Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Усовершествование некоторых этапов производства человеческого лейкоцитарного интерферона (экспериментально-технологические аспекты)

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Усовершествование некоторых этапов производства человеческого лейкоцитарного интерферона (экспериментально-технологические аспекты)"

министерство здравоохранения и икдтшнской

проиывтшостн российской феяерщии

тонсний ордена трудового красного оначени научно-исследовательский институт вакцин и сывороток

усовервенствование некоторых этапов производства человеческого лейкоцитарного интерферона (Эксперниентально-техналоеичесяне аспекты)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кппдндата исднцннспиж наук

На Пропах рукописи

Для слукебноео полыюпппия

Эка. Й

003

ВАГ ИДУ Ми» Наилъ Пнлепопич

03.00.06 - Вирусология

Точек - 1934

Работа выполнена в Уфимском научно-производственном объединении "Иммунопрепарат".

Научные руководители: ■ доктор медицинских наук Ь'. В. Еовнаш кандидат медицинских наук П. О. Кулигяи Официальны? оппоненты: доктор биологических наук, профессор Р. Г. Содтшк кандидат биологических наук Т. А. Васильева

■ Веяудач организация, даюшдя отвыв о научно-практической ценности диссертации - Государственный институт стандартизации и контроля Им. Л. А. Тарасевича.

Завита диссертации состоится " 3/ " \MJlJi _1994 г_

в /V часов на еаседшши специализированного совета К 098.11.01 При Тощаком ордена трудового Красного Внамени научно-иссле-доватедьаком институте вакцин и сывороток НПО "Вирион" (6340Б0, Тгёнск, пр. Ленина, 32).

О диссертацией иожаа ознакомиться в библиотеке Томского научно-исследовательского института вакцин и сывороток.

Автореферат разослан " "__1994 г.

Ученый секретарь' ' специализированного совета кандидат биологических наук

Л Н. Поло пун

. -чМЙСКАЯ ^ДАРСТВЕННА» У П 5 Л И О Тс К А

б'О ¿и -1-

Актуляаааатв п[юбл(ши.

Препараты лейкоцитарного интерферона широко используется в лечении и профилактике вирусных и онкологических заболеваний. Отсутствие противопоказаний к применение, широкая доступность а аптечной сети ¡1 достаточно высокая эффективность обуславливают возмояяоеть их массового использования населением, что диктует необходимость жестких требований к безвредности препарата. Безвредность интерферона в первую очередь связана со степенью его очистки от конта-минирущих примесей: потенциальных лимфотропных вирусов и аллантоисных белков, способных вызывать аллергические реакции. Наибольшую опасность из аллантоисных белков представляет овальбумин (ОА), который попадает в препарат на стадии индукции. ОД обладает выраженными сенсибшгаэирущи-ми свойствами независимо от пути его введения (Максимова Г. А. .Лонская Н. И. 1981;Е<ЗеУаз В. еЬ а1.1988;Ьаи 5. еЬ а1. 1988). Получены данные, что количество ОА в образах коммерческих серий интерферона варьирует в иярских пределах и в некоторых случаях превышает конце"грации, обладающие сенсибилизирумрй активностью для .-вшюк (Николаев К. К. .Варданян Н. В. с соавт. 1991). &го послужило основанием для регламентации в нормативно-технической документации на проиьяодство человеческого лейкоцитарного интерферона (ЧЛИ) максимального содержания ОА не более 0,05 мцг/ил (Николаев Е. И. ,Еарданян Н.В. 1991} ОС 42-247БС-91).

Однако, во всех действующих в настоящее время регламентах производства для индукции интерФ^роногенега используют вирус болезни Ньюкасла (ЕЕН) в виде неочищенной ви-руссодержашей аллантоисной жидкости, й которой кроме еи-руса-индуктора, присутствуют аллантоисни-э белки, в том числе и овальбумин.

Значителгную проблем-/ для безопасности интерферона представляют возможные инфекционные контамннанты, которые могут содержаться в крови доноров, например такие, как

- р. -

возбудители малярии, Оруцеллеаа, трипаносомоза, сифилиса, вирусы инерционного мононукльоза. гепатита и цитомегадо-вирус (ВОЗ,Серия технических докладов 1001,1908; Мукомолов С. А. 1935). ОсоОое Место среди втих инфекций, в связи возрастающей распространенностью и опасностью, занимают лим-фотропные вирусы, р том числе вирус, вызывающий синдром приобретенного иммунодефицита человека (СПИД) (Бшл. ВОВ 1000,1001).

Донорская кровь, используемая ь производстве интерферону, проходит обязательные контроли на СПИД, НВз-Ла, сифилис. Кроме того, на этапа* производства ЧЛИ предусмотрены контроли полуФсЛрйката и готового препарата на выше Перечисленные инфекции- Однако вовможныв случайные ошибки персонала И отсутствие гарантии 100? выявляемости этих нн-фгкций, из-ва недостаточной чувотвительнооти коммерческих тестсистем, ваотавлягуг предусматривать инактивацию возможных инфекиионных-коптаминацтов и вируса-индуктора на даль-неших этдпах производства ЧЛИ.

Кроме того,в действующих в настоящее время регламентах производства длл инактивации вируса-индуктора полуфабрикат интерферона Выдерживают при рН 8,2 не менее Ю дней. Это Не вбегда бывает удоОно для процесса производства, так как, иа-аа неритмичных поставок донорской крови, нарушается ритмичности таких операций, как ровлив, сушка, фасовка.' Паузы, вызванные необходимостью инактивации вируса -индуктора, вносят ешр большую дезорганизацию в планирование производственного процесса.

Цель рискни - разработка производственной технологии получения человеческого Лейкоцитарного интерферона, свободного от контаыикирующих примесей

Для достиконня «оставленной цели сфорнулированы и ре аснй следующие видичн:

1. Разработать производственный способ концентрации и

очистки от балластных белков вируса болезни Ньюкасла и изучить его интерфероногенныэ свойства.

