Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии производства лечебно-профилактических препаратов очищенного концентрированного стафилококкового бактериофага

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии производства лечебно-профилактических препаратов очищенного концентрированного стафилококкового бактериофага"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САНЭПИДНАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского

На правах рукописи

Для служебного пользования N Л О О С / О

НАСИБУЛИН Ильдар Халитович

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ОЧИЩЕННОГО КОНЦЕНТРИРОВАННОГО СТАФИЛОКОККОВОГО БАКТЕРИОФАГА

03.00.07. - Кикробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА -.¿993

Работа выполнена в Уфимском научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова НПО "Иммунопрепарат".

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессо[

Т.Г.Нигматуллин

Официальные оппоненты - доктор

доктор

медицинских наук, профессор

В.П.Ненашев медицинских наук, профессор В.В.Поспелова

Ведущая организация - Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича 113 РФ

Защита состоится "__"_1993 г.

в __ часов на заседании специализированного совета К 084.18.01

Московского научно-исследовательского института эпидемиологии I микробиологии им. Г.Н.Габричевского по I ,ресу: 125212, Косква, ул.Адмирала Макарова, Ю.

С диссертацией можно ознакомиться е библиотеке Московскогс НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.М.Габричевского.

Автореферат разослан "_"_ 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук

3.Н.Ермоленко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Гнойно-воспалительные заболевания (ГЧЗ) в настоящее время являются актуальной проблемой здравоохранения. Значительную роль в этиологии этих заболеваний продолжают играть стафилококки (Мустафин Д.Г., 1990; Grosaero-de М.Н., Wenzel R.P., 1991; Salae S. et el., 1991). Острота проблемы ГВЗ связана, в частности, с широким распространением внутрибольничной инфекции, ведущая роль в этиологической структуре которой принадлежит штаммам Staphylococcus aureus. Стафилококки обусловливают различные гнойные заболевания (Буя- j

нов В.М. с соавт., 1989; Григорьев В.Е. с соавт., 1989; Павлова Е. В. с соавт., 1990; Шутова А.П. с соавт., 1990; Симонен-ко В.В., 1993; Galezak W., Micolajczyk Я., 19В9; Solt К., 1989; Peters G., 1991; Goet2 A., Muder R., 1992). Чаще регистрируются в последние годы случаи заболеваний, вызванные коагулазоот-рицательными стафилококками (Gemmell C.G., 1987; Mclntype P. et al., 1989; Muller R., VolgtH.U., 1991; Patrick C.H. et al., 1992).

Лечение стафилококковых заболеваний антибиотиками, химиотерапевтическими препаратами затруднено в связи с тенденцией приобретения стафилококками высокой устойчивости к ним, а также из-за побочного негативного действия этих препаратов на организм больного. В этих условиях становится весьма важным поиск безвредных и более действенных средств и способов лечения стафилококковой инфекции.

Одним из высокоэффективных препаратов специфического действия является стафилококковый бактериофаг. Однако, он производится в настоящее время по технологии, которая несовершенна и не обеспечивает высокое качество препарата. Очистка стафилофага по этой технологии ограничивается фильтрацией фаголизатов через свечи Шамберлана для их освобождения от нелизировавшихся клеток и других микровзвесей. Полученные таким образом фаголизаты содержат значительное количество продуктов метаболизма бактериальных клеток. Применение таких препаратов с невысокой степенью чистоты может вызывать нежелательные побочные реакции организма. Следует также отметить недостаточно высокую литическую активность выпускаемого препарата; существующая технология малопроизводительна и трудоемка.'

В этой связи весьма актуальными являются исследования по . разработке новой технологии производства препаратов стафилофага.

- 4 - .

которая предусматривала бы получение фаголизатов с высокой литической активностью, их очистку, а также выпуск разнообразных лекарственных форм.

Цель исследования. Основная цель исследования заключалась в разработке современной производственной технологии получения лечебно-профилактических препаратов очищенного концентрированного стафилококкового бактериофага, обладающих высокой литической активностью.

Задачи исследования:

1. Изучить репродукцию стафилококкового бактериофага на различных питательных средах. ,

С 2. Разработать способ культивирования стафилококкового

бактериофага для применения в условиях производства.

3. Отработать методы очистки и концектрирования больших объемов стафилококковых фаголизатов

Л . Изучить возможность создания лекарственных форм препарата стафилококкового бактериофага, отвечающих запросам практического здравоохранения.

5. Научное и экспериментальное обоснование ■создания новой технологической линии.

Научная новизна и практическая значимость работы: Разработан способ реакторного культивирования стафилококкового бактериофага, позволяй1 й получать его с высокой литической активностью в производственных условиях. Способ дает возможность увеличить выход стафилофага в 10-100 '-аз. Впервые отработаны методы концентрирования и очистки больших объемов стафилококковых фаголизатов с использованием ионообменной хроматографии на ДЭЛЭ-целлюлозе и мембранной фильтрации. Созваны новые лекарственные формы препарата стафилофага:. жидкий концентрированный очищенный, сухой таблетнрованный с кислотоустойчивым покрытием и линимент. Все лекарственные формы обладают высокой литической активностью и служат для лечения различных заболеваний стафилококкрвой этиологии.

На разработанную технологию оформлена нормативно-техническая документация:

1. Изменение к регламенту производства "Бактериофаг стафилококковый жидкий" II 168-80;

2. Изменение к ФС 42-103-ВС-88 "Бактериофаг стафилококко. ли жидкий"; (

3. Изменение к ФС 14-189-ВО "Бактериофаг стафилококковый мазь";

4. ВФС 42 ... "Бактериофаг стафилококкозый оч;;щонны;1 сухой.

