Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Серопрофилактика и серотерапия синегнойной инфекции в эксперименте

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Серопрофилактика и серотерапия синегнойной инфекции в эксперименте"

На правах рукописи

ОБОДОВА Марина Александровна

СЕРОПРОФИЛАКТИКА И СЕРОТЕРАПИЯ СИНЕГНОЙНОЙ ИНФЕКЦИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

03 00 07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Волгоград 2007

003161474

Работа выполнена в ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Храпова Наталья Петровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Девдариани Зураб Леванович

доктор медицинских наук Таран Татьяна Викторовна

Ведущая организация Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится^ ноября 2007 г власов на заседании диссертационного совета Д 208 078 01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора (кандидата) наук при ФГУЗ "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г Саратов, ул Университетская, 46)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РосНИПЧИ «Микроб»

Автореферат разослан «6» октября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета:

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Слудский А А

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы Одним из основных критериев качества жизни населения считается уровень инфекционной заболеваемости Важнейшей проблемой здравоохранения, приобретающей все большую социально-экономическую значимость, является внутрибольничное инфицирование

В России проблема борьбы с внутрибольничными инфекциями (ВБИ) относится к числу приоритетных Несмотря на проведение регламентированных санитарно-эпидемиологических мероприятий и успехи в антимикробной терапии, частота нозокомиальных инфекций в структуре патологии не только не уменьшается, но и проявляет тенденцию к нарастанию (Малеев В В , 2004, Зуева JIП, 2000, Решение коллегии МЗ РФ, 2002, Покровский В И с соавт , 2001) Среди причин, влияющих на уровень заболеваемости ВБИ и их структуру, указывают возрастание числа лиц с измененным иммунным статусом в России приблизительно 40 % взрослого населения имеют различные иммунопатологические состояния Существенное влияние на динамичный рост нозо-комиального инфицирования оказывают регистрируемое повсеместно старение населения, ухудшение экологической обстановки, увеличение перечня заболеваний и агентов, приводящих к иммуносупрессии (Покровский В И с соавт, 2001)

Одним из основных этиологических агентов госпитальной инфекции с высокими показателями заболеваемости и летальности является синегнойная палочка (Wenzel RP, 1990) Внешняя среда хирургических, урологических, ожоговых, реанимационных отделений является основным источником инфицирования пациентов Pseudomonas aeruginosa Известно, что этот микроорганизм способен к резервации в объектах окружающей среды в течение длительного времени Циркуляция Р aeruginosa в среде стационаров создает потенциальную опасность возникновения ВБИ среди пациентов с компрометированной иммунной системой на фоне основного заболевания, стресса или иммуно-супрессивной терапии По данным А Ф Мороз с соавторами, синегнойная палочка является причиной госпитальных инфекций в 20-30 % регистрируемых случаев (Мороз А Ф с соавт , 1988)

Антибактериальная терапия при синегнойной инфекции недостаточно эффективна вследствие естественной множественной антибиотикорезистент-ности микроорганизма, а также вследствие увеличения числа резистентных штаммов Р aeruginosa на фоне нерациональной терапии Активная иммунизация может быть успешна при синегнойной инфекции при наличии низко токсичных вакцинных препаратов, выборе оптимальных режимов вакцинации, способности пациентов к полноценному иммунному ответу В настоящее время синтезированы разнообразные вакцинные препараты для специфической профилактики синегнойной инфекции (Pseudogen, Pioimmunogen, PEV-01 и многие другие), но их применение для тяжелых больных часто оказывается неэффективным из-за невозможности выработки адекватного иммунного ответа (Stanislavsky Е et al, 1998)

Увеличение числа полиантибиотикорезистентных госпитальных штаммов Р aeruginosa, возрастание количества лиц с измененным иммунным стату-

з

сом, для которых традиционная терапия малоэффективна, а также способность данного патогена к быстрой колонизации макроорганизма показывают необходимость изменения тактики борьбы с синегнойной инфекцией и требуют разработки новых средств профилактики и лечения

С начала 80-х годов XX века появились публикации зарубежных авторов о получении моноклональных антител (МКА) против различных антигенов Р aeruginosa, накоплены данные об эффективности МКА различной эпитоп-ной направленности как средств профилактики и лечения экспериментальной синегнойной инфекции (HancockRE W et al, 1982, 1985, MuthariaL M , 1983, Sawada Sh et al, 1984, Ye Danni et al, 1985, Rosok M J et al, 1990, Lam J S et al, 1988, De Kievit T R, 1994, Yoshida К, 1989, Bogard W С , 1987, Frank D W , 2-002, Morrison DC et al, 1990, Nelson J W et al, 1992, El-Zaim DE et al, 1998, Lang AB et al, 1989, Bruderer U et al, 1993, Kuriyama M , 1990)

В нашей стране такие исследования не проводили ввиду отсутствия отечественных коллекций гибридом-продуцентов МКА против антигенов Р aeruginosa В настоящее время в Волгоградском НИПЧИ создан набор гибридных клонов, продуцирующих мышиные МКА к белкам наружной мембраны, липополисахариду (ЛПС), экзотоксину А (ЭТА) Р aeruginosa (Карпова М В с соавт, 2000, Храпова Н П с соавт, 2000, 2002, Ломтатидзе М В с соавт, 2004)

Изучение протективных свойств МКА различной антигенной направленности позволит выявить наиболее перспективные варианты антител для профилактики и лечения синегнойной инфекции

