Получение, характеристика и применение моноклональных антител к антигенам синегнойной палочки

Ломтатидзе, Марина Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение, характеристика и применение моноклональных антител к антигенам синегнойной палочки
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Получение, характеристика и применение моноклональных антител к антигенам синегнойной палочки"

На правах рукописи

ЛОМТАТИДЗЕ Марина Владимировна

ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА И ПРИМЕНЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К АНТИГЕНАМ СИНЕГНОЙНОЙ ПАЛОЧКИ

03.00.07 - микробиология 14.00.36 — аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва — 2004

Работа выполнена в Волгоградском научно-исследовательском противочумном институте Министерства здравоохранения Российской Федерации и ГУ НИИ вакцин и сывороток им. Мечникова РАМН.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация

доктор медицинских наук Н.П.Храпова;

кандидат медицинских наук В.В. Свиридов.

доктор медицинских наук, профессор АФ. Мороз;

доктор биологических наук К.Г. Каверина.

Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича.

Защита состоится 23 сентября 2004 г. в 14 час. на заседании диссертационного совета Д 001.38.01 при ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., 5а.

Автореферат разослан 23 августа 2004 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

И.В.Яковлева

2005-4 12669

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Проблема внутрибольничного инфицирования приобретает во всем мире все большую медицинскую и социальную значимость (Покровский В. И. с соавт., 1999; Семина Н.А., 2001; Храпу-нова И.А., 2002). Повышение внимания к данной проблеме связано с регистрируемым в последние годы ростом тяжелых осложнений в стационарах различного профиля, обусловленных циркуляцией в них штаммов микроорганизмов с высоким уровнем резистентности к химиопрепаратам, что связано с широким и зачастую бесконтрольным применением антибиотиков (Hirakata с соавт., 1998; Susan Е. Н. с соавт., 2002; Igumbor E. с соавт., 2000; Blahova, J. с соавт., 2001; Harris Anthony D., с соавт., 2002). Синегнойная палочка — одна из наиболее частых причин возникновения внутрибольничных (нозокомиальных) инфекций: пневмоний, раневой инфекции, бактериемии, поражения мочевыводящих путей и прочей патологии (Stanislavsky E., 1998; Семина Н.А., с соавт., 2000; Рафиев Х.К., 2001). В структуре внутрибольничных инфекций как возбудителя и причину тяжелых осложнений ее идентифицируют в 16—36% случаев (Монисов А.А., 2000; Губернаторов В.В., 2002; Евстропов А.Д., 2002). Ввиду повсеместной распространенности микроорганизма мониторинг внешней среды отделений стационаров и идентификация циркулирующих возбудителей являются жизненно важной проблемой практического здравоохранения.

Традиционные бактериологические методы выявления и идентификации патогенов обеспечивают получение ответа в сроки не ранее 2-3 суток от момента взятия материала для исследования, что порой задерживает начало адекватной терапии. В связи с этим особую значимость приобретает вопрос об использовании методов экспресс-анализа проб клинического материала и объектов внешней среды (Митрохин С.Д., 2000; Савицкая К.И., 2001). В нашей стране в практических лабораториях методы экспресс-выявления P.aeruginosa не применяются ввиду их отсутствия.

Перспективы совершенствования эпиднадзора за внутриболь-ничными инфекциями и системы контроля микробного пейзажа медицинских учреждений напрямую связаны с разработкой и применением быстрых, достоверных и доступных методов обна-

ружения и идентификации патогенных микроорганизмов. К их числу относятся, в первую очередь, такие иммунохимические методы, как ИФА1 (в различных его вариантах) и ИФлА.

В наибольшей степени требованиям, предъявляемым к реагентам, используемым при конструировании иммуноферментных и иммунофлуоресцентных диагностикумов, отвечают монокло-нальные антитела. Постоянство иммунохимических свойств выгодно отличает МкАт от поликлональных антисывороток, а использование моноклональных диагностикумов обеспечивает исключительную специфичность, существенное повышение чувствительности и сокращение времени анализа.

Использование иммунохимических методов при исследовании микроорганизмов предусматривает (в зависимости от преследуемых целей) применение антител, обладающих специфичностью к родовым, видовым или иным антигенным структурам. Для выявления и дифференциации P. aeruginosa от других псевдомонад необходимы антитела, обладающие видовой специфичностью. В качестве таковых могут быть использованы антитела, направленные к видоспецифичным белкам наружной мембраны возбудителя, ЛПС или ПС.

Цель и задачи исследования

Цель исследования — получение МкАт к диагностически значимым видоспецифичным антигенам синегнойной палочки и изучение возможности создания на их основе высокоэффективных препаратов, пригодных для экспресс-анализа проб из объектов внешней среды и клинического материала.

1 Использованные сокращения: Аг — антиген; АЖ — асцитная жидкость; ВСЭ - водно-солевой экстракт; ИПК — иммунопероксидаз-ный конъюгат; ИФлА - иммунофлуоресцентный анализ; КЖ-культу-ральная жидкость; КС - клеточная стенка микроорганизма; ЛПС — липополисахарид; МИБП - медицинские иммунобиологические препараты; м.к. — микробная (-ые) клетка(-и); М&Ат — моноклональные антитела; МПА — мясо-пептонный агар; ОП — оптическая плотность; ПкАт — поликлональные антитела; ПС — полисахарид; ПХ — перок-сидаза хрена; РНАт — реакция нейтрализации антител; РИГА — реакция непрямой гемагглютинации; ИФА - иммуноферментный анализ; УЗД — ультразвуковой дезинтеграт микробных клеток; ФИТЦ флуоресцеинизотиоцианат.

Задачи исследования:

1. Подобрать схемы иммунизации мышей антигенными препаратами P. aeruginosa, оптимальные для получения гибридом-продуцентов антисинегнойных антител.

2. Разработать систему скрининга гибридных культур для отбора продуцентов антител к антигенам P.aeruginosa.

3. Провести эксперименты по слиянию иммунных спленоци-тов с клетками мышиных миелом P3-X63-Ag8.653 и Sp 2/0 и оценить эффективность гибридизации и количество образующихся при этом культур-продуцентов антител.

4. Провести клонирование гибридных культур и на основе отбора технологичных клонов создать коллекцию стабильных гибридом, синтезирующих антитела к антигенам P.aeruginosa.

5. Оценить специфическую активность МкАт в отношении типовых штаммов P.aeruginosa и гетерологичных псевдомонад в ИФА и ИФлА и выявить природу комплементарных лигандов.

6. Наработать в препаративных количествах МкАт к эпито-пам, экспонированным на клеточной стенке P.aeruginosa.

7. На основе антисинегнойных МкАт приготовить экспериментальные образцы иммунодиагностических препаратов для ИФлА и ИФА и оценить их специфичность и активность.

8. Провести сравнительный анализ эффективности применения ФИТЦ-меченых препаратов моно- и поликлональных антител для экспресс-обнаружения P.aeruginosa в пробах клинического материала и из объектов внешней среды.

Научная новизна

Создана первая отечественная коллекция стабильных гибри-дом-продуцентов МкАт к антигенам P.aeruginosa, локализованным на поверхности микробных клеток. С помощью МкАт уточнена структурная организация иммунореактивных компонентов P.aeruginosa, имеющих диагностическое значение.

Представлены доказательства преимущества применения мо-ноклональных иммуноглобулинов, по сравнению с поликлональ-ными, при изготовлении диагностических средств, предназначенных для обнаружения и идентификации P.aeruginosa в клиническом материале от больных и пробах из объектов внешней среды.

Впервые с применением МкАт исследованы пути и скорость диссеминации микробных клеток при моделировании экспериментального синегнойного сепсиса.

Практическая ценность

1. Создана и сохраняется в криобанке ВолгНИПЧИ панель клонов гибридом-продуцентов антител к диагностически значимым антигенам P. aeruginosa.

2. Созданные на основе моноклональных антител иммуно-ферментный и иммунофлуоресцентный диагностикумы позволяют в течение 4-6 час. от момента взятия материала на исследование с высокой специфичностью и чувствительностью выявлять и идентифицировать P.aeruginosa в клиническом материале от больных и пробах из объектов внешней среды. Разработанные экспресс-методы анализа служат основой для изменения общепринятой тактики лабораторных исследований, направленных на выявление внутрибольничных штаммов P.aeruginosa и проведение профилактических мероприятий по санации помещений.

Разработаны и утверждены Ученым советом ВолгНИПЧИ (протокол № 6 от 25.06.2003 г.) «Методические рекомендации по применению метода флуоресцирующих антител для экспресс-обнаружения синегнойной палочки в пробах из объектов внешней среды стационаров».

3. Особенности экспериментов по получению моноклональных антител к антигенам P.aeruginosa отражены в одобренных Ученым советом ВолгНИПЧИ «Методических рекомендациях по получению гибридом-продуцентов МКА к антигенам синегной-ной палочки» (протокол № 14 от 27.12.2000 г.) и «Методических рекомендациях по получению гибридом-продуцентов МКА к ЛПС и экзотоксину А синегнойной палочки» (протокол № 6 от 5.06.2002 г.), предназначенных для сотрудников специализированных биотехнологических лабораторий.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Создана первая отечественная коллекция технологичных гибридом-продуцентов моноклональных антител к диагностически значимым водорастворимым антигенам микробных клеток и ЛПС P.aeruginosa.

2. Разработанные на основе использования моноклональ-ных антител реагенты для иммуноферментного и иммунофлуо-ресцентного методов анализа позволяют без выделения чистой культуры ускоренно выявлять синегнойную палочку и ее антигены в клиническом материале от больных и пробах из объек-

тов внешней среды. По показателям специфичности и чувствительности разработанные тесты существенно превосходят тесты, основанные на использовании поликлональных антител.

Апробация работы

Материалы, изложенные в диссертации, доложены на конференции молодых ученых НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова (Москва, 1998г.), юбилейной конференции, посвященной 30-летию ВолгНИПЧИ (Волгоград, 28—29 ноября 2000 г.), IV научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2000», (Санкт-Петербург, 23— у 25 мая 2000 г),к*ЛЧкО.Г ЪакгНИМЦ. Ш^К.Об.Оч).

Публикации

Основные положения диссертации отражены в 12 печатных работах.

Объем и структура диссертации

Диссертация общим объемом -/ОЗ. с. состоит из введения, ♦ обзора литературы,*" глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литера-

туры (131 ист. отеч. и заруб.). Текст диссертации содержит 15 таблиц и 1 рисунок.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В работе использовали 14 типовых штаммов P. aeruginosa, 4 штамма P.cepacia, 4 штамма P.fluorescens, 2 штамма P.putida и по одному штамму P.alcaligenesf P.pseudoalcaligenes, P.stutzeri, P.fragii, P.liquefaciens, P.ovalis из коллекции лаборатории поддержания живых культур Волгоградского НИПЧИ. Микроорганизмы выращивали на плотных питательных средах: МПА с 5% глицерина, рН 6,8 при 37°С и на триптиказо-соевом агаре производства фирмы Difco с добавлением 5 % глицерина.

Клетки псевдомонад, обеззараженные физическими и химическими методами, ультразвуковые дезинтеграты клеток, водно-солевые экстракты и липополисахариды P.aeruginosa использовали для получения иммунных спленоцитов мышей и антиси-негнойной сыворотки кроликов. Эти же антигенные препараты применяли для сенсибилизации планшетов при выполнении ИФА и в качестве референтных в иммуноблоттинге.

Поликлональные иммунные сыворотки к антигенам P.aerugi-nosa получали, используя несколько схем иммунизации кроликов массой 2,5—3 кг; активность сывороток оценивали в реакции иммунодиффузии с антигенными препаратами P.aeruginosa. Выделенные из сыворотки поликлональные иммуноглобулины метили ФИТЦ или пероксидазой и использовали как препараты сравнения при оценке конъюгатов моноклональных антител.

Кроликов иммунизировали также иммуноглобулиновой фракцией сыворотки мышей при получении антивидовых сывороток и приготовлении (по методу Янкиной Н.Ф. и Ванеевой Л.И., 1985) пероксидазных конъюгатов антител к иммуноглобулинам мыши для выявления антителопродуцирующих гибридных культур и оценки активности МкАт.

При моделировании синегнойного сепсиса использовали белых крыс».. .

Мышей линии BALB/c (массой 14—16 г, обоего пола) использовали для получения иммунных лимфоцитов, применяя несколько схем иммунизации. Каждая схема иммунизации включала 3—4 инъекции препаратов. Для первой инъекции использовали смесь антигена с неполным адъювантом Фрейнда, для последующих — только антиген. Бустирующую дозу антигенов вводили внутриселезеночно или внутрибрюшинно или сочетая внутриселезеночное и внутримышечное введение препарата за 3—4 дня до гибридизации спленоцитов.