2. Разработать производственный способ очистки полуфабриката интерферона от вируса индуктора и других высокомолекулярных балластных примесей.

3. Разработать одностадийный способ Сиосинтеза интерфэрона в условиях промышленного производства.

Научная новизна и tipaimmeciiui цзтюоть ргЛоти

Впервые разработана промышленная технология получения очищенного человеческого лейкоцитарного интерферона для интраназального применения, включаюязл использование очищенного вирусного индуктора, одностадийный способ Сиосинтеза в условиях промышленного производства и очистку полуфабриката интерферона от высокомолекулярных примесей методом ультрафильтрации.

Результаты оформлены в виде Регламента производства У 281 - 90 на интерферон лейкоцитарный человеческий сухоП (1991 г.) и заявления о выдаче патента Российской Федерации Per. N 9301943*5 от 13 апреля 19ЭЗ г. Разработанная технология внедрена в цехе интерферона НПО "Иммунопрепарат" в 1991 г.

Основные поломения, buiiocumub па пофигу:

1. Очистка и концентрация вируса болезни Ньюкасла с использованием ультрафильтрации на мембранах зарубежного и отечественного производства с размером пор от 0,1 до 0,4D мкм обеспечивает высокую степень очистки вируса от оваль-бумина при сохранении его интерф^роногенных свойств и полет быть применена в промышленных масштабах.

2. Одностадийный биосинтез интерферона в условиях промышленного биореактора с использованием очищенного и концентрированного вируса-индуктора обеспечивает получение

• - 4 -

препарата с высокой противовирусной активностью.

3. Очистка полуфабриката интерферона от вируса индуктора и других высокомолекулярных примесей с использованием ультрафильтрации на отечественных мембранах с порогом отсечения 300 кО высокотехнологична и применима в прочищенных условиях.'

Апробация раОоты. Диссертационная работа апробирована на заседании Ученого Совета НПО "Иммуиолрепарат" (протокол N9 от 8 июни 1993 года) и на заседании специализированного ученого совета Томского НИИ вакцин и сывороток (протокол N 16 от 4 ноября 1ЭЗЗ года).

Публикации. Ш теме диссертации опубликовано 2 работы и одно заявление о выдаче патента Российской Федерации.

Структура и обьоч диссертации. Диссертация состоит из введения, главы обзора литературы, главы собственных исследований, заключения; выводов. Изложена на 64 страницах машинописного текста, включающего 8 таблиц, 1 рисунок и библиографический указатель литературы, который содержит 100 источников литературы, в том числе 49 иностранных.

, СОДЕГЕАНЧЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

Б работе использовали вакцинный вта:>!М "Н" вируса болезни Еыкасла в качестве вируса интерфероиогена. В качестве индикаторного вируса при определении противовирусной активности интерфэрона использовали вакцинный штамм "Индиана" вируса везикулярного стоматита.

Источником лейкоцитов слукила донорская крогь, соответствующая требованиям Регламента производства человеческого лешэ!:,>1тарного интерферона N 302-82.

В работе использовали »шкрофильтрационные мембраны ПРР; Н'/РР, с размаем пар 0,1, 0,22 и 0,45 мкм со-

- б г

ответсвенно и ультрафильтрационнь» мембраны РТНК и РТШ с с порогом отсечения по молекулярной массе 10Q н 300 kO cq-ответсвенко ("1&шшпор"США), Кроме того, испольвовади отечественные («мОраны ПА-0,2 (полиамидные с размером пор О, В жм)г. Минск; избраны капроновые, микропористые (размер пор 0,2' шм) р/к "йту калур"; мембраны Пладипор И"Д Н 2 и 1IIA-A N1 (размэр пор 0,2 мкм) Казанское ПО "Tacua"; Н 167 (полипропиленовые), Н72 (лавсановые),УШ-100 (полисульфои-амиднш) с порогом отсечения по молекулярной масса 100 kDi ГСУ-130 (полипропнлэновыэ) с порогом отсечения по lili 130 kQ; УШ-300 (полиоудьфонаиидныэ) о порогом отсечения по Ü ц 300 1<D.

Получение вируса болевни Ньюкасла штамм "Н", вируса вевнкулярного стоматита, интерферона на лейкоцитарной масса с использованием аллантоисного вируса болезни Ньюкасла проводили согласно Регламента производства человеческого лейкоцитарного интерферона N 302-82.

Контроли интерферона на бактериологическую, вирусологическую стерильность, безвредность и токсичность проводили ПО 1С 42-2-17ЕС-91. ,

Определение противоЕирусной активности интерферона проводили на 3-4 суточных перевиваемых клетках почек эмбриона свиньи против 100 ЦПД/БО вируса везикулярного стоматита согласно вС 42-247ВС-91, В качестве ®гандарта использовали коммерческий интерферон для интраназального применения с противовирусной активностью 1600 МЕ/мл.

Общий белок определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951).

Овальбумин определяли с помощью иммуноф?рментной тест-системы производства НПО"Иммунопрепарат" г. Уфа, МС 42-32БВС-92 согласно прилагаемой инструкции по применению.

НЕз-Ag определяли с помощью коммерческой иммунофер-ментной тест-системы, изготовленной на Предприятии по производству бактерийных препаратов ГНИЮМ г.- а Новгород, согласно прилагаемой инструкции.'

- в -

Аналитическую гедь-кромзтогря^пи выполнили, прпдэрлз!-ваяс{> оОЕдпринатмх принципов, сшсйЩК В Гель-Хромз-тография. г. Остйрмад, "Кир" И. 15)70,

Реакцию гркзггйвдщадш ственвд сагдасдо рдоЕодсиа А. 0. Горбуновой и Ц, К Саговой (1660),

Опредедеда ост&тоцяаго <$орюшдагеда вшолиядц па «отод^овдюшшоыу в СО 4г-344Ш-90,$кшг!ю-т!}1чзск|з,}ий«-чзсккэ, фювчаскга |1 »«дгуиомшачеою» штсды каагрота ш-дздздеглх ИМ.!У1:О£5иолог}1ЧЭО«К препаратов, С. 41.