Цель работы, - изучение протективных свойств моноклональных антител против различных антигенов Pseudomonas aeruginosa на модели мышиного экспериментального синегнойного сепсиса

Задачи исследования

1) моделирование экспериментального синегнойного сепсиса,

2) получение МКА против эпитопов ЭТА Р aeruginosa,

3) накопление т vitro и m vivo МКА против различных антигенов Р aeruginosa,

4) оптимизация режимов парентерального введения МКА для профилактики и лечения экспериментальной синегнойной инфекции,

5) анализ эффективности применения МКА и смесей МКА различной эпитопной направленности, а также сочетаний МКА и антибиотика для профилактики и лечения синегнойной инфекции в эксперименте,

6) изучение возможности приготовления липосомальных форм МКА и оценка эффективности их применения для профилактики и лечения экспериментальной синегнойной инфекции

Научная новизна

Получены новые данные о роли гуморальных антител в защите макроорганизма от синегнойной инфекции Впервые изучен протективный потенциал моноклональных иммуноглобулинов против различных антигенов Р aeruginosa, представлены доказательства эффективности пассивной защиты биомоделей от экспериментальной синегнойной инфекции

Определены варианты МКА различной эпитопной направленности, обладающие высоким протективным потенциалом при использовании в различных режимах применения с целью создания пассивного иммунитета у экспериментальных животных при синегнойном сепсисе

Впервые в нашей стране получены гибридные клоны, продуцирующие мышиные моноклональные антитела против экзотоксина А Р aeruginosa, определены особенности получения иммунных B-лимфоцитов мышей, выбора партнеров при гибридизации клеточных линий Представлены приоритетные данные об условиях выделения и накопления экзотоксина А Р aeruginosa, оценке его биологической активности in vivo и in vitro Оптимизированы схемы антигенной стимуляции мышей-доноров спленоцитов, используемых при гибридизации клеточных линий с целью получения МКА против эпитопов ЭТА

Впервые изучен протективный потенциал МКА, включенных в липо-сомы, оптимизированы схемы комбинированного использования моноклональных иммуноглобулинов и гентамицина сульфата, включенного в липосо-мы, для профилактики и лечения экспериментальной синегнойной инфекции

Полученные данные позволяют говорить о прототипах МКА, которые в перспективе могут быть рекомендованы для клинического применения как средства иммунопрофилактики и иммунотерапии синегнойной инфекции

Практическая ценность

Получены гибридные клоны-продуценты мышиных МКА против эпитопов экзотоксина А Р aeruginosa, обладающие высоким протективным потенциалом Гибридомы постоянно хранятся в жидком азоте в биохранилище Волгоградского НИПЧИ, что реализует возможность накопления моноклональных иммуноглобулинов в любое время Оптимизированы условия культивирования токсигенного штамма Р aeruginosa на этапе приготовления препаративных количеств экзотоксина А Показано преимущество использования теста цитотоксичности экзотоксина А на перевиваемых клеточных линиях m vitro с целью определения предельно допустимых суммарных антигенных нагрузок для животных при иммунизации мышей как этапа гибридомной технологии Особенности условий гибридизации клеточных линий изложены в «Методических рекомендациях по получению гибридом-продуцентов моноклональных антител к липополисахариду и экзотоксину А синегнойной палочки» (рассмотрены ученым советом Волгоградского НИПЧИ 05 06 2002 г , протокол № 6 и утверждены директором института)

Подтверждены данные зарубежных исследований (Barclay GR et al, 1986) об отсутствии отчетливой взаимосвязи протективного эффекта МКА и активности антител (AT) в ТИФМ, изотипа AT, концентрации, взаимодействия МКА и ферментов протеазы и фосфолипазы С Р aeruginosa Условия оценки антиферментной активности МКА определены в «Методических рекомендациях по определению влияния моноклональных антител на ферменты синег-нойной палочки» (рассмотрены ученым советом Волгоградского НИПЧИ 05 06 2002 г, протокол №6 и утверждены директором института)

Оптимизированы режимы парентерального введения МКА против различных антигенов синегнойной палочки для профилактики и лечения экспериментального синегнойного сепсиса Конкретизированные схемы применения препаратов иммуноглобулинов, сочетаний МКА и антибиотика представлены в «Методических рекомендациях по оценке протективности моноклональных антител против антигенов Pseudomonas aeruginosa на модели синег-нойнОго сепсиса в эксперименте» (рассмотрены ученым советом Волгоградского НИПЧИ 05 06 2002 г, протокол №6 и утверждены директором института)

Определены типы МКА, обладающие наибольшей протективной активностью, проведено сравнительное исследование протективного эффекта МКА и сочетаний МКА с антибактериальным препаратом (гентамицина сульфат, включенный в липосомы) Показаны отдельные преимущества различных препаратов в зависимости от режима применения

Материалы диссертационной работы включены в цикл лекций по диагностике, лечению и профилактике особо опасных инфекций на курсах подготовки специалистов «Курсы первичной специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям» при ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Полученные данные представляют интерес для сотрудников иммунологических лабораторий, занимающихся вопросами защиты от патогенных микроорганизмов и разработкой средств серотерапии и серопрофилактики инфекционные заболеваний

