Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Усовершенствование некоторых этапов производства человеческого лейкоцитарного интерферона (экспериментально-технологических аспекты)

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование некоторых этапов производства человеческого лейкоцитарного интерферона (экспериментально-технологических аспекты)"

miiicTFJVTuo плравоохранепия н ттпктюа

пгоыипттости российской фешащп тоиския or ми л трулового красного ünAumm

НАУЧЦО ЦССЛШШЕЛЬСЮМ ИНСТИТУТ ВАКЦИН И СИВОРОТОК

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ ЗТА1ЮВ ПРОИЗВОДСТВА ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ЛЕЙ1Ю ЦНТАРНОГО ННТЕРСЕРОНА (Эпсперниепталыю-юхналогнческне (tcttcttru)

Автореферат диссертант и a соиск.ипк ученой сгегюпн кяпяилята келнцииския паук

Un fípnnax ругсописн

Для сяуасвпаео польоояяиия

Зка. H

002

ЭАГНДУЛМН Наняв Вияенопт

ОЗ. ОО.Об - Bnpycoxosm

Точек - Í994

Работа выполнена в Уфимском научно-производственном соединении "Ишунопрепарат".

Научные руководители:-доктор медицинских наук &В.Бовкат кандидат медициною« наук В. 0. {¡умаяии Официальные оппоненты: доктор биологически)! наук, профессор Р. Г. Соланин кандидат биологических наук Г. А. Васильева

Ведувдч организация, девшда отвыв о научно-практической ценности диссертаций - Государотвенный институт стандартизации И контроля им. & А. Тарасовича.

Еавдта диссертации состоите» _1994 г.

в IЧ часов на заседании специализированного совета К 098.11.01 При То^акэц ордена ?рудового Красного Знамени научно-исследовательском института вакцин и сывороток НПО "Вириои" (6340Б0, Мшк, пр. Ленина, 32).

С диссертацией молрю ознакомиться в библиотеке Томского на-учно-исслвдовательокого института вакцин и сывороток.

Автореферат разослан " "__1904 г.

Учений секрегарь' ' специализированного совета кандидат биологических наук

Л П. Похоъух

- 1 -

Аптуялыюпть щюблоиу.

Препараты лейкоцитарного интерферона широко используются в лечении и профилактика вирусных и онкологических заболеваний. Отсутствие противопоказаний к применении, широкая доступность в аптечной сети и достаточно высокая эффективность обуславливают вовмояность их массового использования населением, что диктует необходимость жестких требований к безвредности препарата. Безвредность интерферона в первую очередь связана со степенью его очистки от конта-минируюших примесей: потенциальных лнмфотропных вирусов и аллантонсиых белков, способны* вызывать аллергические реакции. Наибольшую опасность из аллантонсиых белков представляет овальеумин (ОА), который попадает в препарат на стадии индукции. ОА обладает выраженными сенсиСилизируюся-ми свойствами независимо от пути его введения (Максимова Г. А. ,Донская Н И.1931;М®Уаз 0. et з1.1983! 1.аи 5, еЬ а1. 1988). Пзлучены даннш, что количество ОА в образцах коммерческих серил интерферона варьирует в широких пределах и в некоторых случаях превышает конце"грации, обладающие сенсибилизируюиэй активностью для .'игао к (Николаев В. И. , Варданян Н, В. с соавт. 1951). Это послужило основанием для регламентации в нормативно-технической документации на производство человеческого лейкоцитарного интерферона (ЧЛИ) максимального содержания ОА не более 0,05 мцг/мд (Николаев Е. Я., Варданян ЕВ. 1991; ¡ГС 42-247ВС-91).

Однако, во всех действующи в настоящее время регламентах производства для индукции интерф.'роногенееа использует вирус болезни Ньюкасла (ЕЕ!!) в виде неочищенной вк-руссодергацей аллантоисной жидкости, 8 шторой кроме вируса-индуктора, присутствует аллантсисяш белки, в том числе и овальбумия.

Значительную проблем)' для безопасности интерферона представляют возможные инфекционные контаиинаяты, которые могут содержаться в крови доноров, например такие, как

- к -

ьойОуди'гьли малярии, бруцеллеза, трипаносомоза, сифилиса, вирусы инфекционного мононуклеоза, гепатита и цитомегадо-вирус (ВЗД,Серия техническим докладов 1001,1988; Мукомолов С. А. 1385). Особое место среди эти« инфекций, в связи воа-растащей распространенностью и опасностью, занимают лим-фотропиые вирусы, р том числе вирус, выэываюций синдром .приобретенного иммунодефицита человека (СПИД) (Билл.ШЗ 1900,1601).

Дрцорокая кроаь, используемая б производстве интар-фзронз, иррходит обязательные контроли на СПИД, НВз-Ац, сифилис. Кроме того, на этапах производства ЧЛИ предусмотрены контроля полуфабриката и готового препарата на В№ перечисленные инфекции. Однако еоэмоялыэ случайные ошибки персонала и отсутствие гарантии 100? пыявляемости этих инфекций, иэ-еа недостаточной чувствительности коммерческих тестсИзтем, в^отаьляк/г предусматривать инактивацию йоэмои-ьш инфекционных-коитаминаНтов и вируса-индуктора на дадь-, пеших этапах производства ЧЖ

Кроме того,в действующих в настоящее время регламентах производства для инактивации вируса-индуктора полуфабрикат интерферону быдерживарт При рН 2,2 не менее Ю дней. Это Не вйегда бывает удойно для процесса производства, так как, иа-аа неритмичных поставок донорской крови, , нарушается ритмичность таких операций, как розлив, сушка, фасовка' Г1ауэи, вызванные необходимостью инактивации вируса -индуктора, вносят еще большую дезорганизацию в планирование производственного процесса.

Цоль равоги - разработка производственной технологии получения человеческого Лейкоцитарного интерферона, свободного от контаыинирующих примесей

Для достижения поставленной цели сфориулнрованн и ре «еим смслукщнс задачи:

1. Разработать производственный способ концентрации и

очистки от балластных белков вируса болезни Ньюкасла и изучить его ннтерфероногенныэ свойства.