рсзулрташ иажщимт и си ешх/жъ.

. 1. Пацучзщ-.й ощр^ицрсэ вцщ'ииаса ¡пщ'№ц:а ¡з уаюииик ¡¡¡тшилхщюаэ гчхмдц;.?лзгсз

Оу№ствувд!э мэтоди рчксчки готоеид препаратов интерферона от аллантсиеных белков солряланы со аначитальнуии трудностями, например,в технологии изготовления ииьвкцаон-них препаратов интерферона СагЛеП с сравт. (1В70) применяли тшгократкоа параосавдещи интерферона К5СН к зтиювш ешкртом при различных значащих рН. Кузнецов с соадт. (1331) предложили, с целью удаления оллантоисных балков из препарата, использовать ккшуносорбонт с.кроличыши антителами к белкам адланЛнсной жидкости. Штоди позволяют достичь значительной концентрации протшюьнрусной активности и чистоты интерферона, однако отличаются большой трудоемкостью, длительностью и многоступенчатостью. Крот того, метод с использованием антител к белкам, аллантоисной жидкости не позволяет обрабатывать Больший ебьеш интерферона, ввиду ограниченной еорбционной емкости иммуносорбен-та,а также возможно "сползание" иммуноглобулинов кролика с сорбента, что в свою очередь может привести к загрязнению препарата чужеродными белками.

Другим путем очистки Интерферона от примесных белков

является испольвование иммуносорбции (Гарипова с соавт., 1993, Ogburn С. A. et al.,1973, Torna Е. Т. and Paucker К., 197G). Интерферон специфически адсорбировали из смеси белков на иммуносорбенте с иммобилизованными антиинтерферо-новыми иммуноглобулинами, с последующей его алюцией при различных условиях, вызывающих диссоциации комплекса антиген-антитело. Получали высокоактивный и достаточно гомогенный препарат.. Однако- для получения высокоаффинных антител требуется большее количество вмсокоочишенного интерферона, кроме того, как было показано ¡¡йбрун с соавт. (1985), существует предел селективности иммуноаффинной хроматографии,заключавшейся в "неиммунной" сорбции иммуноглобулинов иэ культуральной среды на иммобилизованном иммуноглобулине, а такт возможно "сползание" антител с иммуносорбента в процессе эксплуатации.

В 1982 году был предложен способ очистки интерферона путем его осаждения сульфатом аммония с последующим растворением осадка в 2-8 М мочевине и его гельфильтрацией на колонке с гелем Акрилекс П-бО (Пивоваров А. Я и др.). Rubinstein and Pestka (1981) предложили для очистки интерферона использовать жидкостную хроматографии с высокой раз ре киксе й способностью. Интерферон осаждал;? трихлорук-сусной кислотой и проводили хроматографию растворенного осадка на коленке с сефадексом G-100. Для очистки интерферона также использовали метод адсорбционной хроматографии (Синева.С.А.' с соавт. 1985), заключаются в адсорб- . ции интерферона на колонках' с отечественными кремнеземными сорбентами (макропористое стекло №5-2000 и силохроы С-60), с последующей их злюцией. Все вышеперечисленные способы позволяли получать высокоочиш,енны<? препараты интерферона с достаточно высоким выходом по противовирусной активности. Недостатком этих методов является то, что достаточно сложно в производственных условиях проводить работы с хроматографическим оборудованием, т. к. для этого требуется колонки больших размеров, работа на которых е-зяряяз-

- в -

на с определенными трудностями,основной из которых является обеспечение стерильности процесса.

Таким образом, традиционный пут» очистки интерферона от контаминируюших примесей, в той числе и влдантонснык белков, когда эти примеси удаляют ум из готового препарате, представляется достаточно трудоемким, технически сложный и продолжительный. See ето вместе взятое наводит на мысль о поиске других путей количественного снижения примесных аллантоисных белков в интерферон». Наиболее простое и логичное решение этого вопроса еаювочается в очистка вируса индуктора от аллактоисньпс белков перед его использованием для индукции кнтерфэроногенеаа.

Для очистки вирусов от контамииирухзш»« балков широкое распространение получили следущие методы: ультрацентрифу-гированке, адсорбционная хроматография, ионнообменная хроматография, хроматография на молекулярных ситах, спиртовое и солевое осаждение и разделение в двухфазных полимерных системах.

В условиях крупномасштабного производства наиболее . технологичным является применение селективной ультрафидь-трации (Гомолицкий Е Н. с соавт. 1983). Она позволяет:

1. Одновременно с концентрированием вирионов производить их очистку, так как вирконы, обладающее большим размером задерживаются мембраной, в низкомолекулярные белки и соли свободно проходят через нее.

2. Вследствие mi клети воздействия сохранить структуру вирионов.

3. Сконцентрировать десятки и даже сотни литров ви-руссодержащей жидкости в течение нескольких часов.

Кром? того, стоимость установок для ультрафильтрации значительно ниже, чем стоимость оборудования, использу-.юго в альтернативных методах и они занимают мало места. Для увеличения перерабатываемых объемов образца, требуется простая добавка филгтрущих элементов и увеличение производительности насоса.

- в -

Эффективность селективной ультрафильтрации для концентрации и очистки вирусов Сыла показана еда к началу 80-х годов (Jungemi J,1077, Wolf Я,19Э0). Однако внедрение ее в промышленных масштабах в нашей стране сдерживалось отсутствием отечественных мембран и модулей.