Основные положения, выносимые на защиту

1 Применение МКА различной эпитопной направленности защищает экспериментальных мышей от острой синегнойной инфекции, увеличивая выживаемость животных в ряде случаев до 83 % МКА против эпитопов экзотоксина А Р aeruginosa обладают более выраженной протективной активностью, чем МКА против эпитопов ЛПС, полисахарида (ПС) в составе ЛПС Использованные в работе МКА против эпитопов белков наружной мембраны синегнойной палочки' не обладают протективной активностью

2 Оптимальными условиями получения экзотоксина А Р aeruginosa 103Р являются культивирование глубинным способом при температуре 32 °С в среде на основе диализата триптического перевара соевых бобов, обогащен-

ной глютаматом натрия и глицерином с предварительной абсорбцией ионов железа

3 Проведение эффективной гибридизации клеточных линий и получение гибридом-продуцентов МКА против эпитопов ЭТА Р aeruginosa 103Р были обеспечены стимуляцией мышей-доноров B-лимфоцитов препаратом экзотоксина А в минимальных дозах при непродолжительных циклах иммунизации, а также использованием линии мышиных миеломных клеток Sp2/0

4 Оптимальным режимом применения препаратов МКА для защиты биомоделей от экспериментальной синегнойной инфекции является профилактический Сочетанное применение моноклональных иммуноглобулинов и антибиотика гентамицина сульфата в липосомальной форме более эффективно на ранних этапах лечения

5 Применение липосомальных форм смесей МКА против эпитопов экзотоксина А Р aeruginosa является перспективным направлением исследований в рамках защиты от синегнойной инфекции

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста, проиллюстрирована 5 рисунками и 17 таблицами Состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения и выводов Список использованных источников литературы включает 205 работ (55 отечественных и 150 зарубежных)

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были представлены на конкурсе научных работ молодых ученых в рамках XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (г Москва, 19-23 04 2004 г), конференции молодых ученых Волгоградского НИПЧИ (18 06 2004 г), итоговой научной конференции Волгоградского НИПЧИ (27 05 2005 г), VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (13-14 09 2005 г) и обсуждены на общеинститутской конференции Волгоградского НИПЧИ 30 05 2007 г

Публикации

Основные положения диссертации отражены в 13 печатных работах

Основное содержание работы

Материалы и методы исследований. В работе использованы 1) 7 коллекционных типовых штаммов Pseudomonas aeruginosa (Н-2, Н-3, Н-4, Н-5, Н-6, Н-11, РАО 1) и токсигенный штамм Р aeruginosa 103Р, 2) линии мышиных перевиваемых гибридных клеток-продуцентов МКА против эпитопов ЛПС, ПС в составе ЛПС, белков наружной мембраны, ЭТА Р aeruginosa, из коллекции лаборатории иммунодиагностики и биотехнологии Волгоградского НИПЧИ, постоянно сохраняемые в жидком азоте при - 196 °С, линии мышиных миеломных клеток P3-X63 Ag8 653 и Sp2/0, мышиных фибробластов L929, перевиваемая линия овариальных клеток китайского хомячка СНО-К1 из "Банка клеточных культур" института цитологии АН РФ, 3) лабораторные животные из питомника института (10 кроликов породы «Шиншилла», массой 2,5-3 кг, 800 аутбредных белых мышей массой 18 - 20 г обоих полов и более 2000 белых мышей линии BALB/c, массой 12 - 16 г обоих полов)

Водорастворимые антигены (ВСЭ) готовили из ацетонвысушенных клеток Р aeruginosa Н-2 и Н-3 методом водно-солевой экстракции ЛПС получали из клеток Р aeruginosa Н-2, Н-4, Н-5, Н-6, Н-11, РАО 1 методом водно-фенольной экстракции Экзотоксин А получали методом аффинной очистки из среды культивирования Р aeruginosa 103Р (Храпова Н П с соавт , 2000, 2002) Моноклональные антитела накапливали в препаративных количествах после размораживания различных гибридом-продуцентов и проведения всех последовательных этапов их тиражирования (Храпова Н П с соавт, 2000, 2002) Для культивирования клеток использовали среду RPMI-1640 (Gibco), эмбриональную телячью сыворотку (HyClone) и пластиковую посуду (Nunc) Антителрпродукцию контролировали с помощью непрямого варианта ТИФМ по общепринятой методике Твердую фазу (поливинилхлоридные пластины) нагружали ВСЭ, ЛПС, ЭТА Р aeruginosa Антивидовой иммунопероксидаз-ный конъюгат против иммуноглобулинов мыши для ТИФМ готовили по методу НФ Янкиной, ЛИ Ванеевой (1985) Моноклональные иммуноглобулины выделяли из среды культивирования гибридом и асцитических жидкостей мышей методом осаждения белка сульфатом аммония при 50 % насыщения (O'Berry Р А , 1964) Все образцы иммуноглобулинов стерилизовали мембранной фильтрацией (0,45 ц), определяли концентрацию белка в них, ампулирова-ли и хранили при - 20 °С до момента использования В экспериментах по оценке протективных свойств МКА использовали иммуноглобулины, изолированные из асцитических жидкостей мышей

Специфическую активность иммуноглобулинов определяли в непрямом методе флуоресцирующих антител (НМФА) и непрямом варианте твердофазного иммуноферментного метода (ТИФМ)

Оценку протективной активности МКА in vivo осуществляли в режимах ранней, экстренной профилактики и серотерапии синегнойного сепсиса, моделируя инфекционной процесс на белых мышах линии BALB/c Группам мышей (по 6 особей) за 24 ч (режим ранней серопрофилактики), за 2 ч (режим экстренной серопрофилактики) до заражения и через 24 ч (режим серотера-