2. Разработать производственный способ очистки полу-фаОриката интерферона от вируса индуктора и других высокомолекулярных балластных примесей.

3. Разработать одностадийный способ биосинтеза интерферона в условиях промышленного производства.

Научная aomwna и ирпкгичеасля ¡-запоить работ»

Впервые разработана промышленная технология получения очифнного человеческого лейкоцитарного интерферона для интраназального применения, включающая использование очищенного вирусного индуктора, одностадийный способ биосинтеза в условиях промышленного производства И очистку полу|][ибриката интерферона от высокомолекулярных примесей методом ультрафильтрации,

Результаты оформлены в видэ Регламента производства ¡j 281 - 90 на интерферон лейкоцитарный человеческий сухой (1991 г.) и заявления о выдаче патента Российской Фэдера-ции Per. N 93019430 от 13 апреля 1993 г. Разработанная тох-нология внедрена в цехе интерферона НПО "Кммунопрепарат" в 1991 г.

Основные положения, nuirocmato на nnsyrfy:

1. Очистка и концентрация вируса болезни Ньюкасла о использованием ультрафильтрации на мембранах эарубежного и отечественного производства с размером пор от 0,1 до 0,4С мкм обеспечивает высокую степень очистки вируса от оеаль-бумина при сохранении его интерфлроногенных свойств и молит быть применена в промышленных масштабах.

2. Одностадийный биосинтез интерферона в условиях промышленного биореактора с 'использованием очинённого и концентрированного вируса-индуктора обеспечивает получение

препарата с высокой противовирусной активностью.

3. Очистка полуфабриката интерферона от вируса индуктора и других высокомолекулярных примесей с использованием ультрафильтрации на отечественных мембранах с порогом отсечения 300 kD высокотехнологична и применима в промышленных условиях.

Апробация раВоти. Диссертационная работа апробирована на заседания Ученого Совета НПО "Иммунопрепарат" (протокол N3 от 8 июня 1993 года) и на заседании специализированного ученого совета Томского НИИ вакцин и сывороток (протокол Н 1Б от 4 ноября 1993 года).

Публикации. Но теш диссертации опубликовано 2 работы и одно заявление о выдаче патента Российской Федерации.

Структура и обьви диссертации. Диссертация состоит из введения, главы обзора литературы, главы собственных исследований, заключения; выводов. Изложена на 64 страницах машинописного текста, включающего 8 таблиц, 1 рисунок и библиографический указатель литературы, который содержит 100 источников литературы, в том числе 49 иностранных.

, СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Чатериалы и методы исследования.

Ь работе использовали вакцинный штамм "Н" вируса болезни Ньгкасла в качестве вируса интерфероногена. Б качестве индикаторного вируса при определении противовирусной активности интерферона использовали вакцинный итамм "Иади-ана" в:ф\са везикулярного стоматита.

Источником лейкоцитов служила донорская кроеь, соответствующая требованиям .Регламента производства человеческого лейкоцитарного интерферона N 302-32.

Б работе использовали шкрофильтрационяые мембраны У/рр. 6УРР, Н'/РР, с размерен пар 0,1, 0,22 и 0,45 мкм со-

- Б г

атветсвенно и ультрафпльтрационны* мембраны РТНК н FTMK с с порогом отсечения ло молекулярной ыасса 100 и 300 kQ со-ответсгенно ("1Лшипор"США). Кроме того, нспольвовапц оте-чэствэнниа мембраны ПЛ-0,2 (полиамидные о размером пор 0,Е икм)г, Минск; ыембринц капроновые.микропористые (размер пор 0,2' икм) р/к "И1йу калур"| мембраны Владцгар НТЦ Н 2 и MIA-А N1 (размер пор 0,2 мки) Казанское ПО '"Гасиа"; !( 167 (полипропиленовые), Н72 (лавсановые) .УЩ-100 (полисульфон-вмидныэ) с порогом отсччания по молекулярной масс» ЮТ kD| 1ЕУ-130 (полипропилановш) с порогом отсечзния no it И 130 kQi УК1-300 (полисульфонададние) q порогом отсечения no IIЦ 300 kD.

Получение вируса болезни Ньюкасла там "1Г1, вируса везикулярного стоматита, интерферона на лейкоцитарной массе с использованием аллантоисиого вируса болезни Ньисасдз проводили согласно Рагламэнта рронзсокстса человеческого лейкоцитарного интерферона N 302-82.

Контроли интерферона на бактериологическую, вирусологическую стерильность, безвредность и токсичность проводили по CDC 42-2-17БС-91, .

Определение противовирусной активности интерферона проводили на 3-4 суточных перевиваемых клетках почек эмбриона свиньи против 100 ЦПД/бО вируса везикулярного стоматита согласно <350 42-247ВС-91, в качестве стандарта использовали коммерческий интерферон для интраназального применения с противовирусной активностью 1Бф МЕ/мл.

Общий белок определяли по методу Лоури (Lowry et al. , 1951).

Овальбумин определяли с помощью иммунофершнтной тест-системы производства НПО"Йшунопрепарат" г. Уфа, BSC 42-325B3-92 согласно прилагаемой инструкции по применение.

НВз-Ag определяли с помощью коммерческой иммунофер-мэнтной' тест-системы, изготовленной на Предприятии по производству бактерийных препаратов ГНИИЗМ г.- а Швгород, согласно прилагаемой инструкции.'

- в. -

Анелитичаскув ть-хрсштогррфии РШ-злналн, ярндзры-гаяс|> сйкч принятых призципов, шшсанщя: в кн. Гв-кь-Хроцз-?огрэф!1Л. г. Остарили, "Цф" К 1070,

Реакцию гемзггдащщшш етЕрик согласно рзгдеадстеа А. 0. Горбуновой к Ц а Сотовой (1060).

