Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение вариантов вируса болезни Ньюкасла со сниженной вирулентностью для клеток-продуцентов интерферона

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Получение вариантов вируса болезни Ньюкасла со сниженной вирулентностью для клеток-продуцентов интерферона"

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ им. МЛ. ЧУМАКОВА РАМП

РГб од

1 з дек гт

На правах рукописи

Муллагулова Марина Николаевна

Получение вариантов вируса болезни Ньюкасла со сниженной вирулентностью для клеток-продуцентов

интерферона

03.00.06 - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2000

Работа выполнена в Уфимском научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова Государственного унитарного предприятия «Иммунопрепарат»

Научный руководитель: Научный консультант:

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Е.В.Бобкова

доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН Т.А.Бектимиров

доктор биологических наук, профессор В.П.Грачев доктор медицинских наук, профессор В .В .Малиновская

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт вирусных препаратов

им. О.Г. Анджепаридзе РАМН

Защита состоится « ¿^¿¿¿р^-? 2000 г. в ^^ час,

на заседании диссертационного Совета Д. 001.27.01 Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН по адресу: 142782, Московская область, Ленинский район, и/о Институт полиомиелита.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке "Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН.

Автореферат разослан „

2000 г.

Ученый секретарь

диссертационного Совета О.А.Медведкина

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Широкий спектр заболеваний, при которых показано лечение интерфероном, стимулирует рост производства этого препарата. Однако масштабы производства человеческого лейкоцитарного интерферона сдерживаются дефицитом сырья - донорской крови, а также высокой вирулентностью применяемого в качестве индуктора интерферона в лейкоцитах человека, вакцинного штамма «Н» вируса болезни Ньюкасла. В этих условиях проведение исследований, связанных с поиском решений и методических подходов, направленных на интенсификацию процесса биосинтеза интерферона, весьма актуально.

Цель работы.

Получение вариантов вакцинного штамма «Н» вируса болезни Ньюкасла со сниженной вирулентностью для клеток-продуцентов интерферона (лейкоцитов человека) и оценка их интерфероногенной активности.

Задачи исследования:

1. Селекция вариантов штамма «Н» ВБН с заданными свойствами при условии культивирования вируса в развивающихся кури-1шх эмбрионах, при сниженных пермиссивных температурах.

2. Оценка пригодности химических мутагенов для усиления интерфероногенной и снижения гемолитической активностей ВБН.

3. Подбор стабилизатора и контроль стабильности свойств полученных вариантов индуктора в процессе хранения.

4. Оптимизация условий культивирования варианта вируса в размножающихся куриных эмбрионах.

Научная новизна и теоретическая значимость работы.

Впервые получен высокоактивный и низковирулентный для клеток-продуцентов интерферона, холодоадаптированный вариант вируса болезни Ньюкасла, используемый в качестве индуктора интерферона, повышающего синтез интерферона при слабом повреждении интерферонсинтезирующих клеток. При использовании холо-доадаптированного штамма, урожай интерферона повышался в 4 раза и более по сравнению с исходным производственным вакцинным штаммом «Н» ВБН.

Впервые предложена ростовая добавка Д-изомер лактозы для получения высокого урожая вируса в куриных эмбрионах.

Впервые применена тест-система для стандартизации условий индукции интерферопогенеза.

Научная новизна подтверждена 2 патентами РФ. На третью заявку получена приоритетная справка. Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского Российской Академии медицинских наук (ГКВ № 2348).

Практическая значимость работы.

Полученные результаты положены в основу Изменений к Регламенту производства человеческого лейкоцитарного интерферона № 281-90 и Инструкции по изготовлению и контролю РРИД для определения количества вносимого вируса-индуктора.

Штамм-индуктор и тест-система, а также ростовая добавка Д-изомер лактозы, внедрены в цехе интерферона ГУЛ «Иммунопрепарат».

Апробация работы.

Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета Уфимского научно-исследовательского института вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова (1999 г.). Основные материалы доложены на Всероссийской конференции, посвященной 95-летию Уфимского НИИВС им.И.И.Мечникова (2000 г.).

Положения. выносимые на защиту.

1. Использование двух методических подходов (селекция при пониженной температуре и химический мутагенез) для получения нового варианта индуктора - штамма «Н» ВБН со сниженной вирулентностью для лейкоцитов человека.

2. Селекционированный при 32 °С холодоадаптированный вариант вирусного индуктора оказывает низкое повреждающее действие на интерферонсинтезирующие клетки, позволяя стабильно увеличить в них синтез интерферона не менее чем в 4 раза, по сравнению с исходным штаммом.

3. Мутантный вариант холодоадаптированного штамма «II» ВБН сохраняя низкую повреждающую активность по отношению к клеткам продуцентам интерферона, обладает сниженными гемолитическими свойствами.

4. Селекция вируса в развивающихся куриных эмбрионах в присутствии Д-изомера лактозы позволяет получить стабильный по свойствам вариант холодоадаптированного штамма с высокой ин-терфероногенной и низкой гемолитической активностью, хорошо размножающийся в развивающихся куриных эмбрионах.

5. Разработанная тест-система д ля количественного измерения вносимого вируса-индуктора позволяет стандартизовать условия ин-терфероногенеза.

Публикация результатов исследований.

Материалы диссертации отражены в 2 патентах РФ, 1 Заявке на патентование и изменениях к НТД. Остальные разделы диссертации, на которые не распространяется запрет па публикацию Государственным комитетом СССР по делам изобретений не содержащие технологических сведений ноу-хау, изложены в 2 печатных работах.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 194 источника. Работа иллюстрирована В рисунками и 21 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

Использованы:

Вакцинный штамм «Н» вируса болезни Ньюкасла (музей цеха интерферона ГУЛ «Иммунопрепарат»), с гемагглютинирующей активностью 128 ГАЕ/мл, инфекционной активностью в куриных эмбрионах 108 ТЦДзо/мл и оптимальной температурой размножения (37±0,5) °С.

Вакцинный штамм «Индиана» вируса везикулярного стоматита (музей цеха интерферона ГУЛ «Иммунопрепарат»), был использован как индикатор при определении противовирусной активности (ПВА) интерферона.

Периферическая кровь доноров, соответствующая требованиям Регламента производства человеческого лейкоцитарного интерферона № 281-90.

Кролики поводы Шиншилла, массой 2,5-3 кг (питомник лабораторных животных ГУЛ «Иммунопрепарат»),

Высокотитражные иммунные сыворотки получены по методу (Егоров А.М. и др., 1991), после цикловой иммунизации кроликов маточным холодоадаптированным вакцинным штаммом «Н» вируса болезни Ньюкасла (ВБН-Х-32/19).

Анти - ВБН сыворотка (ГНИИСК имЛ.А.Тарасевича) к вакцинному штамму «Н» вируса болезни Ныокасла.

В качестве химических мутагенов были применены: N-Cyclohexyl-N-[ß-(N-methylmorpholinio)-äthylJ-carbodiimid-p-toluolsulfonat (Merck); Papain rein löslich (Serva); Colchicin (Serva);, азотистая кислота (Реахим).

В ходе экспериментов использованы детергенты: неионные (тритон-Х-100 (Serva); ß - октилгшокозид (Sigma), твин - 20 (Serva); твин - 80 (Serva)) и ионные: (лаурилсаркозинат натрия (Sigma); доде-цилсульфат натрия (Serva)).

В качестве добавок в среду культивирования были использованы: Д(+)-мальтоза (Реахим); Д(+)-глюкоза (Реахим); Д(+)-лактоза (Реахим); и среда MEM, богатая глутамином.

Гемагггаотинирующую активность вируса проверяли в реакции гемаггшотинации с 1% взвесью эритроцитов кур (Сюрин В.Н. и др., 1986).

Селекция холодоадаптарованного варианта проведена следующим образом. Для получения первого пассажа взят маточный вакцинный штамм «И» вируса болезни Ньюкасла, полученный при температуре (37±0,5) °С, в заражающей дозе 4 lg ЭИД/50/0,2 мл, а для последующих пассажей - вирусы предыдущих пассажей с наиболее высоким титром в РГА. Дозу заражения вируса при последующих пассажах уменьшали на 50-100 единиц. Культивирование проводили при температурае (37±0,5) °С; (32±0,5) °С; (28±0,5) °С. В каждый опыт брали не менее 50 эмбрионов.

Влияние различных образцов вируса на жизнеспособность лейкоцитов-продуцентов интерферона, исследовано в процессе индукции. В качестве индуктора использованы в параллельном опыте вакцинный штамм «Н» ВБН, реплицирующийся при (37+0,5) °С, и изучаемый образец холодоадаптарованного варианта пггамм «Н» ВБН-Х-32/19, реплицируюпщйся при (32+0,5) °С. В качестве ко1ггроля использована лейкомасса без добавления вируса. Исходное количество жизнеспособных лейкоцитов в суспензии в каждом опыте составляло 1 000 000±500 живых клеток/мл, при окраске 1% раствором эозината натрия.

Для проверки способности размножения полученного «холодового» варишгга штамма «Н» ВБН-Х-32/19 использованы следующие культуры тканей: фибробласты эмбрионов кур (ФЭК), перевиваемые клеточные культуры VERO, VERO Еб, СПЭВ.

Реверсибелыюстг. холодоадаптированного вакцинного штамма «Н» ВБН-Х-32/19 определяли при культивировании в 9-11 дневных куриных эмбрионах, зараженных вирусом в разведении 10"6. Эмбрионы инкубировали при температуре (37±0,5) °С в течение 48 часов. Далее выдерживали 24 часа при температуре (3±2) °С. Затем собирали аллантоисную вируссодержащую жидкость и контролировали в РГА. Проведено не менее 5 опытов с каждым исследуемым вариантом вируса.

Электрофорез в полиакриламидном геле проводили по методу Леммли (LaemmliU.K., 1970; Остерман JI.A., 1981).

Количество белка определяли по методу Лоури (Методы вирусологии и молекулярной биологии, 1972).

Определение концентрации овальбумина проводили методом ИФА (ВФС 42-325ВС-92).

Определение противовирусной активности (ДВА) интерферона проводили принятым в Регламенте методом (Регламент производст-ва-Интерферон человеческий лейкоцитарный сухой № 281-90), на перевиваемых линиях клеток СПЭВ.

Активность иммунных сывороток оценивали в иммунохимиче-ской реакции по Оухтерлони (1948).

Титр антител к ВБН-Х-32/19 в иммунных сыворотках определяли в реакции иммунодиффузии по Манчини (1963).