пии) после заражения внутрибрюшинно вводили индивидуальные образцы МКА в дозе 2 мг/мышь Дополнительная группа мышей получала препарат сравнения - иммуноглобулины, выделенные из сыворотки интактных животных Животных заражали внутрибрюшинно Р aeruginosa 1ОЗР, используя дозы в диапазоне от 10 до 50 LD50 Срок наблюдения за животными составлял 30 сут После завершения опыта производили расчет показателей средней продолжительности жизни (СПЖ) и % выживших животных в каждой из групп Использовали также показатель «процент защиты», согласно которому увеличение выживаемости на 20 % и более в опытной группе относительно показателя выживаемости животных, получавших препарат сравнения, позволяет считать испытуемый препарат эффективным средством защиты (Таран Т В , 2004)

Помимо оценки протективных свойств МКА проводили исследование протективной активности смесей МКА, в том числе и в липосомальной форме (доза смеси составляла суммарно 2 мг белка в растворе смеси на одно животное), а также сочетаний МКА и смесей МКА с антибиотиком гентамицина сульфатом в липосомальной форме Раздел работы по включению МКА, гентамицина в липосомы выполнен на базе лаборатории иммобилизованных биополимеров Волгоградского НИПЧИ Включение моноклональных иммуноглобулинов в липосомы методом обращения фаз было выполнено впервые Антибиотик, включенный в липосомы, вводили через 2 ч после заражения биомоделей Р aeruginosa 103Р и повторно через 24 ч после заражения (Снатенков Е А, 2005)

Статистическую обработку результатов опытов проводили с помощью методов вариационной статистики (Ашмарин И П., Воробьев А А , 1962), а также компьютерной программы Microsoft Excel 97

Основные результаты исследования и их обсуждение

Изучены свойства 14 вариантов МКА, полученных в лаборатории иммунодиагностики и биотехнологии Волгоградского НИПЧИ Клоны-продуценты МКА против поверхностно локализованных эпитопов синегной-ной палочки - белков наружной мембраны, ЛПС, ПС в составе ЛПС получены ранее (Храпова H П с соавт , 2000, 2002, Ломтатидзе M В , 2004), МКА против элитопов ЭТА Р aeruginosa ЮЗР были получены впервые в ходе настоящих исследований

Раздел работы по получению, выделению и очистке препарата экзотоксина А Р aeruginosa был проведен на базе лаборатории питательных сред и глубинного культивирования Волгоградского НИПЧИ При проведении совместных исследований оптимизирован режим накопления ЭТА в жидкой питательной среде (глубинное культивирование Р aeruginosa ЮЗР при 32 °С в среде на основе триптического перевара бобов сои, обогащенной глютаматом натрия и глицерином, с предварительной абсорбцией ионов железа), его очистки В последующей работе был использован препарат ЭТА с концентрацией белка 1,4 мг/мл, его токсичность для белых мышей (LD50) составила 22 мкг Впервые проведено определение цитотоксичности полученного препарата ЭТА

9

на, перевиваемой клеточной линии СНО-К1 и культуре мышиных фибробла-стов L929 - цитотоксический эффект проявлялся при внесении 0,27 - 0,54 мкг ЭТА в лунки 96-луночной пластины в объеме 100 мкл, что свидетельствовало о более высокой чувствительности данного теста по сравнению с биологическим

Данные теста цитотоксичности выделенного препарата ЭТА Р aeruginosa 103Р послужили основой для определения дозы антигена при стимуляции мышей-доноров иммунных B-лимфоцитов при получении МКА к ЭТА, которая не превышала минимальной дозы экзотоксина, вызывающей дегенеративные изменения перевиваемых клеточных линий, и составила 170 нг Использование минимальных концентраций ЭТА исключало гибель животных от передозировки токсина, что позволило провести полный цикл иммунизации мышей, включающий четырехкратное внутрибрюшинное введения антигена с последующим бустирующим внутриселезеночным введением Схема иммунизации животных представлена в таблице 1

Таблица 1 - Схема иммунизации животных при получении МКА против экзотоксина АР aeruginosa

Календарь Доза Способ Наличие адъюванта, объем препа-

иммунизации ЭТА, нг введения рата (V)

1-й день 20 + НАФ (v/v = 1 1),VL0,5 мл

15-й день 30 Внутрибрюшинно + НАФ (v/v = 1 1), Vv 0,5 мл

45-й день 50 Без НАФ, V 0,5 мл

52-й день 40 Без НАФ, V 0,5 мл

58-й день 30 Внутриселезеночно Без НАФ, V 0,25 мл

60-й день Слияние спленоциты / миелома

При гибридизации клеточных линий результативными явились опыты, в которых в качестве миеломного партнера участвовала линия Sp2/0 Гибридизация проведена по общепринятому протоколу гибридомной технологии

Получено пять стабильных антителопродуцентов против эпитопов ЭТА Р aeruginosa 103Р - 3F5, 5F10, 5Н9, 4D2, 4С12 Тиражирование гибридом-продуцентов, накопление МКА in vitro и m vivo проведено по общепринятой методике Полученные МКА in vitro нейтрализовали токсическое действие ЭТА Р aeruginosa 103Р на клетки перевиваемых линий СНО-К1 и L929 Установлено, что две из полученных гибридом 5Н9 и 4С12 обладали низкой прививаемостью для животных (не более 20 %), в дальнейшей работе одна из них (4С12) использована в качестве компонента смесей МКА