с кислотоустойчивым покрытием".

Нозая технология производства стафилококкового бактериофага обеспечппает получение препарата высокого качества.

Приоритетность исследования подтверждена авторским

свидетельством1 на изобретение N 1526225 "Способ получения стафилококкового бактериофага". Препарат удостоен серебряной медали ВДНХ СССР.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Отработан режим реакторного культивирования стафилококкового бактериофага, позволяющий увеличить литическую активность и выход фага в 10-100 раз.

2. Впервые разработаны методы концентрирования и очистки больших . объемов стафилококкового бактериофага, применимые в условиях производства.

3. Созданы три новые лекарственные формы препарата стафилококкового бактериофага, отличающиеся высокой литической активностью и стабильностью.

Структура диссертации. Диссертационное исследование состоит из введения, обзора литературы, главы "Материалы и методы", трех глав собственных исследований, заключения , выводов и списка литературы. Работа изложена на 115 страницах машинописи, иллюстрирована 2 рисунками и 12 таблицами. Список литературы содержит 192 отечественных и 76 зарубежных источников.

Публикации. По тема диссертации опубликовано 8 научных работ.

Апробация диссертации. Материалы диссертации были доложены на научной конференции Уфимского НИИВС (апрель, 1986), республиканской научной конференции в г.Уфе (апрель, 1988), итоговой научной конференции Уфимского НИИВС, посвященной дню науки (апрель, 1989), конференции молодых ученых в Московском НИИЭМ им.Г.Н.Габричевского (март, 1991), республиканской научно-практической конференции-семинаре" в г.Уфе (февраль, 1993). Диссертация апробирована на заседании Научно-технического Совета Уфимского НИИ вакцин и сывороток НПО "Иммунопрепарат" 06.07.93 г.

- 6 -СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И ИЕТОДЫ.

В работе использовали 115 штаммов стафилококка Staphylococcus aureus, выделенные и идентифицированные в лаборатории биохимии Уфимского НИИ вакцин и сывороток им., И.И.Мечникова из культур, полученных в бактериологических лабораториях лечебных учреждений г.Уфа и из регионов, куда традиционно поставляются препарг ы бактериофагов производства НПО "Иммунопрепарат". Типирование стафилококков проводили с использованием международного набора типовых бактериофагов (Англия). Штаммы соответствовали по культуральным, морфологическим, биохимическим и серологическим свойствам требованиям нормативно-технической документации; не содержали свободного фага и лизировались соответствующим маточным бактериофагом. Согласно регламенту производства

стафилококкового бактериофага работа со штаммами предполагает систематическое их пополнение из различных источников и вклинение в посев наряду со Staphylococcus aureus также коагулазоотрицательных стафилококков.

Штаммы бактериофагов выделяли в лаборатории биохимии Уфимского НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова НПО "Иммунопрепарат" из сточных вод г.Уфы и других городов, от больных стафилококков! и заболеваниями, а также из состава маточных бактериофагов производства НПО "Иммунопрепарат".

В работе'Применяли следующие цитате ьныо среды:

1) Бульон Мартена;

2) Бульбн Хоттингера;

3) Полусинтетическую среду;

4) Среду на основе кислотного гидролизата казеина;

5) Эприно-сывороточную среду,

Во все питательные среды, использованные для культивирования фага, добавляли глюкозу до конечной концентрации 0,4 % . |

При титровании бактериофагов, для получения посевной культуры и хранения штаммов использовали 1,5 а мясо-пептонный агар, а также применяли 0,7 X мясо-пептониый агар и титровальный бульон.

Культивирование фага осуществляли в стационарных условиях и ' в условиях периодического динамического глубинного культивирования. В материалы диссертации включили данные ¿4 опытов в стационарных условиях и 78 опытов по периодическому культивирование.

Определение одиночного цикла развития стафилофага проводили по . суммарному количеству неадеорбированного и вновь образовавшегося фага (Габрилович И.М. с соавт., 1973).

Концентрацию микробных клеток определяли на. ФЭКе 56М со сг тофильтром N 6. Калибровочный график оптической плотности стафилококков строили с использованием оптического стандарта мутности на 10 единиц производства ГИСК им. Л.А.Тарасевича.

Для стерилизующей фильтрации фаголизатов и концентратов стафилофага использовали картон КФБЖ в качестве префильтра, мембраны "Миллипор", "Владипор" и "Мифил" с размерами пор 0,22 мкм, заправленные в фильтродержатели. Подготовку и проведение стерилизующей фильтрации осуществляли согласно методическим разработкам Московского НИИ вакцин и сывороток

им.И.И.Мечникова (Перепечкина Н.П. с соавт., 1988).

Серии препаратов контролировали в лаборатории биохимии УфНИИВС им.И.И.Мечникова, в ОБТК НПО "Иммунопрепарат" и в ГИСК им. JI. А. Тарасевича. Препараты проверяли на специфическую стерильность, безвредность, литическую активность, в тнблетированную форму также на кислотоустойчивость и распадаемость в щелочной среде, остаточную влажность и средний вес таблеток в соответствии с требованиями и методами, изложенными в ФС 42-64ВС-87, ФС 42-107ВС-8В, Регламентах производства N 189-80, N 205-81 и Инструкциях МЗ СССР.

Литическую активность фага' определяли методом Аппельмана (Адаме М., 1961), титр - двуслойным агаровым методом (Gratia А., 1936).

Контроль литической активности препаратов фага проводили через 6, 12 и 1В месяцев хранения при температуре (6 ± 4)° С.