На начальной этапе работы в вкспернмвнтах нами иополь-эовнц микрофильтрацконныв мембраны с размером пор от 0,1 до 0,46 мкм, ("Миллшгар" США), заправленные в специальные гдоскокамарнь» держатели. Очистку и концентрации проводили в твдгэнциальиом потоке,

Как видно иа таблиц« 1, потери гвмаггдоткнируюдей активности были минимальными при испольвоваиин всех трех мембран. При одинаковой кратности концентраций (х40 ршз) содержание общего белка и оаадьбукина было наименьших* при применении мембраны HVPP с равмером пор 0,46 мкм. Содержание OA сжижалось по сравнению о исходной ВАН я 1 ООО рая.

Следующем этапом кашей работы было исследование кн-терфероногенной* активности полученного концентрированного и очинённого вируса. Биосинтез интерферона проводили регламентировании« способом.

В таблица 2 приведены ревультаты в опытов nq биосинтезу интерферона с использованием полученного концентрата вируса-индуктора. Как видно иа атих данных, концентрированный вирус обладал высокое кнтерферокиндуцлрующей активностью, не уступавши вллангоисному вирусу, при атом овальбумин в полученном интерфероне не определялся в пределах чувствительности применяемой тест-системы в Щк (1,5 нг/мл).

Однако исподьаохание мембран фирмы "Киллилор", в связи с сокращением поставок оборудования по импорту и высокой стоимостью, труднодоступно широкому кругу потребителей. Поэтому нами предпринята попытка подбора, отечественных мембран с характеристиками, аналогичными мембранам фирмы "Миллипор".

К таким характеристикам относятся:

СНЖСТКА И КОНЦЕНТРАЦИЯ ЕЕ»/

с шюльзавттг ееввр/я vmnm чтжпахгр"

Таблица î

Тки ! Размер ! Исходная вируссодержа- t очищенный концентрат ! Содержание

ме1"5раны ! ! щая аллантоиеная жяд!соеть1 вируса f белка по Jbypa

I !Обьем? ГАЕ ! Содержание ! Обьем! ГАК ! Содержание !

Т в мкм !(л) !' в ш !свалп>бумина ! (л) t в щ ?овальСумина !—------------

f I ■ ! ! мг/ил ! ! i нг/мл ! BAS ! Конц.

VVPP 0.1 8.0 256 0,4+0,13 0,19 10752 .400+130 1,6+0,14 3,9+0,34

GVFP 0,22 8,0 . 2ББ 0,4+0.13 0.19 10752 240+80 1,8+0.14 3.7+0,SE

HVPP 0.45 8.0 256 0.4+0,13 0,19 10752 160+55 1.8+0,14 З.Э+0,28

Примечание: прлведгну средние результаты 4 опытов по каждому ткпу мембраны.

характеристика шяегфегопл по2>~:%1!юго с ксиоясоздхеи мхшатгаогэ и cnzz&moro а яождапта?*зад:,-raro котсоз салзкш ub¿;i¿zzA. .

ГсДгйСЗ 2

йспадьауеыьй вирус болезни Ньккаол

Протиаовирусааа ашаьасть t шдерфгрона в IS/ил !

окш>буьаша в китгр<5ерокэ в ют/ил

ВАД

Счивеннай и конвднтрз-рсаашша

4160+1410 4160+1410

4+1.3

на опредалиется

Щшыачшше:. приведены средние данные б опытов

- 1В -

- низкая сорбционная емкость

относительная механическая прочность и возможность многократного испольвования без нарушения целостности

- возможность испольвования химических агентов для стерилизации и регенерации

- доотупность.

В работе использованы мембраны ПА-О.Е, капроновые • микропористые. 1МЦ N2, КИА-а N1 о размером пор 0,2 мкм, 8оправленные в плоскокамерные разделительные аппараты, изготовленные в' НПО "Биотехника" при НПО "Иммунопрепарат" г.Уфы. ГЬдачу жидкости на разделительный аппарат осуществляли перистальтическим насосом "Мастерфлекс" при рабочем давлении жидкости внутри камеры 0,3 - 0,4 атм. Площадь фильтрующей поверхности составляла 0,6 кв. м.

Очиотку и концентрацию вируса Солеени Ньюкасла выполняли в режиме микро-диафильтрации по следующей схеме: исходная ВАК —-> осветляйся фильтрация (П-40Ы)----> концентрация, диафильтрация (ПА-0,2)----> концентрат ВНН.

Как видно из данных таблицы 3, концентрация и очистка вируса на отечественных мембранах проходила с минимальной потерей гемагглюгинирующей активности .содержание овальбу-мина снижалось не менее, чем в 1 ООО раз. Однако только мембрана ПА-0,2 сохраняла исходные свойства после 10 операций концентрирования вируса Остальные мембраны либо разрушались в процессе эксплуатации и начинали, пропускать вирус, либо необратимо ввбивались и слабо пропускали ал-лантоисные белки. По-видимому это связано с тем, что из всех использованных нами микрофильтрационных мембран, только мембрана ПА-0,2 имела подложку. Подложка удерживат мембрану от сильной деформации во время работы и таким образом предохраняет ее от разрывов и необратимого забивания пор.. Таким образом, предложенный способ получения очищенного и концентрированного вируса болезни Ньюкасла, с применением отечественных микрофильтрационных мембран ПА-0,2

а

S я

S

9 ^

в fc

II al ëj

S в

£3 «î !

S d

я s

y H

â is

y

I

t-

П

я

» ч K¡ а й

Í gl $ í

tí « pf fí

•ч» Ti t-t Y-l Я я

fi eo í

«H И и j

J I I I I

l g g S. il

о Ю

s 's

8:

>

a

I 1 1 I и

ч n Ч1 ▼H тН г»

O О О О

P3 »i СО п г* ГО гЧ

Í' Ï'

o" о • О о

8 (0. а. to ft to 8

o о о о

МЭ 10* to to

N N M СУ

O О о* о'

N Sí г •< S и» О

? S i 3 1

а

высокотехнологичен, обеспечивает достаточную очистку индуктора от бадаотиде шшан^оионих белков и.примзним в промышленных масштабах.

