Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические свойства бактериофагов ENTEROBACTER и разработка научных основ технологии получения препарата бактериофагов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биологические свойства бактериофагов ENTEROBACTER и разработка научных основ технологии получения препарата бактериофагов"



РГ6 од

i 3 |'!0Н

На правах рукописи

АЛФЕРОВА ЗЛИНА ВЯЧЕСЛАВОВНА

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИОФАГОВ ENTEROBACTER И РАЗРАБОТКА НАУЧНЫХ ОСНОВ ТЕХНОЛОГИЙ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА БАКТЕРИОФАГОВ.

03.00.07. - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических надк

Москва - 1995

Работа выполнена в афинском научно-исследовательской институте вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова НПО "Иниунопрепарат".

Научный руководитель - доктор медицинских наук К.Н.Ворошилова

Официальные оппоненты:

- доктор биологических наук В.й,Мельникова;

- доктор биологических наук Е.й.Шмелёва.

Ведуцая организация - Государственный научно - исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов . им.Л.Й.Тарасевича МЗ РФ.

Защита состоится - "29" ивня 1995 г. в________часов на

заседании диссертационного Совета Д001.38.01. при научно исследовательском институте вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова Российской Академии медицинских наук по адресу: 103054. Иосква, пер.Мечникова, 5а.

С диссертацией моано ознакомиться в библиотеке Московского НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова.

Автореферат разослан "___"_____________1955 г.

Зченый секретарь диссертационного Совета кандидат медицинских наук

Н.Г.Кудрявцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТН

Актуальность проблемы. За последние десятилетия роль бактерий рода Enterobacter в этиологии гнойно-воспалительных заболеваний существенно возросла. Повышается удельный вес внутрибольничных инфекций, обусловленных зтии возбудителей. Наиболее часто порагавтся больные с иыыунодепрессивными состояниями - хирургические (Антипенко В.П., Куницкая С.А., Рудницкая Л.С., 1990; Еремин С.Р. с соавт.. 1992: Левансв A.B. с соавт., 1993; Синицина Г.Г. с соавт., 1935), ожоговые (Белоусов 10.Б., Моисеев B.C., Лепахин.В.К,, 1993; Сологуб В.К. с соавт,, 1985), урологические (Белоусов В.Б., Моисеев B.C., Лепахин В.К., 1993; Иванова К.И. с соавт., 1985; Киселева B.C., Цванг Ы.Б., Теблоева Л.Г., 1982; Тири З.И., Тюри М.З., 1988; Тюри 3.И., Тири К.3., ЛанцнерА.А., 1991), онкологические больные (Ерастова Е.И., Киселева Б.С., Сиоланская А.З., 1982), а такае дети первого года «изни (Абрикосова Н.В., Костюкова H.H., 1991; Апейкина М.Д. с соавт., 1991; Белокрысенко С.С., 1990; Васильева Л.И.. 1991; Воротннцева Н.В. с соавт., 1989; Гизатулина С.С., 1988; 1992; Егорова И.П. с соавт., 1991; Мазурина H.A. с соавт., 1991; Corretger З.Н., Canetuz Е., Uris S., 1379; John I.F., Sharbaudh R.I., Bannister E.R., 1982).

Для лечения гнойно-септических заболеваний, вызванных условно-патогенними бактериями E.coli, Staphylococcus, Streptococcus, Proteus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella наряду с антибиотиками успешно используют препараты бактериофагов (Братина Н.П.. Саасыгина Г.А., Буслаева Г.Н., 1984; Ворошилова H.H. с соавт., 1991; 1993; Галеев Ф.С. с соавт., 1993; Галеев М.А., Нустафин Т.И.. 1993; Красноголовец В.Н., 1989; Келадзе Г.Д., 1984; Тимербулатов В.М. с соавт., 1993; Шарипов P.A., Бикбаева Я.И., Габдуллин Н.Т., 1993; Slopek S. et al., 1983; 1935). Данных о применении для лечения

гнойно-септических заболеваний бактериофагов Enterobacter в доступной нам литературе не обнаружено, несмотря на высокую частоту неэффективности антибиотикотерапии из-за множественной

антибиотикорезистентности возбудителя (Мукова З.В. с соазт., 1992; Иванова К.И. с соавт., 1985; Лувсандагва 3. с соавт.. 1930; Семина H.A.. Ковалева Е.П., Генчиков Л.А., 1989; Brenner DJ.. 1981); или невозможности её из-за токсичности антибиотика 1Венцел Р.П., 1990; Канцеров P.D.. 1992).

Сведения по бактериофагам рода Enterobacter немногочислен!! и касаются в основном изучения биологических и серологических свойств умеренных фагов. использующихся для фаготипирования штаммов (Гайрабеков Р.Х., ПохилС.И., ЛиснякЮ.В.. 1S30; Лотиев К.В.. 1990: 1992; Не Xiaoqing, Pan Ruonan, 1992; Popovici М. et al., 1976). Данные по культивировании бактериофагов Enterobacter и очистке фаголизатов в в доступной литературе отсутствуит. Цель и задачи исследования.