Мыши BALB/c использовались также для получения подкормочных клеток и для культивирования клеток гибридом in vivo и накопления МкАт в асцитах.

При гибридизации спленоцитов в качестве злокачественного партнера использовали клетки мышиных миелом РЗ-Х63-Ag8.653 и Sp 2/0, полученные из «Банка клеточных культур» Института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург).

Для скрининга МкАт заданной специфичности использовали непрямой вариант ИФА: Аг + искомые Ат+ антивидовой ИПК. Условия проведения ИФА на всех этапах анализа соответствовали общепринятым требованиям (Oellerich M., 1984).

Электрофоретическое разделение антигенных препаратов проводили в 12,5% ПААГ-SDS (Laemmli, 1970). Специфичность МкАт исследовали в иммуноблоттинге (Tovey E.R. с соавт., 1987).

Метку МкАт ферментом проводили по методу Mathiesen с соавт. (1978), используя ПХ с RZ не менее 3.0.

Метку МкАт флуорохромом проводили по методу I.D.Marshall et al. (1958), варьируя нагрузку ФИТЦ на 1 г белка, рН среды и время конъюгирования иммуноглобулинов с флуорохромом. Расчет показателей концентрации белка и молярного соотношения Мфвтц/^белок проводили по формулам (The Т.Н., Feltkamp T.E.W., 1970). Свойства меченных флуорохромом иммуноглобулинов оценивали по результатам ИФлА, который проводили общепринятым способом с использованием фиксированных мазков-препаратов клеток типовых штаммов синегнойной палочки и гете-рологичных псевдомонад, приготовленных из взвесей микробов с концентрацией 5-Ю8- 109 м.к./мл, а также при исследовании клинических изолятов возбудителей, смывов с объектов внешней среды, мазков-отпечатков органов и тканей зараженных животных при моделировании синегнойного сепсиса.

Для оценки эффективности применения ИФА с целью обнаружения синегнойной палочки и ее антигенов использовали сэндвич-вариант метода: Атх + искомый Аг + ИПК в рабочем разведении. В качестве первых антител использовали поли- или мо-ноклональные иммуноглобулины, в качестве антигена — взвеси псевдомонад, обеззараженные формалином или автоклавиро-ванием, УЗ-дезинтеграты клеток, ВСЭ, ЛПС синегнойной палочки; иммунопероксидазные конъюгаты готовили также на основе моно- и поликлональных антител.

Основные результаты исследования и их обсуждение

Одним из направлений в совершенствовании лабораторной диагностики возбудителей инфекционных заболеваний является разработка и внедрение в практику новых методов и средств обнаружения патогенных микроорганизмов. Для выявления си-негнойной палочки наиболее перспективным направлением работ признано конструирование высокоактивных и высокоспецифичных иммунодиагностических препаратов на основе МкАт. За рубежом такие препараты получены и успешно применяются. В нашей стране подобные исследования до последнего времени не проводились.

Получение гибридом-продуцентов антител к диагностически значимым антигенам P.aeruginosa потребовало оптимизации условий проведения ряда предварительных этапов, в частности, подбора наиболее эффективных схем иммунизации мышей и получения стимулированных спленоцитов — одного из партнеров

при слиянии клеток, а также выбора метода скрининга гибридных культур для выявления антителопродуцентов.

В качестве последнего был использован непрямой вариант ИФА, удовлетворяющий требованиям специфичности и высокой чувствительности при выявлении минимальных концентраций белка в пробе. Оптимизация условий постановки ИФА состояла в подборе серий антигенных препаратов (ВСЭ и Л ПС), которые применялись для адсорбции на твердой фазе, и образцов поликлональных мышиных сывороток (заведомо положительный контроль). При сенсибилизации планшетов использовали растворы Аг с концентрацией (по белку) 10—20 мкг/мл. Существенных отличий при использовании различных типов планшетов (Greiner, Dynatech, Медполимер) не зарегистрировано. Преимуществом ИФА являлась возможность одномоментного исследования большого числа проб каждые 3—4 дня, что выгодно отличало его от непрямого ИФлА, который как метод скрининга был использован в ограниченном объеме.

Сравнение девяти использованных схем иммунизации мышей УЗ-дезинтегратами микробных клеток, ВСЭ и ЛПС P.aeruginosa, полученных из штаммов Н-1, Н-2, Н-6, Н-11, с эффективностью гибридизации стимулированных этими антигенами спленоцитов с миеломными клетками и выходом активных и стабильных антителопродуцентов позволило установить, что при получении гибридом-продуцентов антител к Аг P.aeruginosa не следует применять длительные циклы иммунизации мышей. При этом антигенная нагрузка на одно животное не должна превышать 2,6409 м.к., а для препаратов ЛПС — не более 0,1—0,2 мг ПС при числе инъекций 3—4. Бустерную инъекцию предпочтительнее делать внутриселезеночно за двое (ЛПС) или трое суток (УЗ-дезинтеграты м.к., ВСЭ) до слияния. Установлено, что сочетанное применение цельных микробных клеток и растворимых антигенов при стимуляции В-лимфоцитов мышей повышает эффективность получения антителопродуцен-тов (до 7 %).

Во всех опытах по получению гибридом-продуцентов МкАт к эпитопам, экспонированным на водорастворимых биополимерах, изолированных из м.к., зарегистрирована быстрая утрата анти-телопродукции большинством из первично-позитивных (по результатам 3-кратного тестирования в ИФА) культур. Из сотен вариантов первичных гибридом для последующего клонирования были отобраны 37 культур-продуцентов Ат с наиболее вы-

сокими показателями активности иммуноглобулинов в ЙФлА. Клонирование в ранние сроки позволило стабилизировать функцию Ат-продукции у 9 клонов-продуцентов МкАт (1В7, 4С11 H-2/G3, 4G4, 2А2, 4Е11, 4G5, 4G8, 4G11).

Следует отметить, что наибольшие трудности возникли при получении МкАт к липополисахариду P.aeruginosa. Судя по высоким показателям титров сывороточных антител у мышей-доноров спленоцитов, можно было ожидать выхода большого числа продуцентов антител к ЛПС. Однако результативность опытов в этой серии экспериментов оказалась более низкой по сравнению с опытами первой серии. При высокой эффективности гибридизации и первоначально большом числе синтезирующих Ат гибридных культур, отмеченных в течение первого месяца культивирования, способность к длительному синтезу антител сохранили лишь немногие культуры. Стабилизация продукции МкАт была достигнута при работе лишь с тремя гибри-домами, полученными при использовании в качестве злокачественного партнера миеломы Sp 2/0.

В целом после проведения двух серий опытов по гибридизации была создана первая отечественная коллекция из 12 стабильных перевиваемых на мышах гибридом, синтезирующих МкАт против антигенов P.aeruginosa. Все коллекционные варианты гибридом, клонированные не менее двух раз, постоянно хранятся в жидком азоте в биохранилище Волгоградского НИПЧИ.

Получение стабильных гибридом-продуцентов МКА к антигенам синегнойной палочки способствовало успешному решению ряда задач данного исследования — определению спектра их специфической активности в отношении типовых штаммов P.aeruginosa (12 штаммов по классификации Habs) в ИФА и ИФлА, отбору вариантов МкАт для иммунофлуоресцентного и иммуноферментного анализов, оценке пригодности МкАт различной эпитопной направленности для создания на их основе иммунодиагностических препаратов, проведению сравнительного анализа параметров качества новых средств с поликлональ-ными аналогами, анализу возможности применения ИФлА с поли- и моноклональными препаратами при исследовании проб клинического материала и из объектов внешней среды.

При изучении свойств 12 типов МкАт, выделенных из среды культивирования гибридом in vitro и из асцитных жидкостей при выращивании продуцентов in vivo, установлено, что все они принадлежат к классу IgG (табл.1). При этом 2 варианта МкАт

относятся к ^03 (1В7 и 4С11), 2 варианта — к ^01 (И-2/03, 404) и 8 вариантов МкАт — к изотипу ^02Ъ (2А2, 4Е11 405, 408, 4011, 5Б8, 5Б10, 704). Определение изотипа МкАт служило основанием для предварительного прогноза о возможности использования тех или иных МкАт в различных иммунологических методах исследования и особенностях методических приемов при создании на их основе диагностических препаратов.

Таблица 1 Изотипы МкАт и характер их взаимодействия с различными антигенами P. aeruginosa в ИФА

МкАт Изо-тип МкАт Титры МкАт

УЗД PAH-1 УЗД PAH-2 УЗД PAH- б всэ РАН- 2 ВСЭ РАН-3 лпс РАН-2 ЛПС РАН- 6 ЛПС РАН-11

1В7 IgG3 - - 1280 16000 6000 - -

2А2 !§G2b 640 - 20 2000 10000 - - -

H-2/G3 igG1 - - 1280 64000 20000 - - -

4G4 igG, - - 1280 8000 20000 - - -

4С11 IgG3 - - 40 16000 20000 - - -

4Е11 80 10 80 8000 20000 - - -

4G5 !§G2b - - - 16000 20000 - - -

4G8 - - - 16000 20000 - - -

4G11 !§G2b - - - 16000 20000 - - -

5D8 - - 80 160 40 8000 8000 -

5D10 IgG2b - - - 80 - 2000 2000 -

7G4 !§G2b - - - 640 - 40 40 32000

Примечание. "—" — отрицательный результат ИФА.

В случае применения при электрофоретическом разделении ВСЭ Н-3 серовара P.aeruginosa антигенные субстанции проявлялись всеми 12 вариантами МкАт. Пять вариантов из полученных МкАт (4G4, 4Е11, 4G5, 4G8, 4G11) не взаимодействовали в иммуноблоттинге ни с одним из использованных антигенных препаратов P.aeruginosa, приготовленных из клеток иных серо-варов.

Напротив, МкАт 2А2 и H-2/G3 проявляли специфичность в отношении антигенных препаратов P.aeruginosa всех использованных сероваров, за исключением ЛПС Н-5, с которым взаимодействовали МкАт, полученные к липополисахариду возбудителя.

Для идентификации компонентов антигенных препаратов, использованных при электрофорезе в полиакриламидном геле, проводили его окрашивание различными видами красителей: Кумаси R-250 (окрашивание белков), азотнокислым серебром (окрашивание липополисахаридов), фирменным красителем Stains all (окрашивание разных субстанций в различные цвета).

Оказалось, что МкАт 1В7 взаимодействуют с эпитопами, расположенными на полисахаридном компоненте ЛПС с м.м. от 20 до 10 кДа. Остальные 11 вариантов МкАт направлены против эпитопов в составе антигенов с м.м. от 35 до 70 кДа белковой природы.

Активность индивидуальных образцов МкАт в ИФА зависела от типа антигена, адсорбированного на твердой фазе. В образцах МкАт, изолированных из среды культивирования гибридом, она колебалась в пределах 1:80-1:640. МкАт, полученные сульфатным осаждением из асцитных жидкостей, были активны в разведениях 1:104 —1:106 .

Спектр специфической активности различных типов МкАт в непрямом ИФлА являлся показателем плотности гомологичных им эпитопов на поверхности м.к. различных штаммов P.aeruginosa (табл.2). Из 12 вариантов МкАт, полученных при выполнении работы, только МкАт 7G4 не взаимодействовали с поверхностно локализованными структурами м.к. типовых штаммов синегнойной палочки. МкАт 4G8 выявляли эпитоп, экспонированный на поверхности всех типовых штаммов P.aeruginosa. Взаимодействие остальных вариантов МкАт отразило разнообразие спектров специфической активности этих антител в отношении м.к. различных сероваров P.aeruginosa.

При оценке возможности применения полученных препаратов МкАт для экспресс-обнаружения P.aeruginosa все индивидуальные варианты специфических иммуноглобулинов метили пе-роксидазой или флуорохромом. В качестве препаратов сравнения использовали поликлональные аналоги. Изготовление последних осуществляли на основе поликлональных иммуноглобулинов, выделенных из кроличьих сывороток, полученных, согласно разработанным схемам иммунизации животных антигенами синегнойной палочки. Отмечено колебание показателей специфической активности поликлональных антител вследствие вариабельности состава индивидуальных сывороток, что в значительной степени осложняло процесс приготовления стандартных образцов препаратов сравнения.