Оптическую плотность элюатов измеряли на ультрафиолетовом адсорбциометре "Увикорд II" с использованием полной системы для хроматографии и гельфильтрации фирмы "LKB" ( Швеция ) при длине волны 254 нм.

Концентрацию НаСХ во фракциях определяли титрованием 0,1 М AgH0g в присутствии KgCrO^.

Контроль чистоты препаратов осуществляли путем определения содержания общего белка методом Лоури ( Lowry Ö.H. et al. , 1951) на ФЭК'е 56 М. в

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили методом вариационной статистики (Ашмарин И.П., Воробьев A.A., 1962).

-в -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ СТАФИЛОКОККОВОГО БАКТЕРИОФАГА.

При выборе способа культивирования исходили из того, что он должен быть технологичен, позволял получать фаг с высокой литической активностью и в больших объемах. Таким требованиям в условиях производства отвечает реакторный способ.

Ь целях отработки методичес их подходов к получению фага указанным способом, провели ряд экспериментов по культивированию стафилофага в небольших объемах питательной среды - бульона Мартена с глюкозой в конечной концентрации 0,4 % и с рН 7,0-7,2. Культивирование фага осуществляли в:1 л банке аппарата Боброва с 300 мл среды. - -

Для выбора оптимальных условий выращивания стафилофага изучили параметры роста бактериальных клеток на указанной среде и отработали оптимальные условия культивирования стафилококков.

В ходе культивирования осуществляли непрерывную аэрацию питательной среды путем подачи стерильного воздуха. Образуемую пену разрушали кремнийорганическим пеногасителем КЭ-10-12 или "Антифомсиланом".

После проведения серии опытов установили, что оптимальная аэрация среды обеспечивалась воздухом, подаваемым в количестве 1,5-2 объемов на 1 о<" • ем культуральной среды в минуту.

Результаты культивирования стафилококков на бульоне Мартена

представлены на рисунке 1. График отражает рост и развитие

бактериальных клеток после внесения их в среду в конечной 7

концентрации 2-3-10 в 1 мл.

Как показали исследования ряда авторов, наибольший выход биомассы фагов отмечается . при их культивировании на клетках экспоненциально размножающейся бактериальной популяции (Хлебо-прос Т.Р. с соавт., 1980; Казакова Т.Б., 1987). Экспоненциальная фаза роста характеризуется, в частности, незначительным количеством нежизнеспособных клеток. Поэтому мы заражали клетки фагом, в начале экспоненциальной фазы.

В ходе изучения одиночного цикла развития установили, что при описанном режиме культивирования латентный внутриклеточный период развития стафилококкового бактериофага составляет 45-50 минут, а урожайность -6-7 инфекционных фаговых частиц из о; .ой зараженной бактериальной клетки.

Полученные данныа позволили . определить оптимальную концентрацию бактерий-хозяев в ' момент заражения их фагом и множественность инфекции.

Результаты культивирования стафилофага в аппарат» Бобров»

при различных концентрациях бактерий и множественности заражения

их фагом представлены в таблице 1..

Данные приведенные о таблице, показывают, что оптимальными

зпчениями, обеспечивающими наибольшую литическую активность

фага, являются: концентрация микробных клеток в момент 9

инфицирования 1-1,7-10 кл/мл и множественность заражения 1:6-7. млрд/мл

Рис. 1. График периодического динамического глубинного культивирования стафилококков на бульоне Мартена в аппарате Боброва.

Временной интервал, в течение которого концентрация клеток

достигала указанной величины составил 2-2,5 часа, а лизис

культуры происходил через 3-3,5 часа после заражения фагом, т.е.

через 3-4 цикла размножения фага. Однако, при заражении фагом

9

клеток в концентрации выше 2*10 в 1 мл полного лизиса не наблюдали, несмотря на увеличение продолжительности

А

культивирования после заражения фагом до 5 часов.

Вышеизложенное позволило перейти к масштабированию процесса в последовательно возрастающих объемах питательной среды: в 3, 5 и 10 литрах. В таблице 2 приведены результаты типичных опытов по культивированию фага при оптимальных условиях в указанных объемах

Таблица1

Сравнение результатов культивирования стафилофагов в аппарате Боброва при различных концентрациях бактерий-хозяев и множественности заражения

Параметры куль- ПРИ МЕР Ы

тииировйния 1 2 3 4 5 6

Концентрация микробных клеток в момент заражения фагом о 1-1,7•10 5-108 1-109 1-Ю9 1,3-1,7 -До' 1 1•109

Множественность ччражнния 1:6-7 1:6 1:10 1:2 1:100 1:6

Иремя сокульти-иирования фаг-Гшкунрия (ч) 3,0 2,0 3,0 2,0* 3,0 4,о"

Литическап активность фаголизата по Аппельману (средние данные) кГ7-6 10-5,8 ю"7 ю-6;6 до"7 ю"7-6

Концентрация микробных клеток в фаголизате о 0,07-10 0,06-109 9* 0,65-10 •• 0,04-Ю9 о» •» 1-10* 0.08•10

Примечание: * При увеличении множественности заражения до 1:2 экспозиция ограничивается 2-мя генерациями, что приводит к уменьшенному количеству конечного продукта

Увеличение времени сокультивироврчия не отражается на конечном результате

■«•

При таких концентрациях микробных клеток в фаголизате затрудняется процесс микрофильтрации

Таблица2

Титр и специфическая литическая активность стафилококковых фаголизатоа, полученных периодическим культивированием в бутылях

Питательная среда Объем (л) Титр по Грациа (ПОЕ/мл) Литическая активность по Аппельману

бульон Мартена 5,0 10,0 2,2*0,16-109 3,46±0,81-109 10-7,19±0,18 10-7,840,48

Как следует из таблицы, различия в титрах фага, полученного в объеме 5 и 10 литров, не значимы (р>0,05), а по литической активности отмечается статистическая значимость найденных различий (р<0,05).

