Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гамма-интерферон человека: его получение, физико-химические и биологические характеристики

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Гамма-интерферон человека: его получение, физико-химические и биологические характеристики"

3 Лй^ДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК РОССИИ , И АУ,Ч Ц0£ЙССЛЕДОВАТЕЛЬСКИй ИНСТИТУТ ГРИППА

На правах рукописи УДК 615.281.8:578.245.2

ВИНТУХОВ Александр Альбертович

ЛММА-ИНТЕРФЕРОН ЧЕЛОВЕКА: ЕГО ПОЛУЧЕНИЕ, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Специальность: 03.00.06 — Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1993

Работа выполнена в Санкт-Петербургском ордена Трудового Краск го Знамени научно-исследовательском институте эпидемиологии и микр биологии им. Пастера.

Научный руководитель: кандидат медицинских наук, старший на> ный сотрудник В. И. Иовлев.

Официальные оппоненты: Аксенов О. А. — доктор медицинских на) профессор; Фридман Э. А. — доктор, медицинских наук, профессор.

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский научно-исследовательск! институт вакцин и сывороток.

Защита состоится «л » 1993 года в 13 час!

на заседании Специализированного совета (Д 074 48.01) при научно-и следовательском институте гриппа Академии медицинских наук Росси Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 15/17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ гриппа.

Автореферат разослан « » 1993 г.

Ученый секретарь

Специализированного совета Жилинская И. I

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ . хтуальность исследования. Известно 3 основных типа интерферо-1 альфа, бета и гамма), которые образуются в различных клетках 1иэма и отличаются строением молекул, а так же фиэико-хими-тми, антигенными и биологическими характеристиками. Интерфе-представляют собой семейство гликопротеидов, обладающих ан-эусными, иммуномодулирующими, противоопухолевыми свойствами, скрывает широкие перспективы для их клинического использова-Опубликованы экспериментальные данные, свидетельствующие о

выраженном гамунорегуляторном и противоопухолевом действии -интерферона, по сравнению с интерферонами типов альфа и бе-мегатся сообщения об успешном применении интерферонов, преи-твенно альфа и бета типов, при лечении острых и хронических еваний, имыунодефицитных состояний и опухолей. В связи с эстями массового получения гамма-интерферона, его клиничес-гпытакия практически не проводились. В то же время опубли-4 экспериментальные данные, свидетельствующие о болёе выра-< иммунорегуляторном и противоопухолевом действии.гамма-ин-зона по сравнению с интерферонами типов альфа и гамма. Это ггельство объясняет высокую заинтересованность специалистов (ного профиля в разработке лечебных препаратов и лекарствен-|рм гамма-интерферона.

ма-интерферон вырабатывается Т-лимфоцитами в присутствии популяций иммунокомпетентных клеток после их контакта с нами, а так*е Под воздействием некоторых веществ биологи-о происхождения или химических соединений. При этом обра-е гамма-интерферона сопровождает бласттрансформацию лимфо-и тесно связано с выработкой других лимфокиков. массовом получении гамма-интерферона для стимулирования га иктерферонообразования в культурах лейкоцитов или лим-з чагде всего используют растительные лектины, культуры зганизмов или микробные антигены. Полученный таким образом 5рика? гамма-интерферона, как правило, токсичен и нуждает-(ательной очистке, которая заметно снижает его активность, :е устраняет присутствующие в исходном материале сопутст-гамма-интерферону лимфокины.

следние годы, благодаря успехам генной инженерии, рекон-ваш, изучены и интегрированы в микробные плазмиды гены х типов интерферонов. Современная биотехнологическая меня- позволила наладить массовое производство генноинженер-

ных интерферонов человека, в том числе и типа гамма. Однако, 1 рабатываемые микробами-рекомбинантами интерферону не гликозили ваны и лишены комплекса иммуномодуляторов, присутствующих в п) родных препаратах интерферона, что снижает их биологическую а1 тивность и клиническую эффективность.

Промышленный выпуск лекарственных препаратов предусматри'ва« тщательное предварительное изучение их физико-химических и бис логических свойств; требует чувствительных и воспроизводимых > тодов тестирования, стандартных препаратов и антисывороток. К] ме того, до начала клинических испытаний необходимо в моделый опытах обозначить те нозологические формы, при которых будет ; фективен испытуемый препарат, выбрать лекарственную форму, ощ делить разовую и курсовую дозы. Тако.го рода проблемы' стояли ш ред нами в связи с планируемой в будущем разработкой технолог! получения природного гамма-интерферона человека.

Настоящее исследование посвячено оптимизации условий образе вания высокоактивного гамма-интерферона в лейкоцитах человека, поиску новых перспективных индукторов, разработке методик и П1 • паратов для стандартизации гамма-интерферона человека, изучем биологических свойств гамма-интерферона.