Таблица 2

Спектр специфической активности МкАт в непрямом

ИФлА

МкАт Типовые штаммы P. aeruginosa

Н-1 Н-2 н-з Н-4 Н-5 Н-б Н-7 Н-8 Н-9 Н-10 Н-11 Н-12

1В7 - - - - + + + - - + +

2А2 - + + + + + - + - + + +

H-2/G3 - + + + + +

4G4 - - + - + + - + - + + +

4С11 - - - - + + + - - + +

4Е11 - - + + + + + - + + +

4G5 - + + - + - +

4G8 + + + + + + + + + + + +

4G11 + - + + + + + + + + +

5D8 - - + + + + + + - + - -

5D10 + + + + + + + - + + +

7G4

Примечание. Концентрация МкАт составляла 25 мкг/мл (по белку); «+» — интенсивность свечения 3+ -4+; «-» — отрицательный результат в непрямом ИФлА.

При решении вопроса о пригодности использования препаратов МкАт в ИФА с целью выявления синегнойной палочки и ее антигенов все типы МкАт конъюгировали с пероксидазой хрена. Полученные образцы ИПК, характеризовавшиеся высокими

показателями специфической активности, использовали в сэндвич-варианте ИФА для выявления синегнойной палочки и ее антигенов. Установлено, что адсорбция на твердой фазе образцов МкАт или их смесей (имитация поликлональных антител) не обеспечивала получения результатов, соответствующих чувствительности метода при выявлении м.к. P.aeruginosa. Наиболее перспективным был признан комбинированный вариант системы диагностики: поликлональные Ат для сенсибилизации твердой фазы («подложка») в сочетании с последующим применением моноклонального ИПК для детекции синегнойной палочки и ее антигенов. Наибольшей чувствительностью обладали имму-ноферментные диагностикумы с моноклональными ИПК 1В7, 2А2 и H-2/G3, позволившие выявить 20-50 нг/мл белка ВСЭ и 103 —104 м.к./мл в формалинизированных взвесях P.aeruginosa.

Помимо высокой чувствительности, все эти диагностикумы были высокоспецифичны, о чем свидетельствовали отрицательные результаты ИФА при постановке реакции с гетерологичны-ми псевдомонадами и бактериями других видов.

Существенное влияние на эффективность обнаружения м.к. P.aeruginosa в исследуемых пробах оказывали условия обеззараживания материала. Этот факт послужил основой для рекомендаций о выборе метода обработки проб, исследуемых с помощью ИФА. Сравнительный анализ результатов ИФА, выполненного со взвесями м. к. P.aeruginosa, обеззараженными формалином и автоклавированием, выявил большую чувствительность метода в случае работы с формалинизированными пробами. Автоклавирование частично инактивирует места связывания специфических иммуноглобулинов с антигенами P.aeruginosa. При этом чувствительность ИФА снижается до 1*106- 1-109 м.к./мл.

Установлено также, что из апробированных в процессе работы вариантов ИФА дот-анализ обладал относительно низкой чувствительностью (106-109 м.к.), что делает его непригодным для использования как скринингового теста на этапах обнаружения P.aeruginosa.

Одним из наиболее эффективных способов обнаружения микроорганизмов в различных пробах из объектов внешней среды является ИФлА. Использование ИФлА для обнаружения P.aeruginosa не практикуют вследствие отсутствия высокоспецифичных препаратов флуоресцирующих антител. Апробация моноклональных диагностических препаратов для ИФлА являлась одной из задач настоящей работы.

Все типы МкАт и поликлональные иммуноглобулины конъ-югировали с флуоресцеинизотиоцианатом. Исключение составлял препарат МкАт 7G4, который при определении специфической активности в непрямом ИФлА с типовыми штаммами си-негнойной палочки не взаимодействовал ни с одним из них, что связано или с отсутствием вообще специфического эпитопа на поверхности клеточной стенки, или с его относительно незначительной плотностью, не обеспечивавшей яркого специфического свечения клеточной стенки микробных клеток при регистрации реакции.

Сравнительный анализ специфической активности поли- и моноклонального препаратов флуоресцирующих иммуноглобулинов выявил более широкий спектр специфической активности первого из них в отношении типовых штаммов P.aeruginosa. Однако поликлональный препарат не проявил строгой специфичности: он перекрестно взаимодействовал с 25% штаммов 9 видов гетерологичных псевдомонад (табл. 3).

В отличие от поликлонального препарата моноклональные флуоресцирующие иммуноглобулины обладали более высокой удельной активностью. Наиболее перспективными вариантами с точки зрения потенциального сырья для создания иммуноди-агностических препаратов для ИФлА оказались МкАт 1В7, H-2/G3, 4G5, 5D8, 5D10, взаимодействующие с эпитопами, локализованными на ПС компоненте ЛПС клеточной стенки представителей вида P.aeruginosa, но не окрашивавшие клетки гете-рологичных видов псевдомонад. В отношении типовых штаммов P.aeruginosa эти препараты обладали более узким спектром специфической активности по сравнению с поликлональным аналогом, окрашивая штаммы 7—9 сероваров P.aeruginosa, имея при этом преимущества в специфичности. Однако при исследовании клинических изолятов синегнойной палочки препарат МкАт 1В7 проявил активность, сопоставимую с активностью поликлонального аналога: оба типа препаратов взаимодействовали с 68 % штаммов, идентифицированных при бактериологическом исследовании как представители псевдомонад. Исследование 87 изолятов, выделенных из проб клинического материала, выявило одинаковые возможности меченых ФИТЦ как поли-, так и моноклональных 1В7 антител.

Получены доказательства пригодности ИФлА с моноклональ-ными препаратами для оценки микробного пейзажа лечебных учреждений.

Таблица 3 Взаимодействие флуоресцирующих моно-и поликлональных иммуноглобулинов диагностических с псевдомонадами

Вил микроорганизма Иммуноглобулины диагностические» флуоресцирующие

Моноклональные Поли-кло-

1В7 Н-2/03 404 405 5Б8 5Б10 наль-ные

1 P.aeruginosa Н -1 - - - + - + +

2 P.aeruginosa Н-2 - - - - - - +

3 P.aeruginosa Н-3 + - - + - + +

4 P.aeruginosa Н-4 - + - - - + +

5 P.aerugino8a Н-5 + + + + — + -

6 P.aeruginosa Н-6 - - — + - -

7 P.aeruginosa Н-7 + + - - - + -

8 P.aeruginosa Н-8 + + + - + + +

9 P.aeruginosa Н-9 - — - - + - +

10 P.aeruginosa Н-10 + — + + - + +

11 P.aeruginosa Н -11 + + - + - + -

12 P.aeruginosa Н-12 + + — + + + +

13 P.aeruginosa РАО — — - - — — +

14 P.aeruginosa 4000 - - - - - - +

1Ь P.cepacia 1934 — — — — — — —

16 P.cepacia 8235 - - - - - - -

17 P.cepacia 8236 - - - - - - -

18 P.cepacia 8240 - - - - - - -

19 P.fluorescens 540 - - - - - - -

20 P.fluorescens 1602 - — — — — — -

21 P.fluorescens 2234 - - - - - - -

22 P.fluorescens 4125 - - - - - - +

23 P.putida 1608 - - + ед.кл - - - -

24 P.putida 2300 - - - - - - +

25 P.pseudoalcalige-

П€3 1300 +

26 P.alcaligenes 4138 - - - - - - -

27 P зШгвп 4136 - + ед.кл. - - - -

28 P fragii 4002 - — - - — — -

29 P.liquefaciens 549 — — - - - - +

30 P.ovalls 899 — - — - — — —

Примечание. «+» — положительный результат ИФлА; «-» — отрицательный результат ИФлА.

Преимущества применения флуоресцирующих моноклональ-ных иммуноглобулинов для обнаружения и идентификации си-негнойной палочки выявлены по результатам исследования 120 различных проб внешней среды трех стационаров: смывов с рук обслуживающего медицинского персонала, с аппаратуры и инструментария и с предметов обихода. Наиболее эффективными реагентами являлись ФИТЦ-конъюгаты на основе МкАт 1В7 и 405. При использовании этих препаратов синегнойная палочка была соответственно выявлена при исследовании 1) смывов с предметов обихода в 32,97 % и 29,78 %; 2) смывов с аппаратуры и инструментария в 25 % и 43,75 %; 3) смывов с рук персонала в 30 % и 40 % исследованных проб.

Таким образом, при использовании моноклональных диаг-ностикумов с ФИТЦ-МкАт 1В7 и 405 синегнойная палочка была выявлена в стационарах почти в одной трети исследованных смывов (в среднем - в 31,6% и 32,5% соответственно), в то время как при использовании поликлонального конъюгата возбудитель был выявлен лишь в 17,27 % исследованных смывов (табл. 4), что свидетельствует о несомненном преимуществе разработанных препаратов МкАт перед поликлональными.

Таблица 4 Эффективность применения ИФлА для экспресс-обнаружения Р.ает^поаа в пробах с объектов внешней среды стационаров

Объекты исследования ФИТЦ-препараты антител

ПкАт М2 1В7 1 Н-2/03 406 5Б10 5Б8

Сводные данные трех стационаров

Предметы обихода 16/86* 31/94 22/94 28/94 25/94 15/94

Аппаратура и инструментарий 3/15 4/16 7/16 7/16 4/16 4/16

Руки обслуживающего персонала 1/9 3/10 3/10 4/10 4/10 3/10

Всего 19/110 38/120 32/120 39/120 33/120 22/120

Примечание. Положительный результат ИФлА — обнаружение в 25 полях зрения не менее 3—5 м.к. с интенсивностью флуоресценции 3+ 4+; * — число положительных находок/общее число исследованных проб.

Особый интерес представляет исследование возможности использования флуоресцирующих моноклональных антител для выявления P.aeruginosa, путей и скорости её диссеминации при воспроизведении экспериментального синегнойного сепсиса. Доказательством этому служат эксперименты на крысах, инфицированных выделенным от больного с остеомиелитом штаммом 73 P.aeruginosa. Животных заражали, вводя подкожно или внут-рибрюшинно LD50 = 8*108 м.к. Через различные интервалы времени после заражения животных умерщвляли и готовили мазки-отпечатки органов и тканей для их исследования в иммуно-флуоресцентном анализе на присутствие возбудителя. С помощью ФИТЦ-препаратов МкАт ^2^3, 4G5 и 5D10 возбудитель был обнаружен в почках, селезенке и брыжейке уже в первые часы после заражения, а через 12 ч зарегистрировано обсеменение всех исследованных органов и тканей животных.

Таким образом, моноклональные ФИТЦ-диагностикумы позволяют с высокой специфичностью и чувствительностью выявлять синегнойную палочку не только в смывах с различных объектов, но и в тканях инфицированного организма, что, по-видимому, может оказаться полезным и при исследовании био-псийного материала, и при оценке обсемененности тканей си-негнойной палочкой в ходе хирургических вмешательств.

В результате проделанной работы продемонстрированы возможности использования МкАт к эпитопам, экспонированным на поверхности м.к. синегнойной палочки, в качестве основы иммунодиагностических препаратов для ИФлА и ИФА при одномоментном исследовании большого числа разнообразных проб. Получение предварительного ответа при экспресс-обнаружении P.aeruginosa в пробах различного материала до момента получения результатов бактериологического исследования расширяет возможности лабораторных исследований, направленных на совершенствование эпиднадзора за синегнойной палочкой и предупреждение внутрибольничного инфицирования данным микроорганизмом.

Выводы

1. Создана первая отечественная коллекция из 12 стабильных гибридом, секретирующих моноклональные антитела различной эпитопной направленности, взаимодействующие с по-

верхностно локализованными антигенами клеточной стенки P.aeruginosa.

2. Установлено, что для эффективной стимуляции В-лимфо-цитов мышей-доноров спленоцитов препаратами УЗ-дезинтегра-тами, ВСЭ и ЛПС P.aeruginosa необходимо: 1) цикл иммунизации ЛПС проводить не более 3 недель, ВСЭ и УЗД P.aeruginosa — 1,5—2 мес; 2) антигенная нагрузка при иммунизации ВСЭ и УЗД не должна превышать 2,6409 м.к./мл, а для ЛПС — не более 0,1—0,2 мг полисахарида; 3) бустерное введение Аг предпочтительнее осуществлять внутриселезеночно за 2 суток в случае стимуляции мышей ЛПС, за 3 суток — при стимуляции ультразвуковыми дезинтегратами и водно-солевыми экстрактами P. aerugin osa.

3. Антисинегнойные МкАт 1В7, 2А2 и H-2/G3, 4G5, 5D8, 5D10 пригодны для изготовления высокоспецифичных и активных иммунодиагностических препаратов для иммуноферментно-го и иммунофлуоресцентного методов выявления P.aeruginosa и ее антигенов.