Определена осгетощигр фардаюдйгдо выполняла по ыгтаду, описанному в СО 42-844Ш-Р0, фда<о-»<мичзсквз, м-Фсгда, ф»ччвв|Я» я тлг/вохийвдршр катоды нодар«з ш-длцзшеках тутоедологинзсгах препаратов, с. 41.

йггодш« исаш/дитя и ет овшшллл^

. í. Пояучопи? тацрщюва тщ'от"о ¡".¡¡цг-'Ыра л урхриинх араиищаниаяэ щтанэкэдзтгд

Судаствугадо (.«ходи рчирткп готовых препаратов интер-$5роца от аллактсисных белков сопря.к-ны со злачитолгниии Трудностям!, напришр, в технологии иаготовлэния иньокциои-вых препаратов интерферона Сап1вП с сравт.(1078) пркшнй-ли многократное пареосаидецив интерферона КЭСН к оптовым спиртом при различных аначзщшк рЕ Кузнецов с соаат. (1981) предложили, -с далью удаления алланюискых Салков из препарата, использовать ишуносорбрнт с. кроличьими антителами к белкам аллангошной жидкости. Штоди позволяют достичь значительной концентрации противовирусной активности И частоты интерферона, однако отличаются большой трудоемкостью, длительностью и многоступенчатость». Крома тога, штод с использованием антител к белкам аллаитоисной жидкости не позволяет обрабатывать больше обьемы интерферона, врнду ограниченной сорбцшнной емкости имыуносорбен-та,а также возможно "сползание" иммуноглобулинов кролика с сорбента, что в свою очередь может привести к загрязнению препарата чудеродными белками.

Другим путем очистки интерферона от примесных белков

является испольвование иммуносорбции (Гзрипова с соавт., 1093, Ogburn С. A. el al. ,1973, Torna Б. Т. and Paucker К., 1076). Интерферон специфически адсорбировали из смеси белков на иммуносорбенте с иммобилизованными аитиинтерферо-новыми иммуноглобулинами, с последующей его плоцией при различных условиях, вызывающих диссоциацию комплекса антиген-антитело. Получали высокоактивный и достаточно гомогенный препарат. Однако■ для получения высокоаффинных антител требуется большее количество высокоочидашого интерферона, кроме того, как было показано Дэбрун с соавт. (1985), существует предел селективности иммуноаффинной хроматографии, заключающейся в "неиммунной" сорбции иммуноглобулинов из культуральной среды на иммобилизованном иммуноглобулине, а так*» вовможно "сползание" антител о иммуносорбента в процессе эксплуатации.

В 1982 году был предложен способ очистки интерферона путем его осаждения сульфатом аммония с последующим растворением осадка в 8-3 М мочевине и его гельфильтрацкгЛ на колонке с гелем Акрилекс П-бО (Пивоваров A. U. и др.). Rubinstein and Pestka (1981) предложили для очистки интерферона использовать жидкостную хроматографию с высокой разрешающей способностью. Интерферон осавдали трихлорук-сусной кислотой и проводили хроматографию растворенного осадка на колонке с сефадекоом G-100. Для очистки интерферона также использовали метод адсорбционной хроматографии (Синева .С. А.' с соавт. 1985), заключающийся в адсорбции интерферона на колонках ' с отечественными крешюзе-кныии сорбентами (макропористое стекло ШЗ-2000 и силохром 0-60), с последующей их элщией. Все вышеперечисленные способы позволяли получать высокоочищенны? препараты интерферона с достаточно высоким выходом по противовирусной активности. Недостатком этих методов является то, что достаточно сложно в производственных условиях проводить работы с хроматографическим оборудованием, т. к. для этого требуются колонки больших размеров, работа на которых еогтрякз-

на с опредзданными трудностями,основной из которых является обеспечение стерильности процесса.

Таким образом, традиционный путь очистки интерферона от контаминируюшнх примесей, в той числа и аллантоиснис Сааков, когда эти примеси удаляют уда из готового препарата, представляется достаточно трудоемким, техничэски слон-нш и продолжительны* Бее его вкзств ввятов наводит на шзлг о поиска других путей колкчоотвэнного снихашш при-шоных аллантоисных белков в интерферон?. Шиболав просто? в логичное решение этого вопроса вакяючается в очистке вируса индуктора от влдшлоксных белков перед его использованием для индукции иитерфароногенеэа.

Для очистки вирусов от коитаминируодк бэлков вирокое распространение получили слэдуюшяе методы: ультрацэнтрпфу-гароианке, адсорбционная хроматография, ионнообмэнная хро-штография, хроматография на молекулярных ситах, спиртовое и солевое ссаядэние и рагдэлэние в двухфазных полимерных системах.

В условиях крупномасштабного производства наиболее технологичным является применение селективной ультрафильтраций (Гомолицкий В. Н. с соавт. 1983). Она позволяет:

1. Одновременно с концентрированием вирионсв производить их очистку, так как вириоиы, обладаете большим рзз-шром задерживаются мембраной, а низкомолекулярные белки и соли свободно проходят через нее.

2. Вследствие мягкости всгдеПстзия сохранить структуру вирионов.

3. Сконцентрировать десятки и даже сотни литров ви-руссодержащей жидкости в течение нескольких часов.

Кром? того, стоимость установок для ультрафильтрации значительно ни.ад,чем стоимость оборудования, используемого в альтернативных методах и они занимают мало места. Для увеличения перерабатываемых объемов образца, требуется простая добавка фильтрувщх элементов и увеличение производительности насоса.

- а -

Эффективность селективной ультрафильтрации для концентрации и очистки вирусов была показана еще и началу 80-х годов (Jungemi J.1Q77, Vtolf R,198Q). Однако внедрение ее в промышленных масштабах в нашей стране сдерживалось отсутствием отечественных шиОран и юдулей,

Из начальном этапе рвЛотн в окспериментах нами нсполь-эовны микрофияьтрационкыэ мембраны с paawepou пор рт 0,1 до 0,45 мкы, ("ttummop" США), заправленные в специальные плоскокамерные держатели. Очистку и концентрами проводили в тезтциалинои погоне,

Как видно иа таблнед 1, потери гемаггднткиируюдаП ак- ' тианости бши ьиним1льнымз1 при исподьЕованни всех трэх ("эмбран. При одинаковой кратности концентрации (х40 раз) содержание обдего Солка и овааьбумина было наншнькам' при пргошенки мембраны HVPP с размером пор 0,4В мкм. Содврка-ннэ О А, снижалось по сравнении с исходной ВАШ в i ООО раз.