Культивирование в больших объемах среды отличается определенной сложностью, связанной с необходимостью обеспечения достаточной аэрации и однородности среды. Поэтому при культивировании фага в объеме среды более 10 литров перемешивание только за счет аэрирования уже было недостаточным и в работе использовали 100-литровый реактор с системой перемешивания, которая и позволяла добиться достаточно высокой гомогенности среды.

7

Бактериальную суспензию вносили в реактор из расчета 2-3-10 клеток на 1 мл питательной среды. Культивирование бактерий проводили при постоянной работе механической мешалки, скорость вращения которой составляла 150-200 об/мин. Аэрирование обеспечивали непрерывной подачей стерильного Воздуха в количестве 1 - 2 л на 1л среды. В процессе культивирования определяли концентрацию микробных клеток по калибровочному графику оптической плотности стафилококков. Бактерии заражали фагом с различной множественностью инфекции.

Проведенные в реакторе - культиваторе опыты показали, что параметры, подобранные при отработке условий культивирования в

а

малых объемах, были оптимальными и в условиях реакторного получения фага.

При множественности инфекции 1:6-7 видимый лизис бактериальных, клеток наступал через 3-3,5 часа. Это сопровождалось снижением оптической плотности культуральной

жидкости до 0,06 единиц.

Полученные данные явились основой для включения их в материалы авторского свидетельства.

В таблице 3 представлены результаты реакторного культивирования стафилококкового бактериофага на различных питательных средах после отработки оптимальных условий. Данные-таблицы показывают, что разработанный способ получения ■ фага имеет существенные преимуществ?', по сравнению с существующим статическим способом культивирования. Литическая активность фага составляла Ю'^-Ю-" и более, что в 10-100 раз выше литической активности фаголизатов, получаемых статическим способом. Статистически значимых различий в значениях литической активности стафилофага, полученного на указанных питательных средах но обнаружено (р>0,05). При сравнительном- анализе значений титров фага, полученного на бульоне Мартена и полусинтетической среде, на бульоне Хоттингера и полусинтетической среде, на бульоне Хоттингера и эприно-сывороточной среде также отмечали отсутствие статистически значимых различий (р>0,05). Сравнение титров фага, полученного на бульоне Мартена и Хоттингера, на бульоне Мартена и эприно-сывороточной среде, на полусинтетической и эприно-сыворо-точной средах выявило статистическую значимость найденных различий (р<0,05).

Необходимо отметит» экономическую эффективность применения менее дорогих безмясных сред, ,а именно:, полусинтетической и эприно-сывороточной сред при ' произвечетве стафилококкового бактериофага.

Таблиц аЗ Титр и специфическая литическая активность стафилококкового бактериофага, полученного реакторный культивированием на различных питательных средах

Питательная среда Количество опытов Титр по Грациа (ПОЕ/мл) Литическая ■ активность по Аппельману :.

бульон Мартена 6 3,99*0,6•109 ^0-7,58±0,15

бульон Хоттингера 3 18,4±8,7-109 10-8,5*0,5

полусинтетическая среда 8 4,79±0,9-109 10-7,5±0,5

эприно-сыво-роточная среда « 27 1,5+0,5-Ю9 10-7,5±0,5

Таким образом, в результате проведенных исследований разработан способ получения стафилококкового бактериофага реакторным культивированием на оптимальных питательных " средах, который обеспечивает высо;-./ю литическую активность фага и его мг"<н() эффективно использовать для производственного получения препаратов стафилофага. Вышеизложенные результаты подтверждают первое положение, выдвигаемое на защиту.

ОЧИСТКА И КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ СТАФИЛОФАГА Микрофильтрация фаголизатов.

Полученные фаголизаты содержали определенное количество нелизировавшихся клеток. Поэтому их фильтровали через микропористые мембраны, заправленные в фильтродержатели диаметром 142 мм или 293 мм. В качестве префильтра использовали картон для фильтрования биологических жидкостей (КФБЯ).

Для микрофильтрации небольших объемов фаголизата (до 2-х литров) применяли мембраны с размером пор 0,45 мкм и 0,22 мкм, заправленные в один фильтродержатель (142 мм).

Микрофильтрацию больших объемов фаголизатов (от 2-х до 30-ти литров и более) осуществляли через 6 слоев картона и каскад Микрофильтрационных мембран: "Миллипор" с размером пор 0,8; О,65; Р,45; 0,22 мкм, "Владипор" N2, Н5иЫ6с размером пор 0,15-0,25 и 0,45-0,65 мкм или "Мифил" с размером пор 0,22 мкм, заправленные в фильтродержатели диаметром 293 мм.

Рабочее давление при проведении процесса составляло 0,02 -0,06 МПа. Скорость фильтрации фаголизата через фильтродержатели диаметром 293 мм была в среднем 250-300 мл/мин., а через фильтродержатели диаметром 142 мм - 50-100 мл/мин.

В таблице 4 представлены результаты одного из типичных опытов по микрофильтрации 10 л фаголизата. Как следует из данных таблицы, микрофильтрация приводила к некоторому снижению титра фага (на 24,3 %). Однако, изменения литической активности при □том были незначительными и статистический . анализ показал недостоверность найденных различий как по титрам, так и по литической активности стафилофага (р>0,05).