4. Комбинированный сэндвич-вариант иммуноферментного анализа, использующий антисинегнойные поликлональные антитела для сенсибилизации планшетов и пероксидазные конъю-гаты МкАт 1В7, 2А2 и H-2/G3 для детекции синегнойной палочки и ее антигенов, позволяет специфически выявлять 1'103~1404 м.к./мл P.aeruginosa.

5. Меченые ФИТЦ МкАт 1В7, H-2/G3, 4G5, 5D8, 5D10 позволяют с высокой специфичностью проводить экспресс-выявление и идентификацию синегнойной палочки в пробах из объектов внешней среды, клинического материала и при исследовании органов и тканей экспериментальных животных, инфицированных P. aeruginosa.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Карпова М.В. Получение МКА к антигенам синегнойной палочки// Материалы итоговой науч. конф. студентов и молодых ученых ВМА. г. Волгоград, 9—19 марта 1999 г. — Волгоград, 1999. — С. 21—22.

2. Карпова М.В., Свиридов В.В., Храпова Н.П. Получение моноклональных антител к P.aeruginosa и их иммунохимиче-ская характеристика// Медицинская иммунология: Материалы

IV науч. конф. с междунар. участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2000». г. С.-Петербург, 23—25 мая 2000 г. — С.-Петербург, 2000. — Т.2. — №4. — С. 167.

3. Храпова Н.П., Карпова М.В., Кулаков М.Я., Ломова Л.В., Вобленко Р.А., Шередекина А.Я. Разработка моноклональных диагностических средств для обнаружения синегнойной палочки// Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации: Реф. сб. — Саратов, 2000. — С. 50.

4. Храпова Н.П., Ломтатидзе М.В., Кулаков М.Я., Ломова Л.В. Получение гибридом-продуцентов моноклональных антител к антигенам синегнойной палочки// Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации: Реф. сб. — Саратов, 2001. — С.15.

5. Крючкова Т.П., Савченко СТ., Гавенский С.Д., Сухов В.В., Ломтатидзе М.В., Лобанов А.Н., Свистунов В.М., Погасий Н.И., Британова Т. Н., Храпова Н.П. Микробный пейзаж объектов внешней среды некоторых лечебных учреждений Волгограда// Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане. — Вып. 6. — Алматы, 2002. — С. 109—111.

6. Храпова Н.П., Савченко СТ., Крючкова Т.П., Сухов В.В., Гавенский С.Д., Андрус В.Н., Ломтатидзе М.В. Роль грамотри-цательной микрофлоры в возникновении внутрибольничных инфекций в учреждениях здравоохранения Волгограда и оценка эффективности применения современных дезинфицирующих средств в условиях стационаров// Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации: Реф. сб. — Саратов, 2003. — С. 56— 57.

7. Ломтатидзе М.В., Храпова Н.П., Тихонов Н.Г., Ломова Л.В., Самыгин В.М., Жога Л.К., Ротов К.А., Савченко СТ., Крючкова Т.П., Ободова М.А. Получение моноклональных антител к липополисахариду и экзотоксину А синегнойной палочки// Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации: Реф. сб. — Саратов, 2003. — С. 55.

8. Крючкова Т.П., Храпова Н.П., Ломтатидзе М.В., Савченко СТ., Гавенский С Д., Сухов В.В. Методические рекомендации по применению метода флуоресцирующих антител для экспресс-обнаружения синегнойной палочки в пробах из объектов

внешней среды стационаров// Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации: Реф. сб. — Саратов, 2003. — С.25.

9. Ломтатидзе М.В., ХраповаН.П., Ломова Л.В., Самыгин В.М., Жога Л.К., Крючкова Т.П., Ободова М.А. Получение гибридом-продуцентов моноклональных антител к липополисахариду и экзотоксину А синегнойной палочки (Методические рекомендации)// Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации: Реф. сб. — Саратов, 2003. — С.25—26.

10. Храпова Н.П., Ломтатидзе М.В., Крючкова Т.П., Савченко СТ., Гавенский С.Д., Сухов В.В. Применение МФА для экспресс-обнаружения синегнойной палочки в пробах из объектов внешней среды стационаров// VI Российский съезд врачей-инфекционистов, г. С.-Петербург, 29—31 окт. 2003 г. — С.-Петербург, 2003. — С. 419—420.

11. Ломтатидзе М.В., Храпова Н.П., Крючкова Т.П., Савченко СТ., Гавенский С Д., Сухов В.В., Свиридов В.В. Экспресс-выявление Pseudomonas aeruginosa при помощи меченых ФИТЦ моноклональных антител// Эпидемиология и вакцино-профилактика. — 2004. — №2(15). — С. 42—45.

12. Ломтатидзе М.В., Храпова Н.П., Свиридов В.В., Крючкова Т.П. Получение моноклональных антител против антигенов синегнойной палочки и перспективы их использования в диагностических целях// Проблемы ООИ. — №1(87). — Саратов, 2004. — С58—60.

Научное издание

ЛОМТАТИДЗЕ Марина Владимировна

ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА И ПРИМЕНЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К АНТИГЕНАМ СИНЕГНОЙНОЙ ПАЛОЧКИ

Автореферат

Подписано к печати 13.08.2004 г. Формат 60x84/16. Печать офс. Бум. офс. Усл. печ. л. 0,9. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 453.

ВГПУ. Издательство «Перемена» Типография издательства «Перемена» 400131, Волгоград, пр. им. В. И. Ленина, 27

î 154 1 7

РНБ Русский фонд

2005-4 12669

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Ломтатидзе, Марина Владимировна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Лабораторная диагностика синегнойной инфекции.

1.2. Применение МкАт для изучения синегнойной палочки и ее обнаружения в различных объектах исследования.

Собственные исследования.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Штаммы микроорганизмов, питательные среды.

2.2. Лабораторные животные.

2.3. Клеточные линии.

2.4. Антигены.

2.5. Схемы иммунизации животных, получение иммунных спленоцитов и антисывороток.

2.6. Протоколы гибридизации.

2.7. Отбор антителопродуцирующих гибридом и их клонирование.

2.8. Накопление, очистка, изотипирование МкАт.

2.9. Анализ специфичности МкАт.

2.9.1. Иммуноферментный анализ.

2.9.2. Иммуноблоттинг.

2.10. Диагностические препараты.

2.10.1. Антимышиный ИПК.

2.10.2. Получение экспериментальных образцов меченых МкАт.

2.10.3. Приготовление меченых флуорохромом антител на основе поликлональных иммуноглобулинов.

2.11. Оценка активности и специфичности экспериментальных образцов меченых флуоресцеинизотиоцианатом поли- и моноклональных антител.

2.12. Оценка активности моноклональных ИПК и их применение в ИФА для выявления антигенов P. aeruginosa.

2.13. Методы статистической обработки результатов опытов.

Глава 3. Получение гибридом-продуцентов МкАт к антигенам P.aeruginosa.

3.1. Оптимизация схем стимуляции В - лимфоцитов.

3.2. Стабилизация свойств гибридом, условия их сохранения и накопление МкАт in vitro и in vivo.

Глава 4. Характеристика свойств МкАт к антигенам

P.aeruginosa.

4.1. Специфическая активность МкАт.

4.2. Иммунохимический анализ.

Глава 5. Изучение возможности применения МкАт к антигенам синегнойной палочки в качестве основы иммунодиагностических препаратов для ИФлА и ИФА.

5.1. Получение и оценка свойств иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих моноклональных и поликло-нальных к антигенам P. aeruginosa.

5.2. ИФА с применением моноклональных антител.

Глава 6. Перспективы совершенствования лабораторного анализа синегнойной инфекции.

6.1. Обнаружение P.aeruginosa в пробах из объектов внешней среды стационаров.

6.2, Идентификация синегнойной палочки, изолированной из проб клинического материала

6.3. Применение моноклональных иммуноглобулинов в ИФлА для изучения мазков-отпечатков при моделировании экспериментальной синегнойной инфекции.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение, характеристика и применение моноклональных антител к антигенам синегнойной палочки"

Актуальность проблемы.

Проблема внутрибольничного инфицирования приобретает все большую медицинскую и социальную значимость (21, 32, 39, 40, 48, 56). Повышение внимания к данной проблеме связано с регистрируемым в последние годы ростом тяжелых осложнений в стационарах различного профиля, обусловленных циркуляцией в них штаммов микроорганизмов с высоким уровнем резистентности к химиопрепаратам (84, 131). На смену доминировавшей прежде грампо-ложительной микрофлоре все чаще приходят грамотрицательные условно-патогенные микроорганизмы (8, 16, 26).

Изменение микробного пейзажа стационаров связано с рядом причин, среди которых наиболее значимой являются появление полирезистентных к антимикробным препаратам госпитальных штаммов (63, 69, 83, 86, 88, 121) как следствие повсеместного широкого и зачастую бесконтрольного применения антибиотиков. Отмечают также возрастание числа иммунокомпрометирован-ных лиц со сниженным уровнем резистентности. Увеличение числа пожилых лиц в возрастной структуре населения сопровождается также увеличением частоты нозокомиальных инфекций. Среди всех случаев бактериемии и менингитов вызванного грамотрицательной микрофлорой на долю лиц старше 65 лет приходится 50 % (16).

Снижение естественного антибактериального иммунитета и появление большого числа лиц с измененным иммунным статусом зачастую обусловлено интенсивной и/или нерациональной антибактериальной терапией или являются результатом проводившейся иммуносупрессивной терапии (17, 64, 118).

Синегнойная палочка - одна из наиболее частых причин возникновения внутрибольничных (нозокомиальных) инфекций: пневмоний, раневой инфекции, бактериемии, поражений мочевыводящих путей. В последние годы число больных с гнойно-септическими осложнениями синегнойной этиологии возросло и в ряде случаев достигает 30 % от числа госпитальных осложнений (18, 21, 23, 32, 34, 39, 41, 47, 49, 51, 53, 61,118).

Синегнойная инфекция распространена повсеместно. Мониторинг внешней среды стационаров в части циркуляции штаммов P.aeruginosa является жизненно важной проблемой практического здравоохранения.

В нашей стране госпитальные штаммы P.aeruginosa отнесены в разряд социально значимых "проблемных микроорганизмов", циркуляция которых в лечебных учреждениях требует постоянного надзора (15, 61).

Pseudomonas aeruginosa занимает второе место по частоте инфицирования пациентов хирургических отделений и третье - в терапевтических стационарах (11, 41, 52, 83, 118). Смертность от синегнойного сепсиса у ожоговых больных достигает 60 - 70 %, несмотря на проводимую комплексную терапию (8, 23). Кроме того, высокий уровень внутрибольничного инфицирования си-негнойной палочкой регистрируют в отделениях урологии, травматологии, трансплантологии и неонатологии (1, 43, 51, 61, 118, 131).

Традиционные методы бактериологической идентификации патогенов обеспечивают получение ответа в сроки не ранее 2-3 суток от момента начала исследования, что тормозит проведение адекватной терапии. В связи с этим, особую значимость приобретает вопрос об использовании методов экспресс-анализа проб клинического материала и объектов внешней среды (31, 44). В нашей стране методы экспресс-обнаружения P.aeruginosa в лабораториях практически не используют. В то же время, известно, что ПНР и ИФА зарекомендовали себя как эффективные и быстрые методы исследования проб клинического материала и объектов внешней среды при поиске синегнойной палочки (72,91,106).

Перспективы совершенствования всей системы контроля микробного пейзажа медицинских учреждений напрямую связаны с разработкой и применением в повседневной работе быстрых и достоверных методов обнаружения и идентификации возбудителей госпитальных инфекций.

Необходимым условием широкого использования в практических лабораториях иммунодиагностических тестов (ИФА, ИФлА и других) является наличие препаратов и тест-систем, изготовленных на основе высокоактивного сырья, предназначенных для обнаружения P.aeruginosa в различных объектах исследования.

На сегодняшний день наиболее совершенной основой для производства высокоактивных иммунодиагностических препаратов признаны МкАт. Их использование в диагностических тест-системах обеспечивает существенное повышение чувствительности и специфичности, а стабильность свойств МкАт является определяющим фактором изготовления стандартных образцов препаратов.

Ввиду отсутствия отечественных диагностических систем для выявления P.aeruginosa и перспективностью использования в них МкАт были определены цель и задачи работы.

Цель работы: получение МкАт к диагностически значимым видоспеци-фичным антигенам синегнойной палочки и изучение возможности создания на их основе высокоэффективных препаратов, пригодных для экспресс-анализа проб из объектов внешней среды и клинического материала.