Из испытуемых 12 вариантов МКА 9 направлены против поверхностно локализованных эпитопов синегнойной палочки — белков наружной мембраны, липополисахарида (ЛПС), полисахарида (ПС) в составе ЛПС, 3 - против экзотоксина А Все образцы МКА накоплены в препаративных количествах, охарактеризованы по изотипу, специфической активности в ТИФМ

Установлено, что из 12 вариантов МКА против поверхностно экспонированных антигенов синегнойной палочки 9 являются IgG2b, 1 - IgG3, 2 - IgGi

ю

МКА против эпитопов Р aeruginosa, экспонированных на поверхности микробной клетки, также охарактеризованы по антиферментной активности в отношении ферментов фосфолипазы С и протеаз Р aeruginosa При дальнейшей оценке протективной активности прямой зависимости протективного потенциала МКА от их изотипа, антиферментной активности не обнаружено

Характеристика использованных в настоящей работе МКА против антигенов Р aeruginosa представлена в таблице 2

Таблица 2 - Характеристика изученных МКА

Эпитоп-ная направленность МКА Наименование МКА Изотип % угнетения активности ферментов Взаимодействие с антигенами

НМФА ТИФМ (титры)

МКА из ЮК МКА из АЖ

протеа-зы фосфолипазы С

ПС в составе ЛПС 1В7 IgG3 25 0 + 103-104 106 - 10 7

2А2 IgG2b 41,7 51,5 + 103 - 10"4 10"6- 10"7

ЛПС 5D8 IgG2b 41,7 82 + 10"3-104 10 6 - 10"7

5D10 IgG2b 25 42 + 103 — 10 4 ю6- ю7

7G4 IgGjb 20 32 + ю4 106 - 10"7

Белки наружной мембраны Н-2 IgG, 8,3 51,5 + 10~3 - 104 ю6- ю7

4Е11 IgGjb 50 39,4 + Ю-3 - 104 106

4G4 IgG, 0 45,4 + Ю-3 ю6- ю7

4G5 IgG2b 25 40 + 10"3- ю-4 106

ЭТА 3F5 IgG2b - - - 10"3 - 104 106 - 10"7

4D2 IgG2b - - - 10"3 - 104 ю-7

5F10 IgG2„ - - - 10"3 - 10 4 106 — 107

4С12 IgG2b - - - 10"3 ю-7

5Н9 IgG2b - - - 10"4 10"6

Примечание «+» - положительный результат, «-» - исследование не проводили

Септический характер экспериментальной синегнойной инфекции подтвержден результатами МФА с использованием моноклональных ФИТЦ-конъюгатов - в первые 3 ч после заражения клетки Р aeruginosa 103Р обнаружены в почках, селезенке и брыжейке мышей, затем через 6 ч микробные клетки обнаруживали в крови и уже через 12 ч выявляли во всех исследуемых органах и тканях Динамика распространения синегнойной палочки по органам и тканям биомоделей в различные сроки после заражения представлена в таблице 3

Таблица 3 - Динамика распространения синегнойной палочки по органам и тканям биомоделей в различные сроки после заражения 10 LD5q Р aeruginosa 103Р

Ткани и органы Сроки обнаружения клеток Р aeruginosa 103Р в МФА

Зч 6ч 12ч 18ч 2сут Зсут Юсут

Кровь - + + + + + +

Почки + + + + + +

Печень - - + + + + +

Селезенка + + + + + + +

Брыжейка + - + + + + +

При посевах органов и тканей экспериментальных животных на питательные среды получен сливной рост культуры, идентифицированной как Р aeruginosa

Протективная активность изучена для 12 вариантов МКА на модели мышиного синегнойного сепсиса, которая, по литературным данным, является наиболее близкой к человеческой синегнойной инфекции (Stanislavsky Е et al, 1998, IglewskiBH, 1998)

С целью отбора наиболее перспективных образцов МКА осуществляли предварительную оценку протективных свойств 12 испытуемых препаратов Исследование протективных свойств МКА проведено при введении животным различных заражающих доз Р aeruginosa 103Р, при этом установлено, что МКА против эпитопов белков наружной мембраны Н-2, 4Е11, 4G4, 4G5 и МКА против эпитопов ЛПС 5D10 обладают низкой протективной активностью при всех режимах введения МКА СПЖ животных в опытных группах, получивших указанные МКА, не превышала СПЖ животных в группах, получивших препарат сравнения - НМИг При введении МКА 7G4 (против эпитопов ЛПС) показатель СПЖ биомоделей в опытных группах превышал таковой в группах биомоделей, получивших препарат сравнения, только при введении МКА в режиме ранней серопрофилактики На рисунке 1 отражены данные скрининговых исследований протективного потенциала МКА при заражении животных 22 LD50F aeruginosa 103Р

В следующих опытах по оценке протективных свойств моноклональ-ных иммуноглобулинов МКА Н-2, 4Е11, 4G4, 4G5, 5D10 не использовали, учитывая результаты скрининговых исследований Препараты МКА 7G4 применяли как компоненты смесей МКА.