Цель исследования - селекция и изучение биологических свойств вирулентных бактериофагов Enterobacter; разработка научных основ культивирования и очистки при получении препарата бактериофагов.Ü Достижение поставленной цели требует решения ряда задач. • Задачи исследования;

1. селекция вирулентных бактериофагов E.aerogenes, E.cloacae. E.agglonerans; изучение их биологических свойств;

2. конструирование препарата бактериофагов Enterobacter;

3. изучение зависимостей репродукции бактериофагов Enterobacter от способа и условий культивирования; разработка оптимизировании* режимов культивирования бактериофагов;

4. изучение закономерностей и разработка способа очистки препарате бактериофагов Enterobacter от бактериальных клеток и балластны) веществ культуральной среды;

5. получение экспериментальных серий препарата и экспериментальное изучение его биологических сеойстз.

Научная новизна работы.

Селекционированы новые вирулентные бактериофаги E.aerogenes, E.cloacae. E.agglonerans; изучены их биологические свойства и сконструирован препарат бактериофагов Enterobacter.

Зпервые изучена зависимость репродукции бактериофагов Enterobacter от способа культивирования. Установлено, что оптимальным для получения биомассы фагов является использование способа периодического динамического гомогенного глубинного культивирования.

Изучены закономерности репродукции бактериофагов Enterobacter в условиях периодического динамического гомогенного глубинного культивирования и определены оптимальные значения факторов, влияющих на виход биомассы бактериофага - резни аэрации, содержание в питательной среде аиинного азота и глюкозы, концентрация бактериальных клеток штаммов - продуцентов бактериофагов.

Впервые разработан способ очистки бактериофагов Enterobacter от бактериальных клеток и балластных веществ с использованием методов мембранного разделения.

Установлено. что разработанные технологические режимы культивирования и очистки позволяют получить препарат бактериофагов Enterobacter, обладающий широким диапазоном антибактериальной активности и нетоксичный при парэнтеральном введэнии.

Практическая значимость работы.

Впервые создан и экспериментально изучен новый антибактериальный препарат бактериофагов Enterobacter поливалентный, обладающий широким диапазоном я высокой степенью литической активности в отношении бактерий E.aerogenes. E.cloacae. E.agglomerans.

Разработана технология оптимизированного управляемого культивирования и очистки препарата.

б

Получены и экспериментально изучены три серии препарата бактериофагов Enterobacter.

Результаты выполненных исследований использованы при подготовке следующих нормативно-технических документов:

- Инструкция по изготовлении и контролю препарата бактериофагов Enterobacter поливалентного очищенного видного, утвернденная Ученым Советом Уфимского НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова НПО "Иммунопрепарат" (протокол Н2 от 01.03.94).

- Программа клинических испытаний препарата бактериофагов Enterobacter поливалентного очищенного жидкого для оценки роактоганности. безопасности и терапевтической эффективности, утвержденная Комитетом ИИБП МЗ РФ (протокол N4 от 23.06.94).

На защиту выносятся следующие положения:

1. Селекционированы и изучены бактериофаги E.aerogenes, E.cloacae. E.aeslonerans. Сконструирован поливалентный препарат бактериофагов, активный в отношении 71,2-84,ОХ штаммов E.aerogenes. 73,5-78,9% штаммов E.cloacae и 77,5-82,7% штаммов E.aggloierans.

2. Способ периодического динамического гомогенного глубинного культивирования на экспоненциально размноаанщейся бактериальной популяции в концентрации i-4xl(f бакт.кл./мл; в условиях 70-80У. насыщения культуральной среды кислородом: при содернании аминного азота 40мг2 и глюкозы в пределах 1-2мг/мл - является оптимальным при получении биомассы бактериофагов Enterobacter.

3. Способ очистки препарата бактериофагов Enterobacter от бактериальных клеток и балластных веществ методами ультрафильтрации в тангенциальном потоке и проточной микрофильтрации позволяет получить высокоочшценный ареактогенный препарат, обладающий широким диапазоном антибактериальной активности.

Структура диссертации. Диссертационное исследование состоит из введения, двух глав обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа излоаена на листах машинописного текста, иллшстрирована

24 рисунками и 15 таблицами. Список литературы содервит 175 отечественных и 36 зарубевных источников.

Апробация диссертации. Материалы диссертации был:; долокены на;

- Республиканской научно-практической конференции - семинаре по применению диагностических, профилактических и лечебных препаратов, выпускаемых НПО "Иммунопрепарат" для лечения гнойно-септических заболеваний, г.Уфа, 1993;

- Российской научно-практической конференции "Актуальные проблемы знутрибольничных инфекций", г.Москва, 1993;

Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета Уфимского НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова НПО "Иммунопрепарат" 31.01.94. По теме диссертации опубликовано 4 научные работы.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе применялись микробиологические, биохимические, гистологические, хроыатографические и математические методы исследований.