Слэдукздм этапом накэй работы было исследование ин-терф^роногенной' активности полученного концентрированного и очиданного вируса. Биосинтез интерф»рона проводили регламентированным способом.

В таблица 2 приведены рэвультаты В опытов nq бкосин-теву интерферона с использованием полученного концентрата вируса-индуктора. Как видно иа эти* данных, концентрированна ввруо обладал высокой иитерфероииндуцирувдгй активностью, не уступавшей аллантоисному вирусу, при атом овадъбумин в полученном интерфероне не определялся в пределах чувствительности применяемой тест-систеиы в МФА (i,B нг/мл).

Однако испольвоеание мембран фирмы "Миллипор", в свяви с сокращением поставок оборудования по ишгарту и высокой стоимостью, труднодоступно широкому кругу потребителей. поэтому нами предпринята попытка подбора, отечественных мембран с характеристиками, аналогичными мембранам фирмы "Миллипор".

К таким характеристикам относятся:

озгстЕл в пвптптлцзя сг/ с еспэльзоваягкгг кжзтда <ж/ -сп'лгг.таг'

Табляца 1

Тип ! Размер I Исходная вируссодержа- ! Очинённый концентрат I Содержание

мембраны ! I тая аллактоисная жидкость! вируса ! белка по Лзури

• пор !-----------------------------------------------------------------! в мг/мл

I !0бьемТ ГАЕ !Содеркавке ГОбьемТ ГАЕ »Содержание »

1 в мкм 1(л) 1 е мл !свальбукина ! (л) 1 в ш ?овальбумика »—-----------

! ? 1 ! мг/ыл ! ? ! яг/ыя ! ВАЖ ? Кокц.

о

УУРР 0.1 8,0 256 0,4+0,13 0,10 10752 .400+130 1.8+0,14 3,9+0,34 '

СЗУРР 0.22 8,0 255 0,4+0,13 0,19 10752 240+50 1,0+0.14 3.7+0, 32

НУРР 0,45 8.0 256 0,4+0,13 0,19 10752 160+Ео 1,8+0,14 3,3+0,23

Примечание: приведены средние результаты 4 опытов по каядску типу мекбраны.

Ü (3

l4

И -í 1 ö

ït M

sin

s й a

y fa

ц

u s ßs

!.' H Ç fl

Ö P P !>

f3 Î?

L

§ в

gl

(4

Л

S

q

§ S

S ^

Q

я "

t-< g

■g

g

a

о о 3 ïj ±1 Si

4 :a

cl и"

Й О

fcl a

i

st

s

о щ

« a

a о

« о

II

& I

- 1Б -

- низкая сорбционная емкость

- относительная механическая прочность и возможность многократного использования без нарушения целостности

- возможность испольвования химических агентов для стерилизации и регенерации

- доступность.

В работе использованы мембраны ПА-О.Е, капроновые • микропористые, 1>Щ N2, МФА-А N1 о размером пор 0,2 мкм, вагравленнда в плоскокамерные разделительные аппараты, изготовленные в' НПО "Биотехника" при НПО "Иммунопрепарат" г. Уфы. Шдачу жидкости на раадэлительный аппарат осудаств-лялп перистальтическим насосом "Мастерфлекс" при рабочем давлении падкости внутри камеры 0,3 - 0,4 атм. Шощадь фильтруодй поверхности составляла 0,6 кв. м.

Очистку и концентрацию вируса болезни Ньюкасла выполняли в режиме микро-диафильтрации по следующей схеме: исходная ВАК ——> осветляющая фильтрация (П-40М)----> концентрация, диафильтрация (ПА-0,2) ----> концентрат ВВП

Как видно из данных таблицы 3, концентрация и очистка вируса на отечественных мембранах проходила с минимальной потерей гемагглютинирующей активности .содержание овальбу-ыина- снижалось . не менее, чем в 1 ООО раз. Однако только мембрана ПА-0,2 сохраняла исходные свойства после 10 операций концентрирования вируса. Остальные мембраны либо разрушались в процессе эксплуатации и начинали, пропускать вирус, либо необратимо вабивались и слабо пропускали ал-лантоисные белки. По-видимому это связано с тем, что из всех использованных нами ыикрофильтрационных мембран, только мембрана ПА-0,2 имела подложку. Подложка удерживат мембрану от сильной деформации во время работы и таким образом предохраняет ее от разрывов и необратимого забивания пор. Таким образом, предложенный сносов получения очищенного и концентрированного вируса болезни Ньюкасла, с применением отечественных микрофильтрационных мембран ПА-0,2

высокотехнологичен, обеспечивает достаточную очистку индуктора от Оецшотщл адлащоисних Оежов и.применим в промышленных масштабах.

Способ внедрен ¡5 произ?одстсо ЧС1 из. предприятии НПО "Иымунопрепарвт".

3. Раярс&р!*;;з трдиЯрргэ сцаШщ Ркссиптит члп

В действуй;?».} с »183ТРЗЙЭ9 р^гадю&мте производс-

тва чеховечзоедго девкодтерпого иптерйорона предусмотрена . удзлзт» аллс-цтопоинх Сода» н »о адвор&фовова»гооя на ■хзШкщигах рируса-цидукторд (гасла ого 1-2 часовой инкуби-даи о лейицитгыи ц;чтри1упфовалкбм. Осадок лейкоцитов рзсдопицируго В СЕег,;:-Д дорши среду 109 с необходимей добоскаш и снова И|И0?6|5|)У»/? При 37 С 16-ЕО ЧЫ201).