Для морфологической характеристики вирусов - вируссодер-жащую аллантоисную жидкость осветляли центрифугированием в течение 20 минут при 4 ООО g. Надосадочную жидкость центрифугировали 30 минуг при 60 ООО g с использованием центрифуги «Хитачи» и доочгацали хроматографическим методом на сефарозе 4В. Подготовку хроматографической колонки, содержащей носитель сефа-роза 4 В готовили по общепринятой методике (Остерман Л.А., 1985).

Изучение морфологии вирусов проводили общепринятыми методами с использованием электронной микроскопии (Ховинсон А., 1972; Быковский А.Ф., 1980). В исследованиях был использован электронный микроскоп ЭМ-ДЖЕМ-ЮОВ (Япония).

Для получения холодоадаптированных линий ВБН использовали метод конечных разведений но Wildy Р. (1955) совместно с методом селекции по признаку повышения выхода интерферона. Селекцию проводили при температурах (37±0,5), (32±0,5), (28±0,5) °С.

Определение чувствительности полученного холодоадаптиро-ваниого вакцинного штамма «Н» вируса болезни Ньюкасла (ВБН-Х-32/19) проводили: к эфиру - по методу Ровозо Г.С., Берку С.Н.; к хлороформу - по методу Майера; к изменению pH - по Майеру; к действию температур - по Ровозо Г.С., Берку С.Н. (Сюрин В.Н. и др., 1986).

Статистическая обработка экспериментальных данных проведена по общепринятым методам (Ашмарин И.П., Воробьев A.A., 1962). В материалах приведены средние величины с доверительным интервалом при Р й 0,05.

Результаты и их обсужлснис.

Применяемый в настоящее время в производстве человеческого лейкоцитарного интерферона в качестве индуктора вакцинный штамм «Н» ВБН, является одним из лучших известных вирусных индукторов (Mogensen К.Е. et al., 1977; Фролова В.М. и др., 1984). Однако, он обладает сильным повреждающим действием на лейкоциты и выраженными гемолитическими свойствами по отношению к остаточным эритроцитам в лейкоцитарной суспензии.

Существует мнение о тесной корреляции между вирулентностью вируса и его способностью индуцировать синтез интерферона. На модели различных вирусов многими авторами отмечено, что штаммы со сниженной вирулентностью способны индуцировать синтез больших количеств интерферона, чем высоко вирулентные (Ruiz-Gomes J. et al., 1963; Ершов Ф.И., Аскарходжаев Н.А., 1980; Jacobsen S. et al., 1981).

Для получения штаммов со сниженной вирулентностью могут быть применены разные методы. Один из наиболее часто используемых - пассажи чистых линий вирусов при низкой заражающей дозе (50-100 инфекционных единиц) в условиях пермиссивной температуры. При этом удается сохранить генетическую однородность штаммов даже в условиях, благоприятных для изменения наследственных свойств, как это показано в модельных опытах с вирусом гриппа, вирусом полиомиелита, вирусом болезни Ньюкасла и др. (Гендон Ю.З., 1975; Полежаев Ф.И. и др., 1986).

Темпера гурочувствительные мутанты размножаются при пермиссивной температуре и не образуют инфекционного вируса при непермиссивной температуре. Возможно, что температурочувстви-тельные мутации могут происходить в любом вирусном гене, но с помощью селективных методов удается выделить лишь те мутанты, у которых изменены функции, существенные для воспроизведения вируса (Полежаев Ф.И. и др., 1986).

Для получения вариантов вируса болезни Ньюкасла со сниженной вирулентностью для лейкоцитов человека, нами использованы две пермиссивные температуры (32 и 28) °С.

Выбор температурного режима был обусловлен тем, что согласно литературным данным низкие температуры, в частности 32 °С

обеспечивают стабильность реплицирующейся РНК вируса (Гендон Ю.З. и др., 1975).

В процессе выполнения работы получены два холодоадапти-рованных варианта штамма, пассируемых при 28 °С (ВБН Х-28) и 32 °С (ВБН Х-32).

Инфекционный титр варианта вируса, культивируемого при 28 °С, в развивающихся куриных эмбрионах, повысился на

I lg ЭИД/50/мл, при возрастании гемагглютинирующей активности в 8 раз (с 1:4 до 1:32).

Инфекционный титр вируса, культивируемого при 32 °С к 19 пассажу, увеличился на 3 lg ЭИД/50/мл (с 8 lg ЭИД/50/мл до

II lg ЭИД/50/мл), а титр в РГА возрос в 6 раз (с 1:128 до 1:768).

При контрольном культивировании исходного штамма с той же множественностью заражения, при 37 °С, инфекционная активность вируса и титр в РГА оставались на прежнем уровне.

При исследовании интерферониндуцирующей активности показано, что при использовании в качестве индуктора линии вируса 1 пассажа, репродуцирующегося при температуре 37 °С в индуцирующей дозе 5 ГАЕ/106 лейкоцит, выход интерферона составил 1400 - 2800 МЕ/мл.

При использовании в аналогичных условиях, в качестве индуктора линии вируса, репродуцирующейся при температуре 28 °С, количество синтезировашюго интерферона практически не увеличивалось и оставалось на уровне 700 - 1400 МЕ/мл.

Однако, при использовании в тех же условиях опыта в качестве индуктора линии вируса 19 пассажа, репродуцирующегося при температуре 32 °С, противовирусная активность синтезированного интерферона достигала 11 200-14 000 МЕ/мл. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1

Интерферониндуцирующая активность различных вариантов вакцинного штамма «Н» вируса болезни Ньюкасла

Номер пассажа К-во вносимого индуктора в ГАЕ/106 лейкоцит ПВА интерферона (МЕ/мл)

Контроль 37 °С Х-32 °С Х-28 °С

1 4,8 2 800+300 2 800+300 700±100

2 5,1 2 800+300 5 600±650 350+150

3 4,8 1 400±300 2 800±650 400+150

4 4,8 900+300 5 600±300 700+150

5 4,8 1 400±300 1 000±300 700+150

9 4,8 900+300 5 600±300 400+150

11 5,0 1 400+300 5 600±600 350+100

12 5,0 1 400±300 10 000±1 200 900+300

19 5,0 2 8001300 12 600±1 400 1 400±300

Можно предположить, что наблюдаемый эффект увеличения синтеза интерферона при использовании холодоадаптированного ■ штамма может быть связан с внедрением большего количество вируса в лейкоцит оказывающего стимулирующий эффект на транскрипцию и трансляцию иРНК-интерферона и замедляющего синтез регулятор-ного белка-блокиратора синтеза интерферона (Орлова Т.Г. и др., 1977; Соколова Т.М. и др., 1978; Ершов Ф.И., 1993). С другой стороны известно, что иРНК-ИФ обладает при 32 °С большей устойчивостью к действию транскриптаз (Ершов Ф.И. и др., 1980).

Линия вируса, репродуцирующаяся при 32 °С, обладала низкой вирулентностью для лейкоцитов человека. Нами показано, что при ее использовании на стадии индукции гибнет не более 25 % ин-терферонпродуцирующих клеток, тогда как при использовании линии вируса, репродуцирующаяся при 37 °С (контроль), гибель лейкоцитов достигает 40 - 45 % (табл. 2), что согласуется с данными других авторов, исследовавших повреждающее действие вирусов, реплицирующихся при 37 °С, в человеческих лейкоцитах (Фролова В.М. и др., 1984).

Таблица 2

Сравнительное повреждающее действие различных вариантов вакцшшого штамма «Н» ВБН на лейкоциты человека

Нагрузка вируса (ГАЕ/106 лейкоцитов) Контроль без вируса ВБНХ-32/19 Исходный штамм

живые % мертвые % живые % мертвые % живые % мертвые %

2 85±1 15±1 82±1 18±2 55±2 45+6

4 80±2 20±2 75±1 25±2 55+3 45±6

5 79±3 21±3 75±3 25+5 60+3 40±6

6 77±3 23±3 75±3 25+5 60±3 40+4

8 77±3 23±3 75±3 25±5 60±3 40±4

10 76±3 24±3 75+3 25±5 60+3 40±4

При использовании нагрузки вируса 5 ГАЕ/106 лейкоцитов, по сравнению с исходным штаммом «Н» ВБН, гемолитические свойства вируса снижались в 11,7 раза, что является еще одним преимуществом полученного штамма.

Таким образом, к 19 пассажу удалось селекционировать холо-доадаптированный вакцинный штамм «Н» вируса болезни Ньюкасла, инфекционная активность которого в куриных эмбрионах, возросла на 3 логарифма (с 8 ЭИД/50/0,2 мл у маточного штамма до 11 18 ЭИД/50/0,2 мл у вируса 19 пассажа). Однако, несмотря на превалирующую долю вирусов, размножающихся при пермиссивной температуре (32 СС) вирус 19 пассажа содержал вирусы, размножающиеся и при температуре 37 °С (4 ^ ЭИД/50/0,2 мл), что обуславливает ре-версибельность температурочувствительных штаммов. Реверсибель-ность данной линии составила 25%, что соответствует данным полученным другими авторами при работе с температурочувствительны-ми штаммами вирусов (Полежаев и др., 1986; Климов А.И. и др., 1987).

При сравнительном электронно-микроскопическом изучении вируса выявлено, что в процессе селекции морфологическое строение холодоадаптированного вируса пе изменяется. На это указывали

другие исследователи, изучавшие морфологию холодоадаптнрован-ных штаммов (Авакян A.A. и др., 1970; Майзель Д., 1972; Быковский А.Ф. и др., 1975; Соловьев В.Д. и др., 1979; Zhirnow О.Р. et al., 1985).

Для сохранения свойств ВБП-Х-32/19 в процессе сушки проведен подбор криопротекторов. Нами был выбран 0,1% желатин, как самый экономичный и не ухудшаюнцш биологических свойств вируса криопротектор.

Селекционированный холодоадаптированный штамм «Н» вируса болезни Ньюкасла (ВБН-Х-32/19) депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского Российской Академии медицинских наук, номер депонента ГКВ № 2348.

В связи с встречающимися литературными данными о повышении иитерфероногенных свойств вируса после воздействия на них химических мутагенов (Покидышев JI.H. и др., 1974) нами была предпринята попытка усилить индуцирующие свойства ВБН-Х-32/19 после воздействия на него химических мутагенов. В качестве химических мутагенов нами были использованы: циклогексил, папаин, колхицин, азотистая кислота.

Основным стимулом синтеза интерферона считают внедрение в клетку чужеродной нуклеиновой кислоты, нарушающей нормальный генетический баланс. Эта стимуляция характерна прежде всего для нуклеиновых кислот вирусов, хотя и любые другие чужеродные нуклеиновые кислоты, в том числе и модифицированные азотистой кислотой нуклеиновые кислоты собственных клеток, могут служить индукторами интерферона (Isaacs А., 1963). При этом по данным Thiry L., азотистая кислота вызывает двойную мутацию: по гем-агглютинирующим и интерферогандуцирующим признакам (Thiry L., 1963; Пфефферкон Э., 1972).