Задачи исследования.

При выполнении работы необходимо было решить следующие задачи:

1. Подобрать схемы иммунизации мышей антигенными препаратами P.aeruginosa оптимальные для получения гибрид ом-продуцентов ан-тисинегнойных антител.

2. Разработать систему скрининга гибридных культур для отбора продуцентов антител к антигенам P.aeruginosa.

3. Провести эксперименты по слиянию иммунных спленоцитов с клетками мышиных миелом P3-X63-Ag8.653 и Sp 2/0 и оценить эффективность гибридизации и количество образующихся при этом культур-продуцентов антител.

5. Оценить специфическую активность МкАт в отношении типовых штаммов P. aeruginosa и гетерологичных псевдомонад в ИФА и ИФ-лА и выявить природу комплементарных лигандов.

6. Наработать в препаративных количествах МкАт к эпитопам, экспонированным на клеточной стенке P.aeruginosa.

8. Провести сравнительный анализ эффективности применения ФИТЦ-меченых препаратов моно- и поликлональных антител для экспресс обнаружения P. aeruginosa в пробах клинического материала и из объектов внешней среды.

Научная новизна.

Создана первая отечественная коллекция стабильных гибридом-продуцентов МкАт к антигенам P. aeruginosa, локализованным на поверхности микробных клеток. С помощью МкАт уточнена структурная организация иммунореактивных компонентов P.aeruginosa, имеющих диагностическое значение.

Представлены доказательства преимущества применения монокло-нальных иммуноглобулинов по сравнению с поликлональными при изготовлении диагностических средств, предназначенных для обнаружения и идентификации P. aeruginosa в клиническом материале от больных и пробах из объектов внешней среды.

Впервые с применением МкАт исследованы пути и скорость дис-семинации микробных клеток при моделировании экспериментального синегнойного сепсиса.

Практическая значимость.

1. Создана и сохраняется в криобанке ВолгБИПЧИ панель клонов гиб-ридом-продудентов антител к диагностически значимым антигенам P. aeruginosa.

2. Созданные на основе моноклональных антител иммуноферментный и иммунфлуоресцентный диагностикумы позволяют в течение 4-6 часов от момента взятия материала на исследование с высокой специфичностью и чувствительностью выявлять и идентифицировать P.aeruginosa в клиническом материале от больных и пробах из объектов внешней среды. Разработанные экспресс методы анализа служат основой для изменения общепринятой тактики лабораторных исследований, направленных на выявление внутрибольничных штаммов P.aeruginosa и проведение профилактических мероприятий по санации помещений.

Разработаны и утверждены Ученым советом ВолгНИПЧИ (протокол № 6 от 25,06.2003 г.) «Методические рекомендации по применению метода флуоресцирующих антител для экспресс обнаружения синегнойной палочки в пробах из объектов внешней среды стационаров».

3. Особенности экспериментов по получению моноклональных антител к антигенам P.aeruginosa отражены в одобренных Ученым советом ВолгНИПЧИ «Методических рекомендациях по получению гибридом-продуцентов МкАт к антигенам синегнойной палочки» (протокол № 14 от 27.12.2000 г.), и «Методических рекомендациях по получению гибридом-продуцентов МкАт к ЛПС и экзотоксину А синегнойной палочки» (протокол № 6 от 5.06.2002 г.), предназначенных для сотрудников специализированных биотехнологических лабораторий.

Основные положения, выносимые на защиту:

2. Разработанные на основе использования моноклональных антител реагенты для иммуноферментного и иммунофлуоресцентного методов анализа позволяют без выделения чистой культуры ускоренно выявлять синегнойную палочку и её антигены в клиническом материале от больных и пробах из объектов внешней среды. По показателям специфичности и чувствительности разработанные тесты существенно превосходят тесты, основанные на использовании поликлональных антител.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 103 стр. машинописного текста, иллюстрирована 16 таблицами и одним рисунком. Состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения и выводов. Библиографический указатель включает 61 отечественных и 70 зарубежных источников.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ломтатидзе, Марина Владимировна

Выводы:

1. Создана первая отечественная коллекция из 12 стабильных гибридом, секретирующих моноклональные антитела различной эпитопной направленности, взаимодействующие с поверхностно локализованными антигенами клеточной стенки P.aeruginosa.

2. Установлено, что для эффективной стимуляции В-лимфоцитов мышей-доноров спленоцитов препаратами УЗ-дезинтегратами, ВСЭ и ЛПС P.aeruginosa, необходимо: 1) цикл иммунизации ЛПС проводить не более 3 недель, ВСЭ и УЗД P.aeruginosa 1,5-2 мес; 2) антигенная нагрузка при иммунизации ВСЭ и УЗД не должна превышать 2,6-109 м.к./мл, а для ЛПС - не более 0,1-0,2 мг полисахарида; 3) бустерное введение Аг предпочтительнее осуществлять внутриселезеночно за 2 суток в случае стимуляции мышей ЛПС, за 3 суток при стимуляции ультразвуковыми дезинтегратами и водно-солевыми экстрактами P.aeruginosa.

3. Антисинегнойные МкАт 1В7, 2А2 и H-2/G3, 4G5, 5D8, 5D10, пригодны для изготовлении высоко специфичных и активных иммунодиагностических препаратов для иммуноферментного и иммунофлуоресцентного методов выявления P.aeruginosa и её антигенов.

4. Комбинированный сэндвич-вариант иммуноферментного анализа, использующий антисинегнойные поликлональные антитела для сенсибилизации планшетов и пероксидазные конъюгаты МкАт 1В7, 2А2 и H-2/G3 для детекции синегнойной палочки и ее антигенов позволяет специфически выявлять м.к./мл P.aeruginosa.

5. Меченые ФИТЦ МкАт 1В7, H-2/G3, 4G5, 5D8, 5D10, позволяют с высокой специфичность позволяют проводить экспресс выявление и идентификацию синегнойной палочки в пробах из объектов внешней среды, клинического материала и при исследовании органов и тканей экспериментальных животных, инфицированных P.aeruginosa.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одним из направлений совершенствования лабораторной диагностики возбудителей инфекционных заболеваний является разработка и внедрение в практику новых методов и средств обнаружения патогенных микроорганизмов. В части создания высокоактивных и высокоспецифичных диагностических препаратов для выявления синегнойной палочки наиболее перспективным направлением исследований признано конструирование иммунодиагностических препаратов на основе МкАт.

За рубежом получены МкАт против антигенов P. aeruginosa, которые успешно применяют в диагностических целях. Подобные исследования в нашей стране пока не проводились.

Целью настоящей работы являлось получение МкАт к диагностически значимым антигенам синегнойной палочки и изучение возможности создания на их основе высокоэффективных препаратов, пригодных для экспресс-анализа проб из объектов внешней среды и клинического материала.

В работе использовали типовые штаммы P.aeruginosa 12 сероваров (согласно классификации Habs) и штаммы 9 видов непатогенных псевдомонад из коллекционного центра ВолгНИПЧИ. Из типовых штаммов тех сероваров, которые, по данным отечественных и зарубежных исследователей, чаще других являются причиной внут-рибольничного инфицирования (12,25,42), готовили антигенные препараты: УЗ - де-зинтеграты микробных клеток, ВСЭ и ЛПС. В качестве экспериментальных животных применяли мышей линии BALB/c, аутбредных белых мышей, кроликов породы "Шиншилла" и белых аутбредных крыс. Миеломными партнерами при гибридизации служили клетки мышиных линий P3-X63.Ag8.653 и Sp2/0.

Получение шбридом-продуцентов МкАт к P.aeruginosa потребовало оптимизации ряда условий проведения различных этапов, в частности, подбора наиболее эффективных схем иммунизации мышей и получение стимулированных спленоцитов -одного из партнеров при гибридизации клеточных линий антигенами Paeruginosa, а также выбора метода скрининга МкАт.

В качестве последнего был использован непрямой вариант ИФА, удовлетворяющий требованиям специфичности и высокой чувствительности при выявлении минимальных концентраций бежа в пробе. Оптимизация условий постановки ИФА состояла в подборе серий антигенных препаратов (ВСЭ и ЛПС), которые применялись для адсорбции на твердой фазе, и образцов поликлональных мышиных сывороток (заведомо положительный контроль). При сенсибилизации планшетов использовали растворы Аг с концентрацией (по белку) 10-20 мкг/мл. Существенных отличий при использовании различных типов пластин (Greiner, Dynatech, Медполимер) не зарегистрировано. Преимуществом ИФА являлась возможность одномоментного исследования большого числа проб каждые 3-4 дня, что выгодно отличало его от непрямого ИФлА, который как метод скрининга был использован в ограниченном объеме.

Сравнение девяти использованных схем иммунизации мышей линии BALB/c УЗ-дезинтегратами микробных клеток, ВСЭ и ЛПС P.aeruginosa, полученных из штаммов Н-1, Н-2, Н-6, Н-11, с эффективностью гибридизации стимулированных этими антигенами спленоцитов с миеломными клетками и выходом активных и стабильных антителопродуцентов позволило установить, что при получении шбридом-продуцентов антител к Аг P.aeruginosa не следует применять длительные циклы иммунизации мышей-доноров спленоцитов. При этом антигенная нагрузка на одно животное не должна превышать 2,6-109 м.к., а для препаратов ЛПС - не более 0,1-0,2 мг ПС при числе инъекций - 3-4. Бустерную инъекцию предпочтительнее делать внутри-селезеночно за двое (ЛПС) или трое суток (УЗ-дезинтеграты м.к., ВСЭ) до слияния. Установлено, что сочетанное применение цельных микробных клеток и растворимых антигенов при стимуляции В-лимфоцитов мьппей повышает эффективность получения Ат-продуцентов (до 7 %, опыт №4).

Во всех опытах по получению гибридом-продуцентов МкАт к эпиталам, экспонированным на водорастворимых биополимерах, изолированных из м.к., зарегистрирована быстрая утрата признака Ат-продукции большинством ив первично-позитивных (по результатам 3-кратного тестирования в ИФА) культур. Из сотен вариантов первичных гибридом для последующего клонирования были отобраны 37 культур-продуцентов Ат с наиболее высокими показателями активности иммуноглобулинов в ИФА. Клонирование в ранние сроки позволило стабилизировать функцию АТ-продукции у 9 клонов-продуцентов МкАт (1В7, 4С11, H-2/G3, 4G4, 2А2, 4Е11, 4G5, 4G8,4G11).

Следует отметить, что наибольшие трудности возникли при получении МкАт к липополисахариду P.aeruginosa судя по высоким показателям титров сывороточных антител у мышей-доноров спленоцитов, можно было ожидать выхода большого числа продуцентов антител к ЛПС. Однако результативность опытов в этой серии экспериментов оказалась более низкой по сравнению с опытами первой серии. Несмотря на высокие показатели эффективности гибридизации и эффективности получения Ат-продуцентов, зарегистрированные в течение первого месяца культивирования гибридных клонов, последние оказались чрезвычайно нестабильными продуцентами иммуноглобулинов. Стабилизация продукции МкАт была достигнута при работе лишь с тремя гибридомами (5D8, 5D10, 7G4), полученными при использовании в качестве второго партнера клеток мышиной миеломы Sp2/0.

В целом после проведения двух серий опытов по гибридизации мышиных клеточных линий была создана первая отечественная коллекция перевиваемых гибридных клеток-продуцентов МкАт против антигенов P.aeruginosa, состоящая из 12 стабилизированных гибридом. Все коллекционные варианты гибридом, клонированные не менее двух раз, постоянно хранятся в жидком азоте в биохранилище Волгоградского НИПЧИ.

Выявленные методические особенности получения гибридом-продуценов МкАт против антигенов P.aeruginosa обобщены в "Методических рекомендациях по получению гибридом-продуцентов МкАт к антигенам синегнойной палочки" и "Методических рекомендациях по получению гибридом-продуцентов МкАт к ЛПС и экзотоксину А синегнойной палочки", предназначенных для сотрудников специализированных лабораторий, занимающихся получением МкАт к антигенам синегнойной палочки и их использованием в диагностике синегнойной инфекции.

Получение стабильных гибридом - продуцентов МесАт к антигенам синегнойной палочки способствовало успешному решению ряда задач данного исследования — определению спектра их специфической активности в отношении типовых штаммов P.aeruginosa (12 штаммов по классификации Habs) в ИФА и ИФлА, отбору вариантов МкАт дня иммунофлуоресцентного и иммуноферментного анализов, оценке пригодности МкАт различной эпитопной направленности для создания на их основе иммунодиагностических препаратов, проведению сравнительного анализа параметров качества новых средств с политональными аналогами, анализу возможности применения ИФлА с поли- и моноклональными препаратами при исследовании проб клинического материала и из объектов внешней среды.