Однако процесс центрифугирования в условиях производства интерферона сопрягай с радом недостатков:

- трудоиц;шоть этапа,включьсарго разлив ив биореакги-ра взьепк лгйкоиитов поово инщкедяи но флаконы, отсос «а-лосодочиоа жидкости па каждого (¿.канона посла центрифугирования, добавление овеггай среди к лввкоцитем и оОратнуи подачу лейкоцитов из фяадаг.ов в биорзьктор, Вое ати операции ?рэ0у»т строгого соблгдаиш правил асептики и антисептики;

-'при достаточно■бодькои обьемэ производства значителен расход стерильного материала и флаконов, что приводит И перегрузке стерилизационного оборудования;

- необходимо значительное гоэличество центрифуг для одновременного центрифугирования большого обьема лейкоци-тарно-вирусной суспензии из биореактора;

- траьмИроваике лейкоцитов в процессе центрифугирования, что может привести к снижению продукции интерферона;

- маиияугяиии,' связанные с центрифугированием, ьиачи-телью уБэлачавадр продахшгеельассть рабочей смени

Шдавко предложен способ получьыи человеческого гзСкоцатьриоп» пнгс-р.*ь.лрона, в котором д:ш индукции иеиоль-

чукгг алд-штонсный вирус болезни Ньюкасла,концентрированный н очш'.'.ечший методом ударафмьтрадаи-диафнлътравди а постоянном о5к;Н9 на и&мбран^х с порогом отсекания по юлеку-ляриой илссз 100 цщ 300 по (Авторское свидетельство ССОР Н170331Б, кл. АБ}Ко?Л'.5. 1В0Й г.).

Способ осуществляется следугелн образом: 1>!двчепки9 ю донорской кропи лейкоцит вэюсгсааг в среда IflOQ. вирус-ицдукгор вводят в среду е леЯ-

Konw»ii И .ит/Зип'Л'П' при 37 0 в теченш 1-3 «ncoa. Озтеи ¿»¿kohuth огдзллг? цэнтря^угкровчвием пра 1Г00 ¡j з тишрп 15 *шут. Озвдя: .г&йкоцигоя рзоувяендярупт и сез;:?!} поршп) пататвлмюя а^гн. Чэроз ÍU-ПО чзсод дав<у£пн<да при С i О líW'ítoíi прочит «ягдъгяк? от лэйкоцатов t'íiiTpBívrKpouai:!»«.

Одного.!«« t«J г:1Д!!!<,Прда!ЗИвНИ9 ТШ'ЛГЭ FüCOl'OO-

чкг?к«ого теруол-пидудаор?» пэ псзеопс? (ггбэздть п-эит^'л";-гврдот аос.*.з стрш! иидутгч к:; г,г,;;

ко'д!'13цтр?.ц!*я »«агьбуькша а протшюп случка Оуягт np-jsu-гл допустипуо (íafl. б).

-л б оьоон pat .юряконин неокоо'ктампМ коицеятрп-р05«пшЗ вирус о Г'Ч'знь незначительном сод^рглтгам ОД, m предпринял;! потоку избегать этап цэптр^угиропан.чл после ВИрусИО.1 КПДУКЦ'Ш С ЦеЛМ) ПОДОЭДт nir:j'KS4£Utl!ia fUROO-таткоя даигр.'^угкрования, что в конечно:'.-счзтэ вздзт к уп-ртг.с-шяо способа получения челог:эчес!сого л з f. i :оц; i т n р но го интерферона

Гиосннгеэ осуществляли следую:"»'-« образом: Суспендировали лэйкоцити в 1G3 среде, содержав;?*! необходим» ¡'.о-таненти, доЗавляли очис^нниЛ концентрат вируса-индуктора к лейкоцитам на расчета от 1 до б тис. ГАЕ на

о

1 млрд. лейкоцитов, шшубироЕалн взвесь При 37 с а течение

10 - ео часок, постоянно перемешивая. Затеи лзйкошгги удаляли цеитрк-|уггровпшк.-?4, а надосадочную жидкость, содер-лч-ry.-j ¡üirüpíjpoü, подкисллли 105 солдксй гаюлотоЛ до рН Z,Z

• 2,-t. Гидер.чявшсн нодкнул-гкиуд ,;cf5jií.s5i.'.«fcT интерферона »

7Ü4';HD; 10 >Ч10Л Г\.ьм ИН'-.КТШ1ЧЦИ'.! li'.lpyo.l сн.ту-.-.горч.

■ - te -

Как следует на полученных данных (таблица 4), лучшие реаультати были получены при соотношении вирур/лейкоцит 2-4 ГАЕ на 1000 ООО лейкоцитов В } МЛ. Как увеличение, так и снижение доем вируса ведет к вначительному снижению противовирусной активности подученного интерферона. По-видимому, в высоких концентрациях рирус оказывает угнетающее действие на лейкоциты, а ниаких концентраций не достаточно для полноценной индукции «¡грерфэроногенеаа. На выход интерферона, погаша соотношения лфус/дзйкоцит, вначительное влияние окааываэу конечная концентрация лейкоцитов во время биосинтеэа. Так при концентрации £ ООО ООО лейк. в т. противовирусная активность интерф°Р°иа рыла в 2 раза ниже, чем при концентрации 4 ООО ООО дейк. о мл., в тоже время дальнейшее увеличение концентрации лейкоцитов до б и более млн. лейкоцитов в цл, не ведет к вемэтиому росту противовирусной активности препарата. Таким образом, в целях ако-доиии сырья и биосинтеза интерферона с высокой противови-. русной активностью следует иопольвовать концентрацию лейкоцитов 4 ООО ООО лейк. /мл.

В дальнейших исследованиях мм иопользоБали в работе соотношение вирус/лейкоцит £-4 ГАЕ/1 ООО ООО лейк, при индукции и коночную концентрацию при биосинтезе 4 ООО ООО лейк. /мл.

Противовирусная активность полученного таким способом интерферона составляла 6-10 ООО № в мл, содержание оцеаьбумина колебалось в пределах 2-4 нг/мл (таблица Б).