Этот методический подход использован нами для полученпия химического мутанта ВБН-Х-32/19. После обработки холодоадапти-рованного варианта штамма ВБН-Х-32/19 азотистой кислотой получен химический мутант, который не дал более высоких титров противовирусной активности синтезированного интерферона по сравнению с использованием ВБН-Х-32/19. Однако, его преимуществом являлось отсутствие лизиса эритроцитов на стадии индукции интерферона, что способствовало получению не загрязнешюго продуктами гемолиза эритроцитов полуфабриката интерферона.

Известно, что на размножение вируса в развивающихся куриных эмбрионах могут влиять различные добавки, вносимые в эмбрион (Ахматуллина Н.Б. и др., 1977; Зусман М., 1977; Ермолаев М.В., 1983; Волкова Л.В. и др., 1998).

Нами для повышения урожая ВБН-Х-32/19 в куриных эмбрионах использованы следующие сахара: Д(+)-мальтоза, Д(+)-глюкоза, Д(+)-лактоза, а также среда МЕМ-богатая глутамином. Проведенные исследования показали, что наилучшие результаты достигнуты при внесении в эмбрион вместе с заражающей дозой вируса Д(+) изомера лактозы. При ее применении гемагглютинирующая активность вируса возросла в 7 раз по сравнению с исходным штаммом.

Полученный результат возможно связан с тем, что лактоза может участвовать в исправлении дефектов клеточной поверхности, возникающих вследствии дестабилизации мембран клетки, что приводит к увеличению на них адсорбции полинуклеотидов (Heyes J. et al., 1974).

Использование холодоадаптированного варианта ВБН, пассируемого в присутствии Д(+)-лактозы обеспечивало высокие титры (16000 - 18000 ME/мл) синтезируемого интерферона. При использовании других Сахаров такого эффекта не наблюдалось. ВБН-Х-32/19 пассируемый в присутствии Д(+)-лакгозы, сохранял свои высокие интерфероногенные свойства даже после 1 года хранения. Результаты представлены на рис. 1.

ПВА интерферона

Рис.1. Интерферонпродуцирующая активность холодоадаптирован-ных линий штамма «Н» ВБН с добавками Сахаров.

Д(+)-изомер лактозы добавляемый в среду при культшнгрова-1ши нпруса обладает и стабилизирующими свойствами для вируса, что согласуется с данными авторов использующих лактозу как основу для конструирования вакцины против Нькаслской болезни птиц (Исаков Н.Б. и др., 1997; Говоров В/Г. и др., 1998).

В процессе выделения лейкомассы из крови доноров при помощи метилцеллюлозы, используемой в производстве интерферона, остается небольшое количество эритроцитов. Так как вакцинный штамм «Н» вируса болезни Ньюкасла обладает гемолитической активностью, остаточные эритроциты на стадии индукции лизируются, загрязняя культуральную среду продуктами гемолиза. При использовании холодоадаптированного ВБН-Х-32/19, полученного с добавлением Д(+)-лактозы лизис эритроцитов практически отсутствовал, что является еще одгаш преимуществом полученного индуктора.

Применяемый в настоящее время в производстве интерферона метод определения необходимого для индукции количества ВБН в ГАЕ не позволяет стандартизовать эту стадию технологического процесса. Недостатком реакции гемагглютинации является нестандартность условий ее постановит, манипуляция с нестандартным ингредиентом (взвесь свежих куриных эритроцитов) и определенная доля субъективизма в оценке результатов (Сюрин В.Н. и др. 1986).

Наиболее доступным и простым количественным методом, позволяющим контролировать необходимое для индукции количество вируса явгяется реакция радиальной иммунодиффузии, в основу которой положен метод Манчини (Фримель X., 1979).

Все авторы, использовавшие эту реакцию, отмечают ее высокую специфичность (КаЦГМЖ, 1970; Негетапэ ТР., 1971). Кроме того достоинством ее является легкая возможность объективной регистрации полученных результатов (Сох N.1 е! а1., 1981). В пределах своей чувствительности радиальная иммунодиффузия в принципе пригодна для количественного определения любого антигена, в частности она рекомендована ВОЗ для количественного определения гемагглютинина вируса гриппа (Кастрикипа Л.Н. и др., 1993).

При разработке системы для количественного тестирования ВБН-Х-32/19 нами изучено влияние ионных и неионных детергентов на размер площади кольца преципитации. Лучший результат получен при добавлении 5 % -лаурилсаркозината натрия и 5 % тритона-Х-100.

Иммунную сыворотку, полученную после 5 циклов иммунизации, лиофильно высушивали. Режим для высушивания подбирали

экспериментапьным путем. Было использовано 6 вариантов крио-протекторов и их комбинаций, наиболее часто применяемых при лиофильном высушивании другими авторами (Никитин Е.Е. и др.,1971; Пушкарь Н.С. и др., 1975; Попов В.И., 1980; Кадетов В.В. и др., 1986).

Сравнительное изучение результатов, полученных в РГА и РРИД с использованием различных вирусных концентратов, полученных из цеха интерферона ГУЛ «Иммунопрепарат», показало, что при одинаковом титре в РГА, количество вносимого индуктора по результатам РРИД значительно варьирует. Использование РРИД позволяет более точно определить нагрузку вируса на лейкоцит и стандартизовать этап индикации при условии стандартной чистоты лейкоцитарной взвеси, используемой для синтеза интерферона, что приводит к более стабильным титрам синтезируемого интерферона.

Результата положены в основу следующей НТД:

• Изменений к Регламенту производства человеческого лейко-. цитарного интерферона № 281 -90;

• Инструкции по изготовлению и контролю РРИД для определения количества вносимого вируса-индуктора.

• По полученным материалам оформлены 3 заявки на патентование, получено 2 патента на изобретение РФ и приоритетная справка.

• Получешшй холодоадаптированяый штамм «Н» вируса болезни Ньюкасла депонирован в Государственной коллекции вирусов института вирусологии им.Д.И.Ивановского Российской Академии медицинских наук (ГКВ № 2348).

• При использовании нового варианта индуктора, в цехе интерферона ГУП «Иммунопрепарат», получен экономический эффект, составляющий 30% от годовой прибыли цеха.

Выводы

1. Методом последовательных пассажей при температуре (32±0,5) °С, при низкой дозе заражения, получен холодоадаптиро-ванный вариант штамма «Н» ВБН с низкой вирулентностью для лейкоцитов человека (ВБН-Х-32/19).

2. Использование в качестве индуктора интерферона холодоа-даптированного варианта ВБН-Х-32/19, обеспечивало биосинтез интерферона лейкоцитами человека с противовирусной активностью 11 ООО -14 ООО МЕ/мл, при низком повреждающем действии на клетки-продуценты.

3. Азотистая кислота, использованная в качестве химического мутагена, позволила получить вариант ВБН-Х-32/19 со сниженными гемолитическими свойствами по отношению к человеческим эритроцитам периферической крови человека.

4. С помощью Д(+) изомера лактозы, внесенного в среду культивирования ВБН-Х-32/19 в процессе пассажей, получен стабильный по свойствам вариант холодоадаптированного ВБН-Х-32/19 с высокой интерфероногенной активностью, обеспечивающий получение интерферона с противовирусной активностью - 16000-18000 МЕ/мл, при низкой гемолитической активности индуктора.

5. Для стандартизации условий интерфероногенеза была разработана тест-система (РРИД) для количественного определения вируса-индуктора.

Основные работы по теме диссертации

1. Бобкова Е.В., Муллагулова М.Н., Загидуллии Н.В., Галеева Э.Г., Маннанов P.A. Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона. // Патент РФ № 2140284 С 1 6 А 61 К 38/21.

2. Бобкова Е.В., Муллагулова М.Н., Загидуллин Н.В., Галеева Э.Г. Холодоадаптированный штамм «Н» вируса болезни Ньюкасл, используемый в качестве индуктора интерферона. //Патент РФ

№ 2154104 7 С 12 N 7/00, А 61 К 38/21//(С 12 N 7/00, С 12 R 1:93).

3. Муллагулова М.Н., Бобкова Е.В., Загидуллин Н.В. Изучение реакции радиальной иммунодиффузии для определения количества вносимого вируса-индуктора в процессе биосинтеза интерферона. //Актуальные вопросы разработки производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов, посвященной 95-летию Уфимского НИИВС им.И.И.Мечникова. - Уфа «Иммунопрепарат». - 2000 - с.51-53.

4. Муллагулова М.Н., Бобкова Е.В., Загидуллин Н.В. Поиск путей получения варианта вируса болезни Ньюкасла со сниженной вирулентностью в лейкоцитах человека. // Актуальные вопросы разработки производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов, посвященной 95-летию Уфимского НИИВС им.ИИ.Мечникова. - Уфа «Иммунопрепарат». - 2000 - с.49-51.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Муллагулова, Марина Николаевна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Взаимоотношение вирус-клетка в процессе инфекции и образования интерферона

1.2. Направленные мутации вирусов

Глава 2. Собственные исследования

2.1. Материалы и методы исследования

2.2. Получение холодоадаптированного вакцинного штамма «Н» вируса болезни Ньюкасла

2.2.1. Получение химических мутантов ВБН-Х-32/

2.2.2. Морфологическая, физико-химическая и биологическая характеристика ВБН-Х-32

2.3. Стимуляция размножения ВБН-Х-32/ в куриных эмбрионах

2.4. Разработка тест-системы для определения количества вируса-индуктора интерферона

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение вариантов вируса болезни Ньюкасла со сниженной вирулентностью для клеток-продуцентов интерферона"

Интерферон был открыт более 40 лет назад, однако интерес к этой проблеме не только не ослаб, но h в последние годы значительно возрос. Широкий спектр заболеваний, при которых показано лечение интерфероном, стимулирует рост производства различных его лекарственных форм. Однако масштабы производства человеческого лейкоцитарного интерферона сдерживаются дефицитом сырья - донорской крови. В этих условиях проведение исследований, связанных с новыми решениями и методическими подходами, направленными на интенсификацию процесса биосинтеза интерферона, весьма актуально.

Для промышленного производства человеческого лейкоцитарного альфа-интерферона в качестве индуктора используется вакцинный штамм «Н» вируса болезни Ньюкасла, либо инфекционный вирус Сендай (Cantell К. et al, 1981; Тазулахова Э.Б., 1996). В некоторых сообщениях высказывается мнение о тесной корреляции между патогенностью вируса и его способностью индуцировать синтез интерферона (Sabin A.B., 1961; Baron S. et al., 1966; Jacobsen S. et al., 1981). Недостатком вирусных индукторов используемых в производстве является их достаточно высокая вирулентность для интерферонсинтезирующих клеток-лейкоцитов человека. Однако многими авторами установлено, что аттенуированные штаммы, по сравнению с вирулентными, вызывают образование больших количеств интерферона (Baron S., 1964; Ершов Ф.И., Аскарходжаев H.A., 1980; Jacobsen S. et al., 1981).

