Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование структурно-функциональной роли С-конца молекулы гамма-интерферона
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Цивковский, Руслан Юрьевич, Кольцово
Министерство здравоохранения России Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии
"Вектор"
На правах рукописи
цивковский
Руслан Юрьевич
ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РОЛИ С-КОНЦА МОЛЕКУЛЫ ГАММА-ИНТЕРФЕРОНА
специальность 03.00.03 - "молекулярная биология"
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Научные руководители -кандидат химических наук С.И. Татьков,
доктор биологических наук, профессор A.A. Ильичев
Кольцово - 1999
ОГЛАВЛЕНИЕ
стр
Введение. 5
Глава 1. Обзор литературы. Механизмы реализации биологических 10 свойств гамма-интерферона и роль в этом С-конца молекулы.
1.1. Введение. 10
1.2. Связывание уИФН с клеточным рецептором и передача сигна- 12 ла в клетку.
1.3. Иммуномодулирующие свойства уИФН. 17
1.4. Антивирусная активность уИФН. 20
1.5. Антипролиферативное действие уИФН. 24
1.6. Роль уИФН в усилении фагоцитоза. 27
1.7. Адъювантные свойства уИФН. 29
1.8. Роль С-конца в реализации различных функций уИФН. 30
1.9. Формулировка задач по уточнению структурно- 44 функциональной организации С-конца уИФН.
Глава 2. Материалы и методы. 46
2.1. Модификация олигонуклеотида 4-аминооксибутиламином. 47
2.2. Методика определения субстратных свойств модифицирован- 47 ных дезоксицитидин-5'-трифосфатов,
2.3. Получение С-концевого фрагмента гена а-фетопротеина. 48
2.4. Выделение гибридного белка ИФН-АФП. 48
2.5. Определение димерной структуры белков методом ковалент- 49 ной сшивки.
2.6. Определение констант связывания гамма-интерферона и его 50 аналогов со специфическим клеточным рецептором.
2.7. Определение фагоцитоз-стимулирующей и антипролифера- 51 тивной активности белков.
2.8. Иммунизация кроликов и определение титров сывороток ка- 52 фетопротеину.
Глава 3. Результаты и обсуждение. 54
3.1. Изучение структурно-функциональной организации С-конца 54 у-интерферона.
3.1.1. Получение продуцента гибридного белка ИФН-АФП в E.coli. 55
3.1.2. Очистка гибридного белка ИФН-АФП. 62
3.1.3. Исследование физико-химических свойств С-концевых анало- 66 гов уИФН.
3.1.4. Исследование биологических свойств аналогов уИФН. 76
3.1.5. Изучение иммуностимулирующих свойств уИФН в составе 82 гибридного белка ИФН-АФП.
3.2. Разработка методов статистического мутагенеза с использова- 91 нием 4-аминооксибутиламина и его производных.
3.2.1. Разработка способа введения мутаций в ограниченный район 93 ДНК с использованием олигонуклеотида, модифицированного АОБА.
3.2.2. Получение мутаций в протяженном районе целевого гена пу- 101 тем создания одноцепочечного района необходимой длины и
его дальнейшей модификации АОБА.
3.2.3. Получение АОБА-производного dCTP (dC** TP) и изучение 105 его субстратных свойств в полимеразной системе in vitro.
3.2.4. Исследование мутагенных свойств dC**TP. 115
Заключение. 120
Выводы. 123
Литература. 125
БЛАГОДАРНОСТИ
Автор глубоко признателен за помощь в освоении ряда методик, проведении части экспериментов и постоянные рекомендации и консультации по различным теоретическим и практическим вопросам научным сотрудникам: к.х.н. Сиволобовой Г.Ф., к.б.н. Кочневой Г.В., Гражданцевой АА., к.х.н. Серпинскому О.И., к.б.н. Смирновой О.Ю., к.х.н. Решетникову С.С., Батуриной И.И. (ГНЦ ВБ «Вектор»), к.ф-.м-.н. Христофорову B.C. и к.б.н. Косареву И.С. (Институт инженерной иммунологии РАН), д.м.н. Черных Е.Р и к.м.н. Останину A.A. (Институт клинической иммунологии СО РАМН).