Наряду с изучением влияния доаы вируса-индуктора и концентрации лейкоцитов на выход интерферона, мы провели исследования по аамене человеческой плазмы, используемой при биосинтезе интерферона, на донорский альбумин. Эти работы были проведены по следующим причинам. При биосинтезе интерферона в питательную среду добавляют человеческую плазму или аглобулиновую фракцию плаамц бев какой-либо обработки. Человеческая плазма помимо веществ, необходимых для культивирования лейкоцитов,содержит другие белки плаз-

ЯJStmiUB СООТНОШЕНИЯ ВНРУО/ЖШЦНТ ПРИ индукции Н КОНЕЧНО!} 1Ю1ЩЕТРЩ1И ЖШОЦНТОВ ПРИ БИОСИНТЕЗЕ ИЛ ПРОТПВОВНРУСНУЙ АКТИВНОСТЬ подученного интерферона

- ТАБЛИЦА 4

Соотношение ! Концентрация ) Противовирусная

вирус/лейкоцит 1 лейкоцитов в 1 активность интер-

ГАЕ/лейк. 1 1 мл 1 ферсжа в МЕ/мл

при индукции ! при биосинтезе 1 1 t

2 ООО ООО 2280+680

1/1 ООО ООО 4 ООО ООО 2280+680

б ООО ООО 2280+680

2 ООО ОСО ' 4160+1410

2/1 ООО ООО ■ 4 ООО ООО 8000+2640

б ООО ООО 8990+2640

г ооо ооо 4160+1410

3/1 ООО ООО 4 ООО ООО 8990+2640, .

6 ООО ООО 8990+2640

2 ООО ООО 4160+1410

4/1 ООО ООО 4 ООО ООО ' 8990+2640

6 ООО ООО 8990+2640

2 ООО ООО 4160+1410

Б/1 ООО ООО 4 ООО ООО Б160+1680

6 ООО ОСО ' 5160+1680

2 ООО ООО 2280+680

6/1 ООО ООО 4 ООО ОСО 4160+1410

б ООО ООО 4160+1410

гшг»чешяя с шгас&ктяяги ■ •

КСЕЯЕЫХ СПОООБСП Щ&ХфЯЗ

ТЕ&ющ З 5

Способ Сиоси.чтега ! КспольэуемыД 1 Я&атавовирусизя естизпоеть ! Содзряаняэ овашбумяяз ■ I вирус ' ! гахтзрфгронг в КЗ/га ! в ЕнтврфгроЕэ в мхг/ш

» ' ! !

двуетадиЯный* Дгустадийнай

Одностадийный**

Одностадийный***

БАЯ

Кошюнтрат Вэтонтра? Котзэгораг

4160+1410 . 4160+1410

езго+жо

. 8330+2640

• 4+1.3 0,003+0,0005

О

0,5+0,15

аз

Пркшчаюк: пугпдадепа срсдтггг данта» 4 опытов по каздэыр способу бпсспятеза. * - св^прястнЗ ютод с цгнтряфугкроваЕйгм гасло п^лтсцга.

- ргзргСотгЕЯнЯ (.ятод с одновременной Еягукцязй и вгяеяатезом.

*л* - в качэотеэ индуктора Еггер4еронагеггзга Еспаагогагя ВоЗ очзщж

и ютшгигряразетай га оброках с порогом отсечаспз 330 Щ.

ми крови, а так ш может содержать болезнетворные агенты. Таким образам, в процесса очистки и концентрации интерферона неизбежно будут концентрироваться и примеси, содержащиеся в культуральной среде. Вамена плазмы на альбумин позволит повысить беввреднооть и безопасность интерферона, так как а процессе получения альбумин подвергается спиртовому н тепловому воздействия, что гарантирует отсутствие в препарата аозбудителеЯ болезней при высокой степени его гомогенности. Кроме того, аамена пдавми на альбумин значительно облегчит вадачу по очистке и концентрации интерферона о помощью ультрвфздтрации, потому что отсутствия в культуральноЯ среде других белков плазмы крови способствует прохождении интерферона через улътрафильтрационную мембрану. Альбумин, проходящий череа мембрану вместе о интерфероном, не ухудшает качество интерферона, а дала мокзт служить стабилизатором при лиофильном высушивании препарата.

Иоходя из вышесказанного,мы исследовали влияние сиро-кого диапоэона концентраций донорского альбумина на различных стадиях биосинтеза на продукцию интерферона лейко- . цитами. Как видно из таб. б, использование донорского альбумина вместо человеческой плазмы в конечной концентрации 0,1-0,8Х не вызывало снижение продукции интерферона лейкоцитами и, в то т время, как будет видно далее, значительно облегчало очистку интерферона от высокомолекулярных примесей с помощью ультрафильтрации.

Таким образом, предлагаемый способ биосинтеза человеческого лейкоцитарного интерферона, в сравнении с существующими в настоящее время способами производства человеческого лейкоцитарного интерферона, является предпочтительнее, так как достигает тех же и даже лучших результатов при значительном упрощении процесса, сокращении материальных и трудовых затрат и экономии рабочего времени.

Разработанный способ биосинтеза интерферона внедрен на предприятии НПО "Иммунонрепарат".

- Я) -

ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ шщ&гггщгл ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО #Р1ШСК0Ю АЛЬБУиННА НА ПРОДУКЦИИ ШПИШЮНА ШН0Щ7АШ

ТАШИА 6

Концентрация донорского альбумина в % Противовирусная

активность

На стадии индукция №1 стадии биосинтеза интерферона

0,05 1£00+400

0.1 2280+680

0,05 0,2 2260+680

0,3 2280+680

0.4 2280+680

о.ос £гш+еао

0.1 6990+Е640

0,1 0.2 8980+2640

0.3 8990+2640

0,4 4160+1410

0,05 2280+680

0.1 6390+2640

0,2 0,2 8990+2640

0,3 8990+2640

0.4 '4160+1410

0,05 2280+680

0,1 В990+2640

0,3 0.2 8990+2640

0.3 8930+2640

.0.4 4160+1410

0,05 2280+680

0,1 4160+1410

0.4 0.2 4160+1410

0.3 4160+1410

0.4 2280+680

В контроле человеческая плазма 32 8990+2640

- El -

3. РпаргМаткл иотада очистки интерферона от шрусл-ин-лукторя н gpystur maomixi популярных npwtfsceй

Нативнне препараты HHTepifepoiia могут подергать, кроме вируса-индуктора,ряд других вирусных контаминант, наиболее опасными из которых является вирусы инфекционного гепатита и лкмфотропные ретро-вирусы семейства HTLY, вызывающе им-муносупресси» и злокачественные заболевания (Urba V.J. et fl., 19ВБ). Их источником мотет слукить кровь доноров, используемая в качестве сырья при получении интерферона.