Способ внедрен в рраиэ?одство ЧЩ на. предприятии ЩО "Иымунопрепарат".

2. Раарзвя&а одкзгялрфюза ещя&ц <%аокни>»а чш

В действуем с »щатоадче 1>рец,] рчгле-шите производства чалоБочэогаго дей|социтвриого н!(тар^)ронц предусмотрено , удзденке ujlkiuiqh3i;uu fioílcaa ц на адсорбнровавшзгоса на ■xaíiMuiitax внрура-кпдуктора посла tiro 1-Е часовой инкубации с дайкоцитаии цонтрп^упфзвшшйм. Осадок лейкоцитоь рйсуспендируют в cEssaií порции орздц 100 с необходимы:^ добавками и сноса инкубирую? при 37- 0 16-20 часов.

Одна.1» процесс цзнгряфугировашы и уелоших производства инторфероиа сопрягян с рядом недостатков:

- трудоемкость втапа,включшцрго разлив ив б.юреакто-ра вввсси лейкоцитов поело индукции во флаконы, otcoc ва-досадочной жидкости иа каждого флакона после центрифугирования, добавление свела?, среди к лейкоцит«.! и ойрмнуь подачу лейкоцитов из флаконов в биорэцетор. Ее в ати операции требу*/? строгого собдадашш правил aceim:;::¡ и антисептики;

-'при достаточно■большом обьеьы производства значителен расход стерильного материала и флаконов, что привод«!' к перегрузке стерилизацнонного оборудования;

- необходимо значительное количество центрифуг для одновременного центрифугирования большого обьема лейкоци-тарно-вирусной суспензии из Оиореактора;

- травмирование лейкоцитов в процессе центрифугирования, что мэкгт привести к сииьйнию продукции интерферона;

- манипуляции,' связанные с центрифугированием, значительно увеличивают продолжительность рабочей см-лш.

Ездавно нредлолон способ получения человеческого ^--Ьюцт'арнаго инте^.форона, ь котором для индукции исиодь-

яуют аллантоисный вирус болезни Ньюкасла,концентрированный и очнпенннй («годом ультрафильтрации-диафильтращш в постоянном оЭьсн-з на неибрзн^х с порогом отсекания по молекулярной пассе 100 или 300 кО (Авторское свидетельство СССР К1700515, кл. 1092 г.).

Способ осуц?ствляется следующим образом: |*.»дэ'?нкиз из донорской крови лейкоциты взвешивают в срзде III09. Очнгчнкнй вирус-индуктор вводят в среду с лейкоцитами и ,'Н>-у5ир>тгг? при 37 0 в течении 1-3 часов. Ег.тен л?Р.коц!|тм отдзгяг? ¡'.знтри'угированиея нря 1РШ г а твчэщгл

16 «няут, Ооадск Л95".1ИЦ«Г08 р<30успенд!фув? п ОРАГ»И поршт

питательной срел-ч. 10-ГО часов япкубздго! при 3? О

продукт отделяет от лэйкоцнтоц цвн?р!!'1угкров<мшт однако.как т видим,применение д&.."ч такого тюогао-«пягзниого вируся-иадунторз не поз?оллчг ргддглп ц-?нтр::!у-щяегуш посла ствгда кадукшш кнтер^лрднзгеиеза, чт к?« юппептрацгя • сЕальбукпна в противном случая Оудзт прзви-П'дть допустимую (таб. б).

в своем рас.юрякзнки вкоокоочк^пнгЛ концэнтри-ромнннй вирус о очень незначительном содер^ш^м ОД, мы предприняли попытку избегать атад ц?нтр,.,.-*'УГйрозанил после аирусноЛ индукции с цель» исключения вьп'^укаааннпх недостатков центрифугирования, что р конечном-счете ведет к упрочни» способа получения человеческого лийкоцитаркого интерферона.

Пгссиитеэ осуществляли следуивдм образом: Суспендировали лейкоциты в 109 среде, сод9ргап.ей необходимы» юкяоненты, добавляли очищс-ниий концентрат Еиру-са-инлуктора к лейкоцитам из расчета от 1 до 6 тыс. ГАЕ на 1 млрд. лейкоцитов, инкубировали взвесь при 37°С а течение 18 - 20 часов, постоянно перемеривая. Ратем лейкоциты удаляли центри?угироьанием, а надосадочную »едкость, содер-тл-ьув питер >рон, подкисляли 10% соляной кислотой до р!1 2,2 - 2,4. Г.чдс-рлившш подкисленный псиуОДшат интерферона в течение 10 дней для ¡•нчктпьаци;! вируса индуктора.

- 16 -

Как следует иа полученных данных (таблица 4), лучшие результаты были получены при соотношении вирус/лейкоцит 2-4 ГАЕ на 1000 ООО лейкоцитов я t МЛ- Как увеличение, так и снижение доац вируса ведет к значительному снижению противовирусной активности полученного интерферона. Ш-видимому, в высоких концентрациях вирус оказывает угнетающее действие на лейкоциты, а низких концентраций не достаточно для полноценной индукции интврфороиогенеаа. На выход интерферона, помимо соотношения вирус/лейкоцит, вначительное влияние онавивает конечная концентрация лейкоцитов во время Сиосинтееа. Так при концентрации 8 ООО ООО лейк. в мл. противовирусная активность интерферона была в 2 раза ниже, чем при концентрации 4 ООО ООО дэйк. в мл., в токе время дальнейшее увеличение концентрации лейкоцитов до 6 и более млн. .«ейкоцитов в мл. но ведат к ваштному росту противовирусной активности препарата. Теким обрааоы, в целях экономии сырья и биоринтева интерферона о высокой противовирусной активностью следует иоподьвовать концентрацию лейкоцитов 4 ООО ООО лейк. /мл.

