesis and treatment of Pseudomonas aeruginosa infections // Drugs. 2007. - № 67. - P. 351 -368.

53. Duchene M., Barron C., Schweizer A. et al. Pseudomonas aeruginosa outer membrane lipoprotein I gene: molecular cloning sequence and expression in Escherichia coli II J. Bacteriology. 1989: - № 171. - P. 4130 - 4137.

54. Editorial. Meeting summary Possibilities for active and passive vaccination against opportunistic infections // Vaccine. 2004. - № 22. - P. 801-804'.

55. Edwards J.R. Meropenem: a microbiological overview // J. Antimicrob. Chemotherapy. 1993. - № 36. - P. 1-17.

56. Frank D.W., Iglewski B.H. Cloning and sequence analysis of a transregulatory locus required for exoenzyme S synthesis in Pseudomonas aeruginosa II J. Bacteriology. 1991. № 173. - P. 6460 - 6468.

57. Fuqua W.C., Winans S.C., Greenberg E. P. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators // J. Bacteriology. 1993. -№ 176. - P. 269-275.

58. Gabelsberger J., Knapp B., Bauersachs S. et.al. Hybrid outer membrane protein antigen for vaccination against Pseudomonas aeruginosa II Behring Inst. Mitt. 1996 Feb. - № 98. - P. 302 - 314.

59. Gerd Döring, Gerald B. Pier. Vaccines and immunotherapy against Pseudomonas aeruginosa II Vaccine. 2008. - № 26. - P. 1011 - 1024.

60. Gilleland H.E.Jr., Parker M.G., Matthews-Greer J.M., Berg R.D. Use of purified outer membrane protein F (porin) preparation of Pseudomonas aeruginosa as a protective vaccine in mice // Infect. Immun. 1984 Apr. - Vol 44, №1. - P. 49-54.

61. Gilleland H.E., Gilleland L.B., Fowler M.R. Vaccine efficacies of elastase, exotoxin A, and outer-membrane protein F in preventing chronic pulmonary infection by Pseudomonas aeruginosa in a rat model // J. Med. Microbiol. 1993. — №38.-P. 79 -86.

62. Gilleland H.E.Jr., Gilleland L.B., Staczek J., et al. Chimeric influenza viruses incorporating epitopes of outer membrane protein F as a vaccine against pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa II Behring Inst. Mitt. 1996 Feb.- №98.-P. 291-301.

63. Govan J.R.W., Glass S. The microbiology and therapy of cystic fibrosis lung infections // Rev. Med. Microbiol. 1990. - №1 - P. 19-28.

64. Hancock R.E.W., Sinhnel R., Martin N. Outer membrane protein of Pseudomonas II Mol. Microbiol. 1990. - №4. - P. 1069-1075.

65. Hancock R.E., Wong R. Potential of protein OprF of Pseudomonas in bivalent vaccines // Review Behring Inst. Mitt. 1997 Feb. - № 98. - P: 283-290.

66. Hauser A.R:, Rello J. Severe infections caused by Pseudomonas aeruginosa II Academic Press. 2003. - № 13. - P. 183-190.

67. Hedstrom R.C., Pavlovskis O.R., Galloway D.R. Antibody Response of Infected Mice to Outer Membrane Proteins of Pseudomonas aeruginosa II Infection and Immunity. 1984 Jan. - Vol 43, № 1. - P. 49-53.

68. Heinz A., Bumann D., Felies M. et al. Enhanced Immunogenicity in the Murine Airway Mucosa with an Attenuated Salmonella Live Vaccine Expressing OprF-OprLfrom Pseudomonas aeruginosa II Infect. Immun. — 2004 Nov. — P. 65466553.

69. Hobbs M., Collie E.S.R., Free P.D. et al. PilS and PilR, a two-component transcriptional regulatory system controlling expression of type 4 fimbriae in Pseudomonas aeruginosa II Mol. Microbiol. 1993. - № 7. - P. 669682.

70. Huang H., Hancock R.E.W. Genetic definition of the substrate selectivity of Pseudomonas aeruginosa outer membrane porin. protein Opr D. // J Bacteriol. 1993; -№ 175. - P. 7793-7800.