Автор также считает своим долгом поблагодарить своих научных руководителей Татькова С.И. и Ильичева A.A. за постоянную помощь и поддержку в течение всей работы и твердую уверенность в ее успешное завершение.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
уИФН - гамма-интерферон человека АФП - альфа-фетопротеин человека дцРНК - двухцепочечная РНК
ИФН-АФП - гибридный белок гамма-интерферон- альфа-фетопротеин
АКО - аминокислотный остаток
ABA - антивирусная активность
АОБА - 4-аминооксибутиламин HaNO(CH2)4NH2
ПАФ - полный адъювант Фрейнда
Расшифровка остальных сокращений приводится по ходу текста.
Введение.
Актуальность проблемы.
Изучение природы и механизма действия интерферонов, и у-интерферона в частности, было одним из наиболее захватывающих разделов молекулярной биологии клетки и вирусологии на протяжении последних трех десятилетий, у-Интерферон (уИФН) был открыт в 1965 году как антивирусный фактор, синтезируемый человеческими лимфоцитами в ответ на их обработку фитогемагглю-тинином [1]. Уже тогда, предвидя исключительную важность этого белка в функционировании всего организма, автор этого открытия Фредерик Е. Уилок писал: «Этот ФГА-индуцированный вирусный ингибитор может продуцироваться белыми кровяными клетками в ответ на стимуляцию клеточного синтеза РНК и, возможно, представляет механизм обратной связи для контроля синтеза РНК.»
В результате последующих исследований рекомбинантного уИФН, полученного вскоре после того, как проклонировали в 1982 году его ген [2,3], было установлено, что антивирусная активность гамма-интерферона - лишь одна из его многочисленных биологических функций, в то время как главными являются регуляция клеточных активностей, связанных с ростом, дифференцировкой и управлением иммунным ответом. Среди них можно особо отметить: иммуноре-гуляторную функцию, антипролиферативную активность, способность усиливать фагоцитоз, а также и другие функции. Особые перспективы исследователи связывали с изучением антипролиферативной активности в свете разработки новых высокоэффективных противораковых агентов. Однако в ходе исследований был также выявлен целый ряд побочных негативных эффектов у-интерферона. Например, было показано, что его биологические активности in vivo значительно отличаются от активности in vitro, а также установлено, что в организме человека и животных белок нестабилен, а его расщепление трипсиноподобными протеазами начинается с С-конца молекулы. Таким образом стало очевидно, что для создания лекарственного препарата на основе иммунного интерферона и эффективных схем лечения необходимо глубже исследовать механизм реализа-
ции регуляторных функций у-интерферона и расшифровать его структурно-функциональную организацию. Такого рода информация крайне необходима для создания аналогов иммунного интерферона со сниженными побочными эффектами и для разработки концепции его применения в медицинской практике. Одним из эффективных подходов к решению данной проблемы является использование методов статистического и олигонуклеотиднаправленного мутагенеза для получения мутантных иммунных интерферонов и всестороннего изучения их свойств. Следует, однако, отметить, что методы статистического мутагенеза используются в настоящее время значительно реже, прежде всего из-за их трудоемкости.
Цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы является всестороннее исследование свойств полученных С-концевых аналогов у-интерферона, установление роли С-конца молекулы в проявлении различных свойств белка, а также разработка новых эффективных методов локализованного статистического мутагенеза, основанных на применении нового мутагена - 4-аминооксибутиламина (АОБА) и модифицированного им цитидина для создания обширного банка мутантных генов уИФН. Для достижения этой цели решались следующие задачи:
1) получение ряда С-концевых аналогов уИФН, содержащих как точечные мутации, так и протяженную полипептидную встройку;
2) изучение физико-химических и биологических свойств С-концевых аналогов уИФН;
3) определение роли как С-конца в целом, так и отдельных его участков в осуществлении функциональной активности уИФН.
4) выяснение механизма мутагенного действия 4-аминооксибутиламина и модифицированного им дезоксицитидин-5'-трифосфата;
5) разработка ряда методов локализованного мутагенеза, позволяющих вводить мутации в районы ДНК различной протяженности.
Научная новизна работы.