Работа выполнялась в рамках Всесоюзной программы "Интерферс утвер-кденной Президиумом АМН СССР и комплексной научно-техниче кой программа 0Ц-043, утвержденной Постановлением ГКНГ СССР, Госплана СССР и Президиума АН СССР.

Цель и задачи исследования. Целью исследований послужила ра работка условий масштабного получения природного гамма-интерфе рона и изучение его основных физико-химических и биологических ■ характеристик.

В работе решались следующие задачи:

1. Поиск оффективного малотоксичного индуктора, стимулирующ го в культуре лейкоцитов человека синтез гамма-интерферона выс кой активности.

2. Выбор оптимальных условий выделения и культивирования ле коцитоь человека, обеспечивающих максимальную выработку гамма-интерферона человека.

3. Разработка схемы иммунизации лабораторных животных гамма интерфероном человека для получения соответствующей гипериммун ной сыворотки.

4. Проведение сравнительного изучения физико-химических и биологических свойств интерферонов человека альфа и гамма гипо

.Проведение ограниченных клинических испытаний мазевой ле-твенной формы природного гамма-интерферона человека. а.учная новизна работы:

в модельных опытах с использованием культивируемых лейкоци-человека обнаружены новые индукторы гаммаинтерферонообразова-

получены новые сведения об условиях образования гамма-интерна в культурах лейкоцитов человека;

получены гипериммунные сыворотки к гамма-интерферону челове-

обнаружены в эксперименте более выраженные, чем у альфа-ин-зрона, антипролиферативная активность и противовирусное дейст-гамма-интерферона в отношении вирусов герпеса простого 1-го и осповакцины;

в ограниченном клиническом опыте установлен выраженный тера-(ческий эффект гамма-интерферона при лечении герпетических 1титов и рака шейки матки. ¡актическая значимость:

разработаны условия масштабного получения высокоактивного щного гамма-интерферона человека; ,

в рамках доклинических испытаний изучены физико-химические и

1гические свойства гамма-интерферона;

приготовлен и утвержден в ГИСК им.Гарасевича отраслевой

.артный образец антигаммаинтерфероновых иммуноглобулинов

■42-28-118-87);

приготовлен и утвержден в ГИСК им.Тарасевича отраслевой' артный образец активности человеческого лейкоцитарного-ин-рона гамма типа (ОСО-42-28-170-89).

робация работы. Основные положения по материалам диссертации ены и обсуждены на Всесоюзной конференции "Итоги и перспек-теоретических и практических (клинических) исследований по еме интерферона", Тбилиси, 1985 г.; научной конференции мо-ученых НИИЭМ им.Габричевского, Москва, 1986 г.; научной ренции молодых ученых в институте микробиологии им.Августа нитейна, Рига, 1987 г.; Х-международном симпозиуме социа-ческих стран по интерферону, Москва-Рига, 1988 г.; Ш-мевду-ном симпозиуме по интерферону, Куба, Гавана , 1989 г. Йликации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ. ?но 2 авторских свидетельства на изобретения № 1415498 от 1988 г. на "Способ получения иммунного интерферона" и

№ 1570069 от 06.05 1990 г. на "Способ получении гаша-интерферс

Основные положения выносимые на аяпуту:

1. Среди известных ^армакологаческих средств обнаружены прег раты, вызывающие образование гамла-иытерферона в культурах лейк цитов человека.

2. С использованием отечественных реагентов и оборудования р работаиа технологическая схема получения высокоактивного челове ческого лейкоцитарного гамма-интерферона.

3. Определены динамика и закономерности антителообразования процессе иммунизации лабораторных животных гамма-интерфероном ч ловека; получены соответствующие гипериммунные сыворотки.

4. Установлены заметные различия в физико-химических свойств и б проявлениях биологической активности препаратов альфа- и га иа-кнтерферонов человека.

5. В клиническом опыте обнаружено выраженное терапевтическое действие гамма-интерферона при лечении герпетических стоматитов рака шейки матки.

Внедрение результатов работы в практику.

Приготовлены и утверждены в ГИСК им.Тарасевича отраслевые ст дартныз образпы активности человеческого лейкоцитарного интерфе на гамма-типа С 000—42—28—118—87) и антигашаинтерфероновых имму глобулинов (0С0-42-28-170-89), которые необходимы для изучения : рактеристик и стандартизации выпускаемых микробиологической промышленностью препаратов интерферона, а также в научных исследов, киях при изучении интерферонового статуса организма.

Структура и объем диссертации.

Диссертация' изложена на страницах мамнописного текста и состоит из введения, обзора литературы, шести глав сообственных исследований, включая "Материалы и методы", заключения и обсувд ния материала, выводов, приложений, указателя литературы (67 от> честгеншх и 167 иностранных источников) .Работа иллюстрирована ; Таблицами и 7 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ • Материалы и методы исследования.