В дальнейших исоледоданиях мы иопольвовали в работе соотношение вирус/лейкоцит Е-4 ГАЕ/1 ООО ООО лейк. при индукции и конечную концентрации при биосинтезе 4 ООО ООО лейк. /мл.

Противовирусная активность полученного таким способом интерферона составляла 6-10 ООО ЫЕ в мл, содержание овальбумина колебалось в пределах 2-4 цг/ыл (таблица б).

Наряду с изучением влияния дозы вируса-индуктора и концентрации лейкоцитов иа выход интерферона, мы провели исследования по замене человеческой плазмы, используемой при биосинтезе интерферона, на донорский альбумин. Эти работы были проьеданы по следующим причинам. При биосинтезе интерферона в питателььую среду добавляют человеческую плазму или аглобулиновую фракцию плазмы беа какой-либо обработки. Человеческая плазма помимо веществ, необходимых для культивирования лейкоцитов,содержит другие белки плаз-

влияние осюттття вирус/лейкоцит при индукции н тнтюа понцетрации лейкоцитов при биосинтезе на противовирусную а1сгивн0сть полученного интерферона

ТАБЛИЦА 4

Соотношение 1 Концентрация • Противовирусная

вирус/лейкоцит 1 лейкоцитов в ? активность интер-

ГАЕ/лейк. ! . 1 мл ! ферона в МЕ/мл

при индукции 1 при биосинтеве ! 1 »

2 ООО ООО 2280+680

1/1 ООО ООО 4 ООО ООО 2280+680

б ООО ООО 2280+680

2 ООО 0С0 ' 4160+1410

2/1 ООО ООО . 4 ООО ООО 8990+2640

б ООО. ООО 8990+2640

г ооо ооо 4160+1410

3/1 ООО ООО 4 ООО ООО 8990+2640. .

6 ООО ООО 8990+2640

2 ООО ООО 4160+1410

4/1 ООО ООО 4 ООО ООО ' 8990+2640

6 ООО ООО 8990+2640

2 ООО ООО 4160+1410

6/1 ООО ООО 4 ООО ООО 6160+1600

б ООО ООО ' 5160+1680

2 ООО ООО 2280+680

6/1 ООО ООО 4 ООО ООО 4160+1410

б ООО ООО 4160+1410

Zfï&~rt?act:.TA ЕптЕгстш тачшюго с Ecvojzsosmzst pjœsraasn слоаовоз тзукцяя

Способ биосинтеза J &польэуемыЯ

! ЕИР7С t

! Протгаовирустая гкгкзвость ! I интерферона в 1ЕЛп !

J t

Содарзание оваиьвумяна в шггерфэрокэ в мят/мл

ЛвустадиЯный* Дгустадийный Одностадийной** Одностадийный***

BAS

Концентрст Пэнцэктрат Концентрат

4160+1410 4160+1410 £К0+г540 . S9SO+2640

4+1.3 ЕЗ СЕ^ЯЯиЕМТСЙ 0.003+0,0335 0,5+0,15

t

ч

CD

Цимэчщтае: сргагдзпы срэдпго дантшо 4 опугоз по кагдону способу биосинтеза. * - сС™?пртилтьй »ктод с цгнтряфупфованкгм сосго индукция.

- разработанная кгтод с одг.овремзшюя вядукцпяй и бетсязтеэои,

- в качэстгэ индуктора ЕНтерфгроногеЕэга еспаЕьзовата ESt очяг~в и коЕцептрярозгказй Еа кебраигх с порогсм отсечэниз 200 ЕЯ.

ыы крови, а так же может содержать болезнетворные агенты. Таким образом,в процессе очистки и концентрации интерферона неизбежно будут концентрироваться и примеси,содержащиеся в культуральной среде. Вамена плазмы на альбумин позволит повысить безвредность и безопасность интерферона, так как в. процессе получения альбумин подвергается спиртовому и тепловому воздействию, что гарантирует отсутствие в препарата возбудителей болезней при высокой степени его гомогенности. Кроме того, вамана плазмы на альбумин значительно облегчит вадвчу по очистке и концентрации интерферона о помощью ультрафильтрами, потому что отсутствие в культуральной среде других белков плазмы крови способствует прохождению интерферона через ультрафильтрационную мембрану. Альбумин, проходяшлй череа мембрану вместе о интерфероном, не ухудшает качество интерферона, а да»» шкет служить етабиливатором при лнофильном высушивании препарата.

Исходя из выш?сказанного,мн исследовали влияние широкого диапоэона концентраций донорского альбумина на различных стадиях биосинтеза на продукцию интерферона лейкоцитами. Как видно из таб. б, использование донорского альбумина вместо человечеакой плазмы в конечной концентрации О,1-0,2Х не вызывало снижение продукции интерферона лейкоцитами и,в то же время, как будет видно далее, значительно облегчало очистку интерферона от высокомолекулярных примесей с помощью ультрафильтрации.

Таким образом, предлагаемый способ биосинтеза человеческого лейкоцитарного интерферона, в сравнении с суи^ст-вуювдми в настоящее время способами производства человеческого лейкоцитарного интерферона, является предпочтительнее, так как достигает тех жй и да*я лучших результатов при значительном упрощении процесса, сокращении материальных и трудовых затрат и экономии рабочего времени.

Разработанный способ биосинтеза интерферона внедрен на предприятии НПО "Иммунопрепарат".