В данной работе исследовано влияние точечных замен, делеции 10 аминокислотных остатков (ако) и протяженной вставки в С-концевой области молекулы гамма-интерферона на димеризацию молекул, спектры кругового дихро-
изма и константы связывания со специфическим клеточным рецептором. Впервые показано, что точечные замены (В38, Б92, <3133) или удаление 10 ако (ДЮ) С-конца молекулы не препятствуют образованию димеров. Даже вставка протяженного полипептида (мутант ИФН-АФП, 53 кДа) в данную область молекулы не смогла полностью подавить димеризацию полученного гибридного белка ИФН-АФП. Не удалось также выявить сколь-нибудь значительного влияния данных мутаций и на КД-спектры очищенных гомогенных мутантных белков в сравнении со спектром рекомбинантного гамма-интерферона, что свидетельствует об отсутствии значительного изменения соотношения альфа-спиральных, бэта-складчатых и неструктурированных участков. Определение констант связывания по методу Скэтчарда выявило значительное влияние на их величину точечных замен, делеций или вставок в С-концевой области молекулы иммунного интерферона. Данные результаты подтверждают участие С-конца молекулы рекомбинантного у-интерферона в связывании со специфическим клеточным рецептором.
Изучено влияние мутаций на антивирусную, антипролиферативную и фа-гоцитоз-стимулирующие активности мутантных аналогов. Наиболее чувствительной оказалась антивирусная активность молекулы, измеренная по подавлению цитопатического действия вируса энцефаломиокардита мышей на культуру клеток диплоидных фибробластов человека Ь-68. Любая из исследованных мутаций приводила к падению удельной антивирусной активности мутантной молекулы. Вместе с тем, на антивирусную активность мутантов, измеренную в системе вирус везикулярного стоматита/клетки Ь-68, практически не повлияли мутации В38, С>133, А10. Причины данного явления остаются не установленными. Как было показано, делеция аминокислотных остатков (А 10) или вставка протяженного полипептидного фрагмента в С-концевой области молекулы у-интерферона не изменило как ее антипролиферативную, так и фагоцитоз-стимулируюшую активности. Таким образом, впервые охарактеризованы мутанты гамма-интерферона, у которых значительно понизилась антивирусная активность, константа связывания с клеточным специфическим рецептором, но одновременно не изменились их иммуномодулирующие активности. Такие аналоги
представляют значительный интерес при изучении механизмов реализации ре-гуляторных функций у-интерферона.
Исследовано развитие иммунного ответа у кроликов на введение гибридного белка ИФН-АФП. Оценка клеточного иммунитета с помощью реакции гиперчувствительности замедленного типа и реакции бласттрансформации лимфоцитов не выявила формирование клеточного ответа на АФП-компоненту гибридного белка. Изучение титра антител против АФП в сыворотке иммунизированных животных подтвердило, что их уровень значительно выше при использовании гибридного белка ИФН-АФП, чем в любых других вариантах иммунизации. Полученные данные позволяют высказать предположение о перспективности использования гибридных белков на основе у-интерферона для получения антисывороток против низкоиммуногенных антигенов.
Впервые экспериментально доказана возможность использования для мутагенеза олигонуклеотидов, модифицированных 4-аминооксибутиламином. Модификация олигонуклеотида происходит по цитидинам, а в районе, комплементарном модифицированному олигонуклеотиду, индуцируются исключительно G А транзиции. Показана возможность введения мутаций с помощью данного мутагена в более протяженные участки генома. Для этих целей получают гетеродуплекс ДНК, содержащий одноцепочечный участок, подлежащий мутагенезу, и обрабатывают его 4-аминооксибутиламином, после чего данным гете-родуплексом можно трансформировать компетентные клетки. Новизна данного метода заключается в том, что не требуется, в отличие от традиционного способа, достраивать комплементарную цепь ДНК in vitro. Таким методом получены мутантные гены у-интерферона, наличие мутаций в одном из них доказано сек-венированием и показано, что в гене индуцируются С —> Т транзиции. Синтезирован новое соединение М4-(4-аминобутокси)дезоксицитидин-5'-трифосфат, способное индуцировать мутации. Показано, что данный модифицированный трифосфат включается как вместо dCTP, так и dTTP при ферментативном синтезе комплементарной цепи ДНК in vitro и индуцирует в первом случае G -» А, а во втором А —» G транзиции. Применение данного мутагена позволяет вводит мутации в район гена, прилегающий к 3'-концу используемого праймера.
Практическая ценность работы.
Охарактеризованные мутантные белки могут быть использованы для изучения механизма действия у-интерферона, а разработанный новый комплекс методов направленного мутагенеза может быть применен как для получения других аналогов уИФН и созданию на их основе новых перспективных лекарственных препаратов, так и для решения задач по структурно-функциональному исследованию генов, геномов и других белков.
Положения, выносимые на защиту.
1) Получение гибридного белка, состоящего из у-интерферона человека к С-концу которого присоединен фрагмент а-фетопротеина человека (ИФН-АФП). Этот белок позволяет получить дополнительные данные о роли С-конца в функционировании всей молекулы уИФН.