Объектом исследований были избраны:

- 152 штамма бактерий рода Enterobacter (в том числе 85 штаммов E.cloacae; 36 штаммов E.aerogenes и 31 штамм E.agglomerans), выделенные от больных с гнойно-воспалительными и энтеральными заболеваниями из различных районов СНГ, типичные по своим культуральным, морфологическим и физиологическим свойствам;

- селекционированные нами вирулентные клоны бактериофагов - 12 клонов E.cloacae; 14 клонов E.aerogenes и б клонов E.aeßlomerans, вошедшие в препарат бактериофагов Enterobacter поливалентный,

В работе использовались жидкие и агаровые питательные среды с основами роста в виде ферментативного гемогидролизата и казеинового гидролизата Хоттингера, а также мясо-пептонный бульон. Для сохранения капсульных форм бактерий Enterobacter использовали 0,4% агар на основе среды Верфеля.

Для изучения токсичности препарата использовали белых беспородных мышей массой 18-20г.

С целые селекции вирулентных бактериофагов Enterobacter проведено 346 клонирований на 152 штаммах с изучением спектра и степени литической активности бактериофагов.

При изучении фаз взаимодействия бактериофагов с бактериальными клетками бактерий-продуцентов, урояайности ' бактериофагов, процессов репродукции бактериофагов использовали методы, описанные Адаме К. (1961). Диапазон и степень литической активности бактериофагов

определяли методой Аппельыана (Адане М.. 1961); концентрацию фаговых частиц - методом ft.Gratia (Gratia А.. 1935).

Концентрации микробных клэток опредаляли с помоцьа датчика оптической плотности (ИПС-1) и оптического стандарта мутности на 5 и 10 единиц производства ГИСК им. Л.А.Тарасевнча.

При разработке режимов культивирования бактериофагов использовали методы периодического статического и периодического динамического культивирования (Баснакьяк И.А..1992),

Культивирование иаздого вида бактерий • и бактериофагов производили отдельно.

Статическое культивирование проводили во флаконах, заэстиаостьа 0,5 литра, и бутылях, вместимостью 15 литрсв.

Изучение закономерностей процессов репродукции бактериофагов и разработку оптимальных режимов периодического динамического культивирования проводили в ферментере Cheuap (объем 20 литров), оснащенном системами термостатирования, перемешивания и аэрирования и в ферментере "Фермус - 3" (объем Юл.), оснащенном системами автоматизированного регулирования и контроля технологических параметров - температуры, числа оборотов мешалки, pH, содержания растворенного кислорода; а такие датчиком измерения оптической плотности культуральной среды.

Зсего проанализировано 384 процесса культивирования бактериофагов в условиях периодического статического и периодического динамического культивирования.

Оценку роста и физиологической активности бактериальной популяции проводили пс динамике изменения концентрации бактериальных клеток, удельной скорости роста и рпекени генерации бактериальной популяции, методами описанными С.Да.Пертом (1978).

Очистку препарата производили методом ультрафильтрации в тангенциальном потоке на плоскорамных аппаратах УФР-1м*с мембранами

1С

УПЫП-100 с порогом задержания веществ - 100-200kD.

Стерилизующую микрофильтрацню фаголизатов проводили способом каскадной проточней фильтрации через фильтр-картон и ацетат целлюлозные мембраны Ш5Й-Й - N1;2 и КОЦ К2;3;4, с размером пор 0,2 -0,7мкм.

Содержание белка в фаголизатах на различных этапах очистки определяли методом Лоури (Loury Q.N., 1951). Степень очистки фаголизатов контролировали методом кидксстной хроматографии (Остерман Л.Й., 1985) на Сефакриле S-200 (размеры колонки 1,5x70см, длина волны 280нм). В качестве маркеров использовали рибонуклеазу й (м.м.13,7к0), химотрипсиноген Й (м.м.25кС), овальбумин (м.м.43кВ).

Токсичность бактериофагов на различных этапах"очистки изучалась в экспериментах острой и хронической токсичности в соответствии с РД-42-28-8-89 "Доклинические испытания новых медицинских иимунобиологических препаратов". Имнроструктурные изменения во внутренних органах изучали методом гистологических срезов тканей (Меркулов Г.Й., 1969). В эксперименте острой токсичности исследования проводили через 7 дней; в эксперименте хронической токсичности часть животных исследовали на следующий день после окончания 20-дневного курса введения фага, а другую - через 7 дней после последнего введения. Контрольным группам животных вводили физиологический раствор.

Изучение антибиотикочувствительнссти клинических штаммов бактерий, проводилось методом оуыаиких дисков.

Экспериментальные данные обрабатывались методами вариационной статистики с использовании t-критериа Стьвдента и коэффициента корреляции (г). (Лакин Г.Ф., 1990).