Таблиц а4

Титр и специфическая литическая активность стафилофага до и после микрофильтрации фаголизата

Фаголизат Питательная среда Объем (л) Титр по Грациа (ПОЕ/мл) Литическая активность по Аппельману

до микрофильтрации после микрофильтрации Бульон Мартена 10,0 9,95 О 2,6210,5 -10 10-7,а±0,4й 10-7.7±0.5

Скорость фильтрации фаголизатов в "тупико'вом" режиме была невысокой. Поэтому для больших объемов применяли тангенциальную микрофильтрацию с рециркуляцией надмембранного потока. В этих целях применили установку фильтрационную реверсивную (УФР-2), разработанную и изготовленную в НПО "Иммунопрепарат". В плоскокамерные разделительные аппараты (ПРА-1М) было установлено 2 м2 мембран с размером пор 0,22 мкм. Скорость фильтрации на установке УФР-2 составила 3-5 л/мин., что обеспечивало быстрое проведение процесса разделения. Рабочее давление при этом составляло 0,04 МПа.

Результаты одного из типичных опытов приведены в таблице 5.

Из данных, предстпленных' в таблице, следует, что

специфическая литическая активность стафилококковых фаголизатов

после микрофильтрации в тангенциальном птоке сохранялась на

-7 84

довольно высоком уровне и составила 10 ■ . Это на 2.84 логарифма выше литической активности фаголизатов по требованиям существовавшей до настоящего времени НТД. Различия_ в значениях литической активности фага статистически не значимы (р>0,05), а сравнение титров показывает достоверность найденных различий (р<0,05).

Таблица5 Результаты микрофильтрации стафилококкового фаголизата в тангенциальном потоке на установке УФР-2

Фаголизат Питательная среда Объем (Л) Титр по Грациа (ПОЕ/мл) Литическая активность по Аппельману

до микрофильтрации через ПРА-1М после микрофнльтра-ции через ПРА-1М бульон Мартена 30,0 30,0 4,8*1,1-Ю9 2,,±0,4-109 10-7,8±0,2 • 10-7,84±0,1

Таким 'образом, в результате проведенных исследований показано, что бнромембранные методы обеспечивают эффективную микрофильтрацию больших , объемов ' стафилококковых фаголизатов и сохранение их высокой литической активности при атом. Более предпочтительным является метод баромембранного разделения в тангенциальном потоке, который сокращает продолжительность проведения процесса и позволяет его нести в автоматическом режиме.

В целях дальнейшей очистки фаголизатов изучили возможность использования двух альтернативных методов.

Концентрирование и очистка стафилофага методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе.

Стафилококковые фаголизаты после микрофильтрации содержат значительное количество белковых и других антигенных комплексов. Поэтому перед нами встала задача выбрать способы очистки стафилофага. применимые в условиях производственного получения фагов и обеспечивающие высокую степень чистоты препаратов.

Одним ля наиболее аффективных способов очистки является ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе. Имеется опит использования данного метода для очистки и концентрирования кишечных бактериофагов, отработанного Т.Г.Нигматуллиным с соавт. для производственных условий (Вискова Р.С, 1978; Горбаткова Г.А., 1983; Нигматуллин Т.Г., 19ЙЗ). Однако этот способ применительно к стафилококковому бактериофагу не разработан. Ввиду этого, ми поставили задачу изучить процесс концентрирования и очистки стафилококковых фаголизатов на ДЗАЭ - целлюлозе. В этих целях первоначально отработали оптимальный режим сорбции и элюции стафилофага на ДЭАЭ-целлюлозе и провели серию опытов с использованием колонок размером 15x200 мм и 30x150мм, содержащих 1-5 г волокнистой ионообменной диэтиламиноэтил-целлюлозы (ТУ 6.09.10.1381-79, НПО "Биолар") в ОН-форме. Через колонки пропускали 500-5000 мл фаголизата со скоростью 10-20 мл/мин.

Элюцию сорбированного стафилофага осуществляли линейным градиентом раствора NaCl (от О до 1,5 Mj, приготовленного на 0,05 М фосфатном буферном растворе с рН 7,2-7,4 при температуре 20-22° С.

Выход фага рассчитывали исходя из суммарного количества фаговых частиц, содержащихся в концентрате и в исходном фаголизате.

На рисунке 2 показан хроматографический профиль стафилофагов, полученный в одном из'опытов. Как следует из рисунка, десорбция

титр фага

М ЫнС!

10

10'

I I I I—г—г 10 11 12 13 14 15 16 17 18 фракции элюата

Рис. 2. Хроматография стафилококкового бактериофага на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Объем фаголизата 500 мл, объем фильтрата 500 мл, объем фракции 10 мл, ДЭАЭ-целлю-лоза 1 г, элюция градиентом ИаС! 0-1,5 М.

стафилофагов начиналась при концентрации хлористого натрия 0,2 Н ■ *

и продолжалась до концентрации элюента 0,9-1,0 М. Следует отметить, что при этом наибольшее количество фага элюировалось при концентрации ЫаС1 0,2-0,6 М/ В последующих опытах установили, что 1,0 М раствор ЫаС1 обеспечивает наибольший выход стафилофагов в наименьшем объеме элюента и поэтому в дальнейшем -в качестве элюента использовали указанную концентрацию хлористого; натрия. Результаты одного из типичных опытов приведены в таблице 6;

Из данных, представленных в таблице, следует, что 99,99 % фага сорбировалось на волокнистой ДЭАЭ-целлюлозе. При этом

фильтрат содержал менее 0,001 % фага от его количества -в фаголизате. Выход фага составил 92,09 % и его титр превышал исходный более, чем в 10 раз.