При введении МКА в режиме ранней серопрофилактики (за 24 ч до заражения биомоделей культурой Р aeruginosa 103Р) все испытуемые иммуноглобулины обладали выраженным протективным эффектом - процент защиты животных в опытных группах был выше 20 % для всех антител

Препараты

Рисунок 1 Скриниш овые исследования протективвой активйости МКА при различных режимах введения, заражающей дозе 22 ЬО^о Р леги°?пош ЮЗР (НМИг препарат сравнения, КЗ - контроль заражения)

Для МКА 1В7 к эпитопам ПС в составе ЛПС и для МКА 4D2 и 3F5 к эпитопам ЭТА Р aeruginosa показатель процента защиты животных был стабильно высоким и составлял 50% и более при всех заражающих дозах В группах животных, получивших эти препараты, отмечено достоверное увеличение сроков СПЖ биомоделей относительно сроков СПЖ животных, получивших препарат сравнения (р<0,05)

При введении моноклональных иммуноглобулинов в режиме экстренной серопрофилактики и серотерапии протективным эффектом обладали только МКА против эпитопов ЭТА, причем стабильное увеличение показателя процента защиты животных от 33 до 67 % при различных заражающих дозах отмечено только для МКА 3F5 На рисунке 2 представлены значения показателя процента защиты животных при оценке протективных свойств испытуемых МКА

При оценке протективных свойств смесей МКА установлено, что их введение для защиты животных от синегнойной инфекции наиболее эффективно в режиме ранней серопрофилактики Наилучшим протективным эффектом обладают смеси МКА, компоненты которых обладают протективными свойствами при использовании их в качестве монопрепаратов Отмечено преимущество липосомальных форм смесей МКА по сравнению с аналогичными изолированными препаратами На рисунке 3 представлены данные показателя процента защиты животных для смесей МКА

Сочетанное использование препаратов иммуноглобулинов и липосо-мального гентамицина для защиты биомоделей от синегнойной инфекции было особенно эффективным при введении МКА в режиме серотерапии Отмечен синергизм действия антибиотика и иммуноглобулинов для всех МКА, смесей МКА Для МКА 4D2, смеси МКА 3F5+5F10, взаимодействующих с эпитопами ЭТА отмечено стойкое увеличение показателя процента защиты животных от 33 до 67 % при всех заражающих дозах Протективные свойства препаратов (процент защиты) при сочетанном применении МКА и антибиотика представлены на рисунках 4,5

При сравнении результатов исследований протективной активности МКА, смесей МКА, сочетаний иммуноглобулинов и антибиотика гентамицина в липосомальной форме установлено, что стабильным протективным эффектом при всех режимах введения обладают МКА 3F5 против эпитопов ЭТА Р aeruginosa 103Р, смесь МКА против эпитопов ЭТА 3F5+5F10 в липосомальной форме, а также сочетание МКА 5F10 и 4D2 против эпитопов ЭТА с липосо-мальным гентамицином Для всех этих препаратов показатель процента защиты животных был выше 20 % при всех режимах введения

Для монопрепаратов МКА и смесей МКА оптимальным режимом введения явился режим ранней серопрофилактики В режиме экстренной серопрофилактики эффективным было лишь введение МКА 3F5, 5F10, 4D2 против эпитопов ЭТА и их смесей в липосомальной форме 3F5+5F10 и 3F5+4C12

Сочетанное применение МКА, их смесей и липосомального гентамици-на обеспечивало защиту животных особенно эффективно при введении иммуноглобулинов в режиме серотерапии.

Данные показателей процента защиты животных для различных препаратов приведены в таблице 4

Анализ результатов всех проведенных экспериментов позволил установить, что МКА против различных антигенов синегнойной палочки обладают различными протективными свойствами и более эффективны в качестве средств профилактики экспериментальной синегнойной инфекции Наиболее перспективными образцами с высокими показателями протективной активности являются МКА 3F5, 4D2, 5F10 против эпитопов ЭТА Р aeruginosa

В последнее время в связи с обсуждением целесообразности применения специфических антител для создания пассивной защиты макроорганизма от патогенов, ряд авторов высказывают мнение о более высоком потенциале МКА как средств профилактики инфекции, нежели как средств лечения (Casadevall А , 1996, Zeitlm L , 1999, Reichert J М , 2001)

Представленные в настоящей работе экспериментальные данные могут служить демонстрацией эффективности профилактического применения МКА при синегнойном сепсисе Учитывая способность Р aeruginosa к персистен-ции в фагоцитах (Pier G В et al, 1989), использование МКА с высокими показателями протективного потенциала в качестве средств профилактики, предупреждающих колонизацию внутриклеточной ниши, может явиться важным звеном в общей схеме мероприятий, направленных на уменьшение последствий инфицирования синегнойной палочкой

Таким образом, в соответствии с целью и задачами работы было выполнено комплексное исследование протективных свойств моноклональных антител, взаимодействующих с различными антигенами Р aeruginosa

Получены новые данные о роли гуморальных антител в защите макроорганизма от синегнойной инфекции Впервые изучен протективный потенциал моноклональных иммуноглобулинов против различных антигенов Р aeruginosa, представлены доказательства эффективности пассивной защиты биомоделей от экспериментальной синегнойной инфекции

Определены варианты МКА, обладающие высокой протективной активностью при создании пассивного иммунитета у экспериментальных животных при синегнойном сепсисе

Получены приоритетные данные о создании гибридных клонов-продуцентов мышиных моноклональных антител против эпитопов ЭТА Р aeruginosa, определены особенности получения иммунных В-лимфоцитов мышей, выбора партнеров при гибридизации клеточных линий Представлены приоритетные данные об условиях выделения и накопления экзотоксина А Р aeruginosa, оценке его биологической активности m vivo и m vitro

100-эо-80706050403020100

□ Введение за 2 ч

& & «Р <<с ^

Препараты Препараты

Рисунок 2 Прагективная активность (% защиты) МКА при заражении животных ! 71Х>50 и 25ЬО$о Р. аеги^пют 103Р

100-1 90-

□ Введение за 24 ч ® Введение за 2 ч ■ Введение через 24 ч

юоп an-Borneo -

50 АО-

гО-гО-100

' ^r ■

□ Введение за 24 ч

□ Введение за 2 ч

К Введекмс через 24 ч

J

L—F.