Три экспериментальные серии препарата бактериофагов Enterobacter • поливалентного прошли контроль в 0ЕТК НПО "Иимунопрепараг" и s ГИСК им.Л.Й.Тарасевича на стерильность, безвредность и литическую

активность в соответствии с Инструкцией по изготовлении и контролю препарата бактериофагов Enterobacter поливалентного, утверяденной 27 марта 1994г.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВаНИИ

С цельи создания препарата и разработки научных основ технологии его 'получения нами были селекционированы вирулентные бактериофаги Enterobacter и изучены их биологические свойства.

Бактериофаги Е. aerogenes характеризовались латентным периодом внутриклеточного размножения 20,0-28,6мин и урожайностью 40,0-102,Офаг.част/ бакт.кл. Для бактериофагов Е. cloacaa эти данные соответственно составляли 20,7-30,0мин и 30,5-81,2 фаг.част./бакт.кл.; для бактериофагов E.agglouerans 26,4-34,7мин и 27,5-112,3 фаг.част./бакт.кл.

На основе выделенных вирулентных клонов сконструированы маточные расы фагов Е.aerogenes, E.cloacae и E.agglomerans, обладающие широким диапазоном и высокой степенью литической активности в отношении гомологичных видов бактерий. Так бактериофаги Е.aerogenes лизировали 81,2 - 90,4% штаммов гомологичных бактерий, E.cloacae.- 77,6 - 89,17.; E.agglomerans - 76,8 - 83,Vi..

Проведенными исследованиями установлено, что значительное влияние на параметры экспоненциального роста бактериальной популяции и выход фага оказывает способ культивирования бактерий и бактериофагов - таблица 1.

При сравнении периодического статического культивирования и периодического динамического гомогенного глубинного культивирования, установлено, что для бактерий Е.aerogenes и E.agglonerans значения максимальной концентрации бактериальных клеток и максимальной удельной

Таблица 1

ВЛИЯНИЕ СПОСОБА КУПЬТйЕИРСВР.КИЯ НА РЕПРОДУКЦИЙ БАКТЕРИИ И БАКТЕРИОФАГОВ

Способ культивирования

Параметра роста .

бактериальной !---------------------------------------------

и фаговой .'периодическое дкканическое.'периодическое ста-

популяции ¡гомогенное глубинное ¡тическое глубинное

Статическая значимость различия. Р

Максимальная концентрация бакт.кл./мл, lgXnax, lgciUsx) E.aerogenes Е.cloacae E.aealomerans

10,0*0.01 10,1*0.01 10,3±0,02

9.2*0.08 9,8*0.03 9,7*0,04

P < 0,001 P < 0,01 P < 0,001

Максимальная удельная скорость роста, йвах.ч-1 X¿sx J

E.aerogenes E.cloacae E.agglomerans.

1.9*0.06 1,9*0.04 2.0*0.03

1,0*0,07 1,9*0,08 1,0*0.03

P < 0,001 P > 0,05 P < 0.001

йинималъное время генерации бактериальной популяции. tdmin,4. Xigx E.aerogenes E.cloacae ' E.aggloaerans

0.4*0.05 0.4*0.02 0,4*0.01

0,7*0,02 0,4*0,02 0,7*0,06

P < 0,001 P > 0,05 P < 0,001

Максимальный выход фаговых частиц, lgPiax, lgCX*sx)

E.aerogenes E.cloacae E.aaslousrans

9.50*0.04 9.90*0,04 10,0*0,05

8.8*0.05 8,9¿p,04 7.9*0.02

P < 0,001 P < 0,001 P < 0,001

ости роста били наибольшими С Р< 0.001; Рс0,001), а времени рации наименьшим С Р< 0,0015 при использовании способа одического динамического культивирования.

Для бактериофагов Е.cloacae значения Jlicax и tdnin не зависели от ;оба культивирования СР>0.05; Р>0,05 3 . тем не менее значения IsXasax I достоверно выае СР<0,001) при использовании способа юдического динамического культизирования.

Для всех трех изученных бактериофагов выход фага был наиболызим периодическом динамическом культивировании С Р<0,001).

В результате изучения влияния содераания аминного азота на десс роста бактериальной популяции, показано, что изменение дентрации аминного азота в пределах от 40мг% до 260мг% не приводит гатистйчески значимым изменениям значений максимальной концентрации териальных клеток, максимальной удельной скорости роста и имального времени генерации бактериальной популяции.

Изменение содераания аминного азота в указанных пределах не яло на степень адсорбции фага, длительность латентного периода, ичину выхода фаговых частиц из одной инфицированной бактериальной тки и на конечный титр фага.

Снижение концентрации аминного азота до 20мг2 приводило к тистически значимому уменьшении значений параметров поненциальнсго роста бактериальной популяции (IgXsiax, Jiiiax и tdnirt) х трех видов бактерий. Наблюдалось такке уменьшение урожайности и :ода биомассы бактериофагов E.aerogenes, Е.cloacae, E.agglomerans, [ статистической значимости различий. На степень адсорбции фаговых :тиц на бактериальных клетках и длительность латентного периода [триклеточного развития фага уменьшение содержания аминного азота до (ГУ. достоверно не влияло (Р>0,05).