После отработки режима хроматографии на колонках, содержащих 1-5 г волокнистой ДЭАЭ-целлюлозы, последующие опыты проводили на колонках размером 55*200 мм и 7йх300мм, содержащих 50-100 г ионообмннника. Через колонки пропускали 20-30 л фаголизата со скоростью 2-3 л/час. Элюциет осуществляли 1,0 М раствором НаС1.

Наряду с концентрированием стафилофагов в процессе колоночной хроматографии происходила их очистка от продуктов метаболизма бактериальных клеток и компонентов питательной среды. О степени очистки судили по содержанию общего белка, который определяли методом Лоури.

Таблицаб

Результаты хроматографии стафилофагов на колонке с волокнистой ДЭЛЭ-целлюлозой

Материал Объем (мл) Титр по Грация (ПОЕ/мл) Литическая активность по Аппельману Адсорбция (%)

фаголизат 1000,0 о , 4,43-10 ю"7-4'

Фильтрат 1000.0 3-Ю4 10"3 99,99

Элюат 85.0 4,8-Ю10 10-8.5

В таблице 7 приведены результаты одного из типичных опытов по хроматографии препаративных количеств стафилофага. Данные таблицы свидетельствуют о том, что ионообменная хроматография на ДЭАЭ - целлюлозе обеспечивает высокую степень чистоты фага и этот метод пригоден для производственных целей.

Таблица'/ Очистка стафилококковых бактериофагов колоночной хроматографией на волокнистой ДЭЛЭ-целлюлоае

Материал Объем (л) Количество белка Очистки на ед.инф.фнг. частицы (%)

мг/мл мг/ед.инф. фаг.част.

Исходный фаголизат Концентрат 30,0 1.5 24,9 3,2 1.17-10~Н 1,2 -КГ1" 98,98

Концентрирование и очистка стафилофага баромембраниыми методами.

В ходе исследований изучили возможность концентрирования и очистки стафилофага баромембранным разделением. '

Концентрирввание и очистку свободных от бактериальных клеток фаголизатов осуществляли в тангенциальном потоке на установке с

ультрафильтрационными плоскокамерными разделительными аппаратами.

2

Аппараты были оснащены мембранами общей площадью 2 м , имеющими размер пор 100 кД. Циркуляцию надмембранного потока проводили при давлении 0,06-0,07 МПа. Скорость фильтрации пермеата составила ' 30-40 л/час.

Фаголизат в количестве 30 л концентрировали в 15-20 раз. Затем проводили дополнительную очистку концентрата двукратной диафильтрацией десятикратными объемами физиологического раствора на 0,05 и фосфатном буферном растворе с рН 7,2-7,4. .; ■ •

Конечной объем концентрата составлял 1,5-2,О л.

Установку промывали , раствором 0,8 И хлористого натрия на 0,05 М фосфатном буферном растворе в количестве 2-х литров.

Результаты одного из типичных опытов концентрирования фага тангенциальной ультрафильтрацией показаны в таблице 8.

Из данных таблицы следует, что в концентрате . содержится 90,5 % стафилофага от количества фага, находившегося в фаголизате после микрофильтрации. Найденные различия в значениях титров и литической активности стафилококкового бактериофага статистически значимы (р<0,05).

Т а б л и ц а 8 Лашшс концентрирования стафилококкового бактериофага баромембранным методом

Материал Объем (л) Титр по Грациа (ПОЕ/мл) Литическая активность по Аппельману Выход фагов по титру (X)

фаголизнт после микрофильтрации Концентрат 30,0 1,5 7,9±0,24-108 1,43±0,2-1010. 10-7,85±0,27 и)-8,86±0,21 100.0 90,5

Отработанный режим ультрафильтрации стафилококкового бактериофага позволил достигнуть удовлетворительной степени его очистки. Так, ид данных, представленных в таблице 9, следует, что очистка концентрата достигает 99,15 %. В фильтрат удаляется не менее 87,9 % белка от его общего количества в фаголизате после микрофильтрации при сохранении биологической активности стафилококкового бактериофага.

Таблица9

Результаты очистки стафилофага баромембрашшмп методами

Материал Объем Количество белка Очистка

(л) (мг/мл) <нг/П0Е)

Фаголизат после микрофильтрации 30,0 6,9 1,71-Ю-8 -

Концентрат до диафильтрации 2.0 12,3 9,74-Ю-10 88,1

Концентрат после диафильтрации 2.0 0,88 6,85- 10~П 99,15

Пермеат 28,0 6.5 - -

• Питательная среда: бульон Мартена

Таким образом, отработан метод очистки и концентрирования

стафилофага баромембранным разделением. Метод обеспечивает

производственное получение жидких концентратов фага с литической —7 —8

активно:—- >•, 10 -10 и очисткой по белку в пересчете на ПОЕ

более, чем на 99 % и его можно использовать наряду с ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе как альтернативный.

Вышеизложенные результаты .подтверждают второе положение, выдвигаемое на защиту.

РАЗРАБОТКА ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРИ СТАФИЛОКОККОВОГО БАКТЕРИОФАГА.

В настоящее время отафилофаг в нашей стране выпускается в двух лекарственных формах: жидкий (Нижегородский НИИЭМ, и НПО "Иммунопрепарат"(г.Уфа)) ив виде мази (Нижегородский НИИЭМ).