71. Jarvis W.R., Martone W.J., Pollak M. Pseudomonas aeruginosa. II In: Mandell, Douglas and Bennett's «Principles and Practice of Infectious Diseases». — 4-th edition. P. 1980-2003.

72. Jang I.J., Kim I.S., Park W.J., et al. Human immune response to a Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein vaccine // Vaccine. 1999 — № 17 -P. 158-168.

73. Gillardi G.L. Pseudomonas and related genera // Manual of clinical microbiology. 1991 - 5th ed. - P. 429-441.

74. Kadurugamuwa J.L, Beveridge T.J. Natural release of virulence factors in membrane vesicles by Pseudomonas aeruginosa and the effect of aminoglycoside antibiotics on their release // J. Antimicr. Chemotherapy. — 1996. № 40 - P. 615621.

75. Kim D.K., Kim J.J., Kim J.H., et al. Comparison of two immunization schedules for a Pseudomonas aeruginosa outer membrane proteins vaccine in burn patients//Vaccine.-2001 Dec.-№8, 19 (9-10).-P. 1274-1283.

76. Knapp B., Hundt E., Lenz U., et al. A recombinant hybrid outer membrane protein for vaccination against Pseudomonas aeruginosa II Vaccine. — 1999 Mar 26. № 17 (13-14). - P. 1663-1666.

77. Kohler T., Michea-Hamzehpour M., Epp S.F., Pechere J-C. Carbapenem activity in Pseudomonas aeruginosa: respective contribution of OprD and efflux systems // Ibid. Abst. 1998 - P. 127.

78. Kovacs K., Paterson D.L., Yu V.L. Antimicrobial Therapy for Pseudomonas aeruginosa: Therapeutic Issues; Resistance; Pneumonia; Endocarditis; and Infections of the GI Tract, Bone and Joint, and Urinary Tract // Infect. Med. -1998.-№15.-P. 385-393.

79. Kovacs K., Paterson D.L., Yu V.L. Antimicrobial Therapy for Pseudomonas aeruginosa: Skin and Soft Tissue, Ear, and Eye Infections; Meningitis; and Clinical Syndromes of Febrile Neutropenic and HIV Patients // Infect. Med. -1998. -№ 15.-P. 464-478.

80. Laemmli V.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4// Nature. 1960. - V. 227. - P. 680.

81. Larbig M., Mansouri E., Freihorst J., et al. Safety and immunogenicity of an intranasal Pseudomonas aeruginosa hybrid outer membrane protein F-I vaccine in human volunteers // Vaccine. 2001 Mar 21. - № 19 (17-19). - P. 2291-2296.

82. Laughlin T.J., Armstrong D.G., Caporusso J., Lavery S.A. Soft tissue and bone infection from puncture wounds in children // J. West Med. — 1996. — № 166.-P. 126-128.

83. Lee N.G. et al., Human anti-Pseudomonas aeruginosa outer membrane proteins IgG cross-protective against infection with heterologous immunotype strains of P. aeruginosa II FEMS Immun. Med. Microbiology. 1999- № 25. - P. 339-347.

84. Lee N.G., Jung S.B., Ahn B.Y. et al. Immunization of burn-patients with a Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein vaccine elicits antibodies with protective efficacy // Vaccine 2000- № 18. - P. 1932-1951.

85. Lee N.G. et al. Protection of mice against P. aeruginosa infections by large-scale affinity-purified human IgG specific to P. aeruginosa outer membrane proteins // Vaccine. 2000. - № 18. - P. 665-674.

86. Lee N.G. et al. Conformation-dependent antibody response to Pseudomonas aeruginosa outer membrane proteins induced by immunization in humans // FEMS Immun. Med. Microbiology. 2000. - № 27. - P. 79-85.

87. Lechi A., Arosio E., Pancera P. et« al. Pseudomonas septicaemia. Aireview of 60 cases observed in a university hospital. // J. Hosp. Infect. 1984. - № 5.1. P. 29-37.

88. Lieberman D, Lieberman D. Pseudomonas infections in patients with

89. COPD: epidemiology and management // Am. J. Respir. Med. 2003. - №2. - P.459.68.

90. Lillehoj E.P., Kim B.T., Kim K.C. Identification of Pseudomonas aeruginosa flagellin as an adhesin for Mucl mucin // Am. J. Lung Cell Mol. Physiol. 2002. - № 282. - P. 751-756.i

91. Lomovskaya O., Lee A., Mistry A. et al. Multidrug resistance pumps as important targets for antibacterial therapy // 38th Intersci Conf Antimicrob Agents Chemother. Sept. 24-27 1998, San Diego. - P. 120.