При изучении свойств 12 типов МкАт, выделенных из среды культивирования in vitro и из асцитных жидкостей при выращивании продуцентов in vivo, установлено, что все они принадлежат к классу IgG. Изотипирование МкАт показало, что 2 варианта МкАт относятся к IgG3 (1В7 и 4С11), 2 варианта - к IgGi (H-2/G3,4G4) и 8 вариантов МкАт - к IgG2b ( 2А2,4Е11,4G5,4G8,4G11,5D8,5D10,7G4). Определение изопша МкАт служило основанием для предварительного прогноза о возможности использования тех или иных МкАт в различных иммунологических методах исследования и особенностях методических приемов при создании на их основе диагностических препаратов.

При определении специфичности моноклональных антител к антигенным субстанциям P.aeruginosa антигенные препараты, приготовленные из микробных клеток различных сероваров (ВСЭ Н-2, ВСЭ Н-3, ЛПС Н-2, ЛПС Н-4, ЛПС Н-5, ЛПС Н-6, ЛПС Н-11, ЛПС РАО-1), подвергали элекгрофоретическому разделению. В случае применения при элекгрофоретическом разделении ВСЭ Н-3 серовара P.aeruginosa антигенные субстанции проявлялись всеми 12 вариантами МкАт. По результатам имму-ноблоттинга, МкАт1В7 взаимодействуют с эпитопами, экспонированными на полиса-харидном компоненте ЛПС с м.м. 10-20 кДа, остальные И вариантов МкАт направлены против эпитопов в составе биополимеров с м.м. 35-70 кДа белковой природы. Установлено, что МкАт 2А2, H-2/G3, 5D8,5D10,7G4 взаимодействуют и с полисахарид-ным компонентом ЛПС P.aeruginosa.

Активность индивидуальных образцов МкАт в ИФА зависела от типа антигена, адсорбированного на твердой фазе. В образцах МкАт, изолированных из среды культивирования гибридом, она колебалась в пределах 1:80 - 1:640. МкАт, изолированные из асцигических жидкостей, были активны в разведениях 1:104 -1:106.

Спектр специфической активности различных типов МкАт в НИФлА являлся показателем плотности гомологичных им эпитопов на поверхности м.к. различных штаммов P.aeruginosa. Из 12 вариантов МкАт, полученных при выполнении работы, только МкАт 7G4 не взаимодействовали с поверхностно локализованными структурами м.к. типовых штаммов синегнойной палочки. МкАт 4G8 выявляли эпитоп, экспонированный с высокой плотностью на поверхности всех типовых штаммов P.aeruginosa. Взаимодействие остальных вариантов МкАт отразило разнообразие спектров специфической активности этих антител в отношении м.к. различных сероваров P.aeruginosa.

При оценке возможности применения полученных препаратов МкАт в методах экспресс - обнаружения P.aeruginosa все индивидуальные варианты специфических иммуношобулинов метили ферментом или флуорохромом. В качестве препаратов сравнения использовали поликлональные аналоги. Изготовление последних осуществляли на основе поликлональных иммуноглобулинов, выделенных из кроличьих сывороток, полученных согласно разработанным схемам иммунизации животных антигенами синегнойной палочки. Отмечено колебание показателей специфической активности поликлональных антител вследствие вариабельности состава индивидуальных сывороток, что в значительной степени осложняло процесс приготовления стандартных образцов препаратов сравнения.

При решении вопроса о пригодности использования препаратов МкАт в ИФА с целью выявления синегнойной палочки и ее Аг все типы МкАт коньюгировали с пе-роксидазой хрена. Полученные образцы ИПК, характеризовавшиеся высокими показателями специфической активности, использовали в сэндвич-варианте ИФА для выявления синегнойной палочки и ее антигенов. Установлено, что адсорбция на твердой фазе образцов МкАт или их сочетаний (имитация поликлональносги) не обеспечивала получения результатов, соответствующих чувствительности метода, при выявлении м.к. P.aeruginosa. Наиболее перспективным был признан комбинированный вариант тест-системы: поликлональные Ат для приготовления твердой фазы ("подложка") в сочетании с последующим применением моноклонального ИПК для детекции синегнойной палочки и ее антигенов. Наибольшей чувствительностью обладали тест-системы иммуноферментные с моноклональными ИПК 1В7, 2А2 и H-2/G3, позволившие выявить 20 - 50 нг/мл белка ВСЭ и МО3 -МО4 м.к./мл в формалинизирован-ных взвесях P.aeruginosa.

Помимо высокой чувствительности все эти тест-системы были высокоспецифичны, о чем свидетельствовали отрицательные результаты ИФА при постановке реакции с гетерологичными псевдомонадами и бактериями других видов. Существенное влияние на эффективность обнаружения м.к. P.aeruginosa в исследуемых пробах оказывали условия обеззараживания материала. Этот факт послужил основой для рекомендаций о выборе метода обработки проб, исследуемых с помощью ИФА. Сравнительный анализ результатов ИФА, выполненного с взвесями м. к. P.aeruginosa, обеззараженных формалином и автоклавированием, выявил большую чувствительность метода в случае работы с формалинизированными пробами. Автоклавирование частично инактивирует места связывания специфических иммуноглобулинов, что приводит к снижению чувствительности ИФА с применением всех типов ИПК выявляет МО6 -М09м.к./мл.

Установлено также, что из апробированных в процессе работы вариантов ИФА дот-анализ обладал относительно низкой чувствительностью (106-109 м.к.), что делает невозможным его использование как скринингового теста на этапах обнаружения P.aeruginosa.

Все типы МкАт и полиьслональные иммуноглобулины конъюгировали с флуоресцеинизотиоцианатом. Исключение составлял препарат МкАт 7G4, который при определении специфической активности в НИФлА с типовыми штаммами синегнойной палочки не взаимодействовал ни с одним из них, что связано или с отсутствием вообще специфического эпитопа на поверхности клеточной стенки или с его относительно незначительной плотностью, не обеспечивавших яркого специфического свечения при регистрации реакции.

Сравнительный анализ специфической активности поли- и моноклональнош препаратов иммуноглобулинов флуоресцирующих выявил более широкий спектр специфической активности первого из них в отношении типовых штаммов P.aeruginosa. Однако поликлональный препарат не проявил строгой специфичности: он перекрестно взаимодействовал с 25% штаммов 9 видов гетерологичных псевдомонад.

В отличие от поликлональнош препарата моноклональные иммуноглобулины флуоресцирующие обладали более высокой удельной активностью. Наиболее перспективными вариантами с точки зрения потенциального сырья для создания иммуно-диагностических препаратов для ИФлА оказались МкАт 1В7, H-2/G3,4G5,5D8,5D10, взаимодействующие с эпигопами локализованными на ПС компоненте ЛПС клеточной стенки представителей вида P.aeruginosa, но не окрашивавших клетки гетерологичных видов псевдомонад. В отношении типовых штаммов Paeruginosa эти препараты обладали более узким спектром специфической активности по сравнению с поли-клональным аналогом, окрашивая штаммы 7-9 сероваров P.aeruginosa, имея при этом преимущества в специфичности. Однако при исследовании клинических изолятов синегнойной палочки препарат МкАт 1В7 проявил активность, сопоставимую с активностью поликлональнош аналога: оба типа препаратов взаимодействовали с 68 % штаммов, идентифицированных при бактериологическом исследовании как представители псевдомонад. Исследование 87 изолятов, выделенных из проб клинического материала, выявило одинаковые возможности как поли- так и моноклональнош препарата 1В7.

Получены доказательства пригодности ИФлА с моноклональными препаратами для оценки микробного пейзажа лечебных учреждений. Преимущества применения флуоресцирующих моноклональных иммуноглобулинов для обнаружения и идентификации синегнойной палочки выявлены по результатам исследования 120 различных проб внешней среды трех стационаров: смывов с рук обслуживающего медицинского персонала, с аппаратуры и инструментария и с предметов обихода. Наиболее эффективными реагентами являлись ФИЩ-конъюгаты на основе МкАт 1В7 и 4G5. При использовании этих препаратов синегнойная палочка была соответственно выявлена при исследовании 1) смывов с предметов обихода в 32,97 % и 29,78 %; 2) смывов с аппаратуры и инструментария в 25 % и 43,75 %; 3) смывов с рук персонала в 30 % и 40 % исследованных проб. Таким образом, при использовании моноклональных диагности-кумов с ФИЩ-МкАт 1В7 и 4G5 синегнойная палочка была выявлена в стационарах почти в одной трети исследованных смывов (в среднем - в 31,6% и 32,5% соответственно), в то время как при использовании поликлонального конъюгата, возбудитель был выявлен лишь в 17,27 % исследованных смывов, что свидетельствует о несомненном преимуществе разработанных препаратов МкАт перед поликлональными. Особенности практического использования ИФлА с моноклональными конъюгатами обобщены в "Методических рекомендациях по применению метода флуоресцирующих антител доя экспресс-обнаружения синегнойной палочки в пробах из объектов внешней среды стационаров".

Особый интерес представляет исследование возможности использования флуоресцирующих моноклональных антител для выявления P.aeruginosa, путей и скорости её диссеминации при воспроизведении экспериментального синешойного сепсиса. Доказательством этому служат эксперименты на крысах, инфицированных выделенным от больного с остеомиелитом штаммом 73 P.aeruginosa. Животных заражали, вводя подкожно или внутрибрюшинно LD30 = 8"108 м.к. Через различные интервалы времени после заражения животных умерщвляли и готовили мазки-отпечатки органов и тканей для их исследования в иммунофлуоресцентном анализе на присутствие возбудителя. С помощью ФИТЦ-препаратов МкАт H-2/G3,4G5 и 5D10 возбудитель был обнаружен в почках, селезенке и брыжейке уже в первые часы после заражения, а через 12 ч зарегистрировано обсеменение всех исследованных органов и тканей животных.

Таким образом, мошжлональные ФИТЦ-диагносшкумы позволяют с высокой специфичностью и чувствительностью выявлять синегаойную палочку не только в смывах с различных объектов, но и в тканях инфицированного организма, что, по-видимому может оказаться полезным и при исследовании биопсийного материала и при оценке обсемененности тканей синегнойной палочкой в ходе хирургических вмешательств.

В результате проделанной работы продемонстрированы возможности использования МкАт к эпитопам, экспонированным на поверхности м.к. синегнойной палочки, в качестве основы иммунодиашостических препаратов для ИФлА и ИФА при одномоментном исследовании большого числа разнообразных проб. Получение предварительного ответа при экспресс-обнаружении P.aeruginosa в пробах различного материала до момента получения результатов бактериологического исследования расширяет возможности лабораторных исследований, направленных на предупреждение внутрибольничнош инфицирования.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Ломтатидзе, Марина Владимировна, Москва

1. Абрамцев М. Ф., Клушенцев М.С Эпидемиологическая характеристика внут-рибольничных гнойно-септических инфекций в хирургических отделениях детских больниц// Хирургия. 1974. - №3. - С. 34-37.

2. Адаме Г.А. Выделение липополисахаридов из грамотрицательных бактерий// Методы исследования углеводов/ Под ред. Хорлина А. Я- М.: Мир, 1975. С. 126-128.

3. Акатова Н.С., Смирнова Н.Е. Серологическая классификация Pseudomonas aeruginosa!I Журн. микробиол., эпидемиол., и имунобиол. 1982. - №7. - С. 8791.

4. Александрова Н.Г., Александрова И.А., Александров А.Д., Мороз А.Ф. Разработка латекс-агглютинации для диагностики синегнойной инфекции// Журн. микробиол., эпидемиол., и имунобиол. 1986. - №4. - С. 10 -14.

5. Александрова И.А., Мороз А.Ф., Анциферова Н.Г., Александров А.Д. Разработка поливалентного эритроцитарного диагностикума на основе антигенов слизи Pseudomonas aeruginosa!! Журн. микробиол., эпидемиол., и имунобиол. -1986.-№10.-С. 72-75.

6. Арутчева А.А. Дифференциально-диагностическая схема для идентификации беспигментных вариантов синегнойной палочки// Лаб. дело. 1984. - №8. - С. 499-500.

7. Вельский В.В., Шаталова Е.В. Взаимное влияние возбудителей при смешанной инфекции ожоговой травмы// Журн. микробиол., эпидемиол., и имунобиол. 1999.-№4.-С. 3-7.