Известно, что большинство аттенуированных штаммов, используемых в медицине и ветеринарии, было получено путем серийных пассажей вируса дикого типа в новом хозяине при низкой температуре, что во многих, хотя и не во всех, случаях приводило к ослаблению вирулентности вируса для основного хозяина. Такие «адаптированные к холоду» мутанты часто имеют фенотип ts, т.е. не способны размножаться при повышенной температуре, при этом мутанты, адаптированные к холоду, при пониженной температуре обычно растут лучше, чем вирус дикого типа (Феннер Ф. и др., 1977).

Пониженная температура репродукции оказалась наиболее полезной для селекции вирусных вакцинных штаммов и их поддержания в целях предохранения от реверсии (Смородинцев А.А. и др., 1975).

Этот принцип широко использован в работе по аттенуации вирусов RS (Wright P.F. et al., 1970); гепатита A (Provost P.J. et al., 1982); аденовируса (Уильяме Д.Ф. и др., 1975); кори (Чумаков М.П. и др., 1998); гриппа (Дектярева Н.И. и др. 1977; Егоров А.Ю. и др. 1984; Herlocher М. et al., 1996; Parkin N.T. et al. 1997; Найхин A.H. и др., 1998; Романова Ю.Р. и др, 1998; Киселева И.В. и др., 1999; Ларионова Н.В. и др., 1999).

Цель работы: Получение вариантов вакцинного штамма «Н» вируса болезни Ньюкасла со сниженной вирулентностью для клеток-продуцентов интерферона (лейкоцитов человека) и оценка их интерфе-роногенной активности.

Актуальность проблемы

Широкий спектр заболеваний, при которых показано лечение интерфероном, стимулирует рост производства этого препарата. Однако масштабы производства человеческого лейкоцитарного интерферона сдерживаются дефицитом сырья - донорской крови. В этих условиях проведение исследований, направленных на поиск новых решений и методических подходов, обеспечивающих интенсификацию процесса биосинтеза интерферона, весьма актуально.

Научная новизна

Впервые получен высокоактивный и низковирулентный для клеток-продуцентов интерферона, холодоадаптированный вариант вируса болезни Ньюкасла, используемый в качестве индуктора интерферона, повышающего синтез интерферона при слабом повреждении интерфе-ронсинтезирующих клеток. При использовании холодоадаптированного штамма, урожай интерферона повышался в 4 раза и более по сравнению с исходным производственным вакцинным штаммом «Н» ВБН.

Впервые предложена ростовая добавка Д-изомер лактозы для получения высокого урожая вируса в куриных эмбрионах.

Впервые применена тест-система для стандартизации условий индукции интерфероногенеза.

Научная новизна подтверждена 2 патентами РФ. На третью заявку получена приоритетная справка. Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского Российской Академии медицинских наук (ГКВ № 2348).

Практическая значимость работы

Полученные результаты положены в основу Изменений к Регламенту производства человеческого лейкоцитарного интерферона № 28190; Инструкции по изготовлению и контролю РРИД для определения количества вносимого вируса-индуктора. Штамм-индуктор и тест-система, а также ростовая добавка Д-изомер лактозы, переданные в цех интерферона ГУЛ «Иммунопрепарат» способствовали получению больших количеств интерферона.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Муллагулова, Марина Николаевна

-91 -Выводы

1. Методом последовательных пассажей при температуре (32+0,5) °С, при низкой дозе заражения, получен холодоадаптированный вариант штамма «Н» ВБН с низкой вирулентностью для лейкоцитов человека (ВБН-Х-32/19).

2. Использование в качестве индуктора интерферона холодоадап-тированного варианта ВБН-Х-32/19, обеспечивало биосинтез интерферона лейкоцитами человека с противовирусной активностью 11 ООО -14 ООО МЕ/мл, при низком повреждающем действии на клетки-продуценты.

3. Азотистая кислота, использованная в качестве химического мутагена, позволила получить вариант ВБН-Х-32/19, со сниженными гемолитическими свойствами, по отношению к человеческим эритроцитам периферической крови человека.

4. С помощью Д(+) изомера лактозы, внесенной в среду культивирования ВБН-Х-32/19 в процессе пассажей, получен стабильный по свойствам вариант холодоадаптированного ВБН-Х-32/19 с высокой ин-терфероногенной активностью, обеспечивающий получение интерферона с противовирусной активностью - 16000-18000 МЕ/мл, при низкой гемолитической активности индуктора.

5. Для стандартизации условий интерфероногенеза была разработана тест-система (РРИД) для количественного определения вируса-индуктора.

Заключение

Применяемый в настоящее время в производстве человеческого лейкоцитарного интерферона в качестве индуктора вакцинный штамм «Н» ВБН, является одним из лучших известных вирусных индукторов (Mogensen К.Е. et al., 1977; Фролова В.М. и др., 1984). Однако, он обладает сильным повреждающим действием на лейкоциты и гемолизирует остаточные эритроциты в лейкоцитарной суспензии.

Существует мнение о тесной корреляции между вирулентностью вируса и его способностью индуцировать синтез интерферона. На модели различных вирусов многими авторами отмечено, что штаммы со сниженной вирулентностью способны индуцировать синтез больших количеств интерферона, чем высоко вирулентные (Ruiz-Gomes J. et al., 1963; Baron S., 1964; Baron S. et al., 1966; Ершов Ф.И., Аскарходжаев H.A., 1980; Ja-cobsen S et al., 1981).

Для получения штаммов со сниженной вирулентностью могут быть применены разные методы. Один из наиболее часто используемых - пассажи чистых линий вирусов при низкой заражающей дозе (50-100 инфекционных единиц) в условиях пермиссивной температуры. При этом удается сохранить генетическую однородность штаммов даже в условиях, благоприятных для изменения наследственных свойств вируса, как это показано в модельных опытах с вирусом гриппа, вирусом полиомиелита, вирусом болезни Ньюкасла и др. (Baron S., 1964; Гендон Ю.З., 1975; Полежаев Ф.И. и др., 1986).

Температурочувствительные мутанты размножаются при пермис-сивной температуре и не образуют инфекционного вируса при непермис-сивной температуре. Возможно, что температурочувствительные мутации могут происходить в любом вирусном гене, но с помощью селективных методов удается выделить лишь те мутанты, у которых изменены функции, существенные для воспроизведения вируса (Полежаев Ф.И. и др., 1986).

С этой целью, для получения вариантов вируса болезни Ньюкасла со сниженной вирулентностью для лейкоцитов человека, нами использованы пермиссивные температуры (32 и 28) °С, для размножения вирусов в куриных эмбрионах.

Выбор температурного режима был обусловлен тем, что согласно литературным данным низкие температуры в частности 32 °С обеспечивают стабильность реплицирующейся РНК (Гендон Ю З. и др., 1975; «Общая и частная вирусология», 1982).

Выбранная нами низкая множественность заражения 50- 100 ЭИД/50/0,2 мл, объясняется тем, что в этих условиях лучше селекционируются варианты вируса с заданными свойствами.

В процессе выполнения работы получены два холодоадаптирован-ных штамма, пассируемых при 28 °С (ВБН Х-28) и 32 °С (ВБН Х-32).

Инфекционный титр штамма вируса, культивируемого при 28 °С, в развивающихся куриных эмбрионах, повысился на 1 ЭИД/50/мл к 9 пассажу, при возрастании гемагглютинирующей активности в 8 раз (с 1:4 до 1:32).

Инфекционный титр вируса, культивируемого при 32 °С к 19 пассажу, увеличивался на 3 ^ ЭИД/50/мл (с 8 ЭИД/50/мл до 11 ^ ЭИД/50/мл), а титр в РГА возрастал в 4 раза (с 1:192 до 1:768).

При контрольном культивировании исходного штамма с той же множественностью заражения, но при 37 °С, инфекционная активность вируса снижалась на 4 ЭИД/50/мл, а титр в РГА оставался на прежнем уровне.

При исследовании интерферониндуцирующей активности, показано, что при использовании в качестве индуктора линии вируса 1 пассажа, репродуцирующегося при температуре 37 °С, с индуцирующей дозой 5 ГАЕ/1х106 лейкоцит, выход интерферона составил 1400 - 2800 МЕ/мл.

При использовании в аналогичных условиях, в качестве индуктора линии вируса, репродуцирующейся при температуре 28 °С, количество синтезированного интерферона практически не увеличивалось и оставалось на уровне 700 - 1400 МЕ/мл.

Однако, при использовании в тех же условиях опыта в качестве индуктора линии вируса 19 пассажа репродуцирующегося при температуре 32 °С, противовирусная активность синтезированного интерферона достигала 11 200-14 000 МЕ/мл.

- 83

Кроме того, линия вируса, репродуцирующаяся при 32 °С, обладает низкой вирулентностью для лейкоцитов человека, и нами показано, что при ее использовании на стадии индукции гибнет не более 25 % ин-терферонпродуцирующих клеток, тогда как при использовании линии вируса, репродуцирующаяся при 37 °С (контроль), гибель лейкоцитов достигает 40 - 45 %, что согласуется с данными других авторов исследовавших повреждающее действие вирусов, реплицирующихся при 37 °С, в человеческих лейкоцитах (Фролова В.М. и др., 1984).

Возможно, эффект увеличения синтеза интерферона при использовании холодоадаптированного штамма связан с тем, что в клетку-продуцент (лейкоцит), внедряется большее количество вируса, которое оказывает стимулирующий эффект на транскрипцию и трансляцию иРНК-интерферона, и обеспечивает замедление синтеза регуляторного белка, блокиратора синтеза интерферона (Орлова Т.Г. и др., 1975; Орлова Т.Г. и др., 1977; Соколова Т.М. и др., 1978).

Кроме того известно, что иРНК-ИФ обладает при 32 °С большей стабильностью по отношению к проявлению транскриптазной активности (Ершов Ф.И. и др., 1980). Процесс индукции интерферона «включает» параллельно с синтезом интерферона и выработку репрессора (Ершов Ф.И., 1993). Можно предположить, что при использовании холодоадаптированного штамма процесс выработки репрессора идет медленее, чем при использовании обычного вакцинного штамма «Н» ВБН.

Весьма существенным преимуществом полученного штамма являлось снижение гемолитических свойств вируса (в 11,7 раза), при испо

- 84 льзовании нагрузки вируса 5 ГАЕ/106 лейкоцитов, по сравнению с исходным штаммом «Н» ВБН.