Известен ряд физико-химических приедав, позволяют?« инактивировать возбудителей ^епатита:

- прогревание при G0-80 С и течение С-20 часов (Tabor Е. et al. ,1984) или при 98 С в течение 2 мин (Kobayashl Hiroyoshl et al., 1Я84),

- последовательная обработка пепсином,' 8 М мочевиной и формалином в разведении 1:4000 (Kew М.,1984),

- обработка 1Z водным раствором глиттарового альдегида при 24 С в течение G часов или 80S спиртом при 11°С в течение 2 часов (Habayashi Hiroyosht et al., 1904),

- формалином (1:500) при 37 0 в течение 4 дней (Scheiermann N. et al.,1084),

- неионным детергентом и эфиром (Mam J. ,1086),

- пепсином и твином-80 (Вязов С. с соавт. ,1965).

Предложен такте ряд хроизтографических методов, позволяющих Фракционировать Hbs-ar на твердофазных полиэлектролитах этиленмалеинового ангидрида (Jalpin S. А., et al.,1983), гидрофобном геле октаногидрааид - Сефароза-4В (Einarsson М. et al., 19Я4), аМиннсм сорбенте на основе Cl<j иэ плазмы и сефароэм (Jazitt У. et al. ,1086).

Значительный интерес вызывает применение для этих целей гамма-облучения. За рубежом этот метод получил ЕИрское распространение в стерилизации медицинских препаратов и

- 82 -

материалов (Осипов В. Е о соавт., 1685).

Однако при получении.препаратов лейкоцитарного интерферона перечисленные.способы инактивации и удаления конга-минирующих вирусов не могут Сыть применены либо в силу овоей нетехнологичности, либо возможности инактивации самого интерферона (Ершов 5>. И. ,1972).

Удаление инфекционных частиц из биологических препаратов с помощью гельфилътрации, аффинной хроматографии и Центрифугирования требует довольно сложного и дорогостоящего оборудования, перерабатываемые обьемы очень незначительны, а процедура -ванимает длительный промежуток времени и поэтому не используется в производстве ЧЛИ для интрана-еального применения.

Учитызая все вышеизлоленное и имея определенный опыт использования -удьтрафильтрации для очистки и концентрации вируса-индуктора, мы для удаления из препарата интерферона высокомолекулярных примесей применили ультрафилъ-трацкю на плоскокамерных разделительных аппаратах.

В работе испольэовали опытные образцы полипропиленовых. лавсановых, полиеульфонамидньн и фенилоновых мембран с различным диаметром пор производства Б1ШСС (Владимир), полисульфоновые мембраны производства НТО "Пластмассы", полшгульфонамидоые мембраны производства КПО "Таема", а также мембраны РТНК, РГЬК ("Миллипор" США). *

Мембраны, еаправляли в плоскокамерные разделительные аппараты, подачу материала осуществляли перистальтическим насосом "Мастерфлекс". Очистку проводили в тангенциальном потоке.

Кетод осуществляли следующим образом.

Подкисленный и неггодкисленный интерферон подавали на плоскокамерные разделительные аппараты, заправленные ^аз-лйчнымй мембранам;!, и рециркудировали его до полной фильтрации. Скорость рециркуляции регулировали перистальтическим насосом таким образом,.чтобы давление внутри аппарата составляло 0.3 - 0,4 атм. Полученный фильтрат, содержащий

- еэ -

интерферон, подвергали стерилизующей фильтрации через мембраны с д1Ш1-!зтроц пор 0,22 (я<м( "Цшшгаор" СШ.\). Стерильный интерферон исследовал'.! на противовирусную активность, вирусологическую стерильность, н проводили аналитическую гегьхронптогряфмз на Сзфзрсае-бЕ

Как видно из дат»,« таблицы 7, на выход интерферона после очисти окзэнйгш! влияние как условия, при которых лропод;ш!сь очистка, так и рявтр пор мембран л материал, из которого они Выли изготовлена

!й1Я'?ньЕН!а потери китерфзроиц после очистки наблкда-лгсь на сэиЗршюх РТ'ЛС и УПН - 300 (порог отсечения 300 кО) к только в то» случпэ, эсли перед йчистдоЗ его рН сос-сгавлялз 2,Я - а,4. Глнц-энтраццч общего Солка скикя'зсь более, чем а 2 рада. Препарат интерферона, пропусчшшй через эти мембраны, был вирусологически стерилэн, тогда как в исходном штериалэ вирус определялся (таблица б). !'з лремзтограм.'ги интерферона видно, что сц5ошшз|;ухяриая фракция, содеркавеаяся в исходном интерфэронэ, после его очистки удалялась (рис, 1).

Чтобы убедится в том, что мембраны РТМК и .УПН - 300 задерживают внрусшя частицы, были проведены следующие каделышэ опиты. На разделительных аппаратах, заправленных этими шкбранвми, провели "уль трафили рацио ВАЗ!!, содержащей ВВН с инфекционным титром 10 ЦЦЦ, а такта раствора плазмы,содерлавэй ШЗз-Аз. Получеиные фильтраты проверили на наличие инфекционных частиц в теста вирусологической стерильности.для ЕБН и для НЬз-ад в икмунофермен-тном анализе. Шлучзинш результаты свидетельствовали о том, что после ультрафильтрации ВБН и НВз-Аег в фильтратах отсутствовал]! (таблица 8).