Препараты интерьеренов человека: природный альфа-интерферон ( активностью 30 тыс.МЕ/мл был получен вирусной индукцией лейкоци-топ человека в лаборатории интерферона С-Пб НИИЭМ им.Пастера; р< комбияант1ый альфа(А)-интерферон (реаферон) с активностью I млн МЕ/амп, изготовлен в НПО "Вектор", разводили до уровня противов! ругней активности 30 тыс.МЕ/мл; рекомбинантный альфаМ-интерфе]

тыс.МЕ/амп, приготовленный в НИИ оргсинтеза АН Латв.ССР, раэ-ли до уровня противовирусной активности 30 тыс.Мл/мл; прнрод-гамма-интерферон с противовирусной активностью 15 тыс.МЕ/мл, чен от проф. К.Кантелла (Финляндия); рекомбинантный гамма-ин-ерон с противовирусной активностью 2 млн 200 тыс.МЕ/мл, пре-авлен проф. Бергом из фкруи "Биоген" Швейцария); природный n-иктерферон человека активностью 20-100 тыс.МЕ/мл Сил приго-ен в лаборатории интерферона С-Пб.НИИЭМ им.Пястера. ультуры клеток. Персиквпсные линии клеток ¿—41, НЕр-2 и HELa. ердивалк серийными пассатами в лаборатории интерферона С-Пб. !>1 пм.Пастера; первичную культуру лейкоцитов получали из крови ров, отвечающей Требованиям по заготовке крови Ш РСФСР., прусы. Вирус везикулярного стоматита (ВВС) штамм "Индиана" чен из музея вирусных штаммов КИИ вирусологии им.Д.Юванов-э АМН России; вирус осповакиины приготовлен на Предприятии по зводству бакпрепаратоЕ Московского НИИ вирусных препаратов; : герпеса 1-го типа, онтеровирус 7-го типа, вирусы гриппа -«тория/ 3572/75 (Н3Л'л) и А//Хабаровск/ 34674/77 (К,У,) полу-из коллекции вирусов С-Пб.НКИЭИ им.Пастера. -|дукторы интерферона. Е работе использовали: конканавалин А ¡ "Si^ia"; фитогемагглиткнин Р фирмы "; лектин чечевицы

j'CfPLA; препараты фторсодержащих соединений, синтезированные ¡6. химико-технологическом институте; германкйсодеркащие сое-шя, полученные в НИИ органического синтеза АН Латв.ССР; экс' алоэ чидкий для инъекций (коммерческий препарат); лимфоци-1й мптоген и антилиифоцитарный иммуноглобулин, выпускаемые ¡риятием по производству бакпрепаратов Ш1ЭМ МЗ Беларуссии. нательные среды. Для культивирвоания клеток пршеняли: среду модифицированную по Дальбеко; среду 129; растворы Хенкса и' сыворотки крови человека и крупного рогатого скота, тиинтер^ероногые сыворотки к альфа- и гамма-интерферонам че-а с активностью ?5 тыс. антиинтерфероновых ед/мл приготовлены б.НИКЭМ ш.Пастера; антисыворотка к бета-интерферону челове-активностыо 24 тыс.антиинтерфероновых ед/мл получена из На-льного института здоровья (Бетезда, США). деление лейкоцитов из донорской крови осуществляли избираем лизисом эритро-итов 0,835? раствором хлористого аммония, отиг-овирусную активность препаратов интерферона определяли новании подселения гитопатического действия ВВС в микрокуль-клоток Ь—41. Результаты тестирования выракали в единицах

активности Международного стандарта (МЕ).

Определение антипролиферативной активности осуществляли по г давлению формирования монослоя клеток линии Ь-41 в лунках пане* для никротирования.

Типовую принадлежность препаратов интерферона устанавливали реакции нейтрализации противовирусной активности с соответствую щими антисыворотками.

Определение безвредности и токсичности гамма-интерферона осу ществляли в соответствии с требованиями 42-247 Ш-89 на инте ферон лейкоцитарный человеческий сухой.

Статистическая обработка результатов. Титры инфекционной ак-I тивности вирусов расчитывали методом Кербера; достоверность сре, них значений результатов лабораторных и клинических опытов уста, навливади исчислением ошибки среднего арифметического, среднег квадратичного отклонения и доверительного коэффициента (по Стью-денту).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Поиск новых индукторов гамма-интерферона.

В смешанных культурах лейкоцитов человека, а в ряде случаев I в опытах ка волонтерах, изучали способность ряда нативных и ина! тивированных вирусов, биологически активных веществ и некоторых химических соединений стимулировать образование гамма-интерферо! Предполагаемые индукторы гамма-интерферона были подразделены не 3 группы: неспецифические митогены, специфические митогены и ниг комолекулярные синтетические химические соединения (табл. I).