Таким образом, к 19 пассажу удалось селекционировать холодоа-даптированный вакцинный штамм «Н» вируса болезни Ньюкасла, инфекционная активность которого в куриных эмбрионах, возросла на 3 логарифма (с 8 ^ ЭИД/50/0,2 мл у маточного штамма до 11 ^ ЭИД/50/0,2 мл у вируса 19 пассажа). Однако, несмотря на превалирующую долю вирусов, размножающихся при пермиссивной температуре (32 ° С), 19 пассаж содержал вирусные частицы размножающиеся и при температуре

37 °С (4 ЭИД/50/0,2 мл), что обуславливает реверсибельность темпе-ратурочувствительных штаммов. Реверсибельность данной линии составила 25%, что соответствует данным полученным другими авторами при работе с температурочувствительными штаммами вирусов (Феннер Ф. и др., 1977; Полежаев и др., 1986; Климов А.И. и др., 1987).

При сравнительном электронно-микроскопическом изучении вируса выявлено, что морфологическое строение холодоадаптированного вируса не отличается от исходного штамма. Сходные данные были получены другими исследователями, изучавшие морфологию температурочувстви-тельных штаммов (Авакян А.А. и др., 1970; Майзель Д., 1972; Быковский А.Ф. и др., 1975; Соловьев В.Д. и др., 1979; гЫто\у О.Р. е! а1., 1985). По нашему мнению это подтверждает положение о том, что ген, отвечающий за температурочувствительность находится только в одном сайте (Уильяме Д.Ф. и др., 1975; Егоров А.Ю. и др. 1994; Ого\уе 1Е. е! а1., 1996).

Для сохранения свойств ВБН-Х-32/19 в процессе сушки проведен подбор криопротекторов. Нами был выбран 0,1% желатин, как самый экономичный и не ухудшающий биологических свойств вируса.

Селекционированный холодоадаптированный штамм «Н» вируса болезни Ньюкасла (ВБН-Х-32/19) депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского Российской Академии медицинских наук, номер депонента ГКВ № 2348.

В связи с встречающимися литературными данными о повышении интерфероногенных свойств вируса после воздействия на них химических мутагенов (Покидышев JI.H. и др., 1974), нами была предпринята попытка усилить индуцирующие свойства ВБН-Х-32/19 после воздействия на него химических мутагенов. В качестве химических мутагенов нами были использованы: циклогексил, папаин, колхицин, азотистая кислота.

Основным стимулом синтеза интерферона считают внедрение в клетку чужеродной нуклеиновой кислоты, нарушающей нормальный генетический баланс. Эта стимуляция характерна прежде всего для нуклеиновых кислот вирусов, хотя и любые другие чужеродные нуклеиновые кислоты, в том числе и модифицированные азотистой кислотой нуклеиновые кислоты собственных клеток, могут служить индукторами интерферона (Isaacs А., 1963). При этом по данным Thiry L., азотистая кислота вызывает двойную мутацию: по гемагглютинирующим и интерфе-рониндуцирующим признакам (Thiry L., 1963; Пфефферкон Э., 1972).

Этот методический подход использован нами для полученния химического мутанта ВБН-Х-32/19. После обработки холодоадаптированного варианта штамма ВБН-Х-32/19 азотистой кислотой получен химический мутант, который не дал более высоких титров ПВА синтезированного интерферона по сравнению с использованием ВБН-Х-32/19. Единственным его преимуществом являлось отсутствие лизиса эритроцитов на стадии индукции интерферона и таким образом интерферон не загрязнялся продуктами гемолиза эритроцитов.

Известно, что на размножение вируса в развивающихся куриных эмбрионах могут влиять различные добавки, вносимые в эмбрион (Ахматуллина Н.Б. и др., 1977; Зусман М., 1977; Ермолаев М.В., 1983; Волкова Л.В. и др., 1998).

Нами для повышения урожая ВБН-Х-32/19 в куриных эмбрионах использованы следующие сахара: Д(+)-мальтоза, Д(+)-глюкоза, Д(+)-лактоза, а также среда MEM богатая глутамином. Проведенные исследования показали, что наилучшие результаты достигнуты при внесении в эмбрион Д(+) изомера лактозы, вместе с заражающей дозой вируса. При ее применении гемагглютинирующая активность вируса возросла в 7 раз по сравнению с исходным штаммом. Возможно, Д(+)-изомер лактозы способствует лучшему контаюу^ндукторов с рецепторами клетки и увеличивает захват индукторов клетками. Обладая стимулирующим эффектом поликатионов, лактоза может участвовать в исправлении дефектов клеточной поверхности, возникающих вследствии дестабилизации мембран клетки, это приводит к увеличению адсорбции полинуклеотидов.

- 87

Использование холодоадаптированного варианта ВБН, пассируемого в присутствии Д(+)-лактозы обеспечивало высокие титры (16000 -18000 МЕ/мл) синтезируемого интерферона, при использовании других Сахаров такого эффекта не достигалось. ВБН-Х-32/19 пассируемый в присутствии Д(+)-лактозы, сохранял свои высокие интерфероногенные свойства даже после 1 года хранения.

Д(+)-изомер лактозы добавляемый в среду при культивировании вируса обладает и стабилизирующими свойствами для вируса, что согласуется с данными авторов использующих лактозу как основу для конструирования вакцины против Нькаслской болезни птиц (Исаков Н.Б. и др., 1997; Говоров В.Т. и др., 1998).

В процессе выделения лейкомассы из крови доноров при помощи метилцеллюлозы, используемой в производстве интерферона, остается небольшое количество эритроцитов. Так как вакцинный штамм «Н» вируса болезни Ньюкасла обладает гемолитической активностью, остаточные эритроциты на стадии индукции лизируются, загрязняя культураль-ную среду продуктами гемолиза. При использовании холодоадаптированного ВБН-Х-32/19 полученного с добавлением Д(+)-лактозы лизис эритроцитов практически отсутствовал, что является еще одним преимуществом полученного индуктора.

Применяемый в настоящее время в производстве интерферона метод определения необходимого количества ВБН в ГАЕ для Индукции не позволяет стандартизовать эту стадию технологического процесса. Недостатком реакции гемагглютинации является нестандартность условий ее постановки, манипуляция с нестандартным ингредиентом (взвесь свежих куриных эритроцитов) и определенная доля субъективизма в оценке результатов (Сюрин В.Н. и др. 1986).

Наиболее доступным и простым количественным методом, позволяющим контролировать необходимое для индукции количество вируса является реакция радиальной иммунодиффузии, в основу которой положен метод Манчини (Фримель X., 1979).

Все авторы использовавшие эту реакцию, отмечают ее высокую специфичность (Kalif M.W., 1970; Heremans J.F., 1971).

Кроме того достоинством ее является легкая возможность объективной регистрации полученных результатов (Сох N.J. et al., 1981). В пределах своей чувствительности радиальная иммунодиффузия в принципе пригодна для количественного определения любого антигена, в частности она рекомендована ВОЗ для количественного определения ге-магглютинина вируса гриппа (Кастрикина Л.Н. и др., 1993).

При разработке системы для количественного тестирования ВБН-Х-32/19 нами изучено влияние ионных и неионных детергентов на размер площади кольца преципитации. Лучший результат получен при добавлении 5 % -лаурилсаркозината натрия и 5 % тритона-Х-100.

Иммунную сыворотку, полученную после 5 циклов иммунизации, лиофильно высушивали и ампулы запаивали под азотом. Режим для высушивания подбирали экспериментальным путем, согласуясь с данными других авторов (Никитин Е.Е. и др.,1971; Пушкарь Н.С. и др., 1975; Попов В.И., 1980; Кадетов В.В. и др., 1986).

Чистоту полненных ингредиентов для РРИД, гомогенность и специфичность вируса контролировали электронной микроскопией, электрофорезом и методом ИФА (Бочков Ю.А. и др., 1997)

Сравнительное изучение результатов, полученных в РГА и РРИД с использованием различных вирусных концентратов, полученных из цеха интерферона ГУЛ «Иммунопрепарат», показало, что при одинаковом титре в РГА, количество вносимого индуктора по результатам РРИД значительно варьирует. При этом в стандартных условиях опыта площадь кольца преципитации прямо пропорционалена концентрации исследуемого антигена. Использование РРИД позволяет более точно определить нагрузку вируса на лейкоцит и стандартизовать этап индукции при условии стандартной чистоты лейкоцитарной взвеси, используемой для синтеза интерферона, что приводит к более стабильным титрам синтезируемого лейкоцитами интерферона.

Полученные результаты положены в основу следующей НТД:

1. Изменений к Регламенту производства человеческого лейкоцитарного интерферона № 281 -90;

2. Инструкции по изготовлению и контролю РРИД для определения количества вносимого вируса-индуктора.

3. Поданы 3 заявки на патентование, получено 2 патента на изобретение и приоритетная справка.

-904. Полненный холодоадаптированный штамм «Н» вируса болезни Ньюкасла депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им.Д.И.Ивановского Российской Академии медицинских наук (ГКВ № 2348).

5. При использовании нового варианта индуктора, в цехе интерферона ГУЛ «Иммунопрепарат», получен экономический эффект, составляющий 30% от годовой прибыли цеха.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Муллагулова, Марина Николаевна, Уфа

1. Авакян A.A., Быковский А.Ф. //Атлас анатомии и онтогенеза ви русов человека и животных. М. «Медицина». - 1970. - с.270

2. Агол В.И., Атабеков И.Г., Крылов В.Н., Тихоненко Т.И. //Молекулярная биология вирусов. М. «Наука». - 1971. - с.418.

3. Александрова Г.И., Смородинцев A.A. Итоги изучения специального варианта живой гриппозной вакцины для детей дошкольного и младшего школьного возраста. //В сб.: Грипп и вирусные ОРЗ. Л. ч.1 -1967.-с. 120-123.

4. Амченкова A.M., Воронина Ф.В., Авакян A.A., Хесин Я.Е. Гистохимическое и электронномикроскопическое изучение клеток в процессе выработки ими интерферона. //В кн.: Образование и действие интерферона. Рига. - «Знатне». - 1972. - с.279-285.

5. Ахматуллина Н.Б., Шигаева М.Х., Деревцова Н.М., Абдукари-мова Д.А., Мустафин К.Г. //Авторское свидетельство СССР №610864 -кл.С 12 №7/00 1977.

6. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. //Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л. «Медгиз». - 1962. - с. 180.

7. Бажан С.И., Белова O.E. Молекулярно-генетические аспекты индукции и противовирусного действия интерферона. //Вестник РАМН. 1998. №3. - с. 18-24.- 93

8. Баринский И.Ф., Шубладзе A.K. //Лейкоцитарные культуры в вирусологических исследованиях. Москва «Медицина». -1980- с.151-156.