Кроме этого, применение ультрафильтрации резко увеличивало (в 3 раза) количество интерферона,пропускаемого через стерилизующие мембраны. Если «о ультрафильтрации Через один стерилизуюиуй фильтр диаметром 233 мм можно было пропустить до 50 литров интерферона, то после ультрафильтра-

тхол ВгТГЕ№ЕГ0!1А'Пт ЕГО СЧИСТКИ ВЕТО дои УХЬТГ/.ТЗХЬТР.'ХГЯ ва.гширшых тиякх СТЕРЛИ

ТзИЛШХВ 7

Тип I Материал I Порог ! рК I Титры иктерферона КБ/мл 1 Евфекаионвый

мембраны ! мембраны I отсечения ! интерферона !----------------1 титр ЕБН

! ! ! во Бремя 1 Исходный 1 Шсхе очжггкк1---;---------

1 ! кБ ! очястки 1 ! ! Едсоя- 1 Пасге

! 1 ! ! ! I тй ! очистки

N158 ПОЛКЩМ.ТШЮН 100 7, г егзо+гало ГЕЯЭ+Е23 0

2,2 8930+2&Ш 41Б0+1-51О 0

N72 лавсан 100 7,2 В990+2МЭ 22804650 2И0. 0

8390+2540 <160+1510 гао^ 0

УПМ-100 полиоудьфон- 100 7,8 вэдо+св« •МЕО+ЫЮ гзао~ 0

амид 2.2 8830+2540 5160+1630 0

ПЗУ-130 полкпропилгн 130 7.2 8930+2640 2230+ЕВО 0

£.2 еззо+Е&га 4150+1410 гно"^ 0

УПК-300 падюулъфая- ЯГО 7,2. 8930+2540 Б1СО+1ЕВО аао 0

аыщ: 2,2 8390+2640 8590+2540 тао 0

РТНК полиэфир- 100 7,2 еВ50+2&40 41Е0+1410 2310", 0

суль4он 2.2 8990+2540 5160+1030 0

!=ТШ полисульфон" 300 7,2 8330+2540 6160+1630 гко" 0

2.2 8930+2040 В350+Е540 0

Примечание: С Кй.ЖДЫМ типом иембран бнло проведено ке кгкее 4 опытов.

Bio Л. Хроматография интерферона на Софарозэ-бВ А - исходный полуфабрикат интерферона Б - полуфабрикат интерферона поело ультрафильтрами на мембране с порогом отсечения по молок, массе 30000D Д I - частииы о мол.массой Солсэ 1000000 Д, элюируют-

ся з свободном объеко колонки И- чатиш с мол.мяссой менее ITOOCO Л, улкируются rJO B'iyrpCHHOM'OÖbOMO колонки.

УЛЬТРАШЛЬТРАЦНЯ РШБОЮВ СОЯВМАЯМ ВВП и ИВз-пг НА ШШРАНАК РТМК ¡1 УПН-900.

ТаОшцп в

Тип ! Исследуемый ! ВЕН-инфекционная ак- НВз-аг-ИФА (единиц

мембраны ! материал ! гивность (ЦПД) оптической плотности)

1 I-------------------.....-------------------------

! I Исходный I Очищенный

-в

РТШ ВБН 10 ДПД не определяется

ИВз-аг 1,00 0. П. 0,090 0. П.

С1

УПМ-300 ВБН 10 ЦПД не определяется

НВз-аг 1,00 О.П. 0,085 О. II

Примечание: при учете результатов реакции в ИФА, опгическа» плотность (ОП) отрицательного контроля составл; ла 0,100, следовательно иэломтелышм считает« образец ОП которого более 0,200

- в? -

цин - более 1Б0 литров.

Таким образом, ультрафидьтрацня интерферона сводит к минимуму риск инфицирования людей вирусом гепатита В и другими инфекциями, присутствие который вовможно 8 крови доноров. При помощи удьтрафильтрации удаляется вируо-ки-дуктор, что способотвует повышению качества интерферона. Очистка интерферона позволяет повысить производительность мембран в процессе стерилиауюдей фильтрации.

Способ внедрен в производство ЧЛИ на предприятии НПО "Иммунопрепарат".

ВЫВОДЫ

1. Разработан промышленный способ очистки и концентрирования вируса болеани Ныасасла - индуктора L- интерферона, с использованием селективной микрофильтрации на импортных и отечественны* мембранах, а размером пор от 0,1 до 0,46 мкм, позволяющий снизить концентрацию овальбумина в вирусной суспензии более, чем в 1 ООО раз при незначительной потери вирусного материала с сохранением интерфероно-генних свойств.

£. разработан одностадийный способ биосинтеза ЧЛИ без удаления вируса-индуктора после стадии индукции, включшаднй использование оптимального количества интерфе-ронсинтеэирующих клеток (4 ООО ООО лейк. /мл.), оптимальной »¡йдуцируюЕрй доеы очищенного вируса (2-4 ГАЕ/1 ООО ООО лейк.), испольеование бесплаэменной культуральной среды.

3. Разработан промышленный способ очистки полуфабриката интерферона от вируса-индуктора и других высокомолекулярных примесей с использованием отечественных и импортны* ультрафяльтрационных мембран с порогом отсечения по И И. 300 kD, Применение которого повысило безопасность препарата, увеличило в три раза производительность стерилизующих фильтров "Mi Ш рог".

4. Внедрение в производство человеческого лейкоцитарного интерферона для интраназального применения разработанных способов привело к сокращению расхода куриных эмбрионов в два раза ва счет снижения расхода вируса на ин-дукци*>| позволило снизить расход донорской крови с 2,4 до 1,8 л на 1 л интерферона вследствие увеличения противовирусной активности -полуфабриката, способствовало экономии стерилизующих фильтров. Кроме того, полностью устранены потери полуфабриката интерферона из-за присутствия в нем HBs-ar. и овальбушиа.