8. Борисова O.K., Богатова И.С. Идентификация Pseudomonas aeruginosa в клиническом материале// Лаб. дело. 1983. - №2. - С. 32-35.

9. Брусина Е.Б., Лившиц М.Л., Шраер Т.И. Эпидемиологическая диагностика госпитальных гнойно-септических инфекций в хирургии// Журн. микробиол., эпидемиол., и имунобиол. -1987. №5. - С. 44-47.

10. Булава Г.В., Григорьев Г.В., Ермолин Г.А. Применение иммуноферментно-го метода в диагностике заболеваний, вызванных синегнойной палочкой// Им-мунол. 1984. - №4. - С. 85-97.

11. Булава Г.В., Ермолин Г.А. Получение антисывороток к антигенам синегнойной палочки и протея для проведения иммуноферментного анализа в клинической практике// Журн. микробиол., эпидемиол., и имунобиол. 1985. - №1. -С. 51-55.

12. Булава Г.В., Ермолин Г.А., Григорьев Н.И. Иммуноферментный метод диагностики гнойно-септических осложнений, обусловленных синегнойной палочкой и протеем// Журн. микробиол., эпидемиол., и имунобиол. 1985. - №6. -С. 89-93.

13. Внутрибольничные инф-ции: Пер. с англ./ Под ред. Р.П.Венцела. М.: Медицина, 1990. - 656 с.

14. Внутрибольничные инфекции: Пер с англ.,/ Под. ред. Мейхол К.Г. М.: Медицина, 1980.

15. Внутрибольничные инфекции и инфекции у пациентов с иммунологическими нарушениями// Медицинская микробиология/ Под.ред.акад.РАМН В.И.Покровского и проф. О.К.Поздеева. М.: Медицина, 1990. - С. 631-642.

16. Губернаторов В.В., Булыгина В.В., Зайцева Е.М. Этиологическая структура микрофлоры при раневых инфекциях у больных травматологического отделения// Матер. VIII Всеросс. съезда эпидемиол., микробиол. и паразитол. 26-28 марта 2002. Т.З. - С. 145.

17. Далина A.M., Лобашевский А.Л., Дратвин С.А. Гемагглютинирующие свойства штаммов Pseudomonas aeruginosa, выделенных от больных с неспецифич-скими заболеваниями легких// Журн. микробиол., эпидемиол., и имунобиол. -1992.-№1.-С. 16-18.

18. Дикий И.Л., Холупия И.Ю., Дика О.М., Стрельников Л.С. Синегнойная инфекция: обоснование некоторых направлений разработки эффективных средств иммунопрофилактики и иммунотерапии// Вест, фармакол. 1996. - №1-2. - С. 142-144.

19. Евстропов А.Д., Ильина В.Н., Шмырин А.А., Хмельницкая Н.А., Дружинин И.А. Этиология бактериемии у обожженных// Матер. VIII Всеросс. съезда эпидемиол., микробиол. и паразитол. 26-28 марта 2002. Т.З. - С. 147-148.

20. Егизова С.А., Дерябин П.Н., Корельник Б.В., Мороз А.Ф., Александрова И.А. Диагностическая эффективность эритроцитарных иммунореагентов из различных антигенов Pseudomonas aeruginosa!7 Журн. микробиол., эпидемиол., и имунобиол. -1990. №11. - С. 30-33.

21. Капранов Н.И. Муковисцидоз в России: современное состояние проблемы// Русс. мед. журнал.- 1996. №6. - Т. 4. - С. 23-27.

22. Коровина Н.А., Захарова И.Н., Мумладзе Э.Б., Гаврюшова Л.П. Протокол диагностики и лечения пиелонефрита у детей// Пособие для практических врачей. М. 2000. - 49с.

23. Ковалева Е.П., Семина Н.А. Внутрибольничные инфекции в педиатрии// Эпидемиол. и инфекц. бол. 2002. - №5. - С. 4-6.

24. Методические указания по применению унифицированных микробиологических (бактериологических) методов исследования в клинико-диагностических лабораториях // Приложение № 1 к прказу МЗ СССР № 535 от 22.04. 1985.- 126с.

25. Методические рекомендации по бактериологической диагностике синегнойной инфекции. №3082-84. Москва. 1984. Министерство здравоохранения СССР. 19с.

26. Митрохин С.Д. Значимость микробиологической лаборатории в современной системе инфекционного контроля многопрофильного стационара (в плане профилактики и лечения госпитальных инфекций)// Микробиол. диагн. 2000. -Т.4.- №1. - С. 42-45.

27. Монисов А.А., Лазикова Г.Ф., Фролочкина Т.Н., Коршунова Г.С. Состояние заболеваемости внутрибольничными инфекциями в Российской Федерации// Эпидемиол. и инфекц. бол. 2000. - №5. - С. 9-11.

28. Моноклональные антитела// Под ред. Кеннета Р.Г. и др. Пер. с англ. М.1983.

29. Наркевич М.И., Тымчаковская И.М. Контроль за инфекциями в лечебно-профилактических учреждениях России// Эпидемиол. и инфекц. бол. 1997. -№1. - С. 8-10.

30. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений // МЗ СССР, Приказ №535 22 апреля 1985.

31. Олейник И.И. Применение РПГА для выявления антител к синегнойной палочке у больных острой деструктивной пневмонией// Журн. микробиол., эпи-демиол., и имунобиол. 1978. - №9. - С. 99-103.

32. Определение грамотрицательных потенциально патогенных бактерий-возбудителей внутрибольничных инфекций // Метод, рекомендации (с правом переиздания местными органами здравоохранения).- МЗ РСФСР., М., 1980.

33. Определение грамотрицательных потенциально патогенных бактерий-возбудителей внутрибольничных инфекций// Метод, рекоменд. Утв. зам. Министра МЗ СССР 3.06.1986.- М., 1986.- 36с.

34. Покровский В.И., Малеев В.В. Актуальные проблемы инфекционной патологии// Эпидемиол. и инфекц. бол. 1999. - №2. - С. 17-20.

35. Псевдомонады и псевдомонозы/ Беляков В.Д., Ряпис JT.A., Илюхин В.И. -М.: Медицина, 1990. -224 с.

36. Рафиев Х.К., Сатторов С.С. Этиологическая структура гнойно-воспалительных заболеваний в различных отделениях больниц Душанбе// Журн. микробиол., эпидемиол., и имунобиол. 2001. - №5. - С. 13-15.

37. Ряпис А.А.Джузенов А.А., Маликова Н.Р., Вартанян Ж.С., Анкирская А.С., Кабелькова И.В. Типирование Pseudomonas aeruginosa и его использование для эпидемиологического анализа// Журн. микробиол., эпидемиол., и имунобиол. -1993.-№6.-С. 110-111.

38. Свирская JI.M., Строков В.А., Анциферова Н.Г. Госпитальная инфекция, обусловленная синегнойной палочкой, в отделениях реанимации// Журн. микробиол., эпидемиол., и имунобиол. 1986. - №5. - С. 7 - 11.

39. Савицкая К.И., Семина Н.А., В.В.Галкин В.В., Абаш Ю.Б. Значение лабораторных исследований в профилактике госпитальной инфекции// Эпидемиол. и инфекц. бол. 2001. - №2. - С. 16-21.

40. Северцова М.К., Вайда М.В., Варро Р. Метод иммуноферментного анализа для выявления антисинегнойных антител у лиц, привитых пиоиммуногеном// Журн. микробиол., эпидемиол., и имунобиол. 1987. - №1. - С. 55-59.

41. Северцова М.К., Дубова В.Г., Гетманова М.А., Темпер P.M. О возможности диагностики синегнойной инфекции методом ИФА с использованием пиоим-муногена в качестве антигена// Журн. микробиол., эпидемиол., и имунобиол. -1988.-№4.-С. 63-66.

42. Семина Н.А., Ковалева Е.П. Внутрибольничные инфекции-актуальная проблема современного здравоохранения// Инфекционные болезни на рубеже XXI века/ Матер, науч.-практ. конф., май, 2000. М., 2000.- 4.2. С.35-36.

43. Семина Н.А. Научные и организационные принципы профилактики внутри-больничных инфекций// Журн. микробиол., эпидемиол., и имунобиол. 2001. -№5.-С. 5-6.

44. Синегнойная инфекция. Под ред. Мороз А.Ф. М.: Медицина, 1988. - 256 с.

45. Сирская JI.M., Строков В.А., анциферова Н.Г. Госпитальная инфекция, обусловленная синегнойной палочкой, в отделениях реанимации// Журн. микробиол., эпидемиол., и имунобиол. 1986. - №5. - С. 7-11.

46. Сологуб В.В., Рожавин М.А. Эпидемиологическое изучение ассоциаций Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa в пульмонологической клинике// Журн. микробиол., эпидемиол., и имунобиол. 1988. - №4. - С. 8-11.

47. Ставертий J1.B., Мефодьев В.В., Гилева С.В. Псевдомонады как маркер санитарно-эпидемиологического состояния учреждений родовспоможения// Журн. микробиол., эпидемиол., и иммунобиол. 2001. - №5. - С. 5-6.

48. Станиславский Е.С., Колкер И.И. Синегнойная инфекция/ Научный обзор. ВНИИМИ Серия: эпидемиол. и инфекц. бол. М. - 1978.

49. Статистические методы в микробиологических исследованиях/ Ашмарин И.П. Воробьев А.А. Ленинград, 1962. - 180 с.

50. Тыдельская И.JI. Пигментные и апигментные шт. P.aeruginosa, выделение при разл.заб. человека// Журн. микробиол., эпидемиол., и имунобиол. 1978. -№1. - С. 100-102.

51. Храпунова И.А. Состояние внутрибольничной инфекционной заболеваемости медицинских работников в лечебно-профилактических учреждениях Москвы// Эпидемиол. и инфекц. бол. 2002. - №2. - С. 20-23.

52. Чекан Л.В., Миньович Ф.Л., Кутимова Л.Р., Едвабная Л.С., Станиславский Е.С. Естественные антитела против Pseudomonas aeruginosa в препаратах 7-глобулина человека// Журн. микробиол., эпидемиол., и имунобиол. -1981. №6. - С. 85-87.

53. Янишевская М.Н, Кузьмина Н.С., Кутимова Л.Р., Ленц М.Н., Минакова Л.В., Миниович Ф.Л. Антитела к токсину Pseudomonas aeruginosa в препаратах нормального иммуноглобулина человека// Журн. микробиол., эпидемиол., и имунобиол. 1983. - №6. - С. 100-102.

54. Янкина Н.Ф., Ванеева Л.И. Разработка метода получения конъюгатов перок-сидазы с антииммуноглобулином для иммуноферментного анализа // Журн. микробиол., эпидемиол., и имунобиол. 1985. - №1. - С. 35-40

55. Яфаев Р.Х., Зуева Л.П. Эпидемиология внутрибольничной инфекции.-Л.-.Медицина, 1989. 168 с.

56. Ashour М., Al-kattan К.М., Jain S.K., Al-majid S., Al-Kassimi F., Mobaireek A., et al. Surgery for unilateral bronchiectasis: results and prognostic factors//Tuber. Lung. Dis. 1996. - V. 77. - P. 168-172

57. Blahova, J., Kralikova K., Rrcmery V. Sr., Schafer V Sudden increase in Pseudomonas aeruginosa nosocomial strains with broad host range transfer of antibiotic resistance.// J. Chemother. 2001. - V. 13. - №6. - P. 607-610.

58. Bodey G.P. Pseudomonas aeruginosa infections in cancer patients: have they gone away?// Curr. Opin. Infect. Dis. 2001. - V14. - №4. - P. 403-407.

59. Bryan L.E, Kureishi A., Rabin H.R. Detection of antibodies to Pseudomonas aeruginosa alginate extracellular polysaccharide in animals and cystic fibrosis patients by enzyme-linked immunosorbent assay//J.Clin. Micr. 1983. - V.18 - №2. -P.276-282.

60. Chia J.K.S., Pollack M., Avigan D., Steinbach S. Functionally distinct monoclonal antibodies reactive with enzymatically active and binding domains of Pseudomonas aeruginosa toxin A// Inf. Immun. 1986. - V.52. - № 3. - P. 756-762.

61. Counts G.W., Schwartz R. W., Ulness В. K. Evaluation of an immunofluorescent-antibody test for rapid identification of Pseudomonas aeruginosa in blood cultures // J. Clin. Microbiol. 1988. - V. 26. - № 6. - P. 1161-1165.