ъштЕ различных кощтглщй чцловечвского #)1ю¥ского альбуцнна на продукция ннпшюна шкоцитш

ШЛИЦА о

Концентрация донорского альбумина в 2 Противовирусная

активность

На стадии индукции Ш стадии биосинтеза интерферона

0,06 1600+400

0,1 £280+600

0,05 0,8 2260+680

0.3 2280*680

0.4 2280+680

0,00 2200+680

0,1 8090+2640

0,1 0.2 8900+2640

о.а 6090+2640

0,4 4160+1410

0,06 22801680

0.1 6990+2640

0,2 0,2 6980+2040

0,3 6990+2640

0.4 '4160+1410

0,05 2280+680

0.1 8990+2640

0,3 0.2 8990+2640

0,3 8390+2640

.0,4 4160+1410

' 0,05 2260+680

0,1 4160+1410

0.4 0,2 4160+1410

0.3 41Б0+1410

0,4 2260+680

В контроле человеческая плазма 31 8990+2640

- 2t -

3. РаареОагка метода очистки интерферон а от внрусп-ня-лукторп и других вывопоиолвпулярных принесся

Нативные препараты интерферона могут содержать, кроме вируса-индуктора,ряд других вирусных контаминант, наиболее опасными из которых являются вирусы инфекционного гепатита и лимфотропньн ретро-вирусы семейства HTLV, вызывающие им-муносупрессию и злокачественные заболевания (Urba W.J. et П., 1086). Их источником мотет служить кровь доноров, используемая в качестве сырья при получении интерферона.

Известен ряд физико-химических приемов, позволяющих инактивировать возбудителей ^епатита:

- прогревание при 50-80 С в течение Б-20 часов (Tabor Е. et al. ,1984) или при 98 С в течение 2 мин (Kobayashi Hiroyoshl et al. , 1984),

- последовательная обработка пепсином, 8 M мочевиной и формалином в разведении 1:4000 (Kew M. ,1984),

- обработка 1% водным раствором глютарового альдегида при 24 С в течение б часоч или 80Х спиртом при 11°С в течение 2 часов (KahayashI Hiroyoshl et al. ,1904),

- формалином (1 : Б00) при 37 С в течение 4 дней (Scheiermann N. et al. ,1984),

- неионным детергентом и эфиром (Nam J. ,1986),

- пепсином и твином-80 (Вязов С. с соавт. ,1985).

Предложен также ряд хроматографических методов, позволявших фракционировать Hbs-ar на твердофазных полиэлектролитах отиленмапеинового ангидрида (Jalpln S.A., et al.,1983), гидрофобном геле октаногидразид - Сефароза-4В (Einarsson M. et al., 1984), аффинном сорбенте на основе Clq из плазмы и сефарозн (Jazitt Y. et al.,1986).

Значительный интерес вызывает применение для этих целей гамма-облучения. За рубежом этот метод получил широко* распространение в стерилизации медицинских препаратов и

- ЕЁ -

материалов (Осипов В. В. о соавт. ,1086).

Однако при получении,препаратов лейкоцитарного интерферона перечисленные способы инактивации и удаления конта-минирущих вирусов не могут быть применены либо в силу своей нетехнологичности, либо возможности инактивации самого интерферона (Ершов Ф. И., 1972).

Удаление инфекционных чаотиц из биологических препаратов с помощью гельфильтрации, аффинной хроматографии и центрифугирования требует довольно сложного и дорогостоящего оборудования, перерабатываемые обьемы очень незначительны, а процедура занимает длительный промежуток времени и поэтому не используется в производстве ЧЛИ для интрана-зального применения.

Учитывая все выиеизложенное и имея определенный опыт использования ультрафильтрации для очистки и концентрации вируса-индуктора, мы для удаления из препарата интерферона высокомолекулярных примесей применили ультрафильтрацию на плоскокамерных разделительных аппаратах.

В работе использовали опытные образцы полипропиленовых, лавсановых, полисульфонамидных и фенилоновых мембран с различным диаметром пор производства ВШШСС (Владимир), полисульфоновые мембраны производства НПО "Пластмассы", полисульфонамидные мембраны производства КШ "Тасма", а также мембраны РТНК, РШ\ ("Миллипор" США). *

Мембраны заправляли в плоскокамерные разделительные аппараты, подачу матери-зла осуществляли перистальтическим насосом "Мастерфлеко". Очистку проводили в тангенциальном потоке.

Мэтод осуществляли следующим образом.

Подкисленный и неподкисленный интерферон подавали на плоскокамерные разделительные аппараты, заправленные личными мембранами, и рециркулировали его до полной фильтрации. Скорость рециркуляции регулировали перистальтическим насосом таким образом,.чтобы давление внутри аппарата составляло 0,3 - 0,4 атм. Полученный фильтрат, содержащий

интерферон, подвергали стерилизующей фильтрации через мембраны с диаметром пор 0,22 мкнС'Шмлипор" США). Стерильный KiiTepi-epoH исследовали на противовирусную активность, вирусологическую стерильность, и проводили аналитическую гельхромптогр^га на Сефэрсзе-ВВ.

1'лк видно из данных таблицы 7, на выход интерферона после очистки окапывали влияние как условия, при которых проводилась очистка, так и размер.пор мембран и материал, из которого они были изготовлены.

Нзшвдызта потери интерферона после очистки еавлвда-гись на кэыбранах PTMit и УП?! - 200 (порог отсечения SQQ |ф) и только в тон сгучгэ, ес£п перед очистная ого pH составляла 2,2 - 2,4. Концентрация обцего Согка шп.талпсь более, чем з 2 раза. Препарат интгр£ерона, пропущенный через эти мембраны, был вируеологичэскл стерилен, тогда как в исходном материала вирус определялся (таблица 6). Из хроматогранга интерферона видно, что высокомолекулярная фракция, содер/авсаяся в исходном интерфероне, после его очистки удалялась (рис. 1).

Чтобы убедится в том, что кембрзны РТШ и УШ - 300 задерживают вирусные частицы, были проведены слэдувщга модельные опыты. Из разделительных аппаратах, заправленных этими мембранами, провели 'удьтрафильтрации E«, содержащей BSH с инфекционным титром 10 ЦПД, а таю» раствора плазмы, содержзс,ей НЕз-Аз-. Полученные фильтраты проверили на наличие инфекционных частиц в тесте вирусологической стерильности для ЕБН и для НЬз-аз в иммунофермен-тном анализе. Полученные результаты свидетельствовали о том, что после ультрафильтрации ВЕН и HBs-Ag в фильтратах отсутствовали (таблица 8).