Известно, что чем выше концентрация бактериофага, вводимого в очаг инфекции, тем выше эффективность лечения. Очищенные концентраты стафилофага имели специфическую литическую активность в 100 - 1000 раз выше требований действующей НТД. Получение высокоактивных концентратов, а также достигнутая степень их очистки (как ионообменной хроматографией на ДЭАЭ - целлюлозе, так и баромембранными методами), позволили использовать эти концентраты в опытах по созданию жидкой очищенной лекарственной формы препарата, а также таблеток и мази.

Жидкий очищенный концентрированный стафилофаг.

Препарат очищенного концентрированного жидкого стафилофага представляет собой стерильный концентрат фага со специфической

_у „о

литической активностью 10 - 10 по методу Аппальмана.

Жидкие концентраты стафилофага в дальнейшем использовали и в опытах по созданию лекарственных форм препарата комбинированного бактериофага против ряда возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний. Эти опыты показали, что стафилофаг сохраняет высокую литическую активность во всех лекарственных формах названного препарата.

Препарат жидкого очищенного концентрированного

стафилококкового бактериофага разливали по 5 мл в 5 мл ампулы и по 5 и 20 мл в 20» мл флаконы.

Создание мазевой формы стафилофага.

• ' Для приготовления препарата стафилококкового бактериофага в

мазевой форме изучили возможность использования жидких

—7 -8

концентратов фага с литической активностью 10 -10 и различных основ.

В результате проведенных исследований установили, что хорошую сохраняемость литической активности фага обеспечивала

лекарственная форма в виде жирного линимента, в котором в качестве основы использовали касторовое масло, а для эмульгирования - ланолин безводный.

Сохраняемость титра стафилофага в препарате в форме мази на основе вазелина составила (Н4±5) Я , а в линименте на основе касторового масла с применением в качестве эмульгатора ланолина безводного отмечали 100 %-ную сохраняемость фага.

Специфическую литическую активность линимента определяли по методу Аппельмана. Предварительно разводили линимент в титровальном бульоне в соотношении 1:4 и выдерживали в термостате при температуре (3? ± 1)° С в течение 3-х часов.

Опытным путем установили оптимальный состав лекарственной формы стафилофага в виде линимента:

масс.%

Очищенный концентрат стафилофага 9,0 - 10,0 ' •

Раствор хинозола 1 %-ный 0,8 - 1,2

Ланолин безводный 25,0-35,0

Масло касторовое до 100,0

Следует отметить, что дальнейшее повышение количества концентрата фага при приготовлении линимента не приводило к увеличению литической активности препарата.

Стафилофаг в виде линимента сохранял литическую активность на высоком уровне в течение 1 года при температуре (6 ± 4)° С.

По лабораторным данным средняя литическая активность

линимента стафилофага'по методу Аппельмана составила к)"6'|,10'21

—7 2±0 '2

а по результатам фагового цеха - 10 . Литическая

активность стафилофага в препарате по действующей НТД - не ниже Ю-4. Полученные нами 5 экспериментально-производстенных серий линимента контролировали также а отделе биологического и технологического контроля НПО "Иммунопрепарат". Препарат в виде линимента стафилофага отвечал всем требованиям НТД. Средняя литическая активность его по данным ОБТК составила ,45±0,15^

что более чем в ЮО раз выше литической активности выпускаемого препарата стафилофага в форме мази.

Таким образом, в результате проведенных исследований, разработана и получена лекарственная форма препарата стафилококкового бактериофага в виде жирного линимента, характеризующаяся высокой степенью литической активности и стабильностью.

- 22 -

Разработка сухой таблетироканной лекарственной формы препарата стафилококкового бактериофага.

В связи с широким распространением стафилококковых энтероколитов, других заболеваний органов пищеварения

стафилококковой этиологии, весьма перспективным является применение для их лечения стафилококкового бактериофаги в виде таблетированной лекарственной формы препарата. Однако, описание подобной лекарственной формы.препарата стафилофага в литературных источниках нами не обнаружено. Сухая таблетированння форма • препарата обладает рядом преимуществ и может оказаться более эффективной для лечения по сравнении с препаратом в жидком виде. Во-первых, сухой тиблетированный бактериофаг с кислотоустойчивой оболочкой не инактивируатсп желудочным соком, что обеспечивает эффективную доставку препарата в кишечник; во-вторых, данная лекарственная форма не обладает неприятными вкусовыми

качествами И удобна для приема внутрь; в-третьих, что немаловажно, имеет преимущества при транспортировании, так как высушенный фаг стабилен и при отрицательных температурах.

С целью сохранения литической активности концентратов стафилофага в процессе лиофилизации, таблетирования и хранения были изучены способы их Стабилизирования различными средами и стабилизаторами (средой файбича, сгущенным обезжиренным стерилизованным молоком, . сухим обезжиренным стерилизованным молоком). ,

Для получения сухих препаратов стафилофага проводили

—8 —9

лиофилизацию концентратов с литической активностью 10 -10 на сублимационной сушильной установке ТГ-15-6. В этих целях очищенный стерильный концентрат фага со стабилизатором помещали в кассеты по 0,5 л. Затем сырую массу замораживали при -(40±2)° С в течение (18±2) часов. Замороженную массу высушивали в течение (42±2) часс .

Лучшую сохраняемость литической активности стафилофага как при лиофилизации^, так и при длительном хранении препарата отмечали при использовании в качестве стабилизатора сухого обезжиренного молока.

. Высушенные концентраты фагов таблетировали, используя традиционные наполнители.

Таблетирование осуществляли прессованием на таблеточной машине роторного типа. Вес таблеток составлял 0,1 и '0,2 г. Таблетки покрывали , кислотоустойчивой оболочкой из ■ацетилфталилцеллюлозы.