Исследование интерфероногенных потенций испытуемых дрепаратоЕ проводили в стандартных условиях. Лейкоциты, выделенные из кровк доноров, суспендировали в среде Игла с. добавлением 7,Ь% сыворотк крови человека группы АВ. Рабочая плотность клеток составляла I 1,5 млн лейкоцитов в I мл. В ряд флаконов с суспензией лейкоцито вносили падающие разведения индуктора. Максимальная концентрация препарата, обычно, была на порядок ниже его токсической дозы, ко торую предварительно определяли с использованием однослойных кул тур клеток линии Ь-41. После.72 часов инкубирования лейкоцитов • при температуре 37° в присутствии испытуемых соединений надосадо жидкость собирали и исельдовали на наличие в ней интерферона. Ти интерферона определяли на основании физико-химических характерна тик (термо- и кчелотолабилъности) или в реакции нейтрализации с соответствующими антисыворотками. В некоторых случаях интерферо-ногеннуп активность препаратов подтверждали в опытах на добровол;

Таблица I

Лучение интетхТ'ероногенных потенций некоторых вирусов, био-югииески актирных веществ я химических соединений.

>дполагаемие индукторы интерферона

Способность выра- Тип вырабатываемого батыгагь интерфе- интерферона _рон_.

в культу- в опытах рах лей- на воло-котгатов нтерах

гамма

Коммерческие препараты (<1Г'Д. Кпи д. )

А. Неспеци?ические митогены + НИ

(5Г'А, лон /1,

Лрктины бобошх (сои, чечевицы, гороха и фасоли )

Биостимуляторы:

- экстракт алоэ

- кратсрин

- тилорон

Антитела к лимфоцитам человека (лимфоцитар-ный митоген, антклим-фоцктарныЯ иммуноглобулин, кроличья антисыворотка к лейкоцитам человека

Б. Специфические митогены Вакцинные птамма вирусов гриппа А, и Аз

Инактигяроранные вирусы гриппа с антигенными формулами ИМ и

В. Ниэкомолекулярные химические соединения

2торсодер-«,.а'дие углево-

НД

на

ад

вд нд

дороды (12 наименований)

Гермпнийсодерчацие соединения (10 наименований )

щ

+

+

+

мечания: НД - данные отсутствуют

И - способность индуцировать интерферон в культурах лейкоцитов обнаружили у 5 из 10 исследованных препаратов к-) - интеэДепоногенная потенция препарата под шифром £,Х—13 подтверждена в опыте на волонтерах

цах.

На первом этапе работы мы подтвердили высокую интерферона ген. ность коммерческих митогенов: фитогемагглютинина (ФГА), конкана-валина <Кон А) и лектина чечевицы (LLC). Испытуемые препараты в широком диапозоне концентраций стимулировали образование гамма-интерферона в смеаанных культурах лейкоцитов с титрами 1600'«1Е/м и выше. Е последующем оти коммерческие растительные митогены использовали в качестве стандартных индукторов гамма-интерферона.

В виду того, что Кон А и LLC препараты малодоступные и дорогостоящие, нами в условиях лаборатории были шделены лектины из сои, чечевицы, гороха и различных сортов фасоли. Однако полученные растительные лектины обладали более низкой интерферонеген-ностыо, чем стандартные индукторы гацма-интер^ерона, И только лектин чечеркш стимулировал образование гамма-интерферона в лейкоцитах человека в концентрациях до 5С0 МЕ/мл.

К растительным дектинам можно отнести экстракт алоэ, получаемый из мякоти листьев методом сгтрторой экстракции. Этот препарат широко используется в клинике, как биогенный стимулятор при лечении хронических заболеваний и вяло текущих воспалительных процессов. В смешанных культурах лейкоцитов человека экстракт алоэ стимулировал образование гамма-интерферона с активностью до 1600 мл. При этом максимальные титры гамма-интерферона вырабатывались при конечных разведениях препарата 1:2500 - 1:5000. Если учесть, что I мл препарата при введении больному разводится в 3000-5000 раз объемом циркулирующей крови, то оптимальная для стимулирования гаммаинтерферонообраэорания концентрация экстракта-алоэ оказалась близкой к средней терапевтической дозе. У 4 нэ 5 добро-ьолънез после однократной подкожной инъекции I мл экстракта алоэ через 24-72 часа отмечали увеличение титров циркулирующего в крови интерферона.

Другие стимуляторы, такие как тилорон и материн, эарекомендо- ■ вав'оие себя хорошими индукторами интерферона в опытах на мышах, не вызывали выработки инге;>ферона ъ культурах лейкоцитов человека в концентрациях от 2 до 1000 ькг/мл. ЛероральныД прием кватерина я дозе С,Ъ г S-c добровольцами не привел к заметному возрастанию титров интерферона ь их крови на сроках наблюдения до 10 суток.

Антитела к лимфоцитам (лимфогдаарний мятоген и антилимфоцитар-ный '^мусоглобулин, используемый в клшп-.ке в качестве иммуноде-прсссанта) гыэигаш' мощную блссттрансформацию клеток. В культурах лей;;опитов эти ыитогскы, равно как и кроличья шмилейкоцитарная

ipopoTKa, стимулировали образование гамма-интерферона в титрах iem"jarartiix активность интерферона, вырабатываемого лейкоцитами в ^сутствии стандартных индукторов (Кон А и tLC).