Кроме этого, применение ультрафильтрации резко увеличивало (в 3 раза) количество интерферона,пропускаемого через стерилизующие мембраны. Если до ультрафильтрации через один стерилизующий фильтр диаметром 233 мм можно было пропустить до БО литров интерферона, то после ультрафильтра-

§

i i

& *

! fi

L- ¡

«5 iE

f * a ° к

о о о ооооооооооо

I I I I I I I I I I I I I I

00000000000000*»

S В 9 S 8

^ И р tf щ

¡u

„ о о о в _

з'ё'вв в â's ê'â'i é'é'á'á' §

¡§J.Я В g.S.I

о I

M N NN СО (j NN Ы (О N NN N t«. N Г- C\2 l- CJ I4- N Г- Ы Г4-* CJ Г-* CU

S

ï

и

o. a i

и о i

fe ? 1

& I !

»

^ т.. 1

i

* Б

S I g

щ 2 ч

8 8 «н *н

I tí

§ § g

i я: >§■

í ^ ö & i & §

t С

ï X

а

Рис Л. Хроматография интерферона на Софарозе-бВ А - исходный полуфабрикат интерферона Б - полуфабрикат интерферона поело ультрафильтрации на мембрана с порогом отсочония по молех. маесо 300000 Д I - частицы о мол. массой более 1000000 Д, элвируют-

ся в свободном объеме колонки II- частицы с мол.массой мснеи 100000 Л, олвируются го внутреннем объеме колоша.

ультрасяльтрация ржтворов с0аеряая1х ибп и ивз-ае на

икиврлнах ртт и упи-аоо.

таблица в

Тип ! Исследуемый 1 ВБН-инфекционная ак- НВз-аг-ИФА (единиц

мембраны I материал I тивность (ЦОД) оптической плотности)

I I-------------------------------------------------

! I Исходный I Очищенный

РТКК ББН 10 "0 Щ1Д не определяется

НВз-аг 1,00 0. П. 0,090 0. П.

-Я

УШ-300 ББН 10 ЦПД Ке определяется

нвз-аг 1,00 о. а 0,085 0. а

Примечание: при учете результатов реакции в КФЛ, оптическш плотность (ОП) отрицательного контроля составл> ла 0,100, следовательно положительным считаете! образец ОП которого более .0,200

цин - более 160 литров.

Таким образом, ультрафильтрация интерферона сводит к минимуму риск инфицирования людей вирусом гепатита В и другими инфекциями, присутствие которых вовможно в крови доноров. При помощи ультрафильтрации удаляется вирус-индуктор, что способствует повышению качества интерферона. Очистка интерферона позволяет повысить производительность мембран в процессе стерилизующий фильтрации.

Способ внедрен в производство ЧЛИ на предприятии НПО "Иммунопрепарат".

выводи

1. Рааработам промышленный способ очистки и концентрирования вируса болевни Ньюкасла - индуктора ^-интерферона, о использованием селективной микрофильтрации на импортны* и отечественных мембранах, о размером пор от 0,1 до О,4Б мкм, позволяющий анивить концентрацию овальбумина в Вирусной суспензии более. Чем в 1 ООО раз при незначительной потери вирусного материала с сохранением интерфероио-генных овойотв.

Е. Разработан одностадийный способ биосинтеза ЧЛИ без удаления вируса-индуктора после стадии индукции, включающий использование оптимального количества интерфе-ронсинтезируюцих клеток (4 ООО ООО лейк. /мл.), оптимальной индуцируюпэй дозы очищенного вируса ( 2-4 ГАЕ/1 ООО ООО лейк.), использование бесплаэменной культуральной среды.

3. Разработан промышленный способ очистки полуфабриката интерферона от вируса-индуктора и других высокомолекулярных примесей с использованием отечественных И импортных ультрафильтрационных мембран с порогом отсечения по М. М. 300 кО, Применение которого повысило безопасность препарата, увеличило в три раза производительность стерилизующих фильтров "М1Шрог".

4. Внедрение в производство человеческого лейкоцитарного интерферона для интраназального применения разработанных способов привело к сокращению расхода куриных эмбрионов в два раза за счет снижения расхода вируса на индукцию, позволило снизить расход донорской крови с 2,4 до 1,8 л на 1 л интерферона вследствие увеличения противовирусной активности .полуфабриката, способствовало акоюмии стерилизующих фильтров. Кроме того, полностью устранены Потери полуфабриката интерферона ив-за присутствия в нем НВз-аг. и овальбумина.

список работ, опувдиновшшх по тепе днссертлции.

1. Регламент производства N £81-СО "Интерферон лейкоцитарный человеческий сухой" Орок введения с 1 января 1991 г. / Р. Е Ыагаэов, В. Г. Юсупов, В. а Кулагин, Е. ЕВобкова, Л. Г. Хафиаова.

2. Интерферон как модулятор иммунитета и аллергии. /В. А.Стриги» , В. А.Трофимов, НЕ Козина. Э.О.Симонова, Т. Д. Евстифеева/ Программа и тез. докл. "Оптимальные орэдс-тва н методы иммунокоррвгируюпрй, противовоспалительной и протиаошнфобной терапии" Карьков, 1963, 10-11 октября, с. 247.

3. Применение мембранной технологии в производстве человеческого лейкоцитарного интерферона / . Е. Е Еобкова, а О. Кулагин / "Вирусние инфэкцнн" Екатеринбург, 1993, с. 1Б0-1Б6.

4. Заявление о выдаче патента Российской Федерации

N 93019433: Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона/ 8. С. Иксанов, Э. Г. Галеева, Л. А. Ишкильдина/ Приоритетная справка от 19 мая 1993.

Подписано в печать 13/1У-Э4г. Заказ 1с. Тираж 100 экз. Ротапринт Бащсирск.ун-та.