92. Mansouri E., Gabelsberger J., Knapp B., et al. Safety and Immunogenicity of a Pseudomonas aeruginosa Hybrid Outer Membrane Protein F-I Vaccine in human volunteers // Infect. Immun. -1999 March, Vol. 67. №3 - P. 1461-1470.

93. Montor W.R., et al. A genome wide study of Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein immunogenicity using self-assembling protein microarrays// Infect. Immun. 2009. - № 698. - P. 770-779.

94. Nikaido H., Hancock R.E.W. Outer membrane permeability in Pseudomonas aeruginosa. II J. The bacteria. 1986. -№ 10 — P. 145-193.

95. Nikaido H., Thanassi D.G. Penetration of lipophilic agents with multiple protonation sites into bacteria cells; tetracyclines and fluoroquinolones as examples // Antimicr. agents chemotherapy. 1993. -№ 37 - P. 1393-1399.

96. Matthews-Greer, J.M., Gilleland H.EJr. Outer membrane protein F (porin) preparation of Pseudomonas aeruginosa as a protective vaccine against, heterologous immunotype strains in a burned mouse model // J. Infect. Dis. 1987 — № 155. —P: 1282-1291.

97. Mizuno T. Outer membrane proteins of Pseudomonas aeruginosa II J. Biochem. 1982. - P. 179-191.

98. Mutharia L.M., Nicas T.I., Hancock R.E.W. Outer membrane proteins of Pseudomonas aeruginosa serotype strains // J. Infect. Dis. 1982. - № 146. - P. 770779.

99. Nakae T., Yoshihara E. Identification of porins in the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa that form small diffusion pores // J. Biol. Chem. — 1989. v. 264. -№ 11.-P. 6296-6301.

100. Ono Y. Pseudomonas aeruginosa II Nippon Rinsho. 2002. — № 60. — P. 2150-2155.

101. Palleroni N.J., Kraig N.R., Holt J.G. Family I: Pseudomonadaceae // Bergey's manual of systematic bacteriology. (Eds.). Baltimore. — 1984. — № 1. P. 141-219.

102. Park W.J., Kim Y.H., Jeong S.M., et al. General pharmacology of a Pseudomonas vaccine prepared from outer-membrane fractions of Pseudomonas aeruginosa II Arzneimittel-Forschung. 1995. - № 46. - P. 1001 - 1006.

103. Pedersen H.B., Rosborg J. Necrotizing external otitis: aminoglycoside and beta-lactam treatment combined with surgical treatment // Clin. Otolaryngol. — 1996.-№22.-P. 271-274.

104. Pesci E.C., Inglewski B.H. The chain of command in Pseudomonas quorum sensing II Trends Microbiol. 1996. - № 24. - P. 132-134.

105. Pier G.B., DesJardin D., Grout M., et al. Human immune response to Pseudomonas aeruginosa mucoid exopolysaccharide (alginate) vaccine // Infect. Immun. 1993. - № 62. - P. 3962 - 3969.

106. Poole K., Krebes K., McNally C., Neshat S. Multiple antibiotics resistance in Pseudomonas aeruginosa: evidence for involvement of an efflux operone // J. Bacteriol. 1993. № 175. - P. 7363-7372.

107. Price B.M., Barten Legutki J., Galloway D.R., et al. Enhancement of the protective efficacy of an oprF DNA vaccine against Pseudomonas aeruginosa II FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2002 Jun 3. - № 33 (2). - P. 89-99.

108. Priebe G.P., Brinig M.M., Hatano K., et al. Construction and characterization of a live, attenuated aroA deletion- mutant of Pseudomonas aeruginosa as a candidate intranasal1 vaccine // Infect. Immun. — 2002. — № 70. P. 1507 -1517.

109. Priebe G.P., Meluleni G.J., Coleman F.T., et al. Protection against fatal Pseudomonas aeruginosa pneumonia in mice after nasal immunization with a live, attenuated aroA deletion mutant // Infect. Immun. 2003. - № 71. - P. 1453 - 1461.