9. Барон С. Интерферон. Получение, методы определения и идентификация. //Методы вирусологии и молекулярной биологии. Москва «Мир». - 1972. - с.323-336.

10. Бектимиров Т.А., Бектемирова М.С. Генетическая обусловленность выработки интерферона у людей и животных. //В кн.: Материалы XV Всесоюзного съезда эпидемиологов, микробиологов и инфекционистов. М. - 1970. - 4.2. - с.350-351

11. Белоусова А.К. Молекулярные основы специфического взаимодействия сигнальных белков. //Успехи современной биологии. 1999. - т.119, №4. - с.345-357.

12. Бобкова Е.В. Технологические аспекты получения препарата интерферона, обогащенного цитокинами. //Докторская диссертация. -1992.

13. Бойчук Л.М., Смородинцев A.A., Тарос Л.Ю. Общая закономерность аттенуации вируса кори. //Труды института им. Пастера. Л. -т.34.- 1968-c.il.-94

14. Борисов A.B., Кузнецов В.Н., Гусев A.A., Кузнецов Ю.В., Смоленский В.И., Норкина В.Н. Вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц. //Патент 2127604 Россия, МПК6 А 61 К 39/12, С 12 N 7/00. 1999.

15. Бохонько А.И., Мамонтова Т.В., Орлова Т.Г. О возможном механизме индукции интерферонообразования. //В сб.: Теоретическая и прикладная инфекционная иммунология. Тезисы докладов I Всесоюзной конференции 27-28 октября 1982г. М. - 1982. - с. 105.

16. Бохонько А.И., Мамонтова Т.В., Когновицкая А.И., Орлова Т.Г. Неспецифичность механизма репрессии интерферонообразования. //Молекулярная генетика микробиология и вирусология. 1984. - №10. -с.35-37.

17. Букринская А.Г., Зайдес В.М. //Молекулярная микробиология парамиксовирусов. М. «Медицина». - 1978. - с. 106 - 129.

18. Быковский А.Ф., Ершов Ф.И., Кармышева В.Я., Блюмкин В.Н., Миронова Л.Л. //Атлас вирусной цитопатологии. М. «Медицина». -1975. -с.185, 260.

19. Волкова Л.В., Молохова Е.И., Петров В.Ф., Сафонова Г.М. Поиск стабилизирующих факторов мазевой композиции с интерфероном. /В сб.: Современная вакцинология. Пермь. - 1998. - с. 162, 213.

20. Гарипова М.И., Монаков Ю.Б., Басченко И.А. Иммуносорбент для очистки интерферона. //Вопросы вирусологии. 1993. - №3. - с. 129132.

21. Геворкян М.Г., Тазулахова Э.Б., Ершов Ф.И. //Антивирусные вещества. Минск «Беларусь». - 1984. - с.127-137.

22. Гендон Ю.З. //Генетика вирусов человека и животных. М. «Наука». - 1967. - с.49-57.

23. Гендон Ю.З. //Молекулярная генетика вирусов человека и животных. М. «Медицина». - 1975. - с.303-309.

24. Гендон Ю.З., Поглазов Б.Ф., Тихоненко Т.И. //Нуклеиновые кислоты и белки вирионов. М. «Наука». - 1975. - с.261-266.

25. Говоров В.Т., Смоленский В.И. Способ изготовления сухой вакцины преимущественно против болезни Ньюкасла. //Патент 2122429 Россия, МПК6 А 61 К 39/17. 1998.

26. Горвиц М., Шарфф М. Получение антисывороток к вирусным антигенам. //Методы вирусологии и молекулярной биологии. Москва «Мир».- 1972.-с.200-207.

27. Дектярева Н.И., Медведева Т.Е., Полякова Ю.М., Голубев Д.Б., Александрова Г.И. Дифференцирующие признаки вирулентных и атте-нуированных (холодоадаптированных) штаммов вируса гриппа А. //Вопросы вирусологии. 1977. - №2. - с.173-177.

28. Долинов К.Е. //Основы технологии сухих биопрепаратов. Москва. - 1969. - с.8-10.

29. Егоров А.Ю., Медведева Т.Е., Полежаев Ф.И. Особенности получения и характеристика холодоадаптированного варианта вируса гриппа A/PR/8/3 4/. //Acta virol. 1984. - т. 28, № 1. - с. 19 - 25.

30. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. //Теория и практика иммуноферментного анализа. Москва «Высшая школа». -1991.-с. 150-163.

31. Ершов Ф.И., Аскарходжаев H.A. Продукция интерферона. //Успехи современной биологии. М. «Наука». - 1980. - т.89, №3. - с.394-405.

32. Ершов Ф.И., Соколова Т.М., Тазулахова Э.Б., Кислинг У. Информационные РНК для интерферона и антивирусного белка. //В кн.: Общая вирусология. М. - 1977. - с.32-38.

33. Ершов Ф.И., Новохатский A.C. //Интерферон и его индукторы. М. Медицина. 1980. - с.28-31

34. Ершов Ф.И., Новохатский А.С.//Индукторы интерферона. Рига «Зинатне». -1981. - с.7-18.

35. Ершов Ф.И. Молекулярная биология интерферона. //Молекулярная генетика микробиология и вирусология. 1983. - № 6. -с.10-15.

36. Ершов Ф.И., Чижов Н.П., Тазулахова Э.Б. //Противовирусные средства. Санкт-Петербург. - 1993. - с. 104.

37. Ершов Ф.И. //Система интерферона в норме и при патологии. М. «Медицина». 1996. - с.7.

38. Ершов Ф.И., Жданов В.М. Возникновение системы интерферона и ее роль в гомеостазе. //В кн.: Система интерферона в норме и при патологии. М. «Медицина». - 1996. - c.l 1 - 20.

39. Зайдес В.М., Березин В.Э., Жданов В.М. Гликопротеиды оболо-чечных вирусов животных как трансмембранные белки. //Вопросы вирусологии. 1986. - № 2. - с.133-148.

40. Зайцева О.В., Тазулахова Э.Б., Ершов Ф.И. /Выделение и характеристика информационнных РНК репрессора интерферона. //Антибиотики. 1980. - №3. - с.215-218.

41. Засухина Г.Д. Система вирус-клетка как модель для изучения регуляции процессами репарации и мутагенеза. //В кн.: Мутагенез и репарация в системе вирус-клетка. М. «Наука». - 1983. - с.7-35.

42. Зусман М. //Биология развития. М. «Мир». - 1977. - с.43-53.

43. Ивановский С.А., Мусина Н.Ю. //Интерфероны и интерфероно-гены, их применение в ветеринарии. Филиал «Башкирский». - 1994.с.7-12.

44. Кадетов В.В., Король В.В., Тереньтьев А.Н. Принципы лиофи-лизации вирусов. //Вопросы вирусологии. -1986. № 3. - с.275-280.-9956. Каверин Н.В., Лукашевич И.С. //Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР. - Вирусология. - 1977. - №6. - с.5.

45. Кастрикина Л.Н., Лонская Н.И. Зависимость определения содержания гемагглютинина методом ОРИД от используемой тест-системы и детергента. //Вопросы вирусологии 1993 - № 3 - с. 132 - 135.

46. Киселева И.В., Руденко Л.Д., Александрова Г.И., Климов А.И., Ларионова Н.В. Штамм А/17/Нанчанг/95/4 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых. //Патент 2128223 Россия, МПК6 С12 N 7/00, А 61 К 39/145. 1999.

47. Климов А.И., Медведева Т.Е., Лисовская К.В., Егоров А.Ю., Гендон Ю.З., Александрова Г.И. Генетические основы апатогенности живых холодоадаптированных гриппозных вакцин. //ЖЭМИ. 1988. - №12. -с.48-52.

48. Колчурина A.A. //В сб.: Материалы конференции посвященной памяти Л.А.Тарасевича. М. - 1965. - с. 149.- 100

49. Коротяев А.И., Бабичев С.А. //Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. Санкт-Петербург, «Специальная литература». - 1998. - с. 158-165, 239-329.

50. Косяков П.Н., Берлинских, Чарчоглян P.A. Антигенные свойства клеток и тканей под действием вирусов. //Вопросы медицинской вирусологии. М. -1971. - вып.12. - с. 131 -134.

51. Кузнецов В.П. Современное состояние проблемы интерферона. //Антибиотики и химиотерапия. 1989. - №9. - с.646-652.

52. Кузнецов В.П., Мехедов Л.Н., Киктенко A.B. О методике получения высококонцентрированных препаратов интерферона для клинического применения. //Биохимия и биофизика микроорганизмов. Межвузовский сборник ГГУ. - Горький. -1981. - с.57-63.

53. Кулагин В.Ф. Разработка научных основ технологии крупномасштабного производства человеческого лейкоцитарного интерферона. //Докторская диссертация. 1995.

54. Кулагин В.Ф., Бобкова Е.В., Юсупов В.Г., Кузнецов В.П. Пути совершенствования производства человеческого лейкоцитарного интерферона. //В кн.: Вопросы медицинской биотехнологии иммунопрепаратов. Уфа.- 1988 -с.87-88.

55. Ларионова Н.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г., Климов А.И., Киселева И.В. Штамм А/47/Нанчанг/95/13 (H3N2) для производства-101живой гриппозной интраназальной вакцины для детей. //Патент 2127757 Россия, МПК6 С12 N 7/00, А 61 К 39/145. 1999.

56. Липкинд М.А., Цветкова И.В. Распределение нейраминидазной и гемагглютинирующей активностей в субклеточных фракциях культуры куриных фибробластов, зараженных вирусом болезни Ньюкасла. //Вопросы медицинской вирусологии. М. - 1971. - вып. 12.-с.59-61.

57. Лукашевич И.С., Варич Н.Л., Каверин Н.В. Характеристика 24 Б и 35 Б вирусспецифических РНК в клетках, зараженных вирусом болезни Ньюкасл. //Вопросы вирусологии. 1977. - № 2. - с. 151-156.

58. Лурия С., Дарнелл Дж., Балтимор Д., Кемпбелл Э. //Общая вирусология. М. «Мир». -1981.

59. Майзель Д. Фракционирование белков и нуклеиновых кислот с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. //Методы вирусологии и молекулярной биологии. Москва «Мир». - 1972. - с.267-293.

60. Маленков А.Г., Чунч Г.А. //Межклеточные контакты и реакции ткани. 1979.-с.136-142.

61. Мериган Т. Анализ белков методом гель-фильтрации. //Методы вирусологии и молекулярной биологии. Москва «Мир». - 1972. - с.294-306.

62. Методы вирусологии и молекулярной биологии. Москва «Мир». - 1972. - с. 187-189.