ПГ !г

Vя V

Смеси МКА

□ Введение за 24 ч

□ Введение за 2 ч

SI Введение через 24 ч

Рисунок 3 Протектнвная активность (% защиты)смесей МКА при заражении животных :22LDsu и 25LD5n P. aeruginosa )()ЗР (JIG лимосомальнуя фирма препарата)

2

Л

п

^ # ^ ^ * ^ / ^ ^

^ 4 4

Препараты + ЯГ

100 90 807060 50403020

□ Введение за 24 ч П Введение за 2 ч

через 24 ч

Рисунок 4 Протекли иная активность (% защиты) препаратов при сочсгат юм применении моноклоинльн ых иммуноглобулин но и и Шпосомал ьн ого гситамнцина при заражении животный Г-21 Р йеги%то$а ШЗР (ЛС ■ липосомалышя форма препарата)

□ Введение за 24 ч

□ Введение за 2 ч

9 Введение через 24 ч

Препараты + ЛГ

100-, 9080-

Рисунок 5 Протективная активность (% защиты) препаратов при сочетанним применении моноклонадьньнс иммуноглобулинов и л и посрмал ьно го гентамицииа при заражении животных 271,0,, /-' аеги^тона 103 Р (ЛС л и посомал ьная форма препарата)

Таблица 4 - Обобщенные данные максимальных показателей процента защиты биомоделей при оценке протективной активности МКА,

смесей МКА, сочетаний иммуноглобулинов и липосомального гентамидина сульфата

Наименование МКА, смесей МКА, сочетаний иммуноглобулинов с ЛГ Эпитопная направленность Режим введения иммуноглобулинов

за 24 ч до заражения за 2 ч до заражения через 24 ч после заражения

1В7 ПС в составе ЛПС 67* 17 17

2А2 50 17 17

508 ЛПС 50 17 0

5И0 ЭТА 50* 50* 17

402 67* 33 17

ЗГ5 83* 67* 50*

1В7+2А2+7С4 ПС в составе ЛПС + ЛПС 0 0 0

1В7+5Б8 83* 0 0

ЗР5+5Р10 ЭТА 50 17 0

ЗР5+4С12 33 0 17

ЗР5+5П0ЛС ЭТА 33 50* 33

ЗР5+4С12ЛС 67* 67* 17

1В7 + ЛГ ПС в составе ЛПС 33 17 33

2А2+ЛГ 17 17 50*

5Б8+ ЛГ ЛПС 17 17 33

5П0+ ЛГ ЭТА 50* 33 50*

4Б2+ ЛГ • 33 33 50*

ЗР5+ЛГ г 1 л О.? 17 33

1В7+2А2+7С4+ ЛГ " ПС в составе ЛПС + ЛПС 0 0 33

1В7+5В8+ ЛГ 33 17 33

ЗР5+5И0+ ЛГ ЭТА 50* 17 67*

ЗР5+4С12+ ЛГ 33 17 33

ЗГ5+5И0 ЛС+ ЛГ ЭТА 33 33 33

ЗК5+4С12ЛС+ ЛГ 17 33 33

Примечание ЛГ - нтамицина сульфат в липосомальной с * - достоверное увеличение сроков СПЖ животных в опьп препарата сравнения юрме ных группах (р<0,05) относительно сроков СПЖ животных в группах

Впервые изучен протективный потенциал МКА, включенных в липо-сомы, оптимизированы схемы комбинированного использования монокло-нальных иммуноглобулинов и гентамицина сульфата, включенного в липосо-мы, для профилактики и лечения экспериментальной синегнойной инфекции

Полученные данные являются доказательствами перспективности использования МКА для защиты от экспериментального синегнойного сепсиса и позволяют говорить о прототипах МКА, которые в перспективе могут быть рекомендованы для клинического применения как средства иммунопрофилактики и иммунотерапии синегнойной инфекции

Выводы

1 Впервые получены мышиные моноклональные антитела против эпитопов экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa 103Р, обладающие высоким протективным потенциалом при воспроизведении экспериментального синегнойного сепсиса на белых мышах

2 Моноклональные антитела против антигенов синегнойной палочки обеспечивают защиту биомоделей от острой синегнойной инфекции (сепсиса) в эксперименте, увеличивая в ряде случаев выживаемость биомоделей до 83 %

3 Условиями эффективной гибридизации клеточных линий при получении МКА против эпитопов ЭТА Р aeruginosa являются непродолжительный цикл иммунизации мышей-доноров B-лимфоцитов малыми дозами антигена, определение суммарной дозы экзотоксина А на основании данных теста цитотоксичности ЭТА для клеточных линий СНО-К1 и L929, использование клеток мышиной миеломы Sp2/0