2) Точечные замены (В38, Б92, (2133), удаление 10 остатков (Л10) и вставка белкового фрагмента в С-концевой области не препятствуют образованию димеров. Спектры кругового дихроизма мутантных белков (за исключением гибридного белка ИФН-АФП) не отличаются от спектра исходного рекомби-нантного у-интерферона, что свидетельствует о неучастии С-конца в формировании вторичной и третичной структуры белка. Влияние точечных замен, делеции или вставки в С-концевой области молекулы у-интерферона на константу связывания со специфическим клеточным рецептором.
3) Влияние мутаций на антивирусную, антипролиферативную и фагоцитоз-стимулирующие активности мутантных у-интерферонов. Любая из исследованных мутаций (за исключением В38) приводит к падению удельной антивирусной активности. Установление факта, что делеция или вставка в С-концевой области молекулы у-интерферона не оказывают влияние на антипролиферативную и фагоцитоз-стимулирующую активности.
4) Усиление гуморального иммунного ответа на АФП при иммунизации гибридным белком ИФН-АФП по сравнению с другими белками.
5) Использование 4-аминооксибутиламина и его производных в качестве мутагена для разработки методов локализованного мутагенеза.
6) Разработка трех методов локализованного мутагенеза, позволяющих вводить мутации в районы ДНК различной протяженности.
Глава 1. Обзор литературы. Механизмы реализации биологических свойств гамма-интерферона и роль в этом С-конца молекулы.
1.1. Введение.
у-Интерферон - лимфокин, обладающий широким спектром биологических активностей, впервые был открыт как специфический антивирусный агент [1]. Основными клетками-продуцентами уИФН являются: 1) активированные ТЪ-лимфоциты (индуцируются специфическими антигенами); 2) не активированные ТИ-лимфоциты (стимулируются митогенами); 3) активированные ЫК-клетки (продукция стимулируется ЮТ-а и 1Ь-12).
уИФН является полипептидом, состоящим из 143 аминокислотных остатков и содержащим боковые олигосахаридные группы. В растворе [4] и в кристаллическом состоянии [5] находится в виде гомодимеров. С-конец уИФНов из различных природных и рекомбинантных источников отличается высокой степенью гетерогенности по аминокислотному составу [6,7], что может быть связано с протеолитическим процессингом и, возможно, играет определенную регу-ляторную роль.
По данным рентгенострукгурного анализа (Рисунок 1.1.1) [5] гомодимер уИФН представляет собой компактный глобулярный белок, содержит примерно 62% а-спиралей и практически не содержит [3-структур, что согласуется с данными спектров кругового дихроизма [8,9]. При этом С-конец белка не участвует в поддержании третичной структуры белка и экспонирован в раствор.
В большинстве случаев начальный этап воздействия уИФН на клетку-мишень заключается в связывании со специфическим клеточным рецептором [10]. Первичная структура рецептора определена из последовательности его кДНК, он был экспрессирован и достаточно хорошо охарактеризован [11,12]. Однако, для проявления биологических функций уИФН требуется наличие дополнительных белковых факторов [13].
уИФН обладает широким спектром биологических активностей, среди которых следует отметить:
_ и __
Рисунок 1.1.1. Схематическое представление д и мера уИФН.
СС-Спирали представлены в виде цилиндров, а неупорядоченные районы в виде трубочек. ЫН,-концы спиралей окрашены синим. С ООН-концы - красным. АВ-петля обозначена стрелкой. Воспроизведено из работы [5].
1) иммуномодулирующую;
2) антивирусную;
3) антипролиферативную;
4) способность усиливать фагоцитоз;
5) антипаразитарную.
Также существует ря
- Цивковский, Руслан Юрьевич
- кандидата биологических наук
- Кольцово, 1999
- ВАК 03.00.03
- Получение мутантных вариантов гамма интерферона человека и исследование их свойств
- Гамма-интерферон человека: его получение, физико-химические и биологические характеристики
- Регуляция систем интерферона и иммунитета модулирубщими препаратами как основа совершенствования профилактики гриппа
- Регуляция систем интерферона и иммунитета модулирующими препаратами как основа совершенствования профилактики гриппа
- Исследование механизмов действия УФ-света и различных препаратов α-интерферона на структурно-функциональное состояние компонентов T- и B- клеточного звена иммунитета человека