Способность экстракта алоэ и антилимфоцитарного иммуноглобули-k индуцировать выработку гамма-интерферона описана впервые и замена авторскими свидетельства!.«! 1415498 от 8.04 19Б8 г и' 1570069.от 6.05 1990 г. Новые индукторы из-за своей доступности малой токсичности весьма перспективны для производства природ-го гамма-интерферона.

Известно, что бласттрансформдция лимфоцитов происходит после повторного контакта с антигеном. В этой связи ш попытались ■ дунировать ингерферонообрязование в смешанных культурах лейко-тов, полученных из Крови доноров, иммунизированных гриппозной кпиной 1-:атнькым)! аттенукрованными и мнахтивированнымр ультрафи-■зтом вирусами А, и А3. Нативные. вирусы стимулировали выработку iKOTTüravH заметных количеств интерферона, который по своим фи-(о-хжическим характеристикам соответствовал 1-му типу. Индук-т лейкогитов инактивированшми вирусами гриппа сопровождалась :азованием невысоких титров (порядка 100 ME/мл) кислотолабиль-■•о интерферона. Очевидно и при индукции натирными вирусами про-годит синтез гамма-интерферона, но его доля и общем уровне про-ювкрусной активности материала невелика и маскируется высокими ■рами альфа-интерферона.

В лаборатории органического синтеза С-Бб. химико-технологичес-•о института были получеш 12 фторсодер^ащих органических сое-ений, которые в опытах на мышах обладали выраженной противо-холевой активностью. Однако, использованные в широком.диапозо-конпентраиий, они не стимулировали образование интерферона в данных культурах лейкоцитов человека.

В институте органического синтеза АН Латв.ССР получена группа комолекулярных германий соде ртац их соединений. Из 10 представ-пых на исследование препаратов 5 стимулировали в культурах *оцитов образование интерферона, который по своим физико-хими-<им характеристикам соответствовал типу гамма. Наиболее актив-интерферонообрйэование происходило в присутствии соединения, значенного шифром LX-I3, при концентрациях 50-100 ,мкг/мл. Пос-гоксикологическях испытаний на белых шаах к морских свинках ират в дозе 750 мг был принят 9-ю взрослыми добровольцами, У i 9 волонтеров через РА часа после приема LX-I3 отмечали 2-4-х ■ноэ нарастание титров интерферона в сыворотке крови. На осно-

еэнии рН- и термолабильности сывороточный интерферон, образовавшийся после перорального приема IX-I3, был отнесен к типу гамма

&.:бор условий выделения у. культивироганик лейкоцитов, обеспе-мигающих стаОильныи г.ыход высоких титрог гакма-инте'рферона.

В процессе получения гамма-интерферона сравнивали 3 способа выделения лейкоцитов из крови доноров: осаждением эритроцитов раствором желатина, избирательным лизисом эритроцитов раствором хлоритого аммония и комбинацией этих методов.

Наиболее эффективной оказалась двухкратная обработка лейкоко!-нентрата раствором хлористого аммония, согласно действующей технологии по получению природного альфа-интерферона, которая обеспечивала высокий выход лейкоцитов при сохранении клетками хоро'-ш интерферонпродуцируицих способностей. Комбинированное выделение лейкоцитов последовательной обработкой желатиной и хлористым аммонием оказалось менее технологичным, так как приводило к заметным потерям клеток и увеличению продолжительности этого производ етвенного этапа. Щадящий метод освобождения лейкоконцентрата от примеси эритрсшстов с помощью желатина не гарантировал получения высоких титров гамма-интерферона.

Дня культивирования лейкоцитов на этапе биосинтезд. гдмма-ин-терферона использовали минимальную среду Игла (MEM), среду Игла, модифицированную Дальбеко (ЩИ), среду 199 и раствор Аака, яриме. нявиийся при производстве природного альфа-интерферона. Стабильно высокие титры гамма-интерферона получали при культивировании лей. койотов в средах Ы£М и УДЙ. Среда 199 или раствор Пака обеспечивали меньшую выживаемость клеток-продуцентов и, как следствие этого, выработку более низких титров гамма-интерферона.

В качестве белковой составлявшей питательной среды, оказалось предпочтительнее использовать нативную сыворотку крови человека АЬ группы или сыворотку крови, лишенную гамма-глобулиновой фракции. При этом, содержание сывороточного белка в среде должно бып ке менее Ь иг/т. Альбумин человека или донорский протеин в тех че концентрациях не обеспечивали полноценный биосинтез гамма-ин-терфсрона лейкоцитами.

Образование гамма-интерферона более интенсивно происходило в стационарных ели роллерних культурах лейкоцитов при посевной дозе 2-4 млн клеток в I мл. КультиЕировдние клеток-продуцентов в спин-нерных условиям не позволяло получать шсоких титров гамма-интерферона.

Отмечено, что предварительная, за 18-20 часов перед внесением

ндуктора, обработка лейкоцитов маяими дозами интерферона в Ь-10 аз увеличивала продуктивность культур. При этом, праймирущий ффект при биосинтезе гамма-интерферона оказывали не только преврати гамма-интерферона, но такке и образцы интерферона альфа и ета типов.

Рисунок I

ДИНАМКА ОБРАЗОВАНИЯ ГАША-ЙНГШЕРОНА (суммарные данные 9 опытов)

24 48 72 96 120 Н4 168

Продолжительность периода биосинмза гамма-интерферона человека (часы)

Незначительные титры гамма-интерферона обнаруживали в культу-

х лейкоцитов только через 20 часов после внесения индуктора,

к гаммаинтерферонообраэования отмечался через 72-96 часов, а

эднее, через, 6-7 суток, происходило снижение титров интерферо-

в культуральной жидкости (рис. I).

Приготовление экспериментальных серий природного гамма-интерферона человека и гипериммунных сывороток к гамма-интерферону.

На основании результатов предварительных исследований была зработана схема для крупномасштабного получения природного гам-интерферона, состоящая из 4-х технологических этапов, в кото-й 1-й этап, "Выделение лейкоцитов, формирование культур клеток-элупентов и их праймирование", предусматривает сбор лейкокон-нтрата, освобождение лейкоцитов от примеси эритроцитов избира-пьным лизисом последних раствором хлористого аммония, суспенди-йание лейкоцитов из расчета 2-4 млн кл/мл в среде Игла с добавим сыворотки крови человека и ЮО-ТЬО МЕ/мл гамма-интерферона

с последующей инкубацией культур лейкоцитов в роллерной установ при температуре 37°; 2-й этап, "Индукция гаммаинтерферонообразо вания", заключается,в смене среды через 20-24 часа, внесении кн. дуктора (экстракта алоэ, лимфопитарного митогена или антилимфоц: тарного иммуноглобулина), и продолжения культивирования клеток при температуре 37° в течение еще 72-56 часов; на 3-м этапе, "Сбор полуфабриката", лейкоциты и дебрис отделяют от питательно? среды центрифугированием или фильтрацией через стеклокартон; и 4-й этап представляет собой частичную о^- "ку и концентрирование гамма-интерферона в режиме микро- и ультрафильтрации. Для устранения возможных микробных или вирусных агентов-контаминантов материал обрабатывали бета-пропиолактоном, после чего разливали в пенициллиноме флаконы или ампула и лиофильно высушивали.

В таком режиме были приготовлены 3 экспериментальные серии ' гамма-интерферона с активностью 40-100 тыс.МЕ/фл, которые были использованы в последующем для изучения физико-химических, антигенных и биологических свойств гамма-интерферона, а также в огра. ниченном клиническом опыте. Одна из полученных серий препарата была направлена в ГОСК им.Тарасевича и после соответствующих исследований оформлена в качестве Отраслевого стандартного образца активности человеческого лейкоцитарного интерферона типа гамма (ОСО-42-28-170-89),

Двум кроликам массой 3,5 кг вводили внутримышечно по I млн МЕ рекомбинантного гамма-интерферона человека фирмы "Биоген". Схема иммунизации состояла из нагрузочного цикла, периода покоя и разрешающей инъекции антигена (рис. 2). Антитела к гамма-интерферону появлялись в крови животных через 2 недели после начала цикла иммунизации и достигали максимальных концентраций к 10-й неделе регулярных инъекций интерфероном. После полуторамесячного периода покоя титры антител заметно снижались, но новое введение гамма-интерферона быстро восстанавливало высокие концетрации специфических антител в крови животных. На пике антителообразовання кролики были тотально обескровлены, а из собранной сыворотки шделе-лена иммуноглобулиновая фракция, которая была передана для контроля в ГИСК им.Тарасевича и оформлена в последующем в качестве Стандартного образка антигаммаиитерфероновых иммуноглобулинов (ОСО-42-28-118-67). Антитела к рекомбинантному гамма-интерферону полностью нейтрализовали противовирусную активность пркродшх образцов гамма-интерферона, но не вступали в реакцию с природными и рекомбинантиыми препаратами альфа-интерферона человека.

ЛЗ-

Рисунок 2

ДИНАМИКА ОБРАЗОВАНИЯ АНТИТЕЛ К ГАШ-ИНТЕРЙЕРОНУ ЧЕЛОЕЕКА В ТЕЧЕНИЕ КУРСА ИШШЗАЦИИ

Время, прошедшее от начала иммунизации (нед.)

Сравнительное изучение физико-химических, антигенных и биоло-еску.х свойств интг.р^еронов человека разных типов.

Центрифугирование препаратов альфа- и гамма-интерферонов чело-а при 18-25 тыс. оборотах в минуту в течение 2 часов не снижа-их противовирусной активности. Контакт с 0,25$ раствором трипа полностью инактивировал испытуемые препараты. Подтверждены данные литературы о существенных различиях в фи-й"-химических свойствах интерферонов альфа и гамма типов. Так гивовируская активность образцов гамма-интерферона полностью нанялась после снижения рН до значений 2,2 или прогревания их температуре 56°. Такая «а обработка природных и рекомбинант-альфа-интерферонов человека не приводила к их инактивации. Ытисыворотка к гамма-интерферону человека в' реакции нейТрали-Н1 подавляла активность только препаратов гамма-интерферона, 1е нейтрализовала противовирусное действие альфа-интерферона, фишунные сыворотки к альфа- и бета-штерферонам человека не 'провали с гамма-интерфероном.

-14В опытах с вирусом везикулярного стоматита (ВВС) установлено, что противовирусное состояние в клетках L-4I развивается через 4 часа после их контакта с гамма-интерфероном, тогда как после контакта с альфа- и бета-интерфероном человека клетки становятся невосприимчивыми к заражению ВВЗ ухе чергэ 2 часа. - ..Природные препараты альфа- и гамма-интерферонов челорекя с одинаковой интенсивность*) тормозили развитие цитопатических изменений (ЦПИ) и накопление е культурах клеток энтеровируса 7-го типа и ВВС. Вирусы осповакиины и герпеса простого 1-го типа значительно медленнее размножались и формировали ЦПИ в клетках защищенных гамма-интерфероном, по сравнению с культурами клеток обработанными альфа-интерфероном.

Установлено, что антипролиферативная активность гамма-интерферона в отношении клеточных линий ¿-41, HELü, НЕр-?, полученных из опухолей человека, значительно превышает антипролиферативное действие альфа-интерферона. Эффект подавления формирования клеточного монослоя удавалось нейтрализовать после контакта испытуемых образцов альфа- и гамма-интерферонов с соответствующими антисыворотками.

Отмечено, что природные интерферона человека обладают выраженной антибактериальной активностью. Полуфабрикаты лейкоцитарных альфа- и гамма-интерферонов вызывали лизис шигелл Флекснера и Зонне. Однако очищенные высокоактивные препараты интерферонов обладали значительно меньшей антишигиллезной активностью. Бактерицидное действие испытуемых образцов не удалось нейтрализовать .антисыворотками к альфа- и гамма-интерферонам человека.

; Опыт клинического применения природного гамма-интерферона

человека.

Одну из экспериментальных серий природного гамма-интерферона человека с активностью 100 тыс. Ш после испытаний на бактериологическую и вирусологическую стерильность, безвредность и токсичность использовали в ограниченном клиническом опыте при лечении герпетических стоматитов и в комплексной терапии рака шейки матки. На обрабатываемые поверхности препарат ¡".носили в виде мази, смешивая предварительно сухой гамма-интерферон с 5 г винилина, из расчета, чтобы I г мази содержал .°0 тыс. МЕ гамма-интерферона.

■ Гаммаинтерфероновой мазью лечили б? ребенка с легкими и сред-нетяжелыми формами первичного и рецидивирующего герпетического стоматита; Ь6 детей с экологичными формами заболевания получали плацебо - винилин. Никаких побочных клинических реакций и ослоп-

1ений не зарегистрировано. Эпитялизация афт и клиническое выздо-ювление больных после лечения гамма-интерфероном наступали, в :реднем, на 2-3 дня раньше, чем в контрольной группе. При лечении 'амма-интерфероном значительно быстрее, чем в контрольной группе ¡ольных, получавших винилин, происходила нормализация содержания :екреторного иммуноглобулина в слюне. За 2-летний период наблюде-1ия среди детей, лечившихся гамма-интерфероном, бал эарегистриро-1ан лишь I случай рецидива, тогда как в группе лиц, получавших ¡лаиебо, рецидивы герпетического стоматита имели место у 26 боль-ых.

15-ти женщинам с разными формами и стадиями рака шейки матки в ериод подготовки к радикальной хирургической операции апплициро-али гамма-интерферонову» мазь непосредственно на опухоль. Курс нтерферонотерапии продолжался 4-6 недель. В процессе лечения роводили кольпимикроскопическое наблюдение, а препараты, полу-енные из иссеченных тканей, исследовали гистологически.

У значительной части больных в процессе регулярного наблюдения тмечали инволюцию опухолей вплоть до полной регрессии. При пато-орфологическом обследовании постоперационного материала у 5-ти енщин опухолевых клеток не обнаружено вовсе. Зще у 8-ми больных тмечали насыщение тканей лимфоцитами и деструкцию опуховевых леток. И лишь у 2-х женщин с раком шейки матки лечение гамма-ин-ерфероном не привело к заметному результату.

ВЫВОДЫ

1. Среди широкого круга исследованных химических соединений, «алогически активных веществ и фармакологических препаратов обкутали новые аффективные индукторы интерферонообразования Сэк-гракт алоэ, антилиыфоцитарный иммуноглобулин), пригодные для умышленного производства природного гамма-интерферона человека.

2. В процессе изучения особенностей образования гамыа-интерфе-жа в смещенных культурах лейкоцитов человека определена пред->чтительная рецептура питательной среды, рабочая плотность кле-ж-продуцентов, праймирущий эффект малых концентраций интерфе-1на на процесс интерферонообразования, установлена оптимальная ¡за индуктора и продолжительность этапа биосинтеза интерферона,

о послужило предпосылкой к разработке технологической схемы по-> чения высокоактивного гамма-интерферона в полупромышленных ооъ-ах.

3. Изучена кинетика выработки антител при интенсивной ишуни-ции лабораторных животных гамма-интерфероном человека, опреде-

яены оптимальные сроки отбора проб кроен и влияние бустериругацих доз гамма-интерферона на процесс антителообразования. Получены гипериммунные антигаммаинторфероновие сыворотки.

4. В результате сравнительного изучения физико-химических, антигенных, и биологических свойств интерферонов человека альфа- и гяума типов, подтверждены данные о термо- и кислотолабильности гамма-интерферона, показаны выраженные антигенные различия альфа-, бета- и гамма-интерферонов человека. Установлено, что, по сравнению с препаратами альфа-интерферона, гамма-интерферон более интенсивно подавляет репродукцию вирусов осповакцины и герпеса простого, а такие обладает солее выраженными антипролиферативны-ми потенциями в отношении некоторых перевиваемых культур клеток человеческого происхождения.

б. Созданная мазевая лекарственная форма природного гамма-интерферона человека оказалась нетоксичной, безвредной и не вызывала побочных реакций у лабораторных животных и добровольцев, tí ограниченном клиническом спите установлена высокая ее эффективность при лечении герпетических стоматитов и рака шейки катки.

РАБОТЫ ОПУБШОВАНШЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I,.Винтухов A.A. "Гамма-интерферон: физико-химические свойства, способы получения и предполагаемые механизмы реализации биологической активности." - Тр.Лен.ШПШ им.Иастера "Иммунопрофилактика и интерферонотерапия вирусных инфекций", Л., 198Ъ, 62, I04-IC5.

2. Синева С.А., Винтухов A.A., Дюбина Т.А., Кондратьева Г.А. "Очистка человеческого лейкоцитарного интерферона методом адсорбционной хроматографии". - ТрЛен.НИИЭМ им.Пастера "Иммунопрофилактика и интерферонотерапия вирусных инфекций", Л,, 1985, 62, 146-149.

3. Винтухов A.A., Иовлев В.И. "Опыт получения гамма-интерферона человека". - Материалы Всесоюзной конференции "Итоги и перспективы теоретических и практических исследований по проблеме интерферона", Тбилиси, 1985, ИЗ.

4. Синева С.А.,- Винтухов A.A., Дюбина Т.А., Иовлев В.И. "Адсорбционный метод очистки лейкоцитарного интерферона человека". -Материалы Всесоюзной конференции "Итоги и перспективы теоретических и практических исследований по проблеме интерферона", Тбилиси, 1985, 122.

5. Кондратьева Г.А., Шелехова С.Е., Винтухов A.A., КоробковС.Б. "Физико-химические и биологические свойства некоторых рекомбин&н-

:них и лейкоцитарных интерферонов". Тезисы докладов конференции юлодых ученых "Современные, проблемы медицинской вирусологии", 'ига, 1987, 84.

6. Винтухов A.A., Иовлев В.И., Степанов А.Н., Смородинцев A.A. 'Получение и основные биологические свойства гамма-интерферона [еловека". - Журнал "Антибиотики и химиотерапия", 1968, 2, 99-102.

7. Бинтухов A.A., Кондратьева Г.А., Шелехова С.Е., СтепановА.Н. Получение и свойства гамма-интерферона человека". - Материалы -го регионального симпозиума социалистических стран по интерфе-:ону "Кнтерферон-88", Рига, 1986, 30.

8. Степанов А.Н., Иовлев В.И., Винтухов A.A., Раэаренова Т.С., елезнова Н.В. "Подходы к созданию технологии получения высокоактивных препаратов природного альфа-интарферона человека". - Мате-иалы Х-го регионального симпозиума социалистических стран по ин-ерферону "Интерферон-88", Рига, 1988, 67.

9. ßaccep Н.Р., Белькова Е.И., Степанов А.Н., Винтухов A.A., оробков С.В., Иовлев В.К. "Антисшгеллезная активность препаратов нтерфврона" - Республиканский сборник "Острые кишечные инфекции",

1968, 12, 156-159.