.Таким образом, в результате проведенных исследований,

установлено, что оптимальным для получения биомассы бактерий и фагов рода Enterobacter является использование питательных сред с содержанием ааинного азота 40мг2.

Изучение влияния исходного содержания в питательной среде глюкозы показало, что изменение концентрации её в пределах 0,05 - 0,52 не приводит к выраженному изменению выхода биомассы бактерий и бактериофагов всех трех изучаемых видов (Р>0,05; Р>0,05)-рисунок 1.

Изменения содержания глюкозы в питательной среде в указанных пределах не оказывало существенного влияния на изменение значений максимальной удельной скорости роста и минимального времени генерации бактериальной популяции E.aerogenes. Для бактерий E.cloacae значение максимальной удельной скорости роста было наибольшим, а времени генерации бактериальной популяции наименьшим, при исходном содержании глюкозы в питательной среде - 0.52: для E.aggloierans - 0.32 (Р<0,05; Р<0,05).

Корреляционной зависимости между значениями 1 gXmax, Jlmax, tdmin и изменение« содержания глюкозы в питательной среден пределах от 0,05 до 0,5% выявлено не было СР>0,05).

Степень адсорбции фага на бактериальных клетках, длительность латентного периода внутриклеточного развития фага, величина выхода фаговых частиц из одной инфицированной клетки не зависели от изменения исходной концентрации глюкозы в питательной среде в указанных пределах С Р>0,05: Р>0,05; Р>0,05).

Установлено, что степень насыщения культуральной среды кислородом (р(у оказывает сильно выраженное влияние на процессы роста и репродукции бактериальной к фаговой популяции - рисунок 2.

При степени насыщения культуральной среди кислородом - 70-80% наблюдался наибольший выход биомассы бактерий и фагов для всех Tpejf

¿дРтах

Рис.1. Зависимость выхода фаговых частиц Enterobacter от концентрации глюкозы в питательной среде.'.

lgPiax - логарифм максимального титра фага: Со гл. - концентрация гликозы в питательной среде,

1 - Е.аегогепез:

2 - E.cloacae;

3 - E.ageloaerans.

LgPtnax

Рис. 2. Зависимость выхода фаговых частиц Enterobacter от концентрации растворенного в кцльтыральной среде кислорода.

IgPaax - логарифм максимального титра фага,' р02 - концентрация растворенного в крьтдральной среде кислорода, 'JL\

1 - E.aerogenes:

2 - E.cloacae;

3 - E.aßßloierans.

¡ценных видов.

Уменьшение содержания кислорода в культуральной среде до 30-40% ходило к статистически значимому снижению выхода биомассы бактерий фагов С Р< 0.01; Р<0,01).

Для бактерий E.aerosenes изменение в культуральной среде слорода оказывало существенное влияние на значения максимальной ельной скорости роста и минимального времени генерации бактериальной пуляции. Значения JUax было наибольшим, a tdmin - наименьшим, при сыщении культуральной среды кислородом - 70-80%.

Изменения значений Jluax и tdmin для E.aggloiaerans и Е.cloacae и уменьшении насыщения среды кислородом с 70-80% до 30-40% были атистически не значимыми (Р>0,05; Р>0,05).

Уменьшение степени насыщения культуральной среды кислородом до •5% приводило к выраженному снижении всех параметров роста [ктериальной популяции для E.aerogenes и E.agglonerariS.

Для Е.cloacae достоверных изменений значений максимальной ;ельной скорости роста и минимального времени генерации не »блшдалось С Р >0,05; Р>0,05), но снижение значения максимальной жцентрации бактериальных клеток было статистически значимо '<0,001).

Для всех трех изученных видов бактериофагов установлено эстоверное снижение выхода биомассы фага СР<0,001) при уменьшении гепени насыщения культуральной среды кислородом с 30-402 до 3-5%.

Степень адсорбции фага на бактериальных клетках и время атентного периода не изменялась в зависимости от содержания в ультуральной среде кислорода.

Была установлена прямая, сильно выраженная, корреляционная ависимость между максимальной концентрацией бактериальных клеток и одержанием в культуральной среде кислорода Сг=0,9Й для E.aerogenes и .aeelonerans и г=0,978 для Е.cloacae); и между максимальным выходом

I ь

фага и содерианием в культуральной среде кислорода Сr=Ü,995 для E.aerogenes, г=0,986 для E.cioacae и 0,99 для E.agglouerans).

Таким образом, оптимальным для получения биомассы бактериофагов является интенсивность аэрации, ооеспечкванщая степень насыщения культуральной среды кислородом (püj>) - 70-80%.

Показана прямая зависимость выхода биомассы фага (IßPnax) от удельной скорости роста бактериальной популяции для всех трех изученных видов бактериофагов - рисунок 3 и соответственно, обратная зависимость выхода биомассы фагов от времени генерации бактериальной популяции - рисунок 4.

Установлено, что на величину максимального выхода фаговых частиц С lßPmax) влияет концентрация микробных клеток экспоненциально размнонающейся бактериальной популяции ClgX) в момент заражения фагом. Для всех изученных бактериофагов эта зависимость представляет собой экстремальную кригуш второго порядка - рисунок 5. При этом выход фаговых частиц возрастает при увеличении концентрации бактериальных клеток (IgX) от 7,5 до 9,3*0,3 (прямая корреляция lgPmax-lgX), дальнейвее увеличение концентрации бактериальных клеток в момент заражения фагом (IgX) - дс 10,0, приводит к снижения выхода фаговых частиц (обратная корреляция lfP:ax-l;X), При этом максимум выхода фага обнаруживается для E.aerogenes при значении lgX-9,0*0.03; для E.cioacae - 9,4*0,02; для E.aeglomerans - 9,6*0,02. Из этого следует, что для зарааения бактериофагом культуры E.aerogenes оптимальным является концентрация экспоненциально размноааюцейся массы бактерий (IgX) - 9,0*0,03; E.cioacae - 9,4*0,02; E.agglomerans - 9,6*0,02.

Для разделении микробной и фаговой популяции фаголизатов бактерий Enterobacter нами был разработан способ, предусматривающий каскадную проточную микрофильтрациш фаголизатов через фильтр-картон и

¿дР,

так

19

10 .

9.

8.

¿о*

2 М.Ч~'

Рис.з. Зависимость выхода фаговых частиц Enterobacter от удельной скорости роста бактериальной популяции.

логарифм максимального титра фага; удельная скорость роста бактериальной популяции, час*;

1 - E.aeroßanes;

2 - E.cloacae;

3 - E.agaloierans.

IgPaax -ß ~

¿9Р<

тах

10.

8,

—г-2

ы,«

Рис. 4. Зависимость выхода фаговых частиц Enterobacter от времени генерации бактериальной популяции.

IgPaax - логарифм максимального титра фага;

td - время генерации бактериальной популяции, час;

1 - E.aerogenes;

2 - E.cloacae;

3 - E.aßgloaerans.

¿д Ртак

Рис.5, Зависимость выхода фаговых частиц Enterobacter от концентрации бактериальных клеток в момент заражения фагом,

1еРшах - логарифм максимального титра фага;

lgX - логарифм концентрации бактериальных клеток;

1 2 3

- E.aerogenes;

- E.cloacae;

- E.aßgloBerans.

ацетат-целлюлозные мембраны с размером пор и,2 и 0,7мкы, и позволяю! получить выход биомассы фагов E.aerogenes - 71,3*8,7%, E.cloacaE 68,6*3,5%, E.asßloserans - 73,5*6,4%; при соеспеченик стерильно! продукта фильтрации.

С целью снижения раактогенностк препарата бактерг.офа! Enterobacter, предназначенного для г.арэнтерального и знтеральн' введения, нами был разработан способ ультрафильтрации в тангенциаль потоке на мембранах с порогом задержания веществ с молекулярной мае 100-200kD с последующей проточной стерилизующей микрофильтрацией че ацетат-целлюлозные мембраны.

Проведенные исследования показали, что использование зт способа позволяет получить Бысокую степень очистки фагслизатов белку - 91,8*1,2%, Выход биомассы фагов при ультрафильтрации для е трех видов составил 97,6*1,5%, после стерилизующей микрофильтрг 67,4*2,7%.

Хроматографическое изучение фаголизатов бактерий Enterobactei различных этапах очистки показало, что питательная среда и фаголи: содержали белковые конпоненты с молекулярной массой до 20< Разработанный режим очистки позволил получить равномерное удал1 всех белковых компонентов - рисунок 6.

При изучении влияния разработанного нами способа очистк биологические свойства фаголизатов бактерий Enterobacter эксперименте острой токсичности установлено, что в неочице вариантах бактериофаг Enterobacter при внутрибрааинном введении в 0,5ыл, то есть в 1500раз превышающую максимальную разовую, в рас на единицу массы тела животного, вызывал падение массы тела и rv 60*1% мышей в первые 72часа после введения. При гистологич( изучении внутренних органов животных, оонаружены изменена структуры, проявляющиеся в умеренных циркуляторных расстройся дистрофических изменениях в печени и почках очагового характера в

а

чз о

Cli

с

■ 1=

о m я

У

э ю а о. е

w

О '

m (Ч

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА

150 Уалюага ■ (CUJ)

■^гтггппттТТТГТТТ

ilDv

ФА ГОЛИ ЗА ТЫ ПОСЛЕ ШРОФИЛЬТРАЦИИ '(СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКА

IÖO 13СМ/элюата • 9^,0*130,0 ИКГ/МЛ) (си3)

ПРЕПАРАТ БАИЕРИОФАГОВ Enterobacter ПОЛИВАЛЕНТНЫЙ (СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКА . 772,0*61,0 ЫКГуиЛ)

—тпп1тттттШШ[|^

50 IÖO 1Й Уэлюата •

(си')

150 Узлюата • (си3)

МАРКЕРЫ:

№1 РИБОНУШАЗА А-(М.М. 13,7 kü )

т ХИМОТРИЮНОГЕН А (U.M. 25,0 kD)

№3 ОШШШН (Ы.М, «tOkD )

Рис. б. Хроыагограшы питательной среды и фаголиаатов бактерий

Enterobacter на различных этапах очистки (Сефакрил $ -200, длина волны 230ни.).

зернистой дистрофии, имеющей обратимый характер.

В.чутрибрашинное введении очищенных вариантов Фаголкзатс Enterobacter в тех же дозировках в эксперименте острой токсичности ь вызывало гибели животных, падения массы тела и патогистологическу изменений структуры внутренних органов.

При изучении биологических свойств фаголизатов Enterobacter эксперименте хронической токсичности, введение неочищенных вариант! бактериофага в продолжении 20 дней в терапевтических дозах в расче' на единицу веса тела, вызывало падение массы тела животных и гибе. 40=1% мышей в течение 13-18 дня эксперимента.

Патогистологические изменения структуры внутренних орган проявлялись в умеренных гемодинамических расстройствах, явлени дистрофии в легких, печени почках и селезёнке. Указанные изменен носили обратимый характер и после восстановительного 7-дневно периода не отмечалось значительных различий в структуре внутренн органов подопытных и контрольных групп мышей.

Очищенные варианты фаголизатов Enterobacter при введении течение 20 дней в терапевтических дозах не вызывали падения мае тела и гибели подопытных животных. Патогистологические изменен внутренних органов значительно менее ' выражены, чем при введем неочищенного препарата и полностью нивелировались в течение 7-дневнс восстановительного периода.

Таким образом, приведенные данные изучения биологических сзой( фаголизатов бактерий Enterobacter различной степени очис свидетельствуют об оптимальности разработанного нами способа очист! позволяющего получить ареактогенный при парэнтеральном введе: бактериофаг. Кроме того. сходство оптимальных технологичес; характеристик при очистке фаголизатов <эакте;и!й E.aerojenes. E.cloac:

E4ö8glomerans позволяет проводить процесс очистки в смеси всех трех видов фаголизатов, что значительно упрощает технологический процесс.

На основании проведенных исследований, нами разработаны оптимизированные реяимы получения бактериофагов E.aerogenes, E.cloacae, E.agglouerans. Оптимальным для получения бактериофагов Enterobacter является использование способа периодического динамического гомогенного глубинного культивирования на экспоненциально размножающейся бактериальной популяции в концентрации 1-4х1(? бакт.кл./мл; в условиях 70-80% насыщения культуральной среды кислородом; при содержании аминного азота 40мг% и глюкозы в пределах 1-2мг/мл. Культивирование и последующая микрофильтрация фаголизатов через фильтр-картон и ацетат-целлюлозные мембраны с целью разделения микробной и фаговой популяций производятся раздельно для каждого вида бактериофагов. Очистку фаголизатов производят способом ультрафильтрации в тангенциальном потоке на мембранах с порогом задержания веществ 100-200kD с последующей проточной стерилизующей микрофильтрацией через ацетат-целлвлоэные мембраны, при этом Фаголизаты сводятся в единый объем. Технологические показатели получения бактериофагов Enterobacter представлены в таблице 2.

На основании разработанных оптимизированных технологических реаимов культивирования и очистки нами были получены три экспериментальные серии препарата оактериофагов Enterobacter поливалентного.

Сравнительное изучение антибиотикочувствительности и фагочувствительности бактерий E.aerogenes, E.cloacae, E.agglomerans, показало, что препарат бактериофагов Enterobacter по своей антибактериальной активности сравним с гентамицином и превосх-одит пятнадцать из изученных шестнадцати антибиотиков - таблица 3. Так антибактериальная активность препарата составляля в отношении

Таблица 2

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ ENTEROBACTER

Фаголизатц ¡Культиви-i 'А выхода фага на этапах получений преларата!Степень

бактерий ¡рование !--------------------------------------------¡очистки

:lePaax ¡Микро- ! Очистка ¡Микро- ¡по белку

I )Usx ¡фильтрация 1¡(ультрафильтрация)!фильтрация 2! X

E.aerogenes 9,86^0.03 71,3*Й,7

Е.cloacae 9.70*0,03 t)8 .5 97.0*1.5 ti7.4*2,7 91,8=41,2 К

E.aeelomerans 9,74*0,04 73,5*6,4

Таблица 3

СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ БАКТЕРИОФАГОВ И АНТИБИОТИКОВ В ОТНОШЕНИИ БАКТЕРИИ РОДА ENTEROEACTER

Препараты ! Количество Ш чувствительных штаммов бактерий

бактериофагов ! Видовая принадлежность штаммов

й | ------------------------------------------------

антибиотиков ! E.aerogenes ! Е.cloacae ! E.agglomerans

Оксациллин 8,6 4,Ь 1,6

Ампициллин 0 0 0

Карбенициллин 20.0 11,5 8,5

Эритромицин 11.4 17,2 9,4

Олеандомицин 0 4,0 и

Линкомицин 0 0 0

Тетрациклин 31,4 34,5 24.3

Левоаицетин 65,7 63,2 33.4

Канамицин 62,9 69,0 37,1

Гвнтамицин 84,3 87,7 73.8

Полимиксин 27,1 66,7 47,6

Рифампицин 25,7 17.2 12.5

Неомицин 21,4 63.3 39.4

Стрептомицин 48,6 54.0 30.5

Ристомицин 14.3 19,5 8,2

Бензилпенициллин 2.0 и О

Бактериофаг

энтеробактер

поливалентный

78,3-84.0

73.5-82.7

7! .2-78,У

E.aerogenes - 78,3 - 84,0%; E.cloacae - 73,5 - 82,7; E.agßlomerans -71,2 - 78,9%, в то время как антибиотикочувствительность бактерий рода Enterobacter к оксациллину, ампициллину, олеандомицину, линкомицину, бензилпенициллину составляла 0-8,6%; карбенициллину, эритромицину, тетрациклину, рифампицину, ристсыицину - 8,2-34,5%; левомицетину, канамицину, полимиксину, неомицину, стрептомицину - 21,4-69,0%. •

Экспериментальные серии препарата бактериофагов Enterobacter поливалентного прешли, контроль в Отделе биологического контроля НПО "Иммунопрепарат" и ГИСК им.Л.Й.Тарасевича, На основании результатов проведенных нами исследований составлена Инструкция по изготовлению и контролю препарата бактериофагов Enterobactor поливалентного очищенного жидкого, утверждённая Ученым Советом Уфимского НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова НПО "Иммунопрепарат" (протокол Н2 от 01.03.34.) и Программа клинических испытаний препарата бактериофагов Enterobacter поливалентного очищенного жидкого для оценки реактогенности безопасности и терапевтической эффективности, утвержденная Комитетом МИБП МЗ РФ (протокол N4 от 23.06.94.).

29 ВЫВОДЫ

1. На основе селекционированных и изученных бактериофагов E.aerogenes, E.cloacae, E.agglomerans, сконструирован поливалентный препарат бактериофагов, активный в отношении 71,2-84,0% штаммов E.aerogenes, 73,5-78,9% штаммов E.cloacae и 77,5-82.7% штаммов E.agglomerans.

2. Изучены закономерности репродукции бактериофагов Enterobacter в

различных условиях культивирования. Установлено, что оптимальным

для получения биомассы бактериофагов является использование способа

периодического динамического гомогенного глубинного культивирования

на экспоненциально размножающейся бактериальной популяции в 9

концентрации 1-4x10 бакт.кл./мл; в условиях 70-80% насыщения культуральной среды кислородом: при содержании аминного азота 40мг% и глюкозы в пределах 1-2мг/мл.

3. Разработан способ очистки препарата бактериофагов Enterobacter от бактериальных клеток и балластных веществ методами ультрафильтрации в тангенциальном потоке и проточной микрофильтрации.

4. На основании установленных закономерностей, разработаны оптимальные технологические режимы культивирования и очистки бактериофагов, получены три экспериментальные серии препарата бактериофагов Enterobacter и изучены их биологические свойства.

5. Установлено, что экспериментальные серии препарата нетоксичны при парентеральном введении и обладают широким диапазоном антибактериальной активности в отношении бактерий E.aerogenes, E.cloacae, E.agglomerans.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Разработка способа очистки препаратов бактериофагов ро Enterobacter и Hafnia. / 3.S.Афанасьева,. H.H.Ворошилова,// В сб "Диагностика, профилактика и лечение гнойно-септических заболевай лекарственными средствами, выпускаемыми НПО "Иммунопрепарат". Тези конференции, -Уфа. -1993, -С.7-9.

2. Изучение биологических свойств бактериофагов рода Enterobacter Hafnia. / 3.В.Афанасьева., Н.Н.Ворозилова. // В сб.: "Диагностик профилактика и лечение гнойно-септических заболеваний лекарственны средствами, выпдскаемыми НПО "Иммунопрепарат". Тезисы конференци -Нфа. -1993. -С.9-14.

3. Изучение процессов репродукции бактериальной и фаговой популяц Enterobacter и Serratia в зависимости от способа и услов культивирования". / H.H.Ворошилова, Э.В.Алферова, С.С.Усманова. Материалы мендународного симпозиума "Роль иммунобиологическ препаратов в современной медицине". -Эфа. -1995. -С.158-164.

4. Закономерности взаимодействия бактериальной и фаговой популяции биореакторе на примерах Enterobacter и Hafnia. / Н.Н.Ворошилова Э.В.Афанасьева., И.А.Баснакьян. // Принята к опубликованиям в аурнг "Микробиология" в К4 или N5 за 1995г.