Таблетки контролировали на раопадаемость: они не распадались

в 0,1 н растворе НС1 в течение 3 часов и легко распадались в течение 30 мин. в щелочной среде (в 0,1 4 н растворе натрия углекислого кислого, рН 8,2-8,4) при температуре 37° С.

Препарат фасовали в 20 мл флаконы по 50 или 100 таблеток или в блистерную упаковку по 50 шт.

Необходимо отметить, что лучшей сохраняемостью литической активности при длительном хранении обладала сухая форма препарата стафилофага, пол\ ¡енная после концентрирования фага на ДЭАЭ-целлюлозе. В связи с этим, более предпочтительными для высушивания являются концентраты, полученные хроматогафией на ДЭАЭ-целлюлозе.

Таким образом, проведенные исследования . позволили разработать сухую таблетированную форму препарата стафилококкового бактериофага; которая удобна для применения и обладает высокой литической активностью. *

Результаты исследований по разработке лекарственных форм препарата стафилококкового бактериофага подтверждают третье положение, выдвигаемое на защиту.

ВЫВОДЫ.

1. Проведены научные и якспериментально-техналогические исследования по разработке методов получения стафилококкового бактериофага на уровне научной новизны и внедрения в практику.

2. Установлено, что оптимальными питательными средами для культивирования стафилококкового бактериофага наряду с бульоном Мартена являются: бульон Хоттингера, полусинтетическая и эприно-сывороточная среды.

3. Стафилококковые фаголизаты, получаемые а условиях периодического динамического гомогенного глубинного культивирования в реакторе, обладают более высокой литической активностью по сравнению с литической активностью фаголизатов, получаемых з статических условиях. Выход стафилококкового бактериофага при реакторном культивировании увеличивается в 10-100 раз.

4. Впервые для получения очищенных концелтратов стафилококкового бактериофага разработана схема поэтапной очистки фаголизатов, предусматривавшая использование микрофильтрации через мембраны, а также двух альтернативных методов: ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе или баромвмбра.чного разделения для их применения а производственных условиях.■ Показано, что концентраты стафилофага можно использовать для создания различных лекарственных форм препарата стафилококкового,- а также комбинированного бактериофагов.

5. Созданные три новые лекарственные. формы препарата стафилококкового бактериофага (жидкий концентрированный очищенный, сухой в таблетках с кислотоустойчивым покрытием и линимент) обладают высокой литической активностью и стабильны при длительном хранении (в течение 1 года).

6. Результаты исследований явились основой производственной технологии получения препаратов оч1. ценного концентрированного стафилококкового бактериофага, внедренной в ; производство НПО "Иммунопрепарат".

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации:

1.Характеристика литической активности препаратов стафилококкового бактериофага, полученных реакторным культивированием / И.Х.Наоибулин, Р.С.Вискова, Н.М.Якубенко, Т.С.Валеева, М.М.Пушкаре-ва, Т.Г.Нигматуллин //Вопр,мед.биотехнологии и иммунопрепаратов. Тез . респуб. науч.конф. -Уфа, 1988. -С.51-52. ,.

2. Новые лекарственные формы стафилококкового бактериофага / И.Х.Насибулин, Р.С.Вискова, Б.Г.Казаков, Н.М.Якубенко, Т.С.Валеева, Т.Г.Нигматуллин //Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии. Тезисы конференции. -Махачкала, 1990..-Ч.II. -С.188-189.

3. Препараты стафилококкового бактериофага для профилактики и лечения гнойно-воспалительных заболеваний/И.Х.Насибулин, Р.С.Вискова, Б.Г.Казаков, Т.С.Валеева, Н.М.Якубенко, Т.Г.Нигматуллин //Иммунитет и иммунологические препараты. -Уфа, 1991. -С.43-44.

4. Использование баромембранных методов в производстве препаратов бактериофагов против возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний / И.Х.Насибулин, Б.Г;Казаков, Р.С.Вискова, Т.С.Валеева, Н.М.Якубенко, Т.Г.Нигматуллин // Иммунитет и иммунобиологические препараты. -Уфа, 1991,- С.44.

5. Получение ичищшшых препаратов бактериофагов против возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний/ Б.Г.Казаков, И.Х.Насибулин, Р.С.Вискова, Т.С.Валеева, Н.М.Якубенко, Т.Г.Нигматуллин // Тезисы докладов VI Всеросс. съезда микробиологов, эпидемиологов и паразитологов. -Нижний Новгород, 1991. -Т.1. -С.174-175.

6." Использование мембранной технологии в производстве лечебно-профилактических бактериофагов/Б.Г.Казаков, И.Х.Насибулин, Р.С.Вискова, Н.и.Якубенко, Т.С.Валеева, Т.Г.Нигматуллин//Актуал.вопр.мед;биотех-нол.: Матер.науч.конф., посвящ. 85-летию Том. НИИ вакцин и сывороток НПО "Вирион". -Томск, 1991. -С.45-46.

7. Получение .очищенных препаратов стафилококкового бактериофага для

профилактики И лечения гнойно-воспалительных заболеваний / И.Х.Насибулин. Р.С.Вискова, Б.Г.Казаков, Н.М.Якубенко. Т.С.Валеева, Т.Г.Нигматуллин //Актуальные проблемы эпидемиологии, диагностики и клиники инфекционных заболеваний. Деп. в МРЖ, 1991, N <1-6. 8. Авторское свидетельство N • 1526225 "Способ получения стафилококкового бактериофага / Т.Г.Нигматуллин, Р.С.Вискова, И.Х.Насибулин, Т.С.Валеева, М.М.Пушкарева. -1989.