63. Никитин Е.Е., Звягин И.В. //Замораживание и высушивание био логических препаратов. Москва. -1971.

64. Общая и частная вирусология. М. «Медицина». - 1982,- т. 1. -стр.231.

65. Орлова Т.Г., Мамонтова Т.В., Менткевич Л.М. Синтез РЖ в инфицированных клетках в условиях гомологичной интерференции вируса болезни Ньюкасл. //Вопросы медицинской вирусологии. -М. -1971. -вып. 12. с.47-49.

66. Орлова Т.Г., Георгадзе И.И., Когновицкая А.И., Карманов П.А. Характеристика информацинной РНК для интерферона и интерфероноин-дуцирующей РНК, выделенных из клеток, зараженных вирусом болезни Ньюкасла. //Вопросы вирусологии. 1975. - №4. - с.412-416.

67. ОрловаТ.Г., Менткевич Л.М., Когновицкая А.И. Клеточные и молекулярнобиологические основы образования интерферона. //В кн.: Успехи иммунологии. М. -1977. - с. 191-202.

68. Орлова Т.Г., Соловьева М.Н., Славина Е.Г. Клетки-продуценты альфа- и гамма-интерферона. //Вопросы вирусологии. 1990. - №3.с.213-216.- 103

69. Остерман JI.А. //Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. Москва «Наука». -1981.

70. Остерман Л.А. //Хроматография белков и нуклеиновых кислот. -Москва «Наука». 1985. - с.109-168.

71. Парфенов В.А., Тихонов Т.А. Система интерферона: ингибиторы действия интерферона. //Фармакология и токсикология. 1990. - №6.с.71-77.

72. Петров Р.В., Атаулаханов Р.И. //Клеточные мембраны и иммунитет. М. «Высшая школа». -1991. - с. 144.

73. Подчерняева Р.Я., Денер Л., Медведева Т.Е., Александрова Г.И. Селекция холодоадаптированных вариантов вируса гриппа H1N1 и H3N2, их антигенная и генетическая характеристика. //Вопросы вирусологии. -1991. №2. - с.100-102.

74. Покидышева Л.Н., Марченко В.И., Кузнецов В.П. Изучение методов стимуляции образования интерферона. //Вопросы вирусологии. -1974.-№3.-с.280-283.

75. Полежаев Ф.И.,Смородинцев A.A. Роль температурочувстви-тельных мутантов в естественной эволюции вируса гриппа. //Вопросы вирусологии. 1986. - № 2. - с.148-153.

76. Попов В.И. //Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии. -Казань. 1980. - с.146-149.

77. Пушкарь Н.С., Белоус A.M. //Введение в криобиологию. Киев. - 1975.-104

78. Пушкарь Н.С., Шраго М.И., Белоус A.M., Калугин Ю.В. //Криопротекторы. Киев. - 1978.

79. Пфефферкон Э. Температурочувствительные мутанты вирусов животных: выделение и предварительная характеристика. //Методы вирусологии и молекулярной биологии. Москва «Мир». - 1972. - с.69-74.

80. Рейзин Ф.И., Зейтленок H.A., Чумаков М.П. Аминокислоты и мембранный транспорт в системе интерфероногенеза. //Успехи соврем, биол. 1974. - т.78. - № 2. - с. 254-272.

81. Робинсон М.В., Труфакин В.А. Апоптоз и цитокины. //Успехи современной биологии. 1999. - т.119, №4. - с.359-367.

82. Романова Ю.Р., Александрова Г.И., Руденко Л.Г., Ларионова Н.В. Штамм А (17) Иоганесбург (94) 1 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых. //Патент 2110277, Россия, МПК6 А 61 К 39/145, С12 N 7/00. 1998.

83. Романцев М.Г. //Противовирусные средства. Санкт-Петербург. -1996. - с.4-15.

84. Сассон А. //Биотехнология свершения и надежды. Под редакцией ДебабоваВ.Г. - М. «Мир». - 1987. - с.411.

85. Сергеев В.А. //Репродукция и выращивание вирусов животных М. «Колос». - 1976.

86. Сергеев В.А., Орлянкин Б.Г. //Структура и биология вирусов животных. М. «Колос» - 1983 - с.20-37.

87. Синелыцикова Т.А. Стимуляция процессов репарации в клетках эукариотов с помощью вирусов и интерферона. //В кн.: Мутагенез и репарация в системе вирус-клетка. М. «Наука». - 1983. - с.133-146.- 105

88. Смородинцев A.A., Лузянина Т.Я., Смородинцев Ал .А. //Основы противовирусного иммунитета. Л. «Медицина». - 1975. - с.62-72.

89. Соколова Т.М., Кислинг У. Молекулярные основы синтеза и действия интерферона. //Антибиотики. 1978. - т. 23. - №12. - c.l 112-1124

90. Соловьев В.Д., Баландин И.Г. //Клетка и вирус. М. «Медицина». - 1973. - с.191.

91. Соловьев В.Д., Бектимиров Т.А. //Интерфероны в теории и практике медицины. М. «Медицина» - 1981. - с.400-408.

92. Соловьев В.Д., Хесин Я.Е., Быковский А.Ф. //Очерки по вирусной цитопатологии. М. «Медицина». - 1979. - с.320.

93. Спигелман С. Внеклеточная стратегия реплицирующегося РНК-генома. //В кн.:Стратегия вирусного генома М. «Медицина». - 1975. -C.45.

94. Сюрин В.Н., БелоусоваР.Н., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. //Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных. М. «Агропромиздат». - 1986. - с.220-226, 258-265.

95. Тазулахова Э.Б. Индукция и продукция интерферонов. //В кн.: Система интерферона в норме и при патологии. М. «Медицина». -1996.-с.71-87.- 106

96. Тарасишин JI.А. Взаимодействие рецептор-антирецептор при вирусных инфекциях. //Молекулярная генетика микробиология и вирусология. 1997. - №4. - с.12-15.

97. Уильяме Дж.Ф., Устацелеби С. Температурочувствительные мутанты аденовируса человека типа 5. //В кн.: Стратегия вирусного генома. Под ред. Волстенхолма и М.О'Коннора. М. «Медицина». - 1975.с.238-252.

98. Феннер Ф., Мак-Ослен Б., Миме С., Сэмбрук Дж., Уайт Д. //Биология вирусов животных. М. «Мир». - 1977. - т. 1. - с.375-377.

99. Филдс Б., Найп Д. //Вирусология. М. «Мир» - 1989. - том 1,2.

100. Фримель X. //Иммунологические методы. М. «Мир» - 1979. -с.49-57.

101. Фролова В.М., Беляева Д.Л., Кузнецов В .П. Роговин В.В. Электронно-цитохимическое изучение лейкоцитов человека после индукции интерферона. //Антибиотики. 1984. - №10. - с.781-784.

102. Хесин Я.Е. Полипептиды интерферонов и их гены. //В кн. Система интерферона в норме и при патологии. М. «Медицина». -1996.-с.20-34.

103. Хесин Я.Е., Наровлянский А.Н., Амченкова A.M. Клеточные рецепторы для интерферонов. /В кн. Система интерферона в норме и при патологии. М. «Медицина». - 1996. - с.39-52.

104. Чекнев С.Б., Ершов Ф.И. Интерфероны. //В кн.: Система интерферона в норме и при патологии. М. «Медицина». - 1996. - с. 196221.

105. Чумаков М.П., Миронова JI.JI., Попова В.Д., Ральф Н.М., Алпатова Г.А. Разработка технологии изготовления живой коревой вакцины с использованием штамма ЭШЧ и линии диплоидных клеток человека М 22. //Биотехнология. 1998. - № 3. - с.40-42.

106. Щегловитова О.Н., Орлова Т.Г., Кулиева A.M. Интерфероны, вырабатываемые лейкоцитами человека после индукции вирусом гриппа //Вопросы вирусологии. 1989. - № 4. - с.463-466.

107. Allison A., Mallucci L. Histochemical studies of lysosomes and lysosomal enzymes in virus-infected cell cultures. //J.Exp. Med. 1965. - v.121. ■ p.463.

108. Baron S. Newcastle disease virus. //Univ. Wis. Press. 1964.p.205.

109. Baron S., Levy H.B. Interferon. //Ann. Rev. Microbiol. 1966. -v.20.-p.291.

110. Blair C.D., Robinson W.S. Replication of Sendai virus. II. Steps in virus assembly. //Virology. 1970. - v.5. - 639.

111. Collins P.L., Hightower L.E., Ball L.A. Transcriptional map for Newcastle disease virus. //J.Virol. 1980. - v.35. - p.682-693.

112. Compans R.W., Holmes K.V., Dales S., Choppin P.W. An electron microscopic study of moderate and virulent virus-cell interactions of the parainfluenza virus SV5. //J.Virology. 1969. - v.30. - p.411.

113. Cox N.J., Konnecke I., Kendal A.P. Genetic and biohemical analysis of the A/Ann Arbor/6/60 cold-adapted mutant. //In: Genetic Variation Among Influenza Viruses, ed.by D.P. Nayak. Academic Press, New York. -1981.p.639-652.

114. Ecker J.R., Hyman R.W. Varicella-zoster virus vaccine DNA differs from the parental virus DNA. //J.Virol. -1981. v.40. - p.314-318.- 109

115. Garcin D., Jtoh M., Kolakofsky D. A point mutation in the Sendai virus accessory C proteins attenuates virulence for mice, but not virus growth in cell culture. //Virol. 1997. - v.238, №2. - p.424-431.

116. Garmashova L.M., Leontieva G.F., Dubrovina T.Ya., Aleksandrova G.J. Partial change of the ts-phenotype of cold-adapted influenza virus strain grown in canine kidney cells in the presence of trypsin. /Acta virol. 1982. -v.26, №4. - p. 234-240.

117. Gendon Y.Z., Markuschin S., Lisovskaya K.V., Penn C.R., Mahy B.W. Extragenic suppression of ts phenotype during recombination between ts mutants of two fowl plague virus strains with a ts mutation in gene 1. //J. Gen. Virol.- 1982.-v. 62.-p.239-248.

118. Granoff A. Studies on mixed infection with Newcastle disease virus. III. Activation of nonplaque-forming virus by plaque-forming virus. //Virology. -1961. v.14. -p.143.

119. Heremans J.F. Antigen titration by single radial immunodiffusion in plates. //Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol.III, - Academic Press, New York and London, -1971- pp. 213 - 224.

120. Herlocher M. Louise, Clavo Anaira C., Maassab Hunein F. Sequence comparisons of A/AA/6/60 influenza viruses: Mutations which may contribute to attenuation. //Virus Res. 1996. - v.42. - № 1-2. - c.11-25

121. Huang A., Baltimore D., Bratt M. Ribonucleic acid polymerase in virions of Newcastle disease virus: comparison with the vesicular stomatitis virus polymerase. //J. Virology. -1971. v.7. - p.389-394.