110. Promega. Fmol. Technical manual. DNA cycle sequencing system. —2001.

111. Protocols and applications. Promega. 1989/90.

112. Qiaqen. The QIAexpressionist // A handbook for. high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins. — 2001.t

113. Saha S., Takeshita F., Sasaki S., et al. Multivalent DNA vaccine protects mice against pulmonary infection caused, by Pseudomonas aeruginosa II Vaccine. — 2006 № 24. - P. 6240 -6249.

114. Shiau J.W., Tang T.K., Shih Y.L., et al. Mice immunized with DNAencoding a modified Pseudomonas aeruginosa exotoxin A develop protective immunity against exotoxin intoxication // Vaccine. 2001 Dec 8. - № 19(9-10). — P. 1106-1112.

115. Siegman-Igra Y., Ravona R., Primerman H., Giladi M. Pseudomonas aeruginosa bacteremia: An analysis of 123 episodes, with particular emphasis on the effect of antibiotic therapy // Intern J. Infect. Dis. 1998. - № 2. - P. 211-215.

116. Staczek J., Gilleland L.B., van der Heyde H.C., Gilleland H.E. DNA vaccines against chronic lung infections by Pseudomonas aeruginosa II FEMS Immunol. Med'. Microbiol. 2003 Jul 15; - №37 (2-3): - P. 147-153.

117. Srikumar R., Li X. Z., Poole K. Inner membrane efflux components are responsible for beta-lactam specificity of multidrug efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa II J. Bacteriol. 1996. -№ 179 (24). - P. 7875-7881.

118. Stock J.B., Ninfa A.J., Stock A.M. Protein phosphorylation and regulation of adaptive response in bacteria // Microbiol. Rev. — 1989. № 53. — P. 450-490.

119. Stanislavsky E.S, Edvabnaya L.S., Bandman O.A. et al. Experimental studies on the protective efficacy of a Pseudomonas aeruginosa II Vaccine. 1989. Vol. 7.-№6.-P. 562-566.

120. Stanislavsky E.S., Kim H.S., Park W.J., et al. Pseudomonas aeruginosa II Hanrimwon publishing company, Seoul, Korea. 1998.

121. Stanislavsky E.S, Lam J.S. Pseudomonas aeruginosa antigens as potential vaccines // Review. 1996 Nov. - № 21(3). - P. 243-277.

122. Stover C.K., Brinkman F.S.L., Kowalik DJ., et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAOl, an opportunistic pathogen // Nature. -2000 Aug. № 406. - P. 947-948.

123. Talon D., Mulin B., Rouget C., et al. Risks and routes for ventilator-associated pneumonia with Pseudomonas aeruginosa II Amer. J. Resp. Crit. Care Med. 1998. - №> 157. - P. 968-984.

124. Thomas L.D., Kyd J.M., Bastin D.A., et al. Immunisation with nonintegral OMPs promotes pulmonary clearance of Pseudomonas aeruginosa II FEMS Immunol Med Microbiol. -2003. № 37. - P. 155 - 160.

125. Troillet N, Samore M.H., Carmeli Y. Imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa: Risk factors and antibiotic susceptibility patterns // Clin. Infect. Dis. -1996.-№25(5).-P. 1093-1098.

126. Ulmer A.J., Rietschel E.T., Zahringer U., Heine H. Lipopolysaccharide: structure, bioactivity, receptors, and signal transduction // Trends Glycosci Glycotechnol. 2002. - № 14(53). - P. 68.

127. Woodruff W.A., Hancock R.E.W., et al. Expression in Escherichia Coli and function of porin protein F of Pseudomonas aeruginosa II J. Bacteriol. 1986. -№ 167.-P. 473-479.

128. Worgall S., Krause A., Qui J., et al. Protective immunity to Pseudomonas aeruginosa induced with a capsid-modified adenovirus expressing P. aeruginosa OprF // J. Virol. 2007. № 81 (24). - P. 13801 - 13808.

129. Zaidi T.S., Priebe G.P., Pier G.B. A live-attenuated Pseudomonas aeruginosa vaccine elicits outer membrane protein-specifc active and passive protection against corneal infection // Infect. Immun. 2006. № 74. - P. 965 - 83.