4 Моноклональные антитела различной эпитопной направленности обладают различным протективным потенциалом МКА против поверхностно расположенных эпитопов Р aeruginosa (липополисахарида, полисахарида в составе ЛПС) обладают менее выраженной протективной активностью по сравнению с МКА против эпитопов ЭТА Р aeruginosa Использованные в работе моноклональные иммуноглобулины против эпитопов белков наружной мембраны синегнойной палочки не обеспечивают защиту биомоделей от синегнойной инфекции

5 Наиболее эффективным способом защиты биомоделей от острой синегнойной инфекции является профилактическое применение МКА, а соче-танное использование МКА и антибактериального препарата оптимально при ранних сроках лечения

6 Впервые проведено включение МКА в липосомы Установлено, что применение липосомальной формы моноклональных антител против эпитопов ЭТА синегнойной палочки в режиме профилактики обеспечивает защиту экспериментальных животных от синегнойной инфекции

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1 Ободова М А, Храпова Н П, Ротов К А, Ломова Л В , Ломтатидзе М В , Снатенков Е А Оценка протективности моноклональных антител против антигенов Pseudomonas aeruginosa на модели экспериментального синегнойного сепсиса (методические рекомендации) // В реф сб «Метод документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ» - Саратов, 2003 - С 24

2 Нарбутович Н И , Храпова Н П , Ломова Л В , Ломтатидзе М В , Ободова М А , Абраменко А В Определение влияния моноклональных антител на ферменты синегнойной палочки (методические рекомендации) // В реф сб «Метод документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ» - Саратов, 2003 - С 25

3 Ломтатидзе М В , Храпова Н П, Ломова Л В , Самыгин В М , Жога Л К , Крючкова Т П , Ободова М А Получение гибридом-продуцентов моноклональных антител к липополисахариду и экзотоксину А синегнойной палочки (методические рекомендации) // В реф сб «Метод документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ» -Саратов, 2003 - С 25-26

4 Ободова М А , Храпова Н П , Ротов К А, Ломова Л В , Ломтатидзе М В , Снатенков Е А Серопрофилактика синегнойной инфекции в эксперименте // В реф сб «Метод документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ» - Саратов, 2003 - С 54 -55

5 Ломтатидзе М В , Храпова Н П, Тихонов Н Г, Самыгин В М, Ломова Л В , Жога Л К , Ротов К А , Савченко С Т , Снатенков Е А , Ободова М А, Крючкова Т П Получение моноклональных антител к липополисахариду и экзотоксину А синегнойной палочки // В реф сб «Метод документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ» - Саратов, 2003 -С 55

6 Нарбутович Н И, Храпова Н П , Тихонов Н Г, Самыгин В М, Жога Л К , Ломова Л В , Снатенков Е А , Ломтатидзе М В , Ободова М А , Абраменко AB Оценка антиферментной активности моноклональных антител, взаимодействующих с антигенами // В реф сб «Метод документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ» - Саратов, 2003 - С 56

7 Ободова М А , Храпова Н П, Ломтатидзе М В , Снатенков Е А Серопрофилактика синегнойной инфекции в эксперименте // Тез докл Матер XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство» -М,2004 - С 466

8 Ободова М А , Храпова Н П, Ломтатидзе М В , Снатенков Е А Протек-тивность моноклональных антител против различных антигенов синегнойной палочки в эксперименте // Мат Всеросс науч -практ конф «Медицинская микробиология-XXI век» (28-30 09 2004 г) - Саратов, 2004 - С 165-166

9 Ободова М.А, Храпова Н П, Ломтатидзе М В , Ломова Л В , Самыгин Л К , Жога Л К Получение моноклональных антител к эзотоксину А синегнойной палочки и оценка их протективных свойств // Вестник ВГМУ - Волгоград, 2004 - Вып 12 - С 14-16

10 Ободова М А , Храпова Н П Ломова Л В , Самыгин В М , Жога Л К , Снатенков Е А, Чупрына Н А , Замарин А А, Кувшинова А Д Получение моноклональных антител к экзотоксину А синегнойной палочки и оценка их протективных свойств // Матер VI Межгос науч - практ конф «Санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств проблемы биологической безопасности и противо-действия биотерроризму в современных условиях» (13-14 09 2005 г) - Волгоград, 2005 - С 171-173

11 Ободова М А , Храпова Н П, Снатенков Е А, Ломова Л В , Нарбутович НИ Серопрофилактика синегнойного сепсиса в эксперименте // Проблемы особо опасных инфекций - Саратов, 2006 -Вып 91 -С 66-69

12 Ободова МА, Храпова НП, Ломова ЛВ, Снатенков ЕА, Самыгин Л К , Жога Л К Получение моноклональных антител к различным антигенам Pseudomonas aeruginosa и сравнительная оценка их протективных свойств // Сб тез науч -практ конф молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» — Санкт-Петербург, 2006 - С 279 - 280

13 Ободова М А , Храпова Н П , Ротов К А Снатенков Е А Ломова Л В Протективные свойства моноклональных антител против различных антигенов синегнойной палочки в эксперименте // Тез докл Мат IX съезда Всеросс науч -практ общ эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (ВНОЭМП) (26-27 04.2007 г) Москва, Санэпидмедиа, 2007 -т2 -С 62-63

Подписано в печать 03 10 2007 г Формат 60x84/16 Бумага офсетная Гарнитура Тайме Уел печ л 1,0 Тираж 100 экз Заказ 295

Издательство Волгоградского государственного университета 400062, г Волгоград, просп Университетский, 100