122. Isaacs A. Interferon. //Advan. Virus Res. 1963. - v.10. - p.l.-110147. Jack G.J., Landenberg P. Живые вакцины, содержащие аттенуи-рованный вирус болезниНьюкасл и их получение. //Патент №5250298 США, МКИ5 А 61 К 39/12. 1995.

123. Jacobsen S., Fridman R.M., Pfau C.J. Interferon induction by lymphocytic choriomeningitis viruses correlates with maximum virulence. //J.Gen.Virol. 1981. - 57. - p.275-283.

124. Kalff M.W. Quantitative determination of serum immunoglobulin levels by single radial immunodiffusion. //Clin. Biochem. 1970 - v.3 - p. 91 -104.

125. Kingsbury D.W. Newcastle disease virus RNA. II. Preferential synthesis of RNA complementary to parental viral RNA by chick embryo cells. //J. Mol. Biol. 1966. - v. 18. - p. 195-204.

126. Kleinschmidt W.J. Biochemistry of interferon and its inducers. //Annu. Rev. Biochem. 1972. - v.41. - p.517-542.

127. Kohase L.D., Kohno S. Temperature-sensitive mutants of Newcastle disease virus affecting interferon induction. //J.Gen. Virol. 1983. - 64. - p.1469-1474.

128. Kumar M., Hassan M.Q., Tyagi S.K., Sarkar D.P. A 45,000-Mr glycoprotein in the Sendai virus envelope triggers virus-cell fusion. //J.Virol. -1997. v.71, №9. - p.6398-6406.-Ill

129. Li Z., Sergei T., Razvi E., Morrison T. Effect of cleavage mutants on syncytium directed by the wild-type fusion protein of Newcastle disease virus. //J. Virol. 1998. - v.75, № 5. - p.3789-3795.

130. Lonberg-Holm K., Philipson L. Early interaction between animal viruses and cells. //Monogr. Virol. 1974. - v.9. - p.67-70.

131. Maassab H.F., Monto A.S., DeBorde D.C., Cox N.J., Kendal A.P. Development of cold recombinants of influenza virus as live virus vaccines. //In: Genetic Variation Among Influenza Viruses, ed.by D.P. Nayak. Academic Press, New York. -1981. - p.617-637.

132. Mahy B.W., Hutchinson J.E., Barry R.D. Ribonucleic acid polymerase induced in cells infected with Sendai virus. //J. Virology. 1970. - v.5 - p.663.

133. Martins R.M.B., Golgher R.R. Induction of human amniotic interferon by strains of paramyxovirus: role of defective inferfering particles. //Rev. microbiol. 1994. - v.24 - p. 1-4.

134. Mills J., Chanock R.M. Temperature sensitive mutants of influenza virus. I. Behavior in tissue culture and experimental animals. //J.Infect. Dis. -1971. -V.123. p.145-157.

135. Mogensen K.E., Cantell K. Production and preparation of human leukocyte interferon. //Pharmac. Ther C. 1977. - v.l. - p.369-381.

136. Ohuchi M., Ohuchi R. Mechanism of membrane fusion mediated with viral proteins. //Kawasaki Med.J. 1997. - v.23, № 3-4. - p.123-134.

137. Orlova T.G., Georgadze I.I., Kognovitskaya A.I., Solovyov V.D. Interferon inducing and interferon - translating functions of RNA isolated from Newscastle disease virus - infected cells. //Acta virol. - 1974. - v. 18. - p.210-216.

138. Parkin Neil T., Chiu Peggy, Coelingh Kathlee L. Temperature sensitive mutants of influenza A virus generated by reverse genetics and chustered charged to alanine mutagenesis. //Virus Res. 1997. - v.46. - № 1-2. - p.31-44.

139. Partocala R., Samuel I., Dona G. //Studii $i cercetari inframicro-biol., microbiol. $i parazitol. Asad. RPR. 1963. - v.14. - p.277.

140. Provost P.J., Banker F.S., Giesa P.A., McAllerW.J., Buynak E.B., Hilleman M.R. Progress toward a live, attenuated human hepatitis A vaccine (41387). //Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1982. - 170. - p.8-14.- 113

141. Ramalho-Santos J., Pedroso de Lima M.C. The influenza virus hemagglutinin: A model protein in the study of membrane fusion. //Biochim. et biofis. acta Rev. Biomembranes. 1998. - v.1376, № 1. - p.147-154.

142. Ramig R.F., Ahmed R., Fields B.N. A genetic map of reovirus: As-sigment of the newly defined mutant groups H, I and J to genome segments. //Virology. 1983. - v.125. - p.299-313.

143. Robinson W.S. Sendai virus RNA synthesis and nucleocapsid formation in the presence of cycloheximide. //J.Virology. -1971. v.44. - p.494.

144. Ruiz-Gomes J., Issacs A. Interferon production by different viruses. //Virology.- 1963.-v. 19.-p.8.

145. Sabin A.B. Reproduction capacity of polioviruses of diverse origin at various temperatures. //Perspect in Virol. -1961. v.2. - p.24.

146. Scheglovitova O.N., Kulieva A.M., Orlova T.G. Production of alfainterferon by human leukocytes. //Acta virol. 1990. - v.34. - p.529 - 536.

147. Scholtissek C. Influenza virus genetics. //Adv. Genet. 1979. - v.20. -p.1-26.

148. Shorte D., Nathans D. Regulatory mutants of simian virus 40: Constructed mutants with base substitutions at the origin of DNA replication. //J. Mol. Biol. 1979. - v.131. - p.801-817.

149. Tau Y.H., Schneider E.L., Tischfild J. Human chromosome 2L dosage: effect on the interferon induced antiviral state. //Science. 1974. - v. 186. -p.61-63.

150. Tau Y.H., Berthold W. A mechanism for the induction and regulation of human fibroblastoid interferon genetic expression. //J.Gen. Virol. 1977. - v.34. - p.401-412.

151. Taylor-Paradimitrion J. //Interferons Their Impact in Biology and Medicine, Oxford Univ. Press. 1985. - p. 25-27.

152. Thiry L. Chemical mutagenesis of Newscastle disease virus. // Virology. 1963. - v.19. - p.225.

153. Vaerman J.P., Lebacg-Verheyden A.M., Scolari L., Heremans J.F. Further studies on single radial immunodiffusion. I. Direct proportionality between area of precipitate and reciprocal of antibody concentration. //Immunochemistry. 1969. - v.6. - 279-285.

154. Ward C.W., Dopheide T.A. Completion of the amino acid sequence of a Hong Kong influenza haemagglutinin heavy chain; Sequence of cyanogen bromide fragment CNI. //Virology. 1980. - v. 103. - p.37-53.

155. Waterson A.P. Two kinds of myxoviruses. //Nature. 1962. - v. 193. -p. 1163-1164.

156. Winter G., Fields S., Brownlee G.G. Nucleotide sequence of the haemagglutinin gene of a human influenza virus Hi subtype. //Nature. -1981. -v. 292. p.72-75.

157. Wright P.F., Chanock R.M. Complementation between temperature-sensitive mutants of respiratory syncytial virus. //Bacteriol. Proc. 1970. - v. 122 - p.193.

158. Wright P.F., Okabe N, McKee K.T., Maassab H.F., Karzon D.T. Cold-adapted recombinant influenza A virus vaccines in seronegative young children.//J.Infect.Dis. 1982. - 146. - p.71-79.

159. Yoneyama M., Suhara W., Fukuhara Y.,Kukuda M., Nischida E., Fujita T. Direct triggering of the type I interferon system by virus infection. //EMBO J. 1998. - v.17, № 4. - p.1087-1095.

160. ЗАЯВЛЕНИЕ о выдаче патента Российской Федерации на изобретение

161. В Российское агентство по патентам и товарным знака! 12185&, Москва, Бережковская на. Федеральный институт промышленной

162. Представляя указанные ниже документы, прошу (просим) выдать патент Российской Федерации на имя

163. Государственное унитарное предприятие "Иммунопрепарат и1. Заявитеяь(и):

164. ВОИС БТ.З (если он установлен)

165. Способ получения вируса-индуктора интерферона

166. Адрес для переписки (полный почтовый адрес, имя или наименование адресата)450024, Республика Башкортостан, г. Уфа, у л.Новороссийская 105,

167. ГУП "Иммунопрепарат", отдел промышленной собственности лефон: 21-31-81Телекс: Факс: 21-31-96

168. Патентный поверенный (полное имя, регистрационный номер, местонахождение)1. Телефон: Телекс:доверенность □ копия доверенности прилагается1. Факс:2000102626

169. Научно-производственное объединение "Иммунопрепарат" ■1. АКТиспользования изобретения

170. Дата составления актаноябрь J999r .

171. Дата начала использования изобретения QL-QlJ98r.

172. Название изобретения, номер охранного документа,дата приоритета

173. QUQ£Q£ JJQ2K3QBHS л^йцоиитарнфгоинтерферона}патент № 2140284,заявка № 98П3448,от 06.07.9t

174. Авторы: Бобкова Е.В.,Муллагулова М.Н.,3агидуллин Н.В. .Галеева Э.Г.

175. Маннанов P.A. Формула изобретения:

176. Название, шифр изделия, в котором использовано изобретение:---Измэыэииа. к. весламиту-лроиз шдлзт недрвэнеского. дэёко.цитдрного. ИНТ£в£врояа. -JL.28I-90 на^интерферон ^лейкоцитарныйчеловеческий сухой.

177. А.И.Ибрагимова С.Ч.Ваданова Н.В.Загидуллин1. РОССИЙСКАЯ1. ФЕДЕРАЦИЯ1. АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК1. ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИимени Д. И. Ивановского

178. Москва, Д-98, ул. Гамалеи, дом 16 Телефон: (095)190-28-42

179. Телеграфный адрес: Москва, Д-98, Институт вирусологии Факс: (095) 190-28-671. На №27 января 1999г.1. УДОСТОВЕРЬ К;: 2

180. Штамм ха*актеризуетсявысокой интерфероштндущтрующой актива ностыо,слабо вирулентшй,шлмуиогенный,обладает способностью агглютинировать эритроциты различныхживотнюс и птиц,стабилен.

181. Штамм обладает способностью продуцировать интер^ероЕ и является индуктором интерферона.

182. Авторами шташа являются научные сотрудники ГУЛ "Ишунопрепа зав.лаб.интерферона Бобкова Е.В.,м.н.с.лаб.Интерферона Муллагуло ^ОТ^ям^тгттратсупря по технологии Загядуллин ИВ. и начальник1. Л.К.Львов Н.Д.Львов