62. Dubois M., Gilles К. A, Hamilton J.R. Colorimetric method for determination of sugars and related substances //Anal. Chem. 1956. - V. 28. - №7. - P. 350-356.

63. Eugene S., Stanislavsky, Joseph S.Lam. Pseudomonas aeruginosa antigens as potential vaccines// FEMS Microbiol. Rew. 1997. - Y.22. - P. 243-277.

64. Fourhier C., Andre J., Marlier H., Guinet R., Gilly R. Serodiagnosis of Pseudomonas aeruginosa infections in mucoviscidosis: comparative study of Western blotting, ELISA exotoxin A and ELISA phospholipase С// Pathol. Biol. 1993. - V.2. -1022-1025.

65. Galloway D.R., Hedstrom R. C., Pavlovskis O. R. Production and characterization of monoclonal antibodies to toxin A from Pseudomonas aeruginosa!I Inf. Im-mun. 1984. - V.44. - № 2. - P. 262-267.

66. Gaston M.A., Yale A., McDougall J., Pitt T.L. Monoclonal antibidies against Pseudomonas aeruginosa II J. Med. Microbiol. 1985. - V. 20. - № 3. - P. 6-7.

67. Gaston M.A., Vale T. A., Wright В., Cox P., Pitt T. L. Monoclonal antibodies to the surface antigens of Pseudomonas aeruginosa!I FEMS Microbiol. Lett.- 1986. -V.37. P. 357-361.

68. Goding J.W. Monoclonal antibodies: principles and practice// Acad. Press Inc., London Ltd. 1986. - P. 59-103.

69. Gordon R.A., Rabin H.R.// Canad. J. Med. Technol. 1987. - V. 49. - № 1. - P. 2227.

70. Granstrom M., Wretlind В., Markman В., Pavlovskis O.R., Vasil M.L. En-zymelinked immunosorbent assay for detection of antibodies to Pseudomonas aeruginosa exoproteins// Eur. Clin. Microbiol. 1985. - 4. - №2. - P. 197-200.

71. Grinenko G.I., Parashina V.A., Luzina E.V., Shobukhova T.S., Aleksandrov D.A., Musina L.T. Characterization of Pseudomonas aeruginosa strains isolated at therapeutic institutions of Moskow// Klin. Lab. Diagn. 1995. - №3. - P. 11-14.

72. Hancock R.E.W., Wieczorek A. A., Mutharia L. M., Poole K. Monoclonal antibodies against Pseudomonas aeruginosa outer membrane antigens: isolation and characterization// Inf. Immun. 1982. - V.37.- P. 166-171.

73. Hancock R.E.W., Chan L. Outer membranes of environmental isolates of Pseudomonas aeruginosa!! J. Clin. Microbiol. 1988. - V. 26. - № 11.- P. 2423-2424.

74. Harris A.D., Perencevich E., Roghmann M.C1., Morris G., Kaye K.S., Johnson J.A. Risk factors for piperacillin-tazobactam-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalized patients// Antimicrob-Agents-Chemother. 2002. - V.46. - №3. -P. 854-858.

75. Huang Xi., McClellan Sharon A., Barrett Ronald P., Hazlett Linda D. IL-18 contributes to host resistance against infection with Pseudomonas aeruginosa through induction of IFN-gamma production// J.Immunol. 2002. - V.168. - №11. - P. 57565763.

76. Husson M.O., Mielcarek C., Gavini F., Caron C., Izard D., Leclerc H.Isolation and characterization of monoclonal antibodies against alkaline phosphatase of Pseudomonas aeruginosa!I J. Clin. Microbiol. 1989. - V.27. - №5. - P. 1115-1118.

77. Igumbor E., Gwanzura L., Chihara M., Obi C., Muza D Antibiotic sensitivity and plasmid profiles of Pseudomonas aeruginosa!I Cent. Afr. J. Med. 2000. - V. 46. -№11.-P. 296-300.

78. Irvin R.T., Ceri H. Immunochemical examination of the Pseudomonas aeruginosa glycocalyx: a monoclonal antibody which recognizes L-guluronic acid residues of alginic acid// Can. J. Microbiol. 1985. - V.31. - №3. - P. 268-275.

79. Jin C.S., Hamaguchi Y., Sakakura Y. ELISA to determine immunoreactive Pseudomonas aeruginosa elastase in chronicnsupparative otitis media// Int. Arch. Allergy Appl Immunol. -1991.

80. Khan A.A., Cerniglia C.E. Detection of P.aeruginosa from clinical and enciron-mental samples by amplification of the exotoxin A gene using PCR// Appl. Environ. Microbiol. 1994. - Oct.

81. Koval S.F., Meadow P.M. The relationship between aminosugars in the lipopoly-saccharide, serotype and aeruginocin sensitivity in strains of Pseudomonas aeruginosa! I J. Gen. Microbiol. 1975. - V. 91. - P. 437-440.

82. Kronborg G., Pressler Т., Fomsgoard A., Koch C., Hoiby N. Specific IgG2 antibodies to Pseudomonas aeruginosa lipid A and lipopolysacharide are early markers of chronic infection in patients with cystic fibrosis// Infection. 1993.

83. KusamaR. ELISA for detection of P.aeruginosa lipoplysaccharides// J. Clin. Microbiol. 1983. - Vol.17. - №2. - P. 317-322.

84. Labows J.N., Kostele J.G., McGinley K.J. Method of detecting Pseudomonas aeruginosa infections utilizing selected ketone and/or sulfur metabolites// The Mo-nell. Chemical. Senses Center. 1997.

85. Lam J.S., Mutharia L. M., Hancock R. E. W.// Monoclonal antibodies against bacteria. Vol. II/ Ed by A. J. L. Macario et E. C. Macario. New York: Acad. Press, 1985. -P. 143-157.

86. Lam J.S., MacDonald L.A., Lam M. Y., Duchesne L.G., Southam G.G. Production and characterization of monoclonal antibodies against serotype strains of Pseudomonas aeruginosaП Inf. Immun. 1987. - V.55. - № 5. - P. 1051-1057.

87. Lam J.S., MacDonald L.A., Lam M. Y., Production of monoclonal antibody against serotype strains of Pseudomonas aeruginosa!/Inf. Immun. 1987.- V.55. -№11.- P. 2854-2856.

88. Lazaraff Van N. Uber ein colorimetrische micrometric zur Bestimmung des Le~ sansfetties ein Blutserum// J. Med. Labor. Technic. 1973. - V. 14. - №3. - P. 37.

89. Lowry О. H., Rosenbrough A. Z.,.Farr A. L,. Pandale R. Z Protein measurement with the Folin phenol reagent// J. Biol. Chem. 1951. - V. 193. - P. 265-275.

90. Marget W., Weiss M., Ruhland B. Lipid A antibody determinations using ELISA on patients at children's hospital: A preliminary report// Infection. 1983. -V.2. - P. 84-86.

91. Marshall J.D., Eveland W.C., Smith W. Superiority of fluorescein isothiocyanate (Riggs) for fluorescent-antibody technic with a modification of its application// Proc. Soc. Exper. Biol. Med. 1958. -V. 98. - № 4. - P. 898-900.

92. Mathews Ruth C., Burnie J.P., Tabaqchali S. Immunoblot analysis of serological response to Pseudomonas aeruginosa septicaemia in men// J.Clin. Pathol. 1986. -V.39. - №12. - P. 1306-1312.

93. Matsuhisa A., Saito Y., Sakomoto Y., Kesci H., Ueyama H., Aikawa Y., Kishi Y., Ohno T. Detection of bacteria in phagocytesmears from septicemia-suspected blood in situ hibridization using biotinylated probes// Microbiol. Immunol. 1994. - P. 427435.

94. Mcintosh J., Govan J.R., Brock D.J. Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum from cystic fibrosis patients by the polymerase chain reaction// Mol. Cell. Probes. 1992. - Aug. P. 281-294.

95. Montie T.C.,Anderson T.R.ELISA for detection of P. aer. H (Flagellar) antigen// Eur. J. Clin. Microbiol. 1988. - V.7. - №2. - P. 256-260.

96. Murakami K., Yoshida T. Monoclonal antibodies against species-specific cepha-losporinase of Pseudomonas aeruginosaII Eur.J. Biochem. 1985. - V.146. - № 3. - P. 693-697.

97. Mutharia L.M., Hancock R. E. W. Suface localization of Pseudomonas aeruginosa outer membrane porin protein F by using monoclonal antibodies// Inf. Immun. -1983. V. 42. - № 3. - P. 1027-1033.

98. Mutharia L.M., Lam J. S., Hancock R. E. W. // Monoclonal antibodies against bacteria. Vol. II/ Ed by A. J. L. Macario et E. C. Macario.- New York: Acad. Press. -1985.-P. 131-142.

99. Nelson J. W.,Barclay R.G.,Govan J.R.W. Diagnosis of chronic P.aeruginosa infection in cystic fibrosis by ELISA for anti-Pseudomonas LPS IgG antibodies// Se-rodiagn. and Immunother. Infect. Dis. 1990. - V.4. - №1. - P. 9-16.

100. Niderwohrmeier В., Bohm R. Detection specificity of an optimal solid-phase enzyme immunoassay for P.aeruginosa and P.mallei!/ Zentralbl Veterinarmed. -1990.-Nov.

101. Noda Y., Yasuoka S., Inoue I., Tani K., Fujisawa K., Ogura T. Analysis of IgA antibody to Pseudomonas aeruginosa in sera and sputa of patients with chronic airway diseases// Intern. Med. 1992. - May.

102. O'Berry P.A. A comparison of 3 metods of serum fractionation in the preparation of vibrio fetus fluorescent antibody conjugates//Am. J. Vet. Res. 1964. - V.25.1. P.l 669-1672.

103. OellerichM. Enzyme-immunoassay: a review// J.Clin. Chem. and Clin. Bio-chem. 1984. - V.22. - №12. - P.895-904.

104. Ouchterlony O. Antigen-antibody reactions in gels. IV. Types in coordinated systems of diffusion// Acta Path. Microbiol. Scand. 1953. - V.32. - P. 231-240.

105. Petras G., Ftist G., Adam M.M., Serial determination of complement and specific antibody titres in Pseudomonas aeruginosa infection// Acta microbial. Hung. -1984. V.3. - №2. - P.141-151.

106. Pseudomonas aeruginosa. Edit by Stanislavsky E., Kim H.S., Park W.J., Ahn D.H., Nishino Т., Chang W.H. and Paik W.H. Hanrimowon Publishing Company, Sroul, Korea, 1998.

107. Recule C, Croize J., Coppere C., Hirtz P.,.Cout JP, Le Noc P. Serology of anti-Pseudomonas aeruginosa and mucoviscidosis: diagnostic aid in the differention between colonization and infection// Pathol. Biol. (Paris). 1993.

108. Shih Pei Ching., Huang Ching Tsan. Effects of quorum-sensing deficiency on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation and antibiotic resistance// J. Antimicrob. Chemother. 2002. - V.49. - №2. - P. 309-314.

109. Sokol P.A., Woods D.E. Monoclonal antibodies to Pseudomonas aeruginosa fer-ripyochelin-binding protein// Inf. Immun. 1986. - V.53. - № 3. - P. 621-627.

110. Sokol P.A. Surface expression of ferrypyochelinbinding protein is required for virulence of Pseudomonas aeruginosa/1 Inf. Immun. 1987. - V. 55. - № 9. - P. 20212025.

111. Stanek G. Identification of gram negative rods and evalution of their antibiotic sensetivity: comparison of the Biotest МНК/ID-system with the API-20E system and the agar diffusion test// Zbl.Bacteriol.Microbiol.Hyg. 1982. - V.253. - №1. - P. 6175.

112. Strikland M. A., Gaston M. A., Pitt T.L.// J. Clin. Microbiol. 1988. -V. 26. -№4.-P. 768-769.

113. The Т.Н., Feltkamp T.E.W. Conjugation of fluorescein isothiocyanate to antibodies. I. Experiments on the conditions of conjugation// Immunology. 1970. - V. 18. -P. 865-873.

114. Tovey E.R., Baldo B.A. Comparison of semi-dry and conventional tank buffer electrotransfer of pfoteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose membranes// Electrophoresis. 1987. - №8. - P.384-387.

115. Vale T.A., Gaston M. A., Pitt T.L. Subdivision of O-serotypes of Pseudomonas aeruginosa with monoclonal antibodies// J. Clin. Microbiol.- 1988. V. 26. - № 9. - P. 1779-1782.

Информация о работе

Ломтатидзе, Марина Владимировна
кандидата медицинских наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Получение, характеристика и применение моноклональных антител к антигенам синегнойной палочки - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы