Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Специализированный продукт диетического профилактического питания на основе коктейля бактериофагов: конструирование, технология производства, оценка безопасности и эффективности применения

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Специализированный продукт диетического профилактического питания на основе коктейля бактериофагов: конструирование, технология производства, оценка безопасности и эффективности применения"



На правах \

КИСЕЛЕВА ИРИНА АНАТОЛЬЕВНА

Специализированный продукт диетического профилактического питания на основе коктейля бактериофагов: конструирование, технология производства, оценка безопасности и эффективности применения

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

13 МАЙ 2015

Москва - 2015

005568522

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Научные руководители:

доктор биологических наук Алешкин Андрей Владимирович кандидат биологических наук Воложанцев Николай Валентинович Официальные оппоненты:

Блинкова Лариса Петровна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук, заведующая лабораторией микробиологических питательных сред.

Куликов Евгений Евгеньевич, кандидат биологичеасих наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского» Российской академии наук, лаборатория вирусов микроорганизмов, старший научный сотрудник. Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени ИМ. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ. ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России). , .

Защита состоится «У г» 2015 года в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, д.10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального бюджетного учреждения науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, д.10, http://www.gabrich.ru Автореферат разослан « ос

'Я » ¿FlC/Ф-и/г015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Ольга Юрьевна Борисова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Микробиологическая безопасность пищи в XXI веке остается ведущей проблемой гигиены питания. Появление новых технологий хранения на холоду, упаковки в пленку, минимальной переработки охлажденного сырья, длительной транспортировки, а также несоблюдение элементарной гигиены работниками пищеблоков, увеличивают возможность появления и/или накопления в пище бактерий-возбудителей пищевых инфекций, таких как сальмонеллы, эшерихии, шигеллы, кампилобактер, листерии, стафилококки и т.д. Применение антибиотиков в пищевой отрасли, сельском хозяйстве не решает эту проблему, снижая уровень экологической чистоты продукции и провоцируя появление новой категории патогенов - штаммов бактерий, резистентных к антибиотикам (Акимкин В.Г. и др., 2010; Онищенко Г.Г., 2011; Алешкин А.В. и др., 2013; Goodridge L.D., Bisha В., 2011). В качестве альтернативы классическим антибактериальным средствам существуют природные биологические агенты - бактериофаги (вирусы бактерий), характеризующиеся специфической способностью к избирательному инфицированию бактериальных клеток и обладающие выраженными бактерицидными свойствами в цикле фаговой инфекции (Бондаренко В.М., 2011; Sulakvelidze А., 2013; Marti R., 2013). Всесторонние исследования бактериофагов, проведенные в течение 100 лет с момента их открытия Ф. Твортом и д'Эреллем в 1915 г., позволили решить многочисленные задачи в микробиологии, вирусологии, биотехнологии, генетике и других отраслях прикладных и фундаментальных исследований (Chanishvili N., 2012; Каттер Э., Сулаквелидзе А, 2012).

Невзирая на обширный мировой и отечественный опыт, накопленный по изучению лечебных и профилактических свойств бактериофагов (Красилышков И.В. и др., 2011; Захаренко С.М., 2013; Pirnay J.-P. et aL, 2010), а также достижения современной молекулярной биологии (Мирошников К. А и др., 2014), отечественные иммунобиологические лекарственные препараты (ИБЛП) на основе бактериофагов (стерильных фильтратов фаголизатов соответствующих видов бактерий) не имеют молекулярно-генетического подтверждения вирулентной природы входящих в них штаммов, обладают низкой эффективностью, содержат эндо- и экзотоксины бактерий-хозяев, а также белковые (антигенные) комплексы питательных сред, что, в ряде случаев, провоцирует усиление интоксикационного синдрома и вызывает аллергические реакции у пациентов (Асланов Б.И. и др., 2012; Зуева Л.П. и др., 2012; McCallin S., 2013). Совершенствование технологического процесса получения фаголизатов с высоким титром вирусных частиц, использование непатогенных индикаторных культур, введение этапов специфической очистки от эндо- и экзотоксинов, а также молекулярно-генетического подтверждения вирулентной природы бактериофагов и отсутствия известных локусов патогенности в фаговых геномах позволят обеспечить высокий уровень безопасности и эффективности

фаговых композиций, необходимый для их внедрения в качестве средств профилактики и лечения широкого круга инфекционных заболеваний.

Степень разработанности темы исследования

Разработанные в тридцатые годы прошлого столетия в СССР иммунобиологические лекарственные препараты на основе бактериофагов широко применяются для лечения острых кишечных и пищевых токсикоинфекций, гнойно-септических и других заболеваний (Ворошилова H.H. и др., 2010; Габриэлян Н.И. и др., 2012; Mi?dzybrodzki et al., 2012; Abedon S.T., 2011). Как в нашей стране, так и за рубежом продолжает активно развиваться направление фагодиагностики условно-патогенных микроорганизмов (Золотухин С.Н., 2007; Мустафин А.Х., 2012; Hagens S., Loessner M.J., 2014). Рост числа спорадических случаев и вспышек инфекций, передающихся пищевым путем, наблюдаемый с конца 1990-х годов в Америке, Канаде и странах Евросоюза, послужил поводом для развития нового сегмента пищевых добавок, содержащих бактериофаги. Ряд таких препаратов уже зарегистрирован Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (US FDA) и Европейской организацией по безопасности продовольствия (EFSA) в форме вспомогательных технологических средств и специализированныхпродуктов диетического профилактического питания (EFSA, 2012, US FDA, 2006).

Цель исследования

Разработать новый специализированный продукт диетического профилактического питания на основе бактериофагов, технологию производства и процедуры контроля, обеспечивающие его безопасность и эффективность в качестве средства профилактики инфекций, передающихся пищевым путем.

Задачи исследования:

1. Сконструировать специализированный продукт диетического профилактического питания на основе бактериофагов. Оценить безопасность потенциальных стартерных микробных культур и их фаголизатов.

2. Оптимизировать технологию культивирования отобранных для продукта штаммов бактериофагов. Оценить специфическую антибактериальную эффективность созданного фагового коктейля.

3. Апробировать предложенные алгоритмы применения специализированного продукта диетического профилактического питания на основе бактериофагов с целью его последующего внедрения в эпидемиологическую практику в качестве средства для снижения риска развития «пищевых» инфекций*.

4. Подобрать форму выпуска специализированного продукта диетического профилактического питания. Установить оптимальные режим и сроки гарантийного хранения. Провести санитарно-гигиеническую экспертизу и государственную регистрацию разработанной рецептуры.

* - в англоязычной литературе - food-borne infections (FBI) - «пищевые» инфекции

Научная новизна исследования

Впервые в Российской Федерации на основе оригинальных вирулентных штаммов бактериофагов создан специализированный продукт диетического профилактического питания (Патент на изобретение РФ № 2518303).

Разработаны процедуры оценки безопасности производственно-перспективных штаммов фагов и коктейля фаголизатов, включающие микробиологические, биохимические и молекулярно-генетические тесты, а также испытания на лабораторных животных.

Благодаря новому способу культивирования увеличена урожайность бактериофагов, исключены экзотоксины и предельно снижены концентрации эндотоксина в готовом продукте (Патент на изобретение РФ № 2525141).

На базе ведущих научно-практических учреждений здравоохранения Российской Федерации разработан алгоритм фагопрофилактики с использованием специализированного продукта диетического профилактического питания на основе бактериофагов.

Теоретическая и практическая значимость работы

Проведенные исследования и разработанная нормативно-техническая документация обеспечили не только прохождение процедуры независимой экспертизы и государственной регистрации специализированного продукта диетического профилактического питания «Фудфаг» (СГР № Ш.77.99.19.004.Е.001234.02.13 от 20.02.2013 г.), но и позволили сформировать теоретические предпосылки для создания в Российской Федерации нового класса продуктов - фагобиотиков.

Разработанный специализированный продукт диетического профилактического питания на основе коктейля бактериофагов (патент на изобретение РФ № 2518303) даст возможность снизить риск развития спорадических случаев и вспышек инфекций, передающихся пищевым путем, за счет фагопрофилактики декретированных контингентов работников предприятий пищевой промышленности, общественного питания, лечебно-профилактических учреждений, образовательных учреждений, сферы бытового обслуживания и других, а также предотвратить возможность возникновения очагов острых кишечных инфекций в условиях чрезвычайных ситуаций (наводнений, землетрясений, техногенных катастроф, вооруженных конфликтов и т.д.). На данное изобретение заключено лицензионное соглашение с биотехнологической компанией «Бифаг».

Внедрение в практику процедуры оценки безопасности производственно-перспективных штаммов фагов будет способствовать отбору исключительно вирулентных бактериофагов для фагосодержащих продуктов и уменьшит вероятность формирования в окружающей среде и организме человека фагорезистентных штаммов патогенных бактерий.

Использование биотехнологическими предприятиями оптимизированного

технологического процесса получения фаголизатов приведет к уменьшению себестоимости продукта за счет увеличения его литической активности и к повышению качества готовой формы, обеспечиваемого очисткой фаголизатов от эндотоксинов и других иммуногенных компонентов питательных сред, провоцирующих развитие интоксикационного синдрома, сенсибилизацию и аллергические реакции у пациентов. Данная технология (патент на изобретение РФ № 2525141) применяется ФБУН ГНЦ ПМБ (Оболенск) в процессе контрактного производства специализированного продукта «Фудфаг».

Методология и методы исследования

Методология диссертационной работы была спланирована в соответствии со структурой и задачами исследования. Предметом исследования стали разработка рецептуры, технологии получения, процедур оценки безопасности и эффективности специализированного продукта диетического профилактического питания на основе коктейля бактериофагов. Объектами исследования выступали штаммы клинически значимых патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, а также бактериофаги, изолированные нами из объектов окружающей среды и клинического материала.

В ходе работы были выделены, изучены и отобраны 7 производственно-перспективных штаммов бактериофагов, активных в отношении бактерий: S. enterica (сероваров Enteritidis, Typhimurium и Infantis), Е. coli OI57:H7, E.coli ОЮ4:Н4, E.coli других серогрупп, Shigella sonnei, Shigellaßexneri, S.aureus и L.monocytogenes.

Научная литература, посвященная исследованиям бактериофагов, была проанализирована формально-логическими методами. В работе использованы микробиологические, иммунохимические, молекулярно-генетические, масс-спектрометрические, электронно-микроскопические и статистические методы исследования.

Материалы и методы исследования

Штаммы микроорганизмов

В работе использовано более 300 бактериальных штаммов и изолятов сальмонелл, шигелл, кишечной палочки, в т. ч. STEC, золотистого стафилококка и листерий из коллекций ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора (п. Оболенск), Istituto Superiore di Sanitä (Рим, Италия), ФГБУ ВПО УГСХА им. П. А. Столыпина и выделенных нами из клинического материала пациентов КДЦ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, пищевых продуктов и других предметов санитарного надзора.

В ходе исследования были изолированы из образцов клинического материала, сточных вод и других объектов окружающей среды 40 штаммов бактериофагов, специфически лизирующих представленные выше бактерии-мишени.

Лабораторные животные

Работу с лабораторными животными проводили совместно с сотрудниками

лаборатории биологических испытаний ФБУН ГНЦ ПМБ (заведующий лабораторией А.И. Борзилов) в виварии, предназначенном для содержания мелких грызунов и лагоморфов конвенциональных и SPF категорий. Виварные помещения оснащены современным оборудованием, обеспечивающим индивидуальную вентиляцию клеток и контролируемые условия содержания животных. В экспериментах задействовали аутбредных мышей массой 17-20 г и морских свинок с массой тела 280-300 г, полученных из сертифицированных питомников. Все животные получали еду и воду ad libitum.

Бактериологические методы

Выделение и идентификацию микроорганизмов проводили по общепринятым методикам (Хоулт Дж., Криг Н., Снит П., 1997; Приложение №1 к приказу Министерства здравоохранения СССР от 22 апреля 1985 г. №535). Родовую принадлежность культур устанавливали на средах Эндо (ФГУП «НПО Микроген»), желточно-солевом, кровяном и Оксфордском агаре (HiMedia Laboratories Pvt Ltd, Индия). Определение биохимических свойств бактерий проводили на средах Гисса с рамнозой, сорбитом, лизином, малонатом натрия и лактозой. Для серологйческого типирования использовали диагностические сыворотки производства РАО «Биопрепарат». Патогенные свойства стафилококков подтверждали в реакции плазмокоагуляции с цитратной плазмой кролика (ФГУП «Аллерген»).

Исследования на животных

При разработке процедур оценки безопасности и эффективности производственно-перспективных штаммов фагов и коктейля фаголизатов на лабораторных животных частично использовали методы из «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Хабриев Р.У., 2005) и «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (Иммунобиологические лекарственные средства) (Миронов А.Н., 2013).

Масс-спектрометпичестй метод

Подтверждение родовой и видовой принадлежности штаммов микроорганизмов проводили масс-спектрометрическим методом на приборе VITEK MS («bioMerieux», Франция) согласно инструкции производителя оборудования.

Методы изолирования и изучения биологических свойств бактериофагов

Выделение бактериофагов и изучение их биологических свойств проводили методами, предложенными М. Адамсом (1959) и Д.М. Гольдфарбом (1961). Для определения титра фаговых частиц и морфологии негативных колоний использовали метод Грациа (1936).

Иммуноферментный анализ проводили согласно инструкции на тест-систему RIDASCREEN® SET А, В, С, D, Е, (R-Biopharm AG, Германия) с целью определения уровня экзотоксинов в фаголизатах. Для подтверждения отсутствия веротоксинов

(шигаподобных токсинов) в фаголизатах использовали иммунохроматографический экспресс-тест RIDArQUICK Verotoxin/ 0157 Combi (R-Biopharm AG, Германия).

Метод аффинной хроматографии использовали для удаления эндотоксинов в полученных фаголизатах. Очистку проводили на хроматографической колонке Endo Trap Blue и Endo Trap HD (Hyglos GmbH, Германия) с использованием буферных растворов фирмы производителя.

Электронно-микроскопическое исследование бактериофагов, контрастированных уранилацетатом, проводили на микроскопе JEM-100CX (JEOL, Япония) при конечном увеличении 80000х.

Молекулярно-генетические методы

Выявление фрагментов генетических детерминант бактериальных факторов вирулентности осуществляли при помощи полимеразной цепной реакции с использованием ранее предложенных пар праймеров (Баннов В.А и др., 2013). Амплификацию фрагментов нуклеотидных последовательностей проводили в термоциклере «Терцик» («ДНК-технология», Москва). Детекцию результата амплификации проводили путем постановки горизонтального электрофореза в 1,5 % агарозном геле при 16 V/cm в течение 1 часа с последующим сравнением электрофоретической подвижности амплифицированныхпродуктов с подвижностью фрагментов маркера молекулярных весов DNA Ladder Mix («Fermentas», Литва). Результат реакции учитывали с помощью гельдокументирующей системы Vilber Lourmat Quantum ST4-1100/26М.

Полную нуклеотидную последовательность фаговых ДНК определяли при помощи секвенирования второго поколения Ion Torrent Sequencing. Предварительно выделяли ДНК бактериофагов с помощью набора GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific, США) согласно протоколу производителя и охарактеризовывали их методом рестрикционного анализа с использованием следующих эндонуклеаз рестрикции: HindIII, EcoRI, EcoRV, Smil, Bglll, Beul («Fermentas», Литва). Биоинформационный анализ секвенированных геномов проведен с использованием пакета программного обеспечения NEWBLER и интернет-ресурса BLAST (httpy/blast.ncbi. nlm.nih.gov/Dlast. cgi).

Статистическая обработка данных

Статистический анализ данных, полученных в диссертационном исследовании, выполнялся с использованием метод-ориентированного пакета прикладных программ «SAS» (SAS Institute Inc., USA) и включал следующие его элементы: построение гистограмм для визуальной оценки характера распределения; расчет средних значений и элементарная статистика для определения основных параметров распределений показателей и проверки их на соответствие нормальному закону распределения; расчет Т-критерия Стьюдента и непараметрических критериев для определения различий средних значений показателей в сравниваемых выборках.

Личное участие автора в получении результатов

Соискателем составлен план исследования, проведен аналитический обзор литературы, идентифицированы бактерии-мишени, изучены биологические свойства штаммов бактериофагов. Автором отработана оригинальная методика культивирования бактериофагов на плотной питательной среде, позволяющая получать бактериофага в высоком титре. Для подтверждения безопасности фаголизатов был отработан алгоритм проверки степени его очистки от продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, в том числе, от эндо- и экзотоксинов. Была разработана рецептура и пилотная технология получения готовой формы специализированного продукта диетического профилактического питания. Разработаны алгоритмы оценки безопасности и эффективности готового продукта в доклинических и ограниченных клинических испытаниях (на базе ГБОУ ВПО АГМА, протоколы заседаний Этического комитета № 5, 2012 г., № 8, 2013 г.).

Изолирование бактериофагов осуществлялось в сотрудничестве с к.б.н. Веревкиным В.В. и к.б.н. Красильниковой В.М. (лаборатория молекулярной диагностики и генно-инженерных препаратов ФБУН ГНЦ ПМБ). Молекулярно-генетическая характеристика штаммов бактериофагов проводилась при участии сотрудника лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии бактериофагов к.б.н. Поповой А.В. (ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского), аспиранта лаборатории прикладной иммунохимии Рубальского Е.О. (ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского) и руководителя отдела коллекционных культур к.б.н. Богуна АГ. (ФБУН ГНЦ ПМБ). Масс-спектрометрию бактериальных штаммов проводили вместе с профессором кафедры микробиологии и вирусологии, д.м.н., профессором Ефимовым Б.А. (ГОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова МЗ РФ) и руководителем лаборатории диагностики дифтерийной и коклюшной инфекции д.м.н. Борисовой О.Ю. (ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского). Электронная микроскопия нативных фаговых частиц была проведена на базе ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» РАМН.

Положения, выносимые на защиту:

1) Отобранные для создания рецептуры производственно-перспективные штаммы бактериофагов на основании их биологической и молекулярно-генетической характеристики признаны оригинальными, не несущими генов токсинов, интеграции, трансдукции и вирулентными.

2) Сконструированный специализированный продукт диетического профилактического питания на основе бактериофагов нарабатывается по разработанной нами оригинальной технологии, обеспечивающей отсутствие токсического эффекта в опытах in vitro и in vivo на лабораторных животных.

3) Доклинические исследования и ограниченные клинические испытания пациентов с хроническими заболеваниями органов пищеварения и добровольцев с искусственно вызванным эшерихиозом подтверждают эффективность продукта

«Фудфаг» в качестве средства фагопрофилактики инфекций, передающихся пищевым путем.

Степень достоверности и апробация результатов исследования

Достоверность полученных результатов работы обоснована достаточным объемом выборки анализируемых образцов (около 2000 образцов кала, 800 образцов мочи и урогенитальных посевов, 130 образцов почв и сточных вод, 300 патогенных и условно-патогенных штаммов бактерий, 40 штаммов-кандидатов бактериофагов), использованием сертифицированных бактериологических, иммунохимических и молекулярно-генетических методов, которые характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью. Комплексное бактериологическое, иммунохимическое и молекулярно-генетическое исследование бактериальных штаммов и штаммов бактериофагов позволило получить данные, сопоставимые с данными литературы, что также свидетельствует о достоверности полученных результатов. Выпущенная продукция подвергалась независимой экспертизе ФГБУ НИИ Питания РАМН и ФГБУЗ «Центр экспертиз и гигиены» САО г. Москвы на соответствии утвержденной нормативной документации.

Диссертация апробирована на заседании секций Ученого Совета ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (протокол № 1 от 05.02. 2015 г.).

Результаты исследований были представлены и обсуждены на российских и международных конференциях: Международной научно-практической конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии» (Саранск, 2012 г.); 9-ой Северо-Западной научной гастроэнтерологической сессии (Санкт-Петербург, 2012 г.); V Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2012 г.); научно-практической конференции с международным участием «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности» (Ульяновск, 2013 г.); International Scientific Conference on Probiotics and Prebiotics - IPC2013 (Kosice, Slovakia, 2013 г.); International Scientific Conference "Phages 2013: Bacteriophage in Medicine, Food & Biotechnology" (Oxford, UK, 2013 г.); International Scientific Conference "2014 -Exploiting bacteriophages for bioscience, biotechnology and medicine (the 5th in a biennial series)" (London, UK, 2014 г.); VI Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2014 г.); 2-ой научно-практической конференции с международным участием: «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности» (Санкт-Петербург, 2014 г.); EMBO Conference on «Viruses of Microbes III: Structure and Function - from Molecules to Communities» (Zurich, Switzerland, 2014 г.); International Scientific Conference "Phages 2014: Bacteriophage in Medicine, Food & Biotechnology" (Oxford, UK, 2014 г.); Ill International Conference on Antimicrobial Research -ICAR2014 (Madrid, Spain, 2014 г.); IX Всероссийском форуме «Здоровье нации - основа процветания России» (Москва, 2015 г.)

Публикации. По теме диссертации имеется 22 печатные работы, в том числе 3 -в рецензируемых изданиях, 19 - в сборниках материалов конференций и 2 патента РФ на изобретения.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 207 страницах и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждений, заключения, выводов, практических рекомендаций, перспектив дальнейшей разработки темы, приложений, списка использованных литературных источников. Диссертация иллюстрирована 48 таблицами и 33 рисунками. Список литературы содержит 218 работ, в том числе 94 -зарубежных и 124 - отечественных публикаций.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Отсутствие в Российской Федерации прецедента по конструированию, регистрации и применению специализированного продукта диетического профилактического питания на основе бактериофагов, активных в отношении «пищевых» патогенов, поставило перед нами задачу по созданию собственного алгоритма его разработки. Этапы создания специализированного продукта диетического профилактического питания «Фудфаг» в рамках настоящего диссертационного исследования представлены на рисунке 1.

Отбор производственно-перспективных штаммов бактериофагов

На основании статистического анализа эпидемиологических данных за последние десять лет, включавших как отечественные, так и зарубежные источники, нами были отобраны наиболее значимые виды бактерий, вызывающие инфекции, передающиеся пищевым путем - это Escherichia coli энтеропатогенной, энтеротоксигенной и энтерогеморрагической групп, Salmonella Enteritidis, Salmonella Infantis, Salmonella Typhimurium, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus.

В процессе формировании банка потенциальных бактериальных штаммов-мишеней проводили их видовую идентификацию. Бактериальные штаммы, обладающие характерными видовыми свойствами, использовали для изолирования и определения спектра литической активности фагов-кандидатов. Культуры, на которых удавалось достичь высоких значений титра бактериофагов, отбирали как штаммы-хозяева для получения одноименного бактериофага, лиофилизировали и закладывали на хранение. Для штаммов, используемых в качестве посевного материала при культивировании бактериофагов, дополнительно подтверждали отсутствие в них лизогенных факторов с помощью модифицированного нами метода химической индукции митомицином С.

В ходе исследований нами были отобраны и изучены 7 производственно-перспективных штаммов бактериофагов, активных в отношении бактерий -возбудителей инфекций, передаваемых пищевым путем, которые составили основу специализированного профилактического продукта. Вирулентные штаммы фагов отбирались на основании их фенотипической и молекулярно-генетической

характеристики. Основными биологическими свойствами, которые служили критериями отбора, были спектр литической активности, высокая урожайность на штамме-хозяине и устойчивость к негативным физическим и химическим факторам внешней среды (таблица 1).

питания «Фудфаг».

Так, все штаммы фагов воспроизводились в титре от Ю10 до 1012 БОЕ/мл, имели широкий спектр литической активности, определявшийся процентом лизируемых штаммов внутри вида (серовара) и сохраняли стабильный титр вирусных частиц как при 30-минутной обработке хлороформом, так и при повышении температуры до 80 °С и значениях рН от 3,6 до 9,6. Устойчивость бактериофагов к кислой среде позднее нашло свое отражение при фармакокинетических исследованиях - мы подтвердили незначительное падение титра для основной массы фагов, включенных в специализированный продукт, после прохождения желудка. Спектр литической

активности у бактериофаговых штаммов-кандидатов был ограничен исключительно культурами патогенных бактерий. В эксперименте in vitro фаги не подавляли рост производственных пробиотических штаммов бифидобактерий, лактобацилл, E.coli М-17 и нормальной микрофлоры, выделенной из фекалий 100 пациентов КДЦ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

Таблица 1. Характеристика производственно-перспективных штаммов бактериофагов.

Фаг CHI EcD7 V18 SE40 эти БВ Lml

Бактерия-хозяин S. aureus Е. coli 0104.Н4 Е. coli 0157-.Н7 S. Enteritidis Б. ТурЫ-типиш Э. 1пГапШ L monocytogenes

Источник и место выделения Гнойная рана, Челябинск Куриные экскременты, Московская обл. Сточные воды коровника, Московская обл. Почва, Московская обл. Куриные экскременты. Калужская обл. Экскременты крупного рогатого скота, Московская обл. Экскременты овец, Астраэан екая обл.

Спектр литаческой активности (% / штаммы бастерий) 94% MRSA-штаммы 100% Е coli 0104.Н4 О ¡04: Hl 2 0157:Н7 etc., 70% Sh. sonnei & flexneri 100% Е. coli 0157.-Н7 0157:Н 85% S. Enteritidis 100% Э. ТурЬь шипит 64% Б. МаШБ 92% L. monocytogenes

Отношение к хю реформу Устойчив Устойчив Устойчив Устойчив Устойчив Устойчив Устойчив

Температурная устойчивость 55 'С 60'С 60 'С 80 "С 75 'С 65 'С 60'С

Устойчивость к рН среды 5,2 - 8,0 5,2 - 9,6 7,0 - 9,6 52 - 9,6 3,6 - 8,0 5,2 - 8,0 7,0 - 8,0

Урожайность (татр), БОБ'мл 10 11 10 -10 io'°-io" ю,0-ю" ю"-ю'2 1о"-ю,г 10".юи 9 10 10-10

В ходе отбора производственно-перспективных штаммов бактериофагов изучали их молекулярно-генетическую характеристику, позволившую судить об оригинальности и вирулентной природе вирусных частиц. Результаты, полученные при секвенировании ДНК бактериофагов, показали, что их размеры колеблются от 18 (CHI) до 167 (EcD7) т.п.н. (рисунок 2). По данным биоинформационного анализа ДНК бактериофагов, геномы всех 7 штаммов не содержат гены интеграз, репрессоров транскрипции и других генов, характерных для умеренных бактериофагов. Не были обнаружены также и известные локусы патогенности, кодирующие бактериальные токсины штаммов-хозяев, антибиотикорезистентности и прочие нежелательные гены. Процент идентичности ДНК бактериофагов, отобранных для специализированного продукта, с близкородственными штаммами, депонированными в GenBank, составлял от 62 до 93 %, что свидетельствует об оригинальности бактериофагов. Полученные при сравнении нуклеотидных последовательностей данные позволили подтвердить таксономическое положение, определенное при электронном микроскопировании бактериофагов:

сальмонеллезные (ST 11, Si3), стафилококковый, колифаги и листериозный фаги относятся к семейству Myoviridae, сальмонеллезный SE40 - Siphoviridae (рисунок 3).

Ц fлубима покрыты» »JOOO Staphylococcus phage S13

Staphylococcus phage 66

В —ж—

■ «"-——

Staphylococcus phage P68

В Глубина покрытия х 100 Coliphage phi 1

Рисунок 2 - Визуализация глубины покрытия и сравнение геномов: а) стафилококкового бактериофага CHI с близкородственными штаммами семейства Myoviridae S13', 66 и Р68: б) колифага EcD7 с

Колифэг ECD7 167 г п н

близкородственными штаммами семейства Myoviridae phil и RB49. Колифаг (EcD7) Колифаг(У18) Стафилофаг (CHI) Листериозный фаг(ип1)

Сальмонеллезный фаг (SB) Сальмонеллезный фаг (ST11) Сальмонеллезный фаг (SE40)

Рисунок 3 - Электронная микроскопия бактериофагов, входящих в коктейль.

Разработка метода получения фаговой биомассы, рецептуры и технологии производства готовой формы специализированного продукта диетического профилактического питания

На следующем этапе создания специализированного продукта на основе бактериофагов был разработан метод получения фаговой биомассы с высокой литической активностью и предельно низким содержанием эндо- и экзотоксинов. В процессе отработки пилотной технологии производства штаммы бактериофагов в титре от Ю10 до 1012 БОЕ/мл получали выращиванием на плотных питательных средах в матрасах с последующей стерилизующей фильтрацией через мембранный фильтр и освобождением от эндотоксина на хромотографической колонке. Ноу-хау предусматривало также использование непатогенных штаммов-хозяев для получения второй генерации фаговых частиц в случае обнаружения экзотоксинов (например, шига-токсина) в фаголизате первого поколения бактериофагов. В готовом коктейле бактериофагов с помощью бактериологического посева контролировали микробиологическую чистоту, отсутствие экзотоксинов подтверждали методом ИФА, а содержание эндотоксина на уровне не выше 50 ЕЭ/мл контролировали ЬАЬ-тестом. После проверки литической активности методом Грациа фаголизат использовали в качестве основного действующего вещества для создания рецептуры специализированного продукта диетического профилактического питания. В состав разработанного специализированного продукта также были включены: стерильный сироп корня солодки, пектин яблочный и глицин, обладающие пребиотическими, противовоспалительными и антиоксидантными свойствами. В качестве вспомогательных компонентов были использованы коммерческий

уравновешивающий буферный раствор (набор EndoTrap, Hyglos, Германия) и стерилизованная дистиллированная вода, обеспечивающие стабильность действующих веществ при хранении и необходимый объем готовой формы - 100 мл. Физико-химические показатели, пищевая и энергетическая ценность, содержание токсичных элементов разработанной рецептуры специализированного продукта полностью соответствовали нормативным данным, утвержденным комиссией ЕврАзЕс в рамках ТР ТС 027/2012 «О безопасности отдельных видов специализированной пищевой продукции, в том числе диетического лечебного и диетического профилактического питания». Специфическая активность специализированного продукта оценивалась по показателю «титр фаговых частиц в готовой форме» и определялась на уровне 106 БОЕ/мл, что, с одной стороны, соответствовалаположениюТРТС021/2011 «О безопасности пищевой продукции», регламентирующему концентрацию действующих веществ в пищевой продукции на уровне не выше лекарственного препарата, а, с другой, подтверждалось доклиническими и клиническими испытаниями по безопасности и эффективности специализированого продукта диетического профилактического питания «Фудфаг». Контрольные процедуры, обеспечивающие нормативное качество специализированного продукта, явились основой ТУ 9197-163-78095326-2012. Санитарно-гигиеническая экспертиза экспериментально-производственных серий продукта была проведена в независимых лабораториях на базе ФГБУ «НИИ питания» РАМН и филиале ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве» в CAO г. Москвы. Высокое качество готовой формы специализированного продукта диетического профилактического питания обеспечивали четко структурированной пилотной технологией его производства, включавшей цепочку этапов от подготовки исходного сырья через приготовление посевного материала (стартерных) культур, получение фаголизата, его очистки, фасовки во флаконы и укупорки в промаркированную потребительскую тару. Контрольные мероприятия, в том числе, оценка микробиологической чистоты и специфической активности специализированного продукта осуществляли на каждой из 6 основных технологических процедур.

На основании многократно воспроизведенного технологического процесса была подготовлена и утверждена ТИ, являющаяся, наряду с ТУ, рецептурой и проектом этикеточной надписи, неотъемлемой частью нормативно-технической документации. Последняя в полном объеме, вместе с образцами специализированного продукта, прошла экспертизу ФГБУ «НИИ Питания» РАМН и государственную регистрацию в Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Репрезентативную выборку образцов из экспериментальных серий специализированного продукта закладывали на хранение на срок годности, в полтора раза превышающий определенный в НТД. Регламентированный при регистрации титр вирусных частиц сохранялся в процессе всего срока гарантийного хранения

специализированного продукта диетического профилактического питания «Фудфаг».

Оценка безопасности и эффективности специализированного продукта диетического профилактического питания на лабораторных животных и в ограниченных клинических испытаниях

На следующем этапе диссертационного исследования нами была проведена оценка безопасности специализированного продукта «Фудфаг» в опытах по изучению острой и хронической (подострой) токсичности на двух видах лабораторных животных. В результате проведенных экспериментов было показано, что при различных способах однократного введения максимальной дозы (1,0 мл -внутрибрюшинно мышам и 5 мл - морским свинкам, 1,0 мл - подкожно и 0,5 мл per os мышам) исследуемого продукта признаков интоксикации у мышей и морских свинок не наблюдали. Поведенческие реакции, внешний вид и привес мышей в экспериментальной и контрольной группах при длительном пероральном приеме специализированного продукта также достоверно не отличались. Для исключения вероятности возникновения побочных эффектов по влиянию бактериофагов на нормальную микрофлору кишечника in vivo (на модели беспородных белых мышей) дополнительно определяли изменение количества основных представителей микробиоценоза толстого кишечника на фоне 10-дневного внутрижелудочного введения фагового коктейля. Компоненты разработанной рецептуры не влияли на нормальную микрофлору кишечника мышей.

Далее на модели лабораторных животных были проведены фармакокинетические исследования фагосодержащего продукта (таблица 2). В процессе эксперимента определяли количество вирусных частиц в фекалиях животных в различные промежутки времени после однократного внутрижелудочного введения специализированного продукта «Фудфаг». Через 9 часов после введения продукта сальмонеллезные фага обнаруживали в экскрементах мышей в наибольшей концентрации. В меньшем количестве в мышиных экскрементах определяли листериозный, эшерихиозный (EcD7) и стафилококковый фага. В дальнейшем количество специфических вирусных частиц снижалось, и к 48 часам в мышиных фекалиях оставались только незначительные количества сальмонеллезных фагов.

Изучение специфической антибактериальной эффективности фагового продукта проводили на модели экспериментальной сальмонеллезной инфекции у беспородных белых мышей, которых заражали штаммом S. Enteritidis 92Rif. Введение препарата через 48 часов после заражения животных в течение 5 дней в дозе 0,5 мл/сут продлевало их жизнь до 9,6 дней, против 8 в контрольной группе. При профилактическом режиме использования фагового коктейля (введение за 24 часа до заражения и далее в течение 5 дней в дозе 0,5 мл/сут) выжило 70 % мышей, средний срок жизни павших мышей составил 11,4 дня. Бактериологический анализ органов и фекалий выживших животных на 14 сутки после окончания терапии подтвердил 100 % санацию внутренних органов животных от S. Enteritidis 92Rif. Полученные

результаты подтверждают высокую профилактическую эффективность специализированного продукта «Фудфаг» в отношении сальмонеллезной инфекции, что имеет существенное клиническое значение, так как в состав испытуемого средства входят три сальмонеллезных бактериофага, лизирующих широкий спектр штаммов сероваров ЕтегйИк, ТурЫтипит и1пГап&, выступающих этиологическим фактором более чем в 70 % подтвержденных случаев сальмонеллезной инфекции в Российской Федерации.

Таблица 2. Изучение фармакокинетики фагового коктейля на модели мышей.

Фаг Титр в коктейле, БОЕУмл Титр фага lg(EOE)/r, определяемый в экскрементах мышей после внугрижелудочного введения lg(BOE)/r Тшах, Ч

0 Зч 6ч 9ч 12 ч 24 ч 48 ч

Lml 0,5xl0lu 0 0 4,0 4,5 3,8 0 0 4,5 9

EcD7 1,1x10'° 0 1,6 5,7 5,9 5,3 3,0 0 5,9 9

SI3 0,3 xlO10 0 2,9 7,7 8,1 6,2 4,1 2,3 8,1 9

ST11 1,0х 10,u 0 2,9 7,2 8,0 6,4 5,3 2,8 8,0 9

SE40 9,6 х 10'' 0 0 2,8 7,6 7,1 5,0 3,1 7,6 9

V18 l.OxlO7 0 0 3,7 4,1 3,0 1,6 0 4,1 9

CHI l,3xl0lu 0 н/д 5,8 5,6 5,1 0 0 5,8 6

Оценку специфической антибактериальной эффективности специализированного продукта профилактического питания на основе бактериофагов проводили также в рамках программы медицинской реабилитации у лиц с хроническими заболеваниями органов пищеварения. Типовая программа реабилитации включала: дието-, фито-, бальнео-, кинезотерапию, тренинги, гастрошколы и т.д. При бактериологическом исследовании фекалий у пациентов были выявлены S. aureus, энтеропатогенная Е. coli, грибы рода Candida и другие представители условно-патогенной микрофлоры, типичные для дисбиотического состояния кишечника. 30 пациентам основной группы дополнительно к типовой программе реабилитации был назначен фаговый коктейль по 50 мл 3 раза в день во время еды, курсом 10 дней. 16 пациентам группы сравнения реабилитация осуществлялась в рамках типовой программы. Включение в программу медицинской реабилитации фагового коктейля позволило на 33,3 % снизить -количество пациентов с дисбактериозом кишечника второй и третьей степени, а у 36,7 % пациентов основной группы добиться полной нормализации показателей микробиоценоза за счет элиминации S. aureus и энтеропатогенной Е. coli. Полученные результаты подтверждают высокую терапевтическую эффективность специализированного продукта «Фудфаг» в отношении возбудителей эшерихиоза и стафилококковой пищевой токсикоинфекции.

В рамках расширения доказательной базы в плане профилактической эффективности специализированного продукта «Фудфаг» нами были продолжены пострегистрационные исследования данного средства, включавшие испытания, как на лабораторных животных, так и на добровольцах. Используя принцип

моделирования инфекционного процесса, предложенный О.М. Дроздовой (1988), мы апробировали на 40 лабораторных животных, а затем на 45 здоровых добровольцах следующий алгоритм применения специализированного продукта: контрольные группы в обоих исследованиях заражались непатогенным штаммом Е. coli KI2 С600 в течение 3-х дней в дозе 5х 107 КОЕ/мл в сутки, опытные группы подвергали такому же заражению на фоне профилактического приема специализированного продукта «Фудфаг» до, во время и спустя сутки после периода инфицирования. В опыт отбирали животных и здоровых добровольцев, не имеющих в кале лактозонегативных штаммов Е. coli. Животные и люди в контрольных группах, вместо специализированного продукта, получали физиологический раствор по схеме приема специализированного продукта «Фудфаг». В результате у представителей контрольных групп на 6-ые сутки эксперимента в экскрементах обнаруживалась лактозонегативная Е. coli, в то время как в фекалиях участников опытных групп идентифицировали исключительно Е. coli с нормальными ферментативными свойствами. С целью повышения достоверности проведенного эксперимента данные микробиологического исследования подтверждали молекулярно-генетическим методом: до заражения испытуемых штамм Е. coli К12 С600 по данным ПЦР отсутствовал во всех образцах фекалий, в то время как на 6-ые сутки эксперимента Е coli К12 С600 присутствовал у членов контрольной группы вплоть до 5-го разведения фекалий и не был обнаружен в образцах от людей и животных из опытных групп (таблица 3).

Таблица 3. Результаты ПЦР-исследования образцов фекалий добровольцев*

Обозначения: 1 kb - маркер молекулярных весов DNA Ladder Mix («Fermentas», Литва), 1-5 — образцы фекалий, К+ - ДНК, выделенная из чистой культуры Е. coli К12 С600, К- - вода для молекулярно-биологических исследований.

Сутки эксперимента

1 (до инфицирования)

6-ые сутки эксперимента

Опытная группа

Контрольная группа

Таким образом, на экспериментальной модели эшерихиоза у лабораторных животных и ограниченной группе добровольцев была подтверждена эффективность предложенного алгоритма использования специализированного продукта «Фудфаг»

в качестве средства специфической фагопрофилактики кишечной инфекции, вызванной непатогенной кишечной палочкой. Полученные результаты имеют существенное значение для клинической практики, потому что два оригинальных колифага, входящие в состав специализированного продукта, обладают широким спектром литической активности, включающим следующие сероварианты E.coli: 026, 055, 0103, 0104, 0121, 0125, 0127, 0128, 0145, 0146, 0157, которые вызывают тяжелые случаи инфекции, передающейся пищевым путем.

Перспективы использования бактериофагов на международной космической

станции (МКС)

Расширяя спектр возможного применения продуктов на основе бактериофагов, мы провели исследования, открывающие в будущем перспективу по использованию бактериофагов на МКС. Различные факторы космического полета, гиподинамия, стресс, особенности питания, ограниченность и специфичность микрофлоры на МКС вызывают дисбиотические нарушения ЖКТ, которые могут провоцировать развитие тяжелых патологических состояний у космонавтов. Пробиотики помогают эффективно скорректировать доклинические проявления дисбаланса микрофлоры, развивающиеся у космонавтов в непривычных условиях обитания. Новый класс пробиотиков - фагобиотики может быть использован для улучшения состояния их здоровья. В рамках долгосрочной программы научно-прикладных исследований и экспериментов, планируемых на Российском сегменте Международной космической станции, и космического эксперимента «Бактериофаг» мы провели сравнение фено- и генотипических свойств бактериофагов, входящих в специализированный продукт«Фудфаг» до и после 1,5 и 3 месяцев хранения на Земле и на МКС. В результате проведенных в 2013-2014 гг. экспериментов нами была подтверждена неизменность фенотипических (за исключением концентрации вирусных частиц) и генотипических свойств у 7 штаммов бактериофагов из коктейля «Фудфаг» в жидкой и лиофилизированной формах, что открывает возможность безопасного и эффективного использования в будущем бактериофагов для нормализации дисбиотических состояний у космонавтов в условиях Международной космической станции.

Таким образом, разработанный в рамках данного диссертационного исследования специализированный продукт диетического профилактического питания «Фудфаг» (свидетельство о государственной регистрации № RU.77.99.19.004.E.001234.02.13 от 20.02.2013 г.), содержащий коктейль бактериофагов, активных в отношении Escherichia coli, Salmonella Enteritidis, Salmonella Infantis, Salmonella Typhimurium, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, безопасен для человека и животных и может применяться в качестве средства фагопрофилактики декретированных контингентов работников предприятий различных отраслей с целью снижения риска развития спорадических случаев и вспышек инфекций, передающихся пищевым путем.

выводы

1. На основе оригинальных вирулентных штаммов эшерихиозных V18 и EcD7, сальмонеллезных ST11, Si3, SE40, стафилококкового СН1 и листериозного Lml бактериофагов нами создан специализированный продукт диетического профилактического питания с подтвержденной в доклинических исследованиях безопасностью и широким спектром специфической антибактериальной эффективности в отношение Listeria monocytogenes, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, Escherichia coli (EHEC), Shigella Jlexneri и Shigella sonnei.

2. Разработанная технология культивирования производственных штаммов бактериофагов является оптимальной для получения фагового коктейля с высоким титром содержащихся в нем вирусных частиц и степенью очистки от эндо- и экзотоксинов.

3. Предложенный алгоритм клинического использования готовой формы коктейля бактериофагов подтвердил эффективность специализированного продукта диетического профилактического питания «Фудфаг» при коррекции дисбиотических состояний в рамках программы медицинской реабилитации у лиц с хроническими заболеваниями органов пищеварения, а также при профилактике эшерихиоза, искусственно вызванного непатогенной кишечной палочкой у добровольцев.

4. Разработанная и полностью реализованная процедура оценки безопасности и эффективности производственно-перспективных штаммов бактериофагов, включающая их фено- и генотипический анализ, а также фармакологическую, токсикологическую и фармакокинетическую характеристику готовой формы, позволила впервые в РФ провести регистрацию фагосодержащего препарата в качестве специализированного продукта диетического профилактического питания.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработанный специализированный продукт диетического профилактического питания на основе коктейля бактериофагов может быть рекомендован для фагопрофилактики декретированных контингентов работников предприятий различных отраслей с целью снижения риска возникновения спорадических случаев и вспышек инфекций, передающихся пищевым путем.

2. Внедрение в практику биофармацевтических компаний апробированной процедуры оценки безопасности и эффективности производственно-перспективных штаммов фагов позволит обеспечить отбор вирулентных бактериофагов для фагосодержащих препаратов и уменьшить вероятность формирования в окружающей среде фагорезистентных штаммов патогенных бактерий.

ПЕРСПЕКТИВЫ НАПРАВЛЕНИЯ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

Дальнейшие исследования будут направлены на мониторинг фагочувствительности персистирующих бактериальных штаммов гомологичных бактериофагам, включенным в специализированный продукт «Фудфаг», и на поддержание эффективности коктейля бактериофагов за счет своевременного включения в него новых штаммов фагов с полной фено- и генотипической характеристикой, которые будут обладать широким спектром литической активности в отношение основных возбудителей инфекций, передающихся пищевым путем.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Киселева, И.А. Пробиотическая БАД на основе поливалентного коктейля бактериофагов в профилактике пищевых инфекций / И.А. Киселева, Н.В. Воложанцев, AB. Алешкин, Э.А Светоч, С.Н. Золотухин, С.С. Афанасьев, О.Г. Ефимова, Д.А Васильев // Материалы международной научной конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии». Сборник конгресса. -Саранск, 2012.-С. 122.

2. Кулакова, Ю.В. Изучение влияния новой пробиотической БАД на основе поливалентного коктейля бактериофагов на нормальную микрофлору / Ю.В. Кулакова, И.А. Киселева, Ю.В. Агапова, Н.В. Воложанцев, A.B. Алешкин, Э.А. Светоч, С.С. Афанасьев, О.Г. Ефимова // Материалы международной научной конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии». Сборник конгресса. - Саранск, 2012. - С. 126.

3. Алешкин, А.В Бактериофаги как пробиотики и средства деконтаминации пищевых продуктов / A.B. Алешкин, Н.В. Воложанцев, Э.А. Светоч, В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, А.И Борзилов, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, A.B. Караулов, ХМ. Галимзянов, Ю.Ф. Космачев, И.А. Киселева, М.С. Афанасьев, Е.О. Рубальский, М.О. Рубальский П Астраханский медицинский журнал. -2012. - № 3. - С. 31 -39.

4. Алешкин, A.B. Специализированный продукт питания «Фудфаг» в профилактике пищевых инфекций / A.B. Алешкин, Н.В. Воложанцев, Э.А. Светоч, С.С. Афанасьев, В.В. Веревкин, С.Н. Золотухин, И.А. Киселева II Материалы 1 международной научно - практической конференции «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности». Сборник конгресса. - Ульяновск, 2013. - Т. 2. - С.93.

5. Затевалов, AM. Влияние бактериофагов на микрофлору толстой кишки / AM. Затевалов, И.А. Киселева, Ю.А Копанев, AB. Алешкин, С.С. Афанасьев, Е.П. Селькова // Материалы 1 международной научно-практической конференции «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности». Сборник конгресса.-Ульяновск, 2013- -Т. 2.-С.9-14.

6. Алешкин, А.В. Бактериофаги в условиях длительного космического полета / А.В. Алешкин, Е.О. Рубальский, А.В. Попова, В.И. Евстигнеев, С.Ю. Пчелинцев, С.С. Афанасьев, Э.А. Светоч, Н.В. Воложанцев, В.В. Веревкин, И.А. Киселева, С.С. Бочкарева // Материалы второй международной научно-практической конференции «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности». -Инфекция и иммунитет. - Специальный выпуск. -2014. - С. 64.

7. Алешкин, А.В. Фагопрофилактика «диареи путешественников» / А.В. Алешкин, Е.О. Рубальский, И.А. Киселева, С.С. Бочкарева, О.Ю. Борисова, С.С. Афанасьев // Материалы второй международной научно-практической конференции «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности», - Инфекция и иммунитет. - Специальный выпуск. - 2014. - С. 63 - 64.

8. Киселева, И.А. Опыт биодеконтаминации пищевых полуфабрикатов с помощью бактериофагов / И.А. Киселева, А.В. Алешкин, О.Г. Ефимова, С.С. Бочкарева, Ю.В. Ларина, О.В. Тарасеева // Материалы VI Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. - Москва, 2014. - С.28.

9. Затевалов, А.М. Исследование динамики фагочувствительности условно-патогенной микрофлоры ротоглотки и кишечника у часто и эпизодически болеющих детей / А.М. Затевалов, С.С. Афанасьев, Е.П. Селькова, А.В. Алешкин, Е.П. Воропаева, И.А. Киселева, Л.В. Феклисова, Е.Р. Мескина, Е.А. Медведева // Материалы второй международной научно-практической конференции «Бактериофага: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности».-Инфекция и иммунитет. - Специальный выпуск.-2014. - С. 81.

10. Зулькарнеев, Э.Р. Фаг-опосредованный биопроцессинг гидробионтов / Э.Р. Зулькарнеев, И.А. Киселева, О.Г. Ефимова, А.В. Алешкин, С.С. Афанасьев, В.А. Алешкин, Х.М. Галимзянов, О.В. Рубальский, М.В. Лозовская // Материалы второй международной научно-практической конференции «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности».-Инфекция и иммунитет. - Специальный выпуск. -2014. —С. 82.

11. Алешкин, В.А. Биодеконтаминация пищевых полуфабрикатов с помощью бактериофагов / В.А. Алешкин, Ю.В. Ларина, И.А. Киселева, А.В. Алешкин II Материалы второй международной научно-практической конференции «Бактериофага: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности». - Инфекция и иммунитет. - Специальный выпуск.-2014.-С. 63.

12. Алешкин, А.В. Бактериофаги в условиях длительного космического полета / А.В. Алешкин, Е.О. Рубальский, А.В. Попова, А.Г. Богун, В.И. Евстигнеев, С.Ю. Пчелинцев, С.С. Афанасьев, Э.А. Светоч, Н.В. Воложанцев,

B.В. Веревкин, И.А. Киселева, С.С. Бочкарева // Астраханский медицинский журнал. -2014-Т.9. -№3-С. 62-71.

13. Борисова, О.Ю. Микробиота кожи подмышечных впадин у лиц с микроэкологическими изменениям / О.Ю. Борисова, А.В. Алешкин, Н.Т. Гауда,

C.С. Бочкарева, Б.А. Ефимов, В.А Чернова, В.А. Алешкин, Л.И. Кафарская, С.С. Афанасьев, И.А. Киселева // Лечение и профилактика. - 2014. - №4(12). -С.33-38.

14. Киселева, И.А. Бактериофаги в профилактике инфекций, передающихся пищевым путем / И.А. Киселева, А.В. Алешкин, Н.В. Воложанцев // Материалы IX Всероссийского форума «Здоровье нации - основа процветания России». - Москва, 2015. -С.465.

15. Kiseleva, I.A. Pilot production of a well - defined phagebiotic cocktail // I. A. Kiseleva, V.V. Verevkin, AV. Aleshkin, N.N. Volozhantsev, E.A Svetoch, S.S. Afanas'ev // International Scientific Conference on Probiotics and Prebiotics. KoSice. -IPC 2013.

16. Aleshkin, AV. Reducing salmonella contamination in poultry products using phages / AV. Aleshkin, N.V. Vofozhantsev, E.A Svetoch, V.V. Verevkin, I.A. Kiseleva, AV. Popova, S.S. Afanas'ev // Proceedings of the Conference: liPhages2013: Bacteriophage in Medicine, Food & Biotechnology". - Oxford, UK, 2013. - P.l 1.

17. Aleshkin, AV. Phage-mediated biocontrol of ground beef artificially contaminated with E.coli / AV. Aleshkin, N.V. Vofozhantsev, E.A Svetoch, V.V. Verevkin, I.A. Kiseleva, AV. Popova, S.S. Afanas'ev // Proceedings of the Conference: "Phages2013: Bacteriophage in Medicine, Food & Biotechnology". - Oxford, UK, 2013. - P.22.

18. Aleshkin, AV. Effectiveness of phage-based probiotic dietary supplement in the prevention of E.coli traveler's diarrhea: a small-scale study / AV. Aleshkin, E.O. Rubal'skii, N.V. Volozhantsev, E.ASvetoch, I.A.Kiseleva, S.S. Bochkareva, O.Yu. Borisova, S.S. Afanas'ev // III International Conference on antimicrobial Research. -Madrid (Spain): ICAR20I4. - 2014 - P.l85.

19. Aleshkin, A Phage cocktail in prophylaxis against traveler's diarrhea / A Aleshkin, E. Rubal'sky, I. Kiseleva, S. Bochkareva, O. Borisova, S. Afanas'ev II Phages 2014. -Oxford, 2014. - P. 13.

20. Aleshkin, A Small-scale experiment of using phage-based probiotic dietary supplement for prevention of E. coli traveler's diarrhoea / A Aleshkin, E. Rubal'sky, I. Kiseleva, S. Bochkareva, O. Borisova, S. Afanas'ev // EMBO Conference on Viruses of Microbes III: Structure and Function - from Molecules to Communities. - Zurich, Switzerland. - 2014. - P. 100 - 101.

21. Aleshkin, A Effects of spaceflight on Iyophilized and liquid phage lysates / A Aleshkin, E. Rubal'sky, A Popova, S. Pchelintsev, S. Afanas'ev, E. Svetoch, N. Volozhantsev, V. Verevkin, I. Kiseleva, S. Bochkareva // EMBO Conference on Viruses of

Microbes III: Structure and Function - from Molecules to Communities. - Zurich, Switzerland, 2014. - P. 103.

22. Aleshkin, A.V. Phage-mediated bioprocessing in decontamination of meat and dairy products contaminated with E.coli/A.V. Aleshkin, N.V. Volozhantsev, E.A. Svetoch, S.S Afanas'ev, I.A Kiseleva, O.V. Taraseeva, A.L. Vanyan, S.S. Bochkareva, Yu. V. Larina// 2014 - Exploiting bacteriophages for bioscience, biotechnology and medicine (the 5th in a biennial series), Agenda, 23rd January 2014 [Электронный ресурс] / Euroscicon Ltd -London (UK), 2014 P. 15 Режим flocTvna:http://lifesc ienceevents.com/wpcontent/uploads/23rdJan2014Exploitinebacterioph ages.pdf

Изобретения

23. Патент 2518303 Российская Федерация, МПК C12N 7/00, А61К 35/76, А61К 39/295, А61Р 31/04. Композиция антибактериальная, штамм бактериофага E.coIi, используемый для такой композиции / Дятлов И.А., Алешкин В.А., Алешкип А.В., Афанасьев С.С., Светоч Э.А., Воложанцев Н.В., Васильев Д.А., Золотухин С.Н., Амерханова A.M., Киселева И.А., Веревкин В.В., Красильникова В.М., Мякинина В.П., Баннов В.А.,Рубальский М.О. Заявители и патентообладатели: Федеральное бюджетное учреждение науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии н микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере прав потребителей и благополучия человека (ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора) (RU), Федеральное бюджетное учреждение науки « Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ) (RU). -JY» 2012127139/10; заяв. 29.06.2012; опубл. 10.06.2014, Бюл. 1. -7 с.

24. Патент 2525141 Российская Федерация, МПК C12N 7/00, А61К 35/76, / Способ получения бактериофага / Киселева И.А., Алешкин А.В., Веревкин В.В., Светоч Э.А., Афанасьев С.С., Рубальский Е.О., Рубальская Е.Е., Рубальский М.О., Ефимова О.Г., Васильев Д.А., Золотухин С.Н. Заявитель и патентообладатель: Федеральное бюджетное учреждение науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере прав потребителей и благополучия человека (ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора) (RU). - № 2013126187/10; заяв. 07.06.2013; опубл. 10.08.2014; Бюл.22. - 5 с.

Список сокращений

БОЕ - бляшкообразующие единицы ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

ЕЭ - единица эндотоксина

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

ИБПЛ - иммунобиологические

лекарственные препараты

ИФА - иммуноферментный анализ

КОЕ — колониеобразующие единицы

ЛД - летальная доза

ЛИ У - лечебно-профилактическое

учреждение

МКС - международная космическая станция

МПА - мясопептонный агар МПБ - мясопептонный бульон ОКИ — острые кишечные инфекции ПТИ - пищевая токсикоинфекция ПЦР - полимеразная цепная реакция СРК - синдром раздраженного кишечника

ТИ - технологическая инструкция

ТУ - технические условия

NCBI - National Center for Biotechnology

Information (национальный центр

биотехнологической информации,

США)

STEC - шига-токсин продуцирующие штаммы E.coli

US FDA - United States Food and Drug Administration (Управление no санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов Министерства здравоохранения и социальных служб США)

EFSA - European Food Safety Authority (Европейская организация по безопасности продовольствия) ЕНЕС - enterohaemorrhagic Е. coli (энтерогеморрагическая кишечная палочка)

FBI - «food-borne infection» (инфекция, передающаяся пищевым путем)

Подписано в печать: Тираж: 110 экз. Заказ № 1301 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект д.74 (495)790-47-77ww.reglet.ru